JP2002539169A

JP2002539169A - アジュバント効果を有する細菌膜分画

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Publication number: JP2002539169A
Application number: JP2000604864A
Authority: JP
Inventors: リボン、クリスティン; コルヴァイア、ナタリー; グエン、ティエン・ゴク; ベック、アラン; ボンフォワ、ジャン・イヴ
Original assignee: ピエール、ファーブル、メディカマン
Priority date: 1999-03-15
Filing date: 2000-03-15
Publication date: 2002-11-19
Also published as: EP1158993A1; ES2276673T3; EP1158993B1; CN1151799C; WO2000054789A1; CN1343124A; DE60032119D1; DE60032119T2; ATE346602T1; AU3298000A; AU778957B2; BR0009051A; ZA200107628B; CA2367917A1; FR2790959B1; FR2790959A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、免疫応答を目標の抗原又はハプテンに対して指向性をもつTh1型応答及び／又はTh1/Th2混合型応答へ指向させるための医薬組成物の調製における前記抗原又はハプテンと結合したグラム陰性菌、特にKlebsiella p neumoniaeの膜分画の使用に関する。本発明は更に、係る膜分画及びそれを含有する医薬組成物の製造法と、特にＲＳウィルスなどのパラミキソウィルスに起因する感染症を始めとする各種の感染症や、特に腫瘍関連抗原と関連した各種の癌などの予防及び治療への前記医薬組成物の利用にも関する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明は、免疫応答を目標の抗原又はハプテンに対して指向性を有するTh1型
及び／又はTh1/Th2混合型応答へ指向させるための医薬組成物の調製における前
記抗原又はハプテンと結合したグラム陰性菌、特にKlebsiella pneumoniaeの膜
分画の使用に関するものである。本発明は更に、係る膜分画及びそれを含有する
医薬組成物の製造法と、特にＲＳウィルスなどのパラミキソウィルスに起因する
感染症を始めとする各種の感染症や、特に腫瘍が腫瘍関連抗原と関連している各
種の癌などの予防及び治療への前記医薬組成物の利用も包含する。

【０００２】ワクチンの接種は特に感染症の予防や低減に有効な手段である。この分野にお
けるワクチン接種の組織的活動の成功により、ワクチンの概念を自己免疫疾患、
癌、及び稔性(妊性)などの分野にまで拡げることが可能となった。一方、抗原だ
けの単独ワクチン接種は必ずしも常に迅速かつ持続性の抗体応答を誘起し得ると
は限らず、迅速で持続性の抗体応答を得るためにはアジュバント、すなわち抗原
によるそのような応答の誘起を助ける化合物の存在が必要である（アジュバント
という用語はラテン語のadjuvare＝「助ける」に由来する）。

【０００３】アジュバントは、その構造と起源について多種多様な化合物の一群を構成して
いる。このカテゴリーには、特に油中水型エマルション（不完全フロイントアジ
ュバント）、水中油型エマルション、グラム陰性細菌から得られるリポ多糖類誘
導体のような細菌起源の化合物、及びアルミニウム塩といったものがある。今の
ところ、人に用いられるワクチン調製用アジュバントとして使用されているのは
アルミニウム塩だけである。

【０００４】或る抗原に対して指向性をもつ抗体応答が発現されるには、複雑な一連の事象
が必要である。これには、抗原を与える細胞、調節Ｔリンパ球（Thすなわちヘル
パー細胞）、及び抗体を産生するＢリンパ球が関与する。このThリンパ球は、産
生されるサイトカインのプロファイルに従って２種に区別することができ、その
一つはIFN-γ（インターフェロンγ）及びIL-2（インターロイキン２）を産生し
てマウスにおけるIgG2aの生成を促進するタイプ１のThリンパ球であり、もう一
つはIL-4、IL-5及びIL-10を産生してマウスにおいてIgG1を生成せしめるタイプ
２のThリンパ球である（Mosmann, T.R. 及び Sad S., Immunol. Today 1996, 17
:138頁参照）。更に、抗原が同一である場合、抗体応答中に優勢アイソタイプへ
向かわせるのはアジュバントであることが開示されている（Toellner K.-M. 他
、J. Exp. Med. 1998, 187:1193 参照）。かくして、アルヒドロゲル(Alhydroge
l)のようなアルミニウム塩類はマウスにおいて本質的にTh2タイプの応答を誘発
してIgG1の生成を促進し、或いはIgEの生成までも促進することが知られている
（Allison A.C., In Vaccine design - The role of cytokine networks Vol. 2
93, 1-9, Plenum Press 1997 参照）が、これはアレルギー素質を持つ患者には
問題を起こす恐れがある。更に、想定した治療目的によっては、Th1型あるいはT
h1/Th2混合型の応答が必要とされることもある。

【０００５】従って、今日においては、Th1型もしくはTh1/Th2混合型の免疫応答、好ましく
はTh1/Th2混合型であってTh1応答がTh2応答に近いか或いはTh2応答より強いよう
な応答を誘発可能な新規アジュバントの入手の要望がある。

【０００６】驚くべきことに、本発明者らはグラム陰性細菌であるKlebsiella pneumoniae
の膜分画（FMKp と呼ばれる）、特に後述の実施例で述べる方法で得られた膜分
画が特別な性質を有することを実証した。事実、本発明者らは、この膜分画FMKp
は抗原と組み合わせると該抗原に指向する抗体応答を増進する能力のみならず、
サイトカイン応答をTh1/Th2混合型プロファイルへと再び向かわせて目的の特定
アジュバント活性に対応する能力をも獲得し、しかもこれは該膜分画の投与の様
式には無関係であるとの知見を得ている。

【０００７】従って本発明の主題は、グラム陰性菌の膜分画、特にKlebsiella pneumoniae
の膜分画を目標の抗原又はハプテンと結合させて、免疫応答を該抗原又はハプテ
ンに対して指向性をもつTh1型及び／又はTh1／Th2混合型応答に指向させること
、すなわち、免疫応答を前記抗原又はハプテンに対して指向性をもつTh1型及び
／又はTh1／Th2混合型応答に指向させるための医薬品組成物の調製における前記
膜分画の使用にある。

