CN102365095A - 分裂gp41 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及治疗或预防性治疗HIV的方法，特别是预防性疫苗的方法，所述方法至少包括以下：对患者给药第一抗原，所述第一抗原包括gp41的膜近端胞外域(MPER)的广泛中和表位，及给药相同患者第二抗原，该第二抗原包括修饰后的多肽——含有三个连续片段N、L和C，由通式N-L-C表示，所述多肽还包括：gp41的N-螺旋区域(N)、gp41的C-螺旋区域(C)和连接环，所述连接环包括在N和C-螺旋之间的合成连接体(L)，连接体取代gp41的氨基酸593-617，编号方案根据原型分离物HIV-1 HxB2进化支B菌株，所述多肽包括calveolin-1中和及98.6D表位，但没有2F5和4E10表位，不是融合肽，所述多肽具有与人白细胞介素2的最低限度的免疫交叉反应性。
Description
包括gp41-衍生抗原的病毒体样小泡。本发明涉及适于诱导抗人免疫缺陷型病毒(HIV)的新型的病毒体样小泡、包含所述病毒体样小泡的药物组合物、诱导抗人免疫缺陷型病毒的免疫反应的治疗方法和试剂盒。
发明背景
HIV-1病毒是一种逆转录病毒，其逐渐摧毁免疫系统，并最终导致获得性免疫缺陷综合症(AIDS)。病毒的特点是在单个患者体内极其迅速的突变。目前的HIV-1毒株的基因组测绘得到系谱图，其根部有三组，称为M、N和O组，其中M组导致当前AIDS流行。
M组被分成9个基因亚型，也称为9个进化支(指定为A至K，没有E或者I)。进化支的原始定义是基于基因组短序列，大多是在HIV包膜蛋白(ENV：gp160)中。这九个进化支的地理分布模式不均。在南非、印度、中国部分地区传播进化支C。进化支A和D是常见于东非，进化支B常见于北美、南美和西欧。四个进化支，A、B、C和D占全世界所有感染的90％以上，进化支C代表了世界上最主导的HIV(约＞60％)。直到最近，疫苗的开发集中在进化支B毒株，其中占主导工业化国家的疫情，但全球只有约12％感染由其引起。
大多数抗HIV-1疫苗的方法针对病毒包膜(Env)糖蛋白，因为他们是在病毒体上并由HIV-1感染细胞上表达主要表面抗原。本土的HIV-1病毒包膜糖蛋白是一种异三聚体，包含三种gp120蛋白，与三种gp41糖蛋白非共价键相关。
由于在单个患者体内的迅速突变，对一种变体的病毒中和抗体通常不能防止患者感染HIV，因为不能识别迅速涌现的突变体。然而，已发现大量的中和抗体，能中和来自进化支B的各种菌株。四种最有效的HIV-1病毒中和抗体已经被确定：b12和2G12针对gp120，2F5和4E10针对gp41的一个区域，称为膜近端外部区域(MPER)。这些抗体对原生的三聚体有高亲和力。然而，能够跨进化支中和的抗体是极为罕见的。2F5与进化支B株反应好，但不善与进化支C株反应，2G12不能中和来自进化支E的C的病毒，b12中和50％的病毒。4E10中和范围极为广泛的几乎所有亚型的HIV-1的主要菌株，尽管它表现出温和的效果。
人们越来越努力开发重组蛋白作为候选疫苗，比本地的包膜糖蛋白复合物gp120/gp41具有更好的抗原模拟。然而，由于很大程度的(至少15)分子同源性，在gp120/gp41和免疫系统的分子之间的，现许多潜在的交叉反应事件可能会出现，而导致可能有害的自身免疫现象。
不同的策略已经描述以便抑制为了获得具有较少或没有与人体蛋白质交叉反应的抗艾滋病毒疫苗，诸如在gp41蛋白的不同部分引入突变和/或缺失，如在美国专利US6,455,265中描述的。
艾滋病毒感染大多发生在入口的粘膜部位，例如阴道和肛门直肠黏膜。大多数的已被人们描述或由以上疫苗策略诱导的中和抗体是全身IgG抗体。然而，妇女经常接触多个HIV-1菌株，粘膜IgA抗体已在阴道分泌物中发现，他们似乎广泛地保护人体不受HIV感染(Broliden，K.等.2009，Immunol.Lett.79，29-36)。因此，需要能够诱导这种粘膜抗体的疫苗。
然而，仍然存在对开发非进化枝(clade)B疫苗，例如进化枝C菌株的需求。
还存在对研发具有能够进行交叉进化枝抑制的广抑制谱的疫苗的需求。
对能够诱导对HIV感染的先天性和/或体液和/或细胞免疫应答的疫苗存在需求。
对能够在粘膜表面水平和/或血液水平上诱导对HIV感染的免疫应答的疫苗存在需求。
对适合于诱导能够干扰HIV-1通过粘膜进入和粘膜下的早期细胞感染的粘膜IgG和分泌IgA(slgA)抗体和全身性IgG抗体的疫苗存在需求。
对适合于抑制或减少HIV通过各种机制，例如转胞吞作用通过粘膜组织例如阴道粘膜组织进入的疫苗存在需求。
本发明的目的在于满足上述所有那些需求。
因此，根据第一方面之一，本发明是涉及治疗或预防治疗HIV的方法，特别是预防性疫苗的方法，所述方法包括至少以下：对患者给药第一抗原，其包括gp41的膜近端胞外域(MPER)的广泛中和表位，给药相同患者第二抗原——包括修饰后的多肽，该多肽含有三种连续片段N、L和C，由通式N-L-C表示，还包括：gp41的N-螺旋区域(N)、gp41的C-螺旋区域(C)和连接环，所述连接环包括在N和C-螺旋之间的合成连接体(L)，连接体取代gp41的氨基酸593-617，编号方案根据原型分离物HIV-1 HxB2进化支B菌株，所述多肽包括calveolin-1中和及98.6D表位，但不是2F5和4E10表位，不是融合肽，所述多肽具有与人白细胞介素2的最低限度的免疫交叉反应性。
因此，根据本发明的HIV疫苗呈现出在血液中以及在主要入口位点引发免疫反应的能力(CTL和/或抗体)的特性，所述主要入口位点是生殖道和肠道/直肠粘膜组织。这种特性是十分有利的，因为HIV感染可以包括病毒在粘膜表面的转吞胞作用步骤，次步骤有利于病毒在体内的移动和扩散。
精液和子宫颈-颈阴道分泌物可能潜在的传输HIV-1给胃肠、肛肠和泌尿生殖道，因为它们包含无细胞的HIV-1颗粒和许多HIV感染的单核细胞。
人们认为，在HIV感染受体中的早期病毒复制的主要位点是肠和其他黏膜部位。这主要是因为绝大多数的易感细胞(肠CD4+T细胞)驻留在粘膜组织，并在最初的几个星期内接触后HIV，这些细胞被破坏。在本发明的意义之内，“病毒体样小泡”的表述是指至少包括部分病毒体脂类和融合蛋白或其片段的囊泡，所述片段具有融合活性，和完整融合蛋白的活性，至少在一定长度上用作与靶细胞的生物膜融合。
gp41-衍生抗原
适于本发明的gp41-衍生抗原可以是gp41蛋白的任何的部分，以及整个gp41蛋白及其类似物。
在发明的意义之内，“关于gp41衍生抗原的类似物”是指与所述gp41衍生抗原的氨基酸序列具有大量(至少)85％、特别是具有至少90％和更特别是具有至少有95％的氨基酸序列同一性或同源性(即，例如由同一家族的相似极性或电荷的氨基酸残基取代的氨基酸残基)的肽，所述类似物具有类似的或保守的生物学特性，特别是指向gp41蛋白的免疫球蛋白抗原结合部分。
根据一个实施例，适用于本发明的gp41衍生抗原可能缺乏与细胞膜的成融特性。
根据本发明的一个方面，提供了第一抗原，其包括gp41的膜近端胞外区域(MPER)的中和表位。
根据本发明，所述第一抗原包括2F5和4E10表位。
在本发明的含义中，2F5表位相应于人2F5抗体识别的gp41的特定区域，所述2F5抗体对于各种主要的HIV-1分离物具有宽的中和活性(Trkola A.等，1995，J.Virol.，69，pp6609-6617，参见图1)。这种单克隆抗体识别靠近分子的跨膜区域的gp41的胞外结构域中相对保守的16-氨基酸线性序列(NEQELLELDKWASLWN，SEQ ID NO.7)内的6个氨基酸的核心表位(Parker等，2001，J.Virol.，75，pp10906-10911)。
4E10人单克隆抗体对位于紧邻2F5表位羧基末端的位置的gp41的跨膜近侧区是特异性的，并且也具有宽的中和活性(Zwick等，2001，J.Virol.，75，pp 10892-10905，参见图1)。
根据本发明的一个方面，第一抗原对应于gp41的第649-683位氨基酸。在另一个实施方式中，所述第一抗原包括中和IgA表位。
在本发明的优选实施方式中，所述第一抗原包括由SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5或SEQID No.6所示的氨基酸序列。
在另一个优选方面，第一抗原连接到病毒体。
