KR100575019B1 - Ｌｔｂ 면역보강제를 갖는 백신 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 하나 이상의 미립자 면역원 및 보조량의 이. 콜라이 특유의 열-불안정성 장독소의 B 서브유니트를 함유하는 백신에 관한 것이다. 보다 특히, 본 발명은, LTB가 A 서브유니트 또는 전체 독소 불순물을 함유하지 않는 백신에 관한 것이다. 상기 목적을 위해서, 바람직하게는 재조합 DNA 기술에 의해 제조된 LTB를 사용한다. 미립자 면역원은 예를 들면, 바이러스, 세균 또는 진균과 관련되거나 이들로부터 유도될 수 있다. 상기 백신은 점막(예를 들면, 비내) 투여시 미립자 면역원에 대한 보호 반응을 유도하는데 특히 적합하다. 상기 투여는 미립자 면역원이 관련된 병원체에 대한 전신계 및 점막 보호 모두를 야기하는 것으로 확인되었다.
LTB 면역보강제, 백신, 열-불안정성 장독소, B 서브유니트, 재조합 DNA, 면역원, 점막성 감염, 인플루엔자, 면역글로불린 반응, 점막 면역 반응, 이. 콜라이
Description
본 발명은 점막 면역보강제로서 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli)(이. 콜라이)의 열-불안정성 장독소의 B 서브유니트(LTB)를 함유하는 백신에 관한 것이다. 본 발명은 특히 사람에서 인플루엔자 감염을 예방하기 위한 상기 유형의 백신에 관한 것이다. 그러나, 본 발명은 인플루엔자 백신에서의 적용에 제한되지는 않는다.
특정 병원체로부터 유도된 항원 제제의 도입을 통해 감염 물질에 대한 면역 반응을 증진시켜 백신화된 환자의 감염을 예방하거나 최소한 억제하는 것이 감염성 질환에 대한 백신화의 목적이다. 이상적으로는, 유도된 면역 반응은 두 개의 구성분, 체액성 반응(항원-특이성 항체의 생성) 및 세포성 반응(병원체에 감염된 세포를 제거할 수 있는 특이적 세포 독성 T 임파구의 생성)으로 이루어져야 한다.
수 많은 백신화 방법이 불활성화되거나 약독화된 전체 병원체를 함유하는 제형의 투여와 관련된다. 그러나, 특정 병원체에 있어서, 전체 병원체를 사용하는 백신화에 상당한 단점이 있으며, 이는 비록 상기 제제가 일반적으로 높은 면역원성을 갖지만, 바람직하지 않은 부작용을 가질 수 있기 때문이다. 이는 규명된 서브유니트 백신 또는 합성 백신을 사용하여 전체 감염 물질의 부작용을 실질적으로 제거하는 최근의 경향을 설명해 준다. 그러나, 전체 병원체과 비교하여, 서브유니트 백신 또는 합성 백신은, 적어도 부가되는 면역보강제의 부재하에서는 종종 면역원성이 그다지 좋지는 않다.
보강제는 상기 항원에 대한 면역 반응을 증진시키기 위해서 항원과 공동으로 투여되는 물질 또는 성분이다. 바람직하지 않은 부작용을 야기하지 않고 서브유니트 항원 또는 합성 항원에 대한 면역 반응을 촉진시키는 적합한 면역보강제가 요망되고 있다.
인플루엔자 백신 제형은 불활성화되거나 약독화된 전체 바이러스를 오랫동안 함유해 왔으며, 일부의 경우에 여전히 함유하고 있다. 상기 제형은 상당한 부작용, 가장 현저하게는 주사 부위에서 발열 및 반응을 야기할 수 있다. 오늘날, 백신화는 일반적으로 서브유니트 제형을 사용하여 수행된다. 상기 서브유니트 백신은 보다 적은 부반응을 야기하며, 바이러스의 두 개의 주요 표면항원, 즉 헤마글루티닌(HA) 및 뉴라미니다제(NA) 만을 다소 정제된 형태로 함유한다. 대부분의 현재의 백신 제형에서는, 어떠한 부가되는 면역보강제도 존재하지 않는다.