【０００８】免疫応答をTh1型及び／又はTh1／Th2混合型応答へ向かわせることについては
、ミョウバンアジュバントで得られるTh1／Th2応答に比べてTh1応答の誘発を促
進するような免疫応答の指向調整が特に好ましい。

【０００９】更に、免疫応答をTh1型及び／又はTh1／Th2混合型応答へ向かわせることにつ
いては、結合される抗原に対して指向性をもつIgG2a抗体の力価をミョウバンア
ジュバントで得られるIgG2a抗体の力価に比べて10倍以上、好ましくは25倍、50
倍、更には100倍以上に高めるような免疫応答の指向調整が特に好ましい。

【００１０】特に好ましい態様においては、免疫応答は、Th1応答がTh2応答に近いか或いは
Th2より強いTh1型応答及び／又はTh1／Th2混合型へ向かって指向調整される。こ
こで「近い」という表現は、結合される抗原に対して指向性をもつIgG2a抗体の
力価として表した場合、該抗原に対して指向性をもつIgG1抗体の少なくとも0.5
倍、好ましくは少なくとも0.75倍に等しく、結合される抗原に対して指向性をも
つIgG抗体の力価がミョウバンアジュバント又はフロイントアジュバントで得ら
れる結合抗原に対して指向性をもつIgG抗体の力価に近いかそれより大きいこと
を意味すしている。

【００１１】本発明はまた、本発明による使用において、前記膜分画が２種以上の異なる菌
株から得られる膜分画を含むことを特徴とする使用にも関する。

【００１２】本発明において「細菌の膜分画」という表現は、先に述べた細菌の培養で得ら
れる膜分画もしくは抽出物を精製又は部分的に精製したものを指し、且つその調
製方法は、培養後の得られた細菌を溶菌する工程と、溶菌工程後に得られた全溶
解物から前記細菌の膜を含む分画を特に遠心分離もしくは濾過によって分離する
工程とを含むものと理解される。

【００１３】また本発明において「細菌の膜分画」という表現は、該細菌がKlebsiella pne umoniae である場合は、Klebsiella pneumoniaeの膜分画の活性成分であってSEQ
ID No.2のアミノ酸配列を有する活性成分又はその断片の一つである蛋白質Ｐ40
を意味するものと理解される。

【００１４】本発明によれば、このような膜分画は、当業者に知られた方法、例えばHaeuw
J.F. ら(Eur. J. Biochem, 255, 446-454, 1998) によって記述されている方法
などによって調製することが可能である。

【００１５】本発明による使用の特別な一実施形態によれば、前記膜分画は以下の工程、す
なわち、ａ）前記細菌をその生育に適した培地中で培養し、次いでその培養菌を遠心分
離する工程と、ｂ）工程ａ）で得た菌体ペレットの分解酵素を失活せしめ、得られた懸濁液を
遠心分離する選択的な工程と、ｃ）工程 a) 又は工程ｂ）で得た菌体ペレットから、抽出液中での該ペレット
の少なくとも１回の洗浄によって、膜に属さない蛋白質並びに核酸を抽出除去す
る工程と、ｄ）工程ｃ）で得た膜ペレットを蛋白質分解酵素の存在下で分解処理し、次い
で遠心分離する工程と、ｅ）工程ｄ）で得たペレットを生理食塩水及び／又は蒸留水中で少なくとも１
回洗浄する工程と、ｆ）工程ｅ）で得たペレットを超音波処理する工程、とからなる方法により調製される。

【００１６】工程ａ）で得た菌体ペレットに含まれる分解酵素を失活せしめる工程ｂ）は、
例えば再懸濁した菌体ペレットを好ましくは100℃近傍の温度で加熱したり、或
いはこれらの酵素の活性に対する阻害剤を添加したりするなど、公知のいかなる
酵素失活法によっても実施することができる。

【００１７】工程ａ）又は工程ｂ）で得たペレットから該細菌の膜に属さない蛋白質並びに
核酸を抽出除去する工程ｃ）は、例えば該ペレットを浸透圧の高い高張溶液（高
張抽出液）を添加したのと同等の抽出液、好ましくは１Ｍ近傍のモル濃度の食塩
水中で少なくとも１回洗浄し、所要の抽出効果を得るに充分な接触時間の後に得
られた懸濁液を遠心分離し、この遠心分離で得られた上澄液を分離することによ
って実施することができ、この洗浄サイクルは数回反復してもよい。

【００１８】工程ｃ）で得られた膜ペレットを酵素分解処理する工程ｄ）は、例えばトリプ
シンやキモトリプシン、或いは蛋白質分解活性を有する任意の既知酵素などの蛋
白質分解酵素の溶液の存在下で実施することができ、反応条件、すなわち溶液の
ｐＨ、反応温度及び反応時間は、好ましくは選択した酵素の活性に最適な条件と
なるように調整し、次いで遠心分離を行うが、この酵素分解処理のサイクルは、
実施する各分解処理サイクルで同一の酵素、同一の酵素の組み合わせ、或いは異
なる酵素を用いて複数回反復することも可能である。

【００１９】工程ｄ）で得たペレットを洗浄する工程ｅ）は、該ペレットを生理的食塩水又
は蒸留水中に取り、充分な接触時間の後に遠心分離することで実施行われ、この
洗浄サイクルも複数回反復することが可能である。

【００２０】最後に、ペレットを超音波処理する工程ｆ）は、特に工程ｅ）の終了時点で得
られた膜分画を物理的に分解してホモジェネートとするための工程である。この
超音波処理の条件（処理時間及び超音波の強度）は、当業者であれば例えば処理
対象の膜分画の量に応じて決定することができる。

【００２１】本発明による使用の別の特別な実施形態では、前記膜分画を以下の工程、すな
わち、ａ）前記細菌をその生育に適した培地中で培養し、次いで選択的に培養菌を遠
心分離する工程と、ｂ）工程ａ）で得た培地又は菌体ペレットを凍結せしめ、その後これを解凍し
て菌細胞を乾燥させる工程と、ｃ）工程ｂ）で得た乾燥菌細胞を再懸濁したうえでＤＮアーゼにより該乾燥菌
細胞から核酸を除去する工程と、ｄ）工程ｃ）で得た菌細胞を磨砕し、得られた懸濁液を清澄化する工程と、ｅ）工程ｄ）で得た懸濁液を酸性媒質中で沈殿処理し、ペレットを除去する工
程と、ｆ）工程ｅ）で得た膜懸濁物を含む上澄液を中和し、次いでこの膜懸濁液を透
析して濃縮する工程と、ｇ）工程ｆ）で得た濃縮膜懸濁液を滅菌する工程、とを備えた方法によって調整することを特徴としている。

