JP4235359B2 - Ｌｔｂアジュバントを含むワクチン - Google Patents
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Description
【０００１】
【技術分野】
本発明は、粘膜免疫アジュバント（ｍｕｃｏｓａｌ ｉｍｍｕｎｏａｄｊｕｖａｎｔ）としての大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）（Ｅ．ｃｏｌｉ）の易熱性（ｈｅａｔ−ｌａｂｉｌｅ）エンテロトキシンのＢサブユニット（ＬＴＢ）を含むワクチンに関する。本発明は特に、ヒトにおけるインフルエンザ感染を予防するためのこの種のワクチンに関する。しかしながら本発明はインフルエンザワクチンにおける適用には制約されない。
【０００２】
特定の病原体に由来する抗原製剤の導入を通して感染性作用物質に対する免疫応答を刺激することにより予防接種した被検体の感染を予防もしくは少なくとも抑制することが、感染症に対する予防接種の目的である。理想的には、誘導された免疫応答は２つの構成成分、すなわち液性応答（抗原特異的抗体の産生）および細胞性応答（その病原体による感染を受けた細胞を除去することができる特異的細胞障害性Ｔリンパ球の産生）からなるはずである。
【０００３】
多くの予防接種法は、不活化もしくは弱毒化させた全病原体を含む製剤の投与を必要とする。しかしながらある一定の病原体については全病原体を用いる予防接種にはかなりの欠点があり、なぜならそういった調製物は例え通常は高い免疫原性を示すとしても、望ましくない、副作用を有することがあるためである。このことにより、全感染性作用物質の不利な副作用を実質的には欠く非常に厳密に限定されたサブユニットワクチンもしくは合成ワクチンの使用が最近の傾向になっていることが説明される。しかしながら全病原体と比較すると、サブユニットワクチンもしくは合成ワクチンは、少なくとも添加アジュバントがない状態ではあまり免疫原性がでないことがよくある。
【０００４】
アジュバントは、抗原と組み合わせて投与され、そうすることでその抗原に対する免疫応答を刺激化するための物質もしくは材料である。望ましくない副作用を生じることなくサブユニット抗原もしくは合成抗原に対する免疫応答を強化する適切なアジュバントについての必要性が存在する。
【０００５】
インフルエンザワクチン製剤は不活化もしくは弱毒化された全ウイルスを長いこと含んできたし、幾つかの事例では未だに含んでもいる。こういった製剤はかなりの副作用をもつことがあり、最も悪名の高いものは発熱および注入部位での応答である。今日では、通常、予防接種はサブユニット製剤を用いて行われる。このサブユニットワクチンでは生じる副作用応答が少なく、そしてウイルスの２つの主要表面抗原、すなわち赤血球凝集素（ＨＡ）およびノイラミニダーゼ（ＮＡ）のみを、幾分かは精製された形態で含む。最も最近のワクチン製剤では添加アジュバンドは一切存在しない。
【０００６】
不活化もしくは弱毒化された全インフルエンザウイルスワクチンならびにサブユニットワクチンは通常は一回の筋肉内（ｉ．ｍ．）注射を通して投与される。いずれの予防接種法により達成されるインフルエンザ感染に対する予防も、特に高齢者では、比較的低い。インフルエンザに対する予防接種の効力が比較的低いのは、そのウイルスの抗原変異性が高いことに一部起因している。しかしながら予防接種によるインフルエンザ感染に対する予防は、抗原に対する免疫応答の刺激化および／または改変により改善し得ると信じるに足る理由がある。
【０００７】
インフルエンザの場合、もしくは一般的にいうと気道を介して罹る感染症の場合には、予防接種効率を改善するための方法は、血流中の十分なＴ細胞依存性ＩｇＧ応答のみではなく、浸潤してくる感染性ウイルスに対する防御の第一線としての肺および鼻腔内での局所免疫応答（分泌性ＩｇＡ）の産生をも目的とすべきである。それに加え、細胞性免疫応答（細胞障害性Ｔ細胞）も、特に感染を制限する際には重要であるかも知れない。筋肉内注射（現行の投与経路）を介してのインフルエンザワクチンの投与は気道における局所ＩｇＡ応答はもたらさないことが示されている。
【０００８】
本発明は、鼻腔内ワクチン製剤内のＬＴＢの存在は、アジュバント無しでの免疫原ワクチンでの筋肉内投与による免疫感作と比較すると血流中のＩｇＧ応答を刺激することのみならず、気道内での局所ＩｇＡ応答も引き起こすという驚くべき発見に関する。
【０００９】
未処理の易熱性エンテロトキシン（ＬＴ）およびそれに密接に関連するコレラトキシン（ＣＴ）は一つのＡサブユニット、ならびに５つの同一なＢサブユニットからなる一つの５量体環構造からなる。Ａサブユニットは酵素活性、すなわちＡＤＰ−リボシル化活性を有し、そしてその毒性活性はトキシンに帰属する。腸上皮ではＡサブユニットが第二メッセンジャーｃＡＭＰの持続合成を誘導し、余剰電解質およびそれに付随する腸内腔への液体分泌をもたらす。
【００１０】
ＬＴおよびＣＴは強力な粘膜免疫原である。局所粘膜投与の際にはこれらの分子は毒素に対する直接的な全身性抗体応答の誘導ばかりでばく、局所的に分泌される抗体の産生をももたらし、その抗体は分泌性ＩｇＡ（Ｓ−ＩｇＡ）として著名である。ＬＴおよびＣＴは強力な粘膜免疫アジュバントでもある。すなわち、無関係な他の免疫原と同時投与する際には、ＬＴもしくはＣＴはその免疫原に対する全身性および粘膜性抗体応答を刺激化しうる。しかしながらＬＴおよびＣＴの毒性のため、今日までのところ、ヒトワクチン製剤におけるＬＴもしくはＣＴの使用は本質的には妨げられてきた。
【００１１】
ＬＴもしくはＣＴの免疫刺激性活性から毒性を分離する試みでは、毒素の無毒化突然変異体もしくは改変させていないが単離された５量体Ｂサブユニット（各々、ＬＴＢもしくはＣＴＢ）がそれぞれの免疫アジュバント活性について調査された。毒素の毒性ＡＤＰ−リボシル化活性はＡサブユニットに存在するため、明白なことではあるが、ヒトワクチン中に改変していないＡサブユニットまたはＬＴもしくはＣＴホロトキシンが例え微量でも存在すれば非常に望ましくないことになる。
【００１２】
