CN1135237A - 诱导针对遗传趋异性hiv-1毒株的中和性抗体的肽 - Google Patents
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Abstract
描述了一种能诱导抗体的肽，这些肽优选包括由粘膜表面分泌的分泌抗体，这些抗体对HIV-1的不同毒株和临床分离物具有中和活性，并能抑制由HIV-1引起的细胞融合。所述肽由7个或8个氨基酸的顺序组成。该顺序分别相应于HIV分离物BH10的gp160的gp41上662-668位的顺序(ELDKWAS)或661-668位的顺序(LELDKWAS)。所述肽优选包括由顺序ELDNWAS、ELNKWAS、LELDNWAS或LELNKWAS组成的肽，或者在遗传上由上列顺序编码的肽：相应于所述氨基酸顺序的核苷酸顺序，或与所述核苷酸顺序杂交的顺序、或用简并法由所述核苷酸顺序推测出的顺序。优选的是，这些肽置换一种病毒蛋白的一部分或若干部分氨基酸顺序，或者插入在一种病毒蛋白的抗原位点中(例如通过各核苷酸顺序的融合)，然后在生物表达系统中进行融合基因的表达。
Description
本发明涉及能够诱导针对HIV-1的不同毒株和临床分离物的中和性抗体的肽、以及用该肽诱导出的抗体，还涉及能把这些肽有效呈递给免疫系统的肽-载体结合物的制备。更具体地说，本发明涉及针对HIV-1的疫苗的建立。
获得性免疫缺陷综合症(艾滋病)是一型人免疫缺陷病毒(HIV-1)长期持续性感染的后期临床表现。持续感染期间针对该病毒及病毒感染细胞的免疫反应通常不能介导感染的消除。疫苗会诱导出免疫反应，这些免疫反应能防止持续感染的确立，甚至能防止发展为艾滋病。多数针对HIV-1的疫苗都着眼于其表面糖蛋白gp160，该蛋白由gp120和gp41组成，负责病毒与细胞受体CD4的结合，并负责触发后续的融合活性。
然而，就gp160而言，所观察到的一些现象反对用整个gp160或gp120作为免疫原的作法提出了异议。体外实验表明，gp120和gp120特异性抗体之间的协同作用阻断了人T细胞的活化(Mittler等人，Science245：1380，1989)。此外，已知gp160上的一些抗原区能诱导增强HIV-1感染的抗体(Jiang等，J.Exp.Med.174：1557，1991)。
用合成肽作免疫原有许多优点。合成肽诱导的抗体具有预定的特异性，在病毒的情况下，可以对合成肽加以选择使其具有病毒粒子表面的结构。合成多肽的有趣之处还在于它们能诱导正常条件下看不到的抗体反应。例如，有可能诱导出比整个蛋白诱导出的抗体反应范围更宽的中和性抗体(Green等人，Cell28：477，1982)。
此外，已证明含有HIV-1分离物HIV-1IIIb的gp120的部分V3环的肽所诱导出的抗体，能预防黑猩猩免受该HIV-1分离物的侵染(Emini等，Nature355：728，1992)。
由于合成肽本身的免疫原性差，必须使其与具有佐剂作用的分子如破伤风类毒素或钥孔血蓝蛋白偶联(Bittle等人，Nature298：30，1982)。另一种作法是克隆一些与日本裂体吸虫谷胱甘肽S-转移酶融合的蛋白形式的小肽(Fikrig等人，Science250：553，1990)。
另外，诸如牛痘病毒、脊髓灰质炎病毒或流感病毒等病毒，可以作为免疫原的载体使用。用含有乙型肝炎表面抗原(HBsAg)顺序、单纯性疱疹病毒糖蛋白D顺序及流感病毒血细胞凝集素顺序的重组牛痘病毒接种的家兔，产生针对所有上述三种外来抗原的抗体(Perkus等人，Science229：981，1985)。此外，表达HIV-1的gp41上的抗原决定基的嵌合脊髓灰质炎病毒，能在家兔体内成功诱导出针对HIV-1的中和性抗体(Evans等人，Nature339：385，1989)。