本发明的另一个方面提供了第二抗原，其包括修饰后的多肽，所述多肽含有三种连续片段N、L和C，由通式N-L-C表示，还包括：gp41的N-螺旋区域(N)、gp41的C-螺旋区域(C)和连接环，所述连接环包括在N和C-螺旋之间的合成连接体(L)，连接体取代gp41的第593-617位氨基酸，编号方案根据原型分离物HIV-1 HxB2进化支B菌株，所述多肽包括calveolin-1中和及98.6D表位，但不是2F5和4E10表位，不是融合肽，所述多肽具有与白细胞介素2的最低限度的免疫交叉反应性。
根据本发明的所述第二抗原是在下文中被无差别地命名为“gp41衍生抗原”或“根据本的发明的gp41”或“rgp41”。
根据本发明的第二抗原几乎保持着N-和C-螺旋之间的相互作用的天然构象，并具有疏水性，这为所述被修饰的第二抗原提供了可溶和稳定的三聚体形式，而无需大幅改变其免疫反应活性。
98.6D表位位于gp41的簇II区中，并且被98.6D人单克隆抗体识别，如在Gorny M.K.等.，1989，Proc.Natl.Acad.ScL，86，pp 1624-1628和Xu J.-Y.等.，1991，J.Virol.，65，pp 4832-4838中所述。
以上所述calveolin-1结合结构域相应于gp-41中的CBD1肽(SLEQIWNNMTWMQWDK，SEQ ID No.8)(Benferhat等，2009，MoI.Immunol.46(4)，pp 705-712)。所述融合肽相应于gp41的氨基末端区域，其在卷曲螺旋形式形成后暴露。该区域被插入靶细胞的膜，导致病毒和细胞膜的融合；其相应于gp41的细胞外部分的区域512-539(Quintana等，2005，JCI；参见图1)。
根据本发明，所述第二抗原能够形成gp41-三聚体，并且保留天然gp41抗原性，并且存在最小的IL-2交叉反应性。这类交叉反应性可以通过本领域技术人员已知的方法进行测定，所述方法例如gp41-ELISA和gp41-点渍法。这类测定的实例在下面提供(参见实施例3，图2)。
根据本发明，表述“保留天然gp41抗原性”或“没有改变其免疫原活性”指根据本发明的多肽与野生型gp41具有几乎相同水平的抗原活性和/或免疫活性。
组成根据本发明的第二抗原的N和C片段可以衍生自包括HIV-1和HIV-2菌株——其包括实验室菌株和原始分离物——在内的HIV的任何gp41蛋白。优选地，这些片段衍生自HIV-1菌株，特别是衍生自HIV1 HxB2菌株，例如在SEQ ID No.1中描述的。
大量gp41蛋白质的核苷酸和蛋白质序列是已知的并且是可获得的：例如在网址http://www.hiv.lanl.gov/的互联网上，也在相应的LosAlamos目录中(HIV Sequence Compendium 2005 Leitner T，Foley B，Hahn B，Marx P，McCutchan F，Mellors J，Wolinsky S，and Korber B，Eds.，published by Theoretical Biology and Biophysics Group，Los AlamosNational Laboratory，NM，LA-UR 06-0680)。
上述和/或权利要求书中的任何序列——其中已经引入一个或多个保守突变(基本上不会改变免疫原性)——也被上述定义所包括。
参考在图1中描述的gp41蛋白的序列(该氨基酸序列由SEQ IDNo.1表示)编号氨基酸。
在更优选的实施方式中，本发明的第二抗原是SEQ ID No.17或SEQ ID No.18描述的序列。
在本发明的又一方面中，第二抗原也包括至少一个间隔肽片段S。在具体方面中，本发明的第二抗原由SEQ ID No.19或SEQ ID No.20表示，并且分别命名为M0或M1。
所述间隔序列可用于获得更好的缀合，例如将多肽与诸如病毒体等载体连接，使进行所述移植的反应性氨基酸更易接近。
特别地，能够将进行所述移植的氨基酸(一个或多个)从病毒体的膜进一步移开。
也可设计所述间隔片段的组成例如氨基酸序列，以便辅助根据本发明的多肽的生产过程。在本发明的具体实施方式中，所述间隔片段可包括参与整个多肽的纯化步骤的组氨酸残基(参见下文实施例1)。
所述间隔肽在本发明的多肽的C-末端部分包括下列描述的至少一个氨基酸序列：SEQ ID No.9、SEQ ID No.10、SEQ ID No.11或SEQID No.12。
所述间隔序列也可参与根据本发明的多肽的免疫原性。
在优选的实施方式中，N片段由gp41的氨基酸540-592表示，编号方案基于原型分离物HIV-1 HxB2，和/或C片段由gp41的氨基酸618-664表示，编号方案基于原型分离物HIV-1 HxB2。
根据优选的实施方式，N片段是SEQ ID No.13或SEQ ID No.14描述的序列，和/或C片段是SEQ ID No.15描述的序列。
在本发明的又一方面中，所述L片段是SEQ ID No.16描述的片段。本发明的第二抗原能够形成三聚体。
在另一方面，本发明涉及包含本发明的第二抗原的含水组合物，所述第二抗原在水介质中形成稳定的三聚体。
本发明——尤其是在下面权利要求书中限定的——包括与先前限定或描述的那些多肽相当的第二抗原。
在本发明含义中，表述“其类似物”就gp41衍生的抗原而言意图指与所述的gp41衍生的抗原氨基酸序列具有(基本上至少85％，特别是至少90％且更特别是至少95％)氨基酸序列同一性或同源性(即，例如被相同家族的极性或电荷相似的氨基酸残基置换的氨基酸残基)的肽，并且特别是就针对gp41蛋白的免疫球蛋白的结合抗原部分而言，所述肽具有类似或保守生物特性。
根据本发明的第二抗原的寡聚体形态，例如三聚体，可以通过本领域技术人员公知的方法进行测定，所述方法例如凝胶过滤，例如FPLC，间隔在3000和600 000道尔顿之间。
本发明的第二抗原形成的三聚体的稳定性可通过本领域技术人员公知的技术进行测量，所述技术例如冻结和解冻包含本发明第二抗原的含水组合物数个循环。
根据本发明的抗原通过本领域技术人员公知的化学合成或遗传工程的任何传统的或标准技术获得。
根据一个选择，所述抗原通过化学合成产生：它们能够以单一序列的形式合成或者以数个随后彼此连接的子序列的形式合成。化学合成可以以固相或溶液进行，这两种合成技术是本领域技术人员公知的。尤其是，这些技术被Atherton和Shepard在“Solid phase peptidesynthesis”(IRL press Oxford，1989)和Houbenweyl在“Methoden derorganischen Chemie”——[Methods in Organic Chemistry]由E.WunschVol.15-1和11，Stuttgart，1974出版——所描述，并且也在下列文章中描述——其通过引用整体并入本文：P.E.Dawson等.(Science 1994；266(5186)，pp776-779)；G G Kochendoerfer等.(1999；3(6)，pp 665-671)；P E Dawson等.(2000，69，Annu.Rev.Biochem.，pp 923-960)。
根据另一个选择，根据本发明的抗原使用本领域技术人员公知的遗传工程技术制造。当根据本发明的多肽通过遗传工程制造时，它们在NH2-末端可包括与第一起始密码子的翻译相应的额外的甲硫氨酸。
这些技术在Molecular Cloning：a molecular manual，by Maniatis等.，Cold Spring Harbor，1989中详细地描述。传统地，PCR技术被用于以可插入表达载体的形式制造编码根据本发明多肽的DNA序列。然后，使用含有所关注序列的表达载体转化考虑用于所关注序列表达的寄主细胞。然后，使用本领域技术人员公知的常规的层析技术将制造的多肽从培养基中分离。在纯化阶段，优选地使用高效液相层析法(HPLC)。一般地，在培养的最后，通过离心收集细胞，并且接收在中性缓冲液中，以便通过任何合适的方法将其破裂。然后，离心细胞溶胞产物，以便将可溶物质与不可溶物质分离。来自离心的上清液和沉淀物的SDS-PAGE分析显示多肽是否可溶。如果肽是不溶的，那么使用含有脲、胍或任何其他增溶剂的缓冲液来获得增溶作用。在该步骤的离心使得能够除去碎片和阻碍层析的其他不溶产物。下面的步骤为将溶解的分子负载到亲和柱上，如果例如在可整合到所关注多肽上的连接体片段L中存在多个组氨酸残基，那么亲和柱可以是金属螯合物类型的。能够亲和纯化的系统可以在性质例如免疫亲和性、对cibachron蓝色染料的亲和性等方面变化。在该阶段，多肽显示接近于或大于80％的纯度，尤其是至少90％的纯度，如通过SDS-PAGE电泳然后考马斯蓝染色的比色法测定的。带的光密度测量使量化纯度成为可能。纯度也可通过反相HPLC、通过测量各个峰的面积进行测量。可增加额外的层析步骤以便进一步纯化多肽；例如可进行凝胶过滤和反向层析法。