【００２２】この方法の工程ｂ）における下記の解凍条件はもちろん当業者によって処理対
象のペレットの初期量に応じて決定され得るものであるが、例えば乾燥菌細胞１
ｋｇ当たり好ましくは４℃で48時間以上の条件で実施すればよい。

【００２３】工程ｃ）における核酸の除去は、例えば乾燥菌細胞５％相当する濃度の細胞懸
濁液に対し、ＤＮアーゼを最終濃度５mg／mlとなるように加えることによって行
われる。

【００２４】工程ｃ）で得た細胞の摩砕は、細胞磨砕の分野の当業者に公知の任意のシステ
ム又は装置を使用して、例えば圧搾、又は好ましくはマントン・ガウリン（Mant
on Gaulin）ループ中で30分間磨砕する等の方法で実施することができる。

【００２５】磨砕後に得られる懸濁液の清澄化処理は、菌細胞磨砕物の清澄化技術に通暁し
た当業者に公知の任意のシステム又は装置（例えばシャープレスシステムなど）
を使用して実施することができる。

【００２６】工程ｄ）で得た懸濁液を酸性媒質中で沈殿処理する工程ｅ）は、例えば酢酸を
用いて実施することができる。沈殿処理に続いてペレットをシャープレス・タイ
プのシステムで除去し、上澄液を回収する。

【００２７】工程ｆ）は、酸性媒質中における沈殿処理後に得られた上澄液を中和し、希釈
し、透析した後に濃縮する工程である。

【００２８】最後に、最終工程は前工程で得た膜分画濃縮液を例えば121℃で35分間加熱す
ることによって滅菌する工程である。

【００２９】本発明による使用の特別な実施形態は、前記膜分画がSEQ ID No.2のアミノ酸
配列を有するKlebsiella pneumoniaeの蛋白質Ｐ40、又はその断片の一つである
ことを特徴とする。

【００３０】ここで、特に「蛋白質Ｐ40断片」とは、蛋白質Ｐ40のアミノ酸配列に含まれる
アミノ酸配列をもち、非特異的免疫応答を増強する作用及び／又は抗腫瘍性の免
疫応答を誘発する作用を有する少なくとも５個、好ましくは10個以上、更に好ま
しくは15個以上のアミノ酸からなる断片を意味するものと理解される。

【００３１】もちろん、上記蛋白質Ｐ40又はその断片は化学合成によって得ることもでき、
或いはまた組換えペプチドの形で得ることも可能である。

【００３２】本発明による使用の別の実施形態では、前述の抗原又はハプテンがウィルス、
細菌、糸状菌又は寄生虫のような感染性病原体に特異的な抗原又はハプテン、或
いは腫瘍細胞に関連する抗原から選ばれていることを特徴としている。

【００３３】このような抗原又はハプテンは、本発明によれば好ましくはペプチド類、リポ
ペプチド類、多糖類、オリゴ糖類、核酸、脂質、又はその他の化合物であって感
染性病原体に特異的な抗原又はハプテン、或いは腫瘍細胞に関連する抗原に対す
るTh1型応答及び／又はTh1/Th2混合型応答に向けて免疫応答を特異的に指向させ
ることのできる化合物から選ばれる。

【００３４】もちろん、上記抗原又はハプテンは、それがペプチドの性格を有するものであ
る場合には、化学合成或いは遺伝子組換え合成によって得ることができる。

【００３５】組換えペプチドの調製法は今日では当業者には充分に知られており、従って本
明細書中では詳しく述べることはしない。これら遺伝子組換えペプチドの生産に
使用できる細胞としては、もちろん細菌の細胞（Olins P.O. 及び Lee S.C., 19
93, 「大腸菌における異種遺伝子の発現に関する近年の進歩（Recent advances
in heterologous gene expression in E. coli）」、Curr. Op. Biotechnology
4: 520-525頁参照）を挙げることができるが、その他にも、酵母の細胞（Buckho
lz R.G., 1993,「異種遺伝子の所産を発現せしめるための酵母システム（Yeast
Systems for the Expression of Heterologous Gene Products）」、Curr. Op.
Biotechnology, 4: 538-542頁参照）や、動物細胞、特に哺乳動物の培養細胞（E
dwards C.P. 及び Aruffo A., 1993, 「COS細胞を用いる一時的発現システムの
現在の応用（Current application of COS cell based transient expression s
ystems）」、Curr. Op. Biotechnology, 4, 558-563頁参照）、更には昆虫の細
胞も挙げることができる。昆虫細胞の場合、使用される方法は、例えばバキュロ
ウィルスを用いたものであっても良い（Luckow V.A., 1993, 「ヒト遺伝子所産
の発現に用いられるバキュロウィルス・システム（Baculovirus systems for th
e expression of human gene pro- ducts）」、Curr. Op. Bio- technology, 4,
564-572頁参照）。

【００３６】本発明による使用の更に別の実施形態では、前記抗原又はハプテンが、前記膜
分画と化学的に結合もしくは混合、特に該膜分画中に含まれる化合物の１種以上
と共有結合されていることを特徴としている。

【００３７】本発明による使用の更に別の好ましい実施形態においては、前記抗原又はハプ
テンが支持ペプチドと共有結合して哺乳動物の血清アルブミンと特異的に結合可
能な複合体を形成しており、この支持ペプチドは好ましくは連鎖球菌のＧ蛋白質
から誘導される断片、特にカルボキシル末端を有するBBと呼ばれる断片であるこ
とを特徴とする。

【００３８】前記複合体は、遺伝子組換えで調製可能であることは述べるまでもない。

【００３９】係るキメラ複合体即ちハイブリッド複合体は、蛋白質の性質を有する前記抗原
又はハプテンをエンコードする配列を連鎖球菌Ｇ蛋白質の前記ペプチド断片をエ
ンコードするＤＮＡ配列にＤＮＡ組換え技術によって挿入もしくは付加すること
によって作成することができる。

