ES2198089T3 - Vacunas con un adyuvante constituido por ltb. - Google Patents

Abstract

Una vacuna para administración en la mucosa, que contiene al menos un inmunógeno en partículas y una cantidad adyuvante de subunidades B de enterotoxina termolábil (LTB) característica de E. coli, completamente exenta de subunidad A u holotoxina LT tóxica.

Description

Vacunas con un adyuvante constituido por LTB.

La presente invención se refiere a una vacuna que contiene las subunidades B de la enterotoxina termolábil (LTB) de la Escherichia coli (E. coli) como un inmunoadyuvante en la mucosa. La invención se refiere en particular a una vacuna de este tipo para impedir las infecciones de gripe en seres humanos. Sin embargo, la invención no está restringida a una aplicación en vacunas para la gripe.

Es el objeto de la vacunación frente a enfermedades infecciosas impedir o al menos contener la infección del sujeto vacunado estimulando una respuesta inmune frente al agente infeccioso a través de la introducción de una formulación de un antígeno derivado del patógeno particular. Idealmente, la respuesta inmune inducida debe consistir en dos componentes, una respuesta humoral (la producción de anticuerpos específicos frente a antígenos) y una respuesta celular (la generación de linfocitos T citotóxicos específicos, capaces de eliminar células infectadas por el patógeno).

Muchos procedimientos de vacunación implican la administración de una formulación que contiene patógenos enteros inactivados o atenuados. Sin embargo, para ciertos patógenos, hay un inconveniente considerable para la vacunación con el patógeno entero, ya que tales preparaciones, incluso aunque son usualmente muy inmunógenas, pueden tener efectos secundarios indeseables. Esto explica la tendencia actual hacia el uso de vacunas constituidas por subunidades bien definidas o vacunas sintéticas, careciendo sustancialmente de efectos secundarios adversos del agente infeccioso entero. Sin embargo, comparadas con el patógeno entero, las vacunas constituidas por subunidades o vacunas sintéticas no son a menudo muy inmunógenas, al menos en ausencia de un adyuvante añadido.

Los adyuvantes son sustancias o materiales administrados conjuntamente con el antígeno para estimular la respuesta inmune frente a ese antígeno. Hay una necesidad de adyuvantes apropiados que estimulen la respuesta inmune frente a antígenos constituidos por subunidades o antígenos sintéticos sin causar efectos secundarios indeseables.

Las formulaciones de vacunas para la gripe han contenido durante mucho tiempo, y en algunos casos contienen todavía, virus enteros inactivados o atenuados. Tales formulaciones pueden tener efectos secundarios considerables, lo más notablemente fiebre y reacciones en el sitio de la inyección. En la actualidad, la vacunación se realiza usualmente con una formulación constituida por subunidades. Esta vacuna constituida por subunidades, que causa menos reacciones secundarias, contiene solamente los dos principales antígenos de superficie del virus, la hemaglutinina (HA) y la neuraminidasa (NA), en una forma más o menos purificada. En las formulaciones de vacunas más corrientes, no hay presente un adyuvante añadido.

La vacuna del virus entero de la gripe inactivado o atenuado, así como la vacuna constituida por subunidades, se administran usualmente por medio de una única inyección intramuscular (i.m.). La protección frente a la infección de la gripe, lograda por cualquier procedimiento de vacunación, es comparativamente baja, particularmente en gente mayor. La eficacia relativamente baja de la vacunación contra la gripe es debida en parte a la alta variabilidad antigénica del virus. Sin embargo, hay razones para creer que la protección por vacunación frente a la infección de la gripe puede mejorarse por estimulación y/o modificación de la respuesta inmune frente al antígeno.