在进一步的实施方式中，本发明也包括编码上述限定的多肽的多核苷酸。
本发明的多核苷酸包括单链和双链DNA/RNA分子。
在本发明的具体方面，根据本发明的编码rgp41的多核苷酸由SEQID No.21或SEQ ID No.28描述。
保持在本发明的范围内的编码修饰多肽的附加DNA序列可由本领域普通技术人员基于本说明书中描述的遗传密码和多肽序列容易地生成。对应RNA序列可以通过用U取代T生成。本领域技术人员容易地理解，鉴于遗传密码的简并，在编码根据本发明的多肽的多核苷酸分子中——尤其是在本说明书中描述的多核苷酸序列中，序列变化是可能的。
相反地，任何本领域普通技术人员将理解同样鉴于遗传密码的简并，在根据本发明的多核苷酸分子编码的多肽分子中——尤其是在本说明书中描述的多核苷酸序列，序列变化是可能的。
所有这些变化被本发明限定(一个或多个)和所附权利要求所包括，这样对于前面具体说明和/或下文描述的多肽，那些变化基本上不会改变所得到的多肽的结构/构造、和/或功能(一种或多种)和/或性质。
根据本发明的一个实施方式，根据本发明的多核苷酸序列被直接化学合成(Young L and Dong Q.，2004，-Nucleic Acids Res.，Apr 15；32(7)，Hoover，D.M.和Lubkowski，J.2002，.Nucleic Acids Res.，30，Villalobos A，等.，2006.BMC Bioinformatics，Jun 6；7：285)。
如此获得的本发明的多核苷酸序列可以以已知的方式引入任何适当的载体内，所述载体可以使在方便的细胞系统中表达所述多肽——任选地以修饰形式——成为可能。
如此获得的多核苷酸序列可被引入宿主细胞，以便转化宿主并促进被引入序列的表达(例如转录和翻译)。载体包括质粒、噬菌体等。优选地，应用其中编码根据本发明多肽的DNA序列在强启动子控制下的载体，所述启动子可以是或可以不是可诱导的。作为可以使用的启动子的实例，涉及T7 RNA聚合酶启动子。表达载体可包括选择性标记例如氨苄青霉素、四环素或其他的适合于在人体中应用的抗生素抗性基因。可选地，可以基于营养缺陷型标记或任何种类的不含抗生素的选择手段(先前敲入宿主基因组的必需基因的互补)选择转化的细胞。
可以使用的表达载体的实例包括质粒pET21b、pET30(Novagen)、酵母、细菌、病毒载体例如杆状病毒和痘病毒。
为了促进根据本发明的抗原的表达和纯化，后者可以以修饰形式例如融合蛋白进行表达，并且可以不但包括分泌信号，还包括附加的异源功能区域。例如，可以在多肽的N-末端增加附加氨基酸特别是带电氨基酸的区域，以便提高在宿主细胞中的稳定性和持续性。
本发明的目标也涉及包含如上所述的多核苷酸的表达载体。
所述载体可用于转化宿主生物，所述宿主生物形成本发明的另一目的。
本发明也提供用所述载体转化的宿主细胞。可以使用与上述表达载传统地组合使用的任何宿主细胞，例如大肠杆菌、BL21(DE3)、BLR(DE3)、origami 2(DE3)、杆菌或其他革兰氏阳性宿主例如乳酸乳球菌、酵母、杆状病毒和真核细例如CHO或Vero，优选的细胞表达系统包括大肠杆菌，例如BL21(DE3)。
在所述方面的另一实施方式，本发明涉及缀合物，这类缀合物包括根据本发明的第二抗原。
在具体方面，本发明的第二抗原与病毒体样小泡轭合。
病毒体样小泡
适合于本发明的病毒体样小泡至少包含病毒体脂质并且表现出融合膜特性。
根据一个实施方式，本发明的病毒体样小泡可以包含单层脂双层。
根据一个实施方式，本发明的病毒体样小泡可以为双或多层脂质体。
根据一个实施方式，病毒体样小泡可以具有一般在50-600nm的直径且特别是100nm-300nm直径且特别是200nm-400nm的直径。
本发明的病毒体样小泡可以为具有约150nm平均直径的球形单层脂质体。病毒体样小泡包含掺入脂双层中的具有或不具有融合蛋白或其片段的病毒膜蛋白。
表述“融合蛋白或其片段”通常指能够诱导和/或促进病毒体样小泡膜与靶细胞生物膜之间的融合反应的蛋白或其片段。
例如，融合蛋白可以为流感膜糖蛋白，诸如血凝素(HA)。
根据一个实施方式，可以使用至少两种不同的融合蛋白或其片段，它们可以展示出不同的融合特性。根据另一个实施方式，不同的融合特性可以为，例如，对温度、离子浓度、酸性、细胞类型和组织类型特异性的不同易感性。
根据一个实施方式，病毒体样小泡可以包含在两种不同温度下介导融合的融合蛋白。根据另一个实施方式，来自不同的病毒菌株的血凝素(HA)可以用于构建病毒体样小泡。作为实例，来自X-31和PR8/34病毒体的HA分子能够在不同温度下催化两种不同的融合反应。
具有不同融合特性的融合蛋白可以来源于不同的流感菌株，或者融合蛋白可来自其它病毒，例如水疱性口炎病毒(VSV)E1蛋白、塞姆利基森林病毒(SFV)包膜蛋白复合体或仙台病毒F蛋白。
与病毒体样小泡膜结合的抗原可以在内涵体中降解并且可以由MHC II类受体呈递给免疫系统。包含在病毒体腔内的抗原可以通过膜融合被递送至抗原呈递细胞的胞质溶胶中并且在胞质溶胶中降解，之后其可以被呈递MHC I类抗原。病毒体递送的抗原的交叉呈递也可发生。
因此，病毒体样小泡可能能够诱导体液和/或细胞免疫应答。
特别地，病毒体样小泡可能诱导产生IgA抗体，例如分泌性IgA以及IgG或IgM。制备方案是本领域技术人员公知的。例如，在WO2004/045582或EP 0538437、EP 1633395、EP 1594466中描述了用于制备病毒体的合适的方案，所述文献以引用的方式并入本文。
根据一个实施方式，根据本发明的病毒体样小泡可以从病毒体小泡本身或从由病毒体小泡与脂质体小泡融合产生的小泡获得。
可以通过任何本领域技术人员公知的方法，如Stegmann等，EMBOJ.6，1987，no.9，2651-9，或de Jonge等.，Biochim.Biophys.Acta，1758，2006，527-539中描述的方法进行病毒体小泡的制备，所述文献通过引用并入本文。例如，可以在使用八乙二醇单N-十二烷基醚(OEG)增溶完整流感病毒，沉积核壳体(病毒糖蛋白和脂质仍然保留在上清液中)和使用疏水性树脂(Bio-Beads SM2)除去上清液中的洗涤剂后，由最初的病毒膜脂质和病毒膜糖蛋白重构病毒体小泡(Stegmann T，等.，EMBO J.6，1987 2651-9)。
可以通过使用短链磷脂增溶病毒膜，沉积核壳体(仅病毒膜糖蛋白和脂质仍然保留在上清液中)和通过透析除去上清液中的短链脂质，由最初的病毒膜重构病毒体。
如上述在用洗涤剂或短链磷脂增溶病毒和除去核壳体之后，在洗涤剂或短链磷脂中增溶的抗原或佐剂可被加入到上清液，然后除去洗涤剂或短链脂质，这导致抗原或佐剂如此引入病毒体。同样地，在洗涤剂或短链磷脂中增溶的脂质可被加入到上清液，以包含在病毒体膜中。可以通过混合含有如上所述的增溶病毒膜的上清液或通过将纯化融合蛋白加入到这类上清液中，然后进行洗涤剂或短链脂质的去除，进行制备包含来自不同病毒的融合蛋白的病毒体小泡。
根据一个实施方式，根据本发明的病毒体样小泡可以从病毒体小泡与脂质体小泡的融合体获得。
因此，根据一个实施方式，本发明的病毒体样小泡可以包含病毒体和脂质体脂质。根据一个实施方式，本发明的病毒体样小泡可以包含脂双层，其包含选自阳离子脂质、合成脂质、糖脂类、磷脂类、磷酸甘油脂类、鞘糖脂类，如半乳糖神经酰胺，鞘脂类，胆固醇及其衍生物的脂质。
磷脂类特别可以包括具有不同脂肪酰组成的磷脂酰胆碱、鞘磷脂、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰甘油、磷脂酸、心磷脂和磷脂酰肌醇。
阳离子脂质可以选自DOTMA(N-[1-(2，3-二油酰氧基)丙基]-N，N，N-三甲基氯化铵)、DOTAP(N-[1-(2，3-二油酰氧基)丙基]-N，N，N-三甲基氯化铵)、DODAC(N，N-二油酰基-N，N，-二甲基氯化铵)、DDAB(双十二烷基二甲溴化铵)和十八酰胺或其它脂肪族胺类等。
可以将用于本发明的脂质配制成与DOPE(二油酰基磷脂酰乙醇胺)的混合物形式的小的单层脂质体，所述的DOPE被广泛用作促进内涵体膜破裂的辅助脂质。
根据另一个实施方式，还可以使用辅助乳化剂以便改善小泡的刚性和/或密封性。作为辅助乳化剂的实例，可以提及的有胆固醇和衍生物，例如带电或中性的胆固醇酯，如胆固醇硫酸酯；具有固醇主链的衍生物，例如植物来源的衍生物，如植物甾醇(谷甾醇、口甾醇)；神经酰胺类；及其混合物。