【００４０】ハイブリッド分子の合成法には、遺伝子操作において所望のポリペプチド配列
をエンコードするハイブリッドポリヌクレオチドを組み立てるために使用されて
いる方法がある。その参考文献としては、例えば融合蛋白質をエンコードする遺
伝子を作る技術に関するものとして、D.V. Goeddelによる「遺伝子発現技術、酵
素学における方法（Gene expression technology, Methods in Enzymology）, V
ol.185, 3-187頁, 1990年）を参照すると良い。

【００４１】本発明によれば、前記共有結合は化学合成によって実施可能である。本発明の
特に好適な実施形態においては、１つ以上の連結要素を前記膜分画及び／又は前
記抗原又はハプテンに導入して化学的結合を促進することが可能である。

【００４２】この場合、導入する前記連結要素は好ましくはアミノ酸である。

【００４３】本発明によれば、１つ以上の連結要素、特別にはアミノ酸を導入して膜分画の
化合物と前記抗体又はハプテンとの間の結合反応を促進することが可能である。
膜分画に含まれる化合物と抗原又はハプテンとの間の本発明による共有結合は、
抗体又はハプテンが例えばペプチド性のものである場合は膜分画の化合物或いは
抗体又はハプテンのアミノ末端（Ｎ末端）もしくはカルボキシル末端（Ｃ末端）
において達成可能である。この結合を可能とする２官能の試薬は、結合のために
選ばれた末端基と、結合対象の抗体又はハプテンの性質に応じて決定される。

【００４４】本発明による使用の更に別の実施形態では、前記抗体、ハプテン、又は複合体
がペプチドの性格を有するものであり、該抗体、ハプテン、又は複合体と、膜分
画に含まれる少なくとも１種の化合物との間の結合が遺伝子組み替えによって行
われることを特徴とする。

【００４５】前記抗体、ハプテン又は複合体と、膜分画に含まれる少なくとも１種の化合物
との間の結合は、実際に遺伝子組み替えによって行うことができる。例えば、前
記グラム陰性菌を膜分画の抽出前に目標とする抗原又は前記複合体をエンコード
する核酸構造を含むベクターによって形質転換せしめ、かくして形質転換した細
菌がその膜に付着又は固定した目的の抗原又は前記複合体を発現するようにする
ことができる。このように、膜に付着した組換え型蛋白質を発現させる技術は周
知であり、またこの技術では、例えばシグナルペプチド型の配列のような特定の
調節シーケンスが必要とされる。

【００４６】本発明による使用の更に別の実施形態では、前記医薬組成物が、前記抗原、ハ
プテン又は複合体と結合している前記膜分画を、例えば水中油型又は油中水型の
エマルションの形態、或いはリポソーム型、マイクロスフェア型、ナノスフェア
型、もしくは前記抗原、ハプテン又は複合体と結合している前記膜分画をマイク
ロカプセル化して微粒子の形で存在せしめ得るようなその他のいかなる構造形態
など、安定性及び／又は免疫原性を高めることのできる形態で担持可能とする成
分を付加的に含んでいることを特徴としている。

【００４７】本発明による使用の更に別の実施形態は、前記成分が、アルミニウム塩類、カ
ルシウム塩類、Quil A又はサポニンのような植物起原の化合物、或いはコレラ、
百日咳又は破傷風トキソイドや易熱性大腸菌毒素のような細菌類起原の化合物か
ら選ばれていることを特徴とする。

【００４８】本発明による使用の別の好適な実施形態は、前記医薬組成物が、前記抗原、ハ
プテン又は複合体と結合している前記膜分画によって誘発される免疫応答を調節
可能とする成分を付加的に含んでいることを特徴とする。

【００４９】この調節用成分としては、サイトカイン、成長因子、ホルモン、或いは核酸、
熱ショック蛋白質類に属する蛋白質、又はリボソームのような細胞成分から選ば
れたものを用いることが特に好ましい。

【００５０】本発明による使用の更に別の実施形態によれば、ウィルス、細菌、糸状菌又は
寄生虫に起因する感染症の予防又は治療向けの医薬組成物、或いは癌、特に腫瘍
が腫瘍関連抗原と関連している癌の予防又は治療向けの医薬組成物の調製のため
の使用も提供される。

【００５１】ウィルスに起因する感染症としては、特にパラミキソウィルス類、特にパライ
ンフルエンザウィルス、更に特別にはＲＳウィルス(RSV)を特に好適な対象とし
て挙げることができる。

【００５２】本発明による使用の特に好適な実施形態においては、前記膜分画と結合してい
る抗原が、SEQ ID No.4のアミノ酸配列を有するウィルスのＧ蛋白質断片であるG
2Naペプチド、又はSEQ ID No.4のアミノ酸配列とのアライメント後のアミノ酸配
列がSEQ ID No.4と80％以上、好ましくは90％、95％、更に好ましくは99％以上
の同一度を示すG2Naペプチドの相同体、或いは連鎖球菌Ｇ蛋白質のＣ末端断片(B
B)と共有結合して哺乳動物の血清アルブミンと結合可能な複合体を形成している
G2Naペプチド又はその相同体の一つであることを特徴としており、上記ペプチド
BBについては、1997年のパワー(Power)らによる文献(Virology, 230, 155-166頁
)及び国際公開公報WO96/14416に記述されている通りである。

【００５３】本発明において、２種の核酸配列又はアミノ酸配列間の「同一度」「同一パー
セント」又は「同一レベル」などの表現は、比較される２種の配列間における最
適アラインメント後の配列位置が同一のヌクレオチド又はアミノ酸残基の百分率
評価を意味する。この百分率は純粋に統計学的なものであり、２種の配列間の相
違部分は核酸又はペプチド分子の全長に亘ってランダムに分布している。このよ
うな２種の核酸配列又はアミノ酸配列間の比較は、これらの配列を最適な方法で
アラインメントした後に伝統的な手法、例えばセグメント又は「比較ウィンドウ
」によって配列の局部領域の同一性を確認したり、類似性を比較したりして行わ
れる。比較を行うための配列の最適アラインメントは手動操作で行っても良く、
或いはスミス−ワットマンによる局部的相同性検索アルゴリズム［Smith and Wa
terman; Ad. App. Math. 2, (1981) 482頁］や、ニードルマン−ワンシュによる
局部相同性検索アルゴリズム［Neddleman and Wunsch; J. Mol. Biol. 48, (197
0) 443頁］や、パーソン−リップマンによる類似度の検索法［Pearson and Lipm
an; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 (1988) 2444頁］や、或いはこれらアルゴ
リズムを使用するコンピュータ・ソフトウェア (ウィスコンシン・ジェネティク
ス・ソフトウエア・パッケージ中のGAP, BESTFIT, FASTA 及びTFASTA; Genetics
Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI, 又は比較ソフトウェア・パ
ッケージ BLAST N か BLAST P）などのいずれを使用して行っても良い。

