CN1280504A - 含有ltb佐剂的疫苗 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种疫苗,该疫苗包含至少一种颗粒状免疫原和辅助量的大肠肝菌特征性热不稳定肠毒素的B亚单位。更具体地讲,本发明涉及一些疫苗,其中辅助性LTB没有污染A亚单位或全毒素。为此,优选使用通过重组DNA技术制备的LTB。颗粒状免疫原可以涉及或者可以来源于例如病毒、细菌或真菌。一旦粘膜(例如鼻内)给药,该疫苗就特别适合于诱导针对所说颗粒状免疫原的保护性应答。已发现这种给药导致针对颗粒状免疫原涉及的病原体的全身和粘膜两者的保护作用。

Description

含有LTB佐剂的疫苗
本发明涉及一种疫苗，该疫苗含有作为粘膜免疫佐剂的大肠杆菌(E．coli)热不稳定性肠毒素的B亚单位(LTB)。本发明具体地说涉及预防人类的流感的这种类型的疫苗。但是，本发明并不局限于在流感疫苗中的应用。
针对传染病的免疫接种的目的是经过引入来源于具体病原体的抗原制剂、通过刺激对传染物的免疫应答，预防或至少限制被接种者的感染。理想地，诱导的免疫应答应当由两部分组成、即体液应答(产生抗原特异性抗体)和细胞应答(产生特异性的细胞毒性T淋巴细胞，该细胞能够清除由病原体感染的细胞)。
许多的接种过程都涉及将含有灭活的或减毒的整个病原体的制剂给药。但是对某些病原体而言，用整个病原体接种存在着相当多的缺点，这是因为这种制剂可能具有不希望有的副作用，即使它们通常是高度免疫原性的。这就解释了目前倾向于使用明确的亚单位疫苗或合成疫苗的趋势，这实质上去掉了整个传染物的不利的副作用。但是与整个病原体相比，至少在缺乏附加的佐剂的情况下，亚单位疫苗或合成疫苗常常是极少有免疫原性的。
佐剂是与抗原结合给药以便刺激对该抗原的免疫应答的物质或材料。需要一些合适的佐剂，其中所述佐剂将会促进对亚单位抗原或合成抗原的免疫应答，同时不造成不希望有的副作用。
流感疫苗的制剂已经长时间地含有、并且在某些情况下仍含有灭活的或减毒的整个病毒。这种制剂可能具有相当大的副作用，其中最突出的是发烧和在注射部位的反应。如今，通常用亚单位制剂进行接种。这种造成副作用更少的亚单位疫苗仅含有以近乎纯化形式存在的所述病毒的两种主要的表面抗原，即血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)。在大多数目前的疫苗制剂中，并不存在附加的佐剂。
灭活的或减毒的整个流感病毒疫苗以及亚单位疫苗通常是通过单一的肌内(i．m．)注射进行给药的。通过其中之一的接种过程实现的对流感的预防是相当低的，尤其在老年人当中更是如此。对流感接种的功效相当低的原因部分是由于病毒具有高度的抗原变异性。但是，有理由相信通过刺激和／或改变对抗原的免疫应答可以改善通过接种疫苗对流感的预防。
在流感或者一般说来在通过呼吸道感染传染病的情况下，用于改善接种功效的策略的目的应当在于不仅在循环系统中产生足够的依赖T-细胞的免疫球蛋白G的应答，而且还应当在肺和鼻腔中产生局部的免疫应答(分泌性免疫球蛋白A)以作为抵御入侵的传染病毒的第一道防线。而且，细胞的免疫应答(细胞毒性的T-细胞)可能也是重要的，尤其是在限制传染的过程中更是如此。已经表明通过肌内注射(通用的给药途径)将流感疫苗给药并没有导致在呼吸道中产生局部的免疫球蛋白A的应答。
