JPS59186921A - 免疫原性複合物 - Google Patents
免疫原性複合物Info
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- JPS59186921A JPS59186921A JP58195132A JP19513283A JPS59186921A JP S59186921 A JPS59186921 A JP S59186921A JP 58195132 A JP58195132 A JP 58195132A JP 19513283 A JP19513283 A JP 19513283A JP S59186921 A JPS59186921 A JP S59186921A
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- proteins
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- A61K39/39—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the immunostimulating additives, e.g. chemical adjuvants
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- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
- A61K2039/55511—Organic adjuvants
- A61K2039/55555—Liposomes; Vesicles, e.g. nanoparticles; Spheres, e.g. nanospheres; Polymers
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、抗原性蛋白質と、ウィルス、マイコゾラズマ
、バクテリア、寄生虫または動物細胞からのベプチVと
のあいだの免疫原性複合物つまりいわゆるイスコム(i
scom )に関する。本発明はまた、それらの製造方
法およびそれらを免疫刺激剤およびワクチンとして用い
ることに関する。
、バクテリア、寄生虫または動物細胞からのベプチVと
のあいだの免疫原性複合物つまりいわゆるイスコム(i
scom )に関する。本発明はまた、それらの製造方
法およびそれらを免疫刺激剤およびワクチンとして用い
ることに関する。
死滅ウィルスたとへばインフレンザウイルスはすぐれた
抗原効果を有することが知られている。
抗原効果を有することが知られている。
しかしそれらは、かなりに精製したあとでさえも発熱的
である。防禦免疫性を誘導するに重要である成分を分け
ることにより発熱効果を避けられたが、免疫原性はしば
しば十分に強くはなくなる。
である。防禦免疫性を誘導するに重要である成分を分け
ることにより発熱効果を避けられたが、免疫原性はしば
しば十分に強くはなくなる。
それで免疫反応を増加さすためには、分離された抗原(
サブユニット)を含有するそれらのワクチンに適当なア
ジュバントを導入せねばならない。
サブユニット)を含有するそれらのワクチンに適当なア
ジュバントを導入せねばならない。
他方、有効なアジュバントは、これまで用いられた方式
では、マイナスの副作用をおこす。アジュバント含有ワ
クチンは、それで、発熱をおこす点では、全ウィルスを
基礎とするワクチンと同様に具合悪いのである。
では、マイナスの副作用をおこす。アジュバント含有ワ
クチンは、それで、発熱をおこす点では、全ウィルスを
基礎とするワクチンと同様に具合悪いのである。
免疫原性を増加さすために、リボゾームの表面に捕捉さ
れているかまたは結合されていた、デタージエントで取
り出された膜蛋白質が製造された( BPO願7940
0 B 3.0 )。
れているかまたは結合されていた、デタージエントで取
り出された膜蛋白質が製造された( BPO願7940
0 B 3.0 )。
ブタ−ジャントを除いた、リボゾーム中膜蛋白質はσ5
P4148876に記載されている。デタージエント不
含の単一ラメラのリポチーム生成物中にアジュバントを
添加することは、σsp4 19S 191に記載さ
れている(その効果について報告はない〕。σ5p41
17113Fi、ウィルス抗原を含有する、マイナスに
荷電したりポゾームを記載している。インフルエンザ赤
血球凝集素およびノイラミニダーゼを含有するりポゾー
ム中にアジュバントとしてマイコバクテリアの細胞壁を
加えると、よりすぐれた免疫反応を与える。
P4148876に記載されている。デタージエント不
含の単一ラメラのリポチーム生成物中にアジュバントを
添加することは、σsp4 19S 191に記載さ
れている(その効果について報告はない〕。σ5p41
17113Fi、ウィルス抗原を含有する、マイナスに
荷電したりポゾームを記載している。インフルエンザ赤
血球凝集素およびノイラミニダーゼを含有するりポゾー
ム中にアジュバントとしてマイコバクテリアの細胞壁を
加えると、よりすぐれた免疫反応を与える。
ジフテリアトキソイrを含有するマイナスに帯電したり
ポゾームに死滅結核菌、°百日咳菌およびサポニンのよ
うなアジュバントヲ加えると、やはりよりよい免疫反応
が得られた(trsp 4053585)。
ポゾームに死滅結核菌、°百日咳菌およびサポニンのよ
うなアジュバントヲ加えると、やはりよりよい免疫反応
が得られた(trsp 4053585)。
しかし、上記した脂質含有膜蛋白質生成物はすべて、長
期保存、凍結乾燥または不注意な扱いたとべば高温で不
安定である。
期保存、凍結乾燥または不注意な扱いたとべば高温で不
安定である。
デタージエント不含および脂質不含の蛋白質ミセルもま
たワクチンとして生産された。Sθn+LikiFor
e日tウィルス(SFV )の膜蛋白質のミセルがSF
Vに対する循環抗体の形成を刺激しそして8FVによる
胎児感染に対してマウスを保護する。他方、バラインア
レンデー6−ウィルスの膜蛋白質は、ミセルに油アジュ
バントを混合しないと、羊における抗体形成を刺激しな
いし、肺炎をおこすPニー3−培賽物の投与に対して保
護しない。オイルアトシュバントは、感染部位において
、局所的反応の形で副作用をおこすのがふつうである。
たワクチンとして生産された。Sθn+LikiFor
e日tウィルス(SFV )の膜蛋白質のミセルがSF
Vに対する循環抗体の形成を刺激しそして8FVによる
胎児感染に対してマウスを保護する。他方、バラインア
レンデー6−ウィルスの膜蛋白質は、ミセルに油アジュ
バントを混合しないと、羊における抗体形成を刺激しな
いし、肺炎をおこすPニー3−培賽物の投与に対して保
護しない。オイルアトシュバントは、感染部位において
、局所的反応の形で副作用をおこすのがふつうである。
(EPC願81102213.6)。
本発明の目的はこれらの欠点を避け、高い免疫原性を有
し、副作用のない貯蔵に安定な膜蛋白質複合物を提供す
ることである。このことは、蛋白質の疎水性領域と、ウ
ィルス、マイコプラズマ細菌、動物細胞または寄生虫よ
りのベゾチドとのあいだの脂質不含複合物を用いて達成
される。この複合物は、1種または1種より多くの配糖
体の添加で製造される。これらの新規複合物は、配糖体
無添加で生ずる相当する蛋白質ミセルとは別の電顕下で
の形態学的構造を有する。これらのミセルは放射状に配
列されたスパイクを有する緊密な中心コアを有するが、
本発明による複合物は、円状サブユニットまたは球状構
造の部分より成立つ開放球状構造を有している。本発明
の複合物およびその部分は、また、相当するミセルより
より低い沈降定数(第1図をみよ)を有し、そして、蛋
白質またはペプ′チドの相当する単量体形より高い沈降
定数を有する。
し、副作用のない貯蔵に安定な膜蛋白質複合物を提供す
ることである。このことは、蛋白質の疎水性領域と、ウ
ィルス、マイコプラズマ細菌、動物細胞または寄生虫よ
りのベゾチドとのあいだの脂質不含複合物を用いて達成
される。この複合物は、1種または1種より多くの配糖
体の添加で製造される。これらの新規複合物は、配糖体
無添加で生ずる相当する蛋白質ミセルとは別の電顕下で
の形態学的構造を有する。これらのミセルは放射状に配
列されたスパイクを有する緊密な中心コアを有するが、
本発明による複合物は、円状サブユニットまたは球状構
造の部分より成立つ開放球状構造を有している。本発明
の複合物およびその部分は、また、相当するミセルより
より低い沈降定数(第1図をみよ)を有し、そして、蛋
白質またはペプ′チドの相当する単量体形より高い沈降
定数を有する。
配糖体を添加して製造した本発明による複合物は、配糖
体無添加で製造される相当する蛋白質ミセル、または蛋
白質分子と可溶化剤(単量体形)または脂質たとへばビ
ロソームに結合した蛋白質分子よりすぐれた免疫原性を
有する。それで膜蛋白質の投与量は、約l/1oまたは
以下に減少させうる。
体無添加で製造される相当する蛋白質ミセル、または蛋
白質分子と可溶化剤(単量体形)または脂質たとへばビ
ロソームに結合した蛋白質分子よりすぐれた免疫原性を
有する。それで膜蛋白質の投与量は、約l/1oまたは
以下に減少させうる。
配糖体の疎水性領域と結合させる疎水性領域を有する蛋
白質またはペゾチri A)エンベロープを有するウィルス、バクテリア、マイ
コプラズマ細菌虫または動物細胞よりの膜蛋白質または
膜ペゾチドに由来するがそれら自体である、親水性およ
び疎水性の基をする両親媒性の蛋白質またはペプチド、
またはバイブIJ P DNA技術で生ずるそのような
蛋白質またはペプチv1または合成で生ずるそのような
分子、 B)親水性蛋白質捷たはペプチドに疎水性基を結合させ
て生成させた両親媒性のもの。それらの蛋白質またはペ
プチドは、ウィルス、バクテリア、マイコプラズマ、寄
生虫に由来しうるし、またはハイプリp DNA技術で
合成またけ採取しうるOC)親水性蛋白質の到達され得
ない疎水性の部分を化学的手段により到達しつるように
した両親媒性蛋白質またはペプテV0それらの蛋白質は
上記したような微生物または細胞に由来しうるし、また
はハイ\デリドDNA技術で得られる、または、合成さ
れたものでありうる。
白質またはペゾチri A)エンベロープを有するウィルス、バクテリア、マイ
コプラズマ細菌虫または動物細胞よりの膜蛋白質または
膜ペゾチドに由来するがそれら自体である、親水性およ
び疎水性の基をする両親媒性の蛋白質またはペプチド、
またはバイブIJ P DNA技術で生ずるそのような
蛋白質またはペプチv1または合成で生ずるそのような
分子、 B)親水性蛋白質捷たはペプチドに疎水性基を結合させ
て生成させた両親媒性のもの。それらの蛋白質またはペ
プチドは、ウィルス、バクテリア、マイコプラズマ、寄
生虫に由来しうるし、またはハイプリp DNA技術で
合成またけ採取しうるOC)親水性蛋白質の到達され得
ない疎水性の部分を化学的手段により到達しつるように
した両親媒性蛋白質またはペプテV0それらの蛋白質は