インフルエンザ抗原のためのアジュバントとしてのＬＴＢの使用はＴａｍｕｒａおよび共同研究者により調査されている（Ｈｉｒａｂａｓｈｉら：Ｖａｃｃｉｎｅ ８：２４３−２４８［１９９０］；Ｋｉｋｕｔａら：Ｖａｃｃｉｎｅ ８：５９５−５９９［１９９０］；Ｔａｍｕｒａら：Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ３：９８１−９８８［１９９２］；Ｔａｍｕｒａら：Ｖａｃｃｉｎｅ １２：４１９−４２６［１９９４］；Ｔａｍｕｒａら：Ｖａｃｃｉｎｅ １２：１０８３−１０８９［１９９４］）。これらの研究では、Ｄａｖｅｎｐｏｒｔら（Ｊ．Ｌａｂ．＆ Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．６３（１）：５−１３［１９６４］）に従うＴｗｅｅｎ／エーテルでの処理によりインフルエンザウイルスから抽出および精製された可溶性インフルエンザウイルス赤血球凝集素（ＨＡ）の使用に基づき、Ａサブユニットを含まないＬＴＢは可溶性ＨＡ抗原と組み合わせてマウスに鼻内投与した際には粘膜免疫アジュバント活性を示さないということが立証された。更には、例えば、ホロトキシンから単離されたＢサブユニット調製物中に残っている残存ホロトキシンのような微量のホロトキシンの存在が、可溶性ＨＡ抗原に対するＬＴＢのアジュバント活性の発現を復帰させることも立証された。更に、特に組換え起源からのＬＴＢ（そして従って、最小限の微量Ａサブユニットさえも完全に含まない）が用いられた場合には、可溶性ＨＡ抗原と共に鼻腔内に同時投与される際にＬＴＢに粘膜活性を発揮させるためには微量のホロトキシンを添加する必要があった。
【００１３】
驚くべきことに、組換え起源からの、そして従ってＡサブユニットを完全に含まない単離されたＬＴＢは、鼻腔内に同時投与された免疫原の天然もしくは提示（ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ）形態に依存する強力な免疫アジュバント活性を持つことが見いだされた。
【００１４】
例えば、オボアルブミン、もしくはヒト免疫不全症ウイルスのエンベロープ糖蛋白質（ｇｐ１２０）の可溶性エクトドメイン（ｅｃｔｏｄｏｍａｉｎ）のような自由に混合された小さな可溶性抗原に対するアジュバント活性は低く、かつ検出不可であることがよくある。他方では、ＬＴＢは自由に混合された巨大な凝集したもしくは粒子状免疫原に対しては非常に強力なアジュバント活性を発揮することが見いだされた。こうした免疫原にはインフルエンザウイルスサブユニット抗原およびカサガイヘモシアニン（ＫＬＨ）が含まれる。
【００１５】
従って本発明は、少なくとも一つの粒子状免疫原、およびＡサブユニットもしくは毒性ＬＴホロトキシンを完全に含まないアジュバント作用性量のＬＴＢを含んでなるワクチンに関する。
【００１６】
本明細書中に定義される際には「粒子状の」は、各々の微生物に特徴的なウイルス、細菌、もしくは真菌類抗原の会合のすべてを意味する。一層特別には用語「粒子状免疫原」は、凝集物、クラスター、ミセル、ヴイロソーム、ロゼット、およびウイルス様免疫原粒子などを含む。
【００１７】
本発明に従うワクチンでは特に組換えＤＮＡ技術から調製されたＬＴＢを利用することができる。一つの免疫原もしくは複数の免疫原は例えばウイルスもしくは細菌のような感染性作用物質に由来してよい。
【００１８】
先の記述に適用されるワクチンは、粘膜（例えば、鼻腔内）投与の際に免疫原に対して全身性免疫グロブリン（例えば、ＩｇＧ）を誘導することが見いだされたばかりでなく、ＩｇＡの局所分泌をも誘導することが見いだされた。
【００１９】
この後者の特徴は、ウイルス（例えば、インフルエンザウイルス、帯状疱疹ウイルス、パピローマウイルス）、または細菌（クラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ）、肺炎球菌のようなもの）、または真菌類での粘膜感染により伝播される疾患に対する免疫化にとっては特に好ましい。
【００２０】
粘膜投与に特有の利点はワクチン適用の簡便さであり、それは更には筋肉内免疫化を受ける予防接種被験者に関する注射針恐怖症の可能性を回避させる。
【００２１】
例えばインフルエンザ感染の場合では高い血清ＩｇＧ力価はウイルスの全身性蔓延の予防、および感染に対する肺の保護にとっては重要となるものの、局所性Ｓ−ＩｇＡ抗体は上気道の保護のための第一線防御力としては非常に重要となる。
【００２２】
粘膜アジュバントの非存在下での不活化インフルエンザウイルスの鼻腔内投与による粘膜予防接種は成功せず（Ｃｌａｎｃｙ：Ｄｒｕｇｓ ５０：５８７−５９４［１９９５］；Ｋａｔｚら：Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１７５：３５２−３６９［１９９７］）、おそらくその理由は粘膜組織に対する抗原の直接投与ではＳ−ＩｇＡ応答がもたらされないためであろうということが報告されている。粘膜アジュバントの同時投与は免疫原に対する局所免疫応答を誘導するための必須条件であるように思われる。顕著なことに、本発明に従う鼻腔内免疫化によりいわゆる一般的粘膜免疫系が活性化され、このことにより適用部位（鼻腔内）のみばかりでなく遠位粘膜組織（例えば、膣粘膜組織）内にもＳ−ＩｇＡの分泌がもたらされることが見いだされた。
【００２３】
本発明に従うワクチンは、例えば細菌性抗原、ウイルスサブユニット（場合によっては不活化されている）、分断（ｓｐｌｉｔ）ウイルス（場合によっては不活化されている）、不活化ウイルスもしくは細菌、または弱毒化された（例えば、冷順応させた）生ウイルスのような、例えばウイルス性もしくは細菌性起源の免疫原を粒子状形態で含む。
【００２４】
本発明に従って用いられるＬＴＢは毒性ＬＴＡもしくは毒性ホロトキシンを厳密に含まない。ＬＴＢが組換えＤＮＡ技術により調製されることが好ましい。本文中での「毒性ＬＴＡを含まない」は、完全にＬＴＡを厳密に含まないことを意味する。
【００２５】
本発明に従うワクチンでは、ＬＴＢを粒子状抗原と自由に混合して使用することができ、その抗原とアジュバントとの間に共有結合（ｃｏｖａｌｅｎｔ ｃｏｕｐｌｉｎｇ）を確立することができるものの、その共有結合は十分なアジュバント効果を達成するために必要ではない。
【００２６】
ＬＴＢ、または一つもしくは複数の免疫原とは別に、本発明に従うワクチンは、水性の溶媒、具体的には緩衝液、更に具体的にはＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）、ならびに安定化剤（例えば、ＰＥＧもしくはメチルセルロース）、および／またはグルコースを含んでよい。
【００２７】
本発明に従うワクチンの構成成分は凍結乾燥されているか、または液体形態をとってよい。
【００２８】
本発明に従うワクチンは、例えばバルクで、またはアンプル内、または注射器内、または噴霧器内に存在してよい。
【００２９】
本発明に従うワクチンは、皮下、もしくは筋肉内、もしくは気管支内、もしくは鼻腔内、もしくは膣内適用によるか、または経口的に投与されてよい。
【００３０】
【実施例】
実施例１
組換えＬＴＢおよびインフルエンザサブユニット抗原の調製
組換えＬＴＢ
