PT721782E - Vacina contra a gripe contendo toxina da tosse convulsa - Google Patents

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Description

85 543 ΕΡ Ο 721 782/ΡΤ
DESCRÍCÃO "Vacina contra a gripe contendo toxina da tosse convulsa" O invento refere-se a uma composição de vacina que compreende antigénios do vírus da gripe e um adjuvante.
As vacinas contra a gripe correntes consistem no vírus completo inactivado, no vírus cindido (vacinas cindidas) ou em preparações purificadas de vacinas de subunidades das glicoproteínas de membranas, hemaglutinina (HA) e neuraminidase (NA). A hemaglutinina e a neuraminidase são os antigénios aos quais se dirigem as respostas dos anticorpos protectores, sendo a hemaglutinina o antigénio protector principal. As estimativas sobre a eficácia destas vacinas administradas parentericamente variam muito. Crê-se que estas vacinas actuam principalmente eliciando anticorpos IgG anti-hemaglutinina circulantes que transudam para o tracto respiratório inferior. M.L. Clements et a/, J. Clinicai Microbiology 24. 157-160, 1986, relataram anteriormente que tanto a IgA excretória como a IgG sérica participam na imunidade ao vírus da gripe. Além disso, em ratinhos, alguns estudos publicados demonstraram a importância da IgA sintetizada localmente para protecção contra a infecção da gripe. Verificou-se também que uma vantagem de estimular uma resposta local de IgA à gripe é haver uma especificidade frequentemente mais alargada do que a resposta sérica, podendo assim proporcionar uma protecção cruzada contra vírus que possuam moléculas de hemaglutinina diferentes das presentes na vacina. Assim, as vacinas contra a gripe que eliciam respostas anti-hemaglutinina tanto locais como excretórias deverão proporcionar uma imunidade superior à das vacinas correntes. Contudo, a vacinação parentérica (intramuscular, subcutânea, etc) não é eficaz para eliciar a produção local de anticorpos, se não tiver havido exposição prévia da mucosa (por exemplo, infecção). Para conseguir um estímulo eficiente do tecido linfóide associado à mucosa (MALT = "mucose-associated /ymphoid t/ssue"), o imunogénio precisa de ser aplicado topicamente na superfície da mucosa no decurso da vacinação.
85 543 ΕΡ Ο 721 782/ΡΤ 2 A administração da vacina contra a gripe em mucosas tem várias vantagens sobre os regímenes de imunização parentérica tradicionais. Entre estas, são da maior importância um estímulo mais eficaz do sistema imunitário local da mucosa do tracto respiratório e a probabilidade das taxas de aceitação da vacina serem aumentadas por ser evitado o medo e o desconforto associados às injecções. Assim, foram feitas várias tentativas para desenvolver vacinas contra a gripe para mucosas. Contudo, um inconveniente é que a maioria dos imunogénios não replicativos são fracamente imunogénicos quando ingeridos ou inalados, e as proteínas solúveis são imunogénios particularmente ineficientes nas mucosas. Sem dúvida que isto se deve aos mecanismos de defesa não específicos das membranas mucosas (por exemplo, macrófagos residentes, lisozima, valores extremos de pH, ácidos biliares, enzimas digestivas, mucos, desprendimento de células epiteliais, mecanismos de limpeza tais como peristalse, batimentos de cílios, micção, etc) rapidamente desnaturarem, degradarem e eliminarem a maior parte das proteínas solúveis, tendo como resultado encontrarem-se no MALT quantidades diminutas daqueles imunogénios.
Administrando grandes doses repetidas de uma determinada proteína, pode esperar-se aumentar a resposta imunitária. Contudo, o resultado desta imunização é muitas vezes a indução de um estado de ausência de resposta imunitária conhecido como tolerância oral, onde o indivíduo responde fracamente à imunização parentérica subsequente com o mesmo antigénio (seria mais rigorosamente designada por tolerância mucosa pois que a inalação de grandes quantidades de proteínas solúveis também induz este estado). Os mecanismos de regulação envolvidos no início da tolerância oral são mal compreendidos mas crê-se que se tenham desenvolvido para evitar que os animais criem respostas imunitárias inapropriadas e possivelmente prejudiciais às proteínas do ambiente e da dieta. Um dos maiores objectivos da vacinologia moderna é obter meios para eliciar respostas imunitárias fortes, mucosas e sistémicas, a proteínas solúveis, enquanto se evita a indução de tolerância mucosa.