En el caso de la gripe, o en general en los casos en los que la infección se contraiga a través del tracto respiratorio, las estrategias para una vacunación mejorada deben dirigirse a la generación de no sólo una respuesta adecuada de IgG dependientes de linfocitos T en la circulación, sino también una respuesta inmune local (IgA de secreción) en los pulmones y cavidad nasal como una primera línea de defensa frente a los virus infectantes invasores. Además, también puede ser importante una respuesta inmune celular (linfocitos T citotóxicos), particularmente restringiendo la infección. Se ha demostrado que la administración de la vacuna de la gripe por medio de una inyección i.m. (la ruta corriente de administración) no da como resultado una respuesta local de IgA en el tracto respiratorio.

La presente invención se refiere al descubrimiento sorprendente que la presencia de LTB en una formulación de vacuna intranasal no solo estimula la respuesta de IgG en la circulación, relacionada con la inmunización i.m. con la vacuna inmunógena sin adyuvante, sino también genera una respuesta local de IgA en el tracto respiratorio.

La enterotoxina termolábil (LT) íntegra, y su homóloga la toxina del cólera (CT), están compuestas de una subunidad A y una estructura de anillo pentámero que consiste en 5 subunidades B idénticas. La subunidad A tiene actividad enzimática, de ADP-ribosilación, y atribuye la actividad tóxica a las toxinas. En el epitelio intestinal, la subunidad A induce la síntesis persistente de segundo mensajero AMPc, que da como resultado una excesiva secreción de electrolito y una secreción concomitante de fluido en la luz del intestino.

LT y CT son potentes inmunógenos en la mucosa. Tras una administración local en la mucosa, estas moléculas dan lugar no sólo a una inducción de una respuesta sistémica de anticuerpos dirigida contra la toxina, sino también a la producción de anticuerpos secretados localmente, señaladamente IgA de secreción (S-IgA). LT y CT son también potentes inmunoadyuvantes en la mucosa. Esto es, cuando se co-administran con otro inmunógeno no relacionado, LT o CT pueden estimular la respuesta de anticuerpos sistémica y en la mucosa frente a ese inmunógeno. Sin embargo, la toxicidad de LT y CT ha imposibilitado esencialmente hasta ahora el uso de LT o CT en formulaciones de vacunas para seres humanos.

En intentos de separar las actividades tóxicas de las inmunoestimulantes de LT o CT, se han examinado mutantes desintoxicados de las toxinas, o la subunidad B pentámera aislada no modificada (LTB o CTB, respectivamente) para determinar su actividad inmunoadyuvante. Claramente, debido a que la actividad tóxica de ADP-ribosilación de las toxinas reside en la subunidad A, la presencia de incluso indicios de subunidad A no modificada o de holotoxina LT o CT en una vacuna para seres humanos es altamente indeseable.

El uso de LTB como un adyuvante para antígenos de la gripe ha sido investigado por Tamura y colaboradores (Hirabashi et al.: Vaccine 8: 243-248 [1990]; Kikuta et al.,: Vaccine 8: 595-599 [1990]; Tamura et al. J.: Immunology 3: 981-988 [1992]; Tamura et al.: Vaccine 12: 419-426 [1994]; Tamura et al.: Vaccine 12: 1083-1089 [1994]). En estos estudios, basados en el uso de vacuna de hemaglutinina (HA) de virus de la gripe soluble, extraída y purificada a partir del virus de la gripe por tratamiento con Tween/éter, conforme a Davenport et al. (J. Lab. & Clin. Med. 63 (1): 5-13 [1964]), se ha establecido que la LTB, sin la subunidad A, carece de actividad inmunoadyuvante en la mucosa cuando se administra a ratones de manera intranasal conjuntamente con el antígeno HA soluble. Se ha demostrado además que la presencia de indicios de holotoxina, por ejemplo holotoxina residual que queda en las preparaciones de subunidades B aisladas de la holotoxina, restablece la expresión de actividad adyuvante de LTB sobre el antígeno HA soluble. Más en particular, cuando se usó LTB de fuentes recombinantes (y por lo tanto, sin ni siquiera los más pequeños indicios de subunidad A), se tuvieron que añadir pequeñas cantidades de holotoxina para que la LTB ejerciera actividad en la mucosa tras una co-administración intranasal con el antígeno HA soluble.