【００５４】２種の核酸配列又はアミノ酸配列間の百分率同一度は、これら２種の配列を最
適にアラインメントし、比較ウィンドウによりカウントすることによって決定さ
れる。比較ウィンドウ内で比較されるべき核酸配列又はアミノ酸配列には、これ
ら２種の配列間の最適アラインメントのための基準配列に対して付加又は欠失が
含まれても良い。百分率同一度は、２種の配列間でヌクレオチド残基又はアミノ
酸残基が同一の部位の数を決定してこの同一部位の数を比較ウィンドウ内にある
部位の総数で割り、その商に１００を乗じることによって％の単位で表す値とし
て計算される。

【００５５】この目的で例えばBLASTシリーズのプログラム「BLAST 2 sequence」を使用す
ることができ、これは http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/b12.html のサイト
から入手可能で、使用されるパラメータ（特にオープンギャップペナルティ＝５
、エクステンションギャップペナルティ＝２、鋳型テンプレート＝例えばプログ
ラムで提案されている"BLOSUM 62"）はデフォルトで与えられており、比較すべ
き２種の配列間の百分率同一度はプログラムによって直接的に計算される。

【００５６】本発明はまた、グラム陰性菌、特にKlebsiella pneumoniaeの膜分画を調製す
る方法に関するものであり、この方法は、以下の工程、即ち、ａ）前記細菌をその生育に適した培地中で培養し、次いで培養菌を遠心分離す
る工程と、ｂ）工程ａ）で得た菌体ペレット中の分解酵素を失活せしめ、得られた懸濁液
を遠心分離する工程と、ｃ）工程 a) 又は工程ｂ）で得た菌体ペレットから、抽出液中での該ペレット
の少なくとも１回の洗浄によって、膜に属さない蛋白質並びに核酸を抽出除去す
る工程と、ｄ）工程ｃ）で得た膜ペレットを蛋白質分解酵素の存在下で分解処理し、次い
で遠心分離する工程と、ｅ）工程ｄ）で得たペレットを生理食塩水及び／又は蒸留水中で少なくとも１
回洗浄する工程と、ｆ）工程ｅ）で得たペレットを超音波処理する工程、とを備えたことを特徴とする。

【００５７】本発明は更に、グラム陰性菌、特にKlebsiella pneumoniaeの膜分画を調製す
る方法も包含し、この方法は、以下の工程、即ち、ａ）前記細菌をその生育に適した培地中で培養し、次いで選択的に培養菌を遠
心分離する工程と、ｂ）工程ａ）で得た培地又は菌体ペレットを凍結せしめ、その後これを解凍し
て菌細胞を乾燥させる工程と、ｃ）工程ｂ）で得た乾燥菌細胞を再懸濁したうえでＤＮアーゼにより該乾燥菌
細胞から核酸を除去する工程と、ｄ）工程ｃ）で得た菌細胞を磨砕し、得られた懸濁液を清澄化する工程と、ｅ）工程ｄ）で得た懸濁液を酸性媒質中で沈殿処理し、ペレットを除去する工
程と、ｆ）工程ｅ）で得た膜懸濁物を含む上澄液を中和し、次いでこの膜懸濁液を透
析して濃縮する工程と、ｇ）工程ｆ）で得た濃縮膜懸濁液を滅菌する工程、とを備えたことを特徴とする。

【００５８】これら二つの方法のいずれかで得ることのできる膜分画は、実際に本発明の一
部を構成するものである。

【００５９】これらの方法によって得ることのできる膜分画中のプロテオグリカン、すなわ
ちFMKpの有効成分の含有量はガラクトース含有量と蛋白質含有量の合計で表わさ
れ、これらは好ましくは下記の範囲内である。ガラクトース含有量：1.2 g/l〜3.4 g/l 蛋白質含有量：7.5 g/l〜14.9 g/l

【００６０】更に好ましくは下記の範囲である。ガラクトース含有量：1.6 g/l〜2.6 g/l 蛋白質含有量：9.3 g/l〜11.7 g/l

【００６１】更に本発明は、本発明による方法によって得られる膜分画を含有する医薬組成
物にも関連し、好ましくはこの医薬組成物は、前記膜分画に結合している前述の
抗原、ハプテン又は複合体、特にパラミキソウィルスに特異的なウィルス抗原又
は複合体、或いは腫瘍関連細胞に関連を持つ抗原を付加的に含んでいる。

【００６２】このような本発明による医薬組成物は、前述のビヒクルた調節成分などの付加
的な成分を含有していても良い。

【００６３】好適な一実施形態において、本発明による医薬組成物は、前記膜分画と結合し
ている抗原が、SEQ ID No.4の配列を有するＲＳウィルスのG2Naペプチド又はそ
の相同体の一つ、或いは該G2Naペプチド又はその相同体であって連鎖球菌のＧ蛋
白質のカルボキシル末端断片(BB)と共有結合して哺乳動物の血清アルブミンと結
合可能な複合体を形成しているものを含有していることを特徴とする。

【００６４】以下に説明する図面並びに実施例に示した例は本発明を例示するためのもので
あって、本発明の技術的範囲をいかなる形にせよ限定するものではない。

【００６５】実施例１：K. pneumoniaeの膜分画(FMKp)の製造方法１：遠心分離で得たペレットからK. pneumoniae I145株の膜成分を抽出する前に、
例えばペレットを場合によっては付加的に再溶解して溶液としたうえで100℃に
加熱することによりペレット中に得られている膜成分中の分解酵素を失活させる
工程を先行させることが好ましい。