本発明中において記載されるところの、組換えＬＴＢ遺伝子および組換えＬＴＢ分子は、例えばブタもしくはヒト起源からのＬＴ−１分子をコードする遺伝子に由来してよい。ブタＬＴ（ｐＬＴ）遺伝子はｐＵＣ１８ベクター（ＶｉｅｉｒａおよびＭｅｓｓｉｎｇ：Ｇｅｎｅ １９：２５９−２６８［１９８２］）内にＰＣＲ技術（ＤｅＨａａｎら：Ｖａｃｃｉｎｅ １４：２６０−２６６［１９９６］）を用いてサブクローン化された。もともとＤａｌｌａｓら（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１３９：８５０−８５８［１９７９］）により記載されたＥＷＤ２９９ベクターをＰＣＲ反応における鋳型として用いた。この構築物の一次ｐＬＴ配列は、ＤＮＡ配列決定により確認した際にはＥＭＢＬ配列データバンクに寄託された際の一次ｐＬＴ配列に厳密に一致することが見いだされた。ｐＵＣ１８−ｐＬＴ構築物からｐＬＴＢ遺伝子を、温度誘導性λＰＲプロモーター（ｖａｎ ｄｅｒ Ｌｉｎｄｅｎら：Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０４：１９７−２０２［１９９２］）を含むｐＲＯＦＩＴ発現ベクター内にサブクローン化した。
【００３１】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＭＣ１０６１を、ｐＲＯＦＩＴプラスミド構築物用の宿主株として用いた。細菌は、ｍｌ当たり５０μｇのカナマイシンを含むルリア−ベルタニ（Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ）培地上で増殖させた。ｐＬＴＢ発現の誘導は、Ｄｅ Ｈａａｎら（上述）により記載されたセ氏２８度から４２度へとｐＲＯＦＩＴ−ＬＴＢベクターを宿す対数期にあるＭＣ１０６１培養物の培養温度を上昇させることにより取得した。
【００３２】
ヒトＬＴＢをコードするｐＫＫ−由来発現ベクター（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｌｔｄ．）（すなわち、ヒトでの毒素原性大腸菌である大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細菌から単離されたＬＴ遺伝子に由来するＬＴＢ遺伝子）であるｐＴＬＴＢは、Ｔａｍｕｒａおよび共同研究者から取得した。ＤＮＡ配列決定により、ｐＬＴＢと比較すると成熟したヒトＬＴＢ（ｈＬＴＢ）内での３アミノ酸置換が明らかにされた（Ｔｈｒ４がＳｅｒへ、Ｇｌｕ４６がＡｌａへ、そしてＬｙｓ１０２がＧｌｕへ）。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＪＭ１０１をｐＴＬＴＢのための宿主として用いた。細菌は、ｍｌ当たり１００μｇのアンピリシンを含むＬＢ培地上で培養した。ｈＬＴＢ発現の誘導は、ｐＴＬＴＢを宿すＪＭ１０１の対数期培養物に最終濃度が５ｍＭになるまでＩＰＴＧを添加することにより取得した。
【００３３】
ｐＬＴＢおよびｈＬＴＢの精製のためには、過剰発現する細菌を回収し、そしてその後に超音波処理により溶菌した。その後には細胞破片を超遠心分離により除去した。組換えｐＬＴＢもしくはｈＬＴＢを含む粗精製細胞抽出物をその後に、固定化させたＤ−ガラクトース（Ｐｉｅｒｃｅ社）カラムにかけた。徹底的に洗浄した後、精製した組換えｐＬＴＢもしくはｈＬＴＢを、Ｕｅｓａｋａら（Ｍｉｃｒｏｂ．Ｐａｔｈ．１６：７１−７６［１９９４］）により以前に記載される要領でのＤ−ガラクトースでの溶出により取得した。組換えｐＬＴＢおよびｈＬＴＢは両方とも以前に記載されるように（ＤｅＨａａｎら：Ｖａｃｃｉｎｅ １４：２６０−２６６［１９９６］）ＧＭ１捕獲用ＥＬＩＳＡ内では至適ＧＭ１−結合性特性を保持していることが見いだされた。精製された蛋白質を含むカラム分画を合わせ、ＰＢＳに対して透析し、そして４℃に保存した。
インフルエンザサブユニット抗原
インフルエンザサブユニット抗原は、Ｂａｃｈｍａｙｅｒら（１９７８年１月１８日の英国特許明細書第１ ４９８ ２６１号）およびＣｈａｌｏｕｐｋａら（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１５：１２１−１２７［１９９６］）により記載される方法に従い、ふ化鶏卵上で増殖させたＢ／Ｈａｒｂｉｎ／７／９４ウイルス（Ｂ／Ｈａｒｂｉｎ）もしくはＡ／Ｊｏｈａｎｎｅｓｂｅｒｇ／３３／９４（Ａ／Ｊｏｈａｎｎｅｓｂｅｒｇ）から調製した。この方法は、ホルムアルデヒドにより不活化させたウイルスの適当なカチオン性界面活性剤での処理、放出された抗原（赤血球凝集素およびノイラミニダーゼ）のウイルスの残存コアからの分離の段階を含む。この方法により、界面活性剤の除去の後の抗原の粒子状すなわちミセル様露出状態（ｅｘｐｏｓｉｔｉｏｎ）がもたらされる。
【００３４】
ｍｌ当たりのμｇとして表現されるサブユニット抗原調製物の効力を、Ｗｏｏｄら（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｓｔａｎｄ．５：２３７−２４１［１９７７］）に従う単純放射状拡散試験で決定した。
【００３５】
実施例２
インフルエンザサブユニットワクチンに対する全身性抗体応答
４匹のマウスからなる群を、麻酔無しで、実施例１に記載される方法に従い調製されたＢ／ＨａｒｂｉｎもしくはＡ／Ｊｏｈａｎｎｅｓｂｅｒｇのいずれかに由来する５μｇのインフルエンザサブユニット抗原で鼻腔内免疫化した。抗原は、単独（ＨＡ）もしくは２．０μｇのｐＬＴＢ（ｐＬＴＢ）と一緒の状態のいずれかで、全ての場合において２０μｌの容量で、０、７、および１４日目に投与した。対照マウスには同一容量のＰＢＳを投与した。マウスを２８日目に屠殺した。血清ＩｇＧ抗体応答を直接ＥＬＩＳＡで決定した。
【００３６】
図１は、ＨＡ Ｂ／Ｈａｒｂｉｎ（黒塗り棒）およびＡ／Ｊｏｈａｎｎｅｓｂｅｒｇ（白抜き棒）に対して観察された血清ＩｇＧ抗体応答を示す。
【００３７】
アジュバント無しでのサブユニット抗原の経鼻投与では全身性抗体応答は殆ど生じなかったが、サブユニット抗原をｐＬＴＢで補足すると２桁を上回る強度で血清抗体応答が亢進した。Ｂ／ＨａｒｂｉｎおよびＡ／Ｊｏｈａｎｎｅｓｂｅｒｇで免疫化したマウスの応答間の違いは有意ではなかった。
【００３８】
これらの結果により、無毒性ｐＬＴＢは鼻腔内投与されたインフルエンザサブユニット抗原に対する高い全身性抗体応答を誘導することができる強力なアジュバントであることが示される。
【００３９】
実施例３
ヒトおよびブタＬＴＢでの全身性抗体応答の比較
４匹のマウスからなる群を、麻酔無しで、実施例１に記載される方法に従い調製されたＢ／Ｈａｒｂｉｎインフルエンザウイルスに由来する５μｇのインフルエンザサブユニット抗原で鼻腔内免疫化した。
【００４０】
抗原は、単独（ＮＯＮＥ）、または２．０μｇのｐＬＴＢ（ｐＬＴＢ）もしくは２．０μｇのｈＬＴＢ（ｈＬＴＢ）と一緒の状態のいずれかで、全ての場合において２０μｌの容量で、０、７、および１４日目に投与した。対照マウスにはＰＢＳを投与した。マウスを２１日目に屠殺した。血清ＩｇＧ抗体応答を２１日目に直接ＥＬＩＳＡで決定した。