最近以来，也有可能用体外诱变法改变流感病毒的基因组(Enami等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA87：3802，1990)。借助这一技术，有可能加工出一种稳定的减毒甲型流感病毒(Muster等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA88：5177，1991)。
在这方面，流感病毒的优点是可以得到许多变异体，从而有可能进行反复的接种。另外，流感病毒能诱导出强的体液免疫和细胞免疫反应，这对抗HIV-1疫苗途径是有利的。
本发明的目的是提供一些就整个gp160而言只略有免疫原性的肽顺序，这些肽顺序可用于诱导对HIV-1的不同毒株和/或临床分离物具有中和活性并且/或者能抑制哺乳动物体内由HIV-1引起的细胞融合的抗体。
本发明的另一目的是提供诱导由粘膜表面分泌的针对HIV-1病毒和病毒感染细胞的分泌抗体的方法。本发明假定，在粘膜组织中诱导抗HIV-1 IgA抗体特别为预防和防止有潜在危险个体的HIV-1感染提供了一种有力的工具，因为包括HIV-1在内的许多病毒感染都是通过呼吸道、胃肠道和生殖道的粘膜表面传播的。
达到上述目的的方法是：制备由化学合成法或微生物学方法得到的7或8个氨基酸的小肽，这些肽优选是由编码以下顺序的核酸顺序衍生的：Glu Leu Asp Lys Trp Ala Ser(单字母代码为ELDKWAS)、Leu Glu Leu Asp Lys Trp Ala Ser(LELDKWAS)、Glu Leu Asn Lys TrpAla Ser(ELNKWAS)、Leu Glu Leu Asn Lys Trp AlaSer(LELNKWAS)、Glu Leu Asp Asn Trp Ala Ser(ELDNWAS)或LeuGlu Leu Asp Asn Trp Ala Ser(LELDNWAS)。
然后，可以将上述6个氨基酸顺序中的至少一个(优选所有的)有效地呈递给免疫系统，以便诱导抗体的形成和释放，这些抗体对HIV-1毒株具有中和活性并且/或者能抑制由这些病毒引起的细胞融合。
本发明的主要目标是提供一种有前途的抗HIV-1疫苗，这种疫苗是以含有至少一种上述肽，优选含有所述上述六种肽的混合物的制剂为基础的。本发明的特有特征和优选实施方案描述如下。
在本发明的一个优选实施方案中，使限定人单克隆抗体2F5(由杂交瘤细胞系2F5制得，该细胞系的PHLS保藏号为90091704，保藏日为1990年9月17日)抗原决定基顺序的氨基酸顺序Glu Leu AspLys Trp Ala(ELDKWA)，与位于gp41上限定2F5抗原决定基的ELDKWA顺序附近的Ser或Leu与Ser二者连接，从而分别建立肽顺序Glu Leu Asp Lys Trp Ala Ser(ELDKWAS)和Leu Glu Leu Asp LysTrp Ala Ser(LELDKWAS)，再将其插入到载体分子即流感病毒HA的抗原位点B中。
经修饰的携有外源氨基酸顺序ELDKWAS或LELDKWAS的“嵌合”HA融合蛋白，在优选以注射形式施用于哺乳动物特别是人的免疫系统后，能非常有效地诱导出针对所呈递的ELDKWAS或LELDKWAS顺序的抗体。用该方法得到的抗体对HIV-1的不同毒株和/或临床分离物具有中和活性。