서브유니트 백신 뿐만 아니라 불활성화되거나 약독화된 전체 인플루엔자 바이러스 백신도 일반적으로 1회의 근육내(i.m.) 주사를 통해 투여된다. 상기 둘 중 하나의 백신화 방법에 의해 달성되는 인플루엔자 감염에 대한 예방은 비교적 낮으며, 노인의 경우에 특히 낮다. 인플루엔자에 대한 백신화의 상대적으로 낮은 효능은 부분적으로는 바이러스의 높은 항원 변이성에 기인한다. 그러나, 백신화에 의한 인플루엔자 감염에 대한 예방이 항원에 대한 면역 반응의 자극 및/또는 변형에 의해 개선될 수 있다는 믿을만한 이유가 있다.
인플루엔자의 경우 또는 일반적으로 기도를 통해 감염이 일어나는 경우, 백 신 효능의 개선을 위한 전략은 순환계에서 적합한 T-세포 의존성 IgG 반응뿐만 아니라 침입하는 감염성 바이러스에 대한 방어의 최전선으로서 폐 및 비강에서 국부적인 면역 반응(분비성 IgA)을 생성시키는 것을 목표로 해야 한다. 추가로, 세포성 면역 반응(세포 독성 T 세포)은 특히 감염을 억제하는데 중요할 수 있다. 근육내 주사(현재의 투여 경로)를 통한 인플루엔자 백신의 투여는 기도에서 국부적인 IgA 반응을 초래하지 못한다는 것이 입증되었다.
본 발명은 비내 백신 제형내 LTB의 존재가, 면역보강제-비함유 면역원 백신을 사용한 근육내 면역화와 비교하여, 순환계에서 IgG 반응을 자극시킬 뿐만 아니라 기도에서 국부적인 IgA 반응을 생성시킨다는 놀라운 발견에 관한 것이다.
온전한 열-불안정성 장독소(LT) 및 이와 밀접한 콜레라 독소(CT)는 하나의 A 서브유니트, 및 5개의 동일한 B 서브유니트로 이루어진 오량체성 환 구조로 구성된다. A 서브유니트는 효소적 ADP-리보실화 활성을 가지며 독소의 독성에 기여한다. 장 상피에서, A 서브유니트는 제2차 메신저인 cAMP의 지속적인 합성을 유도하여 장 내강내로 과도한 전해질 및 부수적인 유액 분비를 초래한다.
LT 및 CT는 강력한 점막성 면역원이다. 국부적인 점막 투여시, 이들 분자들은 독소에 대해 지시된 전신계 항체 반응을 유도할 뿐만 아니라 국부적으로 분비되는 항체, 특히 분비성 IgA(S-IgA)의 생성을 야기한다. LT 및 CT는 또한 강력한 점막성 면역보강제이다. 즉, 관계가 없는 기타 면역원과 동시 투여하는 경우, LT 또는 CT는 상기 면역원에 대한 전신계 및 점막성 항체 반응을 자극할 수 있다. 그러나, LT 및 CT의 독성으로 인해 지금까지 사람 백신 제형에서 LT 및 CT의 사용은 근본적으로 배제되어 왔다.
LT 또는 CT의 면역 자극 활성으로부터 독성을 분리시키고자 하는 시도에서, 상기 독소의 무독화된 변이체, 또는 변형되지 않은 분리된 오량체성 B 서브유니트(각각, LTB 또는 CTB)를 이들의 면역보강제 활성에 대해 시험해 왔다. 명백히, 상기 독소의 독성 ADP-리보실화 활성은 A 서브유니트에 존재하기 때문에, 사람 백신 중 소량의 비변형된 A 서브유니트, 또는 LT 또는 CT 전체 독소의 존재는 매우 바람직하지 않을 수 있다.