【００４１】
図２は、ＨＡ Ｂ／Ｈａｒｂｉｎに対して観察された血清ＩｇＧ抗原応答を示す。
【００４２】
アジュバント無しでのサブユニット抗原の経鼻投与では再度、全身性抗体応答は殆ど生じなかったが、サブユニット抗原をｐＬＴＢおよびｈＬＴＢで補足すると２桁を上回る同程度の強度で血清抗体応答が亢進した。ｐＬＴＢおよびｈＬＴＢで処理した動物の間に観察された違いは有意ではなかった。
【００４３】
実施例４
インフルエンザサブユニットワクチンへの局所粘膜抗体応答の誘導
ｐＬＴＢがインフルエンザＨＡ−特異的Ｓ−ＩｇＡ応答を誘導する能力を調査する目的で、実施例２からのマウスの鼻内洗浄液を、インフルエンザ特異的ＩｇＡ抗体の存在について分析した。鼻内洗浄液は、０．５ｍｌのＰＢＳを鼻咽頭を介して気管の上部へ逆方向に勢いよく洗浄し、逆流させて洗浄し、そして鼻孔で洗浄液を回収することにより取得した。
【００４４】
結果を図３に示す。
【００４５】
このデータにより、組換えｐＬＴＢはＨＡに対する強力な局所Ｓ−ＩｇＡ応答を誘導したことが示された。２つの異なるインフルエンザサブユニット抗原は類似の結果をもたらした。
【００４６】
実施例５
ヒトおよびブタＬＴＢでの粘膜抗体応答の比較
鼻内ＨＡ−特異的抗体応答を亢進させるｐＬＴＢおよびｈＬＴＢの能力を比較する目的で、実施例３からのマウスの鼻内洗浄液を先に記載される要領で回収し、そして２１日目にＨＡ−特異的Ｓ−ＩｇＡの存在について分析した。図４は、ｐＬＴＢおよびｈＬＴＢの両方が活発な鼻内ＨＡ−特異的抗体応答を誘導することを示す。その上、ｐＬＴＢおよびｈＬＴＢで得られた応答の強度は同等であり、このことにより両方の分子は同等なアジュバント特性を有することが示された。
【００４７】
実施例６
鼻腔内適用されるインフルエンザサブユニットワクチンに対する一般的粘膜抗体応答の誘導
投与部位以外の粘膜部位でのインフルエンザＨＡ−特異的Ｓ−ＩｇＡ応答を誘導する組換えｐＬＴＢの能力を調査する目的で、実施例２からのマウス内での鼻腔内免疫化の後の生殖管内でのインフルエンザ特異的Ｓ−ＩｇＡ抗体の誘導を調査した。尿生殖路の洗浄は、ピペットチップを用いて膣内への１００μｌ容量のＰＢＳの１０回の導入および回収により実施した。粘膜洗浄液はＥＬＩＳＡによるＩｇＡ含有量の決定までは４℃に保存した。この結果を図５に示す。
【００４８】
この結果により、ｐＬＴＢはこの遠位の粘膜部位でＳ−ＩｇＡ応答を誘導するのに有効であると判明したことを示す。Ｂ／ＨａｒｂｉｎおよびＡ／Ｊｏｈａｎｎｅｓｂｅｒｇ抗原の両方は同じくらいよく応答した。
【００４９】
実施例７
ＩｇＧ応答の動力学
８匹のメスＢＡＬＢ／ｃマウス（６〜８週令）からなる４群各々を以下のように処置した。
対照 抗原無しの状態でＰＢＳで処理した。麻酔無しの状態で２０μｌを０、７、および１４日目に鼻腔内投与した
ｐＬＴＢ 麻酔無しの状態で、０、７、および１４日目に５μｇのＨＡおよび２．０μｇの組換えｐＬＴＢを２０μｌで鼻腔内適用した
ＨＡｓ．ｃ． 麻酔無しの状態で、０日目に５μｇのＨＡを１００μｌで皮下適用した
Ｃｏｎｖ． 回復期のマウス、すなわち麻酔無しの状態で０日目にＰＲ８ウイルスの１０8感染単位を２０μｌで鼻腔内適用した
各群の４匹のマウスから血液試料を、６、１３、および２０日目に尾静脈から採取した。その上、２８日目には全てのマウスを屠殺および脱血した。各試料中の血清ＩｇＧをＥＬＩＳＡにより測定した。
【００５０】
結果を図６に示す。各々のワクチン療法についての棒（左から右へ）はそれぞれ６、１３、２０、および２８日目のＩｇＧ力価を示す。これらの結果はＨＡ／ｐＬＴＢと共に行う鼻腔内予防接種の後にはＩｇＧ誘導は、ＨＡ単独での皮下予防接種の後、もしくは回復期のマウスにおけるものと少なくとも同一強度のものとなることを示す。
【００５１】
実施例８
鼻および肺の粘膜抗体
実施例７で調査されたものと同一のマウスに、先に記載される要領で２８日目に屠殺した後に鼻腔および尿生殖路の粘膜洗浄を施した。
【００５２】
結果は図８にまとめてある。斜線の付された棒は鼻内洗浄液からのデータを示し、そして白抜き棒は膣洗浄液からのデータを示す。
【００５３】
この結果により、ＨＡ／ｐＬＴＢによる鼻腔内予防接種の際の第一線の防御抗体（Ｓ−ＩｇＡ）の力価は回復期にあるマウスにおけるＳ−ＩｇＡ力価と少なくとも同一程度のものである一方で、ＨＡによる（古典的）皮下予防接種は検出可能な粘膜ＩｇＡ力価をもたらさない。
【００５４】
実施例９
予防接種を施したマウスの攻撃感染抗原投与に対する防御
実施例７の各群の４匹のマウスを２８日目に麻酔無しの状態で、２０μｌ中に含まれる５×１０6の感染単位のＰＲ８ウイルスで鼻腔内経路で感染させた。
【００５５】
攻撃誘発後３日目に鼻および肺のウイルス負荷を決定した。
【００５６】
鼻および肺のホモジネート中のウイルス力価測定は、２段階稀釈およびその後のモルモット赤血球と赤血球凝集素を用いる終点決定によりマイクロタイトレーションプレート内でのＥＰＩＳＥＲＦ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、ＰＡＩＳＬＹ、Ｓｃｏｔｌａｎｄ）上で培養したＭＤＣＫ細胞上で実施した。
【００５７】
結果を図７にまとめてある。斜線の付された棒は鼻でのウイルス力価を示し、そして白抜き棒は肺についてのものである。回復期にあるマウスおよびｐＬＴＢと共に実施する予防接種の際の肺でのウイルス力価は有意ではなかった。従ってこれらのデータは、ｐＬＴＢを粘膜アジュバントとして用いることによりインフルエンザ感染に対する防御が完全であることを示す。
【技術分野】
本発明は、粘膜免疫アジュバント（ｍｕｃｏｓａｌ ｉｍｍｕｎｏａｄｊｕｖａｎｔ）としての大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）（Ｅ．ｃｏｌｉ）の易熱性（ｈｅａｔ−ｌａｂｉｌｅ）エンテロトキシンのＢサブユニット（ＬＴＢ）を含むワクチンに関する。本発明は特に、ヒトにおけるインフルエンザ感染を予防するためのこの種のワクチンに関する。しかしながら本発明はインフルエンザワクチンにおける適用には制約されない。
【０００２】
特定の病原体に由来する抗原製剤の導入を通して感染性作用物質に対する免疫応答を刺激することにより予防接種した被検体の感染を予防もしくは少なくとも抑制することが、感染症に対する予防接種の目的である。理想的には、誘導された免疫応答は２つの構成成分、すなわち液性応答（抗原特異的抗体の産生）および細胞性応答（その病原体による感染を受けた細胞を除去することができる特異的細胞障害性Ｔリンパ球の産生）からなるはずである。
【０００３】
