EA025275B1 - Способ, терапевтическая композиция, вакцинная комбинация и набор для терапевтического или профилактического лечения вич - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к способу терапевтического или профилактического лечения ВИЧ (вирус иммунодефицита человека), в частности способу профилактической вакцинации, при котором, по меньшей мере, вводят пациенту первый антиген, содержащий обладающие широким спектром нейтрализующего действия эпитопы проксимально расположенной к мембране внешней области (ПМВО) gp41, и тому же самому пациенту вводят второй антиген, содержащий модифицированный полипептид, содержащий три смежных сегмента N, L и С, представленный формулой N-L-C, и содержащий N-спиральную область gp41(N), С-спиральную область gp41(С), и связывающую петлю, содержащую синтетический линкер (L) между N и С-спиралями, где линкер заменяет аминокислоты 593-617 в gp41, где схема нумерации основана на используемом в качестве прототипа изоляте штамма HIV-1 HxB2 монофилетической группы В, где указанный полипептид содержит эпитоп, нейтрализующий кальвеолин-1 и 98.6 D, но не содержит эпитопы 2F5 и 4Е10, не содержит пептид слияния, причем полипептид обладает минимальной перекрестной реактивностью с человеческим интерлейкином 2.

Description

Виросомоподобные везикулы, содержащие производные от др41 антигены. Изобретение относится к новой виросомоподобной везикуле, подходящей для того, чтобы вызывать иммунный ответ против человеческого вируса иммунодефицита (ВИЧ), фармацевтическим композициям, содержащим указанные виросомоподобные везикулы, способам лечения и наборам, предназначенным для того, чтобы вызывать иммунный ответ против человеческого вируса иммунодефицита.

Предшествующий уровень техники

ВИЧ-1 представляет собой ретровирус, который постепенно разрушает иммунную систему и в конечном итоге приводит к синдрому приобретенного иммунодефицита (СПИД).

Отличительной особенностью вируса является его чрезвычайно быстрое мутирование в организме одного пациента. В результате геномого картирования существующих в настоящее время штаммов ВИЧ1 получили возможность картировать генеалогическое древо, в основании которого существуют три группы, названные М, N и О, причем группа М ответственна за существующую в настоящее время пандемию СПИДа.

Группа М расщепляется на девять генетических подтипов, также названных девятью монофилетическими группами (обозначенными А-К, без Е или I). Исходное определение монофилетических групп основано на коротких геномных последовательностях, в основном, в оболочечном белке ВИЧ (Εην: др160). Эти девять монофилетических групп обладают неоднородными картинами географического распространения. Монофилетическая группа С распространена в Южной Африке, Индии и районах Китая. Монофилетические группы А и И распространены в Восточной Африке, а монофилетическая группа В характерна для Северной и Южной Америки и Западной Европы. В соответствии со статистикой четыре монофилетические группы А, В, С и И составляют свыше 90% от всей инфекции по всему миру, а монофилетическая группа С сама по себе представляет собой преобладающий в мире ВИЧ (>60%). До недавнего времени разработка вакцин фокусировалась на штаммах монофилетической группы В, которая эпидемически доминирует в промышленно развитых странах, но вызывает всего лишь приблизительно 12% инфекций по всему миру.

Большая часть подходов с использованием вакцин против ВИЧ-1 направлена на гликопротеины вирусной оболочки (Εην), поскольку они представляют собой основные поверхностные антигены, экспрессирующиеся на вирионах и ВИЧ-1 инфицированных клетках. Нативный гликопротеин оболочки ВИЧ-1 представляет собой гетеродимер, содержащий три белка др1120, нековалентно связанных с тремя гликопротеинами др41.

Из-за быстрой мутации в организме одного пациента нейтрализующие вирус антитела против одного варианта обычно не защищают пациента от ВИЧ, поскольку быстро возникают не распознанные мутанты. Тем не менее раскрыто множество антител, обладающих широким нейтрализующим спектром, способных нейтрализовать множество штаммов монофилетической группы В. Четыре наиболее сильных нейтрализующих ВИЧ-1 антитела уже идентифицированы: Ы2 и 2012 к др120 и 2Р5 и 4Е10 к области др41, названной проксимально расположенным к мембране эктодоменом (ПМЭД). Эти антитела обладают высокой аффинностью в отношении нативного тримера. Тем не менее антитела, способные к перекрестной нейтрализации между монофилетическими группами, являются очень редкими. 2Р5 взаимодействует со штаммами монофилетической группы В, но плохо со штаммами монофилетической группы С, 2012 не нейтрализуют вирусы монофилетической группы С-Е, а Ы2 нейтрализует 50% вирусов. 4Е10 способен нейтрализовать чрезвычайно широкий диапазон первичных изолятов ВИЧ-1, по существу, всех подтипов, хотя, по-видимому, он обладает умеренной силой.

Предпринимаются все более интенсивные попытки разработать рекомбинантные белки в качестве вакцин-кандидатов, которые представляют собой более хорошие антигенные мимики по сравнению с комплексом нативного гликопротеина оболочки, таким как др120/др41. Тем не менее вследствие множества (по меньшей мере пятнадцати) молекулярных гомологий между др120/др41 и молекулами иммунной системы может возникать множество потенциальных случаев перекрестной реактивности, которые приводят к возможным вредным аутоиммунным явлениям.

Описаны различные стратегии уменьшения перекрестной реактивности для получения вакцин против ВИЧ, которые не обладают или обладают меньшей перекрестной реактивностью с человеческими белками, такие как введение мутаций и/или делеций в различные части белка др41, как описано в И8 6455265.

Инфекции ВИЧ возникают в основном на слизистой оболочке в области проникновения, такой как влагалище и аноректальная слизистая оболочка. Большинство нейтрализующих антител, которые были описаны или чья продукция вызывалась при помощи вышеприведенных стратегий вакцинации, представляют собой системные антитела 1д0. Тем не менее у женщин, часто контактирующих со множеством штаммов ВИЧ-1, антитела 1дА слизистых оболочек обнаруживаются в вагинальных секретах, и они, повидимому, обладают широким защитным спектром против инфекции ВИЧ (Вгойбеп К., с1 а1. 2009, 1ттипо1. Ьей. 79, 29-36). Таким образом, существует потребность в вакцине, способной вызывать продукцию таких антител слизистой оболочки.

Также существует необходимость в разработке вакцины, не относящейся к монофилетической группе В, такой как, например, штаммы монофилетической группы С.

- 1 025275

Также существует необходимость в разработке вакцины, обладающей широким ингибирующим спектром, обеспечивающим возможность перекрестного ингибирования между монофилетическими группами.

Существует необходимость в вакцине, позволяющей индуцировать гуморальный и/или клеточный иммунный ответ против ВИЧ инфекции.

Существует необходимость в вакцине, позволяющей индуцировать иммунный ответ против ВИЧ инфекции на уровне слизистой оболочки и на уровне крови.

Существует необходимость в вакцине, подходящей для индукции антител слизистой оболочки 1§С и секреторных антител 1дА (§1§А), и системных антител 1§С, способной влиять на проникновение ВИЧ-1 через слизистую оболочку и раннюю инфекцию клеток под слизистой оболочкой.

Существует необходимость в вакцине, подходящей для ингибирования или уменьшения проникновения ВИЧ через ткани слизистой оболочки путем различных механизмов, таких как трансцитоз.

Задача изобретения заключается в том, чтобы удовлетворять все вышеупомянутые потребности.

Таким образом, в соответствии с одним из первых аспектов настоящее изобретение относится к способу терапевтического или профилатического лечения ВИЧ, в частности способу профилактической вакцинации, при котором, по меньшей мере, пациенту вводят первый антиген, содержащий эпитопы широкого нейтрализующего спектра из проксимально расположенного к мембране эктодомена (ПМЭД) др41, и тому же самому пациенту вводят второй антиген, содержащий модифицированный полипептид, содержащий три смежных сегмента Ν, Ь и С, представленный формулой Ν-Ь-С, и содержащий: Νспиральную область §р41 (Ν), С-спиральную область §р41 (С), и связывающую петлю, содержащую синтетический линкер (Ь) между N и С-спиралями, где линкер заменяет аминокислоты 593-617 в §р41, где схема нумерации основана на используемом в качестве прототипа изоляте штамма ВИЧ-1 НхВ2 монофилетической группы В, где указанный полипептид содержит эпитопы, нейтрализующие кавеолин-1, и 98.6 Ό, но не содержит эпитопы 2Р5 и 4Е10, не содержит пептид слияния, где полипептид обладает минимальной иммуногенной перекрестной реактивностью с человеческим интерлейкином 2.

Таким образом, вакцина против ВИЧ по изобретению демонстрирует свойство, заключающееся в способности вызвать иммунные ответы (цитолитические Т лимфоциты (СТЬ) и/или антитела) в крови, а также в первичных областях проникновения, представляющих собой половые пути и кишечные/ректальные слизистые ткани. Это свойство особенно благоприятно, поскольку ВИЧ инфекция может включать стадию трансцитоза вируса через слизистые оболочки, облегчающую транслокацию вируса и распределение его в организме.

Секреты семенной жидкости и секреты шейки матки и влагалища могут, потенциально, переносить ВИЧ-1 в желудочно-кишечный, аноректальный и мочеполовой тракты, поскольку содержат бесклеточные частицы ВИЧ-1 и множество ВИЧ-инфицированных мононуклеарных клеток.

Также полагают, что основным местом, где происходит ранняя репликация вируса у субъектов, инфицированных ВИЧ, является тонкая кишка и другие слизистые оболочки. Основной причиной этого является тот факт, что подавляющее большинство чувствительных клеток (интестинальные СЭ4+ Тклетки) располагается в тканях слизистой оболочки и в течение первых нескольких недель после воздействия ВИЧ эти клетки разрушаются.

В рамках настоящего изобретения предполагают, что выражение виросомоподобная везикула обозначает везикулу, содержащую, по меньшей мере частично, виросомальные липиды и слитые белки или их фрагменты, где указанные фрагменты обладают активностью слияния и характеристиками полноразмерного слитого белка, по меньшей мере, в той степени, которая служит для слияния с биологической мембраной клетки-мишени.

Производный §р41 антиген.

Производный §р41 антиген, подходящий для настоящего изобретения, может представлять собой любой фрагмент белка др41, а также полноразмерный белок §р41 и его аналоги.

В концепции изобретения предполагается, что выражение его аналог в отношении производного §р41 антигена относится к пептиду, имеющему частичную (по меньшей мере) 85%, в частности по меньшей мере 90% и конкретней по меньшей мере 95% идентичность или гомологию аминокислотной последовательности (т.е. аминокислотный остаток заменен, например, на аминокислотный остаток того же самого семейства с близкой полярностью или зарядом) с аминокислотной последовательностью указанного производного §р41 антигена, и который обладает похожими или консервативными биологическими свойствами, в частности в отношении связывания антигенсвязывающего фрагмента иммуноглобулина, направленного против белка др41.

В соответствии с воплощением производный др41 антиген, подходящий для изобретения, может быть лишен способности сливаться с клеточной мембраной.

В одном из аспектов изобретению предложен первый антиген, содержащий нейтрализующие эпитопы проксимально расположенного к мембране эктодомена (ПМЭД) др41.

В соответствии с настоящим изобретением указанный первый антиген включает эпитопы 2Р5 и 4Е10.

В концепции настоящего изобретения эпитоп 2Р5 соответствует специфической области др41. рас- 2 025275 познаваемой человеческим антителом 2Ε5, которое обладает широким спектром нейтрализующей активности для различных первичных изолятов ВИЧ-1 (Тгко1а А. е! а1, 1995, 1. Упо1., 69, р. 6609-6617, см. фиг. 1). Это моноклональное антитело распознает коровый эпитоп, состоящий из шести аминокислот в относительно консервативной 16-аминокислотной линейной последовательности (ИЕрВЬЬЕЬПКГСАЗЬГСК, 8ЕЦ ГО Νο. 7) в эктодомене др41 около трансмембранной области молекулы (Рагкег е! а1, 2001, 1. Упо1., 75, р. 10906-10911).

Человеческое моноклональное антитело 4Е10 специфично в отношении трансмембранной проксимальной области др41 в области, располагающейся в непосредственной близости к С-концу относительно эпитопа 2Р5, и также обладает широким спектром нейтрализующей активности (Ζ\νχΕ е! а1, 2001, 1. У1го1., 75, р. 10892-10905, см. фиг. 1).

В соответствии с аспектом изобретения первый антиген соответствует аминокислотам 649-683 др⁴¹.

В еще одном воплощении указанный первый антиген содержит эпитоп, нейтрализующий 1дА.

