DE69814177T2

DE69814177T2 - Impfstoffe mit einem ltb adjuvans

Info

Publication number: DE69814177T2
Application number: DE69814177T
Authority: DE
Inventors: Etienne Agsteribbe; Rudi Brands; Lolke De Haan; Johan Gustaaf VAN SCHARRENBURG; Ronald Willem VERWEIJ; Christiaan Jan WILSCHUT
Original assignee: Rijksuniversiteit Groningen; Duphar International Research BV
Current assignee: Universiteit Van Groningen Nl; Abbott Biologicals BV
Priority date: 1997-11-25
Filing date: 1998-11-24
Publication date: 2004-04-08
Anticipated expiration: 2018-11-25
Also published as: PL340635A1; EP1071456A1; AU1875099A; NZ504396A; ATE238809T1; SK7762000A3; NO20002613D0; UA72199C2; DE69814177D1; CA2311492C; AU747061B2; TR200001485T2; JP4235359B2; HUP0100058A1; BR9815413A; AU747061C; RU2211050C2; WO1999026654A1; PT1071456E; HUP0100058A3

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Vakzin, welches die Untereinheiten B des Hitze-labilen Enterotoxins (LTB) von Escherichia coli (E. coli) als Mukosa-Immunadjuvans enthält. Die Erfindung betrifft insbesondere ein Vakzin dieses Typs zur Verhinderung von Influenza-Infektionen bei Menschen. Die Erfindung ist jedoch nicht auf die Anwendung in Influenza-Vakzinen eingeschränkt.
Es ist das Ziel der Impfung gegen Infektionskrankheiten, eine Infektion des geimpften Subjekts durch Stimulieren einer Immunantwort gegen das infektiöse Agens durch Einbringen einer von dem bestimmten Pathogen stammenden Antigen-Formulierung zu verhindern oder zumindest einzuschränken. Idealerweise sollte die induzierte Immunantwort aus zwei Komponenten bestehen, einer humoralen Antwort (der Produktion Antigen-spezifischer Antikörper) und einer zellulären Antwort (der Erzeugung spezifischer zytotoxischer T-Lymphozyten, die vom Pathogen infizierte Zellen eliminieren können).
Viele Impfvorgänge umfassen die Verabreichung einer Formulierung, welche das inaktivierte oder abgeschwächte ganze Pathogen enthält. Bei bestimmten Pathogenen ist es jedoch ein beträchtlicher Nachteil, mit dem ganzen Pathogen zu impfen, da solche Präparate, selbst wenn sie gewöhnlich stark immunogen sind, unerwünschte Nebenwirkungen haben können. Dies erklärt den derzeitigen Trend zur Verwendung genau definierter Untereinheits-Vakzine oder synthetischer Vakzine, welchen im Wesentlichen die nachteiligen Nebenwirkungen des infektiösen ganzen Agens fehlen. Im Vergleich zum ganzen Pathogen sind jedoch Untereinheits-Vakzine oder synthetische Vakzine oft nicht sehr immunogen, zumindest wenn kein zugesetztes Adjuvans vorhanden ist.
Adjuvantien sind Substanzen oder Materialien, die in Verbindung mit dem Antigen verabreicht werden, um die Immunantwort gegen das Antigen zu stimulieren. Es besteht ein Bedarf an geeigneten Adjuvantien, die die Immunantwort gegen Untereinheits-Antigene oder synthetische Antigene verstärken würden, ohne unerwünschte Nebenwirkungen zu verursachen.
Influenza-Vakzin-Formulierungen enthielten lange Zeit und enthalten in einigen Fällen noch immer inaktiviertes oder abgeschwächtes Gesamt-Virus. Solche Formulierungen können beträchtliche Nebenwirkungen haben, insbesondere Fieber und Raktionen an der Injektionsstelle. Heutzutage erfolgt die Impfung gewöhnlich mit einer Untereinheits-Formulierung. Dieses Untereinheits-Vakzin, welches weniger Nebenwirkungen hervorruft, enthält nur die beiden Haupt-Oberflächenantigene des Virus, das Hämagglutinin (HA) und die Neuraminidase (NA), in mehr oder weniger gereinigter Form. In den meisten derzeitigen Vakzin-Formulierungen ist kein zugesetztes Adjuvans vorhanden.