上記したような微生物または細胞に由来しうるし、また
はハイ\デリドDNA技術で得られる、または、合成さ
れたものでありうる。
複合物の調製
a)全細胞に由来する膜蛋白質または膜ペプチドの調製
に関しては、複合物は原則的に6段階で調製する。動物
細胞または微生物またはそれらの断片を精製し;疎水性
の蛋白質を可溶化し可溶化剤を除き、同時に、免疫原性
の形状(免疫原性複合物)の、複合物とした望む抗原を
配糖体を用いて移す0 精製および分離 ウィルス、マイコプラズマ、細菌、寄生虫および動物細
胞を既知の方法(たとへば、’TheTOO18of
Biochemistry、霞 T、G、 C!0
Oper、 JOhn Wi1e7 &5ons (
1977) New yorkをみよ、;ct−t、−
+本明細書の参照文献として引用する)、たとへばゲル
濾過または糖グラジェントを通しての遠心またはpθr
cO1を通してのグラジェント遠心またはホロウ ファ
バー ファイアライシス(hol’low fl’be
rflalysis )で濃縮しそして精製する。細菌
では、たとへば超音波またはフレンチプレス処理で細胞
壁をまず融解または破壊するのが有利である。たとへば
、本明細書の参考文献として引用する、0ota−Ro
bles and Eltein、 OROHandb
ook ofMlcroJology VOI II
(1973)、833−844頁をみよ。
に関しては、複合物は原則的に6段階で調製する。動物
細胞または微生物またはそれらの断片を精製し;疎水性
の蛋白質を可溶化し可溶化剤を除き、同時に、免疫原性
の形状(免疫原性複合物)の、複合物とした望む抗原を
配糖体を用いて移す0 精製および分離 ウィルス、マイコプラズマ、細菌、寄生虫および動物細
胞を既知の方法(たとへば、’TheTOO18of
Biochemistry、霞 T、G、 C!0
Oper、 JOhn Wi1e7 &5ons (
1977) New yorkをみよ、;ct−t、−
+本明細書の参照文献として引用する)、たとへばゲル
濾過または糖グラジェントを通しての遠心またはpθr
cO1を通してのグラジェント遠心またはホロウ ファ
バー ファイアライシス(hol’low fl’be
rflalysis )で濃縮しそして精製する。細菌
では、たとへば超音波またはフレンチプレス処理で細胞
壁をまず融解または破壊するのが有利である。たとへば
、本明細書の参考文献として引用する、0ota−Ro
bles and Eltein、 OROHandb
ook ofMlcroJology VOI II
(1973)、833−844頁をみよ。
可溶化
精製された動物細胞または微生物またはそれらのフラグ
メントを、非イオン性、イオン性または両性のイオン性
のデタージエント没食子酸をベースとするデタージエン
トの過剰と混合する。適当な非イオン性デタージエント
の代表的な例は、脂肪族または芳香脂肪族の酸およびア
ルコールを用いたポリグリコールエステルおよびポリグ
リコールエーテルである。これらの例は、 anH2n+1(OOH20H2)xOHの一般式のア
ルキルポリオキシエチレンエーテル(CnEXと略記)
;アルキル基とポリオキシエチレン鎖とのあいだにフェ
ニル環ヲ含有するアルキルフェニルポリオキシエチレン
エーテル(CnPEXと略記〕、たとへばTriton
X−100=3級−08E91.6 (ポリエチレンオ
キサイPのオクチルフェノールエーテル)、アシルポリ
オキシエチレンエステル;アシルポリオキシエチレンソ
ルビタンエステル(CnソルビタンEXト略記)たとえ
ばTween 2 D XTVθen80、β−D−ア
ルキルグルコシPたとへばβ−D−オクチルグルコシr
がある。下記する配糖体、特にサポニンも用いうる。し
かし、これらは弱いデタージエントで、他のデタージエ
ントとあわせて用いるべきである。適当なイオン性のデ
タージエントの代表的な例駕としては、没食子酸デター
ジエントたとへばデソキシコレートおよびコレートがあ
る。
メントを、非イオン性、イオン性または両性のイオン性
のデタージエント没食子酸をベースとするデタージエン
トの過剰と混合する。適当な非イオン性デタージエント
の代表的な例は、脂肪族または芳香脂肪族の酸およびア
ルコールを用いたポリグリコールエステルおよびポリグ
リコールエーテルである。これらの例は、 anH2n+1(OOH20H2)xOHの一般式のア
ルキルポリオキシエチレンエーテル(CnEXと略記)
;アルキル基とポリオキシエチレン鎖とのあいだにフェ
ニル環ヲ含有するアルキルフェニルポリオキシエチレン
エーテル(CnPEXと略記〕、たとへばTriton
X−100=3級−08E91.6 (ポリエチレンオ
キサイPのオクチルフェノールエーテル)、アシルポリ
オキシエチレンエステル;アシルポリオキシエチレンソ
ルビタンエステル(CnソルビタンEXト略記)たとえ
ばTween 2 D XTVθen80、β−D−ア
ルキルグルコシPたとへばβ−D−オクチルグルコシr
がある。下記する配糖体、特にサポニンも用いうる。し
かし、これらは弱いデタージエントで、他のデタージエ
ントとあわせて用いるべきである。適当なイオン性のデ
タージエントの代表的な例駕としては、没食子酸デター
ジエントたとへばデソキシコレートおよびコレートがあ
る。
複合デタージエントたとへばタウロデオキシコレート、
グリコデオキシコレートおよびグリココレートもまた用
いうる。可能な両性イオンデタージエントはリソレシチ
ンおよび合成リソホスホリぎドである。上記のデクージ
エントの混合物も用いうる。
グリコデオキシコレートおよびグリココレートもまた用
いうる。可能な両性イオンデタージエントはリソレシチ
ンおよび合成リソホスホリぎドである。上記のデクージ
エントの混合物も用いうる。
7/l/コール、有機溶媒または小型の両媒性分子だト
へはヘプタン−1,2,3−)リオール、ヘキサン−1
,2,3−)リオール、酢酸、水溶性ペプチドおよび蛋
白質またはそれらの混合物も、または、デタージエント
との混合物も可溶化に用いうる。
へはヘプタン−1,2,3−)リオール、ヘキサン−1
,2,3−)リオール、酢酸、水溶性ペプチドおよび蛋
白質またはそれらの混合物も、または、デタージエント
との混合物も可溶化に用いうる。
脂質および疎水性蛋白質の量に比して過剰に可溶化剤を
用いる。細胞または微生物とデタージエントとを1対3
から1対100重量比に混合するのが適当である。
用いる。細胞または微生物とデタージエントとを1対3
から1対100重量比に混合するのが適当である。
細胞または微生物と可溶化剤とは、緩衝化された、でき
れば、塩溶液中で混合する。塩溶液のそル濃度は、0.
02から0.5Mのあいだ、なるべくは0.05から0
.25 Mのあいだとするが、0.1−0.2Mが有利
である。ヂタージエントは室温で約1時間作用さすべき
である。
れば、塩溶液中で混合する。塩溶液のそル濃度は、0.
02から0.5Mのあいだ、なるべくは0.05から0
.25 Mのあいだとするが、0.1−0.2Mが有利
である。ヂタージエントは室温で約1時間作用さすべき
である。
塩としては塩化ナトリウムが有利である0他の塩もまた
考えうる。特に、アルカリイオン、アルカリ土金属イオ
ンおよびアンモニウムイオンと強鉱酸および有機酸だと
へは酢酸、トリクロル酢酸、ギ酸およびシュウ酸との塩
がある。緩衝液として、PH6,5−9で緩衝作用のあ
るすべての物質が適当である。コレートおよびデスオキ
シコレートを用いる時にはPH8−9が有利である。イ
オン性でないデタージエントを用いる時には、PH7,
4である。
考えうる。特に、アルカリイオン、アルカリ土金属イオ
ンおよびアンモニウムイオンと強鉱酸および有機酸だと
へは酢酸、トリクロル酢酸、ギ酸およびシュウ酸との塩
がある。緩衝液として、PH6,5−9で緩衝作用のあ
るすべての物質が適当である。コレートおよびデスオキ
シコレートを用いる時にはPH8−9が有利である。イ
オン性でないデタージエントを用いる時には、PH7,
4である。
免疫原性複合物の調製
細胞捷たは微生物を可溶化すると、可溶化剤と細胞また
は微生物フラグメントの混合物を生ずる。
は微生物フラグメントの混合物を生ずる。
フラグメントのうちには、可溶化剤と複合物を形成した
、疎水性の領域を有する、帯電した単量体性抗原性蛋白
質が存在する。本発明に準する新規免疫原性複合物は、
1種または1種より多くの配糖体の存在か、配糖体に直
接に移すことにより、−帯電単量体性抗原性蛋白質を可
溶化剤より分けることにより生成させる。なは、この配
糖体は、疎水性および親水性結合を有し、少なくとも、
臨界ミセル濃度で存在せねばならない。フラグメントの
残りは、本発明による複合物が形成されるより前にか、
形成中、または形成後、なるべくは形成前に除去する。
、疎水性の領域を有する、帯電した単量体性抗原性蛋白
質が存在する。本発明に準する新規免疫原性複合物は、
1種または1種より多くの配糖体の存在か、配糖体に直
接に移すことにより、−帯電単量体性抗原性蛋白質を可
溶化剤より分けることにより生成させる。なは、この配
糖体は、疎水性および親水性結合を有し、少なくとも、
臨界ミセル濃度で存在せねばならない。フラグメントの
残りは、本発明による複合物が形成されるより前にか、
形成中、または形成後、なるべくは形成前に除去する。
本発明による複合物は、可溶化剤と、帯電単量体性抗原
性蛋白質と、そして存在するかも知れぬ他のフラグメン
トとの混合物より、たとへば透析、rル瀞過またはクロ
マトグラフィーにより可溶化剤を除去するか、または、
グラジェント遠心、クロマトグラフィー、電気泳動のよ
うなもので、混合物より、帯電、単量体性抗原性蛋白質
を分離することにより製造しうる。本発明の不可欠の特
徴は、ミセル形として存在せねばならない配糖体の存在
で単量体性抗原性蛋白質を可溶化剤より分離するか、ま
たは、蛋白質を分けてからしかに配糖体に移すことであ
る。配糖体と直接的に接触するように、単量体性抗原性
蛋白質を可溶化剤より分ける時に、本発明に準する特殊
の複合物を生成する。配糖体のミセル形が接合物形成の
ためのベースになり、複合体のミセル上の疎水性領域と
膜蛋白質上の疎水性部分とのあいだの引合で複合物が生
成すると考えられる。複合物中の配糖体の量は、用いた
配糖体および複合物に結合した蛋白質の量で変動し、0
.5から50重量%、特に0.5から25重量%、なる
べくは、0.5から15重量%、しばしば0.5から1
0重量%とする。そして、特に、2から8重量%とする
。荷電抗原性単量体性蛋白質を、配糖体の存在しない状
態で可溶化剤から分けると、EPC願81102213
.6により生成するような型の蛋白質ミセルを生ずる。
性蛋白質と、そして存在するかも知れぬ他のフラグメン
トとの混合物より、たとへば透析、rル瀞過またはクロ
マトグラフィーにより可溶化剤を除去するか、または、
グラジェント遠心、クロマトグラフィー、電気泳動のよ
うなもので、混合物より、帯電、単量体性抗原性蛋白質
を分離することにより製造しうる。本発明の不可欠の特
徴は、ミセル形として存在せねばならない配糖体の存在