인플루엔자 항원에 대한 면역보강제로서 LTB의 사용은 다무라와 그의 공동 연구자들의 문헌[Hirabashi et al., Vaccine 8: 243-248(1990); Kikuta et al., Vaccine 8: 595-599(1990); Tamura et al., J. Immunology 3: 981-988(1992); Tamura et al., Vaccine 12: 419-426(1994); Tamura et al., Vaccine 12: 1083-1089(1994)]에서 연구되어져 왔다. 문헌[Davenport et al., J. Lab. & Clin. Med. 63(1): 5-13(1964)]에 따라서 트윈/에테르로 처리하여 인플루엔자 바이러스로부터 추출하고 정제한, 가용성 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌(HA) 백신을 사용함에 기초하는 상기 연구에서, A 서브유니트가 함유되지 않은 LTB는 가용성 HA 항원과 공동으로 마우스에 비내로 투여되는 경우 점막성 면역보강제 활성이 결핍됨을 확인하였다. 미량의 전체 독소의 존재, 예를 들면 전체 독소로부터 분리된 B 서브유니트 제제에 잔류하는 잔존 전체 독소의 존재는 가용성 HA 항원에 대한 LTB의 면역보강제 활성의 발현을 회복시킨다는 것이 추가로 입증되었다. 보다 특히, 재조합 공급원으로부터의 LTB(이로인해 최극미량의 A 서브유니트도 완전히 함유하지 않는)가 사용되는 경우, LTB가 가용성 HA 항원과 비내 동시 투여시 점막성 활성을 발휘하기 위해서는 미량의 전체 독소가 부가되어야만 한다.
놀랍게도, 재조합 기원이며 A 서브유니트가 전혀 함유되지 않은 분리된 LTB는 비내로 동시 투여되는 면역원의 특성 또는 제공 형태에 따라서 강력한 면역보강제 활성을 가진다는 것을 확인하였다. 예를 들면, 난알부민과 사람 면역결핍 바이러스의 외피 당단백질의 가용성 외부 도메인(gp120) 같은 자유로이 혼합되는 작은 가용성 항원에 대한 면역보강제 활성은 낮고 종종 검출할 수 없다. 반면, LTB는 자유로이 혼합되는 커다란 응집된 또는 미립자 면역원에 대해 매우 강력한 면역보강제 활성을 나타낸다. 상기 면역원은 인플루엔자 바이러스 서브유니트 항원 및 키홀 삿갓조개류 헤모시아닌(keyhole limpet hemocyanin, KLH)을 포함한다.
따라서, 본 발명은 하나 이상의 미립자과, 면역보강량의 LTB를 함유하며, 여기에서, LTB가 A 서브유니트 또는 독성 LT 전체 독소가 완전히 함유되어 있지 않음을 특징으로 하는 백신에 관한 것이다.
본원에서 정의되는 바와 같이, "미립자"는 각각의 미생물 특유의 바이러스성, 세균성 또는 진균성 항원의 임의의 결합을 의미한다. 보다 특히, 용어 "미립자 면역원"은 응집체, 클러스터, 미셀, 바이로솜(virosome), 로우젯(rosette), 바이러스형 면역원 입자 등을 포함한다.
본 발명에 따른 백신에서, 특히, 재조합 DNA 기술로부터 제조된 LTB가 유용할 수 있다. 면역원 또는 면역원들은 바이러스 또는 세균 같은 감염 물질로부터 유도될 수 있다.
상기 기술에 적용되는 백신은 점막성(예를 들면, 비내로) 투여시 면역원에 대한 전신계 면역글로불린(예를 들면, IgG)을 유도할 뿐만 아니라 IgA의 국부적인 분비를 유도하는 것으로 확인되었다.
상기 후자의 특성은 바이러스(예를 들면, 인플루엔자 바이러스, 포진 바이러스, 파필로마 바이러스), 세균(클라미디아 또는 뉴모코크스) 또는 진균에 의한 점막성 감염에 의해 전염되는 질환에 대한 면역화에 특히 바람직하다.
