PT725825E - Peptidos que estimulam anticorpos neutralizantes contra estirpes de hiv-1 geneticamente divergentes - Google Patents
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Description
Γ
DESCRIÇÃO "PÉPTIDOS QUE ESTIMULAM ANTICORPOS NEUTRALIZANTES CONTRA ESTIRPES DE HIV-1 GENETICAMENTE DIVERGENTES" Ά prRsenf.fi invenção refere-se a péptidos que produzem anticorpos neutralizantes contra diferentes estirpes e isolados clínicos de HIV-1, assim como aos anticorpos produzidos com estes, e também à preparação de combinações péptido-veículo que apresentam eficientemente estes péptidos ao sistema imunitário. Mais particularmente, esta invenção refere-se ao desenvolvimento de uma vacina contra HIV-1. 0 síndroma da imunodeficiência adquirida (SIDA) é a manifestação clínica de um estágio tardio de uma infecção persistente a longo prazo com o vírus da imunodeficiência humana do tipo 1 (HIV-1). As respostas imunitárias dirigidas ao vírus e às células infectadas com o vírus durante a infecção persistente não conseguem normalmente mediar a resolução da infecção. As vacinas podem estimular respostas imunitárias que podem evitar o estabelecimento de uma infecção persistente ou mesmo evitar a progressão para SIDA. A maior parte das estratégias de vacinas contra HIV-1 são dirigidas para a sua glicoproteína de superfície gp 160 que é constituída por gpl20 e gp41 e é responsável pela ligação do vírus ao receptor celular CD4 e pelo desencadeamento subsequente da actividade de fusão.
No entanto, em contexto com gpl60, foram observados vários fenómenos que argumentam contra a utilização de gpl60 ou gpl20 completas como um imunogénio. Experiências in vitro mostram que o sinergismo entre anticorpos específicos contra gpl20 e gpl20 bloqueia a activação de células T humanas (Mittler et al., Science (1989) 245:1380). Adicionalmente, são conhecidos vários domínios antigénicos na gpl60 que induzem anticorpos que intensificam a infecção por HIV-1 (Jiang et al., J. Exp. Med. (1991) 174: 1557). 1
Vi
A utilização de péptidos sintéticos como imunogénios oferece várias vantagens. Os anticorpos estimulados por péptidos sintéticos possuem uma especificidade pré-determinada, e no caso de vírus, podem ser seleccionados para representar estruturas na superfície de viriões. Os polipéptidos sintéticos são também interessantes na medida em que podem induzir respostas de anticorpos que não se verificam em condições normais. Por exemplo, é possível induzir anticorpos neutralizantes que possuem uma reactividade mais vasta do que anticorpos induzidos por proteínas completas (Green et ai., Cell (1982) 28:477).
Adicionalmente, verificou-se que um péptido contendo parte da ansa V3 de gpl20 do isolado HIV-1 ÍIIB de HIV-1 induzia anticorpos que protegiam chimpanzés contra o confronto com o vírus com o mesmo isolado de HIV-1 (Emini et al., Nature (1992). 355:728).
Porque os péptidos sintéticos possuem por si só uma imunogenicidade pobre, têm de ser acoplados a moléculas que proporcionam um efeito adjuvante tal como a toxóide do tétano ou a hemocianina de lapa (Bittle et al., Nature (1982) 298:30). Outra possibilidade é clonar pequenos péptidos como proteínas de fusão com S-transferase de glutationa de Schistosoma japonicum (Fikrig etal., Science (1990) 250:553).
Além disso, vírus tais como vaccinia, polio ou influenza podem ser utilizados como vectores para imunogénios. Coelhos inoculados com vírus vaccinia recombinante contendo sequências do antigénio de superfície de hepatite B (HBsAg), glicoproteína D do vírus herpes simplex, e hemaglutinina do vírus influenza produziam anticorpos contra os três antigénios estranhos (Perkus et al., Science (1985) 229:981). Além disso, um vírus polio quimérico que expressava um epitopo de gp41 de I1IV-1 induziu com sucesso anticorpos neutralizantes contra HIV-1 em coelhos (Evans et al., Nature (1989) 339:385).
Desde há pouco tempo é também possível alterar o genoma do vírus influenza por mutagénese in vitro (Enami et al., Proc. 2
Natl. Acad. Sei. USA (1990) 87: 3802). Através desta técnica foi possível conceber um vírus influenza A atenuado estável (Muster et al., Proc. Natl. Acad. Sei USA (1991) 88:5177).