で単量体性抗原性蛋白質を可溶化剤より分離するか、ま
たは、蛋白質を分けてからしかに配糖体に移すことであ
る。配糖体と直接的に接触するように、単量体性抗原性
蛋白質を可溶化剤より分ける時に、本発明に準する特殊
の複合物を生成する。配糖体のミセル形が接合物形成の
ためのベースになり、複合体のミセル上の疎水性領域と
膜蛋白質上の疎水性部分とのあいだの引合で複合物が生
成すると考えられる。複合物中の配糖体の量は、用いた
配糖体および複合物に結合した蛋白質の量で変動し、0
.5から50重量%、特に0.5から25重量%、なる
べくは、0.5から15重量%、しばしば0.5から1
0重量%とする。そして、特に、2から8重量%とする
。荷電抗原性単量体性蛋白質を、配糖体の存在しない状
態で可溶化剤から分けると、EPC願81102213
.6により生成するような型の蛋白質ミセルを生ずる。
含有される成分の沈降定数は、細胞フラグメント、本発
明に準する可溶化剤との蛋白質複合物、単量体蛋白質そ
して可溶化剤の順で減少するので、他の7ラグメントを
グラジェント遠心で分けるのが適当である。それで可溶
化剤と、単量体性蛋白質と、他のフラグメントとの混合
物より、グシコシドを添加するより前に他のフラグメン
トを除きそして可溶化剤はたとへば透析、ゲル濾過、ク
ロマトグラフィーで除くか、または、単量体性蛋白質を
、たとへは電気泳動、クロマトグラフィーまたはグラジ
ェント遠心で除く。後者の方法では、複合物が形成され
ているので、同じグラジェント遠心のあいだに他のフラ
グメントを除くこともできる。上記により複合物が形成
されたあとで、たとへば遠心、アフイニテイクロマトグ
ラフイー、分子ふるいまたはゲル濾過で他の細胞成分を
分けることもできる。
明に準する可溶化剤との蛋白質複合物、単量体蛋白質そ
して可溶化剤の順で減少するので、他の7ラグメントを
グラジェント遠心で分けるのが適当である。それで可溶
化剤と、単量体性蛋白質と、他のフラグメントとの混合
物より、グシコシドを添加するより前に他のフラグメン
トを除きそして可溶化剤はたとへば透析、ゲル濾過、ク
ロマトグラフィーで除くか、または、単量体性蛋白質を
、たとへは電気泳動、クロマトグラフィーまたはグラジ
ェント遠心で除く。後者の方法では、複合物が形成され
ているので、同じグラジェント遠心のあいだに他のフラ
グメントを除くこともできる。上記により複合物が形成
されたあとで、たとへば遠心、アフイニテイクロマトグ
ラフイー、分子ふるいまたはゲル濾過で他の細胞成分を
分けることもできる。
配糖体は疎水性および親水性の領域を有するいずれの配
糖体でもよい。なるべくは、W、 Herz。
糖体でもよい。なるべくは、W、 Herz。
H,Grisebach、 G、 W、 Kirby刊
、Fortschritteder Ohemie O
rganischer Naturstoffe、 V
ol、 3 Q(1973)所載のR,Tschesc
heおよびWulfによる(!hemie、und B
iologie der 8aponineに記載のサ
ポニン、特に極性の強いサポニン、主に、極性トリテル
ペンサポニン、つまり極性酸性ビスデスモサイf (b
isdesmosides )たとへば、Quilla
jabarkAraloside Aよりのサポニン抽
出物、0hikoset111usaponin I′
V、 0alendula Glycoside O。
、Fortschritteder Ohemie O
rganischer Naturstoffe、 V
ol、 3 Q(1973)所載のR,Tschesc
heおよびWulfによる(!hemie、und B
iologie der 8aponineに記載のサ
ポニン、特に極性の強いサポニン、主に、極性トリテル
ペンサポニン、つまり極性酸性ビスデスモサイf (b
isdesmosides )たとへば、Quilla
jabarkAraloside Aよりのサポニン抽
出物、0hikoset111usaponin I′
V、 0alendula Glycoside O。
(+hikusetsueaponin V、 A
Chyranthes−8aponin B。
Chyranthes−8aponin B。
calendula−Glycoside A、 Ar
aloside B、 AralosideC!、 P
utranjia−8apon ■、 Bersama
saponoside。
aloside B、 AralosideC!、 P
utranjia−8apon ■、 Bersama
saponoside。
Putranjia−Elaponin rv、 Tr
ichoside A、 TrichosideB、
5aponastae A、 Trichoside
O,Gypsoside。
ichoside A、 TrichosideB、
5aponastae A、 Trichoside
O,Gypsoside。
Nutanoside、 Dianth081deC,
5aponaside D、なるべくは、Aescul
ue hippocaetanumよりのaescin
e (T、 PattおよびW、 Winlkler
: ])a8therapeutisCh wirks
ame Pr1nzip der Rosskasta
nie(Aeeculus hippocaetan
um )、 Arzneimittelforsc
hunglo(4)、273−275(1960)また
はGypsophilla struthium (R
,Vochten、 P、 JoosおよびR,Ruy
ssen : Physicochemical pr
opertiesof 5apoalbin and
their relation to the foa
mstability、 J、Pharm Be1g
42 、213−226(1963)、特にQ、uil
laja eaponaria Mo1inaよりサポ
ニン抽出物、主にに、 ])alθgaard :5a
ponin Aajuvants、 Bull off
工nt Epiz 77(7−8)、1289−129
5(1972)により製造のDQ、−抽出物、K、 D
a18gaara : 5aponinAdjuvan
ts ■、 Archiv fur die Gee
amteVirusforschung44 、243
−、254 (1974)により製造されるQuilA
がある。また配糖体の混合物も用いる。添加する配糖体
の量は、それらの臨界ミセル形成濃度(OMO)の少な
くとも1から6倍、なるべくは少なくとも5倍、特に少
なくとも7から12倍とする。この場合、配糖体は、膜
蛋白質の単量体形に結合しこれを捕捉とすると仮定され
る。なるべくは、0.03重量%の臨界ミセル形成濃度
を有するQuit Aを用いる。それで、Quil A
CD量は少々くとも0.02重量%、特に0.05−
0.5重量%、なるべくは0.2重量%とする。配糖体
についての上記引用を文献として引用する。
5aponaside D、なるべくは、Aescul
ue hippocaetanumよりのaescin
e (T、 PattおよびW、 Winlkler
: ])a8therapeutisCh wirks
ame Pr1nzip der Rosskasta
nie(Aeeculus hippocaetan
um )、 Arzneimittelforsc
hunglo(4)、273−275(1960)また
はGypsophilla struthium (R
,Vochten、 P、 JoosおよびR,Ruy
ssen : Physicochemical pr
opertiesof 5apoalbin and
their relation to the foa
mstability、 J、Pharm Be1g
42 、213−226(1963)、特にQ、uil
laja eaponaria Mo1inaよりサポ
ニン抽出物、主にに、 ])alθgaard :5a
ponin Aajuvants、 Bull off
工nt Epiz 77(7−8)、1289−129
5(1972)により製造のDQ、−抽出物、K、 D
a18gaara : 5aponinAdjuvan
ts ■、 Archiv fur die Gee
amteVirusforschung44 、243
−、254 (1974)により製造されるQuilA
がある。また配糖体の混合物も用いる。添加する配糖体
の量は、それらの臨界ミセル形成濃度(OMO)の少な
くとも1から6倍、なるべくは少なくとも5倍、特に少
なくとも7から12倍とする。この場合、配糖体は、膜
蛋白質の単量体形に結合しこれを捕捉とすると仮定され
る。なるべくは、0.03重量%の臨界ミセル形成濃度
を有するQuit Aを用いる。それで、Quil A
CD量は少々くとも0.02重量%、特に0.05−
0.5重量%、なるべくは0.2重量%とする。配糖体
についての上記引用を文献として引用する。
可溶化剤よりの荷電単葉体性抗原性蛋白質の分離は、遠
心、透析電気泳動および種々のクロマトグラフ法で実施
した。
心、透析電気泳動および種々のクロマトグラフ法で実施
した。
遠心法
上記のように製造したフラグメント化された細胞または
微生物と可溶化剤との混合物は、グラジェント遠心する
。つまり、糖グラジェントまたはグリセロールのグラジ
ェントまたはメトライズアミrのグラジェントまたは重
金属塩たとへばC,、C1(つまりグラジェント材料と
して作用する、適当な密度、粘度を有する比較的に不活
性の物質)のグラジェント、たとへば糖のグラジェント
では下記の濃度のような、配糖体含有グラジェントの存
在する、可溶色剤含有、糖または塩の溶液の上部に重ね
る。
微生物と可溶化剤との混合物は、グラジェント遠心する
。つまり、糖グラジェントまたはグリセロールのグラジ
ェントまたはメトライズアミrのグラジェントまたは重
金属塩たとへばC,、C1(つまりグラジェント材料と
して作用する、適当な密度、粘度を有する比較的に不活
性の物質)のグラジェント、たとへば糖のグラジェント
では下記の濃度のような、配糖体含有グラジェントの存
在する、可溶色剤含有、糖または塩の溶液の上部に重ね
る。
グラジェント系は少なくとも100.000 gで遠心
する。糖としては、グルコースのような単糖類、乳糖、
果糖、しよ糖のよりな三糖類だけでなく、三糖類、四糖
類およびグリセリンを用いうる〇グラジェント中の糖濃
度は、適当には、最初の濃度(グラジェントの最上部)
は、少なくとも5、なるべくは15−255重量%し、
そして、最終濃度(グラジェントの最下部)は少なくと
も20゜なるべくは45−60重量%とする。グラジェ
ントは、たとへば5−25重量%糖含量の上層および2
0−60重量%糖含量の下層より成立ちりんしかし、い
くつかの層が存在してもよく、その際は、個々の層のあ
いだの濃度差は相応して減少させる。糖グラジェントに
は配糖体または配糖体の混合物を含有させる。配糖体の
量は、Q、uilAの臨界ミセル形成濃度の少なくとも
1−3、なるべくは少なくとも7−12倍で、少なくと