점막성 투여의 특별한 장점은 백신 적용의 용이함이며, 이는 추가로 근육내 면역화되는 예방접종자의 잠재적인 주사공포증을 우회하게 된다.
비록, 예를 들면 인플루엔자 감염의 경우에서, 고혈청 IgG 역가는 바이러스의 전신계 확산을 예방하고 감염으로부터 폐를 보호하는데 중요하기는 하지만, 국부적인 S-IgA 항체가 상부 기도를 보호하기 위한 방어 최전선으로서 중요하다.
점막 면역보강제의 부재하에서 불활성화된 인플루엔자 바이러스의 비내 투여에 의한 점막성 백신화는 성공적이지 못한 것으로 보고되었으며[Clancy: Drugs 50: 587-594(1995); Katz et al., J. Infect. Dis. 175: 352-369(1997)], 아마도 이는 점막성 조직에 대한 항원의 직접적인 투여가 S-IgA 반응을 야기하지 않기 때문일 것이다. 점막 면역보강제의 동시 투여는 면역원에 대한 국부적인 면역 반응을 유도하기 위한 필수 전제조건인 것으로 보인다. 주목할 만하게도, 본 발명에 따른 비내 면역화에 의해 소위 일반적인 점막 면역 시스템이 활성화되어 (비내) 적용 부위에서 뿐만 아니라 먼거리의 점막 조직(예를 들면, 질내 점막 조직)에서도 S-IgA의 분비를 야기한다는 것을 확인하였다.
본 발명에 따른 백신은 예를 들면 미립자 형태로 바이러스 또는 세균 기원의 면역원[예를 들면, 세균성 항원, 바이러스성 서브유니트(임의로 불활성화된), 분리된 바이러스(임의로 불활성화된), 불활성화된 바이러스 또는 세균, 또는 약독화된(예를 들면, 차게한) 생 바이러스]를 함유할 수 있다.
본 발명에 따라 사용된 LTB는 독성 LTA 또는 독성 전체 독소를 완전히 함유하지 않는다. 바람직하게는, LTB는 재조합 DNA 기술에 의해 제조된다. 본원에서 독성 LTA의 비함유는 LTA를 전혀 함유하지 않음을 의미한다.
본 발명에 따른 백신에서, LTB는 미립자 항원과 자유롭게 혼합하여 사용할 수 있으며 - 항원과 면역보강제 사이에 공유 결합이 확립될 수 있지만, 적합한 면역보강제 효과를 달성하는데 필요한 것은 아니다.
LTB 및 하나 이상의 면역원과는 개별적으로, 본 발명에 따른 백신은 수성 용매, 특히 완충액, 보다 특히 PBS(포스페이트-완충된 염수) 및 안정화제(예를 들면, PEG 또는 메틸 셀룰로스), 및/또는 글루코스를 함유할 수 있다.
본 발명에 따른 백신의 구성분은 동결 건조되거나 액체 형태로 존재할 수 있다.
본 발명에 따른 백신은 예를 들면, 포장되지 않은 상태로, 또는 앰풀제, 주사제 또는 분무제로 존재할 수 있다.
본 발명에 따른 백신은 피하, 근육내, 기관지내, 비내 또는 질내 적용에 의해 또는 경구적으로 투여될 수 있다.
실시예 1
재조합 LTB 및 인플루엔자 서브유니트 항원의 제조
재조합 LTB
본 발명에서 언급된 바와 같이, 재조합 LTB 유전자 및 재조합 LTB 분자는 예를 들면, 돼지 또는 사람 공급원의 LT-l 분자를 암호화하는 유전자로부터 유도될 수 있다. 돼지 LT(pLT) 유전자를 PCR 기술[Dehaan et al.: Vaccine 14: 260-266(1996)]을 사용하여 pUC18 벡터[Vieira and Messing: Gene 19: 259-268(1982)]에 서브클로닝시킨다. 최초로 문헌[Dallas et al., J. Bacteriol. 139: 850-858(1979)]에 기술된 EWD299 벡터를 PCR 반응에서 주형으로서 사용한다. 상기 작제물의 제1 pLT 서열은 DNA 서열 분석으로 증명되는 바와 같이, EMBL 서열 데이터뱅크에 제출된 바와 같은 제1 pLT 서열과 정확하게 일치하는 것으로 확인되었다. pUC18-pLT 작제물로부터, pLTB 유전자를 pROFIT 발현 벡터내로 서브클로닝시키며, pROFIT 발현 벡터는 온도 유도성 λPR 프로모터를 함유한다[van der Linden et al.: Eur. J. Biochem. 204: 197-202(1992)].