В более предпочтительном воплощении изобретения указанный первый антиген содержит аминокислотную последовательность, описанную 8ЕЦ ГО Νο. 2, 8ЕЦ ΙΌ Νο. 3, 8ЕЦ ΙΌ Νο. 4, 8ЕЦ ΙΌ Νο. 5 или 8ЕО ΙΌ Νο. 6.

В еще одном предпочтительном аспекте первый антиген связан с виросомой.

В еще одном аспекте изобретения предложен второй антиген, содержащий модифицированный полипептид, содержащий три смежных сегмента Ν, Ь и С, представленные формулой Ν-Ь-С, и содержащие: Ν-спиральную область др41 (Ν), С-спиральную область др41 (С), и связывающий их содержащий петлю синтетический линкер (Ь) между Ν и С-спиралями, где линкер заменяет аминокислоты 593-617 др41, причем схема нумерации основана на служащем в качестве прототипа изоляте ВИЧ-1 штамм НхВ2 монофилетической группы В, где указанный полипептид содержит эпитопы, нейтрализующие кавеолин1 и 98,6 Ό, не содержит эпитопы 2Р5 и 4Е10, не содержит пептид слияния и обладает минимальной иммуногенной перекрестной реактивностью с интерлейкином 2 (1Ь-2).

Указанный второй антиген в соответствии с изобретением далее независимо назван производный др41 антиген или др41 по изобретению или гдр41.

Второй антиген в соответствии с настоящим изобретением едва поддерживает нативную конформацию взаимодействия между Ν- и С-спиралями и обладает гидрофобностью, которая придает растворимую и стабильную тримерную форму указанному модифицированному второму антигену, по существу, не изменяя его иммуногенной реактивности.

Эпитоп 98.6Ό расположен в области кластера II в др41 и распознается человеческим моноклональным антителом 98.6Ό, как описано в Οογπυ М.К. е! а1., 1989, Ртос. №11. Асаб. 8οΐ., 86, р. 1624-1628 и Хи Т-У.е! а1., 1991, 1. νΰο1., 65, р. 4832-4838.

Домен, связывающий кавеолин-1, соответствует пептиду СВЭ1 (8ЕЕО1ГСННМТГСМОГСЭК. 8ЕЦ ГО Νο. 8) в др-41 (ВеиСегЬа! е! а1., 2009, Μο1. Iттиηο1. 46(4), р. 705-712). Пептид слияния соответствует Ν-концевой области др41, которая экспонируется после образования формы двойной спирали. Эта область встраивается в мембрану клетки-мишени, что приводит в результате к слиянию вируса и клеточных мембран; она соответствует области 512-539 внеклеточного фрагмента др41 (ОшШапа е! а1., 2005, ГС1; см. фиг. 1).

В соответствии с настоящим изобретением второй антиген дает возможность для образования тримеров гдр41 и сохраняет антигенность нативного др41 и демонстрирует минимальную перекрестную реактивность с ГО-2. Такая перекрестная реактивность может быть определена при помощи способов, хорошо известных специалистам в данной области техники, таких как др41-ЕЬ18А (иммуноферментный анализ) и др41-(дот-блот). Пример такого определения представлен ниже (см. пример 3, фиг. 2).

В соответствии с настоящим изобретением выражение сохраняет антигенность нативного др41 или не изменяя его иммуногенную активность означает, что полипептид в соответствии с изобретением имеет почти тот же самый уровень антигенной и/или иммуногенной активности, как и дикий тип др41.

Ν и С сегменты, составляющие второй антиген в соответствии с настоящим изобретением, могут происходить из любого белка др41 ВИЧ, включающего штаммы ВИЧ-1 и ВИЧ-2, включающие лабораторные штаммы и первичные изоляты. Предпочтительно, эти сегменты происходят из штамма ВИЧ-1, и в частности из штамма НхВ2 ВИЧ-, такого как описанный в 8ЕЦ ГО Νο. 1.

Нуклеотидные и пептидные последовательности большого количества белков др41 известны и доступны, например, на сайте в Интернете 11ир://\γ\γ\γ.11^γ.1аη^дογ/ и также в соответствующих справочниках Εοδ А1атοδ (ВИЧ 8ециепсе С'отрепбшт 2005 Ьейпег Т., ΕοΕγ В., НаЬи В., Магх Р., МсСи1сйаи Ε., МеШтс 1., ГСЪиивку 8., и Κογ4γ В., Ебз., опубликована ΤΦοιόΙ№1 Βίο1ο§γ апб Вюрйузюз Стир, Εοδ А1атοδ №ι1юпа1 ^аЬο^аΐο^у, ИМ, ЬА-ИК 06-0680).

Любая последовательность, определенная выше и/или в формуле изобретения, в которую введена одна или более чем одна консервативная мутация (которая, по существу, не изменяет иммуногенность), также охватывается вышеприведенным определением.

Аминокислоты пронумерованы со ссылкой на последовательность белка др41, описанную на фиг. 1 (аминокислотная последовательность которого представлена 8ЕЦ ГО Νο. 1).

- 3 025275

В более предпочтительном воплощении второй антиген по изобретению представляет собой последовательность, описанную при помощи 8ЕО ГО Νο. 17 или 8ЕО ГО Νο. 18.

В еще одном аспекте изобретения второй антиген также содержит по меньшей мере один промежуточный пептидный сегмент 8. В специфическом аспекте второй антиген по изобретению представлен при помощи 8ЕО ГО Νο. 19 или 8ЕО ГО Νο. 20 и соответственно назван М0 или М1.

Указанная промежуточная последовательность полезна для обеспечения более хорошей конъюгации, например связывания полипептида с носителем, например виросомой, приводя к тому, что реактивные аминокислоты, по которым осуществляют указанное связывание, становятся более доступными.

В частности, она может дать возможность для перемещения аминокислоты(лот) в том месте, по которому осуществляют указанное связывание, в сторону от мембраны виросомы.

Композиция указанного промежуточного сегмента, например аминокислотная последовательность, также может быть разработана таким образом, чтобы способствовать способу получения полипептида в соответствии с изобретением. В конкретном воплощении изобретения указанный промежуточный сегмент может содержать остатки гистидина, которые могут принимать участие на стадии очистки полноразмерного полипептида (см. ниже в примере 1).

Указанный промежуточный пептид содержит, по меньшей мере, аминокислотную последовательность, описываемую 8ЕО ГО Νο. 9, 8ЕО ΙΌ Νο. 10, 8ЕО ΙΌ Νο. 11 или 8ЕО ΙΌ Νο. 12, на С-концевом фрагменте полипептида по изобретению.

Указанная промежуточная последовательность также может принимать участие в иммуногенности полипептида в соответствии с изобретением.

В предпочтительных воплощениях Ν сегмент представлен аминокислотами 540-592 в др41, где схема нумерации основана на используемом в качестве прототипа изоляте ВИЧ-1 НхВ2 и/или С сегмент представлен аминокислотами 618-664 в др41, где схема нумерации основана на используемом в качестве прототипа изоляте ВИЧ-1 НхВ2.

В соответствии с предпочтительным воплощением Ν сегмент представляет собой последовательность, описываемую 8ЕО ГО Νο. 13 или 8ЕО ГО Νο. 14 и /или С сегмент представляет собой последовательность, описанную в 8ЕО ГО Νο. 15.

В еще одном аспекте изобретения указанный Ь фрагмент представляет собой последовательность, описанную в 8ЕО ГО Νο. 16.

Второй антиген по изобретению способен образовывать тримеры.

В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к водной композиции, содержащей второй антиген по изобретению, где указанный второй антиген образует стабильные тримеры в водной среде.

Настоящее изобретение, в частности, как определено в формуле изобретения, охватывает второй антигенный эквивалент для ранее определенных или описанных, в частности их аналоги, как определено.

В рамках изобретения выражение аналог в отношении производного др41 антигена, как предполагается, относится к пептиду, являющемуся, по существу (по меньшей мере на 85%, в частности по меньшей мере на 90% и конкретней по меньшей мере на 95%), идентичным по аминокислотной последовательности, или гомологичным (т.е. аминокислотный остаток заменен на аминокислотный остаток того же самого семейства, имеющий, например похожую полярность или заряд) аминокислотной последовательности указанного производного др41 антигена и который обладает похожими или консервативными биологическими свойствами, в частности в отношении связывания антигенсвязывающего фрагмента иммуноглобулина, направленного против белка др41.

Олигомерное, например тримерное, состояние второго антигена в соответствии с изобретением может быть определено при помощи способов, хорошо известных специалистам в данной области техники, таких как гель-фильтрация, например ЖЭХБ (жидкостная экспресс-хроматография белков), с разделением от 3000 до 600000 Да.

Стабильность тримеров, образованных вторым антигеном по изобретению, может быть измерена при помощи способов, хорошо известных специалистам в данной области техники, таких как несколько циклов замораживания и оттаивания водной композиции, содержащей второй антиген по изобретению.

Антигены в соответствии с изобретением получают при помощи любого обычного или стандартного способа химического синтеза или генетической инженерии, хорошо известного специалистам в данной области техники.

В соответствии с одной из возможностей антигены продуцируют путем химического синтеза: они могут быть синтезированы в форме единичной последовательности, или в форме нескольких субпоследовательностей, которые затем связываются друг с другом. Химический синтез может быть осуществлен в твердой фазе или в растворе, эти два способа синтеза хорошо известны специалистам в данной области техники. Эти способы в частности описаны в ЛШсгЮп аий 8Ъератй 8οΙίΠ рНаке рерИйе 8уШЪе818 (ГОЬ рге88 Ох&тй, 1989) и в Ηοιι^η\\Ό\'1 МеНюйен йег οτ^ηίδο^η СЪеш1е [Μе!ЪοЙ8 ίη Отдашс СЪеш18Ъу] риЪНзйей Ъу ЕЛУшъсЪ νοί. 15-1 и 11, 81и11даг1. 1974, и также в следующих статьях, которые включены здесь путем ссылки: Р.Е. Ο;·ι\ν8οη е! а1. (8с1епсе 1994; 266(5186), р. 776-779); О.О. ΚοсЪеηйοе^Γе^ е! а1. (1999; 3(6), р. 665-671 ); Р.Е. Οπν8οη е! а1. (2000, 69, Аппи. Ксу. ВюсЪеш., р. 923-960).

В соответствии с еще одной возможностью антигены в соответствии с изобретением продуцируют с

- 4 025275 использованием способов генетической инженерии, хорошо известных специалистам в данной области техники. Когда указанные полипептиды в соответствии с изобретением продуцируют путем генетической инженерии, они могут содержать по концу ΝΗ₂ дополнительный метиониновый остаток, соответствующий трансляции первого кодона инициации.

Эти способы подробно описаны в Мо1еси1аг С1ошпд: руководстве по молекулярной генетике, Машайк е! а1., Со1й 8ртшд НатЬот, 1989. Обычно способ ПЦР (полимеразной цепной реакции) используют для продукции последовательности ДНК, кодирующей полипептиды в соответствии с изобретением в форме, которая может быть встроена в экспрессирующийся вектор. Экспрессирующийся вектор, содержащий интересующую последовательность, затем используют для трансформации клетки-хозяина, что дает воможность для экспрессии интересующей последовательности. Продуцируемые полипептиды затем выделяют из культуральной среды с использованием обычных хроматографических способов, хорошо известных специалистам в данной области техники. Обычно на стадии очистки используют высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ). Как правило, клетки собирают путем центрифугирования по завершении выращивания и суспендируют в нейтральном буфере для последующего разрушения подходящими способами. Клеточный лизат затем центрифугируют для отделения растворимого материала от нерастворимого материала. Анализ при помощи δΌδ-ΡΑΟΕ (электрофорез в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия) супернатанта и осадка после центрифугирования позволяет определить, является ли полипептид растворимым или не растворимым. В том случае, если пептид является нерастворимым, то солюбилизации достигают с использованием буфера, содержащего мочевину, гуанидин или какой-либо другой солюбилизирующий агент. Центрифугирование на этой стадии дает возможность для удаления дебриса и других нерастворимых продуктов, которые могли бы препятствовать проведению хроматографии. На следующей стадии наносят солюбилизированную молекулу на аффинную колонку, которая может иметь тип металлического хелатообразователя в том случае, если множество гистидиновых остатков, такое как в линкерном сегменте Ь, может быть встроено в интересующий полипептид. Система, которая дает возможность для аффинной очистки, может варьировать по своей природе, такой как иммуноаффинность, аффинность с аЬасЬтои Ь1ие (голубой сефарозой) и т.д. На этой стадии полипептид проявляет степень чистоты, близкую или больше чем 80%, в частности по меньшей мере 90%, что может быть определено при помощи колориметрии после δΌδ-ΡΑΟΕ с последующим окрашиванием кумасси голубым. Денситометрическое измерение полос дает возможность для количественной оценки степени чистоты. Степень чистоты также может быть измерена при помощи обращенно-фазовой НРЬС, путем измерения площади различных пиков. Дополнительная хроматографическая стадия может быть добавлена для дополнительной очистки полипептида; например можно упомянуть гель-фильтрацию и обращенно-фазовую хроматографию.