然而，现已证明，由于已知的HIV-1病毒的多形性，甚至gp41的高度保守的(L)ELDKWAS氨基酸顺序内也会发生突变，而这一顺序相应于HIV-1分离物BH10的氨基酸661-668(LELDKWAS)或662-668(ELDKWAS)。本说明书中采用的核苷酸和氨基酸编号相应于Los Alamos数据库中采用的HIV-1分离物BH10的gp160的编号(Myers等人，Data Base Human Retrovirusand Aids)。这些突变尤其影响所述顺序中间的Asp(D)和/或Lys(K)氨基酸，从而降低了病毒对被携有2F5抗原决定基的抗体中和的敏感性。然而，用本发明的一些肽能成功克服这种不希望的病毒回避机制，这些肽中Asp(D)或相邻的Lys(K)被天冬酰胺(N)置换。
可以利用至少一种所述肽，优选所有六种所述肽的混合物，制备用于诱导抗体的药物，这些抗体对HIV-1的不同毒株和/或临床分离物具有中和活性，并且/或者能抑制HIV-1引起的细胞融合。
在另一个实施方案中，可以使用同样的肽来制备一种药物，这种药物在优选鼻内施用于哺乳动物后能诱导出由粘膜表面分泌的抗HIV-1 IgA抗体。这些肽既可以每种肽单独使用，也可以与至少一种其他所述肽混合使用。
在本发明的另一个实施方案中，所述六种肽中的至少一种与一种载体连接。这种载体可以是例如病毒，优选减毒和/或重组形式的病毒。最好使用流感毒、杆状病毒或牛痘病毒。小肽与诸如病毒蛋白或完整病毒等载体连接后，增强了这些嵌合肽—载体结合物或嵌合融合蛋白呈递给免疫系统后诱导抗体的效力。
特别有利的是以与载体病毒蛋白的融合蛋白形式使用每一种上述肽，其中至少一种本发明的氨基酸顺序替换了至少一部分病毒载体蛋白，或者插入到病毒蛋白的至少一个抗原位点中。所以，这一特征构成了一个重要的实施方案。在一个优选的实施方案中，所述病毒蛋白是流感病毒的血细胞凝集素(HA)、流感病毒的神经氨酸苷酶(NA)或乙型肝炎病毒的表面抗原。在另一个实施方案中，该表面蛋白可得自优选为重组形式的杆状病毒或牛痘病毒。
本发明还涉及任一种由7个或8个氨基酸组成的上述肽和/或肽—载体结合物或融合蛋白在药物制备中的应用，所述药物用于诱导抗体，这些抗体对HIV-1的不同毒株和/或临床分离物具有中和活性，并且/或者抑制HIV-1引起的细胞融合。更具体地说，打算提供一种有效的疫苗用于对受HIV-1威胁的个体进行预防和/或对HIV-1感染患者进行治疗，尤其是预防感染发展成艾滋病，所述疫苗的基础是至少一种所述肽，优选所有六种所述肽的混合物，以及/或者与载体连接的所述六种肽。
在另一个优选实施方案中，利用所述六种肽和/或与载体连接的所述六种肽来制备和生产药物制剂，这些药物在施用于哺乳动物的免疫系统后能诱导出由动物或人类患者的粘膜表面分泌出的抗HIV-1IgA抗体。在这种情况下优选鼻内施用。
因此，本发明的所述六种肽和/或肽—载体结合物还可以用于生产一种药物，用于预防危险个体的HIV-1感染。
看来，本发明的这一特有特征使人们有望通过按照本发明在粘膜表面诱导抗HIV-1特异性分泌IgA抗体，提供一种早在病毒进入哺乳动物体内的最初阶段就有效进攻侵入病毒的医学工具。据信，先有技术治疗HIV-1感染患者的方法至少在某种程度上不能防御疾病，因为病毒主要在血流中被追踪，而且是在很晚的阶段，即广泛分布于体液系统中之后才被追踪的。
本发明进一步涉及一种具有HIV-1中和活性并能够防止由HIV-1引起的细胞融合的抗体，其特征在于，该抗体是由六种所述肽之一诱导的。