이. 콜라이 MC1061을 pROFIT 플라스미드 작제물을 위한 숙주 균주로 사용한다. 세균을 카나마이신 50㎍/㎖를 함유하는 루리아-베르타니(LB) 배지에서 성장시킨다. pLTB 발현의 유도는 문헌[De Haan et al.(상기)]에 기술된 바와 같이 pROFIT-LTB 벡터를 갖는 로그-상 MC1061 배양물의 배양 온도를 28℃에서 42℃로 승온시킴으로써 달성된다.
사람 LTB(즉, 사람에서 장독성인 이. 콜라이 세균으로부터 분리된 LT 유전자 로부터 유도된 LTB 유전자)를 암호화하는 pKK-유도된 발현 벡터(제조원: Pharmacia Ltd.)인 pTLTB를 다무라 및 그의 동료들로부터 획득한다. DNA 서열 분석으로 pLTB와 비교하여 성숙 사람 LTB(hLTB)에서 3개의 아미노산 치환(Thr4가 Ser로, Glu46이 Ala로, 및 Lys102가 Glu로)을 확인하였다. 이. 콜라이 균주 JM101을 pTLTB를 위한 숙주로 사용한다. 세균을 암피실린 100㎍/㎖를 함유하는 LB 배지에서 성장시킨다. hLTB 발현의 유도는 pTLTB를 갖는 JM101의 로그-상 배양물에 최종 농도가 5mM이 되도록 IPTG를 부가함으로써 달성된다.
pLTB 및 hLTB를 정제하기 위해서, 과발현하는 세균을 수거한 후 초음파로 용해시킨다. 후속적으로, 세포 분쇄물을 초원심분리시켜 제거한다. 이후, 재조합 pLTB 또는 hLTB를 함유하는 조 세포 추출물을 고정화된 D-갈락토스(제조원: Pierce) 컬럼에 적용시킨다. 충분히 세척한 후, 재조합 정제된 pLTB 또는 hLTB가 문헌[Uebsaka et al., Microb. Path. 16: 71-76(1994)]에서 이전에 기술된 바와 같이 D-갈락토스와 함께 용출되어 수득된다. 재조합 pLTB 및 hLTB 모두가 문헌[De Haan et al.: Vaccine 14: 260-266(1996)]에서 이전에 기술된 바와 같이 GM1 포획 ELISA에서 최적의 GM1-결합 특성을 보유하는 것으로 확인된다. 정제된 단백질을 함유하는 컬럼 분획을 모으고, PBS에 대해서 투석한 후 4℃에서 저장한다.
인플루엔자 서브유니트 항원
인플루엔자 서브유니트 항원을 문헌[Bachmayer et al.: 영국 특허 제1 498 261호(January 18, 1978)]과 문헌[Chaloupka et al., J. Microbiol. Infect. Dis. 15: 121-127(1996)]에 기술된 방법에 따라서, 배발생된 계란에서 성장시킨 B/Harbin/7/94 바이러스(B/Harbin) 또는 A/Johannesburg/33/94(A/Johannesburg)로부터 제조한다. 상기 방법은 포름알데하이드-불활성화된 바이러스를 적합한 양이온성 세제로 처리하는 단계, 바이러스 잔여 코어로부터 방출된 항원(헤마글루티닌 및 뉴라미니다제)을 분리하는 단계를 포함한다. 상기 방법은 세제를 제거한 후 미립자, 즉 항원의 미셀형 노출 상태를 야기한다.