本发明涉及这样一种惊人的发现：相对于用不含佐剂的免疫原疫苗进行肌内免疫接种而言，在鼻内疫苗制剂中LTB的存在不仅刺激了循环系统中免疫球蛋白G的应答，而且在呼吸道中产生了局部的免疫球蛋白A的应答。
完整的热不稳定的肠毒素(LT)及其关系密切的霍乱毒素(CT)是由一个A亚单位和一个五聚体环状结构组成的，其中五聚体环状结构是由五个相同的B亚单位组成的。A亚单位具有酶促ADP-核糖基化活性并且认为毒性活性是由毒素引起的。在肠上皮细胞中，A亚单位诱导第二信使cAMP不断地合成，从而造成过量的电解质以及随之而来的流体分泌到消化道腔中。
LT和CT是有效的粘膜的免疫原。当进行局部的粘膜给药时，这些分子不仅导致诱导了定向于所述毒素的系统抗体应答，而且导致产生了局部的分泌型抗体，其中最突出的是分泌性免疫球蛋白A(S-IgA)。LT和CT也是有效的粘膜的免疫佐剂。即当与其它不相关的免疫原共同给药时，LT或CT能够刺激针对该免疫原的系统和粘膜的抗体应答。但是迄今为止，LT和CT的毒性已经基本上排除了LT或CT在人的疫苗制剂中的使用。
为了试图使LT或CT的毒性与免疫刺激活性分离开，已经检测了该毒素去毒的突变体或未修饰的分离的五聚体B亚单位(分别为LTB或CTB)的免疫佐剂的活性。显然，由于该毒素有毒的ADP-核糖基化的活性残留在A亚单位中，因此在人的疫苗中甚至存在痕量的未修饰的A亚单位或者存在LT或CT的全毒素都是非常不受欢迎的。
Tamura及其同事已经研究了LTB作为流感抗原的佐剂的用途(Hirabashi等人《(疫苗》8：243-248[1990]；Kikuta等人《疫苗》8：595-599[1990]；Tamura等人《免疫学杂志》3：981-988[1992]；Tamura等人《疫苗》12：419-426[1994]；Tamura等人《疫苗》12：1083-1089[1994])。在这些研究中，在使用可溶的流感病毒血凝素(HA)疫苗的基础上确认当与可溶的HA抗原结合经鼻内给小鼠给药时，不含A亚单位的LTB缺少粘膜的免疫佐剂的活性，其中所述的HA疫苗是根据Davenport等人(《实验室与临床医学杂志》63(1)：5-13[1964])报道的通过用吐温／醚处理从流感病毒中提取和纯化的。进一步表明痕量全毒素的存在、例如在从全毒素分离出的B亚单位制剂中剩余的残留的全毒素恢复了针对可溶HA抗原的LTB的佐剂活性的表达。更具体地讲，当使用来自重组来源(并因而完全没有甚至是最少的痕量的A亚单位)的LTB时，为了当与可溶的HA抗原经鼻内共同给药时使LTB发挥粘膜的活性，必须加入痕量的全毒素。
令人吃惊的是发现了从重组来源分离的并因而完全不含A亚单位的LTB具有有效的免疫佐剂的活性，而该活性取决于鼻内共同给药的免疫原的性质或存在形式。
例如，针对自由混合的小的可溶抗原(诸如卵清蛋白或人免疫缺损病毒包膜糖蛋白的可溶的胞外域(gp120))的佐剂活性是很低的并且常常是检测不到的。另一方面发现针对自由混合的大的聚集的或颗粒状免疫原，LTB发挥了非常有效的佐剂的活性。这些免疫原包括流感病毒亚单位抗原和匙孔血蓝蛋白(KLH)。
因此，本发明涉及一种疫苗，该疫苗含有至少一种颗粒状免疫原和辅助量的完全不含A亚单位或有毒的LT全毒素的LTB。
正如本文定义的那样，“颗粒状”是指以各微生物特征性病毒、细菌或真菌抗原的任何缔合物。更具体地讲，术语“颗粒状免疫原”包括集结体、簇合物、微团(micelles)、病毒体、玫瑰花结、类似病毒的免疫原颗粒等。