Das inaktivierte oder abgeschwächte Influenza-Gesamt-Virus-Vakzin sowie das Untereinheits-Vakzin werden gewöhnlich über eine einzige intramuskuläre (i. m.) Injektion verabreicht. Der Schutz gegen eine Influenza-Infektion, der durch beide Impf-Verfahren erreicht wird, ist relativ gering, insbesondere bei älteren Menschen. Die relativ geringe Wirksamkeit der Impfung gegen Influenza ist teilweise auf die hohe antigene Variabilität des Virus zurückzuführen. Es ist jedoch begründet anzunehmen, dass der Impfschutz gegen eine Influenza-Infektion durch Stimulierung und/oder Modifizierung der Immunantwort gegen das Antigen verbessert werden kann.
Im Falle von Influenza oder allgemein in Fällen, in welchen man sich die Infektion über den Atemtrakt zuzieht, sollten Strategien für eine verbesserte Impfwirkung auf die Erzeugung nicht nur einer adäquaten T-Zellen-abhängigen IgG-Reaktion im Kreislauf, sondern auch auf eine lokale Immunantwort (sekretorisches IgA) in den Lungen und in der Nasenhöhle als erste Verteidigungslinie gegen eindringendes infektiöses Virus abzielen. Weiters könnte eine zelluläre Immunantwort (zytotoxische T-Zellen) auch von Bedeutung sein, insbesondere bei der Einschränkung der Infektion. Es wurde nachgewiesen, dass die Verabreichung von Influenza-Vakzin über eine i. m.-Injektion (der derzeitige Verabreichungsweg) nicht zu einer lokalen IgA-Antwort im Atemtrakt führt.
Die vorliegende Erfindung betrifft die überraschende Erkenntnis, dass das Vorhandensein von LTB in einer Intranasal-Vakzin-Formulierung nicht nur die IgG-Antwort im Kreislauf stimuliert, sondern im Vergleich zu einer i. m.-Immunisierung mit dem Adjuvans-freien Immunogen-Vakzin auch eine lokale IgA-Antwort im Atemtrakt erzeugt.
Das intakte, Hitze-labile Enterotoxin (LT) und sein nahe verwandtes Cholera-Toxin (CT) sind aus einer Untereinheit A und einer pentameren Ringstruktur zusammengesetzt, die aus fünf identischen B-Untereinheiten besteht. Die Untereinheit A hat eine enzymatische, ADP-Ribosylierungs-Aktivität, und die toxische Aktivität ist den Toxinen zuzuschreiben. Im Darm-Epithelium induziert die Untereinheit A andauernd die Synthese des zweiten Messenger-cAMP, was zu übermäßiger Elektrolyt- und gleichzeitiger Fluid-Sekretion in das Lumen des Darms führt.
LT und CT sind starke Schleimhaut-Immunogene. Nach lokaler Verabreichung über die Schleimhaut führen diese Moleküle nicht nur zur Induktion einer systemischen, gegen das Toxin gerichteten Antikörper-Reaktion, sondern auch zur Produktion lokal sezernierter Antikörper, vor allem Sekretions-IgA (S-IgA). LT und CT sind auch starke Schleimhaut-Immunoadjuvantien. Das heißt, bei gemeinsamer Verabreichung mit einem anderen, nicht verwandten Immunogen können LT oder CT die systemische und Schleimhaut-Antikörperreaktion gegen dieses Immunogen stimulieren. Die Toxizität von LT und CT hat jedoch bisher die Verwendung von LT oder CT in humanen Vakzin-Formulierungen im Wesentlichen ausgeschlossen.
Bei Versuchen, die toxischen von den immunstimulierenden Aktivitäten von LT oder CT zu trennen, wurden enttoxifizierte Mutanten des Toxins, oder die nicht veränderte isolierte pentamere Untereinheit B (LTB bzw. CTB) auf ihre immunoadjuvierende Aktivität untersucht. Ganz eindeutig ist, weil die toxische ADP-Ribosylierungsaktivität der Toxine in der Untereinheit A vorliegt, das Vorhandensein von selbst Spurenmengen der unmodifizierten Untereinheit A oder von LT- oder CT-Holotoxin in einem Human-Vakzin sehr unerwünscht.