も0.02、特に少なくとも0.05−0.5、なるべ
くは少なくとも0.2重量%とする。この配糖体含有グ
ラジェント中で、可溶化剤は分離され、可溶化剤と蛋白
質とのあいだの複合物は蛋白質と配糖体とのあいだの複
合物に転換される。
する。糖としては、グルコースのような単糖類、乳糖、
果糖、しよ糖のよりな三糖類だけでなく、三糖類、四糖
類およびグリセリンを用いうる〇グラジェント中の糖濃
度は、適当には、最初の濃度(グラジェントの最上部)
は、少なくとも5、なるべくは15−255重量%し、
そして、最終濃度(グラジェントの最下部)は少なくと
も20゜なるべくは45−60重量%とする。グラジェ
ントは、たとへば5−25重量%糖含量の上層および2
0−60重量%糖含量の下層より成立ちりんしかし、い
くつかの層が存在してもよく、その際は、個々の層のあ
いだの濃度差は相応して減少させる。糖グラジェントに
は配糖体または配糖体の混合物を含有させる。配糖体の
量は、Q、uilAの臨界ミセル形成濃度の少なくとも
1−3、なるべくは少なくとも7−12倍で、少なくと
も0.02、特に少なくとも0.05−0.5、なるべ
くは少なくとも0.2重量%とする。この配糖体含有グ
ラジェント中で、可溶化剤は分離され、可溶化剤と蛋白
質とのあいだの複合物は蛋白質と配糖体とのあいだの複
合物に転換される。
糖グラジェントの頂部には、可#fヒ剤または可溶化剤
の混合物を含有する、糖または重金属塩の溶液の層を存
在させる。脂質はこの層の中に残存する。この層中の可
溶化剤の濃度は、用いた、微生物または細胞と可溶化剤
との混合物中での濃度より低いかまたは同じとし、適当
には、0.12から3重量%まで、なるぺ<Fio、7
5から1.5重量%とする。1重量%が有利である。糖
または塩濃度はグラジェントの上層中の濃度と同じかま
たは低くしうる。
の混合物を含有する、糖または重金属塩の溶液の層を存
在させる。脂質はこの層の中に残存する。この層中の可
溶化剤の濃度は、用いた、微生物または細胞と可溶化剤
との混合物中での濃度より低いかまたは同じとし、適当
には、0.12から3重量%まで、なるぺ<Fio、7
5から1.5重量%とする。1重量%が有利である。糖
または塩濃度はグラジェントの上層中の濃度と同じかま
たは低くしうる。
少なくとも16時間、少なくとも100.000gで、
200Cでなるべくは20時間遠心したあと、蛋白質性
の分画を集め緩衝液(0,5Mから0.001M)なる
べくは0.005 M Tris−MCI 、 0.0
1 MNaCl、 pH7,4または0.2M酢酸アン
モニウム、PH7,0に対して透析し、そして、本明細
書の文献として引用するThe Tools of B
iOOheBloohe、 T、G。
200Cでなるべくは20時間遠心したあと、蛋白質性
の分画を集め緩衝液(0,5Mから0.001M)なる
べくは0.005 M Tris−MCI 、 0.0
1 MNaCl、 pH7,4または0.2M酢酸アン
モニウム、PH7,0に対して透析し、そして、本明細
書の文献として引用するThe Tools of B
iOOheBloohe、 T、G。
cooper編、John Wiley & 5ons
(New york1974)記載のような方法で、
たとへぼ、凍結乾燥、真空透析および超濾過で濃縮する
。遠心中にすべての成分が沈降し、その際、蛋白質と可
溶化剤との複合物より可溶化剤の結合がゆるみ、単量体
性蛋白質は配糖体に移されそれと複合物を形成する。つ
ぎの透析で糖を除く。
(New york1974)記載のような方法で、
たとへぼ、凍結乾燥、真空透析および超濾過で濃縮する
。遠心中にすべての成分が沈降し、その際、蛋白質と可
溶化剤との複合物より可溶化剤の結合がゆるみ、単量体
性蛋白質は配糖体に移されそれと複合物を形成する。つ
ぎの透析で糖を除く。
複合物は場合により、たとへば、25から60重量%の
糖、なるべくtI′i10から4o重量係のしよ糖を含
有する糖グラジェントとによるグラジェント遠心で遊離
配糖体よりさらに精製しつる。
糖、なるべくtI′i10から4o重量係のしよ糖を含
有する糖グラジェントとによるグラジェント遠心で遊離
配糖体よりさらに精製しつる。
透析法
上記のように細胞または微生物を精製したのち、そして
、上記の重量比に可溶化剤と混合したのち、上記した緩
衝液中の細胞と可溶化剤との混合物は、別様には、Q、
uilAの臨界ミセル形成濃度((!MC! )の少な
くとも1から、なるべくは7から12倍の、0.05−
2重量、なるべくは0.2重量%の配糖体と混合し、0
.5−0.001’M、なるべljo、005M Tr
is −HCl 、 Q、OI M NaC1、pH7
,4、特に0.2M酢酸アンモニウム緩衝液、pH7,
0に対して透析しうる。その結果、配糖体の存在で可溶
化剤を分離する。生成した膜蛋白質複合物は、上記の遠
心法の所に記載したようにして、配糖体添加物は除いて
、沈降グラジェント遠心で分離しうる。このようにして
他のフラグメントおよび遊離グリコシドより分ける。
、上記の重量比に可溶化剤と混合したのち、上記した緩
衝液中の細胞と可溶化剤との混合物は、別様には、Q、
uilAの臨界ミセル形成濃度((!MC! )の少な
くとも1から、なるべくは7から12倍の、0.05−
2重量、なるべくは0.2重量%の配糖体と混合し、0
.5−0.001’M、なるべljo、005M Tr
is −HCl 、 Q、OI M NaC1、pH7
,4、特に0.2M酢酸アンモニウム緩衝液、pH7,
0に対して透析しうる。その結果、配糖体の存在で可溶
化剤を分離する。生成した膜蛋白質複合物は、上記の遠
心法の所に記載したようにして、配糖体添加物は除いて
、沈降グラジェント遠心で分離しうる。このようにして
他のフラグメントおよび遊離グリコシドより分ける。
細胞および微生物と可溶化剤とを緩衝液中に含有する混
合物はまたグラジェント遠心しうる0たとへぼ、5−6
0重量係上記緩衝液中糖グラジェント、なるべくは10
−20重量%しよ゛糖グラジェント上に重層し、少なく
とも150.000 gで〈 少ル、とも20分、なるべくは250.0009で30
分遠心しうる。そのようにして他のフラグメントも、可
溶化剤と蛋白質との複合物より分けられる。
合物はまたグラジェント遠心しうる0たとへぼ、5−6
0重量係上記緩衝液中糖グラジェント、なるべくは10
−20重量%しよ゛糖グラジェント上に重層し、少なく
とも150.000 gで〈 少ル、とも20分、なるべくは250.0009で30
分遠心しうる。そのようにして他のフラグメントも、可
溶化剤と蛋白質との複合物より分けられる。
頂部分画と称する蛋白質性の上層液を抽出し、Qul
A のCMCの少なくとも1−3倍、なるべくは少なく
とも7−12倍、つ捷り0.05−0.5重量%、なる
べくは0.2重量%の配糖体を加え、0.5から0.0
01M、特に0.005Mの緩衝液に対し透析する。特
に、0.005 M Tri8−MCI 。
A のCMCの少なくとも1−3倍、なるべくは少なく
とも7−12倍、つ捷り0.05−0.5重量%、なる
べくは0.2重量%の配糖体を加え、0.5から0.0
01M、特に0.005Mの緩衝液に対し透析する。特
に、0.005 M Tri8−MCI 。
0.01 M MCI、 pH7,4、なるべくは0.
2M酢酸アンモニウムを用いる。可溶化剤は配糖体の存
在で除去する。上記遠心法の項の方法で沈降グラジェン
ト遠心してさらに精製しうるo 5−600重量なるべ
くは19から40i[E量チの糖グラジェントで遠心し
てさらに精製する。
2M酢酸アンモニウムを用いる。可溶化剤は配糖体の存
在で除去する。上記遠心法の項の方法で沈降グラジェン
ト遠心してさらに精製しうるo 5−600重量なるべ
くは19から40i[E量チの糖グラジェントで遠心し
てさらに精製する。
電気泳動法
別様には、フラグメント化微生物または細胞と可溶化剤
との混合物、または、混合物を緩衝液中5−60重量%
、なるべく1l−j、10−20重量%糖グラジェント
でグラジェント遠心して得られる蛋白質性頂部液(他の
フラグメントおよび遊離可溶化剤が除かれている)f可
溶化剤より電気泳動で分け、Quil AのOMOの少
なくとも1から6、なるべくは少なくとも7−12倍、
0.0’ 5−0.5重量%、なるべくは0.2重量%
の配糖体を含有する溶液に移す。このようにして、荷電
単量体性抗原性蛋白質を可溶化剤より分ける。電気泳動
による分離のためには、可溶剤−緩衝液溶液は、電気泳
動を妨害し過度の高温を発するような過剰の添加塩を含
有しないのが適当である0たとへば担体を用いるかまた
は用いないゾーン電気泳動および担体を用いるか用いな
いインタコホレーシスを用いうる0担体としては、ポリ
アクリルアミv1寒天、シリカデル、でんぷん、セルロ
ース、ポリ塩化ビニル、イオン交換体、セライトのよう
な担体を用いうる。遠心法の、The Tools o
f Biochemistry引用文献に記載のように
複合物を分離し濃縮しうる。遠心法の所に記載のグラジ
ェント遠心でも精製しうる。
との混合物、または、混合物を緩衝液中5−60重量%
、なるべく1l−j、10−20重量%糖グラジェント
でグラジェント遠心して得られる蛋白質性頂部液(他の
フラグメントおよび遊離可溶化剤が除かれている)f可
溶化剤より電気泳動で分け、Quil AのOMOの少
なくとも1から6、なるべくは少なくとも7−12倍、
0.0’ 5−0.5重量%、なるべくは0.2重量%
の配糖体を含有する溶液に移す。このようにして、荷電
単量体性抗原性蛋白質を可溶化剤より分ける。電気泳動
による分離のためには、可溶剤−緩衝液溶液は、電気泳
動を妨害し過度の高温を発するような過剰の添加塩を含
有しないのが適当である0たとへば担体を用いるかまた
は用いないゾーン電気泳動および担体を用いるか用いな
いインタコホレーシスを用いうる0担体としては、ポリ
アクリルアミv1寒天、シリカデル、でんぷん、セルロ
ース、ポリ塩化ビニル、イオン交換体、セライトのよう
な担体を用いうる。遠心法の、The Tools o
f Biochemistry引用文献に記載のように
複合物を分離し濃縮しうる。遠心法の所に記載のグラジ
ェント遠心でも精製しうる。
種々の荷電または重量の疎水性膜蛋白質が出発゛材料中
に存在するなら、電気泳動または遠心でそれらを相互に
分け、それらの複合物を分けうる。
に存在するなら、電気泳動または遠心でそれらを相互に
分け、それらの複合物を分けうる。
これの条件で種々の膜蛋白質の複合物を分けそして濃縮
しつる。
しつる。
クロマトグラフ法
可溶化蛋白質は、望むなら、細胞フラグメントより精製
したあとで、クロマトグラフ法で可溶化剤より分けつる
。抗原構造は、たとへばセルロース、アガロース、デキ
ストラン、アクリルアミドおよびガラスより成立ちつる
、子爵性の基体(マトリックス)に吸着される。マトリ
ックス構造には種々のリガンドを結合させる。すると分
離に用いうるような特異的構造となる0用いた可溶化剤
がマトリックス中を吸着されないで通過すると同時に、
ふつう、抗原構造が吸着される。ついで抗原を脱着する