在本发明的疫苗中，具体地说来可以采用由重组DNA技术制得的LTB。所述的一种免疫原或多种免疫原可以来源于传染物，如病毒或细菌。
发现适用于上述的疫苗不仅在粘膜(例如鼻内)给药时诱导产生了针对免疫原的全身性免疫球蛋白(例如免疫球蛋白G)，而且还发现该疫苗诱导了免疫球蛋白A的局部的分泌。
这一在后的特性对预防某些疾病而进行免疫接种来说是特别有利的，其中所述的疾病是通过由病毒(如流感病毒、疱疹病毒、乳头状瘤病毒)、细菌(类似衣原体、肺炎链球菌)或真菌的粘膜感染来传播的。
粘膜给药的一个特别的优点是使疫苗的使用容易，而且还回避了接受鼻内免疫接种的被接种者对针潜在的恐惧。
尽管例如在流感的情况中高的血清免疫球蛋白G的滴度对防止病毒在系统中的扩散以及保护肺部以防感染来说是重要的，但是局部的S-IgA抗体作为保护上呼吸道的第一道防线是至关重要的。
已经报道了在缺少粘膜佐剂的情况下通过鼻内将灭活的流感病毒给药而进行的粘膜免疫接种并不成功(Clancy《药物》50：587-594[1995]；Katz等人《传染病杂志》175：352-369[1997])，这可能是因为将抗原直接向粘膜组织给药并没有导致S-IgA的应答。粘膜佐剂的共同给药似乎是诱导对免疫原产生局部免疫应答的一个先决条件。显然发现通过本发明的鼻内免疫接种，激活了所谓的普通的粘膜免疫系统，这导致不仅在施用部位(鼻内)、而且在远距离的粘膜组织中(例如在阴道粘膜组织中)都分泌出S-IgA。
本发明的疫苗可以含有呈颗粒形式的例如病毒或细菌来源的免疫原，诸如细菌抗原、病毒亚单位(可灭活可不灭活)、分裂病毒(可灭活可不灭活)、灭活的病毒或细菌或者减毒的(例如适应寒冷的)活的病毒。
本发明所用的LTB是严格地不含有毒的LTA或有毒的全毒素的。优选地，所述LTB是通过重组DNA技术制得的。在本文的上下文中，不含有毒的LTA是指严格不含LTA的。
在本发明的疫苗中，可以与颗粒抗原自由地混合来使用LTB-在抗原和佐剂之间可以建立共价的偶联，但是却不必实现足够的佐剂的效果。
除了LTB和一种或多种免疫原之外，本发明的疫苗还可以含有含水的溶剂、具体地讲为缓冲液、更具体地讲为PBS(磷酸盐缓冲盐水)以及稳定剂(例如PEG或甲基纤维素)和／或葡萄糖。
本发明疫苗的组分可以是冷冻干燥的或者呈液态的。
本发明的疫苗例如可以以散装的形式存在，或者存在于安瓿瓶、注射器或喷雾器中。
可以将本发明的疫苗通过皮下、肌内、支气管内、鼻内或阴道内施用或经口服给药。
实施例1
制备重组LTB和流感亚单位抗原重组LTB
如本发明提及的重组的LTB基因和重组的LTB分子可以来源于例如猪或人来源的编码LT-1分子的基因。采用PCR技术(DeHaan等人《疫苗》14：260-266[1996])在pUC18载体上(Vieira与Messing《基因》19：259-268[1982])亚克隆猪LT(pLT)基因。将最初由Dallas等人(《细菌学杂志》139：850-858[1979])所述的EWD299载体用作PCR反应中的模板。正如DNA测序所验证的那样，发现该构建体的初级pLT序列恰好正是如EMBL序列数据库递交的初级pLT序列。通过pUC18-pLT构建体，在含有温度诱导型λPR启动子(van der Linden等人《(欧洲生物化学杂志》204：197-202[1992])的pROFIT表达载体中亚克隆pLTB基因。