Ainda que muitas proteínas solúveis sejam fracos imunogénios por via mucosa, algumas proteínas, particularmente componentes microbianos que podem reconhecer e ligar-se a receptores na superfície de células eucarióticas,
85 543 ΕΡ Ο 721 782/ΡΤ podem eliciar respostas imunitárias sistémicas e locais. A toxina da cólera (TC), por exemplo, é um dos mais potentes imunogénios por via mucosa conhecidos.
Alguns componentes microbianos têm sido referidos como possuindo actividade adjuvante por via mucosa. Assim, a toxina da cólera é conhecida como sendo um adjuvante por via mucosa que melhora as respostas a alguns antigénios co-administrados. No ratinho, somente quantidades diminutas de TC são necessárias para o efeito adjuvante. Infelizmente, uma dose de 2pg de TC, fornecida a voluntários humanos, é diarreica e uma dose de 5 pg induz evacuações que não se distinguem da cólera clássica. A TC activa é por conseguinte nitidamente inaceitável como adjuvante por via mucosa, para o homem. A toxina da tosse convulsa (PTX) foi também referida como tendo propriedades adjuvantes, mas um grande inconveniente, além das suas propriedades tóxicas inerentes, é a sua propriedade de estimular e potenciar a produção de IgE e portanto conduzir à anafilaxia face às proteínas co-administradas - ver, por exemplo, MU et aj Infection and Immunitv. pp. 2834-2840, Julho 1993. A toxina da cólera, a toxina da tosse convulsa e a toxina lábil ao calor (LT) de E. coli, estruturalmente relacionada, são exemplos de toxinas que têm uma estrutura bipartida AB5 que consiste num protómero (a subunidade A) e num pentâmero B (a subunidade B). A subunidade A é geralmente considerada responsável pela toxicidade da toxina, enquanto que se pensa que a subunidade B está geralmente envolvida na ligação à superfície da célula. Por exemplo, na toxina da cólera, a subunidade A (CTA) é a porção enzimática da CT responsável pela modificação covalente das proteínas G hospedeiras e pela consequente toxicidade da CT, enquanto que a subunidade B (CTB) medeia a ligação da CT ao seu receptor (gangliósido GM,) na superfície das células eucarióticas. A CTB não é tóxica e também é um bom imunogénio por via mucosa.
Tem sido relatado que as subunidades B de certas toxinas microbianas bipartidas apresentam propriedades adjuvantes por via mucosa. Por exemplo, o pedido de patente japonesa N° 3-135923 (Zaidan Hojin), publicado em 10 Junho 1991 revela que a subunidade B da toxina da tosse convulsa é um 85 543 ΕΡ Ο 721 782/ΡΤ 4
adjuvante para antigénios da estirpe Yamagata da gripe A quando administrada por via intranasal. A preparação da subunidade B foi feita a partir da toxina completa por tratamento com ureia seguido de cromatografia em coluna usando uma coluna de Sepharose. Revelação idêntica pode ser encontrada no artigo de
Oka et at^ Vaccine, Vol. 1 2(1 4) 1 994, pp. 1 255-1 258. A subunidade B da toxina da cólera (CTB) tem também sido investigada como adjuvante por via mucosa por muitos grupos, com resultados contraditórios. A CTB obtida de fornecimentos comerciais é preparada a partir da toxina completa e por vezes contém vestígios de CT que podem ser responsáveis pelo grau de adjuvância da CTB relatado por alguns autores.