在一个优选实施方案中，所述抗体是一种分泌抗体，优选为抗HIV-1 IgA抗体，最好是由粘膜表面分泌的抗体。
进一步，本发明还涉及用微生物学方法或化学方法制备所述六种肽中任一种的方法。
在一个实施方案中，所述六种肽是按标准生物医学程序化学合成的，优选用Applied Biosystems431A型肽合成仪进行合成。
在另一个实施方案中，所述氨基酸顺序是用一种微生物学方法得到的，该方法包括如下步骤：在宿主生物的基因组中插入一段核苷酸顺序，用标准微生物学培养技术进行基因组的表达，分离至少一种(优选多种)所述肽，其中所述核苷酸顺序选自：
a)相应于所述六种肽之一的核苷酸顺序；
b)与a)中的核苷酸顺序之一杂交的核苷酸顺序；
c)用简并法由a)中的核苷酸顺序之一推测出的核苷酸顺序。
嵌合融合蛋白或肽—载体结合物可以按以下实施方案来制备，该实施方案包括：用化学方法或微生物学方法，使选自所述六种肽的氨基酸顺序与一种载体(优选病毒或病毒蛋白)连接。
在一个优选实施方案中，制备与载体(优选病毒或病毒蛋白)连接的所述六种肽的方法是微生物学方法，该方法包括以下步骤：使一个核苷酸顺序与一个相应于载体氨基酸顺序的核苷酸顺序连接，将连接后的核苷酸顺序转移到一个宿主生物中，用标准微生物学技术进行连接后顺序的表达，分离至少一种(优选多种)与载体连接的所述肽，其中所述核苷酸顺序选自：
a)相应于所述六种肽的氨基酸顺序之一的核苷酸顺序；
b)与a)中的核苷酸顺序之一杂交的核苷酸顺序；
c)用简并法由a)中的核苷酸顺序之一推测出的核苷酸顺序。
在另一个实施方案中，制备与载体(优选病毒或病毒蛋白)连接的所述六种肽的方法的特征是：使至少一个核苷酸顺序与相应于载体病毒蛋白氨基酸顺序的核苷酸顺序连接，从而置换至少一部分相应于病毒蛋白氨基酸顺序的核苷酸顺序，或者插入到所述顺序相应于病毒蛋白抗原位点的至少一个位点中，其中所述核苷酸顺序选自：
a)相应于所述六种肽的氨基酸顺序之一的核苷酸顺序；
b)与a)中的核苷酸顺序之一杂交的核苷酸顺序；
c)用简并法由a)中的核苷酸顺序之一推测出的核苷酸顺序。
在一个具体实施方案中，所施用的病毒蛋白选自流感病毒的血细胞凝集素、流感病毒的神经氨酸苷酶和乙型肝炎病毒的表面抗原。在另一个特征性实施方案中，用流感病毒、杆状病毒或牛痘病毒作为宿主生物，这些病毒都优选为重组形式。
在除WSN(在下列实施例中主要述及该病毒株)以外的流感病毒株的HA抗原位点B中插入所述六种肽的顺序，同样会产生能诱导中和性抗HIV-1抗体并防止HIV-1驱动性细胞融合的融合蛋白和/或嵌合病毒。
另外，将这些顺序导入流感病毒HA的其他位点或导入流感病毒的神经氨酸苷酶(NA)中，将产生能诱导中和性抗HIV抗体并防止HIV驱动性细胞融合的肽—载体融合蛋白和/或嵌合病毒。
以下实施例将进一步说明本发明，这些实施例决不限制本发明的范围。
实施例1：抗原决定基图谱测定
用Towbin等人(Proc.Natl.Acad.Sci.USA76：4350，1979)的免疫印迹法鉴定单克隆抗体2F5的抗原决定基。以与谷胱甘肽转移酶融合肽的形式克隆出HIV-1分离物BH10的gp41重叠片段的肽。通过克隆在质粒pGEX-2T(Pharmacia)的BamHI和EcoRI位点之间的gp41相应寡核苷酸的杂交，得到不同的融合肽。将重组质粒转化到大肠杆菌DH5株中，用异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导融合肽的表达。然后用谷胱甘肽-Sepharose 4B柱纯化大肠杆菌提取液，把纯化的提取液加到十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶上，用电泳法分离，用银染色和免疫印迹法分析蛋白表达情况(图1)。免疫印迹数据表明，人单克隆抗体2F5的抗原决定基包含相应于gp160的氨基酸662-667的氨基酸顺序ELDKWA。