Sorprendentemente, se encontró que LTB aislada a partir de un origen recombinante, y por lo tanto completamente libre de subunidad A, poseía una potente actividad inmunoadyuvante, dependiendo de la naturaleza o forma de presentación del inmunógeno co-administrado de manera intranasal.

Por ejemplo, la actividad adyuvante sobre los antígenos de pequeño tamaño solubles mezclados libremente, tales como ovalbúmina o el ectodominio soluble de la glicoproteína de la envoltura del virus de la inmunodeficiencia humana (gp120), es baja y a menudo no detectable. Por otra parte, se encontró que LTB ejerce una muy potente actividad adyuvante sobre inmunógenos en agregados o en partículas de gran tamaño mezclados libremente. Estos inmunógenos incluyen antígenos constituidos por subunidades del virus de la gripe y hemocianina de lapa californiana (KLH).

De acuerdo con esto, la presente invención tiene que ver con una vacuna que contiene al menos un inmunógeno en partículas y una cantidad adyuvante de LTB completamente libre de subunidad A u holotoxina LT tóxica.

Como se define aquí, ``partículas'' quiere decir cualquier asociación de antígenos víricos, bacterianos o fúngicos característicos de los microorganismos respectivos. Más en particular, la expresión ``inmunógeno en partículas'' comprende agregados, agrupaciones, micelas, virosomas, rosetas, partículas inmunógenas pseudovíricas, y similares.

En la vacuna conforme a la presente invención, en particular, puede utilizarse LTB preparada a partir de la tecnología de ADN recombinante. El inmunógeno o inmunógenos puede proceder de agentes infectantes, tales como virus o bacterias.

Se encontró que las vacunas aplicables a la descripción anterior no sólo indujeron inmunoglobulinas sistémicas (por ejemplo, IgG) frente al inmunógeno tras una administración en la mucosa (por ejemplo, intranasal), sino que también se encontró que indujeron una secreción local de IgA.

Esta última propiedad es particularmente favorable para la inmunización frente a enfermedades que se trasmiten por infección de la mucosa con virus (tales como el virus de la gripe, virus del herpes, virus del papiloma) o bacterias (como Chlamydia, neumococos), u hongos.

Una ventaja particular de la administración en la mucosa es la facilidad de la aplicación de la vacuna, que, además, evita la potencial fobia a las agujas de las personas que se vacunan recibiendo una inmunización intramuscular.

Aunque, por ejemplo, en el caso de la infección de la gripe, son importantes altos valores de IgG en el suero para impedir la propagación sistémica del virus y para la protección de los pulmones frente a la infección, los anticuerpos S-IgA locales son cruciales como una primera línea de defensa para la protección del tracto respiratorio superior.

Se ha informado de que la vacunación en la mucosa por administración i.n. del virus de la gripe inactivado, en ausencia de un adyuvante en la mucosa, no fue exitosa (Clancy: Drugs 50: 587-594 [1995]; Katz et al.; J. Infect. Dis. 175: 352-369 [1997]), debido probablemente a que la administración directa de un antígeno en el tejido de la mucosa no da como resultado una respuesta de S-IgA. La co-administración de un adyuvante en la mucosa parece ser un pre-requisito para inducir una respuesta inmune local frente a un inmunógeno. Extraordinariamente, se encontró que por inmunización i.n. conforme a la presente invención, se activa el denominado sistema inmune común de las mucosas, lo que da como resultado la secreción de S-IgA no sólo en el sitio de aplicación (i.n.), sino también en tejidos de mucosas distantes (por ejemplo, en el tejido de la mucosa vaginal).

Las vacunas conforme a la presente invención pueden contener inmunógenos de origen, por ejemplo, vírico o bacteriano, tales como antígenos bacterianos, subunidades víricas (inactivadas opcionalmente), virus fraccionados (inactivados opcionalmente), virus o bacterias inactivadas, o virus vivos atenuados (por ejemplo, adaptados al frío), en forma de partículas.