【００６６】好適には、遠心分離ペレットからの膜成分の実際の抽出は、必要に応じて分解
酵素を失活させたうえで該ペレットの菌細胞成分を食塩水（例えば１Ｍ塩化ナト
リウム溶液）で１回もしくは複数回処理し、次いで得られた懸濁液を好ましくは
20,000 gで遠心分離することによって行う。この遠心分離によって除去される上
澄液は蛋白質や核酸等の膜成分以外の不純物を含み、ペレット側には膜成分が含
まれている。

【００６７】不純物を含む食塩水を分離した後、膜成分を蛋白質分解酵素、好ましくはトリ
プシン及びキモトリプシンの存在下、溶液中にてｐＨ８、37℃で４時間の酵素分
解処理に付す。

【００６８】酵素分解処理の後、溶液を超音波処理で均質化（ホモジェネート）する。かく
して得られる生成物がFMKpと称する膜分画を構成する。

【００６９】得られた上清を再び同じ条件下で、好適には140,000ｇで遠心分離にかける。

【００７０】膜糖ペプチドの調製：この分画は、40,000 gで30分間の遠心分離で得たペレットから調製した。この
ペレットを生理的食塩水に再懸濁し、この懸濁液を沸騰水浴上、100℃で10分間
加熱して分解酵素を失活させた。冷却後、20,000 gで30分間の遠心分離によって
媒質を除去し、得られたペレットを１ＭのNaClで２回抽出し、蛋白質及び核酸を
除去した。20,000 gで30分間の遠心分離により膜成分を回収した。

【００７１】次いで、それら膜成分を、トリプシンを用いてｐＨ８、37℃で4時間の分解処
理に付し、更にキモトリプシンを用いて同一条件の処理を行った。

【００７２】次に2,000 gで30分間の遠心分離を行って膜成分を回収し、生理食塩水で洗浄
した後、更に蒸留水で洗浄し、15分間に亘って超音波による磨砕処理を行った。

【００７３】方法２： +4℃で48時間以上の解凍処理を行った後、１kgのK. pneumoniae乾燥細胞を溶
液中に乾燥細胞濃度が５％となるように再懸濁させ、この再懸濁液に５mg/lのＤ
Ｎアーゼを加えた。次いでマントン・ガウリン・ループによる磨砕処理を30分間
行い、シャープレス・システムを用いて処理速度50 l/hで清澄化処理を行った後
に酢酸を加え、ｐＨ＝4.2＋0.1で30分間の沈殿処理を行った。ペレットを除去（
シャープレス・システムで処理速度25 l/h）し、上澄液を中和してから浸透処理
済の水で最初の容量の２倍に希釈した。次いでPUF 100によって800Ωcmまで定容
透析を行った後、得られた膜懸濁液(MS)を濃縮して乾燥細胞１kg当たり11リット
ルの濃度とした。その後、オートクレーブによりMSを＋121℃で35分間加圧滅菌
し、＋4℃で6週間保存した。

【００７４】 FMKpの特性：当然のことながら、FMKpの有効成分の一つであるプロテオグリカンの含有量は
ガラクトース含有量と蛋白質含有量との合計に等しい。ガラクトース含有量：平均 2.2 g/l 蛋白質含有量：平均10.5 g/l

【００７５】実施例２：組換え蛋白質BBG2Naに対するFMKpのアジュバント効果 BBG2Naは大腸菌によって産生される組換え蛋白質である。これは、Ａ型のＲＳ
ウィルス(RSV)の残基130から残基230まで延在する断片であり、SEQ ID No.4の配
列を有するG2Naペプチドに連鎖球菌のＧ蛋白質断片であるBBが融合したものであ
って、血清アルブミンと結合する能力を持つ。BBG2Naは、抗RSVワクチンの一つ
である（Power U., Virology 1997, 230: 155-166頁参照）。

【００７６】 BALB/c系列のマウスに、20μgのBBG2Naと種々の量のFMKpを皮下注射によって
２回投与した。28日経過後(D28)に血液サンプルを採取し、血清の抗体力価を固
相中にてELISAによりG2Naを用いて測定した。得られた結果を図１に示す。驚く
べきことに、これらの結果は、FMKpが抗G2Na性IgG応答を統計学的に有意のレベ
ルで増強することを示している。すなわち、到達した抗G2Na性IgG力価は、ミョ
ウバン或いはフロイントのアジュバントで誘導される力価と同程度である。アジ
ュバント効果は用量に従って変化する。効果はFMKp＝５μgから認められ、FMKp
が50μg以上で最大値となり、FMKp＝100μgまでそのレベルを安定に維持する。
従って、FMKpはBBG2Naに対する有効なアジュバントであることが判る。

【００７７】免疫応答、換言すればTh1/Th2応答の指向性に対するFMKpの調節作用を確認す
るために、上述のようにして採取した血清サンプルについて抗G2Na性のIgG1及び
IgG2aの各力価を測定した。その結果（図２）は、驚くべきことに、FMKpには抗G
2Na性免疫グロブリンのIgG1/IgG2a比を改変する能力があり、これは、ミョウバ
ンの場合の結果、即ちIgG1のアイソタイプが卓越しているのと対照的である。こ
のプロファイルは、フロイントのアジュバントによって誘導されるものに近似し
ている。このことは、FMKpが混合型(Th1/Th2)応答を誘発するための免疫アジュ
バントとして使用できることを示している。

【００７８】上述のようにして免疫を与えたマウスに、鼻からの経路で10^５のTCID_５０濃度
のRSV-Aウィルスによるウィルス感染テストを行った。このテストは、最後の免
疫付与処理の３週間後に実施した。ウィルス感染テスト開始から５日後にマウス
を屠殺し、肺を取り出してRSV-A力価を測定した。その結果（図３）は、FMKpを
アジュバントとして用いたBBGaNaで処理されたマウスがRSV-Aウィルスの感染か
ら防護されていることを示している。