。脱着段階で可溶化剤、塩および緩衝物質の交換がおこ
りうる。可溶化剤は配糖体でおき代えられ、複合物を生
成する。
したあとで、クロマトグラフ法で可溶化剤より分けつる
。抗原構造は、たとへばセルロース、アガロース、デキ
ストラン、アクリルアミドおよびガラスより成立ちつる
、子爵性の基体(マトリックス)に吸着される。マトリ
ックス構造には種々のリガンドを結合させる。すると分
離に用いうるような特異的構造となる0用いた可溶化剤
がマトリックス中を吸着されないで通過すると同時に、
ふつう、抗原構造が吸着される。ついで抗原を脱着する
。脱着段階で可溶化剤、塩および緩衝物質の交換がおこ
りうる。可溶化剤は配糖体でおき代えられ、複合物を生
成する。
イオン交換クロマトグラフィーにおいては、ジエチルア
ミンエタノール(DEAE )のような荷電液体分子を
マトリックスに結合させ陽イオン交換体に用いる。カル
ボキシルメチル(CM )またはリン酸塩(P)基をマ
トリックスに結合させ陰イオン交換体に用いる。抗原構
造と可溶化剤とのあいだの正味の荷電の差を用いて、こ
れらの分子を分ける。一般的に荷電は可溶化剤になく蛋
白質にある。K−またはNaC1のような塩のグラジェ
ントや可溶化剤の存在(濃度については上記可溶化の項
をみよ)でリン酸緩衝液でPHを調節して溶出する。
ミンエタノール(DEAE )のような荷電液体分子を
マトリックスに結合させ陽イオン交換体に用いる。カル
ボキシルメチル(CM )またはリン酸塩(P)基をマ
トリックスに結合させ陰イオン交換体に用いる。抗原構
造と可溶化剤とのあいだの正味の荷電の差を用いて、こ
れらの分子を分ける。一般的に荷電は可溶化剤になく蛋
白質にある。K−またはNaC1のような塩のグラジェ
ントや可溶化剤の存在(濃度については上記可溶化の項
をみよ)でリン酸緩衝液でPHを調節して溶出する。
溶出液に可溶化剤に代えて配糖体を加えるならば、溶出
において蛋白質を精製し、可溶化剤を交換し捷たは複合
物を生成させうる。ついで塩を透析で除く。
において蛋白質を精製し、可溶化剤を交換し捷たは複合
物を生成させうる。ついで塩を透析で除く。
ゲル濾過では、抗原構造より小さい可溶化蛋白質いあと
からでてくるようにする。イムノアフィニティークロマ
トグラフィーによると、抗体は、上記のマ) IJラッ
クス非可逆的に結合させ得、そのあと、抗体に独特の親
和性および特異性を抗原の精製に用いる。可溶化剤の抗
体への親和性はない。溶出は温和な変性によりおこなう
。たとへは、可溶化剤または配糖体の存在でpHを約4
に減少させる。
からでてくるようにする。イムノアフィニティークロマ
トグラフィーによると、抗体は、上記のマ) IJラッ
クス非可逆的に結合させ得、そのあと、抗体に独特の親
和性および特異性を抗原の精製に用いる。可溶化剤の抗
体への親和性はない。溶出は温和な変性によりおこなう
。たとへは、可溶化剤または配糖体の存在でpHを約4
に減少させる。
レクチンクロマトグラフィーではレクチンを用いる。レ
クチンは特異的な糖基と可逆的に反応しうる1群の蛋白
質で、たとへば糖蛋白質を結合しうる。レクチンをリガ
ンドとしてたとへば5epharose (Pharm
acia 、 crppsala )に結合さすか、適
当なマトリックスに結合させた市販品を用いる。デター
ヅエント(可溶化剤)は固定レクチンに親和性を有しな
い。吸着された抗原は、メチルff[たとへばメチルマ
ンノシド、メチルグルコシrまたはN−アセチルグリコ
サミンを、可溶化剤または配糖体の存在で緩衝剤塩溶液
中に溶解したものを用いて容易に脱着しうる〇 コバレントクロマトグラフイーでに、チオール基をコバ
レント結合に用いて抗原構造をマトリックスに結合させ
る。抗原中のチオール基は、適当なマトリックスに結合
させた活性化チオ基に、チオージスルファイV交換によ
り結合する。この結合は可逆的で、可溶化剤を洗って除
いたあと、チオールを有する抗原構造を、メルカプトエ
タノールまたはジチオトリエタふノールでジスルファイ
r結合を還元することにより、可溶化剤または配糖体の
存在で溶出しうる。
クチンは特異的な糖基と可逆的に反応しうる1群の蛋白
質で、たとへば糖蛋白質を結合しうる。レクチンをリガ
ンドとしてたとへば5epharose (Pharm
acia 、 crppsala )に結合さすか、適
当なマトリックスに結合させた市販品を用いる。デター
ヅエント(可溶化剤)は固定レクチンに親和性を有しな
い。吸着された抗原は、メチルff[たとへばメチルマ
ンノシド、メチルグルコシrまたはN−アセチルグリコ
サミンを、可溶化剤または配糖体の存在で緩衝剤塩溶液
中に溶解したものを用いて容易に脱着しうる〇 コバレントクロマトグラフイーでに、チオール基をコバ
レント結合に用いて抗原構造をマトリックスに結合させ
る。抗原中のチオール基は、適当なマトリックスに結合
させた活性化チオ基に、チオージスルファイV交換によ
り結合する。この結合は可逆的で、可溶化剤を洗って除
いたあと、チオールを有する抗原構造を、メルカプトエ
タノールまたはジチオトリエタふノールでジスルファイ
r結合を還元することにより、可溶化剤または配糖体の
存在で溶出しうる。
ハイVロフオビツククロマトグラフイーこの方法は、オ
クチル、フェニル型の固定化ハイドロフオビツクリガン
ぜと、抗原構造のハイドロフオビツク表面との相互作用
を用いる。別様には、この技術は、混合物より可溶化剤
を結合させ、同時非吸着抗原構造を採取し、例4(透析
法)により連続処理する方法でもありうる。別の条件で
は、抗原構造をリガンドに結合させ得、可溶化剤のりガ
ントへの親和性をなくして、ついで透析法を用いうる。
クチル、フェニル型の固定化ハイドロフオビツクリガン
ぜと、抗原構造のハイドロフオビツク表面との相互作用
を用いる。別様には、この技術は、混合物より可溶化剤
を結合させ、同時非吸着抗原構造を採取し、例4(透析
法)により連続処理する方法でもありうる。別の条件で
は、抗原構造をリガンドに結合させ得、可溶化剤のりガ
ントへの親和性をなくして、ついで透析法を用いうる。
高イオン強度たとへば硫酸アンモニウムで固定し、水ま
たはエチレングリコールを用いて低イオン強度で溶出し
つる。
たはエチレングリコールを用いて低イオン強度で溶出し
つる。
それでこの複合物は細菌よりの膜蛋白質を含有し得、細
胞材料を上記方法で処理するより前にまず細胞壁を破壊
するのが有利である。ハイVロフオビック蛋白質を生成
させうる細菌の例としては、Bscherichia、
5taphylococci、 Haemophil
usに属するもの、たとへば、H,1nfluenza
e 、 BordetellaたとへばB、 pert
ussiJ Vil)rioたとへば■。
胞材料を上記方法で処理するより前にまず細胞壁を破壊
するのが有利である。ハイVロフオビック蛋白質を生成
させうる細菌の例としては、Bscherichia、
5taphylococci、 Haemophil
usに属するもの、たとへば、H,1nfluenza
e 、 BordetellaたとへばB、 pert
ussiJ Vil)rioたとへば■。
ch、olerae、 Salmonellaたとへば
B、typhi、 S。
B、typhi、 S。
paratyphiがある。なるべくは、C011中の
結合因子たとへばpili K 88およびたとへばサ
ルモネラ中のporin蛋白質捷たは、B、pertu
ssi8およびNe1sseria meningit
idisの外膜蛋白質とするO エンベロープを有する用いうるウィルスの例としては、
Orthomyxoviridaeたとへばインフルエ
ンザA 、 B 、 C、ParamyoVirida
e特に、はしかウィルス、流行性耳下腺炎ウィルス、バ
ラインフルエンr1.2.3および4ウイルス、イヌジ
ステンパーウィルス、リングペストウィルス、Rhab
doviridae特に狂犬病ライ/l/ ス、Ret
rovididae特に、ねこ白血病ウィルス、ウシ白
血球ウィルス、aerpesviridae 、特にP
seudorables 、 coronaviria
ae。
結合因子たとへばpili K 88およびたとへばサ
ルモネラ中のporin蛋白質捷たは、B、pertu
ssi8およびNe1sseria meningit
idisの外膜蛋白質とするO エンベロープを有する用いうるウィルスの例としては、
Orthomyxoviridaeたとへばインフルエ
ンザA 、 B 、 C、ParamyoVirida
e特に、はしかウィルス、流行性耳下腺炎ウィルス、バ
ラインフルエンr1.2.3および4ウイルス、イヌジ
ステンパーウィルス、リングペストウィルス、Rhab
doviridae特に狂犬病ライ/l/ ス、Ret
rovididae特に、ねこ白血病ウィルス、ウシ白
血球ウィルス、aerpesviridae 、特にP
seudorables 、 coronaviria
ae。
Togaviridae 、たとへばEEE、 Wi、
VHiE (イースターン、ウェスターンおよびベネ
ズエラウマ脳炎)、黄熱病ウィルス特に、ウシウィルス
性下痢ウィルスおよびヨーロッパブタ発熱性ウィルス、
Arenaviridae、 Poxvididae、
Bunyaviridae。
VHiE (イースターン、ウェスターンおよびベネ
ズエラウマ脳炎)、黄熱病ウィルス特に、ウシウィルス
性下痢ウィルスおよびヨーロッパブタ発熱性ウィルス、
Arenaviridae、 Poxvididae、
Bunyaviridae。
工ri(lOViri(lae 、特に、アフリカブタ
熱ウィルスおよび未分類ウィルスとして、ヒト肝炎β−
ウィルスおよびMarburg / Fit)O1aウ
ィルスがある。
熱ウィルスおよび未分類ウィルスとして、ヒト肝炎β−
ウィルスおよびMarburg / Fit)O1aウ
ィルスがある。
本発明に準じて用いうる寄生虫の例として、原虫には、
ToxoplasmaたとへばToxoplasma
gondiiPlaemOdiumたとへげり÷郷佇P
’lasmodium uivaxmalariae、
falciparium、ovale、Teileri
aparvumおよびFilaroidae 、なるべ
くはparaflariaおよびonchocerca
、 Bntamoebah1θto17tic&、種々
の型のアナプラズマ、9chistog oInaたと
へばBchis加soma haemat−Obium
。
ToxoplasmaたとへばToxoplasma
gondiiPlaemOdiumたとへげり÷郷佇P
’lasmodium uivaxmalariae、
falciparium、ovale、Teileri
aparvumおよびFilaroidae 、なるべ
くはparaflariaおよびonchocerca
、 Bntamoebah1θto17tic&、種々
の型のアナプラズマ、9chistog oInaたと
へばBchis加soma haemat−Obium
。
mansoi、 japonicum、およびTr7p
an080maたとへばTrypanosoma ga