La LTB usada conforme a la presente invención no tiene LTA tóxica u holotoxina tóxica estrictamente. Preferiblemente, LTB se prepara por tecnología de ADN recombinante. Sin LTA tóxica en el presente contexto quiere decir sin LTA estrictamente.

En la vacuna conforme a la presente invención, LTB puede usarse mezclada libremente con el antígeno en partículas puede establecerse un acoplamiento covalente entre el antígeno y el adyuvante, sin embargo, no se necesita para lograr un efecto adyuvante adecuado.

Aparte de la LTB y uno o más inmunógenos, la vacuna conforme a la presente invención puede contener un disolvente acuoso, en particular un tampón, más en particular PBS (disolución salina tamponada con fosfato), así como un estabilizador (por ejemplo PEG o metil-celulosa), y o glucosa.

Los componentes de la vacuna conforme a la presente invención pueden estar liofilizados o estar en forma líquida.

La vacuna conforme a la presente invención puede estar por ejemplo suelta, o en una ampolla, o en una jeringa, o en un nebulizador.

La vacuna conforme a la presente invención puede administrarse por aplicación subcutánea, o intramuscular, o intrabronquial, o intranasal, o intravaginal, o por vía oral.

Ejemplo 1 Preparación de LTB recombinante y antígeno constituido por subunidades de la gripe LTB recombinante

Los genes de LTB recombinante y las moléculas de LTB recombinante, como se mencionan en la presente invención, pueden derivarse de genes que codifican moléculas LT-1 a partir de, por ejemplo, una fuente porcina o animal. El gen porcino LT (pLT) se subclonó en el vector pUC18 (Vieira and Messing: Gene 19: 259-268 [1982]) usando técnicas de RCP (DeHaan et al.: Vaccine 14: 260-266 [1996]). El vector EWD299, descrito originalmente por Dallas et al. (J. Bacteriol. 139: 850-858 [1979]) se usó como molde en la reacción de RCP. La secuencia primaria de pLT de esta construcción se encontró que fue exactamente conforme a la secuencia primaria de pTL que se suministró al banco de datos de secuencias EMBL, como se verificó por secuenciación de ADN. A partir de la construcción pUC18-pLT, el gen pLTB se subclonó en el vector de expresión pROFIT, que contenía un promotor \lambdaPR termoinducible (van der Linden et al.: Eur. J. Biochem. 204: 197-202 [1992]).

Se usó E. coli MC 1061 como cepa anfitriona para las construcciones de plásmido pROFIT. Las bacterias se cultivaron en un medio Luria-Bertani que contenía 50 \mug de kanamicina por ml. La inducción de la expresión de pLTB se obtuvo elevando la temperatura de los cultivos de MC 1061 en fase logarítmica transformados con el vector pROFIT-LTB desde 28 a 42 grados Celsius, como se describe por De Haan et al. (supra).

El pTLTB, un vector de expresión derivado de pKK (Pharmacia Ltd.) que codifica LTB humana (es decir, un gen de LTB derivado de un gen de LT aislado de una bacteria E. coli enterotoxinógena en humanos), se obtuvo de Tamura y colaboradores. La secuenciación de ADN reveló 3 sustituciones de aminoácidos en LTB humana madura (hLTB) comparado con pLTB (Tre4 a Ser, Glu46 a Ala, y Lis102 a Glu). Se usó una cepa de E. coli JM 101 como anfitrión para pTLTB. Las bacterias se cultivaron en un medio LB que contenía 100 \mug de ampicilina por ml. La inducción de la expresión de hLTB se obtuvo por adición de IPTG a cultivos en fase logarítmica de JM 101 transformados con pTLTB hasta una concentración final de 5 mM.