图1说明人单克隆抗体2F5的特异性(见实施例1)。
图2说明携有2F5抗原决定基顺序的嵌合血细胞凝集素的构建(见实施例2)。
图3说明用嵌合流感病毒免疫的小鼠抗血清的ELISA滴度(见实施例3)。
图4说明用重组杆状病毒感染细胞免疫的小鼠的ELISA滴度(见实施例5)。
图1显示含有HIV-1(分离物BH10)的gp160重叠片段的融合肽的免疫印迹。含有氨基酸597-677(泳道2)、634-677(泳道3)和648-677(泳道4)的构建体与抗体2F5有反应，相反，含有氨基酸667-677(泳道5)的融合肽则不显示阳性反应。这初步表明单克隆抗体2F5的抗原决定基是由gp160的648-667位顺序内的氨基酸构成的。根据这些结果，使这一区域的六聚体重叠肽与谷胱甘肽S-转移酶融合。
如图1b所示，含有氨基酸顺序GLU LEU ASP LYS TRP ALA(氨基酸662-667，泳道2)的肽与抗体2F5有高度的反应性，而含有氨基酸顺序LEU ASP LYS TRP ALA SER(LDKWAS，氨基酸663-668，泳道3)或ASP LYS TRP ALA SER LEU(DKWASL，氨基酸664-669，泳道4)的肽与单克隆抗体的反应性则降低。含有氨基酸顺序LEU GLU LEU ASP LYS TRP(LELDKW，氨基酸661-666，泳道1)的肽未显示出明显的反应性。这些数据表明，单克隆抗体的抗原决定基含有相应于HIV-1 BH10分离物的gp160上的氨基酸662-667的氨基酸顺序GLU LEU ASP LYS TRP ALA(ELDKWA)。在这方面，相应于该抗原决定基顺序的合成肽和含有该顺序的融合蛋白都能够抑制由2F5抗体介导的中和作用。
实施例2：质粒和嵌合流感病毒的构建
所采用的所有基因操作都按Sambrook等人所述的标准程序进行(Molecular Cloning，A Laboratory Manual，Cold Spring HarbourLaboratory Press，New York，1989)。如图2所示，将gp41顺序Leu GluLeu Asp Lys Trp Ala Ser(LELDKWAS)或Glu Leu Asp Lys Trp AlaSer(ELDKWAS)插入到流感WSN病毒HA的抗原位点B中。用pT3/WSN-HAm1作模板，利用得自流感病毒WSN HAm1的有意义引物和反义引物(其中反义引物还含有相应于gp160 1981或1984-2004位的21或24个核苷酸的插入)，得到一种PCR产物，用该PCR产物置换质粒pT3/WSN-HAm1(Li等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA90：5214-5218，1993)的Pst I-Hind III片段，从而构建出质粒pHA-ELDKWAS和pHA-LELDKWAS。以同样的方式制备质粒pHA-ELNKWAS、pHA-LELNKWAS、pHA-ELDNWAS和pHA-LELDNWAS。