mbiense、 bruseiまたはcongole
siがある。
an080maたとへばTrypanosoma ga
mbiense、 bruseiまたはcongole
siがある。
b)非ハイドロフォビック蛋白質またはペプチPより出
発しハイVロフォビックの基をそれらに結合さすことも
可能である。非ハイVロフォビック蛋白質に、エンベロ
ープを有するかまたは有しないウィルス、細菌、マイコ
プラズマ、寄生虫より由来しうる。非エンプローゾウィ
ルスで、非ハイリオウイルス、Adenov4rida
e、 Parvoviridae 。
発しハイVロフォビックの基をそれらに結合さすことも
可能である。非ハイVロフォビック蛋白質に、エンベロ
ープを有するかまたは有しないウィルス、細菌、マイコ
プラズマ、寄生虫より由来しうる。非エンプローゾウィ
ルスで、非ハイリオウイルス、Adenov4rida
e、 Parvoviridae 。
たとへは、ねこペストウィルス、およびプタバルポウイ
ルス、ReoviridaeたとへばRotaviru
sがある。マイコプラズマの例には、M、pnθumo
niae。
ルス、ReoviridaeたとへばRotaviru
sがある。マイコプラズマの例には、M、pnθumo
niae。
mycoides、 bovis、 5uis、 or
ale、 salvarium。
ale、 salvarium。
hominlBおよびfermentansがある。
これらの蛋白質またはペプチド例a)のように精製しう
る〇 非ハイドロンオビック蛋白質に結合させうるハイドロフ
オビック基は、1 、2 、3 、4 j5 、6゜7
および8炭素原子数の、なるべくは6.7および8炭素
原子数の、直鎖、枝分れ、飽和オたは不飽和の脂肪族鎖
; ’l”rp、工Is、 Phe、 Pro、 Ty
r、 Leujvar、特に’ryrから選択した、1
.2.3.4.tたFi5個、なるべくは2.3.4個
のアミノ酸の小型ベデチrコリン酸、コレステロール誘
導体たとへぼ、コリン酸、ウルソデンキシコリン酸であ
る。
る〇 非ハイドロンオビック蛋白質に結合させうるハイドロフ
オビック基は、1 、2 、3 、4 j5 、6゜7
および8炭素原子数の、なるべくは6.7および8炭素
原子数の、直鎖、枝分れ、飽和オたは不飽和の脂肪族鎖
; ’l”rp、工Is、 Phe、 Pro、 Ty
r、 Leujvar、特に’ryrから選択した、1
.2.3.4.tたFi5個、なるべくは2.3.4個
のアミノ酸の小型ベデチrコリン酸、コレステロール誘
導体たとへぼ、コリン酸、ウルソデンキシコリン酸であ
る。
これらの疎水性の基は、非ハイrロフォビックの蛋白質
に結合させうる基に連結しておらねばならぬ。それらの
基はたとへばカルボキシル基、アミノ基、ジスルファイ
ド基、ヒPロキシル基、スルフヒドリル基およびアルデ
ヒド基のようなカルプロパン、ブタン、ヘキサン、ヘゾ
タン、オクタンのカルボキシル、アルデヒ’ % 7
ミ/ 、ヒ) 。
に結合させうる基に連結しておらねばならぬ。それらの
基はたとへばカルボキシル基、アミノ基、ジスルファイ
ド基、ヒPロキシル基、スルフヒドリル基およびアルデ
ヒド基のようなカルプロパン、ブタン、ヘキサン、ヘゾ
タン、オクタンのカルボキシル、アルデヒ’ % 7
ミ/ 、ヒ) 。
キシルおよびジスルファイr誘導体とシスチン、アスパ
ラギン酸、グルタミン酸、リジンを含有するペプチドと
のあいだ、なるべくはオクタナールとTyr−T7r−
Tyr−Cye(−Aspまた1d−Glu)とする。
ラギン酸、グルタミン酸、リジンを含有するペプチドと
のあいだ、なるべくはオクタナールとTyr−T7r−
Tyr−Cye(−Aspまた1d−Glu)とする。
結合させうる基を有する疎水性基は、たとへぼ上記した
ような可溶化剤および洗浄剤または塩酸、酢酸、67チ
容量係酢酸、カセイソーダ、アンモニヤを用いて水に溶
解せねばならぬ。ついで、物質が沈殿せぬよう中性の方
向に調整する。なは、疎水性基を結合させようとする蛋
白質を変性さす…とじてはならない。
ような可溶化剤および洗浄剤または塩酸、酢酸、67チ
容量係酢酸、カセイソーダ、アンモニヤを用いて水に溶
解せねばならぬ。ついで、物質が沈殿せぬよう中性の方
向に調整する。なは、疎水性基を結合させようとする蛋
白質を変性さす…とじてはならない。
疎水性分子は、非疎水性蛋白質に、10:1から0.1
: 1なるべくは1:1に添加する。
: 1なるべくは1:1に添加する。
結合分子として、カルボキシル基を有する疎水性基ハ、
水溶性のカルボジイミドまたは複合無水物を経由して蛋
白質に結合させつる。第1の場合、カルざジイミrでp
!−15でカルざキシル基を活性化し、リン酸塩含量の
高い緩衝液(pH8)に溶解した蛋白質と混合する。第
2の場合は、ジオキサンまたはアセトニトリル中トリエ
チルアミンの存在でカルボキシ化合物とイソブチルクロ
ルホルメートとを反応させ、生ずる無水物をP)48か
ら9において蛋白質に添加する。カルボキシル基をヒド
ラゾンを用いてヒVラジVに変え、これを、蛋白質中の
過ヨー素酸酸化糖単位中アルデヒドおよびケトンとヒド
ラゾン結合とする。
水溶性のカルボジイミドまたは複合無水物を経由して蛋
白質に結合させつる。第1の場合、カルざジイミrでp
!−15でカルざキシル基を活性化し、リン酸塩含量の
高い緩衝液(pH8)に溶解した蛋白質と混合する。第
2の場合は、ジオキサンまたはアセトニトリル中トリエ
チルアミンの存在でカルボキシ化合物とイソブチルクロ
ルホルメートとを反応させ、生ずる無水物をP)48か
ら9において蛋白質に添加する。カルボキシル基をヒド
ラゾンを用いてヒVラジVに変え、これを、蛋白質中の
過ヨー素酸酸化糖単位中アルデヒドおよびケトンとヒド
ラゾン結合とする。
亜硝酸を用いてアミノ基を低温条件でシア・戸ニウム塩
に変え、これをT7r、 H2OおよびL7Sとアゾ結
合させる。
に変え、これをT7r、 H2OおよびL7Sとアゾ結
合させる。
コハク酸無水物でヒrロキシル基をヘミサクシネート誘
導体に変え、これをカルボキシル基に結合させうる〇 アルデヒV基は蛋白質中のアミノ酸と反応させてシック
塩基となしうる。
導体に変え、これをカルボキシル基に結合させうる〇 アルデヒV基は蛋白質中のアミノ酸と反応させてシック
塩基となしうる。
いくつかのカップリングのための基および方法は、Jo
urnalof 1mmunological Met
hods、 59(19831)129−143.28
9−299、Methods in Enzymolo
gy Vol 93 280−33およびAnalyt
ical BiochemiStr7116 s 40
2受は入れた疎水性基を有するそのように製造された蛋
白質またはペゾチVつい”e 、a)におけるように配
糖体と結合させ複合物となしうる。しかし、ここで細胞
フラグメント除去のための精製段階は省略しうる。
urnalof 1mmunological Met
hods、 59(19831)129−143.28
9−299、Methods in Enzymolo
gy Vol 93 280−33およびAnalyt
ical BiochemiStr7116 s 40
2受は入れた疎水性基を有するそのように製造された蛋
白質またはペゾチVつい”e 、a)におけるように配
糖体と結合させ複合物となしうる。しかし、ここで細胞
フラグメント除去のための精製段階は省略しうる。
C)疎水性基が閉じこめられている親水性蛋白質より出
発し、蛋白質をおだやかに檀那で、疎水性が露出される
ようにしてもよい。たとへは約2.5の低い一13Mの
尿素または70℃を超える高温などある。これらの蛋白
質は、■gGs工gM。
発し、蛋白質をおだやかに檀那で、疎水性が露出される
ようにしてもよい。たとへは約2.5の低い一13Mの
尿素または70℃を超える高温などある。これらの蛋白
質は、■gGs工gM。
工gA、工gDおよび工gEのような免疫グロブリンお
よびポリオウィルス蛋白質のようなある種のウィルス蛋
白質でありうる。免疫グロブリンは、アンチジオチぎツ
ク(antidiotypi(! )抗体に用いうる。
よびポリオウィルス蛋白質のようなある種のウィルス蛋
白質でありうる。免疫グロブリンは、アンチジオチぎツ
ク(antidiotypi(! )抗体に用いうる。
得られる蛋白質はb)におけるように蛋白質として精製
し、C)におけるように配糖体に結合させて複合物とす
る0なは細胞7ラグメン)k除く段階は略する。
し、C)におけるように配糖体に結合させて複合物とす
る0なは細胞7ラグメン)k除く段階は略する。
本発明に準する凭疫原性複合物は、ヒトおよび動物にお
いて特異的な免疫の刺激に用いうる。それらは、細菌、
ウィルス、マイコプラズマおよび寄生虫による病気に対
するワクチンおよび楕々の動物細胞に由来する膜蛋白質
に対する、研究のための抗体生産に用いうる。
いて特異的な免疫の刺激に用いうる。それらは、細菌、
ウィルス、マイコプラズマおよび寄生虫による病気に対
するワクチンおよび楕々の動物細胞に由来する膜蛋白質
に対する、研究のための抗体生産に用いうる。
種々の細菌またはウィルスに由来する両親媒性蛋白質の
混合物を用いて、いくつかの病気に対してワクチンとも
なしうる。
混合物を用いて、いくつかの病気に対してワクチンとも
なしうる。
本発明は、場合によっては、ふつうの添加物および充填
剤を加えた、なるべくは、T、N溶液(例1)のような
、イソコムの緩衝溶液の形の、本発明に準するインコム
を含有するヒトや家畜用組成物とする。
剤を加えた、なるべくは、T、N溶液(例1)のような
、イソコムの緩衝溶液の形の、本発明に準するインコム
を含有するヒトや家畜用組成物とする。
つぎに、非限定的実施例で本発明をよりくわしく記載す
る。
る。
例1
[Jmθaで分離されたバラインフルエンデー6−ウィ
ルス30重量%しよ糠中、100.000.Fで4℃で
1時間遠心し精製した。底部の層を、[11,05M
Tris−MCI 、 pH7,4および0.I M
NaC1(’I’N)巾約10■/−の濃度に溶解した
。同じ緩衝液(TMJ中11−51n/−のPニー3−
ウィルスを、TN緩衝液中約105カウント/分3H−
標識ウィルスとあわせて、2重量%(最終濃f) Tr
itOn X −100を用いて可溶化した。(A、L
uukkonen、 O。
ルス30重量%しよ糠中、100.000.Fで4℃で
1時間遠心し精製した。底部の層を、[11,05M
Tris−MCI 、 pH7,4および0.I M
NaC1(’I’N)巾約10■/−の濃度に溶解した
。同じ緩衝液(TMJ中11−51n/−のPニー3−
ウィルスを、TN緩衝液中約105カウント/分3H−
標識ウィルスとあわせて、2重量%(最終濃f) Tr
itOn X −100を用いて可溶化した。(A、L
uukkonen、 O。
Gamberg、 B、Renkonen (19
79)Virology76 56−59頁、本明細書
中の文献に引用する)。約200μlの容葉の試料を、
TN中1チTrtton x −100含有15チしよ
糖の300μjおよび0.2%(重量) Quil A