㎍/㎖로서 표현되는 서브유니트 항원 제제의 효능을 문헌[Wood et al., J. Biol. Stand. 5: 237-241(1977)]에 따른 단독-방사 확산 시험에서 결정한다.
실시예 2
인플루엔자 서브유니트 백신에 대한 전신계 항체 반응
4마리 마우스의 그룹을 실시예 1에서 기술된 방법에 따라 제조된 B/Harbin 또는 A/Johannesburg 바이러스 중 하나로부터 유도된 인플루엔자 서브유니트 항원 5㎍을 사용하여 마취없이 비내 면역화시킨다. 상기 항원을 모든 경우에 0일, 7일 및 14일째 20㎕의 용적으로 단독(HA) 또는 pLTB 2.0㎍과 함께 제공한다. 대조군 마우스에게는 동일 용적의 PBS를 제공한다. 마우스를 28일째 희생시킨다. 혈청 IgG 항체 반응을 직접적인 ELISA로 결정한다.
도 1은 HA B/Harbin(검은 막대) 및 HA A/Johannesburg(흰 막대)에 대한 관찰된 혈청 IgG 항체 반응을 나타낸다.
보강제 없이 서브유니트 항원의 비내 투여는 빈약한 전신계 항체 반응을 나 타내는 반면, 서브유니트 항원에 pLTB의 보충은 두배 이상의 정도로 혈청 항체 반응을 강화시킨다. B/Harbin 및 A/Johannesburg로 면역화시킨 마우스의 반응에서 차이점은 유의적이지 않다.
상기 결과는 비-독성 pLTB가 비내 투여된 인플루엔자 서브유니트 항원에 대한 높은 전신계 항체 반응을 유도할 수 있는 강력한 면역보강제임을 나타낸다.
실시예 3
사람 및 돼지 LTB를 사용한 전신계 항체 반응의 비교
4마리 마우스의 그룹을 실시예 1에서 기술된 방법에 따라 제조된 B/Harbin 인플루엔자 바이러스로부터 유도된 인플루엔자 서브유니트 항원 5㎍을 사용하여 마취없이 비내 면역화시킨다.
상기 항원을 모든 경우에 0일, 7일 및 14일째 20㎕의 용적으로 단독(무처리) 또는 pLTB 2.0㎍ 또는 hLTB 2.0㎍과 함께 제공한다. 대조군 마우스에게는 PBS를 제공한다. 마우스를 21일째 희생시킨다. 혈청 IgG 항체 반응을 21일째에 직접적인 ELISA로 결정한다.
도 2는 HA B/Harbin에 대한 관찰된 혈청 IgG 항체 반응을 나타낸다.
보강제 없이 서브유니트 항원의 비내 투여는 빈약한 전신계 항체 반응을 나타내는 반면, 서브유니트 항원에 pLTB 및 hLTB의 보충은 두배 이상의 동일한 정도로 혈청 항체 반응을 강화시킨다. pLTB 및 hLTB로 처리된 동물에서 관찰된 차이점은 유의적이지 않다.
실시예 4
인플루엔자 서브유니트 백신에 대한 국부적인 점막성 항체 반응의 유도
인플루엔자 HA-특이적인 S-IgA 반응을 야기하는 pLTB의 능력을 조사하기 위해서, 실시예 2로부터의 마우스의 비내 세척물을 인플루엔자-특이적인 IgA 항체의 존재에 대해 분석한다. 비내 세척물은 비인강에서 기관 상부까지를 통해 PBS 0.5㎖를 역으로 플러쉬하고, 반대로 플러쉬한 후 콧구멍에서 세척액을 수거함으로써 수득한다.
결과를 도 3에 나타낸다.
상기 데이터는 재조합 pLTB가 HA에 대한 강력한 국부적인 S-IgA 반응을 유도함을 나타낸다. 두 개의 상이한 인플루엔자 서브유니트 항원이 유사한 결과를 나타낸다.