多くの予防接種法は、不活化もしくは弱毒化させた全病原体を含む製剤の投与を必要とする。しかしながらある一定の病原体については全病原体を用いる予防接種にはかなりの欠点があり、なぜならそういった調製物は例え通常は高い免疫原性を示すとしても、望ましくない、副作用を有することがあるためである。このことにより、全感染性作用物質の不利な副作用を実質的には欠く非常に厳密に限定されたサブユニットワクチンもしくは合成ワクチンの使用が最近の傾向になっていることが説明される。しかしながら全病原体と比較すると、サブユニットワクチンもしくは合成ワクチンは、少なくとも添加アジュバントがない状態ではあまり免疫原性がでないことがよくある。
【０００４】
アジュバントは、抗原と組み合わせて投与され、そうすることでその抗原に対する免疫応答を刺激化するための物質もしくは材料である。望ましくない副作用を生じることなくサブユニット抗原もしくは合成抗原に対する免疫応答を強化する適切なアジュバントについての必要性が存在する。
【０００５】
インフルエンザワクチン製剤は不活化もしくは弱毒化された全ウイルスを長いこと含んできたし、幾つかの事例では未だに含んでもいる。こういった製剤はかなりの副作用をもつことがあり、最も悪名の高いものは発熱および注入部位での応答である。今日では、通常、予防接種はサブユニット製剤を用いて行われる。このサブユニットワクチンでは生じる副作用応答が少なく、そしてウイルスの２つの主要表面抗原、すなわち赤血球凝集素（ＨＡ）およびノイラミニダーゼ（ＮＡ）のみを、幾分かは精製された形態で含む。最も最近のワクチン製剤では添加アジュバンドは一切存在しない。
【０００６】
不活化もしくは弱毒化された全インフルエンザウイルスワクチンならびにサブユニットワクチンは通常は一回の筋肉内（ｉ．ｍ．）注射を通して投与される。いずれの予防接種法により達成されるインフルエンザ感染に対する予防も、特に高齢者では、比較的低い。インフルエンザに対する予防接種の効力が比較的低いのは、そのウイルスの抗原変異性が高いことに一部起因している。しかしながら予防接種によるインフルエンザ感染に対する予防は、抗原に対する免疫応答の刺激化および／または改変により改善し得ると信じるに足る理由がある。
【０００７】
インフルエンザの場合、もしくは一般的にいうと気道を介して罹る感染症の場合には、予防接種効率を改善するための方法は、血流中の十分なＴ細胞依存性ＩｇＧ応答のみではなく、浸潤してくる感染性ウイルスに対する防御の第一線としての肺および鼻腔内での局所免疫応答（分泌性ＩｇＡ）の産生をも目的とすべきである。それに加え、細胞性免疫応答（細胞障害性Ｔ細胞）も、特に感染を制限する際には重要であるかも知れない。筋肉内注射（現行の投与経路）を介してのインフルエンザワクチンの投与は気道における局所ＩｇＡ応答はもたらさないことが示されている。
【０００８】
本発明は、鼻腔内ワクチン製剤内のＬＴＢの存在は、アジュバント無しでの免疫原ワクチンでの筋肉内投与による免疫感作と比較すると血流中のＩｇＧ応答を刺激することのみならず、気道内での局所ＩｇＡ応答も引き起こすという驚くべき発見に関する。
【０００９】
未処理の易熱性エンテロトキシン（ＬＴ）およびそれに密接に関連するコレラトキシン（ＣＴ）は一つのＡサブユニット、ならびに５つの同一なＢサブユニットからなる一つの５量体環構造からなる。Ａサブユニットは酵素活性、すなわちＡＤＰ−リボシル化活性を有し、そしてその毒性活性はトキシンに帰属する。腸上皮ではＡサブユニットが第二メッセンジャーｃＡＭＰの持続合成を誘導し、余剰電解質およびそれに付随する腸内腔への液体分泌をもたらす。
【００１０】
ＬＴおよびＣＴは強力な粘膜免疫原である。局所粘膜投与の際にはこれらの分子は毒素に対する直接的な全身性抗体応答の誘導ばかりでばく、局所的に分泌される抗体の産生をももたらし、その抗体は分泌性ＩｇＡ（Ｓ−ＩｇＡ）として著名である。ＬＴおよびＣＴは強力な粘膜免疫アジュバントでもある。すなわち、無関係な他の免疫原と同時投与する際には、ＬＴもしくはＣＴはその免疫原に対する全身性および粘膜性抗体応答を刺激化しうる。しかしながらＬＴおよびＣＴの毒性のため、今日までのところ、ヒトワクチン製剤におけるＬＴもしくはＣＴの使用は本質的には妨げられてきた。
【００１１】
ＬＴもしくはＣＴの免疫刺激性活性から毒性を分離する試みでは、毒素の無毒化突然変異体もしくは改変させていないが単離された５量体Ｂサブユニット（各々、ＬＴＢもしくはＣＴＢ）がそれぞれの免疫アジュバント活性について調査された。毒素の毒性ＡＤＰ−リボシル化活性はＡサブユニットに存在するため、明白なことではあるが、ヒトワクチン中に改変していないＡサブユニットまたはＬＴもしくはＣＴホロトキシンが例え微量でも存在すれば非常に望ましくないことになる。
【００１２】
インフルエンザ抗原のためのアジュバントとしてのＬＴＢの使用はＴａｍｕｒａおよび共同研究者により調査されている（Ｈｉｒａｂａｓｈｉら：Ｖａｃｃｉｎｅ ８：２４３−２４８［１９９０］；Ｋｉｋｕｔａら：Ｖａｃｃｉｎｅ ８：５９５−５９９［１９９０］；Ｔａｍｕｒａら：Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ３：９８１−９８８［１９９２］；Ｔａｍｕｒａら：Ｖａｃｃｉｎｅ １２：４１９−４２６［１９９４］；Ｔａｍｕｒａら：Ｖａｃｃｉｎｅ １２：１０８３−１０８９［１９９４］）。これらの研究では、Ｄａｖｅｎｐｏｒｔら（Ｊ．Ｌａｂ．＆ Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．６３（１）：５−１３［１９６４］）に従うＴｗｅｅｎ／エーテルでの処理によりインフルエンザウイルスから抽出および精製された可溶性インフルエンザウイルス赤血球凝集素（ＨＡ）の使用に基づき、Ａサブユニットを含まないＬＴＢは可溶性ＨＡ抗原と組み合わせてマウスに鼻内投与した際には粘膜免疫アジュバント活性を示さないということが立証された。更には、例えば、ホロトキシンから単離されたＢサブユニット調製物中に残っている残存ホロトキシンのような微量のホロトキシンの存在が、可溶性ＨＡ抗原に対するＬＴＢのアジュバント活性の発現を復帰させることも立証された。更に、特に組換え起源からのＬＴＢ（そして従って、最小限の微量Ａサブユニットさえも完全に含まない）が用いられた場合には、可溶性ＨＡ抗原と共に鼻腔内に同時投与される際にＬＴＢに粘膜活性を発揮させるためには微量のホロトキシンを添加する必要があった。
【００１３】
驚くべきことに、組換え起源からの、そして従ってＡサブユニットを完全に含まない単離されたＬＴＢは、鼻腔内に同時投与された免疫原の天然もしくは提示（ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ）形態に依存する強力な免疫アジュバント活性を持つことが見いだされた。
【００１４】