Verificou-se além disso que a CTB recombinante e o pentâmero B da toxina lábil ao calor (LTB) da E. coli, altamente relacionado, ainda que eles próprios imunogénicos, são desprovidos de adjuvância. Assim, Holmgren et al (Vaccine, Vol. II, pp 1 179-1 184, 1993) relataram que, quando se usa CTB recombinante ou altamente purificada, foram consistentemente incapazes de observar acção adjuvante da CTB para outros antigénios com ela misturados. Holmgren et al concluíram ser necessária a molécula completa da CT para ter uma acção adjuvante. Ensaiaram também uma forma mutante da toxina lábil ao calor (LT) de E. coli. onde a subunidade B era idêntica à subunidade B normal e a subunidade A era idêntica com excepção de uma substituição de um só aminoácido na posição 112 (Glu-»Lys). Contudo, a forma mutante que não possui actividade de ribossiiação de ADP e não provocou secreção de fluidos nas ansas ligadas de coelho, falhou na produção de qualquer resposta de IgA significativa contra ela própria e não demonstrou propriedades adjuvantes.
Fizeram-se também tentativas para usar a subunidade B da toxina da cólera (CTB) como adjuvante para vacinas contra a gripe por via mucosa. Contudo, estas tentativas, bem como outras abordagens, como por exemplo a encapsulação de antigénios em microesferas, ou o uso de estirpes vivas atenuadas, foram muito mal sucedidas.
Verificou-se agora que uma forma mutante da toxina da tosse convulsa é um excelente adjuvante para os antigénios da gripe, apresentando, ela própria, também boas propriedades imunogénicas. WO-A-95/34323, um pedido anterior publicado depois da data de prioridade do presente invento, revela as
85 543 ΕΡ Ο 721 782/ΡΤ 5 propriedades adjuvantes de toxinas da tosse convulsa mutantes mas não revela composições que contenham antigénios tanto da gripe A como da gripe B.
Assim, num primeiro aspecto, o invento proporciona uma composição de vacina que compreende uma quantidade imunogénica eficaz de um antigénio da gripe e uma quantidade adjuvante eficaz de uma forma mutante não tóxica da toxina da tosse convulsa, caracterizada por estarem presentes na composição tanto os antigénios virais da gripe A como os da gripe B.
Num aspecto particular, o invento proporciona uma composição de vacina como atrás se indicou, onde a composição de vacina se encontra adaptada a administração intranasal.
Os antigénios da gripe contêm de preferência os antigénios do vírus da gripe, hemaglutinina e neuraminidase. Em particular os antigénios da gripe podem compreender os antigénios purificados, hemaglutinina e neuraminidase, do vírus da gripe.
Prefere-se que os antigénios purificados hemaglutinina e neuraminidase estejam presentes sob a forma de rosetas. As rosetas são de preferência partículas com um raio na gama dos 10 aos 25 nanómetros.
Prefere-se que as rosetas estejam substancialmente isentas de lípidos e, além disso, prefere-se que a preparação dos antigénios purificados, hemaglutinina e neuraminidase, no seu todo esteja substancialmente isenta de lípidos.
Um exemplo de uma preparação de hemaglutinina/neuraminidase adequada para uso nas composições do presente invento é o produto "Fluvirin" fabricado e vendido pela Evans Medicai Limited of Speke, Meyerside, Reino Unido, e veja-se também S. Renfrey e A. Watts, Vaccine, 1994, Volume 12, N°8, pp 747-742. A forma mutante não tóxica da toxina da tosse convulsa é de preferência uma forma em que o aminoácido Glu 129 na subunidade S, tenha sido substituído por um outro aminoácido (p.ex. glicina) e/ou o resíduo de aminoácido arginina 9 na subunidade S, tenha sido substituído (p.ex. por lisina).