含有20から50重量%までのTN中12−しよ糖グラ
ジェント上に重ねた。遠心したあと、500μl宛の分
画を下部から集め、試料(20−50μ/)の放射活性
を測定した。放射活性のある蛋白質分画を集め0.00
5 m Tris−HCI 、 0.0’I M Na
C1,pH7,4中で透析し、10−フラスコに入れ、
EdWard8 凍結乾燥装置中で18時間透析した。
79)Virology76 56−59頁、本明細書
中の文献に引用する)。約200μlの容葉の試料を、
TN中1チTrtton x −100含有15チしよ
糖の300μjおよび0.2%(重量) Quil A
含有20から50重量%までのTN中12−しよ糖グラ
ジェント上に重ねた。遠心したあと、500μl宛の分
画を下部から集め、試料(20−50μ/)の放射活性
を測定した。放射活性のある蛋白質分画を集め0.00
5 m Tris−HCI 、 0.0’I M Na
C1,pH7,4中で透析し、10−フラスコに入れ、
EdWard8 凍結乾燥装置中で18時間透析した。
この調製物の沈降係数に248であった。
この複合物は、10−14重量%しよ糖グラジェント中
で遠心してさらに精製した。
で遠心してさらに精製した。
例2
ウマインフルエンザウィルス(8o1valla。
5O1valla、ストックホルムで分離)を用い、例
1の操作を反復した。この実験を配糖体無添加で実施し
た( upc願81102213.6の原則による)0
そしてそのように得られた蛋白質ミセルおよび配糖体を
用いて生成した蛋白質複合物は、10−40重t%の糖
グラジェントでプラス4℃で4時間28肌000yで遠
心した。結果は第1図に示す。
1の操作を反復した。この実験を配糖体無添加で実施し
た( upc願81102213.6の原則による)0
そしてそのように得られた蛋白質ミセルおよび配糖体を
用いて生成した蛋白質複合物は、10−40重t%の糖
グラジェントでプラス4℃で4時間28肌000yで遠
心した。結果は第1図に示す。
これはチログロブリンの沈降係数を標準にしている(矢
印は16S)。蛋白質ミセルの沈降係数は30Bで、配
糖体蛋白質のミセルは198である。。
印は16S)。蛋白質ミセルの沈降係数は30Bで、配
糖体蛋白質のミセルは198である。。
(ウィルス糖蛋白質は、ガラク*ドースオキシダーゼ−
3H−水素化ホウ素法で標識した)0例3 例1の方法は、パラインフルエンザ−3−ウィルスに代
えてはしかウィルスを用いて反復した。
3H−水素化ホウ素法で標識した)0例3 例1の方法は、パラインフルエンザ−3−ウィルスに代
えてはしかウィルスを用いて反復した。
得られた複合物は電顕で、第2図の特徴的構造を示した
。
。
例4
Bilthoven (オランV)より得た狂犬病ウィ
ルスを5ephacr71 S 300上にゲル重層し
て精製した。TN中2++v/m7!の濃度に再懸濁さ
せた。ウィルス01■? 100 mMのオクチル−β
−D−グルコシドを用いて可溶化し、20℃で45分イ
ンキュベートした。試料は50重量%のショ糖溶液上に
重層し、プラス4°Cで45分250.000 gで遠
心した。上層の溶液を取り出しqutIA ? 0.2
重量%に添加した。
ルスを5ephacr71 S 300上にゲル重層し
て精製した。TN中2++v/m7!の濃度に再懸濁さ
せた。ウィルス01■? 100 mMのオクチル−β
−D−グルコシドを用いて可溶化し、20℃で45分イ
ンキュベートした。試料は50重量%のショ糖溶液上に
重層し、プラス4°Cで45分250.000 gで遠
心した。上層の溶液を取り出しqutIA ? 0.2
重量%に添加した。
E料Uセルロースホースに入れ、1000m容量の0.
15Mの酢酸アンモニウム緩衝液中プラス20℃で透析
した。この溶液は72時間のあいだかくはんし、その間
溶液は3度交換した。透析した材料は狂犬病ウィルスの
複合物を含有した010−40重量%糖溶液中プラス4
℃で280.000 gで4時間遠心して、材料の1部
を精製した。電顕像は、第3図の構造を示す。
15Mの酢酸アンモニウム緩衝液中プラス20℃で透析
した。この溶液は72時間のあいだかくはんし、その間
溶液は3度交換した。透析した材料は狂犬病ウィルスの
複合物を含有した010−40重量%糖溶液中プラス4
℃で280.000 gで4時間遠心して、材料の1部
を精製した。電顕像は、第3図の構造を示す。
例5
例・4の方法を反復した。はしかウィルスを用いた。複
合物は、例3で得られた複合物と同じ構造を示した。
合物は、例3で得られた複合物と同じ構造を示した。
例6
しよ糖グラジェント遠心を用いてパラインフルエンザ−
6−ウィルス(σ−23)を精製した。
6−ウィルス(σ−23)を精製した。
精製ウィルスは1oq/TnI!に、o、o 2Mバー
ビトン緩衝液、pH8,0,0,24Mグルコース(B
G )に溶解精製した。BG−緩衝液中1−5■/−P
ニー3−ウィルスを、BG緩衝液中約1053H+カウ
ント/分標識ウィルス(上記Luukkonen等、1
977による)と共に、2 % Triton x −
100を用いて可溶化した。1−の試料を、PH8,0
,0−02Mハ−ヒ)、ン緩衝液および肌02重量係の
Quil A含有1%アガロースデル上に重層した。
ビトン緩衝液、pH8,0,0,24Mグルコース(B
G )に溶解精製した。BG−緩衝液中1−5■/−P
ニー3−ウィルスを、BG緩衝液中約1053H+カウ
ント/分標識ウィルス(上記Luukkonen等、1
977による)と共に、2 % Triton x −
100を用いて可溶化した。1−の試料を、PH8,0
,0−02Mハ−ヒ)、ン緩衝液および肌02重量係の
Quil A含有1%アガロースデル上に重層した。
アガロースデルは85u2表面積、25uの高さのチュ
ーブに入れた。チューブの上方部分および下方部分はそ
れぞれ、pH8,0,0,02Mパービトン緩衝液の電
気泳動緩衝液に接続した。上方を陰極に、下方を陽極に
接続した。5v/cIILで4時間泳動させた。デルの
陽極側で試料を集めて放射活性を測定した。pH7,0
,0,15M酢酸アンモニウム緩衝液中で透析した。凍
結乾燥した。
ーブに入れた。チューブの上方部分および下方部分はそ
れぞれ、pH8,0,0,02Mパービトン緩衝液の電
気泳動緩衝液に接続した。上方を陰極に、下方を陽極に
接続した。5v/cIILで4時間泳動させた。デルの
陽極側で試料を集めて放射活性を測定した。pH7,0
,0,15M酢酸アンモニウム緩衝液中で透析した。凍
結乾燥した。
この調製物は約208の沈降係数(例2と同様に測定)
であった。
であった。
この複合物げ10−400重量%よ糖グラジェントで精
製した。
製した。
例7
Toxoplasma gondii (Tage W
aller、 8tatensVeterinKrme
dicinska Anstalt )を木綿を通し濾
過し、4°Cで20分、100.000 gで30重量
しよ糠中で遠心して精製した。このものは、0.05
M トリス−HCl、pH7,4および0 、I M
NaC1(TN )巾約5■/−に溶解した。本明細書
の参考文献として引用する、” An investi
gation ofthe antigenic 5t
ructure of ’l’oxoplaema g
ondii”により、約105カウント/分の3H標識
トキソゾラズマ(Luukkonen等、1977 )
(TN−緩衝液中)とあわせて、1tngのToxo
plasma gondiiを、5%オクチル−β−D
−グルコシVおよび5%サポニン中で可溶化した。約2
00μl容量の試料は、TN中1%Triton X
−100含有15%しよ糖の300 piおよび0.2
重量% Quil A含有20から500重量%TN中
12m7!t、よ糖グラジエ′ント上に重層させた。約
18時間、20°Cで150.000 、!9で遠心し
た。遠心後はグラジエン)H500pl宛ノ分画毎に集
メ(20−50pl)の試料の放射活性をみた。2つの
放射活性ぎ−クを検出した。それぞれのピーク中の分画
をあわせ、例1のように透析し濃縮した。Quil A
との複合物は、同じ寄生虫より得た蛋白質ミセルより低
い沈降係数を示した。
aller、 8tatensVeterinKrme
dicinska Anstalt )を木綿を通し濾
過し、4°Cで20分、100.000 gで30重量
しよ糠中で遠心して精製した。このものは、0.05
M トリス−HCl、pH7,4および0 、I M
NaC1(TN )巾約5■/−に溶解した。本明細書
の参考文献として引用する、” An investi
gation ofthe antigenic 5t
ructure of ’l’oxoplaema g
ondii”により、約105カウント/分の3H標識
トキソゾラズマ(Luukkonen等、1977 )
(TN−緩衝液中)とあわせて、1tngのToxo
plasma gondiiを、5%オクチル−β−D
−グルコシVおよび5%サポニン中で可溶化した。約2
00μl容量の試料は、TN中1%Triton X
−100含有15%しよ糖の300 piおよび0.2
重量% Quil A含有20から500重量%TN中
12m7!t、よ糖グラジエ′ント上に重層させた。約
18時間、20°Cで150.000 、!9で遠心し
た。遠心後はグラジエン)H500pl宛ノ分画毎に集
メ(20−50pl)の試料の放射活性をみた。2つの
放射活性ぎ−クを検出した。それぞれのピーク中の分画
をあわせ、例1のように透析し濃縮した。Quil A
との複合物は、同じ寄生虫より得た蛋白質ミセルより低
い沈降係数を示した。
例8
グラスミf ptllK 88を有するバクテリヤE。
coli f、3度、機械的に振り等電点て沈降させた
。この材料は例1記載のように処理した。得られた複合
物は第2図および第3図に示す特徴的構造を有した。
。この材料は例1記載のように処理した。得られた複合
物は第2図および第3図に示す特徴的構造を有した。
例9
ボリン(porin )蛋白質を有するsalmone
llaを用い例8の方法を反復した。第2および6図に
示す特徴的構造を有する複合物を得た。
llaを用い例8の方法を反復した。第2および6図に
示す特徴的構造を有する複合物を得た。
例10
ネコ白血球ウィルスで感染されたネコよりエーテル(θ
pitθ1)腎細胞を採取した。しolのように処理し
た。第2および第3図に示す特徴的構造の複合物を得た
。
pitθ1)腎細胞を採取した。しolのように処理し
た。第2および第3図に示す特徴的構造の複合物を得た
。
例11
生白血球ウィルスで転換したエピチル腎細胞を例1の方
法で処理した。第2および第3図に示す特徴的構造の複
合物を得た。
法で処理した。第2および第3図に示す特徴的構造の複
合物を得た。
例12
例1の方法でバラインフルエンf′−6−ウィルスσ−
23を精製し、蛋白質複合物を調製した。
23を精製し、蛋白質複合物を調製した。
ただし、20から50重量%TTN中よ糖グラジェント
は、Quil A以外のサポニンを含有した。