Die Verwendung von LTB als Adjuvans für Influenza-Antigene wurde von Tamura und Mitarbeitern untersucht (Hirabashi et al.: Vaccine 8: 243–248 [1990]; Kikuta et al.,: Vaccine 8: 595–599 [1990]; Tamura et al. J.: Immunology 3: 981–988 [1992]; Tamura et al.: Vaccine 12: 419–426 [1994]; Tamura et al.: Vaccine 12: 1083– 1089 [1994]). In diesen Untersuchungen wurde, auf Grund der Verwendung löslichen Influenza-Virus-Hämagglutinin(HA)-Vakzins, das extrahiert und durch Behandlung mit Tween/Ether gemäß Davenport et al. (J. Lab. & Clin. Med. 63(1): 5–13 [1964]) von Influenza-Virus gereinigt worden war, etabliert, dass einem LTB, das frei von Untereinheit A ist, die Schleimhaut-Immunadjuvans-Aktivität fehlt, wenn es Mäusen intra-nasal in Verbindung mit dem löslichen HA-Antigen verabreicht wurde. Es wurde weiters gezeigt, dass das Vorhandensein von Spurenmengen an Holotoxin, beispielsweise restlichem Holotoxin, das in aus Holotoxin isolierten Unterein heit-B-Präparaten verbleibt, die Expression der Adjuvans-Aktivität von LTB gegenüber dem löslichen HA-Antigen wieder herstellt. Insbesondere musste, wenn LTB aus rekombinanten Quellen (und daher vollkommen frei von selbst den geringsten Spurenmengen der Untereinheit A) verwendet wurde, eine Spur an Holotoxin zugegeben werden, damit das LTB nach gemeinsamer Verabreicheung mit dem löslichen HA-Antigen in die Nase eine Schleimhaut-Aktivität ausübt.
Überraschenderweise wurde festgestellt, dass isoliertes LTB rekombinanten Ursprungs und daher vollkommen frei von Untereinheit A, je nach dem Wesen oder der Präsentationsform des intranasal gemeinsam verabreichten Immunogens tatsächlich eine starke Immunadjuvans-Aktivität besitzt. Beispielsweise ist die Adjuvans-Aktivität gegenüber frei gemischten kleinen löslichen Antigenen, wie Ovalbumin oder die lösliche Ektodomäne des Hüllen-Glykoproteins des HIV (gp120) gering und häufig nicht detektierbar. Anderseits stellte man fest, dass LTB gegenüber frei gemischten großen, aggregierten oder partikuläre Immunogenen tatsächlich eine sehr starke Adjuvans-Aktivität ausübt. Zu diesen Immunogenen zählen das Influenza-Virus-Untereinheits-Antigen und das Schlüsselloch-Napfschnecken-Hämocyanin (keyhole limpet hemocyanin, KLH).
Demgemäß betrifft die vorliegende Erfindung ein Vakzin, das mindestens ein partikuläres Immunogen und eine adjuvantierende Menge von LTB, das vollständig frei von Untereinheit A oder von toxischem LT-Holotoxin ist, enthält.
Wie hierin definiert, bedeutet "partikulär" jegliche Assoziierung von Virus-, Bakterien- oder Pilz-Antigenen, die für die jeweiligen Mikrorganismen charakteristisch sind. Insbesondere umfasst der Ausdruck "partikuläres Immunogen" Aggregate, Cluster, Mizellen, Virosome, Rosetten, Virus-artige Immunogen-Partikel u. dgl.
Im Vakzin gemäß der vorliegenden Erfindung kann insbesondere mit rekombinanter DNA-Technologie hergestelltes LTB benützt werden. Das Immunogen oder die Immunogene können von infektiösen Agentien, wie Viren oder Bakterien, stammen.
Man stellte fest, dass Vakzine, die der obigen Beschreibung entsprechen, nach Verabreichung über die Schleimhaut (z. B. intranasal) nicht nur systemisches Immunglobulin (z. B. IgG) gegen das Immunogen induzieren, sondern auch eine lokale Sekretion von IgA induzieren.
Diese letztere Eigenschaft ist besonders günstig für die Immunisierung gegen Krankheiten, die durch eine Schleimhautinfektion mit Viren (wie Influenza-Virus, Herpes-Virus, Papilloma-Virus) oder Bakterien (wie Chlamydia, Pneumokokken) oder Pilze übertragen werden.