将大肠杆菌MC1061用作pROFIT质粒构建体的宿主菌株。在含有50μg／ml卡那霉素的Luria-Bertani培养基上培养细菌。如De Haan等人所述(出处同上)，通过将含有pROFIT-LTB载体的MC1061培养物对数期的培养温度由28℃升高到42℃，便获得了对pLTB表达的诱导。
从Tamura及其同事那里得到了pTLTB、即编码人LTB的来源于pKK的表达载体(Pharmacia有限公司)(即来源于从在人体内产肠毒素的大肠杆菌细菌中分离出的LT基因的LTB基因)。DNA测序揭示出与pLTB相比，在成熟的人LTB(hLTB)中存在着3个氨基酸的取代(Thr4取代Ser、Glu46取代Ala，以及Lys102取代G1u)。将大肠杆菌菌株JM101用作pTLTB的宿主。在含有100μg／ml氨苄青霉素的LB培养基上培养细菌。通过向含有pTLTB的JM101的对数期培养物中加入IPTG至最终浓度为5mM，便获得了对hLTB表达的诱导。
为了纯化pLTB和hLTB，收获超量表达的细菌，然后通过超声处理破碎细胞。随后，通过超速离心除去细胞碎片。然后，将含有重组pLTB或hLTB的粗的细胞提取物加入到固定化D-半乳糖(Pierce)柱中。在经过彻底的洗涤后，如Uesaka等人(《微生物病原体》16：71-76[1994])以前所述的那样，通过用D-半乳糖洗脱便获得了重组的纯化的pLTB或hLTB。正如以前所述的那样(DeHaan等人《疫苗》14：260-266[1996])，发现重组的pLTB和hLTB在GM1捕捉酶联免疫吸附测定中同时保留着最佳的GM1结合特性。汇集含有纯化蛋白的柱组分，通过PBS对其进行透析并在4℃下储存。流感亚单位抗原
流感亚单位抗原是从根据Bachmayer等人(于1978年1月18日出版的专利说明书GB 1 498 261)和Chaloupka等人(《欧洲微生物传染病杂志》15：121-127[1996])所述的方法在含胚鸡卵上培养的B／Harbin／7／94病毒(B／Harbin)或A／Johannesburg／33／94(A／Johannesburg)中制得的。该方法包括用合适的阳离子洗涤剂处理用甲醛灭活的病毒、使释放出的抗原(血凝素和神经氨酸酶)与病毒残余的核心分离的步骤。在除去洗涤剂后，该方法生成了颗粒状的、即呈类似于微团状的抗原。
在根据Wood等人(《生物学标准杂志》5：237-241[1977])的单成分辐射扩散试验中测定以μg／ml表示的亚单位抗原制剂的效能。
实施例2
针对流感亚单位疫苗的系统抗体应答
将四只小鼠的小组在不进行麻醉的情况下用5μg的流感亚单位抗原进行鼻内的免疫接种，其中所述的抗原来源于根据实施例1中所述的方法制得的B／Harbin或A／Johannesburg病毒。在第0天、第7天和第14天时，将抗原或者单独地(HA)或者与2．0μg的pLTB(pLTB)一起给药，其中在所有的情况下体积都为20μl。对照小鼠接受相同体积的PBS。在第28天时处死小鼠。在直接的酶联免疫吸附测定中测定血清免疫球蛋白G抗体的应答。
图1表明观察到的针对HA B／Harbin(实心柱)和HA A／Johannesburg(空心柱)的血清免疫球蛋白G抗体的应答。