Uma vantagem do vírus influenza neste contexto é a disponibilidade de muitas variantes de modo que a vacinação repetida pode ser possível. Além disso, o vírus influenza induz fortes respostas secretoras e de imunidade celular, que podem ser vantajosas para uma abordagem de vacina anti-HIV-1. É o objectivo da presente invenção proporcionar sequências de péptido, que são apenas minimamente imunogénicas no contexto da gpl60 completa, e cujas sequências de péptidos podem ser utilizadas para promover anticorpos que apresentam actividade neutralizante contra diferentes estirpes e/ou isolados clínicos de HIV-1 e/ou que inibem a fusão de células causada por HIV-1 em mamíferos. É ainda outro objectivo da invenção proporcionar estratégias para promover anticorpos secretores segregados por superfícies mucosas e dirigidos ao vírus HIV-1 ou a células infectadas com HIV-1. Foi presumido de acordo com a invenção que a promoção de anticorpos IgA anti-HIV-1 em tecidos da mucosa proporcionará uma ferramenta poderosa especialmente na profilaxia e prevenção de indivíduos potencialmente em risco de infecção por HIV-1, uma vez que muitas infecções virais incluindo HIV-1 são transmitidas através das superfícies mucosas do tracto respiratório, gastrointestinal e genital.
Os objectivos são atingidos preparando pequenos péptidos com sete ou oito aminoácidos obtidos por síntese química ou por métodos microbiológicos, sendo os péptidos preferencialmente derivados de sequências de ácidos nucleicos codificando para Glu Leu Asp Lys Trp Ala Ser (=ELDKWAS no código de uma letra) , Leu Glu Leu Asp Lys Trp Ala Ser (LELDKWAS), Glu Leu Asn Lys Trp Ala Ser (ELNKWAS) , Leu Glu Leu Asn Lys Trp Ala Ser (LELNKWAS) , Glu Leu Asp Asn Trp Ala Ser (ELDNWAS) ou Leu Glu Leu Asp Asn Trp Ala Ser (LELNKWAS). 3
Pelo menos uma, preferencialmente todas, das seis sequências de aminoácidos (daqui em diante referidas como "as referidas seis AAS") podem então ser eficientemente apresentadas ao sistema imunitário de modo a induzir a formação e libertação de anticorpos que apresentam actividade neutralizante contra estirpes de HIV-1 e/ou que podem inibir a fusão celular causada por estes vírus. É um dos principais objectivos da presente invenção proporcionar uma vacina anti-HIV-1 promissora baseada numa formulação compreendendo pelo menos um, preferencialmente uma mistura de todos os seis, dos péptidos acima. São descritas abaixo caracteristicas especiais e realizações vantajosas da presente invenção.
Numa realização preferida da invenção, a sequência de aminoácido Glu Leu Asp Lys Trp Ala (ELDKWA) definindo a sequência de epitopo do anticorpo monoclonal humano. 2F5 (obtido da linha de células de hibridoma 2F5, depósito PHLS N° 90091704; depositada a 09/17/90) é conectada com uma Ser ou com ambas uma Leu e Ser - que estão localizados adjacentes à Sequência ELDKWA em gp41 definindo o epitopo 2F5 - estabelecendo assim as sequências de péptido Glu Leu Asp Lys Trp Ala Ser (ELDKWAS) e Leu Glu Leu Asp Lys Trp Ala Ser (LELDKWAS) respectivamente, e inserida numa molécula veiculo, nomeadamente o sítio B antigénico do HA do vírus influenza. A proteína de fusão HA "quimérica" modificada, transportando a sequência de aminoácidos estranha ELDKWAS ou LELDKWAS, promove muito eficientemente anticorpos dirigidos às sequências ELDKWAS ou LELDKWAS apresentadas durante a aplicação, preferencialmente na forma de uma injecção, no sistema imunitário dc mamíferos, e humanos em particular. Os anticorpos obtidos por este método apresentam actividade neutralizante contra diferentes estirpes e/ou isolados clínicos de HIV-1.
Foi, no entanto, abandonada devido ao conhecido polimorfismo das mutações do vírus HIV-1 que podem ocorrer mesmo 4 dentro da sequência de aminoácidos altamente conservada (L)ELDKWAS de gp41, que corresponde aos aminoácidos 661-668 (LELDKWAS) ou 662-668 (ELDKWAS) do isolado de HIV-1 BH10. A numeração de nucleótidos e aminoácidos utilizada ao longo desta especificação corresponde à de gpl60 do isolado de HIV-1 BH10 como utilizado na base de dados de Los Alamos (Myers et al., Data Base Human Retrovirus and Aids). As mutações afectaram particularmente os aminoácidos Asp (D) e/ou Lys (K) no centro da referida sequência, reduzindo assim a susceptibilidade do virus para ser neutralizado por anticorpos contendo o epitopo 2F5. Este mecanismo indesejado de fuga virai pode, no entanto, ser utltrapassado com sucesso utilizando os péptidos de acordo com a presente invenção, em que Asp (D) ou Lys (K) adjacente é substituído por asparagina (N).
Pelo menos um, preferencialmente uma mistura de todos os seis, dos referidos seis péptidos podem ser utilizados para o fabrico de um produto farmacêutico para promover anticorpos que apresentam actividade neutralizante contra diferentes estirpes e/ou isolados clínicos de HIV-1 e/ou que inibem a fusão de células causada por HIV-1.
Noutra realização, os mesmos péptidos podem ser utilizados seja cada péptido por si só ou numa mistura com pelo menos um outro dos referidos péptidos, para o fabrico de um produto farmacêutico para induzir anticorpos IgA anti-HIV-1 segregados por superfícies mucosas durante a aplicação a mamíferos, preferencialmente intranasal.