Ein besonderer Vorteil der Verabreichung über die Schleimhaut ist die Einfachheit der Vakzinverabreichung, womit weiters eine mögliche Nadelphobie bei eine intramuskuläre Immunisierung erhaltenden Impflingen umgangen wird.
Obwohl beispielsweise im Falle einer Influenza-Infektion hohe Serum-IgG-Titer für die Verhinderung einer systemischen Ausbreitung des Virus und den Schutz der Lunge gegen eine Infektion wichtig sind, sind lokale S-IgA-Antikörper als erste Verteidigungslinie für den Schutz des oberen Atemtrakts entscheidend.
Es wurde berichtet, dass eine Impfung über die Schleimheut durch i. n.-Verabreichung von inaktiviertem Influenza-Virus in Abwesenheit eines mukosalen Adjuvans nicht erfolgreich war (Clancy: Drugs 50: 587–594 [1995]; Katz et al.; J. Infect. Dis. 175: 352–369 [1997]), vermutlich weil eine direkte Verabreichung eines Antigens an Schleimhautgewebe nicht zu einer S-IgA-Antwort führt. Die gemeinsame Verabreichung eines mukosalen Adjuvans scheint eine Bedingung zur Induktion einer lokalen Immunantwort gegen ein Immunogen zu sein. Bemerkenswerterweise stellte man fest, dass durch eine i. n.-Immunisierung gemäß der vorliegenden Erfindung das sogenannte allgemeine mukosale Immunsystem aktiviert wird, was zur Sekretion von S-IgA nicht nur an der Stelle der Anwendung (i. n.), sondern auch in entfernt gelegenen Schleimhautgeweben (z. B. im Schleimhautgewebe der Vagina) führt.
Vakzine gemäß der vorliegenden Erfindung können Immunogene beispielsweise viralen oder bakteriellen Ursprungs enthalten, wie bakterielle Antigene, virale Untereinheiten (gegebenenfalls inaktiviert), Split-Viren (gegebenenfalls inaktiviert), inaktivierte Viren oder Bakterien, oder abgeschwächte (z. B. Kälte-adaptierte) Lebendviren, in einer partikulären Form.
Das gemäß der vorliegenden Erfindung verwendete LTB ist absolut ("strictly") frei von toxischem LTA oder toxischem Holotoxin. Vorzugsweise wird das LTB durch rekombinante DNA-Technologie hergestellt. Frei von toxischem LTA bedeutet im vorliegenden Zu sammenhang absolut LTA-frei.
Im Vakzin gemäß der vorliegenden Erfindung kann das LTB in freier Beimengung mit dem partikulären Antigen verwendet werden – eine kovalente Kupplung zwischen dem Antigen und dem Adjuvans kann jedoch etabliert werden, ist jedoch nicht nötig, um eine adäquate adjuvantierende Wirkung zu erreichen.
Abgesehen von LTB und einem oder mehreren Immunogenen kann das Vakzin gemäß der vorliegenden Erfindung ein wässeriges Lösungsmittel, insbesondere einen Puffer, mehr im Besonderen PBS (Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung) sowie einen Stabilisator (z. B. PEG oder Methylcellulose) und/oder Glucose enthalten.
Die Bestandteile des Vakzins gemäß der vorliegenden Erfindung können gefriergetrocknet sein oder in flüssiger Form vorliegen.
Das Vakzin gemäß der vorliegenden Erfindung kann z. B. als "Bulk", oder in einer Ampulle oder in einer Spritze oder in einem Zerstäuber vorliegen.
Das Vakzin gemäß der vorliegenden Erfindung kann durch subkutane oder intramuskuläre oder intrabronchiale oder intranasale oder intravaginale Anwendung oder per os verabreicht werden.