Para la purificación de pLTB y hLTB, se recogieron las bacterias en las que se produjo la sobre-expresión, y se sometieron a lisis por exposición a ultrasonidos. Posteriormente, los restos de las células se retiraron por ultracentrifugación. Los extractos crudos de las células que contenían pLTB o hLTB recombinante se aplicaron luego a una columna de D-galactosa (Pierce) inmovilizada. Después de un lavado extensivo, se obtuvieron pLTB o hLTB recombinantes purificadas por elución con D-galactosa, como se ha descrito previamente por Uesaka et al. (Microb. Path. 16: 71-76 [1994]). Se encontró que tanto pLTB como hLTB recombinantes retuvieron propiedades óptimas de unión a GM1, en un ELISA de captura de GM1, como se ha descrito previamente (DeHaan et al.: Vaccine 14: 260-266 [1996]). Las fracciones de la columna que contenían proteína purificada se unieron, se dializaron frente a PBS y se almacenaron a 4ºC.

Antígeno constituido por subunidades de la gripe

El antígeno constituido por

\hbox{subunidades de la}

gripe se preparó a partir de virus B/Harbin/7/94 (B/Harbin) o A/Johannesburg/33/94 (A/Johannes-burg) cultivado en huevos embrionados de pollo, conforme al método descrito por Bachmayer et al. (memoria descriptiva de la patente GB 1498261 del 18 de enero de 1978) y por Chaloupka et al. (Eur. J. Microbiol. Infect. Dis. 15: 121-127 [1996]). Este método comprende las etapas de tratamiento de los virus inactivados con formaldehído con un detergente catiónico adecuado, separación de los antígenos liberados (hemaglutinina y neuraminidasa) a partir del núcleo residual del virus. Este método conduce a partículas, es decir, a una exposición similar a micelas de los antígenos después de la retirada del detergente.

Se determinó la potencia de las preparaciones de antígeno constituido por subunidades, expresada como \mug por ml, en un ensayo de difusión radial simple conforme a Wood et al. (J. Biol. Stand. 5: 237-241 [1977]).

Ejemplo 2 Respuesta sistémica de anticuerpos frente a la vacuna constituida por subunidades de la gripe

Se inmunizaron i.n. grupos de cuatro ratones sin anestesia con 5 \mug de antígeno constituido por subunidades de la gripe derivado de o virus B/Harbin o de virus A/Johannesburg preparado conforme al método descrito en el Ejemplo 1. El antígeno se suministró solo (HA) o junto con 2 \mug de pLTB (pLTB), en todos los casos en un volumen de 20 \mul, en los días 0, 7 y 14. Los ratones testigo recibieron el mismo volumen de PBS. Los ratones fueron sacrificados en el día 28. Se determinó la respuesta de anticuerpos IgG en el suero en un ELISA directo.

La figura 1 muestra las respuestas de anticuerpos IgG en el suero observadas frente a HA B/Harbin (barras sólidas) y HA A/Johannesburg (barras sin trazos).

La administración nasal del antígeno constituido por subunidades sin adyuvante dio como resultado una pobre respuesta sistémica de anticuerpos, mientras que el suplemento con pLTB del antígeno constituido por subunidades mejoró la respuesta de anticuerpos en el suero en más de dos órdenes de magnitud.

Las diferencias entre las respuestas de los ratones inmunizados con B/Harbin y A/Johannesburg no fueron significativas.

Estos resultados muestran que pLTB no tóxica es un potente adyuvante capaz de inducir altas respuestas sistémicas de anticuerpos frente a un antígeno constituido por subunidades de la gripe administrado i.n.

Ejemplo 3 Comparación de respuestas sistémicas de anticuerpos con LTB humana y porcina

Se inmunizaron i.n. grupos de cuatro ratones sin anestesia con 5 \mug de antígeno constituido por subunidades de la gripe derivado de virus de la gripe B/Harbin preparado conforme al método descrito en el Ejemplo 1.

El antígeno se suministró solo (SIN ADYUVANTE) o junto con 2 \mug de pLTB (pLTB) ó 2 \mug de hLTB (hLTB), en todos los casos en un volumen de 20 \mul, en los días 0, 7 y 14. Los animales testigo recibieron PBS. Los ratones fueron sacrificados en el día 21. Se determinó la respuesta de anticuerpos IgG en el suero en un ELISA directo en el día 21.

La figura 2 muestra la respuesta de anticuerpos IgG en el suero observada frente a HA B/Harbin.