В еще одном воплощении настоящее изобретение также относится к полинуклеотиду, кодирующему определенные выше полипептиды.

Полинуклеотиды по настоящему изобретению включают одноцепочечные и двухцепочечные молекулы ДНК/РНК.

В конкретном аспекте настоящего изобретения полинуклеотид, кодирующий гдр41 в соответствии с настоящим изобретением, описывается 8ЕЦ ГО №. 21 или 8ЕЦ ГО №. 28.

Дополнительные последовательности ДНК, кодирующие модифицированные полипептиды, охватываемые в объеме настоящего изобретения, могут быть легко получены специалистами в данной области техники на основе генетического кода и полипептидных последовательностей, описанных в настоящем описании. Противоположные последовательности РНК могут быть получены путем замены и на Т. Специалистам в данной области техники легко понятно, что ввиду вырожденности генетического кода вариации последовательности возможны между полинуклеотидными молекулами, кодирующими полипептиды в соответствии с настоящим изобретением, в частности полинуклеотидными последовательностями, описанными в настоящем описании.

Наоборот, любому специалисту в данной области техники понятно, что вариации последовательности возможны среди полипептидных молекул, кодируемых полинуклеотидными молекулами в соответствии с настоящим изобретением, в частности полинуклеотидных последовательностей, описанных в настоящем описании, все так же вследствие вырожденности генетического кода.

Все эти вариации охвачены в определении(ях) по изобретению и формуле изобретения, в той степени, в которой эти вариации, по существу, не меняют структуру/конформацию и/или функцию(и), и/или свойства получающегося в результате полипептида по сравнению с теми, которые специфическим образом описаны ранее и/или далее.

В соответствии с одним из воплощений изобретения полинуклеотидную последовательность в соответствии с изобретением получают непосредственно путем химического синтеза (Уоиид Ь. апй Эопд Ц., 2004,-№с1ею Ас1йк Кек., Арг 15; 32(7), Нооует Ό.Μ. апй ЬиЬкотеккт 1. 2002. №с1ею Ас1йк Кек., 30, Уй1а1оЬок А., е! а1., 2006. ВМС ВютГогтайск. 1ип 6; 7:285).

Полученные таким образом полинуклеотидные последовательности по изобретению могут быть введены известным путем в любой подходящий вектор, который обеспечивает возможность для экспрессии указанного полипептида, возможно в модифицированной форме в удобных клеточных системах.

- 5 025275

Полученные таким образом полинуклеотидные последовательности могут быть введены в клеткухозяин таким образом, чтобы трансформировать хозяина и способствовать экспрессии (например, транскрипции и трансляции) введенной последовательности. Векторы включают плазмиды, фаги и т.д. Предпочтительно используют векторы, в которых последовательность ДНК, кодирующая полипептид в соответствии с изобретением, находится под контролем сильного промотора, который может быть индуцируемым или не индуцируемым. В качестве примера промотора, который может быть использован, можно упомянуть промотор Т7 РНК-полимеразы. Экспрессирующиеся векторы могут включать селективный маркер, такой как ген резистентности к ампициллину, тетрациклину или другой ген резистентности к антибиотикам, подходящий для применения у людей. Альтернативно, трансформированные клетки могут быть отобраны благодаря ауксотрофному маркеру, или любому типу средств для отбора без применения антибиотиков (дополнение незаменимого гена, ранее нокаутированного в геноме хозяина).

Примеры экспрессирующихся векторов, которые могут быть использованы, включают плазмиды рЕТ21Ь, рЕТ30 (Ыоуадеи), дрожжевые, бактериальные, вирусные векторы, такие как: бакуловирусы и поксвирусы.

Для того чтобы способствовать экспрессии и очистке антигена в соответствии с настоящим изобретением последний может быть экспрессирован в модифицированной форме, такой как белок слияния, и может включать не только сигналы секреции, но также дополнительные гетерологические функциональные области. Например, область дополнительных аминокислот, в частности заряженных аминокислот, может быть добавлена по Ν-концу полипептида для улучшения стабильности и персистентности в клетке-хозяине.

Задача изобретения также относится к экспрессирующемуся вектору, содержащему описанный выше полинуклеотид.

Указанный вектор может быть использован для трансформации организма хозяина, где указанный организм-хозяин представляет собой еще одну цель настоящего изобретения.

В изобретении также предложена клетка-хозяин, трансформированная указанным вектором. Может быть использована любая клетка-хозяин, обычно используемая в комбинации с экспрессирующимися векторами, описанными выше, например Е. сой, ВЬ21 (ЭЕ3). ВЬК(ОЕЗ), опдапи 2(ΌΕ3), ВасШиз или другие грамположительные хозяева, такие как Ьас1ососси8 1асЙ8, дрожжи, бакуловирус и эукариотические клетки, такие как СНО (клетки яичника китайского хомячка) или Уето. Предпочтительные клеточные системы экспрессии включают Е. сой, такие как ВЬ21 (ΌΕ3).

В еще одном своем аспекте настоящее изобретение относится к конъюгату, где такой конъюгат содержит второй антиген в соответствии с настоящим изобретением.

В конкретном аспекте второй антиген по изобретению конъюгирован с виросомоподобной везикулой.

Виросомоподобная везикула.

Виросомоподобная везикула, подходящая для изобретения, содержит, по меньшей мере, виросомальные липиды и предпочтительно проявляет свойства слитой мембраны.

В соответствии с воплощением виросомоподобная везикула по изобретению может включать моноламеллярный липидный бислой.

В соответствии с воплощением виросомоподобная везикула по изобретению может представлять собой би- или мультиламеллярную везикулу.

В соответствии с одним воплощением, виросомоподобная везикула может иметь диаметр, как правило, находящийся в диапазоне от 50 до 600 нм, и, в частности, диаметр от 100 до 300 нм, и, в частности, от 200 до 400 нм.

Виросомоподобные везикулы по изобретению могут представлять собой сферические моноламеллярные везикулы, имеющие средний диаметр приблизительно 150 нм. Виросомоподобные везикулы содержат включенные в липидный бислой вирусные мембранные белки с или без белков слияния, или их фрагменты.

Предполагается, что выражение белки слияния или их фрагменты относится к белкам или их фрагментам, способным вызывать и/или способствовать реакции слияния мембраны виросомоподобной везикулы и биологической мембраны клетки-мишени.

Например, белки слияния могут представлять собой мембранные гликопротеины вируса гриппа, такие как гемагглютинин (ГА).

В соответствии с воплощением могут использовать по меньшей мере два различных слитых белка или их фрагмента, которые могут демонстрировать различные характеристики слияния.

В соответствии с еще одним воплощением отличительные характеристики слияния могут представлять собой, например, отличающуюся чувствительность к температуре, к концентрации ионов, к кислотности, к типу клеток и к специфичности типа ткани.

В соответствии с воплощением виросомоподобная везикула может содержать белки слияния, которые опосредуют слияние при двух отличающихся температурах.

В соответствии с еще одним воплощением отличающиеся белки слияния с вирусным гемагглютинином (ГА) могут быть использованы для конструирования виросомоподобной везикулы. В качестве примера, молекулы ГА вирионов Х-31 и РК.8/34 могут быть способны катализировать две различные реакции слияния при отличающихся температурах.

- 6 025275

Слитые белки с отличающимися характеристиками слияния могут происходить из различных штаммов вируса гриппа, а также других вирусов, таких как белок ΕΙ вируса везикулярного стоматита (У8У), белковый комплекс оболочки вируса леса Семлики (ЗРУ), или белок Р вируса Сендай.

Антиген, связанный с мембраной виросомоподобной везикулы, может разрушаться в эндосоме и может быть презентирован рецепторам МНС II класса иммунной системы. Антиген, инкапсулированный внутри виросомы, может быть доставлен в цитозоль антигенпрезентирующей клетки при слиянии мембран и разрушен в цитозоле, после чего может быть презентирован антигенами МНС I класса. Также может происходить перекрестное проникновение антигенов, доставляемых виросомами.

Таким образом, виросомоподобная везикула может быть способна вызывать гуморальный и/или клеточный иммунный ответ.

В частности, виросомоподобная везикула может обладать способностью индуцировать продукцию 1дА, такого как секреторный 1дА, а также 1дО или 1дМ. Протоколы приготовления хорошо известны специалистам в данной области техники. Подходящие протоколы для приготовления виросом описаны, например, в АО 2004/045582 или ЕР 0538437, ЕР 1633395, ЕР 1594466, которые включены здесь путем ссылки.

В соответствии с одним из воплощений виросомоподобную везикулу по изобретению могут получать из самой виросомальной везикулы или из везикулы, возникающей в результате слияния виросомальной везикулы с липосомальной везикулой.

Получение виросомальных везикул может быть осуществлено при помощи любого способа, известного специалистам в данной области техники, такого как описанный в 3!едшапи е! а1., ЕМВО I. 6, 1987, по. 9, 2651-9, или бе 1оп§е е! а1., ВюсЫш. ВюрЫь. Ас!а, 1758, 2006, 527-539, включенным здесь путем ссылки. Виросомальные везикулы, например, могут быть восстановлены из исходных липидов мембраны вируса и гликопротеинов вирусной мембраны после солюбилизации, например интактного вируса гриппа с моно-Ы-додецильным эфиром октаэтиленгликоля (ОЭГ), осаждения нуклеокапсида (вирусные гликопротеины и липиды остаются в супернатанте), и удаления детергента из супернатанта с использованием гидрофобной смолы (В1д-Веаб8 Зм2) (3!едшаии Т., е! а1., ЕМВО I. 6, 1987, 2651-9).

Виросомы также могут быть восстановлены из исходных вирусных мембран путем солюбилизации вирусных мембран с короткоцепочечным фосфолипидом, осаждения нуклеокапсида (в супернатанте остаются только гликопротеины вирусной мембраны и липиды), и удаления короткоцепочечного липида из супернатанта путем диализа.

После солюбилизации вируса с детергентом или короткоцепочечным фосфолипидом и удаления нуклеокапсида, как описано выше, антигены или адъюванты, солюбилизированные в детергенте или короткоцепочечном фосфолипиде, могут быть добавлены к супернатанту до удаления детергента или короткоцепочечного липида, что приводит к включению антигена или адъюванта в образованную таким образом виросому. Аналогично, липиды, солюбилизированные в детергенте или короткоцепочечном фосфолипиде, могут быть добавлены к супернатанту для включения в виросомальную мембрану. Приготовление виросомальных везикул, содержащих слитые белки из различных вирусов, может быть осуществлено путем смешивания супернатантов, содержащих солюбилизированные вирусные мембраны, как описано выше, или путем добавления очищенных слитых белков к такому супернатанту до указанного удаления детергента или короткоцепочечного липида.

В соответствии с одним из аспектов виросомоподобную везикулу по изобретению могут получать путем слияния виросомальной везикулы с липосомальной везикулой.

Таким образом, в соответствии с одним из воплощений виросомоподобная везикула по изобретению может включать виросомальные и липосомальные липиды. В соответствии с одним из воплощений виросомоподобная везикула по изобретению может включать липидный бислой, содержащий липиды, выбранные из катионных липидов, синтетических липидов, гликолипидов, фосфолипидов, глицерофосфолипидов, гликосфинголипидов, таких как галактозилцерамид, сфинголипиды, холестерин и их производные.

Фосфолипиды могут включать, в частности, фосфатидилхолин, сфингомиелин, фосфатидилэтаноламин, фосфатидилсерин, фосфатидилглицерин, фосфатидную кислоту, кардиолипин и фосфатидилинозит с варьирующими композициями жирного ацила.

Катионные липиды могут быть выбраны из ΌΟΤΜΑ (Ы-|1-(2.3-диолеилокси)пропил|-Н.Ы.Ытриметиламмония хлорида), ΌΟΤΑΡ (М-[1-(2,3-диолеоилокси)пропил]-М,М,М-триметиламмония хлорида, ΌΟΌΑΟ (Н'Н-диолеил-Н'Н-диметиламмония хлорида), ОПАВ (дидодецилдиметиламмония бромида) и стеариламина или других алифатических аминов и т.д.