BEISPIEL 1
HERSTELLUNG VON REKOMBINANTEM LTB UND INFLUENZA-UNTEREINHEITS-ANTIGEN
REKOMBINANTES LTB
Rekombinante LTB-Gene und rekombinante LTB-Moleküle, wie in der vorliegenden Erfindung erwähnt, können von Genen stammen, die für LT-I-Moleküle codieren, z. B. von einer Schweine- oder Human-Quelle. Das Schweine-LT("porcine LT", pLT)-Gen wurde in den pUC18-Vektor (Vieira und Messing: Gene 19: 259–268 [1982)) kloniert, wobei PCR-Techniken verwendet wurden (DeHaan et al.: Vaccine 14: 260–266 [1996]). Der EWD299-Vektor, der ursprünglich von Dallas et al. (J. Bacteriol. 139: 850–858 [1979]) beschrieben worden war, wurde als Matrize in der PCR-Reaktion verwendet. Es zeigte sich, dass die primäre pLT-Sequenz dieses Konstrukts exakt in Übereinstimmung mit der primären pLT-Sequenz ist, wie sie in der EMBL-Sequenz-Datenbank hinterlegt ist, was mittels DNA-Sequenzierung verifiziert wurde. Vom pUC18-pLT-Konstrukt wurde das pLTB-Gen in den pROFIT-Expressionsvektor subkloniert, welcher einen Temperatur-induzierbaren λPR-Promotor (van der Linden et al.: Eur. J. Biochem. 204: 197–202 [1992]) enthält.
E. coli MC1061 wurde als Wirts-Stamm für die pROFIT-Plasmid-Konstrukte verwendet. Bakterien wurden auf einem Luria-Bertani-Medium, das 50 μg Kanamycin pro ml enthielt, gezüchtet. Die Induktion der pLTB-Expression wurde erhalten, indem die Kultur-Temperatur der log-Phasen-MC1061-Kulturen, die den pROFIT-LTB-Vektor enthalten, von 28 auf 42 Grad Celcius erhöht wurde, wie von De Haan et al. (supra) beschrieben.
pTLTB, ein von pKK stammender Expressionsvektor (Pharmacia Ltd), der für humanes LTB codiert, (d. h. für ein LTB-Gen, das von einem LT-Gen stammt, das aus einem in Menschen enterotoxigenen E. coli-Bakterium isoliert ist), wurde von Tamura und Mitarbeitern erhalten. Die DNA-Sequenzierung zeigte 3 Aminosäure-Substitutionen im reifen humanen LTB (hLTB), im Vergleich zum pLTB (Thr 4 zu Ser, Glu46 zu Ala und Lys 102 zu Glu). E. coli Stamm JM101 wurde als Wirt für pTLTB verwendet. Die Bakterien wurden auf LB-Medium, das 100 μg Ampicillin pro ml enthielt, gezüchtet. Die Induktion der hLTB-Expression wurde durch Zugabe von IPTG zu log-Phasen-Kulturen von JM101, die pTLTB enthielten, zu einer Endkonzentration von 5 mM erhalten.
Zur Reinigung von pLTB und hLTB wurden überexprimierende Bakterien geerntet und dann mittels Schallbehandlung lysiert. Danach wurde der Zellabfall durch Ultrazentrifugieren entfernt. Rohe Zellextrakte, die rekombinantes pLTB oder hLTB enthielten, wurden dann auf eine immobilisierte D-Galactose (Pierce)-Säule aufgetragen. Nach ausgiebigem Waschen wurden rekombinantes gereinigtes pLTB oder hLTB durch Elution mit D-Galactose, wie früher von Uesaka et al. (Microb. Path. 16: 71–76 [1994]) beschrieben, erhalten. Es zeigte sich, dass sowohl rekombinantes pLTB als auch hLTB optimale GM1-Bindungseigenschaften in einem GM1-"capture"-ELISA behielten, wie früher beschrieben (DeHaan et al.: Vaccine 14: 260–266 [1996]). Säulen-Fraktionen, die gereinigtes Protein enthielten, wurden gepoolt, gegen PBS dialysiert und bei 4°C gelagert.
INFLUENZA-UNTEREINHEITS-ANTIGEN
Das Influenza-Untereinheits-Antigen wurde aus B/Harbin/7/94-Virus (B/Harbin) oder A/Johannesburg/33/94 (A/Johannesburg), die auf Embryonen enthaltenden Hühnereiern gemäß dem von Bachmayer et al. (Patentschrift GB 1,498.261 vom 18. Jänner 1978) und von Chaloupka et al. (Eur. J. Microbiol. Infect. Dis. 15: 121–127 [1996]) beschriebenen Verfahren gezüchtet worden waren, herge stellt. Dieses Verfahren umfasst die Schritte der Behandlung der Formaldehyd-inaktivierten Viren mit einem geeigneten kationischen Detergens, die Trennung der freigesetzten Antigene (Hämagglutinin und Neuraminidase) aus dem übrigen Virus-Kern. Dieses Verfahren führt zu einer partikulären, d. h. Mizellen-artigen, Exposition der Antigene nach dem Entfernen des Detergens.