Numa outra realização da invenção, pelo menos um dos seis péptidos referidos está ligado a um veículo. Tal veículo pode, por exemplo, ser um vírus, preferencialmente na sua forma atenuada c/ou recombinante. Podem ser utilizados vantajosamente o vírus influenza, baculovírus ou vírus vaccinia. A ligação dos pequenos péptidos a um veículo tal como, por exemplo, uma proteína virai ou um vírus completo intensifica a eficácia da indução de anticorpos após apresentação de tais combinações 5
f quiméricas péptido-veiculo ou proteínas de fusão quiméricas ao sistema imunitário. É particularmente vantajoso, utilizar cada um dos péptidos acima como uma proteína de fusão com uma proteína virai como veículo, em que pelo menos uma das sequências de aminoácidos de acordo com a invenção substitui pelo menos uma parte da proteína virai transportadora ou está inserida em pelo menos um dos sítios antigénicos da proteína virai. Esta característica, deste modo, representa uma realização importante. Numa realização preferida, a referida proteína virai é a hemaglutinina (HA) do vírus influenza, a neuraminidase (NA) do .vírus influenza ou o antigénio de superfície do vírus da hepatite B. Noutra realização, pode ser derivada de um baculovírus ou vírus vaccinia - preferentemente recombinante. A presente invenção refere-se também à utilização de qualquer dos péptidos acima identificados consistindo em sete ou oito aminoácidos e/ou combinações péptido-veiculo ou proteínas de fusão para o fabrico de um produto farmacêutico para estimular ou induzir anticorpos que apresentam actividade neutralizante contra diferentes estirpes e/ou isolados clínicos de HIV-1 e/ou que inibem a fusão de células causada por HIV-1. Mais particularmente, pretende-se proporcionar uma vacina eficaz baseada em pelo menos um, preferencialmente uma mistura de todos os seis péptidos referidos e/ou os seis referidos péptidos ligados a um veículo, para o tratamento profiláctico de indivíduos em risco com HIV-1 e/ou o tratamento terapêutico de doentes infectados com HIV-1, especialmente para evitar a progressão da infecção para SIDA.
Numa outra realização preferida, os referidos seis péptidos e/ou oo referidos seis péptidos ligados a um transportador são utilizados para preparar e fabricar formulações farmacêuticas que - após aplicação ao sistema imunitário de mamífero - leva à indução de anticorpos IgA anti-HIV-1 segregados pelas superfícies mucosas dos doentes animais ou humanos. A aplicação 6
intranasal é preferida neste caso.
Consequentemente, os referidos seis péptidos e/ou combinações péptidos-veiculo da presente invenção podem também ser utilizados para o fabrico de um produto farmacêutico para a profilaxia e prevenção de indivíduos em risco de infecção com HIV-1.
Parece, que esta característica especial da presente invenção pode dar a esperança de que através da estimulação de anticorpos IgA segregados anti-HIV-1 específicos nas superfícies mucosas de acordo com a presente invenção seja proporcionada uma ferramenta médica que ataca eficazmente os invasores virais no primeiro estádio da sua entrada no corpo do mamífero. Crê-se que métodos anteriores da técnica para tratar doentes infectados com HIV-1 terão em parte falhado em defender da doença porque o vírus é primeiramente capturado na corrente sanguínea e num estádio mais tardio, isto é, após vasta distribuição no sistema humoral. A presente invenção refere-se ainda a um anticorpo apresentando actividade neutralizante e sendo capaz de evitar a fusão de células causada por HIV-1, caracterizado por ser estimulado por um dos referidos seis péptidos.
Numa realização preferida, o referido anticorpo é um anticorpo segregado, preferencialmente um anticorpo IgA anti-HIV-1, e sendo vantajosamente segregado por superfícies mucosas.
Além disso, a presente invenção refere-se também a um processo para o fabrico de qualquer dos seis péptidos referidos por métodos microbiológicos ou químicos.
Numa realização os referidos seis péptidos são quimicamente sintetizados seguindo procedimentos bioquímicos convencionais, preferencialmente utilizando um Sintetizador de Péptidos Applied Biosystems 431A.
Noutra realização, as referidas sequências de aminoácidos são obtidas por um processo microbiológico compreendendo os 7
passos de inserir uma sequência de nucleótidos seleccionada do grupo consistindo de a) uma sequência de nucleótidos correspondente a um dos seis péptidos referidos; b) uma sequência de nucleótidos que híbrida com uma das sequências dc nucleótidos em a); c) uma sequência de nucleótidos deduzida de uma das sequências de nucleótidos em a) por degenerescência; no genoma de um organismo hospedeiro, que realiza a expressão do genoma utilizando técnicas convencionais de cultura microbiológica, e isolando pelo menos um, preferencialmente uma multiplicidade, dos referidos péptidos.