Липиды, используемые по изобретению, можно готовить в виде небольших моноламеллярных липосом в смеси с ΌΟΡΕ (диолеоилфосфатидилэтаноламином), который широко используется в качестве вспомогательного липида для облегчения разрушения эндосомальной мембраны.

В соответствии с еще одним воплощением также может быть использован агент, способствующий эмульгации, для улучшения жесткости и/или закрывания везикул. В качестве примера агента, способствующего эмульгации, можно упомянуть холестерин и его производные, такие как, например, сложный эфир холестерина, заряженный или нейтральный в виде сульфата холестерина; производное стерольной цепи, такое как, например производное растительного происхождения, такое как фитостерол (ситосте- 7 025275 рол, сигмастерол); церамиды; и их смеси.

Виросомы или их содержимое может быть подвергнуто гидролизу и физическому разрушению при хранении. В соответствии с одним из воплощений виросомы могут быть подготовлены для длительного хранения путем лиофилизации и разводиться водным раствором перед использованием. Таким образом, перед лиофилизацией могут быть добавлены лиопротекторы, такие как инулин, для того чтобы способствовать сохранению целостности виросомы во время лиофилизации и после разведения (\УПкс1ш1 1. с1 а1., 1. Ырокоте Ке8. 17, 2007, 173-182). Предпочтительно используют лиофилизацию (Атогу ТР. с1 а1. Уассше 17, 2007, 8707-17).

Виросомоподобная везикула по изобретению также может содержать нацеливающую группировку, которая нацеливает указанную везикулу на специфическую клетку или ткань.

В соответствии с одним из аспектов виросомоподобная везикула по изобретению дополнительно может содержать нацеливающую группировку, которая нацеливает указанную везикулу на специфическую клетку или ткань.

Подходящая нацеливающая группировка может быть выбрана из рецептора клеточной поверхности, хемокина, цитокина, фактора роста, антитела или фрагмента антитела, пептидной последовательности имеющей специфичность или специфический заряд, комплементарный молекуле адгезии, такой как интегрин.

Нацеливающая группировка может быть включена в, или присоединена к липидному бислою указанной везикулы при помощи любого из способов, известных специалистам в данной области техники.

В соответствии с одним из воплощений антиген, располагающийся на внешней поверхности виросомоподобной везикулы по изобретению, может быть ковалентно связян с липидом указанной виросомоподобной везикулы, или интеркалирован в липидный бислой указанной виросомоподобной везикулы при помощи пептидного трансмембранного домена.

В соответствии с одним из воплощений антиген может находиться внутри виросомы.

Модификации антигена по изобретению и способы перекрестного связывания указанного модифицированного антигена с внешней поверхностью виросомоподобной везикулы могут быть такими, как описано в νθ 2004/078099.

В соответствии с одним из воплощений антиген может быть ковалентно связан с внешней поверхностью виросомоподобной везикулы путем перекретного связывания с липидом или фосфолипидом. В соответствии с еще одним воплощением антиген может быть ковалентно связан с внешней поверхностью виросомоподобной везикулы путем перекрестного связывания с углеводом. В соответствии с воплощением ковалентно-связанный антиген может содержать по меньшей мере один располагающийся на Сконце перекрестно-связывающий остаток.

Например, перекрестно-связывающий остаток может быть выбран из цистеина (Сук) или лизина (Ьук). В соответствии с еще одним воплощением ковалентно-связанный антиген может также содержать по меньшей мере один промежуточный остаток между указанными располагающимися на С-конце перекрестно-связывающими остатками и соответствующим С-концевым краем антигена.

Подходящий промежуточный остаток может быть выбран, например, из остатков О1у (глицин), А1а (аланин), 8ег (серин), Акр (аспартат), Ьук (лизин), О1и (глутамин), Ηίκ (гистидин), 11е (изолейцин) и Ьеи (лейцин). От 2 до 12, в частности от 3 до 10, и конкретней от 4 до 8 промежуточных остатков могут быть связаны с образованием промежуточных последовательностей. Подходящие промежуточные последовательности могут быть выбраны, например, из 01у-01у или Ьук-01у.

Перекрестное связывание антигена с поверхностью виросомоподобной везикулы может быть осуществлено, например, путем применения амфифильных производных РЕО (полиэтиленгликоль), фосфатидилэтаноламина (ФЭ), фосфатидилхолина (ФХ), фосфатидилсерина, холестерина или их смеси, легко включаемых в липидный бислой. Перекрестное связывание антигена с липидом виросомоподобной везикулы по изобретению может быть осуществлено при помощи любого способа, известного специалистам в данной области техники.

Перекрестное связывание может быть проведено в растворе липида, и липид-пептидный конъюгат может быть затем включен в виросомоподобную везикулу.

В соответствии с воплощением изобретения антиген может быть связан с липидом везикулы по изобретению, например, при помощи бифункционального сукцинатного линкера, в частности [гамма]малеинидомасляной кислоты Ν-гидроксисукцинимидного эфира или Ы-[гамма]-малеимидобутирилоксисукцинимидного эфира.

Антигены, связаные с липидом антигены, фосфолипиды и адъюванты могут быть добавлены к супернатанту, образующемуся после солюбилизации вируса с детергентом или короткоцепочечным фософлипидом, и удаления нуклеокапсида, как описано выше. Виросомы затем могут быть образованы, как описано ранее, путем удаления детергента, например, с использованием Вю-Веабк 8М-2 (Вюгаб), АтЬег1у1е ХМ, или короткоцепочечный фосфолипид может быть удален путем диализа.

Адъюванты.

В соответствии с одним воплощением иммуностимулирующее действие виросомоподобных вези- 8 025275 кул по изобретению может быть дополнительно увеличено путем ассоциации этих виросомоподобных везикул по меньшей мере с одним адъювантом.

Указанный адъювант может быть инкапсулирован внутри и/или включен в липидный бислой и/или свободно комбинирован с указанной везикулой.

В соответствии с одним из воплощений виросомоподобная везикула дополнительно может содержать по меньшей мере один адъювант, усиливающий и/или опосредующий иммунный ответ, выбранный из врожденного иммунного ответа и/или адаптивного иммунного ответа.

Используемые адъюванты могут усиливать иммунологический ответ путем активации антигенпрезентирующих клеток (АПК), макрофагов и/или стимулирующих специфических наборов лимфоцитов.

Адъювант, который может быть подходящим согласно настоящему изобретению, может представлять собой любой лиганд, подходящий для активации рецептора, распознающего патоген (РКК - рабюдеп гесодшйои гсссрЮг). экспрессирующегося в и на дендритных клетках (ДК), Т-клетках, В-клетках или других антигенпрезентирующих клетках.

Лиганды, активирующие путь, опосредованный рецептором нуклеотид-связывающего домена олигомеризации (ΝΘΌ), могут быть подходящими для задач изобретения. Адъюванты, подходящие для этих лигандов, могут представлять собой мурамилдипептидные производные. Лиганды, активирующие То11подобные рецепторы (ТЬК - 1о11-Пкс гесер1ог8), также могут быть подходящими для задач изобретения. Эти рецепторы представляют собой члены семейства РКК и широко экспрессируются множеством клеток врожденного иммунитета, включающих ДК, макрофаги, тучные клетки и нейтрофилы.

В качестве примера лигандов, активирующих ТЬК, можно упомянуть для ТЬК4 монофосфориллипид А, 3-О-деацитилированный монофосфориллипид А, липополисахариды (ЬР§) Е. сой, таксол, белок слияния респираторно-синцитиального вируса (К§У), и белки теплового шока 60 и 70, для ТЬК2 липопептидов, таких как ГОпальмитоил-8-2,3(биспальмитоилокси)пропилцистеинилсерил-(лизил)₃-лизин, пептидогликан §1арйу1ососси8 аигеиз, липопротеины М. 1иЬегси1о818, и зимозан Засйаготусез сегеу181ае, и высокочистые ЬР8 Р. дшдуайз, для ТЬК3 двухцепочечная РНК, для ТЬК5 флагеллин, для ТЬК7 синтетические соединения, такие как имидазохинолины, и для ТЬК9 некоторые типы СрС-обогащенной ДНК. Другие полезные для изобретения адъюванты могут представлять собой Т-хелперные эпитопы.

Т-хелперный эпитоп представляет собой пептид, обычно происходящий из экзогенных белков, которые претерпевают протеолитическое расщепление и процессинг в пути эндоцитоза антигенпрезентирующих клеток (АПК). В этих клетках главный комплекс гистосовместимости II класса (МНС II) ассоциируется с этими пептидами в эндосомах. Этот комплекс, который переносится на поверхность АПК, может взаимодействовать со специфическим Т-клеточным рецептором СИ4+ Т-лимфоциов, приводя к их активации. В зависимости от хелперного эпитопа Т-клеточный ответ может представлять собой ответ Тй1 и/или Тй2 типа, как известно в области техники.

В качестве примера эпитопа Тй-ориентированного ответа можно упомянуть пан эпитоп ИК хелперной Т-клетки (РАЙКЕ - Рап ИК ерйоре). Этот эпитоп сконструирован таким образом, что связывается с наиболее обычными молекулами НЬА-ИК с высокой аффинностью и действует в качестве сильного иммуногена. Показано, что эпитоп РАИКЕ НТЬ увеличивает силу вакцин, разработанных для стимуляции клеточного иммунного ответа (А1ехапбег I. е1 а1., Iттиηо1. Кез. 18, 1998, 79-92).

В соответствии с воплощением адъювант, который может быть использован с виросомоподобными везикулами по настоящему изобретению, может быть выбран из солей алюминия, алюминийфосфатных гелей, микобактерий, таких как ВСС, М. уассае, или СогупеЬас1епит рагуцт, пептидов, гемоцианина лимфы улитки, дипептидных и трипептидных производных мурамила, монофосфориллипида А, интерлейкина-2 (ЕЛ-2), ГЕ-12, колониестимулирующего фактора гранулоцитов-макрофагов (СМ-С8Р дгаии1осу1е-тасгорйаде со1опу 8Йти1айид Гас1ог), лигандов хемокинового семейства, таких как КАЭТЕ§ (регулируемый при активации, экспрессируемый и секретируемый нормальными Т-клетками - Кеди1а1еб ироп Асйуайоп №гта1 Т се11 Ехргеззеб апб §есге1еб), липопротеина грамположительных бактерий, компонента клеточной стенки дрожжей, двухцепочечной РНК, липополисахарида грамотрицательных бактерий, флагеллина, И-обогащенной одноцепочечной вирусной РНК, СрС содержащей ДНК, сурессирующей цитокиновый 6Г сигнальный путь малой интерферирующей РНК (8ОС8 δίΕΝΑ - Зирргеззог оГ С’уЮкше §1дпайшд зта11 иНегГеппд ΕΝΑ), пептидов-производных меллитина, пан ИК эпитопа (РАИКЕ) и их смесей.

Такие препараты могут также стандартно содержать фармацевтически приемлемые концентрации солей, буферных агентов, антиоксидантов, консервантов, совместимых носителей, адъювантов, как ранее описано, и возможно другие терапевтические агенты.

Виросомоподобные везикулы по изобретению и, в частности, содержащие их фармацевтические композиции могут вводить путем инъекции или через слизистую оболочку, или с помощью комбинации этих путей.

Путь инъекции может быть, например, интраперитонеальным, внутрикожным, подкожным, внутрисосудистым или внутримышечным путем.

Могут использовать любой путь введения через слизистую оболочку, например мочеполовой путь, такой как, например, влагалищный путь, желудочно-кишечный путь, аноректальный путь, респираторный путь, через слизистые оболочки верхних дыхательных путей, назально-ротовой путь и их смеси.

- 9 025275

В одном из воплощений первый и второй антиген по изобретению могут быть представлены в виде лекарственных форм для перорального введения, таких как таблетки, капсулы (каждая из которых включает препараты с рассчитанным по времени высвобождением и препараты с замедленным высвобождением), пилюли, порошки, гранулы, эликсиры, настойки, растворы, суспензии, сиропы и эмульсии.

В соответствии с настоящим изобретением указанный первый антиген и указанный второй антиген по изобретению могут быть введены вместе одному и тому же пациенту в одной дозе или в отличающихся дозах в соответствии со способом по настоящему изобретению.

В конкретном воплощении указанное совместное введение указанного первого и второго антигенов может быть осуществлено по меньшей мере двумя различными путями одновременно или в соответственно различные или следующие друг за другом моменты времени.