Die Stärke der Untereinheits-Antigen-Präparate, als μg pro ml ausgedrückt, wurde in einem Einzel-Radial-Diffusions-Test gemäß Wood et al. (J. Biol. Stand. 5: 237–241 [1977]) bestimmt.
BEISPIEL 2
SYSTEMISCHE ANTIKÖRPER-REAKTION AUF INFLUENZA-UNTEREINHEITS-VAKZIN
Gruppen von vier Mäusen wurden i. n. ohne Anästhesie mit 5 μg Influenza-Untereinheits-Antigen immunisiert, das entweder von B/Harbin- oder A/Johannesburg-Virus, hergestellt gemäß der im BEISPIEL 1 beschriebenen Verfahren, stammte. Das Antigen wurde entweder alleine (HA) oder zusammen mit 2,0 μg pLTB (pLTB), in allen Fällen in einem Volumen von 20 μl an den Tagen 0, 7 und 14 gegeben. Kontroll-Mäuse erhielten dasselbe Volumen an PBS. Die Mäuse wurden am Tag 28 getötet. Die Serum-IgG-Antikörper-Reaktion wurde in einem direkten ELISA bestimmt.
1 zeigt die beobachteten Serum-IgG-Antikörper-Reaktionen gegen HA B/Harbin (ausgefüllte Balken) und HA A/Johannesburg (leere Balken).
Eine nasale Verabreichung des Untereinheits-Antigen ohne Adjuvans ergab eine schwache systemische Antikörper-Reaktion, wogegen die Ergänzung des Untereinheits-Antigens mit pLTB die Serum-Antikörper-Reaktion um mehr als zwei Größenordnungen verstärkte. Die Unterschiede zwischen den Reaktionen von Mäusen, die mit B/Harbin und A/Johannesburg immunisiert worden waren, waren nicht signifikant.
Diese Ergebnisse zeigen, dass nicht-toxisches pLTB ein starkes Adjuvans ist, das starke systemische Antikörper-Reaktionen gegen i. n. verabreichtes Influenza-Untereinheits-Antigen induzieren kann.
BEISPIEL 3
VERGLEICH SYSTEMISCHER ANTIKÖRPER-REAKTIONEN MIT HUMANEM UND SCHWEINE-LTB
Gruppen aus 4 Mäusen wurden i. n. ohne Anästhesie mit 5 μg Influenza-Untereinheits-Antigen, das von B/Harbin-Influenza-Virus stammte, hergestellt gemäß dem in BEISPIEL 1 beschriebenen Verfahren, immunisiert.
Das Antigen wurde entweder alleine (KEINES) oder zusammen mit entweder 2,0 μg pLTB (pLTB) oder 2,0 μg hLTB (hLTB), in allen Fällen in einem Volumen von 20 μl, an den Tagen 0, 7 und 14 gegeben. Die Kontrolltiere erhielten PBS. Die Mäuse wurden am Tag 21 getötet. Die Serum-IgG-Antikörper-Reaktion wurde in einem direkten ELISA am Tag 21 bestimmt.
2 zeigt die beobachtete Serum-IgG-Antikörper-Reaktion gegen HA B/Harbin. Nasale Verabreichung von Untereinheits-Antigen ohne Adjuvans ergab wiederum eine schwache systemische Antikörper-Reaktion, wogegen die Ergänzung des Untereinheits-Antigens mit pLTB und mit hLTB die Serum-Antikörper-Reaktion im selben Ausmaß um mehr als zwei Größenordnungen verstärkte. Die beobachteten Unterschiede zwischen mit pLTB und hLTB behandelten Tieren waren nicht signifikant.
BEISPIEL 4
INDUKTION EINER LOKALEN MUKOSALEN ANITKÖRPER-REAKTION AUF INFLUENZA-UNTEREINHEITS-VAKZIN
Um die Fähigkeit von pLTB, Influenza-HA-spezifische S-IgA-Reaktionen hervorzurufen, zu untersuchen, wurden Nasen-Waschflüssigkeiten der Mäuse aus BEISPIEL 2 auf das Vorhandensein von Influenza-spezifischen IgA-Antikörpern analysiert. Die Nasen-Waschflüssigkeiten wurden erhalten, indem 0,5 ml von PBS rückläufig über die Nasopharynx in den oberen Teil der Trachea gespült, rückgespült und das Spülungsfluid an den Nasenlöchern gesammelt wurde.