85 543
EP 0 721 782/PT 6 A toxina mutante é de preferência uma forma mutante dupla; por exemplo, uma forma mutante dupla em que tanto o resíduo de aminoácido Glu 129 como o aminoácido arginina 9 na subunidade St tenham sido substituídos. São exemplos particulares de toxinas não tóxicas mutantes duplas da tosse convulsa para utilização no presente invento, as reveladas no pedido de patente europeia EP-A-0462534 (Sclavo SpA). Uma toxina não tóxica mutante dupla preferida é a mutante descrita no Exemplo 1 da EP-A-1462534, em que o resíduo arginina 9 tenha sido substituído por lisina, e o resíduo ácido glutâmico 129 tenha sido substituído por glicina. Este mutante daqui em diante é referido como PT 9K/1 29G. O invento também proporciona o uso de uma forma mutante não tóxica da toxina da tosse convulsa como atrás se definiu, para o fabrico de uma composição adjuvante para estimular ou potenciar a resposta imunitária protectora a um antigénio da gripe co-administrado com ela. O antigénio da gripe e a toxina adjuvante mutante da tosse convulsa são de preferência administrados por via mucosa. Assim podem ser administrados por via oral, intranasal, intrabronquial ou por qualquer outra via mucosa, mas prefere-se que o antigénio da gripe e a toxina mutante sejam aplicados por administração intranasal. O antigénio da gripe e a toxina adjuvante mutante podem ser administrados separadamente, por exemplo, com um curto intervalo entre si, ou podem ser administrados juntos, ao mesmo tempo. Quando administrados em conjunto, podem ser formulados como uma mistura de entidades distintas. Em alternativa, podem ser quimicamente ligados entre si ou podem constituir parte de uma proteína de fusão produzida por métodos de DNA recombinante.
As composições da vacina do presente invento são de preferência formuladas como uma solução aquosa para administração, como um aerossol, ou gotas nasais ou na forma de pó seco, por exemplo, para inalação.
As composições para administrar como gotas nasais podem conter um ou mais excipientes do tipo usualmente incluído nestas composições, por exemplo, 85 543 ΕΡ Ο 721 782/ΡΤ 7
conservantes, agentes reguladores da viscosidade, agentes reguladores da tonicidade, agentes tamponantes e semelhantes. O presente invento também contempla proporcionar meios para se administrarem formulações intranasais do antigénio da gripe e da toxina mutante da tosse convulsa. Um dispositivo de aplicação pode, por exemplo, tomar a forma de um dispositivo para inalação ou de um sistema de aplicação de aerossol, e pode ser proporcionado para fornecer apenas uma dose simples ou doses múltiplas. A vacina pode ser administrada ao paciente numa quantidade eficaz para estimular uma resposta imunitária protectora no paciente. Por exemplo, a vacina pode ser administrada ao homem numa só ou em mais doses contendo cada dose 1-250 microgramas e, com maior preferência, 3-50 microgramas de proteína preparada a partir de cada estirpe de vírus. Por exemplo, quando são feitas preparações de hemaglutinina e neuraminidase a partir de três estirpes de vírus, p.ex., 2x gripe A e 1x gripe B, uma dose total de proteína virai administrada pode situar-se na gama de 9-150 microgramas. O invento será agora ilustrado por meio de um exemplo relativamente às concretizações específicas, abaixo descritas, e aos desenhos em anexo.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
As Figuras 1a e 1b ilustram as respostas de IgG anti-hemaglutinina sérica em ratinhos imunizados com antigénio de superfície purificado (PSA) derivado da estirpe Texas da gripe A e com PSA derivado da estirpe Panamá da gripe B, sozinho ou em combinação com a toxina mutante da tosse convulsa PT-9K/129G. Cada barra representa a média geométrica dos títulos de 4 ratinhos. As barras de erro representam 1 erro padrão da média. O valor limite é de 50 que é o limite inferior de detecção.
As Figuras 2a e 2b ilustram as respostas de IgA anti-hemaglutinina nasais em ratinhos imunizados com o antigénio de superfície purificado (PSA) derivado da estirpe Texas da gripe A e da estirpe Panamá da gripe B, sozinho ou em combinação com PT-9K/129G. Como na Figura 1a e 1b, cada barra representa
85 543 ΕΡ Ο 721 782/ΡΤ 8 a média geométrica dos títulos de quatro ratinhos e as barras de erro representam 1 erro padrão da média.