В еще одном воплощении изобретение охватывает совместное введение указанного первого и второго антигенов системным путем, таким как инъекция, например внутримышечным путем и местным путем, таким как через слизистый эпителий, например путем интраназальной ингаляции.

Указанное совместное введение одному пациенту указанного первого и второго антигена могут быть осуществлено одним и тем же путем, например системным путем, одновременно или соответственно различными или следующими друг за другом моментами времени.

Профилактический способ по изобретению для реализации ίη νίνο по меньшей мере одной из следующих функций:

а) индукция врожденного или адаптивного иммунного ответа, такого как продукция системных и/или антител к слизистым, содержащих изотипы 1дА и/или 1дС. против ВИЧ-1;

б) контроль и/или устранение виремии у пациента, инфицированного ВИЧ-1;

в) блокирование или уменьшение проникновения вируса ВИЧ через слизистый эпителий;

г) предупреждение или уменьшение первичной ВИЧ инфекции в собственной пластинке под слизистым эпителием;

д) предупреждение или уменьшение миграции вируса в кишечник и в лимфатические узлы;

е) предупреждение или уменьшение проникновения ВИЧ инфекции в лимфатические узлы;

ж) запуск иммунного ответа на слизистой оболочке против ВИЧ-1 в половых органах и кишечнике;

з) усиление системного иммунного ответа и иммунного ответа на слизистых оболочках против

ВИЧ;

и) контроль над ВИЧ инфекцией, такой как достижение замедления, прерывания или ослабления инфекции;

к) предупреждение ВИЧ трансцитоза;

л) нейтрализация ВИЧ инфекции ίη νίνο.

м) индукция антителзависимой клеточной цитотоксичности.

В концепции изобретения предполагается, что выражение адаптивный иммунный ответ относится к иммунному ответу, основанному на активации компонента иммунной системы, придающего специфичность и память в отношении антигена или патогена.

Такой ответ может быть высокоспецифичен в отношении антигена или патогена, и более эффективен при втором и последующих контактах с антигеном или патогеном. Такой адаптивный иммунный ответ может быть основан на активации лимфоцитов, таких как Т-клетки или В-клетки.

В концепции изобретения предполагается, что выражение врожденный иммунный ответ относится к ответу, основанному на неспецифической системе распознавания и не меняется при последующем контакте с антигеном или патогеном.

Такая система может быть основана на клетках иммунной системы, таких как, например, моноциты, макрофаги или естественные киллеры (ΝΚ), или естественные киллеры Т (ΝΚΤ) клетки.

В еще одном аспекте изобретение относится к набору для применения вышеописанного терапевтического способа, содержащему указанный первый и второй антиген.

Настоящее изобретение также относится к терапевтической композиции или препарату, содержащему первый антиген и второй антиген, как описано выше.

В специфическом аспекте указанный первый антиген и указанный второй антиген представлены в одинаковых дозах или соответственно отличающихся дозах или лекарственных формах.

Настоящее изобретение в еще одном воплощении относится к терапевтической, в частности профилактической вакцинной ассоциации, в которой содержится первое лекарственное средство, содержащее первый антиген, как определено выше, и второе лекарственное средство, содержащее второй антиген, как определено выше.

Настоящее изобретение дополнительно поясняется при помощи следующих примеров, которые представлены для задач иллюстрирования, и их не следует интерпретировать, как ограничивающие объем настоящего изобретения.

- 10 025275

Краткое описание фигур

Фиг. 1 - диаграмма структуры ВИЧ-1 гликопротеина оболочки др41 монофилетической группы В, штамма НхВ2, представляющая хорошо известные эпитопы, кластеры и идентифицированные области. Светлые кружки соответствуют неизменным аминокислотам, светло-серые кружки соответствуют высококонсервативным аминокислотам, умеренно-серые кружки соответствуют умеренно варабельным аминокислотам, темные кружки соответствуют неизменным аминокислотам, и аминокислоты, которые значительно более изменчивы в одной монофилетической группе, нежели чем в другой, изображены как сильно выделенные контуром кружки. Часть области ПМЭД, содержащая эпитопы для нейтрализующих антител широкого спектра действия 2Р5 и 4Е10, и представленная в пептиде Р1 по настоящему изобретению, изображена слева внизу; эта часть отсутствует в §р41 полипептиде по изобретению. Аминокислоты из кластера 1 заменены на линкер в §р41 белковых конструкциях по изобретению;

фиг. 2 - перекрестная реактивность дикого типа §р41 и производных с моноклональным антителом против §р41, МАЬ 98.6 (слева) и антителом против-1Ь2, АЕ-202 (справа);

фиг. 3 демонстрирует 1§А в образцах сыворотки крови макак, иммунизированных гдр41виросомами и Р1-виросомами при помощи внутримышечной инъекции (обезьяны 02.1-2.6), по сравнению с сывороткой крови макак, иммунизированных виросомами путем комбинированной внутримышечной и интраназальной инъекции (03.1-3.6). Группа 1 (01.1-1.6, плацебо) представляет собой контрольную группу; этих животных внутримышечно иммунизировали обычными виросомами вируса гриппа, лишенными антигенов ВИЧ. Данные приведены для образцов сыворотки крови, отобранных на 24 неделю, и ΘΌ для уровня до иммунизации (неделя 0) вычитали из значений ΘΌ для 24 недели (те24-теО). Разведение образца 1:300;

фиг. 4 - 1§0, измеренные в образцах сыворотки крови макак, иммунизированных гдр41-виросомами, смешанными с Р1-виросомами, путем внутримышечной инъекции (обезьяны 02.1-2.6), по сравнению с сыворотками крови макак, иммунизированных виросомами, путем комбинированной внутримышечной и интраназальной инъекции (03.1-3.6). Группа 1 (обезьяны 01.1-1.6) представляют собой контрольную группу (плацебо), внутримышечно иммунизированную виросомами вируса гриппа. Данные приведены для образцов сыворотки крови, отобранных на 24 неделю, и 0Ό для уровней до иммунизации (неделя 0) вычитали из 0Ό на 24 неделю (те24-теО). Разведение образца 1:900;

фиг. 5 - виремия во время и после внутривагинальных иммунизации ЗН1УЗР162Р3 монофилетической группы В. Стелки указывают на 13 вагинальных иммунизации 20-30 ТСГО₅₀, начиная через месяц после последней из четырех вакцинаций, сутки после исходной иммунизации обозначаются косым шрифтом. Вирусная нагрузка в плазме крови указана линиями для отдельных животных; предел обнаружения 2,5х10³ копий на мл обозначен прямой линией. Линии с символами обозначают отдельных животных, группы как на фиг. 3 и 4;

фиг. 6 - ингибирование трансцитоза ВИЧ-1 через эпителиальные клетки посредством шеечновлагалищных секреций (СУЗ - сегу1соуа§1па1 кесгейопк). Панель А: штамм ВИЧ-1 93ВК029 (монофилетическая группа В) Панель В: штамм ВИЧ-1 92ВК025 (монофилетическая группа С). Заполненные столбцы: СУЗ использовали с разведением 1:6, пустые столбцы 1:10. В отсутствие специфических антител 1дА против др41 способность трансцитоза ВИЧ-1 составляет >100%, тогда как в присутствии специфических 1§А против др41 трансцитоз может быть уменьшен >40% для СУЗ, разбавленной 1:6;

фиг. 7 - ингибирование трансцитоза через эпителиальные клетки посредством секретов СУЗ с или без истощения 1§А. Заполненные столбцы: с истощением, заштрихованные столбцы - без истощения. Когда СУЗ содержала антитела 1дА слизистой оболочки, то может быть обнаружено ингибирование трансцитоза ВИЧ-1. Когда 1дА истощались в СУЗ, то утрачивалось ингибирование трансцитоза;

фиг. 8 - панель А: виремия после сенсибилизацией вирусом монофилетического штамма С штаммом ЗН1У11571рб3Ы4 невакцинированных обезьян; панель В: виремия у обезьян, вакцинированных виросомами, производными антигенов §р41 монофилетической группы В (группа 3 в примере 6) и сенсибилизированных ЗН1У монофилетической группы С штаммом ЗН1У11571рб3Ы4. Через 18 месяцев после четвертой вакцинации животные получали бустерную вакцинацию и через пять недель их 10 раз внутривагинально сенсибилизировали 10-20 ТСГО₅₀. Вирусная нагрузка в плазме крови указана линиями для индивидуальных животных; предел обнаружения составляет 10³ копий на 1 мл.

Примеры

Пример 1.

Создание М0 и М1, полипептида по изобретению (гдр41), кодируемого ЗЕЦ ГО Νο. 28 и ЗЕЦ ГО N0 21, при помощи молекулярной биологии.

а) Первая стадия: конструирование цр41-б1оор (ЗЕЦ ГО Νο. 27).

Петлю §р41-дельта конструировали при помощи ПЦР.

Конструирование праймеров.

Олигонуклеотидный праймер §р41-№е (ЗЕЦ ГО №. 22) и олигонуклеотидный праймер §р41-Ват1 (ЗЕЦ ГО №. 23) использовали для амплификации Ν-спирали и введения гидрофильного линкера. Эти олигонуклеотидные праймеры сконструированы для соответствующего введения сайтов для рестриктаз №е! и ВатН1. Олигонуклеотидный праймер §р41-Ват1 также сконструирован для введения олигопеп- 11 025275 тидного линкера δΟΟΚΟΟδ (δΕΟ ΙΌ Νο. 16) для замены удаленного фрагмента петли.

Олигонуклеотидный праймер др41-Ват2 (δΕΟ ΙΌ N0. 24) и олигонуклеотидный праймер др41 Χ1οΙ (δΕΟ ΙΌ Νο. 25) использовали для амплификации С-спирали др41 при помощи ПЦР. Эти олигонуклеотидные праймеры сконструированы для введения сайтов рестрикции рестриктазами ВатН1 и Хйо1, соответственно.

Условия ПЦР.

Полинуклеотид §р41й1оор амплифицировали на матрице др41 (δΕΟ ΙΌ Νο. 26) при помощи ПЦР с использованием описанных выше олигонуклеотидных праймеров. Плазмиду использовали в концентрации 0,5 мкг/мкл, каждый из праймеров использовали в концентрации 10 мкМ и каждый из άΝΤΡ использовали в концентрации 10 мМ. Амплификацию проводили с использованием ДНК-полимеразы Эу№-1/утс из Ртп/утс5. Амплификацию инициировали со стадии денатурации в течение 5 мин при 94°С, а затем последовали 30 циклов, каждый из которых содержал одну стадию длительностью одна минута при 94°С (стадия денатурации), одну стадию длительностью одна минута при 60°С (гибридизация), и одну стадию длительностью одна минута при 72°С (элонгация), и амплификацию останавливали на последней стадии длительностью 10 мин при 72°С. Очищенные продукты ПЦР разрезали при помощи Νάβ1 (О/уте, Κ0111δ) и Х1ю1 (О/уте, Κ0146δ) для встраивания рБТ21Ь. Вектор рБТ21Ь (Шеадсп) разрезали при помощи Νάβ1 и Χ1ο1, и продукты ПЦР экстрагировали и очищали. Лигирование осуществляли с использованием Ошек 1ί§αΙίοη ΚίΙ (Νον Бид1аий ВЫаЬк) в соответствии с предписаниями производителя, приводя в результате к рΕΤ21Ь-др41ά1οοр.

Продукты рΕΤ21Ь-др41ά1οοр трансформировали ЭН5-а1рйа Отйгодеп).

б) Вторая стадия: конструирование Μ0^р41С-ά1οοр монофилетической группы В (δΕΟ ΙΌ Νο. 28), кодирующей полипептид М0 (гдр41 в соответствии с изобретением).

Две ПЦР осуществляли на матрице СΡ41ά1οοр (δΕΟ ΙΌ Νο. 27) с получением конструкции М0др41С_С1айеВ с использованием полимеразы Рйикюи (Рн1п/утс5). Первую реакцию осуществляли с праймерами: СР41В-С-О1 (δΕΟ ΙΌ Νο. 29) и СР41В-С-К2 (δΕΟ ΙΌ Νο. 30).

Вторую реакцию осуществляли с праймерами: СР41В-С-О1 (δΕΟ ΙΌ Νο. 29) и СР41В-С-К1 (δΕΟ ΙΌ Νο. 31).