病毒体或其内含物可以在储存时经历水解和物理降解。根据一个实施方式，通过冷冻干燥，病毒体可被保存进行长期储存，并且在使用前用水溶液重建。冻干保护剂例如菊粉可在冻干前加入，以在冻干期间和重建时帮助保存病毒体完整性(Wilschut，J.等.，J.Liposome Res.17，2007，173-182)。优选地，使用喷雾冷冻干燥(Amorij，J.P.等.Vaccine17，2007，8707-17)。
本发明的病毒体样小泡可以进一步包含靶向部分，它使所述的小泡靶向至特定的细胞或组织。
根据一个实施方式，本发明的病毒体样小泡可以进一步包含靶向部分，它使所述的小泡靶向至特定的细胞或组织。
合适的靶向部分可以选自细胞表面受体、趋化因子、生长因子、抗体或抗体片段、具有与黏着分子诸如整联蛋白互补的特异性或荷质比的肽序列。可以通过任何本领域技术人员公知的技术将靶向部分掺入所述小泡的脂双层或附着于其上。
根据一个实施方式，位于本发明的病毒体样小泡外表面的抗原可以是：
—与所述病毒体样小泡的脂质共价连接，或
—通过肽跨膜结构域嵌入所述病毒体样小泡的脂双层。
根据一个实施方式，抗原可被包含在病毒体内。
本发明的抗原的修饰和使所述修饰的抗原与病毒体样小泡外表面交联的方法可以是如WO 2004/078099中描述的那些。
根据一个实施方式，抗原可以通过交联脂质或磷脂与病毒体样小泡的外表面共价连接。根据另一个实施方式，抗原可以通过与碳水化合物交联而与病毒体样小泡的外表面共价连接。根据一个实施方式，共价连接的抗原可以包含至少一个C-末端定位的交联残基。
例如，交联残基可以选自半胱氨酸(Cys)或赖氨酸(Lys)。根据另一个实施方式，共价连接的抗原可以进一步包含在所述C-末端定位的交联残基与相应的C-末端抗原端之间的至少一个间隔残基。
合适的间隔残基可以选自：例如Gly(甘氨酸)、Ala(丙氨酸)、Ser(丝氨酸)、Asp(天冬氨酸)、Lys(赖氨酸)、Gln(谷氨酰胺)、His(组氨酸)、He(异亮氨酸)和Leu(亮氨酸)残基。2至12个、特别是3至10个、且更特别是4-8个间隔残基可以连接而形成间隔序列。合适的间隔序列可以选自，例如Gly-Gly或Lys-Gly。
例如，可以通过使用易于掺入脂双层的两亲PEG衍生物、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰丝氨酸、胆固醇或其混合物使抗原与病毒体样小泡的表面交联。可以通过任何本领域技术人员公知的方法使抗原与本发明的病毒体样小泡的脂质交联。
交联可以在脂质溶液中操作并且随后可以将脂质-肽缀合物掺入病毒体样小泡。
根据本发明的一个实施方式，例如，可以使抗原与本发明的小泡的脂质通过双官能琥珀酸酯连接基，特别是[γ]-马来酰亚胺基丁酸N-羟基琥珀酰亚胺酯或N-[γ]-马来酰亚胺基丁酰氧基-琥珀酰亚胺酯进行连接。
如上所述，在用洗涤剂或短链磷脂增溶病毒并且除去核壳体之后，抗原、脂质连接的抗原、磷脂和佐剂可被加入到所形成的上清液中。然后，可形成病毒体，如前所述，通过使用Bio-Beads SM-2(Biorad)除去洗涤剂，Amberlyte XM或短链磷脂可通过透析移除。
佐剂
根据一个实施方式，本发明的病毒体样小泡的免疫刺激作用可通过将那些病毒体样小泡与至少一种佐剂结合得到进一步增强。
可以将所述的佐剂包囊在所述的小泡内部和/或掺入其脂双层和/或与所述小泡自由合并。
根据一个实施方式，病毒体样小泡还可以包含至少一种增强和/或介导免疫应答的佐剂，所述的免疫应答选自先天性免疫应答和/或适应性免疫应答。可用的佐剂可以通过活化抗原呈递细胞(APC)、巨噬细胞和/或刺激特异性淋巴细胞组来增强免疫应答。
可以召集至本发明的佐剂可以是适合于使在树突细胞(DC)、T细胞、B细胞或其它抗原呈递细胞中和其上表达的病原体识别受体(PRR)活化的任何配体。
活化核苷酸结合寡聚结构域(NOD)受体通路的配体可适合用于本发明的目的。适合于这些配体的佐剂可以是胞壁酰二肽衍生物。活化Toll-like受体(TLR)的配体也可召集用于本发明的目的。那些受体为PRR家族的成员并且在各种先天性免疫细胞，包括DC、巨噬细胞、肥大细胞和中性白细胞上广泛表达。
作为活化TLR的配体的实例，可以提及的有：就TLR4而言，为单磷酸类脂A、3-O-脱乙酰单磷酸类脂A、来自大肠杆菌的LPS、紫衫醇、RSV融合蛋白和宿主热激蛋白60和70；就TLR2而言，为脂肽，例如N-棕榈酰-S-2，3(二棕榈酰氧基)-丙基-半胱氨酰-丝氨酰-(赖偶酰) 3 - 赖氨酸、金黄色葡萄球菌的肽多糖、来自结核分枝杆菌的脂蛋白和啤酒糖酵母多糖和高度纯化的牙龈卟啉单胞菌LPS；就TLR3而言，为dsRNA；就TLR5而言，为鞭毛蛋白；就TLR7而言，为合成化合物，例如咪唑并喹啉类；或就TLR9而言，为某些类型的富含CpG-的DNA。用于本发明的其它有用的佐剂可以为T辅助细胞表位。
T辅助细胞表位为通常来源于在抗原呈递细胞(APC)胞吞途经内已经进行蛋白水解降解和加工的外源性蛋白的肽。在那些细胞中，II类主要组织相容性复合体(MHC II)与内涵体中的那些肽类结合。这种转运至APC表面的复合体可以与T淋巴细胞的CD4的特异性T细胞受体发生相互作用，导致其活化。根据所述辅助细胞表位，T细胞应答可以属于Th1和/或Th2类型，如现有技术中所知。
作为Th-定向应答表位的实例，可以提及pan DR辅助性T细胞表位(PADRE)。改造该表位以便以高度亲和力结合最常见的HLA-DR分子并且起强力免疫原的作用。已经证实PADRE HTL表位可以增进为了刺激细胞免疫应答而设计的疫苗的效力(Alexander J.等.，ImmunolRes.18，1998，79-92)。
根据一个实施方式中，可以与本发明的病毒体样小泡共同使用的佐剂可以选自铝盐，磷酸铝凝胶，例如卡介苗，M.vaccae等的分枝杆菌、或短棒状杆菌、多肽、钥匙孔戚血蓝蛋白、白细胞介素2(IL-2)、IL-12、GM-CSF、趋化因子家族的配体，如趋化因子(调节正常T细胞表达和分泌的激活)、革兰氏细菌脂蛋白，酵母细胞壁组成部分，双链RNA、革兰氏菌脂多糖、鞭毛蛋白、丰富的U的单链病毒RNA，含有DNA的CpG、6F细胞因子信号抑制剂的小分子RNA(siRNA，SOCS)、二甲双胍衍生肽、平头DR抗原表位(PADRE)及其混合物。
这些制剂通常包含药学上可接受浓度的盐、缓冲剂、抗氧化剂、防腐剂、兼容载体、如前面所述佐剂以及可选的其他治疗剂。
本发明所述的病毒体样小泡，特别是包含其的组合物的给药可以通过注射或黏膜途径，或两种途径的组合。
注射可以是，例如，腹腔内，皮内，皮下血管或肌肉注射。
任何粘膜途径可以被使用，如泌尿生殖途径，或者例如阴道途径、肠道途径、肛门直肠途径、呼吸道途径、施用于上粘膜组织、口鼻腔途径及其组合。
在一个实施方式中，本发明的第一和/或第二的抗原可以提供为口服剂型，诸如片剂、胶囊剂(包括定时释放和缓释制剂)、丸剂、粉剂、颗粒剂、酏剂、酊剂、溶液、悬浮剂、糖浆剂和乳液。
根据本发明，发明的所述第一抗原和所述第二抗原可以根据本发明的方法对相同患者联合给药，以相同剂量或分别以不同剂量。
在一个特定的实施方式中，所述第一抗原和第二次抗原的所述联合给药可以在同一时间或在分别不同时间或在相继时间、以至少两种不同路径来实施。
在另一个实施方式中，本发明包括通过全身途径和局部途径联合给药所述第一和第二抗原，所述全身途径诸如注射，例如肌肉注射，所述局部途径诸如通过粘膜上皮组织，例如通过鼻腔吸入。
对相同患者联合给药所述第一和第二抗原，可以通过相同路径，例如全身路径，在相同时间或在分别不同的时间或在相继时间实施。
本发明的预防疾病方法，体内执行至少一种下列功能：
a)诱导先天或适应性免疫反应，诸如全身和/或粘膜抗体——含有抗HIV-1的IgA和/或IgG亚型，
b)控制和/或删除HIV-1感染病人的病毒血症；
c)阻止或减少HIV病毒跨过粘膜上皮组织进入；
d)防止或减少原发性HIV感染粘膜上皮组织下方的固有层，
e)防止或减少病毒在肠道中的迁移和迁移至淋巴结；
f)防止或减少HIV感染淋巴结；
g)在生殖器和肠道隔室中触发抗HIV-1的粘膜免疫反应；
h)促进全身和粘膜免疫反应抵抗HIV；
i)控制HIV感染，诸如，获得延迟、瞬时、或次等的感染；
j)预防HIV的转胞吞作用；
k)体内中和HIV感染；
l)诱导抗体依赖性细胞毒性。
在本发明的含义中，表述“适应性免疫应答”意图指依赖免疫系统元件活化的免疫应答，这就抗原或病原体而言暗示特异性和记忆。