As Figuras 3a e 3b ilustram a determinação, usando a técnica ELISPOT, das células secretoras, nasais e pulmonares, de anti-hemaglutinina (estirpe A Texas) dos ratinhos imunizados com o antigénio de superfície purificado (PSA) derivado da estirpe Texas da gripe A e da estirpe Panamá da gripe B, sozinho ou em combinação com PT-9K/129G.
As Figuras 4a e 4b ilustram a determinação, usando a técnica ELISPOT, das células secretoras, nasais e pulmonares, de anti-hemaglutinina (estirpe B Panamá) dos ratinhos imunizados com PSA derivado da estirpe Texas da gripe A e estirpe Panamá da gripe B, sozinho ou em combinação com PT-9K/129G. EXEMPLO 1
Colocou-se o antigénio de superfície purificado (PSA) da gripe contendo proteína tanto da estirpe Texas da gripe A como da estirpe Panamá da gripe B, disponível comerciaimente na Evans Medicai Limited, Speke, Merseyside, Reino Unido, com a marca registada "Fluvirin", em solução salina tamponada com fosfato, a par da toxina mutante de B. pertussis, PT-9K/129G, obtida da IRIS Biocine, de Siena, Itália, (4,4 mg/dose), para se obter uma concentração total de proteína de antigénio da gripe de aproximadamente 1 mg/ml e uma concentração de proteína da toxina da tosse convulsa de 0,25 mg/ml. O PSA da gripe consiste quase completamente na proteína de pico hemaglutinina (HA), ainda que contenha alguma neuraminidase.
Prepararam-se também soluções de controlo contendo as mesmas concentrações de PSA mas não de PT-9K/129G. Além disto, preparou-se uma composição compreendendo a mesma concentração de PSA adsorvida sobre o adjuvante já conhecido al-hidrogel (hidróxido de alumínio). O PSA foi adsorvido durante a noite, a 4°C, sobre o al-hidrogel.
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Estudos de Imunização de Ratinhos
As composições preparadas como acima se descreveu foram administradas a grupos de doze ratinhos BALB/c, adultos (6-8 semanas) fêmeas, do seguinte modo:
Grupo 1. 20 μΙ (10 μΙ por narina) de solução de PSA (A + B)/PT-9K/129G administrada por via intranasal (dose total de PSA = 20pg). PT-9K/129G = 5 pg
Grupo 2. 20 μΙ de PSA administrado por via intranasal (dose total de PSA = 20 pg).
Grupo 3. 200 pl de PSA (A + B)/al-hidrogel administrado por via subcutânea (dose total de PSA = 20 pg). 0 processo de imunização foi conduzido três vezes com intervalos de aproximadamente um mês, como se mostra no regímen de imunização e amostragem no Quadro 1
Regime de imunização e amostragem QUADRO 1
Imunização Dia Amostra Dia 1 1 1 21 2 28 2 42 3 61 3 77 + 79
Em cada ponto de amostragem, quatro ratinhos de cada grupo foram sangrados até à morte por punção cardíaca, foram removidas as suas cabeças e o seu tracto nasal foi lavado com 1 ml de PBS + albumina de soro bovino a 1%.
Ensaios aos anticorpos
Em todos os ensaios foi usada a vacina da gripe completa (WIV) estirpes A Texas e B Panamá, como antigénio. Ainda que WIV seja somente "50% HA,
85 543 ΕΡ Ο 721 782/ΡΤ 10 pensa-se que os ensaios determinavam principalmente anticorpos anti-HA. Esta suposição foi confirmada substituindo PSA (”100%HA) por WIV e repetindo alguns ensaios. Os resultados foram semelhantes com ambos os antigénios. Os anticorpos IgG sérico e IgA nasal específicos para HA, foram medidos por ensaio imunossorvente com ligação de enzimas (ELISA: “Enzyme Linked [mmunosorbant Assay"). Depois de corrigir quanto ao ruído de fundo, as curvas de diluição de densidade óptica (OD) individuais foram representadas em gráfico e determinaram-se os valores dos títulos. O título foi determinado como a diluição do soro que origina uma leitura de OD de 0,2 ou a diluição da lavagem nasal que origina uma leitura de OD de 0,1.