As proteínas quiméricas de fusão ou combinações péptido-veiculo podem ser fabricados de acordo com uma realização compreendendo a ligação de uma sequência de aminoácidos seleccionada do grupo consistindo nos referidos seis péptidos, a um veículo, preferencialmente um vírus ou uma proteína virai, por métodos químicos ou microbiológicos.
Numa realização preferida, o processo para o fabrico dos referidos seis péptidos ligados a um veículo, preferencialmente um vírus ou proteína virai, é microbiológico e compreende os passos de ligação de uma sequência de nucleótidos seleccionada do grupo consistindo de a) uma sequência de nucleótidos correspondente a uma das sequências de aminoácidos dos seis péptidos referidos; b) uma sequência de nucleótidos que híbrida com uma das sequências de nucleótidos em a); c) uma sequência de nucleótidos deduzida de uma das sequências de nucleótidos em a) por degenerescência; com uma sequência de nucleótidos correspondendo a uma sequência de aminoácido do veículo, transferindo as sequências de nucleótidos ligadas para um organismo hospedeiro, que realiza a 8
expressão da sequência ligada utilizando técnicas microbiológicas convencionais, e isolando pelo menos um, preferencialmente uma multiplicidade, dos referidos péptidos ligados a um veiculo.
Numa outra realização, o processo para o fabrico dos referidos seis péptidos ligados a um veiculo, preferencialmente um virus ou proteína virai, é caracterizado por pelo menos uma sequência de nucleótidos seleccionada do grupo consistindo de a) uma sequência de nucleótidos correspondente a uma das sequências de aminoácidos dos seis péptidos referidos; b) uma sequência de nucleótidos que hibrida com uma das sequências de nucleótidos em a); c) uma sequência de nucleótidos deduzida de uma das sequências de nucleótidos em a) por degenerescência; estar ligada a uma sequência de nucleótidos correspondendo a uma sequência de aminoácidos de uma proteína virai como veículo, substituindo assim pelo menos parte da sequência correspondendo à sequência de aminoácidos da proteína virai ou sendo inserida em pelo menos um sítio da referida sequência correspondente a um sítio antigénico da proteína virai.
Numa realização específica, a proteína virai aplicada é seleccionada do grupo consistindo em hemaglutinina do vírus influenza, neuraminidase do vírus influenza e no antigénio de superfície do vírus da hepatite B, e em outra realização característica, um vírus influenza, baculovírus ou vírus vaccinia - cada um preferencialmente numa forma recombinante - é utilizado como organismo hospedeiro. A inserção de sequências dos seis péptidos referidos no sitio antigénico D do HA das estirpes de influenza que não WSN, cuja estirpe é principalmente referida nos exemplos seguintes, levará igualmente a proteínas de fusão e/ou vírus quiméricos que estimulam anticorpos neutralizantes anti-HIV-1 e evitam a fusão de células conduzida por HIV-1. 9
Também, a introdução destas sequências em outros sítios da HA do virus influenza ou da neuraminidase (NA) do vírus influenza leva a proteínas de fusão péptido-veículo e/ou vírus quiméricos que estimulam anticorpos anti-HIV neutralizantes e evitam a fusão de células conduzida por HIV. A presente invenção será posteriormente explicada e demonstrada nos exemplos seguintes, que não limitam em qualquer aspecto o âmbito da presente invenção.
Exemplo 1: Mapeamento de epitopos o epitopo do anticorpo monoclonal 2F5 foi identificado por imunotransferência utilizando um método descrito por Towbin et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA (1979) 76:4350. Os péptidos de fragmentos sobreponíveis de gp41 do isolado BH10 de HIV-1 foram clonados como péptidos de fusão com S-transferase de glutationa. Os diferentes péptidos de fusão foram obtidos através da hibridação de oligonucleótidos correspondentes a gp41 que foram clonados entre o sítio Bam Hl e o sítio Eco RI do plasmídeo pGEX-2T (Pharmacia). Os plasmídeos recombinantes foram transformados na estirpe de E. coli DH5 e a expressão das proteínas de fusão foi induzida com tiogalactósido de isopropilo (IPTG) . O extracto de E. coli foi então purificado com colunas de glutationa-sepharose 4B, aplicado em géis de poliacrilamida na presença de dodecilsulfato de sódio, separado por electroforese, e a proteína de expressão foi analisada através de coloração com prata e imunotransferência (Fig. 1). Os resultados da imunotransferência demonstram que o epitopo do anticorpo monoclonal humano 2F5 compreende a sequência de aminoácidos ELDKWA correspondente aos aminoácidos 662-667 de gp 160. A Fig. 1 ilustra a especificidade do anticorpo monoclonal humano 2F5 (ver Exemplo 1). A Fig. 2 ilustra a construção de hemaglutininas quiméricas que 10
% transportam a sequência do epitopo 2F5 (ver Exemplo 2) A Fig. 3 ilustra titulo de ELISA de anti-soros de murganhos imunizados com vírus influenza quiméricos (ver Exemplo 3) A Fig. 4 ilustra títulos de ELISA de murganhos imunizados com células infectadas com os haculovlrus recombinantes (ver Exemplo 5). A Fig. 1 apresenta imunotransferências de péptidos de fusão com fragmentos sobreponíveis de gp 160 de HIV-1 (isolado BH10). Em contraste com as construções que compreendem os aminoácidos 597 a 677 (pista 2), 634 a 677 (pista 3) e 648 a 677 (pista 4) que foram reactivos com o anticorpo 2F5, um péptido de fusão compreendendo os aminoácidos 667 a 677 (pista 5) não apresentou uma reacção positiva.