La administración nasal del antígeno constituido por subunidades sin adyuvante dio como resultado una pobre respuesta sistémica de anticuerpos, mientras que el suplemento con pLTB y con hLTB del antígeno constituido por subunidades mejoró en el mismo grado la respuesta de anticuerpos en el suero, en más de dos órdenes de magnitud. Las diferencias observadas entre los animales tratados con pLTB y con hLTB no fueron significativas.

Ejemplo 4 Inducción de respuesta local de anticuerpos en la mucosa frente a la vacuna constituida por subunidades de la gripe

Para investigar la capacidad de pLTB para inducir respuestas de S-IgA específicos a HA de la gripe, se analizaron lavados nasales de los ratones del Ejemplo 2 para detectar la presencia de anticuerpos IgA específicos a la gripe. Se obtuvieron lavados nasales pasando un chorro de 0,5 ml de PBS en sentido retrógrado por la nasofaringe hasta la parte superior de la tráquea, y recogiendo el fluido de lavado de vuelta en las fosas nasales.

Los resultados se muestran en la figura 3.

Los datos muestran que pLTB recombinante indujo fuertes respuestas locales de S-IgA frente a HA. Los dos antígenos diferentes constituidos por subunidades de la gripe dieron resultados similares.

Ejemplo 5 Comparación de respuestas de anticuerpos en la mucosa con LTB humana y porcina

Para comparar las capacidades de pLTB y hLTB para mejorar las respuestas nasales de anticuerpos específicos a HA, se tomaron en el día 21 lavados nasales de los ratones del Ejemplo 3 como se ha descrito anteriormente, y se analizaron para detectar la presencia de S-IgA específicos a HA. La figura 4 muestra que tanto pLTB como hLTB indujeron fuertes respuestas nasales de anticuerpos específicos a HA. Además, las respuestas obtenidas con pLTB y hLTB fueron comparables en magnitud, demostrando que ambas moléculas tenían propiedades adyuvantes comparables.

Ejemplo 6 Inducción de respuesta de anticuerpos en la mucosa genital frente a la vacuna constituida por subunidades de la gripe aplicada i.n.

Para investigar la capacidad de pLTB recombinante para inducir respuestas de S-IgA específicos a HA de la gripe en mucosas diferentes del sitio de administración, se investigó la inducción de anticuerpos S-IgA específicos a la gripe en el tracto genital después de una inmunización i.n., en los ratones del Ejemplo 2. Se llevaron a cabo lavados del tracto urogenital, introduciendo y retirando 10 veces un volumen de 100 \mul de PBS dentro de la vagina, usando una punta de pipeta. Los lavados de la mucosa se almacenaron a 4ºC hasta la determinación de sus contenidos de IgA mediante un ELISA. Los resultados se muestran en la figura 5.

Los resultados muestran que pLTB probó ser eficaz induciendo respuestas de S-IgA en esta mucosa distante. Tanto el antígeno B/Harbin como el A/Johannesburg respondieron igualmente bien.

Ejemplo 7 Cinéticas de la respuesta de IgG

Se trataron como sigue cuatro grupos de ocho ratones BALB/c hembras (6-8 semanas) cada uno:

Testigo

tratados con PBS sin antígeno. 20 \mul i.n. sin anestesia, en los días 0, 7 y 14.

pLTB

5 \mug de HA y 2 \mug de pLTB recombinante en 20 \mul, aplicados i.n. sin anestesia, en los días 0, 7 y 14.

HA s.c.

5 \mug de HA en 100 \mul, aplicados s.c. sin anestesia en el día 0.

Conv.

ratones convalecientes, es decir, ratones infectados con 10^{8} unidades infecciosas de virus PR8, en 20 \mul aplicados i.n. sin anestesia en el día 0.

Se tomaron muestras de sangre de cuatro ratones de cada grupo, de las venas de la cola, en los días 6, 13 y 20. Además, en el día 28, todos los ratones fueron sacrificados y desangrados. En cada muestra, los IgG del suero se midieron por ELISA.