例えば、オボアルブミン、もしくはヒト免疫不全症ウイルスのエンベロープ糖蛋白質（ｇｐ１２０）の可溶性エクトドメイン（ｅｃｔｏｄｏｍａｉｎ）のような自由に混合された小さな可溶性抗原に対するアジュバント活性は低く、かつ検出不可であることがよくある。他方では、ＬＴＢは自由に混合された巨大な凝集したもしくは粒子状免疫原に対しては非常に強力なアジュバント活性を発揮することが見いだされた。こうした免疫原にはインフルエンザウイルスサブユニット抗原およびカサガイヘモシアニン（ＫＬＨ）が含まれる。
【００１５】
従って本発明は、少なくとも一つの粒子状免疫原、およびＡサブユニットもしくは毒性ＬＴホロトキシンを完全に含まないアジュバント作用性量のＬＴＢを含んでなるワクチンに関する。
【００１６】
本明細書中に定義される際には「粒子状の」は、各々の微生物に特徴的なウイルス、細菌、もしくは真菌類抗原の会合のすべてを意味する。一層特別には用語「粒子状免疫原」は、凝集物、クラスター、ミセル、ヴイロソーム、ロゼット、およびウイルス様免疫原粒子などを含む。
【００１７】
本発明に従うワクチンでは特に組換えＤＮＡ技術から調製されたＬＴＢを利用することができる。一つの免疫原もしくは複数の免疫原は例えばウイルスもしくは細菌のような感染性作用物質に由来してよい。
【００１８】
先の記述に適用されるワクチンは、粘膜（例えば、鼻腔内）投与の際に免疫原に対して全身性免疫グロブリン（例えば、ＩｇＧ）を誘導することが見いだされたばかりでなく、ＩｇＡの局所分泌をも誘導することが見いだされた。
【００１９】
この後者の特徴は、ウイルス（例えば、インフルエンザウイルス、帯状疱疹ウイルス、パピローマウイルス）、または細菌（クラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ）、肺炎球菌のようなもの）、または真菌類での粘膜感染により伝播される疾患に対する免疫化にとっては特に好ましい。
【００２０】
粘膜投与に特有の利点はワクチン適用の簡便さであり、それは更には筋肉内免疫化を受ける予防接種被験者に関する注射針恐怖症の可能性を回避させる。
【００２１】
例えばインフルエンザ感染の場合では高い血清ＩｇＧ力価はウイルスの全身性蔓延の予防、および感染に対する肺の保護にとっては重要となるものの、局所性Ｓ−ＩｇＡ抗体は上気道の保護のための第一線防御力としては非常に重要となる。
【００２２】
粘膜アジュバントの非存在下での不活化インフルエンザウイルスの鼻腔内投与による粘膜予防接種は成功せず（Ｃｌａｎｃｙ：Ｄｒｕｇｓ ５０：５８７−５９４［１９９５］；Ｋａｔｚら：Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１７５：３５２−３６９［１９９７］）、おそらくその理由は粘膜組織に対する抗原の直接投与ではＳ−ＩｇＡ応答がもたらされないためであろうということが報告されている。粘膜アジュバントの同時投与は免疫原に対する局所免疫応答を誘導するための必須条件であるように思われる。顕著なことに、本発明に従う鼻腔内免疫化によりいわゆる一般的粘膜免疫系が活性化され、このことにより適用部位（鼻腔内）のみばかりでなく遠位粘膜組織（例えば、膣粘膜組織）内にもＳ−ＩｇＡの分泌がもたらされることが見いだされた。
【００２３】
本発明に従うワクチンは、例えば細菌性抗原、ウイルスサブユニット（場合によっては不活化されている）、分断（ｓｐｌｉｔ）ウイルス（場合によっては不活化されている）、不活化ウイルスもしくは細菌、または弱毒化された（例えば、冷順応させた）生ウイルスのような、例えばウイルス性もしくは細菌性起源の免疫原を粒子状形態で含む。
【００２４】
本発明に従って用いられるＬＴＢは毒性ＬＴＡもしくは毒性ホロトキシンを厳密に含まない。ＬＴＢが組換えＤＮＡ技術により調製されることが好ましい。本文中での「毒性ＬＴＡを含まない」は、完全にＬＴＡを厳密に含まないことを意味する。
【００２５】
本発明に従うワクチンでは、ＬＴＢを粒子状抗原と自由に混合して使用することができ、その抗原とアジュバントとの間に共有結合（ｃｏｖａｌｅｎｔ ｃｏｕｐｌｉｎｇ）を確立することができるものの、その共有結合は十分なアジュバント効果を達成するために必要ではない。
【００２６】
ＬＴＢ、または一つもしくは複数の免疫原とは別に、本発明に従うワクチンは、水性の溶媒、具体的には緩衝液、更に具体的にはＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）、ならびに安定化剤（例えば、ＰＥＧもしくはメチルセルロース）、および／またはグルコースを含んでよい。
【００２７】
本発明に従うワクチンの構成成分は凍結乾燥されているか、または液体形態をとってよい。
【００２８】
本発明に従うワクチンは、例えばバルクで、またはアンプル内、または注射器内、または噴霧器内に存在してよい。
【００２９】
本発明に従うワクチンは、皮下、もしくは筋肉内、もしくは気管支内、もしくは鼻腔内、もしくは膣内適用によるか、または経口的に投与されてよい。
【００３０】
【実施例】
実施例１
組換えＬＴＢおよびインフルエンザサブユニット抗原の調製
組換えＬＴＢ
本発明中において記載されるところの、組換えＬＴＢ遺伝子および組換えＬＴＢ分子は、例えばブタもしくはヒト起源からのＬＴ−１分子をコードする遺伝子に由来してよい。ブタＬＴ（ｐＬＴ）遺伝子はｐＵＣ１８ベクター（ＶｉｅｉｒａおよびＭｅｓｓｉｎｇ：Ｇｅｎｅ １９：２５９−２６８［１９８２］）内にＰＣＲ技術（ＤｅＨａａｎら：Ｖａｃｃｉｎｅ １４：２６０−２６６［１９９６］）を用いてサブクローン化された。もともとＤａｌｌａｓら（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１３９：８５０−８５８［１９７９］）により記載されたＥＷＤ２９９ベクターをＰＣＲ反応における鋳型として用いた。この構築物の一次ｐＬＴ配列は、ＤＮＡ配列決定により確認した際にはＥＭＢＬ配列データバンクに寄託された際の一次ｐＬＴ配列に厳密に一致することが見いだされた。ｐＵＣ１８−ｐＬＴ構築物からｐＬＴＢ遺伝子を、温度誘導性λＰＲプロモーター（ｖａｎ ｄｅｒ Ｌｉｎｄｅｎら：Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０４：１９７−２０２［１９９２］）を含むｐＲＯＦＩＴ発現ベクター内にサブクローン化した。
【００３１】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＭＣ１０６１を、ｐＲＯＦＩＴプラスミド構築物用の宿主株として用いた。細菌は、ｍｌ当たり５０μｇのカナマイシンを含むルリア−ベルタニ（Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ）培地上で増殖させた。ｐＬＴＢ発現の誘導は、Ｄｅ Ｈａａｎら（上述）により記載されたセ氏２８度から４２度へとｐＲＯＦＩＴ−ＬＴＢベクターを宿す対数期にあるＭＣ１０６１培養物の培養温度を上昇させることにより取得した。