这类应答可以是对抗原或病原体高度特异性的，并且对第二次和随后与该抗原或病原体相遇(encounter)更有效。这类适应性免疫应答可依赖于淋巴细胞例如T-细胞或B-细胞的活化。
在本发明的含义中，表述“先天性免疫应答”意图指依赖于非特异性识别系统的应答，并且不在随后与该抗原或病原体相遇时改变。
这类系统依赖于免疫细胞，例如单核细胞、巨噬细胞或天然杀伤(NK)细胞或天然杀伤T(NKT)细胞。
本发明的另一个方面涉及如上所述治疗方法的试剂盒，包括所述第一和第二次抗原。
本发明还涉及治疗组合物或制剂，包括上文所述的第一抗原和第二抗原。
在一个特定的方面，所述第一抗原和所述第二抗原是相同剂量或分别不同的剂量或剂型。
本发明的另一个实施方式中涉及具有治疗、尤其是一个预防性疫苗的关联，关于：
-第一药剂，包括由上述定义的第一抗原，
-第二药剂，包括由上述定义的第二抗原。
结合以下实施方式将能够进一步理解本发明，所述实施方式以说明为目的，不应解释为限制发明的范围。
附图说明：
图1：进化枝B的HIV-1包膜糖蛋白gp41，HxB2菌株的结构图，提供鉴定的公知的表位、簇和区域。空心环相应于不变的氨基酸，浅灰色环相应于高度保守的氨基酸，中等灰色环相应于中等可变的氨基酸，深环相应于不变的氨基酸，和在一个进化枝上比另一个进化枝更可变的氨基酸被描绘为大轮廓的环。含有宽中和抗体2F5和4E10的表位并且在本发明的P1肽中存在的MPER区域的一部分在左下示出，该部分缺乏本发明的gp41多肽。在本发明的gp41蛋白构建体中，来自簇1的氨基酸被连接体置换。
图2：野生型gp41和衍生物与针对gp41的单克隆抗体MAb 98.6(左)和抗-IL2抗体AF-202(右)的交叉反应性。
图3：示出与通过组合的肌肉内和鼻内注射用病毒体免疫的猕猴的血清相比(G3.1到3.6)，通过肌肉内注射用gp41-病毒体和用P1-病毒体免疫的猕猴的血清样品中的IgA(猴G2.1到2.6)。组1(G1.1-1.6，安慰剂)是对照组；这些动物使用缺乏HIV抗原的普通流感病毒体肌肉内免疫。数据为在第24周收集的血清的数据，免疫前背景的OD(第0周)从第24周的OD减去(w24-w0)。样品稀释1∶300。
图4：与通过组合的肌肉内和鼻内注射用病毒体免疫的猕猴的血清相比(G3.1到3.6)，通过肌肉内注射用与P1病毒体混合的gp41-病毒体免疫的猕猴的血清样品中测量的IgG(猴G2.1到2.6)。组1(G1.1-1.6)是对照(安慰剂)组；其使用流感病毒体肌肉内免疫。数据为在第24周收集的血清的数据，免疫前背景的OD(第0周)从第24周的OD减去(w24-w0)。样品稀释1∶900。
图5：在用SHIVSF162P3进化枝B阴道内攻击期间或之后的病毒血症。箭头表示用20-30TCID50的13次阴道攻击，在4次疫苗接种的最后一次后的一个月开始，最初攻击后的日期通过斜体数字指出。个体动物的血浆病毒载量通过线表示；2.5×103个拷贝/ml的检测极限通过直线表示。具有标志的线表示个体动物。分组如图3和4中。
图6：通过子宫颈阴道分泌物(CVS)抑制经过上皮细胞的HIV-1转胞吞作用。图A：菌株HIV-1 93BR029(进化枝B)；图B：HIV-1菌株92BR025(进化枝C)；实心条：以1∶6稀释使用的CVS；空心条：1∶10。在不存在针对gp41的特异性IgA抗体的情况下，HIV-1的转胞吞作用能力＞100％有效，而在存在特异性IgA抗-gp41抗体的情况下，使用1∶6稀释的CVS，转胞吞作用可被减小到＞40％。
图7：通过CVS抑制经过上皮细胞的转胞吞作用，其具有或不具有IgA耗竭。实心条：耗竭；阴影线条：未耗竭。当CVS包含粘膜IgA抗体时，可以观察到对HIV-1转胞吞作用的抑制。当IgA从CVS耗竭时，失去对转胞吞作用的抑制。
图8：图A：用菌株SHIV1157ipd3N4对进化枝C病毒攻击后未免疫接种的猴的病毒血症。图B：用来自进化枝B的病毒体gp41-衍生的抗原(实施例6的第3组)免疫接种并用SHIV进化枝C、菌株SHIV1157ipd3N4攻击的猴中的病毒血症。第四次免疫接种后第18个月，动物接受增强剂并且5周后，对其用10-20TCID50阴道内攻击10次。个体动物的血浆病毒载量通过线表示；注意检测极限是103个拷贝/ml。
实施例
实施例1：通过分子生物学构建由SEQ ID No.28和SEQ ID No.21编码的本发明的多肽M0和M1(rgp41)
a)第一步骤：构建qp41-d环(SEQ ID No.27)
通过PCR构建gp41-δ环。
设计引物
使用寡核苷酸引物gp41-Nde(SEQ ID No.22)和寡核苷酸引物gp41-Bam1(SEQ ID No.23)扩增N-螺旋并引入亲水性连接体。设计这些寡核苷酸引物分别引入针对限制酶Nde1和BamH1的位点。也设计寡核苷酸引物gp41-Bam1引入寡肽连接体SGGRGGS(SEQ IDNo.16)来置换环的缺失部分。
通过PCR，使用寡核苷酸引物gp41-Bam2(SEQ ID No.24)和寡核苷酸引物gp41-Xho1(SEQ ID No.25)扩增gp41的C-螺旋。设计这些寡核苷酸引物以分别引入BamH1和Xho1限制酶位点。
PCR的条件
利用上述的寡聚核苷酸引物，通过PCR由gp41母体(SEQ IDNo.26)来扩增gp41-d环多核苷酸。质粒以0.5μg/μl使用，每种引物以10μM使用，每种dNTP以10mM使用。利用Finnzymes的DNA聚合酶DyNazyme进行扩增。用在94℃下变性5分钟的步骤开始扩增，然后进行30个下述循环，每个循环包括：94℃下1分钟的步骤(变性步骤)、60℃下1分钟的步骤(杂交)、72℃下1分钟的步骤(延长)，通过在72℃下10分钟的最后步骤终止扩增。将纯化的PCR产物进行消化，对于pET21b中的插入物，通过Nde1(Ozyme，R0111S)和Xho1(Ozyme，R0146S)。对通过Nde1和Xho1消化的pET21b载体(Novagen)和PCR产物进行提取并纯化。使用Quick连接试剂盒(NewEngland Biolabs)根据制造商的说明书进行连接，产生pET21 b-gp41-d环。
将pET21b-gp41-d环产物转化入DH5-α(Invitrogen)中。
b)第二步骤：构建编码M0多肽(根据本发明的rgp41)的
M0qp41C-d环进化枝B(SEQ ID No.28)
使用Phusion聚合酶(Finnzymes)，对母体GP41-d环(SEQ IDNo.27)进行两个PCR以获得M0gp41 C_进化枝B构建体。用下列引物进行第一个反应：GP41 B-C-D1(SEQ ID No.29)和GP41 B-C-R2(SEQ ID No.30)。用下列引物进行第二个反应：GP41 B-C-D1(SEQID No.29)和GP41 B-C-R1(SEQ ID No.31)。
使用Nde1(Ozyme，R0111S)和Xho1(Ozyme，R0146S)限制酶对阳性PCR产物进行消化，以将Gp41 C_进化枝B编码基因插入pET30b(VWR，69910-3)。使用Nde1和Xho1限制酶(Ozyme)消化pET30b载体。提取并纯化(使用Macherey-Nagel的提取试剂盒，740 609 250)与Gp41 C_进化枝B基因和pET30b相应的DNA片段。使用Quick连接试剂盒(New Englands Biolabs Inc，M2200S)将这两个片段进行连接。使用1μl的连接混合物转化大肠杆菌DH5-α(Invitrogen，12297-016)。在具有30μg/mL的卡那霉素的LB琼脂平板上分离转化体。分离的菌落接种在4mL的补充有30μg/mL卡那霉素的LB培养基中。在37℃和180rpm下，进行培养过夜。根据在来自Macherey-Nagel，Ref.740588-250的Nucleospin Plasmid提取试剂盒中给出的方案，进行从相应细胞团(pellet)提取DNA。通过限制酶消化对其进行分析，并且使用T7prom(SEQ ID No.32)和T7term(SEQ ID No.33)引物测序插入物。
M0gp41d环-C进化枝B的完整的核苷酸序列由SEQ ID No.28表示。
c)第三步骤：构建编码M1多肽(根据本发明的rgp41)的 M1qp41C-d环进化枝B(SEQ ID No.21)
通过PCR构建M1gp41C-d环进化枝B。使用Phusion聚合酶(Finnzymes)，对母体GP41-d环C_进化枝B(SEQID No.28)进行两个PCR以获得M1gp41 C_d环进化枝B。