Esta foi a primeira indicação de que o epitopo do anticorpo monoclonal 2F5 é formado por aminoácidos que pertencem à sequência entre as posições 648 e 667 de gp 160. Com base nestes resultados, os péptidos 6-meros sobreponíveis desta região foram fundidos com a S-transferase de glutationa.
Como apresentado na Fig. Ib, o péptido contendo a sequência de aminoácidos GLU LEU ASP LYS TRP ALA (aminoácidos 662-667, pista 2) foi altamente reactivo com o anticorpo 2F5, enquanto que para péptidos contendo a sequência de aminoácidos LEU ASP LYS TRP ALA SER (LDKWAS, aminoácidos 663-668, pista 3) ou ASP LYS TRP ALA SER LEU (DKWASL, aminoácidos 664-669, pista 4) a reactividade com o anticorpo monoclonal foi reduzida. Um péptido contendo a sequência de aminoácidos LEU GLU LEU ASP LYS TRP (LELDKW, aminoácidos 661-668, pista 1) não apresentou reactividade significativa. Estes resultados demonstram que o epitopo do anticorpo monoclonal compreende a sequência de aminoácidos GLU LEU ASP LYS TRP ALA (ELDKWA) que corresponde aos aminoácidos 662-667 no gp 160 do isolado BH10 de HIV-1. Neste contexto, tanto um péptido sintético correspondente a esta 11
sequência de epitopo como uma proteína de fusão contendo esta sequência foram capazes de inibir a neutralização mediada pelo anticorpo 2F5.
Exemplo 2: Construção de plasmídeos e os vírus influenza quiméricos
Todas as manipulações genéticas utilizadas foram realizadas de acordo com procedimentos convencionais descritos por Sambrook et al., (1989) em "Molecular Cloning", A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press, Nova Iorque. Como ilustrado na Fig. 2, as sequências de gp41 Leu Glu Leu Asp Lys Trp Ala Ser (LELDKWAS) ou Glu Leu Asp Lys Trp Ala Ser (ELDKWAS) foram
inseridas no sítio antigénico B do HA do vírus influenza WSN. Os plasmídeos pHA-ELDKWAS e pHA-LELDKWAS foram construídos substituindo o fragmento Pst I-Hínd III do plasmídeo pT3/WSN-HAml que é descrito por Li et al. (Pzoc. Natl. Acad. Sei. USA 90, 5214-5218; 1993) com um produto de PCR que foi obtido utilizando pT3/WSN-HAml como um molde e iniciadores sentido e anti-sentido derivados do vírus influenza WSN HAml, em que o iniciador anti-sentido contém ainda uma inserção de 21 ou 24 nucleótidos correspondendo às posições de gp 160 de 1981 ou 1984 a 2004. Os plasmídeos pHA-ELNKWAS, pHA-LELNKWAS, pHA-ELDNWAS e pHA-LELDNWAS foram preparados do mesmo modo. A sequência do WSN HA é proporcionado por Hiti et al. {J. Virol. 41, 730-734, 1982) e a sequência de gp 160 pela entrada ENV$HIV10 da base de dados Swissprot. A transfecção do ARN deste plasmídeo em células MDBK e a selecção e preparação de vírus quiméricos foi realizada de acordo com Enami et al. (Proc. Natl. Acad. Sei. 87, 3802-3805, 1990) com as modificações descritas por Enami e Palease (J. Virol. 65, 2711-2713, 1991).
Exemplo 3: Imunização e resposta de anticorpo de murganhos imunizados com os vírus influenza quiméricos 12
Murganhos OF-1 foram imunizados com virus influenza quiméricos-ELDKWAS murganhos (Ml, M2, M3, M4) ou virus influenza- LELDKWAS (murganho M5) . Os murganhos foram primeiro imunizados com 102 TCID50 intranasalmente (i.n.) seguido por uma imunização de reforço i.n. com 5xl05 TCTD50 após 6 semanas, uma imunização intraperitoneal (i.p.) com 20 μg de virus vivo purificado com sacarose após 3 semanas e um reforço final com 20 μς de virus desnaturado com SDS em adjuvante de Freund incompleto após intervalos de mais 3 semanas. Para a imunização intranasal os murganhos foram anestesiados com éter. Para o virus de controlo selvagem WSN (wt 1, wt 2), foi utilizado o mesmo protocolo. Os murganhos foram sangrados 12 dias após o reforço final, os anti-soros foram inactivados durante lha 56°C e foram determinados os títulos de ELISA e a actividade de neutralização dos anticorpos. A Fig. 3A apresenta a ligação de anti-soros influenza-ELDKWAS a um péptido de fusão de S-transferase de glutationa (GST) contendo a sequência ELDKWA no seu terminal C. A sequência foi determinada utilizando ELISA, placas de microtitulação de 96 poços foram revestidas com o péptido de fusão GST-ELDKWA a 4 μg/mL (100 μg/poço) em tampão carbonato, pH 9,6 durante 4 h à temperatura ambiente. As placas foram então lavadas com PBS/Tween a 0,05%. Foi adicionado anti-soro diluído em PBS/BSA a 1%/Tween a 0,05% e incubado durante 1 h à TA. Após lavagem, os anticorpos foram detectados por incubação com um anticorpo de cadeia IgG γ de cabra anti-murganho, conjugado com peroxidase de rabanetes. As placas foram coradas utilizando dicloridrato de 0-fenilenodiamina como um substrato. A reacção foi interrompida com H2SO4 a 2,5 M e as placas foram medidas (comprimento de onda da medição 4 92 nm, comprimento de onda de referência 620 nm) .