在没有佐剂的情况下亚单位抗原的鼻部给药产生了极少的系统抗体应答，而用pLTB补充亚单位抗原则使血清抗体应答增强了两个数量级以上。在用B／Harbin和A／Johannesburg免疫接种的小鼠应答之间的差别并不明显。
这些结果表明无毒的pLTB是一种有效的佐剂，它针对流感亚单位抗原的鼻内给药能够诱导高度的系统抗体应答。
实施例3
比较人和猪LTB之间的系统抗体应答
将四只小鼠的小组在不进行麻醉的情况下用5μg的流感亚单位抗原进行鼻内的免疫接种，其中所述的抗原来源于根据实施例1中所述的方法制得的B／Harbin流感病毒。
在第0天、第7天和第14天时，将抗原或者单独地(无)或者与2．0μg的pLTB(pLTB)或与2．0μg的hLTB(hLTB)一起给药，其中在所有的情况下体积都为20μl。对照动物接受PBS。在第21天时杀死小鼠。在第21天时，在直接的酶联免疫吸附测定中测定血清免疫球蛋白G抗体的应答。
图2表明观察到的针对HA B／Harbin的血清免疫球蛋白G抗体的应答。
在没有佐剂的情况下亚单位抗原的鼻部给药再次产生了极少的系统抗体应答，而用pLTB和hLTB补充亚单位抗原则使血清抗体应答增强了两个数量级以上且两者增强的程度相同。在pLTB和hLTB处理的动物之间所观察到的差别并不明显。
实施例4
诱导对流感亚单位疫苗的局部粘膜抗体应答
为了研究pLTB引起流感HA-特异性S-IgA应答的能力，分析来自实施例2小鼠的鼻洗液中流感-特异性免疫球蛋白A抗体的存在。鼻洗液是通过用0．5ml的PBS沿着鼻咽到气管的上部逆向冲洗、再反向冲洗并且在鼻孔处收集灌洗液来得到的。结果示于图3中。
这些数据表明重组pLTB诱导了针对HA的强烈的局部S-IgA应答。两种不同的流感亚单位抗原产生了类似的结果。
实施例5
比较人和猪LTB之间的粘膜抗体应答
为了比较pLTB和hLTB增强鼻HA-特异性抗体应答的能力，在第21天时选取如上所述的来自实施例3的小鼠的鼻洗液并且分析HA-特异性S-IgA的存在。图4表明pLTB和hLTB都诱导了强烈的鼻HA-特异性抗体的应答。此外，由pLTB和hLTB得到的应答在数量上是类似的，这表明两种分子都具有类似的佐剂特性。
实施例6
诱导针对鼻内施用的流感亚单位疫苗的生殖粘膜抗体应答为了研究重组pLTB在除给药部位之外的粘膜部位引起流感HA-特异性S-IgA应答的能力，在对来自实施例2的小鼠进行鼻内免疫接种后，调查生殖道中流感-特异性S-IgA抗体的诱导。通过使用吸管尖端将体积为100μl的PBS引入阴道中并从中抽出共计10次来进行尿生殖道的灌洗。在4℃下储存粘膜的洗液直至通过酶联免疫吸附测定测定其免疫球蛋白A的含量。结果示于图5中。
该结果表明pLTB证明了在该远距离的粘膜部位诱导S-IgA的应答是有效的。B／Harbin和A／Johannesburg的抗原应答得同样好。
实施例7
免疫球蛋白G应答的动力学
将由八只雌性BALB／c小鼠(6-8周龄)组成的四个小组中的每只小鼠处理如下：对照      在第0天、第7天和第14天时，在不进行麻醉的情况下用20μl不含抗原的PBS经鼻内处理pLTB      在第0天、第7天和第14天时，在不进行麻醉的情况下经鼻内施加5μgHA和2．0μg重组pLTB的20μl溶液HA皮下接种在第0天时，在不进行麻醉的情况下经皮下施加5μgHA的100μl溶液恢复期    恢复期的小鼠，即被108个PR8病毒感染单位感染的小鼠在第0天时在不进行麻醉的情况下经鼻内施加20μl的溶液