Da mesma forma que se tomaram as lavagens nasais da terceira amostra, foram isolados os linfócitos das membranas mucosas da cavidade nasal e dos pulmões, e foi analisada por ELISPOT a resposta imunitária local.
Resultados 1. Resposta sérica anti-HA do soro
Antigénio de Superfície Purificado (Figura 1 e Quadros 2 e 3)
Como se esperava, foi eliciada uma boa resposta sérica por imunização subcutânea (S\C) com PSA + al-hidrogel. Todos os animais testados apresentaram seroconversão após a primeira imunização e a média geométrica dos títulos (GMT) foi boa. A resposta aumentou após cada reforço no caso da gripe Texas A e a GMT foi muito alta ("230 000) após a terceira dose. No caso da gripe Panamá B, a GMT, após a terceira dose tinha baixado levemente em relação ao nível obtido após a primeira dose mas não obstante foi ainda alta (ca 150 000). Pelo contrário, a resposta sérica ao PSA sozinho administrado por via intranasal foi fraca: no caso da gripe Panamá B, somente um dos quatro ratinhos apresentava seroconversão após a primeira dose e, ainda que todos os animais testados apresentassem seroconversão após a terceira dose, a GMT foi muito mais baixa do que a dos animais que tinham recebido uma dose de PSA + al-hidrogel. PT-9K/129G (referido .no Quadro, por conveniência, como "crm") aumentou a resposta sérica do PSA administrado por via intranasal; após a terceira vacinação, a resposta de anticorpos anti-A/Texas no ratinho que recebeu PSA + PT-9K/129G foi aproximadamente seis vezes a do ratinho que
85 543 ΕΡ Ο 721 782/ΡΤ recebeu PSA sozinho Ι\Ν, e a resposta anti-B/Panamá foi aproximadamente quinze vezes a do ratinho que recebeu PSA sozinho l\N. QUADRO 2
Resposta de IgG sérica anti-A/Texas: efeito de PT-9K/129G Grupo Após a Dose 1 Após a Dose 2 Após a Dose 3 Seroconversão GMT1 2 3 4 5 Seroconversão GMT5 Seroconversão GMT5 PSA A/B l\N 4/4a 75 4/4 2986 4/4 5518 PSA A/B S\C 4/4 53465 4/4 218716 4/4 232511 PSA A/B crm 3/4 203 4/4 13048 4/4 34526 3 N° positivo/N0 testado 0 Média Geométrica do Título QUADRO 3
Resposta de IgG sérica anti-B/Panamá: efeito de PT-9K/129G Grupo Após a Dose 1 Após a Dose 2 Após a Dose 3 Seroconv GMT5 Seroconv. GMT5 Seroconv. GMT5 PSA A/B 1\N 1/4 66 3/4 1 528 4/4 2 368 PSA A/B S\C 4/4 38 538 4/4 163 372 4/4 149 607 PSA A/B +crm 1/3 67 4/4 4 967 4/4 33 971 a N° positivo/N0 testado b Média Geométrica do Título 1
Resposta de IgA anti-HA em lavagens nasais 2
Antigénio de Superfície Purificado (Figura 2 e Quadros 4 e 5) 3 PSA + al-hidrogel administrados subcutaneamente foram muito fracos na indução de uma resposta de IgA nasal tanto contra a estirpe Texas da gripe A como contra a estirpe Panamá da gripe B, o que concorda com as nossas verificações anteriores e com as de outros. O PSA sozinho, administrado por via intranasal, foi também fracamente imunogénico por via mucosa ainda que fosse melhor do que a imunização subcutânea no que se refere ao número de animais que produzem IgA. A adição de PT-9K/129G aumentou significativamente a 4 resposta de IgA, tanto à estirpe Texas A como à estirpe Panamá B da gripe. 5
Esta resposta foi significativamente reforçada nestes ratinhos pela segunda imunização e foi também ligeiramente reforçada após a terceira imunização. A