Fig. 3B: Foi seguido o mesmo procedimento como descrito na Fig. 3A, excepto para a detecção de anticorpos em que foi utilizado um anticorpo IgA de cabra anti-murganho, conjugado 13
com peroxidase de rabanetes. A actividade de neutralização dos anticorpos foi determinada através de ensaios de inibição de sincicios. As diluições reciprocas de soro que inibem a formação de sincicios em 50% (EC50) são apresentados na Tabela 1. Os anti-soros dos murganhos Ml - M3 neutralizaram todo o painel de teste a várias diluições de soro. Os anti-snros M4 e M5 neutralizaram os isolados de HIV-1 MN e RF, mas não IIIB. Os anti-soros induzidos pelo virus WSN selvagem não neutralizaram nenhum dos isolados de HIV-1 testados na mais baixa diluição do soro (1:20).
Tabela 1 NEUTRALIZAÇÃO DE HIV-1 POR SOROS DESENVOLVIDOS INFLUENZA QUIMÉRICOS CONTRA VÍRUS Título de neutralização (EC5q) anti-soros MN RF III B Ml 53 95 20 M2 24 40 160 M3 34 160 67 M4 29 24 não testado M5 20 34 24
Para o ensaio de inibição de sincicios a linha celular indicadora AA-2 é descrita por Chaffee et al., J. Exp. Med. (1988) 168:605, e como inoculo de virus foram utilizados "stocks" congelados das estirpes de HIV-1 MN, RF e III B. Todos os "stocks" de virus foram diluidos para 101,9-102,5 TCID50 por mL. Os anti-soros de murganho foram diluidos 2 vezes em meio e distribuídos em placas de microtitulação de 96 poços (4 réplicas de cada diluição) . Foram adicionados 50 μΐ, de vírus a 50 μΐ de anti-soros diluídos e a mistura vírus/anticorpo foi pré-incubada durante 2 h a 4°C. Para infecção foram adicionados 100 μι de células AA-2 (5xl06 células/mL) a cada poço; foi registada a presença de sincicios após 5 dias como uma indicação de infecção por HIV-1. A estimativa para a^^dose de 50% de inibição (EC50)
Κλ foi realizada de acordo com Reed e Muench como descrito em Am. j. Hyg. (1938) 27:493. São apresentadas as diluições reciprocas de soro que inibem a formação de sincicios em 50% (EC50) .
Exemplo 4: Expressão de hemaglutininas quiméricas transportando os epitopos de 2F5 estendidos por baculovírus recombinantes.
As hemaglutininas quiméricas contendo os seis péptidos referidos foram preparadas como descrito no Exemplo 1. A sequência codificante destas hemaglutininas quiméricas foi flanqueada pelo sitio da enzima de restrição Bam Hl e inserida no sitio Bam Hl do plasmídeo (Bluebac III, Invitrogen, San Diego CA) . As experiências de transfecção de modo a obter baculovírus recombinantes que contêm as hemaglutininas quiméricas foram realizadas de acordo com métodos descritos por Groebe et al., Nucleic. Acids Res. (1990) 18:4033, Felgner et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA (1987) 84:7413. Os baculovírus quiméricos recombinantes podem ser utilizados para originar anticorpos neutralizantes de HIV-1.
Exemplo 5: Imunização e resposta de anticorpo de murganhos imunizados com células infectadas pelos baculovírus recombinantes
As células Sf9 que foram utilizadas para imunizações foram infectadas por baculovírus recombinantes numa multiplicidade de infecção (MOI) de 1-5, e recolhidas 3 dias após infecção. As células foram lavadas duas vezes com PBS e ressuspendidas em PBS estéril a uma concentração de 5 x 106 células/mL. Estas células reagiram especificamente com o anticorpo monoclonal 2F5 cm transferências de Western, indicando que estas células continham a hemaglutinina contendo a sequência ELDKWAS ou LELDKWAS. Foram imunizados murganhos Balb/c com quatro injecções intraperitoneais de lxlO6 células Sf9 infectadas a intervalos de 15 ? 2 semanas (Van Wyyke Coelingh et al., Virology (1987) 160: 4465). Sete dias após a quarta imunização os murganhos foram sangrados e foram determinados os títulos dos anti-soros por ELISA. A Fig. 4 apresenta a ligação dos anti-soros derivados de baculovírus recombinantes a um péptido sintético compreendendo a sequência Gly Gly Gly Glu Leu Asp Lys Trp Ala (GGGF.T.DKWA) numa ELISA que foi efectuada como descrito no Exemplo 2.