【００３２】
ヒトＬＴＢをコードするｐＫＫ−由来発現ベクター（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｌｔｄ．）（すなわち、ヒトでの毒素原性大腸菌である大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細菌から単離されたＬＴ遺伝子に由来するＬＴＢ遺伝子）であるｐＴＬＴＢは、Ｔａｍｕｒａおよび共同研究者から取得した。ＤＮＡ配列決定により、ｐＬＴＢと比較すると成熟したヒトＬＴＢ（ｈＬＴＢ）内での３アミノ酸置換が明らかにされた（Ｔｈｒ４がＳｅｒへ、Ｇｌｕ４６がＡｌａへ、そしてＬｙｓ１０２がＧｌｕへ）。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＪＭ１０１をｐＴＬＴＢのための宿主として用いた。細菌は、ｍｌ当たり１００μｇのアンピリシンを含むＬＢ培地上で培養した。ｈＬＴＢ発現の誘導は、ｐＴＬＴＢを宿すＪＭ１０１の対数期培養物に最終濃度が５ｍＭになるまでＩＰＴＧを添加することにより取得した。
【００３３】
ｐＬＴＢおよびｈＬＴＢの精製のためには、過剰発現する細菌を回収し、そしてその後に超音波処理により溶菌した。その後には細胞破片を超遠心分離により除去した。組換えｐＬＴＢもしくはｈＬＴＢを含む粗精製細胞抽出物をその後に、固定化させたＤ−ガラクトース（Ｐｉｅｒｃｅ社）カラムにかけた。徹底的に洗浄した後、精製した組換えｐＬＴＢもしくはｈＬＴＢを、Ｕｅｓａｋａら（Ｍｉｃｒｏｂ．Ｐａｔｈ．１６：７１−７６［１９９４］）により以前に記載される要領でのＤ−ガラクトースでの溶出により取得した。組換えｐＬＴＢおよびｈＬＴＢは両方とも以前に記載されるように（ＤｅＨａａｎら：Ｖａｃｃｉｎｅ １４：２６０−２６６［１９９６］）ＧＭ１捕獲用ＥＬＩＳＡ内では至適ＧＭ１−結合性特性を保持していることが見いだされた。精製された蛋白質を含むカラム分画を合わせ、ＰＢＳに対して透析し、そして４℃に保存した。
インフルエンザサブユニット抗原
インフルエンザサブユニット抗原は、Ｂａｃｈｍａｙｅｒら（１９７８年１月１８日の英国特許明細書第１ ４９８ ２６１号）およびＣｈａｌｏｕｐｋａら（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１５：１２１−１２７［１９９６］）により記載される方法に従い、ふ化鶏卵上で増殖させたＢ／Ｈａｒｂｉｎ／７／９４ウイルス（Ｂ／Ｈａｒｂｉｎ）もしくはＡ／Ｊｏｈａｎｎｅｓｂｅｒｇ／３３／９４（Ａ／Ｊｏｈａｎｎｅｓｂｅｒｇ）から調製した。この方法は、ホルムアルデヒドにより不活化させたウイルスの適当なカチオン性界面活性剤での処理、放出された抗原（赤血球凝集素およびノイラミニダーゼ）のウイルスの残存コアからの分離の段階を含む。この方法により、界面活性剤の除去の後の抗原の粒子状すなわちミセル様露出状態（ｅｘｐｏｓｉｔｉｏｎ）がもたらされる。
【００３４】
ｍｌ当たりのμｇとして表現されるサブユニット抗原調製物の効力を、Ｗｏｏｄら（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｓｔａｎｄ．５：２３７−２４１［１９７７］）に従う単純放射状拡散試験で決定した。
【００３５】
実施例２
インフルエンザサブユニットワクチンに対する全身性抗体応答
４匹のマウスからなる群を、麻酔無しで、実施例１に記載される方法に従い調製されたＢ／ＨａｒｂｉｎもしくはＡ／Ｊｏｈａｎｎｅｓｂｅｒｇのいずれかに由来する５μｇのインフルエンザサブユニット抗原で鼻腔内免疫化した。抗原は、単独（ＨＡ）もしくは２．０μｇのｐＬＴＢ（ｐＬＴＢ）と一緒の状態のいずれかで、全ての場合において２０μｌの容量で、０、７、および１４日目に投与した。対照マウスには同一容量のＰＢＳを投与した。マウスを２８日目に屠殺した。血清ＩｇＧ抗体応答を直接ＥＬＩＳＡで決定した。
【００３６】
図１は、ＨＡ Ｂ／Ｈａｒｂｉｎ（黒塗り棒）およびＡ／Ｊｏｈａｎｎｅｓｂｅｒｇ（白抜き棒）に対して観察された血清ＩｇＧ抗体応答を示す。
【００３７】
アジュバント無しでのサブユニット抗原の経鼻投与では全身性抗体応答は殆ど生じなかったが、サブユニット抗原をｐＬＴＢで補足すると２桁を上回る強度で血清抗体応答が亢進した。Ｂ／ＨａｒｂｉｎおよびＡ／Ｊｏｈａｎｎｅｓｂｅｒｇで免疫化したマウスの応答間の違いは有意ではなかった。
【００３８】
これらの結果により、無毒性ｐＬＴＢは鼻腔内投与されたインフルエンザサブユニット抗原に対する高い全身性抗体応答を誘導することができる強力なアジュバントであることが示される。
【００３９】
実施例３
ヒトおよびブタＬＴＢでの全身性抗体応答の比較
４匹のマウスからなる群を、麻酔無しで、実施例１に記載される方法に従い調製されたＢ／Ｈａｒｂｉｎインフルエンザウイルスに由来する５μｇのインフルエンザサブユニット抗原で鼻腔内免疫化した。
【００４０】
抗原は、単独（ＮＯＮＥ）、または２．０μｇのｐＬＴＢ（ｐＬＴＢ）もしくは２．０μｇのｈＬＴＢ（ｈＬＴＢ）と一緒の状態のいずれかで、全ての場合において２０μｌの容量で、０、７、および１４日目に投与した。対照マウスにはＰＢＳを投与した。マウスを２１日目に屠殺した。血清ＩｇＧ抗体応答を２１日目に直接ＥＬＩＳＡで決定した。
【００４１】
図２は、ＨＡ Ｂ／Ｈａｒｂｉｎに対して観察された血清ＩｇＧ抗原応答を示す。
【００４２】
アジュバント無しでのサブユニット抗原の経鼻投与では再度、全身性抗体応答は殆ど生じなかったが、サブユニット抗原をｐＬＴＢおよびｈＬＴＢで補足すると２桁を上回る同程度の強度で血清抗体応答が亢進した。ｐＬＴＢおよびｈＬＴＢで処理した動物の間に観察された違いは有意ではなかった。
【００４３】
実施例４
インフルエンザサブユニットワクチンへの局所粘膜抗体応答の誘導
ｐＬＴＢがインフルエンザＨＡ−特異的Ｓ−ＩｇＡ応答を誘導する能力を調査する目的で、実施例２からのマウスの鼻内洗浄液を、インフルエンザ特異的ＩｇＡ抗体の存在について分析した。鼻内洗浄液は、０．５ｍｌのＰＢＳを鼻咽頭を介して気管の上部へ逆方向に勢いよく洗浄し、逆流させて洗浄し、そして鼻孔で洗浄液を回収することにより取得した。
【００４４】
結果を図３に示す。
【００４５】
このデータにより、組換えｐＬＴＢはＨＡに対する強力な局所Ｓ−ＩｇＡ応答を誘導したことが示された。２つの異なるインフルエンザサブユニット抗原は類似の結果をもたらした。
【００４６】
実施例５
ヒトおよびブタＬＴＢでの粘膜抗体応答の比較