실시예 5
사람 및 돼지 LTB를 사용한 점막성 항체 반응의 비교
비내 HA-특이적인 항체 반응을 강화하는 pLTB 및 hLTB의 능력을 비교하기 위해서, 실시예 3으로부터의 마우스의 비내 세척물을 상기와 같이 수거하고 21일째 HA-특이적인 S-IgA의 존재에 대해서 분석한다. 도 4는 pLTB 및 hLTB 모두가 활력있는 비내 HA-특이적인 항체 반응을 유도함을 나타낸다. 추가로, pLTB 및 hLTB를 사용하여 수득된 반응은 그 규모에서 유사하며, 이는 두 분자 모두가 비교할만한 면역보강제 특성을 가짐을 입증해 준다.
실시예 6
비내 적용된 인플루엔자 서브유니트 백신에 대한 생식기 점막 항체 반응의 유도
투여 부위 이외의 점막성 부위에서 인플루엔자 HA-특이적인 S-IgA 반응을 야기하는 재조합 pLTB의 능력을 조사하기 위해서, 실시예 2로부터의 마우스에서 비내 면역화 후 생식관에서 인플루엔자-특이적인 S-IgA 항체의 유도를 조사한다. 피펫 팁을 사용하여 질내로 PBS 100㎕를 도입하고 제거하기를 10회 반복하여 비뇨생식관의 세척액을 수집한다. 점막성 세척액을 ELISA로 이의 IgA 함량을 결정할 때까지 4℃에서 저장한다. 결과를 도 5에 나타낸다.
상기 결과는 이러한 먼거리의 점막성 부위에서 S-IgA 반응을 유도하는데 있어서 pLTB가 효과적임을 입증하는 것으로 나타난다. B/Harbin 및 A/Johannesburg 항원 모두가 동일하게 잘 반응한다.
실시예 7
IgG 반응의 역학
8마리 암컷 BALB/c 마우스(6 내지 8주령)의 4개 그룹 각각을 하기와 같이 처리한다.
대조군: 0일, 7일 및 14일째에 마취하지 않고 항원없이 PBS 20㎕를 비내로 처리한 그룹.
pLTB: 0일, 7일 및 14일째에 마취없이 20㎕ 중 HA 5㎍ 및 재조합 pLTB 2.0㎍을 비내 적용시킨 그룹.
HA s.c.: 0일째 마취없이 100㎕ 중 HA 5㎍을 피하로 적용시킨 그룹.
Conv.: 회복기 마우스, 즉 0일째 마취없이 20㎕ 중 PR8 바이러스의 108개 감염 단위로 비내 감염시킨 마우스 그룹.
각각의 그룹의 4마리 마우스로부터의 혈액 샘플을 6일, 13일 및 20일째 꼬리 정맥으로부터 채취한다. 추가로, 28일째 모든 마우스를 희생시켜 채혈한다. 각각의 샘플에서, 혈청 IgG를 ELISA로 측정한다.
결과를 도 6에 나타낸다. 각각의 백신화 섭생에 대해 막대(좌측에서 우측으로)는 각각 6일, 13일, 20일 및 28일째의 IgG 역가를 나타낸다. 이러한 결과는 HA/pLTB를 사용한 비내 백신화 후, IgG가 HA을 단독으로 사용한 피하 백신화 후 또는 회복기 마우스에서와 같은 동일한 정도 이상으로 유도된다는 것을 나타낸다.
실시예 8
코 점막 및 폐 점막 항체
실시예 7에서 시험한 동일한 마우스를 상기된 바와 같이 28일째에 희생시킨 후 비강 및 비뇨생식관의 점막성 세척액을 수집한다.
결과를 도 8에서 요약한다. 평행선을 그은 막대는 비내 세척액으로부터의 데이터를 나타내며 흰 막대는 질내 세척액으로부터의 데이터를 나타낸다.