Indução de anticorpos segregados
Imunizações realizadas por aplicação de pelo menos um, preferencialmente uma mistura, dos seis péptidos referidos resultou em títulos de ELISA de IgG específica para ELDKWA significativamente melhorados. Além disso, em contraste com imunizações utilizando a sequência ELDKWA, as imunizações com os seis péptidos referidos resultou também numa resposta de IgA significativa. Surpreendentemente, esta resposta imunitária de IgA foi também desencadeada ao nível da mucosa.
Exemplo 6: Anticorpos IgA em secreções respiratórias de murganhos Balb/c imunizados com vírus influenza-ELDKWAS.
Os murganhos foram imunizados com 102 PFU intranasalmente e sujeitos a reforço após 4 semanas com 105 PFU pela mesma via. A terceira imunização foi administrada intranasalmente (IN) ou intraperitonealmente (IP) com 107 PFU após mais 4 semanas. As lavagens nasais foram colhidas e misturadas 8 semanas depois da terceira imunização e a reactividade destas amostras com o péptido ELDKWA foi determinada por ELISA. Como um controlo (mistura WT) , as lavagens nasais de murganhos imunizados com o vírus influenza selvagem (WT) foram misturadas e analisadas. Foi utilizado o mesmo esquema de imunização como para o grupo IN (rf. Fig. 5). Os anticorpos estimulados foram inicialmente produzidos pela mucosa nasal e pode ser reconhecido que os 16 títulos de anticorpo são anormalmente altos. Pode ainda ser observado na Fig. 5 que a aplicação intranasal do vírus influenza-ELDKWAS levou a uma maior concentração de anticorpos neutralizantes anti-HIV-1 do que a aplicação intraperitoneal.
Exemplo 7: Anti corpos TgA em secreções intestinais de murganhos Balb/c imunizados com vírus influenza-ELDKWAS
Os murganhos foram imunizados com 102 PFU intranasalmente e reforçados após 4 semanas com 105 PFU pela mesma via. A terceira imunização foi administrada intranasalmente (rf. Fig. 6a) ou intraperitonealmente (Fig. 6b) com 107 PFU após mais 4 semanas. Os sedimentos fecais contendo os anticorpos libertados da mucosa intestinal foram recolhidos e extraídos 8 semanas após a terceira imunização, e a reactividade destas amostras com o péptido ELDKWA foi determinada por ELISA. IN 0, IN R, IN B e IN S são amostras de murganhos que receberam a terceira imunização intranasalmente, e as amostras IP 0, IP R, IP RS e IP S foram recolhidas de murganhos que receberam a terceira imunização intraperitonealmente. WT1 e WT2 são amostras de murganhos controlo imunizados com o vírus influenza selvagem (WT).
Lisboa, 18 de Maio de 2001
17
Claims (17)
- REIVINDICAÇÕES Péptido que estimula anticorpos que apresentam actividade ne.utralizante contra diferentes estirpes e/ou isolados clínicos de HIV-1 e/ou que inibem a fusão de células provocada por hiv-1, caracterizado por o péptido ser composto de uma sequência de aminoácidos seleccionada do grupo consistindo em ELDKWAS, LELDKWAS, ELDNWAS, ELNKWAS, LELDNWAS e LELNKWAS. Péptido de acordo com a reivindicação 1 caracterizado por estar ligado a um veículo. Péptido de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por ser uma parte de um vírus - preferencialmente recombinante - seleccionado vantajosamente do grupo consistindo em um vírus influenza, um baculovírus e um vírus vaccinia. Péptido de acordo com a reivindicação 2 ou 3, caracterizado por pelo menos uma das referidas sequências de aminoácidos substituir pelo menos parte da sequência de aminoácidos de uma proteína virai, ou ser inserida em pelo menos um sítio antigénico de uma proteína virai. Péptido de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por a proteína virai ser seleccionada de um grupo consistindo em hemaglutinina (HA) de vírus influenza, neuraminidase (NA) de vírus influenza e o antigénio de superfície do vírus de hepatite B. Péptido de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por a proteína virai ser derivada de um baculovírus ou vírus vaccinia - preferencialmente recombinantes. 17. Utilização de pelo menos um péptido de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 6 para o fabrico de um produto farmacêutico para estimular anticorpos anti-HIV-1 em animais e humanos.
- 8. Utilização de acordo com a reivindicação 7, em que os referidos anticorpos são anticorpos IgA, preferencialmente segregados por superfícies mucosas.