Положительные продукты ПЦР разрезали с использованием рестриктаз Ше1 (О/уте, Κ0111δ) и Χ1ο1 (О/уте, Κ0146δ) для встраивания гена, кодирующего Ср41С_С1айеВ, в рЕТ30Ь (УАК, 69910-3). Вектор рЕТ30Ь расщепляли с использованием рестриктаз Ше1 Х1ю1 (О/уте). Фрагенты ДНК, соответствующие гену Ср41С_С1айеВ и рЕТ30Ь, экстрагировали и очищали (с использованием набора для экстракции от Масйегеу-№де1, 740 609 250). Лигирование этих двух фрагментов осуществляли с использованием набора Ошск Π^ηΟοη (№ν Бпд1аиЙ8 Вю1аЬ8 Шс, Μ2200δ). 1 мкл смесей для лигирования использовали для трансформации Е. той ОН5-а1рйа Отйгодеп, 12297-016). Трансформанты выделяли на планшетах с агаром БВ с 30 мкг/мл канамицина. Выделенные колонии инокулировали в 4 мл среды БВ, дополненной 30 мкг/мл канамицина. Выращивание осуществляли в течение ночи при 37°С и 180 об/мин. Экстракцию ДНК из соответствующих осадков осуществляли в соответствии с протоколом, приведенным в наборе для экстракции ΝικΚοφίη Р1а8тШ ех1гас1юи кй от Масйегеу-№де1, КеЕ 740588-250. ДНК анализировали с расщеплением рестриктазами и встроенные последовательности секвенировали с использованием праймеров Т7ргот (δΕΟ ΙΌ Νο. 32) и Т7!егт (δΕΟ ΙΌ Νο. 33).

Определяли полную нуклеотидную последовательность Μ0др41ά1οοр-С монофилетической группы В, и она представлена на δΕΟ ΙΌ Νο. 28.

в) Третья стадия: конструирование Μ1др41С-ά1οοр монофилетической группы В (δΕΟ ΙΌ Νο. 21), кодирующей полипептид М1 (гдр41 в соответствии с изобретением)

Μ1др41С-ά1οοр монофилетической группы В конструировали при помощи ПЦР. Две ПЦР осуществляли на матрице Ср41ά1οοрС_С1аάеВ (δΕΟ ΙΌ Νο. 28) с получением Μ1др41С-ά1οοр монофилеотической группы В с использованием полимеразы Рйикюи (Ртп/уте5).

Первую реакцию осуществляли с праймерами: СР41В-С-О1 (δΕΟ ΙΌ Νο. 29) и СР41-С3-К1 (δΕΟ ΙΌ Νο. 34).

Перед второй реакцией ПЦР очистку осуществляли с использованием набора тс^ярт ех!гас1 к11 (Масйегеу №де1, 740609250) со следающими праймерами: СР41В-С-О1 (δΕΟ ΙΌ Νο. 29) и СР41-С3-К2 (δΕΟ ΙΌ Νο. 35).

Положительные продукты ПЦР разрезали с использованием рестриктаз Ше1 (О/уте, Κ0111δ) и ΧΗο1 (О/уте, Κ0146δ) для встраивания гена, кодирующего Μ1др41ά1οοр-С монофилетической группы В, в рЕТ30Ь (УАК, 69910-3). Вектор рЕТ30Ь расщепляли с использованием рестриктаз Ше1 Χ1ο1 (О/уте). Фрагменты ДНК, соответствующие гену Μ1др41ά1οοр-С монофилетической группы В и рЕТ30Ь, экстрагировали и очищали (с использованием набора для экстракции от Масйегеу-№де1, 740 609 250). Лигирование этих двух фрагментов осуществляли с использованием набора Ошск йда1юи (№у Бпд1аиЙ8 Вю1аЬ8 Шс, Μ2200δ). 1 мкл смесей для лигирования использовали для трансформации Е. той ОН5-а1рйа (ΙηνίίΓοдеп, 12297-016). Трансформанты выделяли на планшетах с агаром БВ с 30 мкг/мл канамицина. Выделенные колонии инокулировали в 4 мл среды БВ, дополненной 30 мкг/мл канамицина. Выращивание осуществляли в течение ночи при 37°С и 180 об/мин. Экстракцию ДНК из соответствующих осадков осущест- 12 025275 вляли в соответствии с протоколом, приведенным в наборе для экстракции Жс1еокрш ИакшШ ехйасйои кб от МасксгсуАадск Ке£. 740588-250. ДНК анализировали с расщеплением рестриктазами и встроенные последовательности секвенировали с использованием праймеров Т7ргот (8ЕЦ ГО Νο. 32) и Т71сгт (8ЕЦ ГО Νο. 33).

Определяли полную нуклеотидную последовательность М1др41б1оор-С монофилетической группы В, и она представлена на 8ЕЦ ГО Νο. 21

Пример 2. Репродукция модифицированного полипептида в Е. сой.

а) Трансформация.

Плазмиду рЕТ30Ь- М0др41б1оор-С монофилетической группы В или рЕТ30Ь- М1др41б1оор-С монофилетической группы В трансформировали в экспрессирующийся штамм Е. сой ВЬК (ЭЕ3). Экспрессией М1др41б1оор-С и М0др41б1оор-С монофилетической группы В управляли при помощи промотора 17.

б) Тесты экспрессии.

Шесть культур Е. сой штамма ВЬК (ЭЕ3), несущих плазмиду рЕТ30Ь-М1др41б1оор-С монофилетической группы В или рЕТ30Ь-М0др41б1оор-С монофилетической группы В выращивали при 37°С в бульоне Луриа с 30 нг/мл канамицина до достижения оптической плотности при 600 нм 0,6 (спектрофотометр 1аксо У-530). Модифицированный полипептид индуцировали при помощи 1 мМ 1РТО (изопропил β-Ό-тиогалактозид), и выращивание продолжали в течение еще 2 ч при 37°С. Экспрессию белков контролировали путем разделения на δΌδ-4-12% РАСЕ.

с) Продукция.

1) Культивирование. Один литр культуры ВЬ21 (ЭЕ3)/ рЕТ30Ь-М1др41б1оор-С монофилетической группы В или (ЭЕ3)/рЕТ30Ь-М0§р41б1оор-С монофилетической группы В выращивали в бульоне Луриа при 37°С до достижения оптической плотности при 600 нм 6,0. Экспрессию сконструированной при помощи генетической инженерии др41 - петли индуцировали при помощи 1 мМ 1РТС, и выращивание продолжали в течение еще 2 ч при 37°С. Культуру центрифугировали (центрифуга Весктап СоиНег Ауаий 120ХР с ротором ША 8-1000,4000/§, 30 мин, 4°С) и осадок хранили при -80°С.

2) Экстракция модифицированных полипептидов МО или М1 гдр41. Осадок ресуспендировали буфером для ультразвуковой обработки (40 мл Тйк-НС1 50 мМ рН 8, №гС1 300 мМ). Бактерии разрушали при помощи ультразвуковой обработки в течение 15 мин на льду/этаноле (амплитуда разрушителя ПР2008 80%, коэффициент 0,5). Затем суспензию центрифугировали при 40000/д в течение 30 мин при 4°С для отделения растворимых белков (супернатанта) от нерастворимых белков (осадка) (центрифуга Весктап СоиИет Ауаий 120ХР с ротором 1А20).

г) Очистка модифицированного полипептида М1 гдр41.

1) Аффинная хроматография.

Первую стадию очистки М1 (кодируемого М1др41б1оор-С монофилетической группы В, §ЕЦ ГО Ж. 21) осуществляли при помощи аффинной хроматографии на среде Νί Зерйатоке™ 6 Рак! Иоте, помещенной в колонку ХК16/20 (СЕ Неаййсате) с объемом колонки 1 мл среды на 1 л культуры в колбах. Специфический спейсерный пептид δ дал возможность для использования стадии аффинной хроматографии в качестве стадии захвата для получения растворимой фракции М0 или М1. Эта процедура подходит ввиду низкой продуктивности белка. Колонку уравновешивали 50 мМ Ш-фосфатным буфером с рН 7,5, №гС1 300 мМ, β-меркаптоэтанол 5 мМ. Очищенные образцы пептида М1 в 50 мМ Ш-фосфатном буфере с рН 7,5, №гС1 300 мМ, р-меркаптоэтанол 5 мМ, М§С1₂ 2 мМ, лейпептином и пепстатином 0,1 мМ наносили на колонку со скоростью 2 мл/мин. Колонку затем промывали буфером для уравновешивания и осуществляли элюцию 25, 50 и 150 мМ имидазолом. М1 др41 элюировали 50 мМ Ш-фосфатным буфером с рН 7,5, №гС1 300 мМ, β-меркаптоэтанолом 5 мМ, имидазолом 300 мМ со скоростью 4 мл/мин. Ттеееи®20 в конечной концентрации 0,05% добавляли к объединенной после аффинной хроматографии фракции, и диализ проводили в течение ночи при 4°С при медленном перемешивании на магнитной мешалке против 50 мМ №г-фосфатного буфера при рН 7,5, №гС1 300 мМ, ТСЕР 1 мМ, Ттеееи 20 0,05%. Образцы затем концентрировали в три раза путем центрифугирования в модуле для концентрирования Аписоп 10 кДа (Мййроге).

2) Гель-фильтрация.

Вторую стадию очистки М1 осуществляли путем гель-фильтрации с использованием сред δире^άе\™ 200 Ргер дтайе, упакованных в колонку ХК 26/60 (СЕ НеаИйсаге), имеющую объем 320 мл. Колонку уравновешивали 50 мМ Ш-фосфатным буфером с рН 7,5, №гС1 300 мМ, ТСЕР 1 мМ, Ттеееи20 0,05%. М1 в 50 мМ Ш-фосфатном буфере с рН 7,5, №С1 300 мМ, ТСЕР 1 мМ, Ттеееи 20 0,05% наносили на колонку со скоростью 1,5 мл/мин и элюировали уравновешивающим буфером со скоростью 2,5 мл/мин. В соответствии с калибровочной кривой белок элюировали в виде растворимых тримеров. Таким образом, присутствие спейсера, содержащей цистеиновый остаток по С-концевому фрагменту М1 или МО, не модифицировало конформационное состояние белка.

Пример 3. Перекрестная реактивность.

Четыре белка наносили на нитроцеллюлозную мембрану: те! др41-НА (нативный §р41, слитый с последовательностью НА (СеиВаик АР348176) в 50 мМ Тпк с рН 8, №гС1 200 мМ, Ттйои Х-100 0,1%, 0,1

- 13 025275 мг/мл, петля 0р41-дельта (δΕΟ ΙΌ Νο. 38), который отличается от нативного фрагмента др41 на фиг. 1 в основном путем замены 25 остатков в кластере I на линкер δΕΟ ΙΌ Νο. 16 в Τήδ 50 мМ рН 8, Ν;·ιΟ 200 мМ, глицерин 5%, 0,2 мг/мл, 0р41-сконструированная петля (δΕΟ ΙΌ Νο. 37), которая отличается от нативного фрагмента др41 на фиг. 1 в основном путем замены 12 остатков в кластере I на линкер δΕΟ ΙΌ Νο. 16) в 50 мМ Τήδ с рН 8, ΝαΟ 200 мМ, имидазол 200 мМ, глицерин 5%, 0,2 мг/мл, человеческий рекомбинантный ΙΌ-2 в 50 мМ Τήδ рН 8, ΝαΟ 200 мМ, 0,1 мг/мл и отрицательный контроль (бычий сывороточный альбумин) (фиг. 2).

Мембрану инкубировали при 37°С и затем помещали в 20 мл ΡΒδ Т\\сеп 0,3%, 5% молоко в течение еще одного часа при встряхивании. Антитела 98.6 Ό (человеческое моноклональное антитело против 0Ρ41 из ΝΙΒδΟ, ИК) и АР-202 (антитело против человеческого ΙΌ-2 из К & Ό δуδΐетδ) добавляли в конечной концентрации 0,05 или 0,5 мкг/мл соответственно, в 20 мл ΡΒδ/Тгееп 20 0,3-5% молоке в течение одного часа при встряхивании. Подходящую концентрацию антитела против Ι§0, связанного с перокисдазой, добавляли в 20 мл ΡΒδ Т\\ееп 0,3%, молоко 5%, с встряхиванием в течение одного часа, и блот трижды промывали в течение 15 мин каждый раз в ΡΒδ Т\\ееп 0,3%. Две пероксидазные активности затем выявили при помощи имеющегося в продаже усиленного хемилюминисцентного набора (АтегеЬат), и пленку Койак приводили в контакт с блотом, как известно в области техники.