用下列引物进行第一个反应：GP41 B-C-D1(SEQ ID No.29)和GP41-C3-R1(SEQ ID No.34)。
在用下列引物进行第二个PCR反应之前，使用Nucleospin提取试剂盒(Macherey Nagel，740609250)进行纯化：GP41 B-C-D1(SEQ IDNo.29)和GP41-C3-R2(SEQ ID No.35)。
使用Nde1(Ozyme，R0111S)和Xho1(Ozyme，R0146S)限制酶对阳性PCR产物进行消化，以将M1gp41-d环C_进化枝B编码基因插入pET30b(VWR，69910-3)。使用Nde1和Xho1限制酶(Ozyme)消化pET30b载体。提取并纯化(使用Macherey-Nagel的提取试剂盒，740 609250)与M1gp41-d环C_进化枝B基因和pET30b相应的DNA片段。使用Quick连接试剂盒(New Englands Biolabs Inc，M2200S)将这两个片段进行连接。使用1μl的连接混合物转化大肠杆菌DH5-α(Invitrogen，12297-016)。在具有30μg/mL的卡那霉素的LB琼脂平板上分离转化体。分离的菌落接种在4mL的补充有30μg/mL卡那霉素的LB培养基中。在37℃和180rpm下，进行培养过夜。根据在来自Macherey-Nagel，Ref.740588-250的Nucleospin Plasmid提取试剂盒中给出的方案，进行从相应细胞团(pellet)提取DNA。通过限制酶消化对其进行分析，并且使用T7prom(SEQ ID No.32)和T7term(SEQ ID No.33)引物测序插入物。
M1gp41-d环-C_进化枝B的完整核苷酸序列由SEQ ID No.21表示。
实施例2：在大肠杆菌中复制修饰多肽
a)转化
将pET30b-M0gp41-d环-C进化枝B或pET30b-M1gp41d环-C进化枝B质粒转化到表达性大肠杆菌菌株BLR(DE3)中。M1gp41-d环-C和M0gp41-d环-C进化枝B的表达通过T7启动子驱动。
b)表达测试
将携带有pET30b-M1 gp41d环-C进化枝B或pET30b-M0gp41d环-C进化枝B质粒的大肠杆菌菌株BL21(DE3)的6份培养物在具有30μg/ml卡那霉素的Luria Broth中于37℃下进行生长，直到600nm的光密度达到0.6(分光光度计JascoV-530)。用1mM的IPTG(异丙基BD-硫代半乳糖苷)诱导修饰的多肽，在培养物在37℃下再继续2小时。蛋白质的表达通过SDS-4-12％PAGE进行分离进行检测。
c)制备
1)培养物
将1升BL21(DE3)/pET30b-M1gp41d环-C进化枝B或(DE3)/pET30b-M0gp41d环-C进化枝B的培养物在Luria Broth中于37℃下进行生长，直到在600nm下的光密度达到6.0。用1mM的IPTG诱导gp41-改造环的表达，并且培养物在37℃下再继续2小时。将培养物离心(Centrifuge Beckman Coulter Avanti J20XP，转头为JLA 8-1000，4000×g，30min，4℃)，然后将沉淀物(细胞团，pellet)贮存于80℃下。
2)提取M0或M1 rgp41修饰多肽
用超声缓冲液(40mL的Tris-HCl 50mM pH8，NaCl 300mM)将沉淀物进行重悬。在冰/乙醇上进行15分钟超声处理步骤(破碎机UP200S幅度80％，系数0.5)以破裂细菌。然后，将悬液在40 000×g于4℃下离心30分钟(Centrifuge Beckman Coulter Avanti J20XP，转头为JA20)，以分离可溶性蛋白质(上清液)和不可溶性蛋白质(沉淀)。
d)纯化M1 rgp41修饰多肽
1)亲和层析
通过在Ni SepharoseTM 6 Fast Flow介质填充的XK16/20柱(GEHealthcare)上进行亲和层析进行纯化M1(由M1 gp41 d环-C进化枝B，编码，SEQ ID No.21)的第一步骤，其中每1L瓶中的培养物1mL培养基的柱体积。特定的间隔肽能够使用亲和层析步骤作为捕获步骤以回收M0或M1的可溶部分。因为蛋白的低产率，这是适当的。用缓冲液——磷酸钠50mM pH7.5、NaCl 300mM、β-巯基乙醇5mM——平衡该柱。在磷酸钠50mM pH7.5、NaCl 300mM、β-巯基乙醇5mM、MgCl22mM、Leupeptine和Pepstatine 0.1mM中的M1肽的澄清样品以2ml/min加载到柱上。然后，用平衡缓冲液洗涤该柱，并且洗脱步骤在25mM、50mM和150mM咪唑下进行。使用缓冲液——磷酸钠50mM pH7.5、NaCl 300mM、β-巯基乙醇5mM、咪唑300mM——以4mL/min洗脱M1 gp41。终浓度0.05％的Tween
20被加入到混合部分亲和层析上，并且在4℃下、在缓慢磁搅拌下对缓冲液——磷酸钠50mM pH7.5、NaCl300mM、TCEP 1mM、Tween20 0.05％——进行透析。然后，通过在Amicon 10kDa浓度单位(Millipore)上离心对样品浓缩3次。
2)尺寸排阻层析
通过使用柱体积320ml的SuperdexTM 200制备级介质填充的XK26/60柱(GE Healthcare)的尺寸排阻层析进行M1的第二纯化步骤。用缓冲液——磷酸钠50mM pH7.5、NaCl 300mM、TCEP 1mM、Tween200.05％——平衡该柱。将磷酸钠50mM pH7.5、NaCl 300mM、TCEP1mM、Tween20 0.05％中M1以1.5ml/min加载到柱上，并且用平衡缓冲液以2.5ml/min进行洗脱。根据校准曲线，作为可溶三聚体洗脱蛋白质。因此，在M1或M0的C-末端部分包含半胱氨酸残基的间隔区的存在不会改变蛋白质的构象状态。
实施例3：交叉反应性
将四种蛋白点加在硝化纤维素膜上：wt gp41-HA(在Tris 50mM pH8，NaCl 200mM，Triton X-100 0.1％，0.1mg/ml中，与HA标签(GenBankAF348176)融合的天然gp41)；Gp41-δ环(SEQ ID No.38)，其与图1的天然gp41片段不同，主要在于在簇I中的25个残基用SEQ ID No.16的连接体置换，处于Tris 50mM pH 8，NaCl 200mM，甘油5％，0.2mg/ml；Gp41-改造环(SEQ ID No.37)，其与图1的天然gp41片段不同，主要在于在簇I中的12个残基用SEQ ID No.16的连接体置换，处于Tris 50mM pH 8，NaCl 200mM，咪唑200mM，甘油5％，0.2mg/ml；人重组IL-2，处于Tris 50mM pH 8，NaCl 200mM，0.1mg/ml和阴性对照(牛血清白蛋白)(图2)。
在37℃下温育该膜，然后放入20ml的PBS Tween 0.3％、5％乳——中搅拌下持续额外一个小时。98.6D抗体(来自NIBSC，UK的抗-GP41人单克隆抗体)和AF-202抗体(来自R&D系统的抗-人-IL-2抗体)分别以0.05μg/ml或0.5μg/ml的终浓度加入20ml的PBS Tween 200.3％、5％乳中搅拌下持续一个小时。将适当浓度的抗-lgG过氧化物酶偶联的抗体加入到20ml的PBS Tween 0.3％、乳5％中搅拌下持续一个小时，并且洗涤印记3次，15分钟，每一次在PBS Tween 0.3％中进行。然后，用商用增强化学发光试剂盒(Amersham)显示过氧化物酶活性，并且将Kodak膜暴露于印记，如本领域已知的。
如在图2中所示，天然Gp41被抗-人IL-2抗体强烈识别，在簇I中25个残基的置换消除了人抗-IL-2抗体对该蛋白的识别，在簇I中12个残基的置换部分消除了人抗-IL-2抗体的活性，重组人IL-2如所期望的被AF-202抗-IL-2抗体强烈识别。然而，连接体进行的12或25个氨基酸的置换不会影响抗-gp41单克隆抗体98.6的识别。
实施例4：rgp41多肽的溶解性测试
表达根据本发明的gp41多肽的大肠杆菌培养物在4000g、4℃下离心15分钟。将沉淀物重悬在一定体积的裂解缓冲液中：磷酸盐50mMpH 7.5、NaCl 300mM、MgCl2 2mM、β-巯基乙醇5mM、benzonase 1μM，pepstatine 1μM、leupeptine 1μM，以达到OD 600nm＝10。将溶液在4℃下温育30分钟。通过三个周期的冷冻/融化进行细胞裂解。通过4℃下以21000g离心30分钟，分离可溶的和不可溶的蛋白质。通过SDS-PAGE 4-12％电游然后考马斯蓝染色，分析10微升蛋白质以测定溶解性水平。发现rgp41多肽存在于悬浮液中。因此该蛋白质是可溶的。