WSN HA的顺序由Hiti等人提供(J.Virol.41，730-734，1982)，gp160的顺序由Swissprot数据库(出入码为ENVSHIV10)提供。按照经Enami和Palese等人修改的(J.Virol.65：2711-2713，1991)Enami等人的方法(proc.Natl.Acad.Sci.87：3802-3805，1990)，将由上述质粒得到的RNA转染到MDBK细胞中，并选择和制备嵌合病毒。
实施例3：用嵌合流感病毒免疫的小鼠的免疫及抗体反应
取若干OF-1小鼠，用嵌合流感-ELDKWAS病毒(小鼠M1、M2、M3、M4)或流感-LELDKWAS病毒(小鼠M5)免疫。小鼠先用102TCID50鼻内免疫，6周后用5×105TCID50进行一次鼻内加强免疫，3周后用20μg蔗糖纯化的活病毒进行腹膜内免疫，再过3周后用不完全弗氏佐剂中的20μg经SDS变性的病毒进行最后一次加强免疫。鼻内免疫时，小鼠处于乙醚麻醉状态。对野生型WSN对照病毒(wt1、wt2)采用同样程序。最后一次加强免疫12天后将小鼠放血，使抗血清在56℃下灭活1小时，测定抗血清的ELISA滴度和中和活性。
图3A显示流感-ELDKWAS抗血清与C末端含有ELDKWA顺序的谷胱甘肽S-转移酶(GST)融合肽的结合。用ELISA法测定顺序。在室温下，用溶解在碳酸盐缓冲液(pH9.6)中的4μg/mlGST-ELDKWA融合肽涂布96孔微量滴定板(100μl/孔)4小时。然后用PBS/0.05％Tween洗滴定板。加入稀释在PBS/1％BSA/0.05％Tween中的抗血清，于室温下保温1小时。洗涤后，与结合有辣根过氧化物酶的羊抗小鼠IgGγ-链抗体一起保温，从而对抗体进行检测。用邻苯二胺二盐酸盐作底物对滴定板进行染色。用2.5M H2SO4停止反应，对滴定板进行测定(测定波长为492nm，参比波长为620nm)。
图3B：除了检测抗体时使用与辣根过氧化物酶结合的羊抗小鼠IgA抗体外，采用与如图3A所述相同的程序。用合胞体抑制测定法测定抗血清的中和活性。抑制合胞体形成50％的血清稀释度的倒数(EC50)示于表1。小鼠M1-M3的抗血清在不同的血清稀释度下都中和整个试验组。抗血清M4和M5中和HIV-1分离物MN和RF，但不中和IIIB。由WSN野生型病毒诱导的抗血清以最低的血清稀释度(1∶20)进行测试时，不中和任何HIV-1分离物。
表1
针对嵌合流感病毒产生的血清对HIV-1的中和作用
中和滴度(EC50)
抗血清 MN RF IIIB
M1 53 95 20
M2 24 40 160
M3 34 160 67
M4 29 24 未测
M5 20 34 24
进行合胞体抑制测定时，所用的指示细胞系是Chaffee等人(J.Exp.Med.168：605，1988)所述的AA-2细胞系，所用的病毒接种物是HIV-1的MN、RF和IIB株的冰冻原种。所有病毒原种都稀释到每毫升101.9-102.5TCID50。用培养基将小鼠抗血清稀释2倍，并分配到96孔微量滴定板中(每个稀释度4次重复)。在50μl经稀释的抗血清中加入50μl病毒，病毒/抗体混合物于4℃下预保温2小时。为进行感染，在每孔中力入100μlAA-2细胞(5×106个细胞/ml)。5天后记录指示HIV-1感染的合胞体是否存在。按照Reed和Muench所述的方法(Am.J.Hyg.27：493，1938)估测50％抑制剂量(EC50)。给出了抑制合胞体形成50％的血清稀释度的倒数(EC50)。
实施例4：携有延长2F5抗原决定基的嵌合血细胞凝集素由重组杆状病毒的表达