鼻内ＨＡ−特異的抗体応答を亢進させるｐＬＴＢおよびｈＬＴＢの能力を比較する目的で、実施例３からのマウスの鼻内洗浄液を先に記載される要領で回収し、そして２１日目にＨＡ−特異的Ｓ−ＩｇＡの存在について分析した。図４は、ｐＬＴＢおよびｈＬＴＢの両方が活発な鼻内ＨＡ−特異的抗体応答を誘導することを示す。その上、ｐＬＴＢおよびｈＬＴＢで得られた応答の強度は同等であり、このことにより両方の分子は同等なアジュバント特性を有することが示された。
【００４７】
実施例６
鼻腔内適用されるインフルエンザサブユニットワクチンに対する一般的粘膜抗体応答の誘導
投与部位以外の粘膜部位でのインフルエンザＨＡ−特異的Ｓ−ＩｇＡ応答を誘導する組換えｐＬＴＢの能力を調査する目的で、実施例２からのマウス内での鼻腔内免疫化の後の生殖管内でのインフルエンザ特異的Ｓ−ＩｇＡ抗体の誘導を調査した。尿生殖路の洗浄は、ピペットチップを用いて膣内への１００μｌ容量のＰＢＳの１０回の導入および回収により実施した。粘膜洗浄液はＥＬＩＳＡによるＩｇＡ含有量の決定までは４℃に保存した。この結果を図５に示す。
【００４８】
この結果により、ｐＬＴＢはこの遠位の粘膜部位でＳ−ＩｇＡ応答を誘導するのに有効であると判明したことを示す。Ｂ／ＨａｒｂｉｎおよびＡ／Ｊｏｈａｎｎｅｓｂｅｒｇ抗原の両方は同じくらいよく応答した。
【００４９】
実施例７
ＩｇＧ応答の動力学
８匹のメスＢＡＬＢ／ｃマウス（６〜８週令）からなる４群各々を以下のように処置した。
対照 抗原無しの状態でＰＢＳで処理した。麻酔無しの状態で２０μｌを０、７、および１４日目に鼻腔内投与した
ｐＬＴＢ 麻酔無しの状態で、０、７、および１４日目に５μｇのＨＡおよび２．０μｇの組換えｐＬＴＢを２０μｌで鼻腔内適用した
ＨＡｓ．ｃ． 麻酔無しの状態で、０日目に５μｇのＨＡを１００μｌで皮下適用した
Ｃｏｎｖ． 回復期のマウス、すなわち麻酔無しの状態で０日目にＰＲ８ウイルスの１０8感染単位を２０μｌで鼻腔内適用した
各群の４匹のマウスから血液試料を、６、１３、および２０日目に尾静脈から採取した。その上、２８日目には全てのマウスを屠殺および脱血した。各試料中の血清ＩｇＧをＥＬＩＳＡにより測定した。
【００５０】
結果を図６に示す。各々のワクチン療法についての棒（左から右へ）はそれぞれ６、１３、２０、および２８日目のＩｇＧ力価を示す。これらの結果はＨＡ／ｐＬＴＢと共に行う鼻腔内予防接種の後にはＩｇＧ誘導は、ＨＡ単独での皮下予防接種の後、もしくは回復期のマウスにおけるものと少なくとも同一強度のものとなることを示す。
【００５１】
実施例８
鼻および肺の粘膜抗体
実施例７で調査されたものと同一のマウスに、先に記載される要領で２８日目に屠殺した後に鼻腔および尿生殖路の粘膜洗浄を施した。
【００５２】
結果は図８にまとめてある。斜線の付された棒は鼻内洗浄液からのデータを示し、そして白抜き棒は膣洗浄液からのデータを示す。
【００５３】
この結果により、ＨＡ／ｐＬＴＢによる鼻腔内予防接種の際の第一線の防御抗体（Ｓ−ＩｇＡ）の力価は回復期にあるマウスにおけるＳ−ＩｇＡ力価と少なくとも同一程度のものである一方で、ＨＡによる（古典的）皮下予防接種は検出可能な粘膜ＩｇＡ力価をもたらさない。
【００５４】
実施例９
予防接種を施したマウスの攻撃感染抗原投与に対する防御
実施例７の各群の４匹のマウスを２８日目に麻酔無しの状態で、２０μｌ中に含まれる５×１０6の感染単位のＰＲ８ウイルスで鼻腔内経路で感染させた。
【００５５】
攻撃誘発後３日目に鼻および肺のウイルス負荷を決定した。
【００５６】
鼻および肺のホモジネート中のウイルス力価測定は、２段階稀釈およびその後のモルモット赤血球と赤血球凝集素を用いる終点決定によりマイクロタイトレーションプレート内でのＥＰＩＳＥＲＦ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、ＰＡＩＳＬＹ、Ｓｃｏｔｌａｎｄ）上で培養したＭＤＣＫ細胞上で実施した。
【００５７】
結果を図７にまとめてある。斜線の付された棒は鼻でのウイルス力価を示し、そして白抜き棒は肺についてのものである。回復期にあるマウスおよびｐＬＴＢと共に実施する予防接種の際の肺でのウイルス力価は有意ではなかった。従ってこれらのデータは、ｐＬＴＢを粘膜アジュバントとして用いることによりインフルエンザ感染に対する防御が完全であることを示す。
Claims (8)
- 少なくとも一つの粒子性ウイルス抗原、およびＡサブユニットもしくは毒性ＬＴホロトキシンを全く含まない大腸菌（E. coli）に特徴的な易熱性エンテロトキシンのＢサブユニット（ＬＴＢ）のアジュバント作用性量を含んでなり、かつ、該少なくとも一つの粒子性ウイルス抗原は該Ｂサブユニットに共有結合していないものである、粘膜投与用のワクチン。
- ＬＴＢが組換えＤＮＡ法により調製される、請求項１に記載のワクチン。
- ウイルス抗原が、粘膜感染により伝播する疾患に対する免疫感作を提供する、請求項１または２に記載のワクチン。
- インフルエンザ抗原がウイルス抗原として用いられる、請求項３に記載のワクチン。
- 有効成分として、少なくとも一つの粒子性ウイルス抗原、およびＡサブユニットもしくは毒性ＬＴホロトキシンを全く含まない大腸菌（E. coli）に特徴的な易熱性エンテロトキシンのＢサブユニット（ＬＴＢ）のアジュバント作用性量を含んでなり、かつ、該少なくとも一つの粒子性ウイルス抗原は該Ｂサブユニットに共有結合していないものである、ことを特徴とする、ウイルス抗原に対する全身性免疫グロブリン応答の誘導用製薬学的製剤。
- 有効成分として、少なくとも一つの粒子性ウイルス抗原、およびＡサブユニットもしくは毒性ＬＴホロトキシンを全く含まない大腸菌（E. coli）に特徴的な易熱性エンテロトキシンのＢサブユニット（ＬＴＢ）のアジュバント作用性量を含んでなり、かつ、該少なくとも一つの粒子性ウイルス抗原は該Ｂサブユニットに共有結合していないものである、ことを特徴とする、ウイルス抗原に対する一般的粘膜免疫応答の誘導用製薬学的製剤。
- 粒子性ウイルス抗原とＡサブユニットもしくは毒性ＬＴホロトキシンを全く含まない大腸菌（E. coli）に特徴的な易熱性エンテロトキシンのＢサブユニット（ＬＴＢ）のアジュバントの粘膜投与により個体内での前記ウイルス抗原に対する全身性免疫グロブリン応答の誘導に適するアジュバント作用性量を混合することを含んでなり、かつ、前記ウイルス抗原が前記Ｂサブユニットに共有結合していないものであることを特徴とするワクチンの調製方法。
- 粒子性ウイルス抗原とＡサブユニットもしくは毒性ＬＴホロトキシンを全く含ない大腸菌（E. coli）に特徴的な易熱性エンテロトキシンのＢサブユニット（ＬＴＢ）の粘膜投与により個体内での前記ウイルス抗原に対する一般的粘膜免疫応答の誘導に適するアジュバント作用性量を混合することを含んでなり、かつ、前記ウイルス抗原が前記Ｂサブユニットに共有結合していないものであることを特徴とするワクチンの調製方法。
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