Los resultados se muestran en la figura 6. Las barras (de izquierda a derecha), para cada uno de los regímenes de vacunación, representan los valores de IgG en los días 6, 13, 20 y 28, respectivamente. Estos resultados muestran que después de una vacunación i.n. con HA/pLTB, la inducción de IgG es de al menos la misma magnitud como después de una vacunación s.c. con HA sola, o como en ratones convalecientes.

Ejemplo 8 Anticuerpos en la mucosa nasal y de los pulmones

Los mismos ratones que fueron estudiados en el Ejemplo 7 se sometieron a lavados de la mucosa de la cavidad nasal y del tracto urogenital después de ser sacrificados en el día 28, como se ha descrito anteriormente.

Los resultados se resumen en la figura 8. Las barras sombreadas representan los datos de los lavados nasales y las barras sin trazos muestran los datos de los lavados vaginales.

Los resultados indican que el valor de los anticuerpos de la primera línea de defensa (S-IgA), tras una vacunación i.n. con HA/pLTB, es de al menos la misma magnitud que el valor de S-IgA en ratones convalecientes, mientras que la vacunación s.c. (clásica) con HA no conduce a un valor detectable de IgA en la mucosa.

Ejemplo 9 Protección de ratones vacunados frente a una provocación

Cuatro ratones de cada uno de los grupos del Ejemplo 7 fueron infectados en el día 28, i.n. sin anestesia, con 5x10^{6} unidades infecciosas de virus PR8 en 20 \mul.

Tres días después de la provocación, se determinó la cantidad de virus en las fosas nasales y pulmones.

La valoración del virus en homogeneizados de fosas nasales y pulmones se llevó a cabo en células MDCK, que se cultivaron en un medio EPISERF (Life Technologies, PAISLY, Scotland) en placas de microvaloración por diluciones en dos etapas, y por una determinación posterior del punto final usando hemaglutinación con eritrocitos de cobaya.

Los resultados se resumen en la figura 7. Las barras sombreadas representan los valores de virus en las fosas nasales y las barras sin trazos en los pulmones. Los valores de virus en los pulmones para ratones convalecientes y tras vacunación con pLTB fueron insignificantes. Por lo tanto, estos datos muestran que usando pLTB como adyuvante en la mucosa, la protección frente a la infección de la gripe es completa.

Claims (7)

1. Una vacuna para administración en la mucosa, que contiene al menos un inmunógeno en partículas y una cantidad adyuvante de subunidades B de enterotoxina termolábil (LTB) característica de E. coli, completamente exenta de subunidad A u holotoxina LT tóxica.

2. Una vacuna conforme a la reivindicación 1, en la que LTB se prepara por métodos de ADN recombinante.

3. Una vacuna conforme a la reivindicación 1-2, en la que se usan como inmunógeno antígenos víricos, o bacterianos, o fúngicos.

4. Una vacuna conforme a la reivindicación 1-3, en la que el inmunógeno proporciona inmunización frente a una enfermedad que se trasmite por infección en la mucosa.

5. Una vacuna conforme a la reivindicación 4, en la que se usan antígenos de la gripe como inmunógeno.

6. El uso de las subunidades B de enterotoxina termolábil (LTB) característica de E. coli, completamente exenta de subunidad A u holotoxina LT tóxica, en la preparación de una vacuna que comprende un inmunógeno en partículas y una cantidad adyuvante de dicha LTB, adecuada para la inducción de una respuesta sistémica de inmunoglobulinas frente a dicho inmunógeno en una persona, tras una administración en la mucosa.

7. El uso de las subunidades B de enterotoxina termolábil (LTB) característica de E. coli, completamente exenta de subunidad A u holotoxina LT tóxica, en la preparación de una vacuna que comprende un inmunógeno en partículas y una cantidad adyuvante de dicha LTB, adecuada para la inducción de una respuesta del sistema inmune común de las mucosas frente a dicho inmunógeno en una persona, tras una administración local en la mucosa.