imunização final teve pouco efeito; de facto, os níveis médios de IgA específica diminuíram ligeiramente. QUADRO 4
Resposta de IgA nasal anti-A/Texas: efeito de PT-9K/129G Grupo Após a Dose 2 Após a Dose 3 conversão de IgA GMTb conversão de IgA GMTb PSA A/B l\N 4/4a 21 4/4 15 PSA A/B S\C 0/4 <1 0/4 1 PSA A/B + crm 4/4 123 4/4 21 3 N° positivo/N0 testado b Média Geométrica do Título QUADRO 5
Resposta de IgA nasal anti-Panamá/B: efeito de PT-9K/129G Grupo IgA Após a Dose 2 IgA Após a Dose 3 conversão GMT conversão GMT PSA A/B l\N 4/4 16 4/4 7 PSA A/B S\C 0/4 1 0/4 1 PSA A/B +crm 4/4 195 4/4 31 a N° positivo/N0 testado b Média Geométrica do Título
Resposta local de células secretoras de anticorpos (ASC) anti-HA em tecidos nasais e pulmonares
Os linfócitos foram isolados da mucosa nasal e do parênquima pulmonar de grupos de quatro ratinhos, de todos os grupos na altura da terceira amostragem. Os linfócitos de ratinhos individuais foram reunidos e ensaiados, quanto às células secretoras de anticorpos anti-gripe IgA, IgG e IgM, utilizando ELISPOT. Os resultados estão indicados nos Quadros 3 e 4.
Eram detectáveis nos tecidos nasal e pulmonar de todos os grupos células B que segregam anticorpos específicos para HA. Havia um número 13 85 543 ΕΡ Ο 721 782/ΡΤ muito maior destas células nos grupos PSA + PT-9K/129G tanto para a gripe Texas A como para a gripe Panamá B, e isto é mais aparente quando os resultados são representados num gráfico numa escala linear (Figura 3 e 4). Em todos os casos, excepto nos ratinhos imunizados por via subcutânea, as células excretoras de anticorpos (ASC) IgA predominavam na cavidade nasal, enquanto que a IgG predominava nos pulmões.
Ensaio ELISPOT para células secretoras de anticorpos (ASC) específicos nos pulmões de murinos A produção local de anticorpos nos pulmões de murinos foi determinada utilizando a técnica ELISPOT. Foram isolados os linfócitos dos pulmões dos murinos como segue: os pulmões foram lavados rapidamente com PBS para remover vestígios de sangue e foram depois cortados finamente com uma lâmina de bisturi. Juntou-se 1 ml de PBS contendo 10 mM de MgCI2, 0,5 U/ml de colagenase A (Boehringer Manheim, Lewes, RU) e foram adicionados 0,25 m/ml de DNase 1 (Boehringer) por cada par de pulmões e incubou-se a 37 graus C com agitação suave durante 45 minutos. Passou-se então a mistura através de uma malha de calibre 40. Prensaram-se protuberâncias através da malha com o pistão de uma seringa de 5 ml. Colocou-se a suspensão celular num tubo de centrífuga e deixou-se repousar durante vários minutos para que os resíduos grandes assentassem. Removeu-se o sobrenadante e formou-se uma pelete com as células e lavou-se várias vezes. Removeram-se os glóbulos vermelhos e as células não viáveis, por centrifugação, num gradiente Ficol-lsopaque (LSM, Flow Laboratories Ltd., Herts, R.U.). Após lavagem, determinou-se a viabilidade celular por exclusão com Azul de Tripano. Finalmente, suspenderam-se as células em meio RPMI 11640 completo (soro fetal bovino a 10%, 100 Ul/ml de penicilina, lOOpg/ml de estreptomicina, 2 mg de L-glutamina: Flow).