Die Ergebnisse sind in 3 gezeigt.
Die Daten zeigen, dass rekombinantes pLTB starke lokale S-IgA-Reaktionen gegen HA induzierte. Die zwei verschiedenen Influenza-Untereinheits-Antigene führten zu ähnlichen Ergebnissen.
BEISPIEL 5
VERGLEICH MUKOSALER ANTIKÖRPER-REAKTIONEN MIT HUMANEM UND SCHWEINE-LTB
Um die Fähigkeiten von pLTB und hLTB zur Verstärkung nasaler HA-spezifischer Antikörper-Reaktionen zu vergleichen, wurden nasale Waschflüssigkeiten der Mäuse aus BEISPIEL 3 wie oben beschrieben genommen und auf das Vorhandensein von HA-spezifischem S-IgA am Tag 21 analysiert. 4 zeigt, dass sowohl pLTB als auch hLTB heftige nasale HA-spezifische Antikörper-Reaktionen induzierte. Außerdem waren die mit pLTB und hLTB erhaltenen Reaktionen hinsichtlich ihrer Größe vergleichbar, was zeigt, dass beide Moleküle vergleichbare Adjuvans-Eigenschaften aufweisen.
BEISPIEL 6
INDUKTION VON ANTIKÖRPER-REAKTIONEN DER GENITAL-SCHLEIMHAUT AUF I. N. ANGEWANDTES INFLUENZA-UNTEREINHEITS-VAKZIN
Um die Fähigkeit von rekombinantem pLTB, Influenza-HA-spezifische S-IgA-Reaktionen an anderen Schleimhautstellen als der Verabreichungsstelle hervorzurufen, zu untersuchen, wurde die Induktion von Influenza-spezifischen S-IgA-Antikörpern im Genitaltrakt nach i. n. Immunisierung bei den Mäusen aus BEISPIEL 2 untersucht. Spülungen des Urogenitaltrakts wurden durchgeführt, indem unter Verwendung einer Pipetten-Spitze ein 100 μl-Volumen PBS zehn Mal in die Vagina eingebracht und aus dieser entzogen wurde. Die Mukosa-Waschflüssigkeiten wurden dann bei 4°C bis zur Bestimmung ihres IgA-Gehalts durch ELISA gelagert. Die Ergebnisse sind in 5 gezeigt.
Die Ergebnisse zeigen, dass pLTB sich als wirksam für die Induktion von S-IgA-Reaktionen an dieser entfernt gelegenen Schleimhautstelle erwies. Sowohl B/Harbin- als auch A/Johannesburg-Antigen gab gleich gute Reaktionen.
BEISPIEL 7
KINETIK DER IgG-REAKTION
Vier Gruppen aus acht weiblichen BALB/c-Mäusen (6–8 Wochen alt) wurden wie folgt behandelt:
Kontrolle: mit PBS ohne Antigen behandelt. 20 μl i. n. ohne Anästhesie an den Tagen 0, 7 und 14;
pLTB: 5 μg HA und 2,0 μg rekombinantes pLTB in 20 μl i. n. ohne Anästhesie an den Tagen 0, 7 und 14 angewandt;
HA s. c. 5 μg HA in 100 μl, s. c. ohne Anästhesie am Tag 0 angewandt; rekonv.: rekonvaleszente Mäuse, d. h. Mäuse, infiziert mit 10⁸ infektiösen Einheiten des PR8-Virus in 20 μl, i. n. ohne Anästhesie am Tag 0 angewandt.
Von vier Mäusen von jeder Gruppe wurden Blutproben von der Schwanzvene an den Tagen 6, 13 und 20 entnommen. Weiters wurden am Tag 28 alle Mäuse getötet und ausgeblutet. In jeder Probe wurde Serum-IgG mittels ELISA gemessen.
Die Ergebnisse sind in 6 gezeigt. Die Balken (von links nach rechts) für jede der Impf-Schemata repräsentieren die IgG-Titer an den Tagen 6, 13, 20 bzw. 28. Diese Ergebnisse zeigen, dass nach einer i. n.-Impfung mit HA/pLTB die IgG-Induktion mindestens genauso groß wie nach einer s. c.-Impfung mit HA alleine, oder wie bei rekonvaleszenten Mäusen ist.