如实施例1所述制备含有所述六种肽的嵌合血细胞凝集素。这些嵌合血细胞凝集素的编码顺序邻接限制酶位点BamHI，并插入到质粒Bluebac III(Invitrogen，San Diego，CA)的BamHI位点中。按照Groebe等人(Nucleic Acids Res.，18：4033，1990)和Felgner等人(Proc.Natl.Acad.Sci.USA84：7413，1987)所述的方法进行转染实验，以便得到含有嵌合血细胞凝集素的重组杆状病毒。所得的重组嵌合杆状病毒可用于诱导HIV-1中和性抗体。
实施例5：用重组杆状病毒感染细胞免疫的小鼠的免疫和抗体反应
用重组杆状病毒以1-5的感染复数(MOI)感染用于免疫的Sf9细胞，感染3天后收集细胞。将细胞用PBS洗二次，并以5×106个细胞/ml的浓度重新悬浮于无菌PBS中。这些细胞在Westem印迹中与单克隆抗体2F5发生特异反应，表明这些细胞含有携带ELDKWAS或LELDKWAS顺序的血细胞凝集素。以二周的间隔给Balb/cA小鼠四次腹膜内注射1×106个感染的Sf9细胞使小鼠免疫(Van Wyyke Coelingh等人，Virology160：4465，1987)。第四次免疫7天后，将小鼠放血，测定抗血清的ELISA滴度。图4显示在如实施例2所述进行的ELISA中，由重组杆状病毒得到的抗血清与一种合成肽的结合，该合成肽含有顺序Gly Gly Gly Glu Leu Asp Lys TrpAla(GGGELDKWA)。
分泌抗体的诱导
用所述六种肽中的至少一种，优选用所述六种肽的混合物进行免疫，使IgG ELDKWA特异性ELISA滴度显著提高。另外，与用ELDKWA顺序进行的免疫不同的是，用所述六种肽进行的免疫也产生显著的IgA反应。意外的是，在粘膜水平上也触发该IgA免疫反应。
实施例6：用流感-ELDKWAS病毒免疫的Balb/c小鼠的呼吸道分泌物中的IgA抗体
用102PFU鼻内免疫小鼠，4周后用105PFU以同样的途径进行加强免疫。再过4周后用107PFU鼻内(IN)或腹膜内(IP)进行第三次免疫。第三次免疫8周后收集并合并洗鼻液，用ELISA法测定这些样品与肽ELDKWA的反应性。作为对照(WT并集液)，合并用野生型(WT)流感病毒免疫的小鼠的洗鼻液并进行分析。采用与IN组相同的免疫方案(参见图5)。所诱导出的抗体主要是由鼻粘膜产生的，可以看出抗体滴度极高。从图5还可以看出，鼻内施用流感-ELDKWAS病毒产生的HIV-1中和性抗体的浓度比腹膜内施用时要高。
实施例7：用流感-ELDKWAS病毒免疫的Balb/c小鼠的小肠分泌物中的IgA抗体
用102PFU鼻内免疫小鼠，4周后用105PFU以相同的途径进行加强免疫。再过4周后用107PFU鼻内(参见图6a)或腹膜内(图6b)进行第三次免疫。第三次免疫8周后收集并提取含有从小肠粘膜释放的抗体的粪便，用ELISA法测定这些样品与肽ELDKWA的反应性。INO、INR、INB和INS是鼻内接受第三次免疫的小鼠的样品，样品IPO、IPR、IPRS和IPS是从腹膜内接受第三次免疫的
Claims (20)
1.一种肽，该肽能够诱导对HIV-1的不同毒株和/或临床分离物具有中和活性并且/或者能抑制由HIV-1引起的细胞融合的抗体，该肽的特征在于，该肽由选自ELDKWAS、LELDKWAS、ELDNWAS、ELNKWAS、LELDNWAS和LELNKWAS的氨基酸顺序组成。
2.权利要求1的肽，其特征在于该肽与一种载体连接。
3.权利要求2的肽，其特征在于该肽是优选为重组形式的病毒的一部分，该病毒最好选自流感病毒、杆状病毒和牛痘病毒。
4.权利要求2或3的肽，其特征在于，至少一种所述氨基酸顺序置换了一种病毒蛋白的至少一部分氨基酸顺序，或者插入到一种病毒蛋白的至少一个抗原位点中。