В соответствии с представленным на фиг. 2 нативный 0р41 уверенно распознается антителом против человеческого ΙΌ-2, замена 25 остатков в кластере Ι прекращает распознавание этого белка человеческим антителом против ΙΌ-2, замена 12 остатков в кластере Ι частично устраняла реактивность человеческого антитела против ΙΌ-2, рекомбинантный человеческий ΙΌ-2, как ожидают, в значительной степени распознается АР-202 антителом против Ιί-2. Тем не менее замена 12 или 25 аминокислот на линкер не влияет на распознавание моноклональным антителом к др41 98.6.

Пример 4. Тест растворимости полипептида гдр41.

Культуры Ε.οοίί. экспрессирующие полипептид др41 в соответствии с изобретением, центрифугировали при 4000 д при 4°С в течение 15 мин. Осадки суспендировали в объеме лизирующего буфера: 50 мМ фосфат рН 7,5, №С1 300 мМ, МдС1₂ 2 мМ, бета-меркаптоэтанол 5 мМ, бензоназа 1 мкМ, пепстатин 1 мкМ, лейпептин 1 мкМ для достижения ΟΌ 600 нм = 10. Раствор инкубировали при 4°С в течение 30 мин.

Клеточный лизис осуществляли при помощи трех циклов замораживания/оттаивания. Растворимые и нерастворимые белки разделяли в течение 30 мин путем центрифугирования при 21000 д при 4°С. Десять микролитров белков анализировали для определения уровня экспрессии и растворимости с помощью 4-12% δΌδ-ΡΛ0Ε с последующим окрашиванием кумасси голубым. Как обнаружено, полипептид гдр41 представлен в супернатанте. Таким образом, белок является растворимым.

Пример 5. Получение виросомоподобных везикул, презентирующих др41 полипептид, продуцируемый в Е. οο1ί, на внешней поверхности ( гдр41-виросомы), и получение виросом, презентирующих синтетический пептид на внешней поверхности (Р1-виросомы).

Виросомоподобные везикулы готовили, по существу, как описано в АО 2007/099387. Вкратце, вирус гриппа Λ/δ^ηдарο^е/6/86 выращивали в яйцах с развивающимся эмбрионом и инактивировали бетапропиолактоном, как известно в области техники. Вирус растворяли в 100 мМ окстаэтиленгликольмонодецилэтилового эфира (ОЭГ) в физиологическом растворе, забуференном фосфатом (ΡΒδ), и вирусный нуклеокапсид удаляли путем ультрацентрифугирования. Солюбилизированные мембраны, содержащие 4 мг гемагглютинина, смешивали с 32 мг яичного фосфатидилхолина (ФХ) и 8 мг фосфатидилэтаноламина (ФЭ), растворенного в 2 мл ΡΒδ, содержащего 100 мМ ОЭГ. Раствор, содержащий фосфолипиды и гемагглютинин, как описано выше, смешивали и подвергали ультразвуковой обработке в течение 1 мин. Этот раствор центрифугировали в течение 1 ч при 100000 д и препарат вирусной мембраны/липидную смесь стерилизовали путем фильтрования.

Полипептид по настоящему изобретению, содержащий спейсер и цистеиновый остаток в Сконцевой позиции (δΕΟ ΙΌ ΝΟ 19), конъюгировали через малеимидо-сукцинимидный линкер по Ν-концу с региоизомером фосфатидилэтаноламина (ФЭ) в соответствии со следующим.

Фосфатидилэтаноламин (ФЭ) растворяли в метаноле и добавляли 0,1% (об./об.) триэтиламин. Раствор затем смешивали с гетеробифункциональным перекрестным линкером ^[гамма]малеимидобутирилоксисукцинимидным эфиром (ГМБС) ^егсе Скет1са1 ^трапу, ΡοοΗοΓύ, ΙΌ) (отношение ФЭ: ГМБС = 5:1), который ранее растворяли в диметилсульфоксиде (ДМСО) (20 мкл). После инкубации в течение 30 мин при комнатной температуре растворители упаривали в течение 1 ч в вакууме в центрифуге δрееάνас. Затем добавляли ГМБС-ФЭ, растворенный в 1 мл ΡΒδ, содержащем 100 мМ октаэтиленгликоль (ОЭГ) (Р1ика Скеткак, δ^ί^τ^ά), (ΡΒδ-ОЭГ) и полипептид по настоящему изобретению, содержащий сегмент δ с цистеиновым остатком по С-концевой позиции (δΕΟ ΙΌ ΝΟ 19) (отношение ФЭТМБС:полипептид = 5:1). На этой стадии малеимид фосфатидилэтаноламин-ГМБС реагирует с сульфгидрилом свободного С-концевого цистеина др41 полипептида. После инкубации в течение 30 мин добавляли избыток свободного цистеина для гашения какого-либо оставшегося свободного МБС (отношение цистеин:ГМБС = 10:1).

Связанный с липидом полипептид добавляли к содержащему гемагглютинин вирусному мембранному препарату/жидкой смеси, как описано выше, в отношении 1 мг гдр41 на миллиграмм гемагглюти- 14 025275 нина, и гдр41-виросомы получали путем удаления детергента на ЗМ-2 ВюВеабк (ВюКаб, 01айЬгцдд, З\\й/ег1апб).

Аналогично, связанный с липидом синтетический пептид Р1, аминокислотная последовательность которого соответствует ЗНО ГО Νο. 5 (Щ1'(Х)С.И\тНН2:МЖ\\АЖ\\'\\\1П)1Т\\\'1.\\'¥1И1 АС (карбоксиметил(1,3-дипальмитиолглицеро-2-фосфатидилэтаноламино))-ОН синтезировали в виде соли трифторуксусной кислоты (ТФУ) 8ΡΤΡΡΟΚΝΕΡΕΕΕΕΕΌΚ\Α8Ε\Ν\ΡΌΙΤΝ\Β\ΥΙΚΒ8гидроксилцистеин путем твердофазной Ртос химии, как известно в области техники, и связывали с фосфатидилэтаноламином через его С-концевой гидроксилцистеин с использованием бромацетилфосфатидилэтаноламина. После очистки пептида путем препаративной ВЭЖХ и ионного обмена с получением его соли ацетата, пептид лиофилизировали, растворяли в РВ8-ОЭГ, смешивали с препаратом вирусной мембраны/липидной смесью в отношении 5 мг Р1 на мг вирусного гемагглютинина, и Р1виросомы получали путем удаления детергента.

Пример 6. Иммунизация макак вакцинной композицией, содержащей гдр41-виросомоподобные везикулы по изобретению и Р1-виросомы по изобретению.

Иммунизацию макак вакцинной композицией, содержащей виросомоподобные везикулы с полипептидом гдр41, как описано выше, а также виросомоподобными везикулами с производным др41 антигена пептидом Р1, располагающимся на внешней поверхности, осуществляли следующим образом.

Использовали три группы по 5 самок макак, имеющие средний возраст приблизительно 5 лет. За четыре недели до первого введения вакцины все макаки получали внутримышечные инъекции инактивированного бета-пропиолактоном вируса гриппа А Зшдароге 6/86 (100 мкл, 0,01 мг/мл). Затем осуществляли вакцинации макак виросомоподобными везикулами в водном растворе (40 мкг Р1-виросом и 40 мкг гдр41-виросом, 100 мкл) на 0, 7, 15 и 24 неделе. Группа 1 (обезьяны с 01.1 по 01.6) получали виросомы гриппа без антигенов др41 (плацебо). Группа 2 (02.1-2.6) получала четыре внутримышечные вакцинации Р1-виросомами и др41-виросомами при каждой вакцинации, и группа 3 (03.1 - 3.6) две внутримышечные вакцинации (0 и 7 недели) с последующими двумя интраназальными вакцинациями (15 и 24 неделя), вводимыми в виде спрея, каждый раз Р1-виросомами и др41-виросомами. Одно животное в группе 3 (3.2) умерло по причинам, не связаным с вакцинацией.

Образцы сыворотки крови отбирали в каждый момент вакцинации.

Уровень общих антител 1д0 и 1§А в сыворотке крови определяли в соответствии со следующим протоколом ИФА. Пептид Р1 (3Ε0 ГО ΝΟ 5) 100 нг/100 мкл/лунку или гдр41 по изобретению (3Ε0 ГО Νο. 19, 100 нг/100 мкл/лунку) в 50 мМ бикарбонатном буфере с рН 9,6 использовали для того, чтобы покрыть планшеты ИФА (№тс) в течение ночи при 4°С. Планшеты насыщали БСА 2% РВЗ Т\\сеп 0,1% в течение 1 ч при 37°С, затем промывали буфером РВЗ-Т\\сеп 0,1%. Образцы сывороток крови, разведенные 1/300 для 1§А или 1/200 для Ι§0 при помощи РВЗ Т\\ееп 0,1%, инкубировали в течение ночи при 4°С. Планшеты затем промывали буфером РВЗ-Тгееп 0,1%. Для обнаружения Ι§0 у макак использовали козье антитело к Ι§0 макаки, связанное с биотином (Коск1апб) (1/15000), с последующей инкубацией со стрептавидином-НКР (пероксидаза хрена) ЦттипоЮсЬ), разведенным 1/50000.

Для обнаружения ^А макак использовали козье антитело против !§А макаки, связанное с биотином (Коск1апб) (1/15000), с последующей инкубацией со стрептавидином-НКР (пероксидаза хрена) (Ιιηιηιιпо!есй), разведенным 1/50000.

Моноклональное антитело 2Р5-1дА использовали в качестве положительного контроля с последующей инкубацией с меченым биотином козьим РаЬ'2 к человеческому ^А (конечная концентрация 0,14 нг/мл) (СаЙад Н 14015) и выявляли при помощи стрептавидина-НКР (1/50000). Моноклональное антитело 2Р54д0 использовали в качестве положительного контроля с последующей инкубацией с меченым биотином козьим РаЬ'2 к человеческому ^0 (конечная концентрация 0,1 нг/мл) (Коск1апб 609106123) и выявляли при помощи стрептавидина-НКР (1/50000). Антитела инкубировали в течение 1 ч при 37°С. Колориметрическую реакцию запускали путем добавления субстрата ТМВ и останавливали путем добавления 1М Н₂РО₄. Оптическую плотность (ΟΌ) считывали при 450 нм.

Результаты проиллюстрированы на фиг. 3 (др41-специфический ^А в сыворотке крови) и фиг. 4 (др41-специфический ^0 в сыворотке крови). Результаты демонстрируют, что внутримышечно вакцинированные самки макак имеют высокие уровни специфических антител ^0 и ^А против др41 в сыворотке крови. В заключение, присутствие антител ^0, а также ^А обнаружено в сыворотке крови иммунизированных самок макак. Эти результаты выявили, что иммунный ответ в виде ^А может быть получен при помощи вакцины по изобретению.

Для исследования того, вызывает ли вакцинация иммунитет на слизистой оболочке, шеечновлагалищные образцы получали у всех вакцинированных в примере 6 животных на 24 неделю путем введения 3 мл РВЗ, содержащего антибиотики и ингибиторы протеазы. Образцы центрифугировали для удаления дебриса, аликвотировали, немедленно замораживали и хранили при -80°С. Р1 антитела слизистой оболочки определяли при помощи ИФА, как описано выше, тогда как антитела против др41 монофилетической группы В определяли в соответствии с Тибог е! а1., 2009, Мисо§а1 Iттиηο1. 2, 412-426. Результаты выражали в виде количества животных, имеющих концентрации антител в два раза превосходящие стандартное отклонение, и сравнивали с результатами определений антител в сыворотке крови,

- 15 025275 выраженными аналогичным образом (таблица). Сыворотку крови обезьяны № 3.2 исключали из анализа.

Сыворотка крови СУ8
Антиген	Антитело	Группа 1	Группа 2	Группа 3	Группа 1	Группа 2	Группа 3
ΡΙ	1дА	0/6	2/6	0/5	0/6	3/6	4/5
ΡΙ	|де	0/6	6/6	0/5
др41	1дА	0/6	6/6	4/5	0/6	2/6	2/5
др41	1дС	0/6	6/6	3/5	0/6	2/6	3/5

Дополнительно обнаружено, что антитела 1дА и 1дС также индуцируются в половом тракте, тогда как 1дА обнаружен в кишечных отделах даже после вакцинации путем внутримышечной инъекции в отсутствие слизистого адъюванта.

Пример 7. Защита от гетерологической сенсибилизации вакцинированных макак.