- 9. Utilização de acordo com a reivindicação 7 ou 8 para o fabrico de um produto farmacêutico para o tratamento profiláctico e/ou terapêutico de indivíduos infectados ou em risco com HIV-1.
- 10. Anticorpo com actividade neutralizante de HIV-1 e sendo capaz de evitar a fusão de células provocada por HIV-1, caracterizado por ser um anticorpo IgA que é capaz de se ligar a um péptido transportando a sequência de aminoácidos ELDKWA.
- 11. Anticorpo de acordo com a reivindicação 10, segregado por uma superfície mucosa.
- 12. Processo para o fabrico de um péptido de acordo com a reivindicação 1 caracterizado por ser quimicamente sintetizada uma sequência de aminoácidos como definida na reivindicação 1, preferencialmente através de um sintetizador de péptidos comercial.
- 13. Processo para o fabrico de um péptido de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o péptido ser produzido através de um método microbiológico, compreendendo o referido método inserir uma sequência de nucleótidos seleccionada do grupo consistindo em 2 I a) uma sequência de nucleótidos correspondente a uma das referidas sequências de aminoácidos; b) uma sequência de nucleótidos que hibrida com uma das sequências de nucleótidos em a); c) uma sequência de nucleótidos deduzida de uma das sequências de nucleótidos cm a) por degenerescência; no genoma de um organismo hospedeiro, que realiza a expressão do genoma utilizando técnicas convencionais de cultura microbiológica, e isolando pelo menos um, preferencialmente uma multiplicidade, dos referidos péptidos.
- 14. Processo para o fabrico de pelo menos um péptido de acordo com qualquer das reivindicações 2 a 6 compreendendo a ligação de uma sequência de aminoácidos de acordo com a reivindicação 1 a um veículo, preferencialmente um vírus ou uma proteína virai, por métodos químicos ou microbiológicos.
- 15. Processo de acordo com a reivindicação 14 em que o referido método é microbiológico e compreende os passos de ligação de uma sequência de nucleótidos seleccionada do grupo consistindo em a) uma sequência de nucleótidos correspondente a uma das referidas sequências de aminoácidos; b) uma sequência de nucleótidos que hibrida com uma das sequências de nucleótidos em a); c) uma sequência de nucleótidos deduzida de uma das sequências de nucleótidos em a) por degenerescência; com uma sequência de nucleótidos correspondendo a uma sequência de aminoácidos do veículo, transferindo as sequências de nucleótidos ligadas para um organismo 3hospedeiro, que realiza a expressão da sequência ligada utilizando técnicas microbiológicas convencionais, e isolando pelo menos um, preferencialmente uma multiplicidade, dos referidos péptidos ligados ao referido veiculo.
- 16. Processo de acordo com a reivindicação 15 em que pelo menos uma das sequências de nucleótidos a) a c) está ligada a uma sequência de nucleótidos correspondente a uma sequência de aminoácidos de uma proteína virai como o veiculo, substituindo assim pelo menos parte da sequência de nucleótidos correspondendo à sequência de aminoácidos da proteína virai ou estando inserida em pelo menos um sítio da referida sequência correspondente a um sítio antigénico da proteína virai.
- 17. Processo de acordo com a reivindicação 16, em que a referida proteína virai é seleccionada do grupo consistindo em hemaglutinina do vírus influenza, neuraminidase do vírus influenza e no antigénio de superfície do vírus da hepatite B.
- 18. Processo de acordo com qualquer das reivindicações 13, 15 a 17, em que um vírus do grupo consistindo em vírus influenza, baculovírus e vírus vaccinia - preferencialmente recombinantes - é utilizado como o organismo hospedeiro.
- 19. Processo para a produção de anticorpo apresentando actividade neutralizante de HIV-1 e sendo capaz de evitar fusão de células provocada por HIV-1, caracternzado por um péptido seleccionado do grupo consistindo em ELDKWAS, LELDKWAS, ELDNWAS, ELNKWAS, LELDNWAS e LELNKWAS, estando o referido péptido preferencialmente ligado a um veículo, ser aplicado ao sistema imunitário de um humano ou animal, no qual o referido anticorpo é produzido. 4
- 20. Processo de acordo com a reivindicação 19, em que o referido péptido é aplicado ao sistema imunitário através de uma superfície mucosa, preferencialmente intranasalmente.
- 21. Processo de acordo com a reivindicação 19 ou 20 em que o referido anticorpo é produzido através de secreção por uma superfície mucosa.Processo de acordo com qualquer das reivindicações 19 a 21 com o referido péptido ligado a um veículo, em que o referido veiculo é um vírus, preferencialmente vírus influenza, ou parte de um vírus, preferencialmente hemaglutinina de vírus influenza.
- 23. Processo de acordo com qualquer das reivindicações 19 a 22, em que o anticorpo produzido é um anticorpo IgA.
- 24. Vacina anti-HIV-1 compreendendo pelo menos um péptido, preferencialmente uma mistura de pelo menos dois péptidos de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 6.Lisboa, 18 de Maio de 2001 /agente oficial da propriedade industrial 5
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