상기 결과는 HA/pLTB를 사용한 비내 백신화에서 방어 최전선 항체(S-IgA)의 역가는 회복기 마우스의 S-IgA 역가와 동일한 수준 이상인 반면, HA를 사용하는 ( 전통적인) 피하 백신화는 검출할 만한 점막성 IgA 역가를 야기하지 못한다는 것을 나타낸다.
실시예 9
항원 투여에 대한 백신화된 마우스의 보호
실시예 7의 각각의 그룹의 4마리 마우스를 28일째에 마취없이 20㎕ 중 PR8 바이러스의 5 x 106개 감염 단위로 비내 감염시킨다. 항원 투여 3일 후, 바이러스 양을 코와 폐에서 측정한다.
코 및 폐 균질화물에서 바이러스 역가 측정은 미세역가 플레이트에서 EPISERF(제조원: Life Technologies, PAISLY, Scotland)상에서 배양한 MDCK 세포상에서 2-단계 희석에 의해, 및 기니아 피그 적혈구에 의한 혈구응집을 사용한 후속적인 종료점 측정에 의해 수행한다.
결과를 도 7에 요약한다. 평행선을 그은 막대는 코에서의 바이러스 역가를 나타내며 흰 막대는 폐에서의 바이러스 역가를 나타낸다. 회복기 마우스 및 pLTB를 사용하여 백신화시킨 마우스의 폐에서의 바이러스 역가는 유의적이지 않다. 따라서, 상기 데이터는 점막성 면역보강제로서 pLTB를 사용함으로써, 인플루엔자 감염에 대해 완전히 보호됨을 나타낸다.
Claims (12)
- A 서브유니트 또는 독성 LT 전체 독소가 완전히 배제된 면역보강량의 이. 콜라이(E. coli) 특유의 열-불안정성 장독소의 B 서브유니트(LTB)와 함께 하나 이상의 미립자 면역원을 함유하며, 여기서 상기 B 서브유니트가 상기 하나 이상의 미립자 면역원과 공유결합되어 있지 않음을 특징으로 하는, 점막 투여용 백신.
- 제1항에 있어서, LTB가 재조합 DNA 방법으로 제조되는 백신.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 바이러스성, 세균성 또는 진균성 항원이 면역원으로서 사용되는 백신.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 면역원이 점막성 감염에 의해 전염되는 질환에 대한 면역화를 제공하는 백신.
- 제4항에 있어서, 인플루엔자 항원이 면역원으로서 사용되는 백신.
- 삭제
- 삭제
- A 서브유니트 또는 독성 LT 전체 독소가 완전히 배제된 면역보강량의 이. 콜라이 특유의 열-불안정성 장독소의 B 서브유니트(LTB)와 함께 미립자 면역원을 함유하며, 여기서, 상기 B 서브유니트가 상기 미립자 면역원과 공유결합되어 있지 않음을 특징으로 하는, 점막 투여시 환자의 면역원에 대한 전신계 면역글로불린 반응을 유도하는데 적합한 백신.
- A 서브유니트 또는 독성 LT 전체 독소가 완전히 배제된 면역보강량의 이. 콜라이 특유의 열-불안정성 장독소의 B 서브유니트(LTB)와 함께 미립자 면역원을 함유하며, 여기서, 상기 B 서브유니트가 상기 미립자 면역원과 공유결합되어 있지 않음을 특징으로 하는, 국부 점막 투여시 환자의 면역원에 대한 일반적인 점막 면역 반응을 유도하는데 적합한 백신.
- A 서브유니트 또는 독성 LT 전체 독소가 완전히 배제된 면역보강량의 이. 콜라이 특유의 열-불안정성 장독소의 B 서브유니트(LTB)와 함께 미립자 면역원을 함유하며, 여기서 상기 B 서브유니트가 상기 미립자 면역원과 공유결합되어 있지 않음을 특징으로 하는, 백신.
- 제3항에 있어서, 면역원이 점막성 감염에 의해 전염되는 질환에 대한 면역화를 제공하는 백신.
- 제11항에 있어서, 인플루엔자 항원이 면역원으로서 사용되는 백신.
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