Обезьян из примера 6 сенсибилизировали живым вирусом в соответствии со следующим: через четыре недели после последней вакцинации животных внутривагинально 13 раз сенсибилизировали каждые 4-7 суток низкими дозами (20-30 ТСГО₅₀) 8Н1У8Рг₆2Р3, как изображено на фиг. 5. Этот химерный обезьяний/человеческий вирус иммунодефицита монофилетической группы В имеет патогенный 81Утас239 в качестве скелета, содержащий гены сну (др120+др41), ГаГ, гем и νρυ из ВИЧ-18Р162Р3. Этот вирус распознает рецептор ССК5 в противоположность штамму Х4 1гор1с НхВ2, используемому для создания конструкции др41 по изобретению, и пептиду Р1 по изобретению. Таким образом, сенсибилизация производится гетерологическим вирусом. Вирус предоставлен ΝΙΑΙΌ (ΝαΙίοηαΙ 1п5ЙГиГе о£ А11егду апб 1п£есбои8 б18еа8е8 (Национальный Институт Аллергии и Инфекционных Заболеваний)), ΝΙΗ (Ναΐίοηαΐ 1п51Пи1с5 ο£ НеаНН (Национальный Институт Здоровья)) ВеГйекба, США) в 2 мл РВ8.

Как представлено на фиг. 5, все невакцинированные обезьяны (плацебо, группа 1) быстро инфицировались вирусом, причем вирусная нагрузка в плазме крови в течение двух недель составляла приблизительно 10⁶-10⁷ копий в мл, как ожидалось (Не88е11 А.Р еГ а1. ΝηΙ. Меб. 15, 951-959). 50% обезьян в группе 2 (внутримышесная вакцинация) были защищены. Все животные в группе 3 (внутримышечная/интраназальная вакцинация) были защищены; одно животное (№ 3.3) имело замедленную и низкую виремию на уровне 800 копий/мл в течение приблизительно одной недели, и было негативным после этого; подтверждая, что анализ образцов необходимо было повторить с меньшим порогом обнаружения (фиг. 5). Одно животное в группе 3 погибло по причинам, не связанным с сенсибилизацией. Эти данные указывают на то, что вакцинация защищает животных от гетерологической сенсибилизации, хотя группа 3 имела низкие уровни системных нейтрализующих антител.

Пример 8. Ингибирование трансцитоза и защита между монофилетическими группами.

Для исследования того, индуцирует ли вакцинация иммунитет на слизистых оболочках, шеечновлагалищные образцы, полученные как описано в примере 6, анализировали при помощи анализов ингибирования трансцитоза ВИЧ-1, которые осуществляли, как описано ранее (Вοт8е1 еГ а1., 1997. №й. Меб. 3: 42-47). Трансцитоз ВИЧ-Ι через эпителиальные клетки и нейтрализацию трансцитоза антителами исследовали на интестинальной клеточной линии НТ 29, выращиваемой в виде плотного поляризованного монослоя в течение 7 суток на проницаемой фильтровальной подложке (размер пор 0,45 мкм), образующей границу между двумя независимыми камерами, где верхняя омывает апикальную (просветную) поверхность эпителиального монослоя, а нижняя омывает базолатеральную поверхность. Перед экспериментами по трансцитозу эпителиальные клетки промывали и дополнительно инкубировали в КРМ1 1640, глутамине, 10% ФТС (фетальная телячья сыворотка). Образцы шеечно-влагалищного секрета (СУ8) (разведение 1/12 и 1/6) из группы 1 (плацебо) или группы 3 (^24; 1.т. + ί.η. - см. пример 7 выше) предварительно инкубировали с клетками, инфицированными ВИЧ-1 (1х 10⁶ вируса ВИЧ-1 93ВК029 (ВИЧ1 монофилетическая группа В) или с вирусом 92ВК025 (ВИЧ1 монофилетическая группа С) + РВМС (7 сутки после инфицирования активированных РВМС здоровых индивидов ЖС8Р или первичными вирусами) в течение 20 мин при комнатной температуре. Затем преинкубированные ВИЧ-1 инфицированные клетки добавляли в апикальную камеру. Контакт между ВИЧ-1 инфицированными клетками и монослоем эпителиальных клеток приводил в результате к быстрой репликации ВИЧ-1-вирионов, а затем интернализации ВИЧ частиц и трансцитозу из апикальной в базолатеральную половину монослоя эпителиальных клеток. Через 2 ч ингибирование трансцитоза под действием СУ8 определяли путем обнаружения р24 в базолатеральной среде при помощи имеющихся в продаже наборов для ИФА (Οοϋ1ΐ£Γ, УШершГе, Ргапсе). В течение 2-часового контакта инфицированных клеток с эпителиальными клетками барьерная функция эпителиального монослоя сохраняется ненарушенной, препятствуя проникновению ВИЧ-1 инфицированных клеток в монослой или транслокацию ВИЧ инфицированных клеток в базолатеральную камеру (1). Результаты трансцитоза ВИЧ-1 представлены на фиг. 6. Очевидно, что, трансцитоз вируса монофилетической группы В ингибировался СУ8 вакцинированных животных. Тем не менее неожиданно, что вакцинация также приводила к ингибирующей активности против вируса монофилетической группы С, что продемонстрировано по уменьшению трансцитоза ВИЧ-1 относительно контроля (защита между монофилетическими группами), что свидетельствует о присутствии общего конформационного эпитопа, поскольку аминокислотная последовательность отличалась между использованными вирусами.

- 16 025275

Пример 9. Трансцитоз ингибируется под действием иммуносекреторного 1дА в СУ8 вакцинированных животных.

В образцах шеечно-влагалищных секретов, отобранных у животных, как описано в примере 8, истощали уровень 1дА путем инкубации с биотинилированными антителами против 1дА макак в соответствии со следующим. Биотинилированные антитела против человеческого 1дА (СаНад, Франция) связывали со стрептавидином-агарозой (Р1егбе, Франция) в массовом отношении 1:3, и связанные шарики промывали для удаления не связавшихся биотинилированных антител против 1дА. 30 мкл шариков перемешивали в течение ночи при 4°С с СУ8 (разведение 1:6) и центрифугировали в течение 10 мин при 1000 д. Получающийся в результате супернатант собирали и анализировали, а затем инкубировали со стрептавидинагарозными шариками (Р1егбе, Франция) и центрифугировали для удаления шариков. Эти образцы с истощенным уровнем 1дА затем тестировали в анализе на трансцитоз с использованием вируса 93ВК029 монофилетической группы В, как описано в примере 8, и сравнивали с образцами без истощения уровня 1дА. Как показано на фиг. 7, имелось лишь небольшое или отсутствие ингибирования трансцитоза ВИЧ-1 после истощения уровня 1дА, что ясно демонстрирует роль скорее 1дА слизистых оболочек, нежели чем 1дА сыворотки крови в защите против инфекции.

Пример 10. Перекрестная защита от монофилетических групп ίη νίνο.

Поскольку перекрестное ингибирование трансцитоза между монофилетическими группами обнаружено в анализах ίη νίΐτο, как указано выше, было принято решение сенсибилизировать обезьян из группы 3, пример 6 (интраназальная и внутримышечная вакцинация виросомами, основанными на монофилетической группе В) вирусом монофилетической группы С. Через один год после последней вакцинации виросомами обезьяны все еще оставались серонегативными. Их ревакцинировали еще раз путем внутримышечной инъекции, как описано в примере 6, и через пять недель после вакцинации их сенсибилизировали 10 раз с интервалами 4-7 суток с 10-20 ТСГО₅₀ §Ηΐν1157ίρά3Ν4 (монофилетическая группа С, тропизм К5, любезно предоставленная Ότ. КиШ КиртесЫ, Иапа РатЬет Сапсег ПъШШе, И8А). В каждый момент вакцинации образцы крови отбирали для определения виремии. Образцы крови отбирали каждые 4-7 суток в течение 60 суток (фиг. 8). Как представлено на фиг. 8, первые 40 суток после инфицирования ни одно вакцинированное животное не инфицировалось. В невакцинированной контрольной группе 5/6 обезьян инфицировались на 11 сутки (фиг. 9), и на 60 сутки все животные были инфицированы. В вакцинированной группе 2/5 обезьян оставались не инфицированными в течение 120 суток исследования, в то же время для инфицированных последнее было значительно замедленно по сравнению с контрольной группой.

Эти неожиданные данные обеспечивают ясное доказательство перекрестной защиты от монофилетических групп ίη νίνο.

Claims (17)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Способ терапевтического или профилактического лечения ВИЧ, включающий:

   а) введение пациенту первого антигена, содержащего обладающие широким спектром нейтрализующего действия эпитопы проксимально расположенного к мембране эктодомена (ПМЭД) др41, и

   б) введение второго антигена, содержащего модифицированный полипептид, состоящий из трех смежных сегментов Ν, Ь и С, представленный формулой Ν-Ь-С, причем N сегмент представлен аминокислотами 540-592 др41, где схема нумерации основана на изоляте штамма ВИЧ-1 НхВ2 монофилетической группы В; С сегмент представлен аминокислотами 618-664 др41, где схема нумерации основана на изоляте штамма ВИЧ-1 НхВ2 монофилетической группы В, и Ь сегмент представлен §ЕЦ ГО Νο. 16.
2. 2. Способ по п.1, представляющий собой способ профилактической вакцинации.
3. 3. Способ по п.1, где указанный первый антиген содержит эпитопы 2Р5 и 4Е10.
4. 4. Способ по п.3, где первый антиген содержит аминокислотный сегмент 649-683 из др41, где схема нумерации основана на изоляте ВИЧ-1 НхВ2.
5. 5. Способ по п.1, где указанный первый антиген содержит нейтрализующий 1дА эпитоп.
6. 6. Способ по п.1, где указанный первый антиген содержит аминокислотную последовательность, выбранную из 8ЕЦ ГО Νθ. 2, 8ЕЦ ГО Νθ. 3, 8ЕЦ ГО Νθ. 4, 8ЕЦ ГО Νθ. 5 или 8ЕЦ ГО Νθ. 6.
7. 7. Способ по п.1, где указанный первый антиген связан с виросомой.
8. 8. Способ по п.1, где указанный второй антиген содержит аминокислотную последовательность, выбранную из 8ЕЦ ГО Νο. 19 или 8ЕЦ ГО Νο. 20.
9. 9. Способ по п.1, где указанный второй антиген конъюгирован с виросомой.
10. 10. Способ по п.1, при котором одному и тому же пациенту вводят указанный первый антиген и указанный второй антиген совместно в одной и той же лекарственной форме или разных лекарственных формах, где указанные антигены содержатся в одинаковой или различных дозах.
11. 11. Способ по п.1, при котором вводят указанный первый и второй антигены двумя различными путями одновременно или в разные моменты времени.
12. 12. Способ по п.10, при котором вводят указанный первый и второй антигены системным путем и местным путем.
13. 13. Способ по п.10, при котором вводят указанный первый и второй антигены одним и тем же пу- 17 025275 тем одновременно или в разные моменты времени.
14. 14. Профилактический способ по любому из пп.1-13 для реализации ίη νίνο по меньшей мере одной из следующих функций:

    а) индукция врожденного или адаптивного иммунного ответа против ВИЧ-1;

    б) контроль и/или устранение виремии у пациента, инфицированного ВИЧ;

    в) блокирование или уменьшение проникновения вируса ВИЧ через слизистый эпителий;

    г) предупреждение или уменьшение первичной ВИЧ инфекции в собственной пластинке под слизистым эпителием;

    д) предупреждение или уменьшение миграции вируса ВИЧ в кишечник и в лимфатические узлы;

    е) предупреждение или уменьшение проникновения ВИЧ инфекции в лимфатические узлы;

    ж) запуск иммунного ответа на слизистой оболочке против ВИЧ в половых органах и кишечнике;

    з) усиление системного иммунного ответа и иммунного ответа на слизистых оболочках против

    ВИЧ;

    и) контроль над ВИЧ инфекцией;

    к) предупреждение ВИЧ трансцитоза;

    л) нейтрализация ВИЧ инфекции ίη νίνο;

    м) индукция антителозависимой клеточной цитотоксичности.
15. 15. Терапевтическая композиция для терапевтического или профилактического лечения ВИЧ, содержащая первый антиген и второй антиген, как соответственно определено в п.1, и фармацевтически приемлемые концентрации солей, буферных агентов, антиоксидантов, консервантов, совместимых носителей или адъювантов.
16. 16. Вакцинная комбинация для терапевтического или профилактического лечения ВИЧ, содержащая первое лекарственное средство, содержащее первый антиген, раскрытый в п.1, и второе лекарственное средство, содержащее второй антиген, раскрытый в п.1, и фармацевтически приемлемые концентрации солей, буферных агентов, антиоксидантов, консервантов, совместимых носителей или адъювантов.
17. 17. Набор для осуществления терапевтического способа по пп.1, 3 или 4, содержащий указанные первый и второй антигены.