【００７９】結論として、FMKpは、マウスをRSV-Aウィルスの感染から防護する能力を損な
うことなく抗体産生応答の指向性を調節可能にするものである。

【００８０】実施例３：不活性化ウィルス（インフルエンザワクチン）に対するFMKpのアジュ
バント効果 BALB/c系列のマウスに0.01μgのイムグリップ（Immugrip：商標、ラボラトリ
ーズ・イネイバ（Laboratoires INAVA）が市販しているインフルエンザワクチン
）と、種々の量のFMKpを１回注射した。これらの製品は同時に投与した。注射は
、Ｄ０（０日目）に皮下注射で行った。血液サンプルをＤ７（７日経過）とＤ１
４（１４日経過）とＤ２１（２１日経過）にそれぞれ採取した。血清中の抗イム
グリップ性IgG抗体の力価をELISAにより２μg/mlのイムグリップを使用して固相
中で測定した。得られた結果（図４）は、FMKpが抗イムグリップ性抗体の力価を
統計学的に有意のレベルで増強することを示しており、しかもこの増強はFMKpの
最小用量、すなわち0.1μgから認められる。アジュバント効果は用量に従って変
化する。興味深いのは、FMKpが存在する場合はアジュバントなしのイムグリップ
を投与した対照群に比べて早期の抗体応答発生が誘発され、Ｄ７からそれが得ら
れることが認められることである。この効果は、対照アジュバントである完全フ
ロイントアジュバント(CFA)を用いた場合には得られないものである。

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】 FMKpをアジュバントとしたBBG2Naの用量と応答（血清中の抗G2Na IgG の力価
）の測定結果を示すグラフであり、図中＊印は、ｐ＜0.05、即ち、PBS群との比
較で95％を越える有意差が認められた場合を示す。

【図２】 FMKpをアジュバントとしたBBG2Naの抗 G2Na IgG1 及び同IgG2aの力価の測定結
果を示すグラフである。

【図３】 FMKpをアジュバントとしたBBG2Naの防護効果の実験結果を示すグラフである。

【図４】市販インフルエンザワクチン"Immugrip"（商標名）に対するFMKpのアジュバン
ト効果を示すグラフであり、図中＊印は、ｐ＜0.05、即ち、同じ試料採取日のア
ジュバント不使用群 (FMKp＝０)との比較で95％を越える有意差が認められた場
合を示す。

【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書

【提出日】平成１３年３月１６日（２００１．３．１６）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】請求項１

【補正方法】変更

【補正の内容】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｋ 39/155 Ａ６１Ｋ 47/48 ４Ｈ０４５ 47/48 Ａ６１Ｐ 31/00 Ａ６１Ｐ 31/00 31/04 31/04 31/10 31/10 31/12 31/12 33/00 33/00 35/00 35/00 37/02 37/02 Ｃ１２Ｎ 1/20 ＥＣ１２Ｎ 1/20 Ｃ０７Ｋ 19/00 // Ｃ０７Ｋ 19/00 Ｃ１２Ｒ 1:22 (Ｃ１２Ｎ 1/20 Ａ６１Ｋ 37/02 Ｃ１２Ｒ 1:22） (72)発明者グエン、ティエン・ゴクフランス国、74160 サン・ジュリアン・アン・ジェネボワ、レ・ペティ・ウタン・ラトイ７ (72)発明者ベック、アランフランス国、74160 コロンジェ・スー・サルブ、ルート・デュ・ポワリエ・ア・ラーン 503 (72)発明者ボンフォワ、ジャン・イヴフランス国、74350 レ・サピー、レ・ノワーイェ（番地無し) Ｆターム(参考） 4B065 AA29X BD01 BD11 BD15 BD17 BD44 CA45 4C076 AA17 CC03 CC07 CC27 CC31 CC32 CC34 CC35 CC41 EE59 4C084 AA02 BA41 CA01 DC50 MA02 MA05 NA01 NA14 ZB261 ZB262 ZB331 ZB332 ZB351 ZB352 ZB371 ZB372 4C085 AA38 BA57 BB11 CC07 CC08 FF16 4C087 AA01 AA02 AA03 BC36 BC83 CA09 MA02 MA05 NA01 NA14 ZB26 ZB33 ZB35 ZB37 4H045 AA11 AA20 AA30 BA40 CA01 DA86 EA31 GA01 GA15