Realizou-se o ensaio ELISPOT como se segue: Em resumo, revestiram-se placas de cultura de tecidos de 24 poços (Costar), durante a noite, com o antigénio da gripe. Após lavagem e bloqueio, adicionaram-se aos poços 0,5 ml de volumes de diluições da suspensão de linfócitos em RPMI 11640 completo e incubaram-se a 37 graus Cl C02 a 10% durante três horas. Após lavagem, adicionaram-se sequencialmente IgG, A ou M de cabra anti-ratinho (1/1000, Sigma) e IgG de coelho anti-cabra - fosfatase alcalina (1/1000, Sigma). 14 85 543 ΕΡ Ο 721 782/ΡΤ
Finalmente, adicionou-se solução substrato (0,5 μΙ de fosfato de 5-bromo-4-cloro-3-indolilo (BCIP) a 1 mg/ml em tampão de 2-amino-2-metil-1,3-propanodiol (AMP) (Sigma) e incubaram-se as placas até serem visíveis manchas azuis por microscopia de baixa potência.
Lisboa, iWV. 2000
Por MEDEVA EUROPE LIMITED - O AGENTE OFICIAL -

Claims (15)

  1. 85 543 ΕΡ Ο 721 782/ΡΤ 1/2
    REIVINDICAÇÕES 1. Composição de vacina compreendendo uma quantidade imunogénica eficaz de um antigénio da gripe e uma quantidade adjuvante eficaz de uma forma mutante não tóxica da toxina da tosse convulsa, em que ambos os antigénios da gripe B e da gripe A estão presentes na composição.
  2. 2. Composição de vacina de acordo com a reivindicação 1, onde o antigénio da gripe compreende antigénios hemaglutinina e neuraminidase.
  3. 3. Composição de vacina de acordo com a reivindicação 2, onde o antigénio da gripe compreende antigénios purificados hemaglutinina e neuraminidase.
  4. 4. Composição de vacina de acordo com a reivindicação 3, onde os antigénios purificados hemaglutinina e neuraminidase estão na forma de rosetas.
  5. 5. Composição de vacina de acordo com a reivindicação 4, onde as rosetas são partículas com um raio na gama de 10 a 25 nanómetros.
  6. 6. Composição de vacina de acordo com a reivindicação 4 ou a reivindicação 5, onde as rosetas estão substancialmente isentas de lípidos.
  7. 7. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, onde a forma mutante, não tóxica, da toxina da tosse convulsa é uma forma em que o aminoácido Glu 1 29 na subunidade S·, foi substituído por outro aminoácido.
  8. 8. Composição de acordo com a reivindicação 7, onde o aminoácido Glu 1 29 foi substituído por glicina.
  9. 9. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, onde a forma mutante, não tóxica, da toxina da tosse convulsa é uma forma em que o resíduo de aminoácido arginina 9 foi substituído por outro aminoácido. 85 543 ΕΡ Ο 721 782/ΡΤ 2/2
  10. 10. Composição de acordo com a reivindicação 9, onde o aminoácido arginina 9 foi substituído por lisina.
  11. 11. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, adaptada a administração mucosa.
  12. 12. Composição de acordo com a reivindicação 11, que é adaptada a administração intranasal.
  13. 13. Produto farmacêutico que compreende um dispositivo aplicador adaptado à aplicação intranasal da composição, em combinação com uma composição de vacina conforme foi definido em qualquer das reivindicações precedentes.
  14. 14. Produto farmacêutico de acordo com a reivindicação 13, onde o dispositivo aplicador é um sistema para aplicação de aerossol.
  15. 15. Utilização de uma forma mutante, não tóxica, da toxina da tosse convulsa conforme definida em qualquer uma das reivindicações precedentes, para o fabrico de uma composição adjuvante para estimular ou aumentar a imunogenicidade por via mucosa de um antigénio da gripe com ela co-administrado, onde a composição contém os antigénios tanto da gripe B como da gripe A.
    Por MEDEVA EUROPE LIMITED - O AGENTE OFICIAL -
    E^aSBíõIõàõ da cubsha ferreira Ag. Of. Pr. Ind. βοθ dos Flores, 74 - 4.° 1ΕΘΘ LISBOA
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