在第6天、第13天和第20天时，从每个小组的四只小鼠的尾静脉中取出血样。此外在第28天时，处死所有的小鼠并放血。在每个样品中，通过酶联免疫吸附测定测量血清的免疫球蛋白G。
结果示于图6中。针对每种接种方法的长方柱(从左至右)分别代表着第6、13、20和28天时免疫球蛋白G的滴度。这些结果表明在用HA／pLTB经鼻内接种后，免疫球蛋白G的诱导与在单独用HA经皮下接种后或与恢复期小鼠中的诱导至少是处于同一数量级的。
实施例8
鼻粘膜和肺粘膜抗体
如上所述在第28天时杀死与实施例7中研究的相同的小鼠之后，所述小鼠经历对鼻腔和尿生殖道的粘膜的灌洗。
结果总结在图8中。阴影柱代表来自鼻洗液的数据，而空心柱表示来自阴道洗液的数据。
结果显示当用HA／pLTB经鼻内接种时第一道抗体(S-IgA)防线的滴度与恢复期小鼠中S-IgA的滴度至少是处于同一数量级的，而(传统的)采用HA的皮下接种导致检测不到粘膜免疫球蛋白A的滴度。
实施例9
被接种的小鼠针对激发的保护作用
在第28天时，在不进行麻醉的情况下用5×106个PR8病毒感染单位的20μl溶液经鼻内感染实施例7各个小组中的四只小鼠。
激发后第3天时，测定鼻和肺中病毒的加量。
在EPISERF(生命技术公司，PAISLY，苏格兰)上培养的MDCK细胞上，在微量滴定板中通过两步稀释、随后通过采用与豚鼠红细胞之间的血细胞凝集作用的终点测定进行对鼻和肺匀浆中的病毒的滴定。
结果总结在图7中。阴影柱代表鼻子中病毒的滴度，而空心柱是针对肺的。对恢复期小鼠和在用pLTB接种时肺中病毒的滴度是不明显的。因此，这些数据表明通过使用pLTB作为粘膜佐剂，对流感的预防是完全的。

Claims (10)

1．一种疫苗，所述疫苗含有至少一种颗粒状免疫原和辅助量的大肠肝菌特征性热不稳定肠毒素的B亚单位(LTB)。
2．根据权利要求1的疫苗，其中所述的LTB没有污染A亚单位或全毒素。
3．根据权利要求1-2的疫苗，其中所述的LTB是通过重组DNA方法制得的。
4．根据权利要求1-3的疫苗，其中病毒、细菌或真菌的抗原用作免疫原。
5．根据权利要求1-3的疫苗，其中所述的免疫原提供针对由粘膜感染传播的疾病的免疫保护。
6．根据权利要求5的疫苗，其中流感抗原用作免疫原。
7．用于诱导针对免疫原的全身性免疫球蛋白应答的方法，所述方法是通过把呈颗粒状的所说免疫原以及辅助量的大肠肝菌特征性热不稳定肠毒素的B亚单位经粘膜给药。
8．用于诱导针对免疫原的普通粘膜免疫应答的方法，所述方法是通过把呈颗粒状的所说免疫原以及辅助量的大肠肝菌特征性热不稳定肠毒素的B亚单位经粘膜给药。
9．大肠肝菌特征性热不稳定肠毒素的B亚单位(LTB)在制备疫苗中的用途，其中所述疫苗包括颗粒状免疫原和辅助量的所说LTB，当经粘膜给药时，所述的疫苗适合于在个体中诱导针对所说免疫原的全身性免疫球蛋白应答。
10．大肠肝菌特征性热不稳定肠毒素的B亚单位(LTB)在制备疫苗中的用途，其中所述疫苗包括颗粒状免疫原和辅助量的所说LTB，当经局部粘膜给药时，所述的疫苗适合于在个体中诱导针对所说免疫原的普通粘膜免疫应答。
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