5.权利要求4的肽，其特征在于病毒蛋白选自流感病毒的血细胞凝集素(HA)、流感病毒的神经氨酸苷酶(NA)和乙型肝炎病毒的表面抗原。
6.权利要求4的肽，其特征在于病毒蛋白得自优选为重组形式的杆状病毒或牛痘病毒。
7.六种由七个或八个氨基酸的顺序组成的肽中的至少一种，优选所有六种，在制备一种药物中的应用，所述氨基酸顺序选自ELDKWAS、LELDKWAS、ELDNWAS、ELNKWAS、LELDNWAS和LELNKWAS，所述药物用于诱导对HIV-1的不同毒株和/或临床分离物具有中和活性并且/或者能抑制由HIV-1引起的细胞融合的抗体。
8.权利要求1的肽在制备一种药物中的应用，所述药物用于在优选以鼻内途径给予哺乳动物时诱导由粘膜表面分泌的抗HIV-1 IgA抗体。
9.权利要求2-6中任一项的肽在制备一种药物中的应用，所述药物用于诱导对HIV-1的不同毒株和临床分离物具有中和活性并能抑制由HIV-1引起的细胞融合的抗体。
10.权利要求2-6中任一项的肽在制备一种药物中的应用，所述药物用于在优选以鼻内途径给予哺乳动物时诱导由粘膜表面分泌的抗HIV-1 IgA抗体。
11.权利要求1-6中任一项的肽在制备一种药物中的应用，所述药物用于预防和防止危险个体的HIV-1感染。
12.一种具有HIV-1中和活性并能够防止由HIV-1引起的细胞融合的抗体，其特征在于该抗体是由权利要求1的肽中的一种诱导的。
13.权利要求12的伉体，其特征在于该抗体是一种分泌抗体，优选为一种抗HIV-1 IgA抗体，最好是由粘膜表面分泌的。
14.制备权利要求1的肽的方法，其中至少一种所述氨基酸顺序是由化学方法或微生物学方法产生的。
15.权利要求14的方法，其中所述方法是一种微生物学方法，该方法包括：在宿主生物的基因组中插入一段核苷酸顺序，用标准微生物学培养技术进行基因组的表达，分离至少一种(优选多种)所述肽，其中所述核苷酸顺序选自：
a)相应于所述氨基酸顺序之一的核苷酸顺序；
b)与a)中的核苷酸顺序之一杂交的核苷酸顺序；
c)用简并法由a)中的核苷酸顺序之一推测出的核苷酸顺序。
16.制备权利要求2-6中任一项的肽的方法，该方法包括：用化学方法或微生物学方法，使权利要求1的氨基酸顺序与一种载体(优选为病毒或病毒蛋白)连接。
17.权利要求16的方法，其中所述方法是微生物学方法，该方法包括以下步骤：使一个核苷酸顺序与相应于载体氨基酸顺序的核苷酸顺序连接，将连接后的核苷酸顺序转移到一个宿主生物中，用标准生物学技术进行连接后顺序的表达，分离至少一种(优选多种)与载体连接的肽，其中所述核苷酸顺序选自：
a)相应于所述氨基酸顺序之一的核苷酸顺序；
b)与a)中的核苷酸顺序之一杂交的核苷酸顺序；
c)用简并法由a)中的核苷酸顺序之一推测出的核苷酸顺序。
18.权利要求17的方法，其中使a)-c)中至少一个核苷酸顺序与相应于载体病毒蛋白氨基酸顺序的核苷酸顺序连接，从而置换至少一部分相应于病毒蛋白氨基酸顺序的核苷酸顺序，或者插入到所述顺序相应于病毒蛋白抗原位点的至少一个位点中。
19.权利要求18的方法，其中使用相应于一种病毒蛋白的核苷酸顺序，所述病毒蛋白选自流感病毒的血细胞凝集素、流感病毒的神经氨酸苷酶、以及乙型肝炎的表面抗原。
20.权利要求15和17-19中任一项的方法，其中用一种病毒作为宿主生物，所述病毒选自优选为重组形式的流感病毒和牛痘病毒。
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