实施例5：制备在外表面上呈递在大肠杆菌中生产的gp41多肽的病毒体样小泡(rgp41-病毒体)和制备在外表面上呈递合成肽的病毒体(P1-病毒体)
基本如WO 2007/099387中所述制备病毒体样小泡。
简言之，流感A病毒/Singapore/6/86病毒在胚卵中生长，并且用β-丙内酯失活，如本领域已知的。将该病毒溶解在磷酸缓冲盐溶液(PBS)中的100mM八乙二醇一癸基醚(OEG)中，并且通过超速离心除去病毒核壳体。将含有4mg血细胞凝集素的溶解膜与溶解在含100mMOEG的2ml PBS中的32mg卵磷脂酰胆碱(PC)和8mg的磷脂酰乙醇胺(PE)混合。磷脂和如上所述含有血细胞凝集素的溶液混合并超声处理1分钟。在100 000g下离心该溶液1h，并且通过过滤对病毒膜制剂/脂质混合物灭菌。
如下，本发明的C-末端位置包括间隔区和半胱氨酸残基的多肽(SEQ ID NO 19)通过N-末端处的马来酰亚胺-琥珀酸酯连接体与磷脂酰乙醇胺(PE)的区域异构体缀合。
将磷脂酰乙醇胺(PE)溶于甲醇并且加入0.1％的(v/v)三乙胺。然后将该溶液与预先溶于二甲亚砜(DMSO)(20μl)的异双官能交联连接体N-[γ]-马来酰亚胺基丁酰氧基-琥珀酰胺-酯(GMBS)(PierceChemical Company，ROCkfOrd，IL)(比例，PE∶GMBS＝5∶1)混合。在室温下温育30分钟后，在真空中用真空离心蒸发浓缩器离心蒸发溶剂1小时。然后将GMBS-PE溶于含100mM八乙二醇(OEG)(FlukeChemicals，Switzerland)的1ml PBS(PBS-OEG)，并且加入本发明的在C-末端位置包含具有半胱氨酸残基的片段S的多肽(SEQ ID No19)(比例PE-GMBS∶多肽＝5∶1)。在该步骤中，使磷脂酰乙醇胺-GMBS与gpP1多肽的游离C-末端半胱氨酸的巯基反应。在30分钟温育后，加入过量游离的半胱氨酸以猝灭任何剩余的游离GMBS(比例，半胱氨酸∶GMBS＝10∶1)。
如上所述，以每ml血细胞凝集素1mg rgp41的比例，将脂质-缀合的多肽加入到含血细胞凝集素的病毒膜制剂/脂质混合物，并且通过在SM-2 BioBeads(BioRad，Glattbrugg，Switzerland)珠上除去洗涤剂，形成rgp41-病毒体。
同样地，通过本领域已知的固相Fmoc化学，氨基酸序列相应于SEQ ID No.5(SQTQQGKNEQELLELDKWASLWNWFDITNWLWYIKLSC-羧甲基(1，3-二棕榈酰基-甘油-2-磷脂酰基乙醇氨基))-OH的脂质-连接的合成肽P1被合称为TFA盐SQTQQGKNEQELLELDKWASLWNWFDITNWLWYIKLS-羟基半胱氨酸，并经由其C-末端羟基半胱氨酸使用溴乙酰基-磷脂酰基乙醇胺被连接到磷脂酰乙醇胺。在通过制备HPLC纯化和离子交换产生其乙酸盐后，冻干该肽，溶解在PBS-OEG中与病毒膜制剂/脂质混合物以每mg病毒血细胞凝集素5mgP1的比例混合，并且通过洗涤剂去除形成P1-病毒体。
实施例6：用包含本发明的rgp41-病毒体样小泡和本发明的P1-病毒体的疫苗组合物免疫猕猴
如下进行，用包含具有如上所述的rgp41多肽的病毒体样小泡以及具有位于外表面的gp41衍生的抗原肽P1的病毒体样小泡的疫苗组合物免疫猕猴。
使用3组平均年龄大约5岁的5只雌性猕猴。在首次给予疫苗之前4周，所有猕猴接受剂溶内注射β-丙内酯失活的流感新加坡6/86(100μl，0.01mg/ml)。此后，在第0、7、15和24周进行用水溶液中病毒体样小泡(40μg的P1-病毒体和40μg的rgp41-病毒体，100μl)免疫接种猕猴。第一组(猴G1.1到G 1.6)接受流感病毒体，没有gp41抗原(安慰剂)。第二组(G2.1-2.6)在每次疫苗接种时接受用P1-病毒体和gp41-病毒体两者的四次肌肉内免疫接种，第三组(G3.1-3.6)接受两次肌肉内免接种(第0周和第7周)，然后以喷雾剂给予两次鼻内疫苗接种(第15周和第24周)，每一次使用P1-病毒体和gp41-病毒体两者。第3组种的一只动物(3.2)死于与疫苗接种无关的原因。
在每次疫苗接种时间点，采集血清样品。
根据下列ELISA方案，测定血清中总IgG和IgA抗体。在4℃下，使用在碳酸氢盐缓冲液50mM，pH 9.6中的肽P1(SEQ ID No.5)100ng/100μl/孔或本发明的rgp41(SEQ ID No.19，100ng/100μl/孔)包被ELISA平板(Nunc)过夜。在37℃下，用BSA 2％PBS Tween 0.1％饱和平板1小时，然后用PBS-Tween 0.1％缓冲液洗涤。对于IgA，用PBS Tween 0.1％稀释血清1/300，或对于IgG，用PBS Tween 0.1％稀释血清1/200，将它们在4℃下温育过夜。此后，用PBS-Tween 0.1％缓冲液冲洗平板。为了检测猕猴IgG，使用与生物素(Rockland)(1/15000)偶联的抗-猕猴IgG山羊抗体，随后与1/50000稀释的链霉抗生物素-HRP(Immunotech)一起温育。
为了检测猕猴IgA，使用与生物素(Rockland)(1/15000)偶联的抗-猕猴IgA山羊抗体，随后与1/50000稀释的链霉抗生物素-HRP(Immunotech)一起温育。
将2F5-lgA单克隆抗体用作阳性对照，然后与抗-人IgA生物素标记的山羊Fab′2(最终0.14μg/ml)(Caltag H 14015)一起温育，并且使用链霉抗生物素-HRP(1/50,000)显示。将2F5-lgG单克隆抗体用作阳性对照，然后与生物素酰化的抗-人IgG山羊Fab′2(最终0.1μg/ml)(Rockland 609106123)一起温育，并且使用链霉抗生物素-HRP(1/50,000)显示。在37℃下，将抗体温育1小时。通过添加底物TMB引起比色反应并且通过添加H2PO4 1M终止。在450nm下读取光密度(OD)。
结果在图3(血清中gp41-特异性IgA)和图4(血清中gp41-特异性IgG)图解。结果示出肌肉内免疫接种的雌性猕猴在其血清中具有高水平的特异性IgG和IgA抗-gp41抗体。结论，IgG以及IgA抗体的存在在来自免疫雌性猕猴的血清中观察到。该结果显示用IgA的免疫应答可以用本发明的疫苗获得。
为了研究免疫接种是否已经诱导粘膜免疫性，在第24周，通过引入3ml含抗生素和蛋白酶抑制剂的PBS，从实施例6的所有免疫接种的动物获得子宫颈-阴道样品样品。离心样品以除去碎片，将样品等分，立刻速冻并将其储存在-80℃。通过如上所述ELISA测定粘膜P1抗体，同时根据Tudor等.，2009，Mucosal Immunol.2，412-426，测定进化枝B抗-gp41抗体。结果表示为具有标准偏差两倍抗体浓度的动物的数量，并且与血清抗体测定的结果相比较，以相似方式表示(表I)。来自猴3.2的血清被从分析排除。
表I
另外，观察到IgA和IgG抗体也在生殖道中诱导，而IgA在肠道室中检测到，这甚至在不存在佐剂下通过肌肉内注射免疫接种后。
实施例7：保护对免疫接种猕猴的异源攻击
如下，用活病毒攻击实施例6的猴：在最后免疫接种后四周，用低剂量(20-30TCID50)的SHIVSF162P3阴道内攻击动物13次，每4-7天一次，在图5中所示。该嵌合猿猴/进化枝B人类免疫缺陷病毒具有病原性SIVmac239作为骨架，包含来自HIV-1 SF162P3的env(gp120+gp41)、tat、rev和vpu基因。该病毒识别受体CCR5，与用于衍生本发明的gp41-构建体和本发明的肽P1的X4热带HxB2菌株不同。因此，该攻击是使用异源病毒的攻击。该病毒由NIAID(NationalInstitute of Allergy and Infectious diseases)、NIH(National Institutes ofHealth)Bethesda，USA)在2ml PBS中提供。
如在图5中所示，所有为免疫接种的猴(安慰剂，第1组)被病毒迅速感染，血浆病毒载量的峰在两周内出现，大约每毫升106到107个拷贝，如所预期的(Hessell，AJ.等.Nat.Med.15，951-959)。第2组中50％的猴(肌肉内免疫接种)被保护。第3组中所有动物(肌肉内/鼻内)被保护；一只动物(第3.3号)具有延迟并且低的病毒血症——800个拷贝/ml——持续大约1周，并且此后为阴性的；为了证实，用较低的检测阈值重复对样品的分析(图5)。第3组中一只动物死于与攻击无关的原因。这些数据表明接种疫苗保护动物免于异源攻击，尽管第3组具有低水平的全身性中和抗体。