BEISPIEL 8
NASEN- UND LUNGENSCHLEIMHAUT-ANTIKÖRPER
Dieselben Mäuse, die in BEISPIEL 7 untersucht wurden, wurden Schleimhaut-Spülungen der Nasenhöhle und des Urogenitaltrakts unterzogen, nachdem sie, wie oben beschrieben, am Tag 28 getötet worden waren.
Die Ergebnisse sind in 8 zusammengefasst. Die schraffierten Balken repräsentieren die Daten der Nasenwaschflüssigkeiten, und die leeren Balken die Daten der Vaginalwaschflüssigkeiten.
Die Ergebnisse zeigen, dass der Titer der Antikörper der ersten Verteidigungslinie (S-IgA) nach i. n.-Impfung mit HA/pLTB mindestens genauso groß ist wie der S-IgA-Titer bei rekonvaleszenten Mäusen, wogegen die (klassische) s. c.-Imfpung mit HA nicht zu einem detektierbaren Mukosa-IgA-Titer führt.
BEISPIEL 9
SCHUTZ GEIMPFTER MÄUSE GEGEN EINEN "CHALLENGE"
Vier Mäuse jeder der Gruppen aus BEISPIEL 7 wurden am Tag 28 mit 5 × 10⁶ infektiösen Einheiten des PR8-Virus i. n. in 20 μl ohne Anästhesie infiziert.
Drei Tage nach dem Challenge wurde die Virus-Belastung in Nase und Lunge bestimmt.
Die Virus-Titration in Nasen- und Lungen-Homogenaten erfolgte auf MDCK-Zellen, die auf EPISERF (Life Technologies, PAISLY, Schottland) in Mikrotitrations-Platten gezüchtet worden waren, durch Zweistufen-Verdünnungen und durch nachfolgende Endpunkt-Bestimmungen unter Verwendung einer Hämagglutination mit Meerschweinchen-Erythrozyten.
Die Ergebnisse sind in 7 zusammengefasst. Die schraffierten Balken repräsentieren die Virus-Titer in der Nase, und die leeren Balken sind für die Lunge. Die Virus-Titer in der Lunge für rekonvaleszente Mäuse und nach Impfung mit pLTB waren unbedeutend. Folglich zeigen diese Daten, dass durch Verwendung von pLTB als mukosales Adjuvans der Schutz gegen eine Influenza-Infektion ein vollständiger ist.

Claims

Vakzin zur Verabreichung über die Schleimhaut, welches zumindest ein partikuläres Immunogen und eine adjuvantierende Menge der Untereinheiten B des für E. coli charakteristischen Hitze-labilen Enterotoxins (LTB) enthält und vollständig frei von Untereinheit A oder von toxischem LT-Holotoxin ist.
Vakzin nach Anspruch 1, wobei das LTB durch rekombinante DNA-Methoden hergestellt ist.
Vakzin nach Anspruch 1–2, wobei Virus- oder Bakterien- oder Pilz-Antigene als Immunogen verwendet werden.
Vakzin nach Anspruch 1–3, wobei das Immunogen eine Immunisierung gegen eine Krankheit vorsieht, die durch Schleimhautinfektion übertragen wird.
Vakzin nach Anspruch 4, wobei Influenza-Antigene als Immunogen verwendet werden.
Verwendung der Untereinheiten B von Hitze-labilem, für E. coli charakteristischem Enterotoxin (LTB), vollständig frei von Untereinheit A oder toxischem LT-Holotoxin, bei der Herstellung eines Vakzins, welches ein partikuläres Immunogen und eine adjuvantierende Menge des LTB enthält, welches für die Induktion einer systemischen Immunoglobulin-Antwort gegen das Immunogen in , einem Individuum nach Verabreichung über die Schleimhaut geeignet ist.
Verwendung der Untereinheiten B von Hitze-labilem, für E. coli charakteristischem Enterotoxin (LTB), vollständig frei von Untereinheit A oder toxischem LT-Holotoxin, bei der Herstellung eines Vakzins, welches ein partikuläres Immunogen und eine adjuvantierende Menge des LTB enthält, welches für die Induktion einer allgemeinen Schleimhaut-Immunantwort gegen das Immunogen in einem Individuum nach lokaler Verabreichung über die Schleimhaut geeignet ist.