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】免疫応答を目標の抗原又はハプテンに対して指向性をもつTh
1型応答及び／又はTh1/Th2混合型応答へ指向させるための医薬組成物の調製にお
ける前記抗原又はハプテンと結合したKlebsiella pneumoniaeの膜分画の使用。
【請求項２】前記膜分画が、少なくとも２種の異なる菌株の膜分画からな
ることを特徴とする請求項１に記載の使用。
【請求項３】前記膜分画を、ａ）前記細菌をその生育に適した培地中で培養し、次いでその培養菌を遠心分
離する工程と、ｂ）工程ａ）で得た菌体ペレット中の分解酵素を失活せしめ、得られた懸濁液
を遠心分離する選択的な工程と、ｃ）工程 a) 又は工程ｂ）で得た菌体ペレットから、抽出液中での該ペレット
の少なくとも１回の洗浄によって、膜に属さない蛋白質並びに核酸を抽出除去す
る工程と、ｄ）工程ｃ）で得た膜ペレットを蛋白質分解酵素の存在下で分解処理し、次い
で遠心分離する工程と、ｅ）工程ｄ）で得たペレットを生理食塩水及び／又は蒸留水中で少なくとも１
回洗浄する工程と、ｆ）工程ｅ）で得たペレットを超音波処理する工程、とを含む方法により調製することを特徴とする請求項１又は２に記載の使用。
【請求項４】前記膜分画を、ａ）前記細菌をその生育に適した培地中で培養し、次いで選択的に培養菌を遠
心分離する工程と、ｂ）工程ａ）で得た培地又は菌体ペレットを凍結せしめ、その後これを解凍し
て菌細胞を乾燥させる工程と、ｃ）工程ｂ）で得た乾燥菌細胞を再懸濁したうえでＤＮアーゼにより該乾燥菌
細胞から核酸を除去する工程と、ｄ）工程ｃ）で得た菌細胞を磨砕し、得られた懸濁液を清澄化する工程と、ｅ）工程ｄ）で得た懸濁液を酸性媒質中で沈殿処理し、ペレットを除去する工
程と、ｆ）工程ｅ）で得た膜懸濁物を含む上澄液を中和し、次いでこの膜懸濁液を透
析して濃縮する工程と、ｇ）工程ｆ）で得た濃縮膜懸濁液を滅菌する工程、とを含む方法により調製することを特徴とする請求項１又は２に記載の使用。
【請求項５】前記抗原またはハプテンが、感染性因子の１種に特異的な抗
原又はハプテン、或いは腫瘍細胞に関連する抗原から選ばれていることを特徴と
する請求項１〜４のいずれか１項に記載の使用。
【請求項６】前記抗原又はハプテンが、ペプチド類、リポペプチド類、多
糖類、オリゴ糖類、核酸、脂質、又はそれら以外の化合物であって免疫応答を感
染性因子に特異的な抗原又はハプテン或いは腫瘍細胞に関連する抗原に対して指
向性をもつTh1型応答及び／又はTh1/Th2混合型応答へ向けて特異的に指向させ得
る化合物から選ばれていることを特徴とする請求項５に記載の使用。
【請求項７】前記抗原又はハプテンが、前記膜分画と結合又は混合されて
いることを特徴とする請求項１〜６のいずれか１項に記載の使用。
【請求項８】前記抗原又はハプテンが、支持ペプチドと共有結合して哺乳
動物の血清アルブミンと特異的に結合可能な複合体を形成していることを特徴と
する請求項１〜７のいずれか１項に記載の使用。
【請求項９】支持ペプチドが、連鎖球菌のＧ蛋白質から誘導されたペプチ
ド断片であることを特徴とする請求項８に記載の使用。
【請求項１０】前記複合体を遺伝子組換えによって調製することを特徴と
する請求項８又は９に記載の使用。
【請求項１１】前記抗原又はハプテン或いは複合体が、前記膜分画に含ま
れる少なくとも１種の化合物と共有結合されていることを特徴とする請求項７〜
１０のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１２】共有結合が化学合成によって行われた結合であることを特
徴とする請求項１１に記載の使用。
【請求項１３】前記膜分画内及び／又は前記抗原又はハプテン或いは複合
体内に含まれる少なくとも一つの化合物に、化学結合反応を促進するために一つ
以上の連結要素が導入されていることを特徴とする請求項１２に記載の使用。
【請求項１４】導入された連結要素がアミノ酸であることを特徴とする請
求項１３に記載の使用。
【請求項１５】前記抗原、ハプテン又は複合体と、前記膜化合物とがペプ
チドの性質を有するものである場合に、該抗原、ハプテン又は複合体と、該膜分
画に含まれる少なくとも一つの化合物との間の結合を遺伝子組換えによって行う
ことを特徴とする請求項１１に記載の使用。
【請求項１６】医薬組成物が、その安定性及び／又は免疫原性を向上でき
る形態で、前記抗原、ハプテン又は複合体と結合している前記膜分画を担持可能
とする成分を付加的に含んでいることを特徴とする請求項１〜１５のいずれか１
項に記載の使用。
【請求項１７】前記成分が水中油型又は油中水型のエマルションの形態で
あることを特徴とする請求項１６に記載の使用。
【請求項１８】前記成分が、リポソーム型、マイクロスフェア型又はナノ
スフェア型の粒子、或いは前記抗原、ハプテン又は複合体と結合している前記膜
分画をマイクロカプセル化して微粒子状形態で存在せしめ得るその他の構造形態
の粒子であることを特徴とする請求項１６に記載の使用。
【請求項１９】前記成分が、アルミニウム塩類、カルシウム塩類、Quil A
又はサポニンのような植物起原の化合物、或いはコレラ、百日咳又は破傷風トキ
ソイドや易熱性大腸菌毒素のような細菌類起原の化合物から選ばれていることを
特徴とする請求項１６に記載の使用。
【請求項２０】医薬組成物が、前記抗原、ハプテン又は複合体と結合して
いる前記膜分画によって誘発される免疫応答を調節可能とする成分を付加的に含
んでいることを特徴とする請求項１〜１９のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２１】前記調節用成分が、サイトカイン、成長因子、ホルモン、
或いは核酸、熱ショック蛋白質類に属する蛋白質、又はリボソームのような細胞
成分から選ばれていることを特徴とする請求項２０に記載の使用。
【請求項２２】感染症又は癌の予防又は治療向けの医薬組成物の調製にお
ける請求項１〜２１のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２３】感染症が、ウィルス、細菌、糸状菌又は寄生虫に起因する
ものであることを特徴とする請求項２３に記載の使用。
【請求項２４】パラミキソウィルス感染の予防又は治療向けの医薬組成物
の調製における請求項２３に記載の使用。
【請求項２５】パラミキソウィルスが、ＲＳウィルスであることを特徴と
する請求項２４に記載の使用。
【請求項２６】前記膜分画と結合している抗原が、SEQ ID No.4の配列を
有するG2Naペプチド、又はその配列がSEQ ID No.4と80％以上の同一度を示す該
ペプチドの相同体の一つであることを特徴とする請求項２５に記載の使用。
【請求項２７】前記G2Naペプチド又はその相同体が、連鎖球菌のＧ蛋白質
のカルボキシル末端断片(BB)と共有結合して哺乳動物の血清アルブミンと結合可
能な複合体を形成していることを特徴とする請求項２６に記載の使用。
【請求項２８】パラミキソウィルスがパラインフルエンザウィルスである
ことを特徴とする請求項２４に記載の使用。
【請求項２９】請求項３又は４のいずれかで特定された方法により調製さ
れた膜分画と、該膜分画に結合した抗原又はハプテンとを含有することを特徴と
する医薬組成物。
【請求項３０】抗原がパラミキソウィルスのペプチド断片から選ばれてい
ることを特徴とする請求項２９に記載の医薬組成物。
【請求項３１】パラミキソウィルスがＲＳウィルス又はパラインフルエン
ザウィルスであることを特徴とする請求項３０に記載の医薬組成物。
【請求項３２】膜分画と結合した前記抗原が、SEQ ID No.4の配列を有す
るＲＳウィルスのG2Naペプチド、又はその配列がSEQ ID No.4の配列と80％以上
の同一度を示すペプチドであることを特徴とする請求項３１に記載の医薬組成物
。
【請求項３３】前記G2Naペプチド又はその相同体の一つが、連鎖球菌のＧ
蛋白質のカルボキシル末端断片(BB)と共有結合して哺乳動物の血清アルブミンと
結合可能な複合体を形成していることを特徴とする請求項３２に記載の医薬組成
物。