实施例8：抑制转胞吞作用和交叉-进化枝保护
为了研究免疫接种是否已经诱导粘膜免疫性，如在实施例6中所述获得的子宫颈-阴道通过HIV-1转胞吞作用抑制分析进行分析，如前所述(Bomsel等，1997.Nat.Med.3：42-47)地进行。对在可透性滤膜支持物(0.45μm孔径)上生长为致密极化单层达7天的肠细胞系HT-29研究在HIV-1经过上皮细胞的转胞吞作用和通过抗体中和转胞吞作用，从而形成独立的室之间界面，上部浸浴了上皮单层的上(腔)表面，而下部浸浴了基底外侧表面。在转胞吞作用实验之前，洗涤上皮细胞，并且进一步在RPMI 1640，谷氨酸盐，10％FCS中温育。来自第一组(安慰剂)或第3组(W24；i.m.+i.n.-参见上述实施例7)的子宫颈-阴道分泌物(CVS)样品(1/12和1/6稀释)与HIV-1感染的细胞(1×106HIV-193BR029病毒(HIV1进化枝B)或具有92BR025病毒(HIV1进化枝C)+PBMCs)在室温下一起预温育20分钟(用JRCSF或原初病毒感染用感染活化的来自健康个体的PBMC后7天)。然后，将预温育的HIV-1感染的细胞加到上室。HIV-1感染的细胞和上皮细胞单层之间的接触导致HIV-1病毒体的快速萌发，随后HIV颗粒相互作用和转胞吞作用从上部到达上皮细胞单层的基底外侧。2h后，通过商用ELISA(Coulter，Villepinte，France)在检测基底外侧培养基中的p24测定通过CVS对转胞吞作用的抑制。在2小时的感染细胞与上皮细胞接触期间，上皮单层的屏障功能保持完整，这排除了HIV-1感染细胞穿透入单层或HIV感染的细胞易位入基底外侧室(1)。HIV-1转胞吞作用结果在图6中示出。明显地，进化枝B病毒的转胞吞作用被免疫接种动物的CVS所抑制。然而，令人吃惊地，免疫接种也诱导了对进化枝C病毒的抑制活性，如通过HIV-1各自对照的减少的转胞吞作用所示(交叉-进化枝保护)，这暗示存在共有的构象表位，因为氨基酸序列在使用的病毒之间是不同的。
实施例9：在疫苗接种动物的CNS中的分泌IgA抑制转胞吞作用
将如在实施例8中所述从动物收获的子宫颈-阴道分泌物的样品通过与生物素酰化-抗猕猴IgA抗体温育，耗竭IgA，如下所述。将生物素酰化-抗人IgA(Caltag，france)与链霉抗生物素-琼脂糖(Pierde，France)以1∶3重量比结合，洗涤并且偶联的珠以除去为未结合的生物素酰化抗-lgA。在4℃下，将30μl的珠与CVS(1∶6稀释)一起旋转过夜，并且在1000g下离心10分钟。收集并分析所得到的上清液，然后与链霉抗生物素-琼脂糖珠(Pierde，France)一起温育，并且离心以除去该珠。然后，使用进化枝B 93BR029病毒，如实施例8所述的，测试这些IgA-耗竭的样品的转胞吞作用分析，并将其与没有IgA耗竭的样品进行比较。如在图7中所示，在耗竭IgA，对HIV-1的转胞吞作用有很小或没有抑制作用，这清楚地表明粘膜而不是血清的IgA在保护免于感染中起作用。
实施例10：体内交叉-进化枝保护
因为在分析中观察到对体外交叉-进化枝转胞吞作用的抑制，如上所述，所以决定用进化枝C病毒攻击实施例6的第3组的猴(用进化枝B基病毒体进行鼻内和肌肉内疫苗接种)。在用病毒体进行其最后疫苗接种后一年，猴仍然是血清反应阴性的。通过如上在实施例6中所述的肌肉内注射，将它们再免疫接种一次，并且在免疫接种后5周，以4-7天的间隔用10-20TCID50的SHIV1157ipd3N4(进化枝C，向性R5，由Dr.Ruth Ruprecht，Dana Farber Cancer Institute，USA友好提供)攻击它们10次。在每个免疫接种时间点，采血样以测定病毒血症。在后，每4-7天采血样，持续60天(图8)。如在图8中所示，感染后前40天，没有免疫接种的动物被感染。在未免疫接种的对照组中，5/6猴在第11天被感染(图9)，并且在第60天，所有动物被感染。在免疫接种组，在120天的研究期间，2/5猴保持未被感染，而对于感染的那些，各自比对照组明显延迟。
这些令人吃惊的数据为体内交叉-进化枝保护提供了明显的证据。
Claims (17)
1.治疗或预防性治疗HIV的方法，特别是预防性疫苗的方法，所述方法包括至少以下步骤：
a)对患者给药第一抗原，所述第一抗原包括gp41的膜近端胞外域(MPER)的广泛中和表位，及
b)给药相同患者第二抗原，该第二抗原包括修饰后的多肽——含有三个连续片段N、L和C，由通式N-L-C表示，所述多肽还包括：gp41的N-螺旋区域(N)、gp41的C-螺旋区域(C)和连接环，所述连接环包括在N和C-螺旋之间的合成连接体(L)，连接体取代gp41的氨基酸593-617，编号方案根据原型分离物HIV-1 HxB2进化支B菌株，所述多肽包括calveolin-1中和及98.6D表位，但没有2F5和4E10表位，不是融合肽，所述多肽具有与人白细胞介素2的最低限度的免疫交叉反应性。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一抗原包括2F5和4E10表位。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述第一抗原包括gp41的氨基酸片段649-683，编号方案根据原型分离物HIV-1 HxB2。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一抗原包括中和IgA表位。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一抗原包括由SEQ IDNo.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5或SEQID No.6所示的氨基酸序列。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一抗原连接到病毒体。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述第二抗原包括由SEQ IDNo.19或SEQID No.20所示的氨基酸序列。
8.根据权利要求1所述的方法，其中所述第二抗原与病毒体轭合。
9.根据权利要求1所述的方法，包括以相同或分别不同的剂量对相同患者联合给药所述第一抗原和所述第二抗原。
10.根据权利要求1所述的方法，包括以至少两种不同的施用路径，在同一时间或分别在不同或相继时间联合给药所述第一和第二抗原。
11.根据权利要求9所述的方法，包括通过全身途径和局部途径联合给药所述第一和第二抗原，所述全身途径诸如注射，例如肌肉注射，所述局部途径诸如通过粘膜上皮组织，例如通过鼻腔吸入。
12.根据权利要求9所述的方法，包括通过相同途径——例如全身途径——在同一时间或分别在不同或在相继时间，对相同患者联合给药所述第一和第二抗原。
13.本发明的预防疾病方法，体内执行至少一种下列功能：
a)诱导先天或适应性免疫反应，诸如全身和/或粘膜抗体——含有抗HIV-1的IgA和/或IgG亚型，
b)控制和/或删除HIV-1感染病人的病毒血症；
c)阻止或减少HIV病毒跨过粘膜上皮组织进入；
d)防止或减少原发性HIV感染粘膜上皮组织下方的固有层，
e)防止或减少病毒在肠道中的迁移和迁移至淋巴结；
f)防止或减少HIV感染淋巴结；
g)在生殖器和肠道隔室中触发抗HIV的粘膜免疫反应；
h)促进全身和粘膜免疫反应抵抗HIV；
i)控制HIV感染，诸如，获得延迟、瞬时、或次等的感染；
j)预防HIV的转胞吞作用；
k)体内中和HIV感染；
l)诱导抗体依赖性细胞毒性。
14.一种治疗组合物或制剂，其包括分别由权利要求1所限定的第一抗原和第二抗原。
15.根据权利要求14所述的治疗组合物或制剂，其中所述第一抗原和所述第二抗原是相同剂量，或分别是不同剂量或不同剂型。
16.一种治疗、特别是预防性治疗疫苗联合体：
-第一药物，其包括如权利要求1所述的第一抗原，和
-第二药物，其包括如权利要求1所述的第二抗原。
17.试剂盒，其实施如权利要求1-3中所述的治疗方法，所述试剂盒包括所述第一和第二抗原。
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