は、Quil A以外のサポニンを含有した。
2種の市販サポニンを試験した。ME3rQk″Wei
θ日”。
θ日”。
rθ1n 51400023およびSc、 Lickh
ardt″S″5OhuChardt、 Munich
である。(純粋な形状なサポニン。製造者は製品の型を
明らかにしない。
ardt″S″5OhuChardt、 Munich
である。(純粋な形状なサポニン。製造者は製品の型を
明らかにしない。
薄層クロマトグラフィーでQuil Aと異なる)。
生ずる複合物の沈降定数は24Bで、例6の複合物と同
じ構造を示す。
じ構造を示す。
例16
5ηのはしかウィルスを例3のように可溶化し、DIB
セルロース型の陰イオン交換体で処理した。
セルロース型の陰イオン交換体で処理した。
イオン交換体は20−のカラムとし、0.5重量%のオ
クチル−β−D−グルコシr含有、pH7,2の0.0
1 M Uン酸塩緩衝液と平衡させた。試料はイオン交
換体に施し、未成着分1d、0.5重量%オフ−y /
l/ −β−D −y” ルコシ)含有、pH7,2,
0,01M リン酸塩緩衝液の5倍容量で洗い流した。
クチル−β−D−グルコシr含有、pH7,2の0.0
1 M Uン酸塩緩衝液と平衡させた。試料はイオン交
換体に施し、未成着分1d、0.5重量%オフ−y /
l/ −β−D −y” ルコシ)含有、pH7,2,
0,01M リン酸塩緩衝液の5倍容量で洗い流した。
はしか膜蛋白質の同定された分画を同定し合併しQ、u
il Aを0.1重量%まで加え、0.05M酢酸アン
モニウム、PH7,0に対し透析した。特徴的構造(図
1および2)を有する複合物を生成した0例14 LOndon 5chool of Tropical
Mediains andHygine (Ftng
land)より受は取った肝炎Bウィルスの22 nm
粒子をTN中に1■/−に再懸濁させたc 22 nm
粒子の0.3■蛋白質をTriton x−100,
0,5M NaC1の2容量%で可+1a化L、670
Cで16時間インキュベートした。ついで例1の操作を
反復した。生成複合物は20Sの沈降定数を示した。電
顕で第4図の構造の複合物を示した。
il Aを0.1重量%まで加え、0.05M酢酸アン
モニウム、PH7,0に対し透析した。特徴的構造(図
1および2)を有する複合物を生成した0例14 LOndon 5chool of Tropical
Mediains andHygine (Ftng
land)より受は取った肝炎Bウィルスの22 nm
粒子をTN中に1■/−に再懸濁させたc 22 nm
粒子の0.3■蛋白質をTriton x−100,
0,5M NaC1の2容量%で可+1a化L、670
Cで16時間インキュベートした。ついで例1の操作を
反復した。生成複合物は20Sの沈降定数を示した。電
顕で第4図の構造の複合物を示した。
この構造は第1図の構造とは異なる。
例15
牛下痢ウィルス(BM)3■をTN K溶解しTrlt
on x −100を1容量チ捷で加え可溶化した。混
合物は室温で2時間かくけんした。可溶イヒしたウィル
スはBepharoθ134Bに固定化したレクチンL
θntilより成立つレクチンカラムに処した。
on x −100を1容量チ捷で加え可溶化した。混
合物は室温で2時間かくけんした。可溶イヒしたウィル
スはBepharoθ134Bに固定化したレクチンL
θntilより成立つレクチンカラムに処した。
カラムはTNで平衡させ、カラムにウィルスを導入した
あと、0.1容量% Triton X −100を含
有するTNの5力ラム容量倍で洗い、ついで10カラム
容量倍のTNで洗った。ウィルスエンベローフ蛋白質を
、0.2Mメチルα−D−マンノシド、0.5重量係オ
クチルーβ−D−グルコシl−” (TN中)の緩衝液
で溶出脱着させた。ウィルスをエンベロープする蛋白質
含有分画を集めQuFI A fO,1型針L16まで
加えた。+4°Cで3日間PH7,0の0.05M酢酸
アンモニウムに対し透析した。そのあいだ1リツトルの
緩衝液は6度変えた。
あと、0.1容量% Triton X −100を含
有するTNの5力ラム容量倍で洗い、ついで10カラム
容量倍のTNで洗った。ウィルスエンベローフ蛋白質を
、0.2Mメチルα−D−マンノシド、0.5重量係オ
クチルーβ−D−グルコシl−” (TN中)の緩衝液
で溶出脱着させた。ウィルスをエンベロープする蛋白質
含有分画を集めQuFI A fO,1型針L16まで
加えた。+4°Cで3日間PH7,0の0.05M酢酸
アンモニウムに対し透析した。そのあいだ1リツトルの
緩衝液は6度変えた。
最終生成物は凍結乾燥した。電顕は第4図の複合物構造
を示した。この調製物の沈降定数は20Sであった。
を示した。この調製物の沈降定数は20Sであった。
例16
ポリオウィルスをホルマリンで殺し既知の方法だとべば
超遠心、そにつぐ、Sepharoee(phanmc
ia。
超遠心、そにつぐ、Sepharoee(phanmc
ia。
typp日aha )ゲルクロマトグラフィーで精製し
た。
た。
最後に塩化セシウム中でデンシティ遠心に処した。
たとへば2 % SD8 (ナトリウムVデシルスルフ
ェート)のような可溶色剤含有TNのような緩衝液中で
90°Cで2分間加熱し可溶化した。ウィルス蛋白質は
0.1チSDSを含有する13チポリアクリルアミvデ
ル中の電気泳動で分けた。デル中の蛋白質は、co m
a8sie Blue R250で着色させ同定した。
ェート)のような可溶色剤含有TNのような緩衝液中で
90°Cで2分間加熱し可溶化した。ウィルス蛋白質は
0.1チSDSを含有する13チポリアクリルアミvデ
ル中の電気泳動で分けた。デル中の蛋白質は、co m
a8sie Blue R250で着色させ同定した。
VI’ 3は約26000ダルトンの分子量のウィルス
蛋白前のひとつである。このウィルス蛋白質の帯をデル
より切り出し、逆電気泳動で抽出した。
蛋白前のひとつである。このウィルス蛋白質の帯をデル
より切り出し、逆電気泳動で抽出した。
抽出物ハ、2 % Triton x −100可溶化
剤全含有するTNvc溶解した。この混合物は、例1の
遠心法で蛋白質複合物(iscomer )とした。電
顕は、第6図に示す特徴的構造を示した0例17 ホルマリンで殺した精製ポリオウィルス′(i−0,1
MのMgCl2を含有する67答量チの酢酸に溶解した
。ウィルスはついで100,000 、!9で2時間超
遠心に処した。ウィルス蛋白質のみ含有する上清を、0
.1重量% QullAの存在で、0.01 y Tr
ts。
剤全含有するTNvc溶解した。この混合物は、例1の
遠心法で蛋白質複合物(iscomer )とした。電
顕は、第6図に示す特徴的構造を示した0例17 ホルマリンで殺した精製ポリオウィルス′(i−0,1
MのMgCl2を含有する67答量チの酢酸に溶解した
。ウィルスはついで100,000 、!9で2時間超
遠心に処した。ウィルス蛋白質のみ含有する上清を、0
.1重量% QullAの存在で、0.01 y Tr
ts。
0.14 M NaC1、pH7,4に対し透析した。
生成複合物は例6製造のものと同じ構造を示した。
例18
凍結脱水した形状の1tTei8s61ria m8n
ingiti(lieの外膜蛋白質を、Nationa
l工n5titute of Health。
ingiti(lieの外膜蛋白質を、Nationa
l工n5titute of Health。
(オランダ)より受は取った。2係(重箪)のオクチル
−β−D−グルコシPおよび肌1重量%のQuil A
f含有するTNに溶解し、例4のように処理した。生
ずる複合物は例2のように測定して、沈降定数208で
あったO 例19 0.1.2.3および4個のチロシンを末端に結合させ
合成した、疎水性アミノ酸を有するペグチー1口てい病
ペプチド144−169.0、 Kaufbehren
、 VP工を用いた。ペプチドは極少量の67容量チ
酢酸に溶解し、25%アンモニヤで中和し、Ag de
st (2%最終濃度とする)と共に0.5M酢酸アン
モニウムの濃度まで希訳した。
−β−D−グルコシPおよび肌1重量%のQuil A
f含有するTNに溶解し、例4のように処理した。生
ずる複合物は例2のように測定して、沈降定数208で
あったO 例19 0.1.2.3および4個のチロシンを末端に結合させ
合成した、疎水性アミノ酸を有するペグチー1口てい病
ペプチド144−169.0、 Kaufbehren
、 VP工を用いた。ペプチドは極少量の67容量チ
酢酸に溶解し、25%アンモニヤで中和し、Ag de
st (2%最終濃度とする)と共に0.5M酢酸アン
モニウムの濃度まで希訳した。
0.1%の配糖体を加え、混合物は、0.05M酢酸ア
ンモニウム、P)(7に対し透析した(透析チュー−7
” 5pectra por 6MWc01.000
)。
ンモニウム、P)(7に対し透析した(透析チュー−7
” 5pectra por 6MWc01.000
)。
2週間の間隔をおき、マウスを、50μg量で2度ワク
チン処理した。
チン処理した。
Q O,005
10,217
20,311
30,347
40,346
生成複合物の電顕像(第5図)は、2[+−4[)nm
の長さで10nmの巾の球状の電子を通さない粒子を示
した。他の大きさのものもある。
の長さで10nmの巾の球状の電子を通さない粒子を示
した。他の大きさのものもある。
第5a図は6個のチロシンに結合したペプチドの電顕像
で、第5b図は4個のチロシンに結合したベゾチドの像
である。
で、第5b図は4個のチロシンに結合したベゾチドの像
である。
例20
既知の方法(van clen Branden、 、
7. L、de (+oen。
7. L、de (+oen。
L+KanarekおよびRuyschaert (1
981)およびMo1ecular工mmuno1og
y 18 # pp621−631(1981))で精
製するか、硫酸アンモニウム沈殿で接縮した( J、E
、 0onradie、 M、 GOvender。
981)およびMo1ecular工mmuno1og
y 18 # pp621−631(1981))で精
製するか、硫酸アンモニウム沈殿で接縮した( J、E
、 0onradie、 M、 GOvender。
L、 Visser、 Journal of Imm
unological MethodsVol 59
pp、 289−299 、1983、本明細書の参照
文献として引用)マウスよりの工ga4rs冷蔵室中で
0.15Mリン酸塩(PC緩衝液、P)12 )の1リ
ツトルに対して透析した。ついで2%のデタージエント
(たとへば)オクチル−β−D−グルコシP〕を加えた
。デタージエントの臨界ミセル濃度(OMO)が低いな
らば、透析を始めるより前にデタージエントを交換すべ
きである。混合物はpc pH7に対し透析した01時
間後に0805チの最終濃度までQ、uil Aを加え
た。冷蔵室中で24時間pH7のPCに対し透析を続け
た0複合物の形成は、Beckman SW −600
−ター中で40000 rpmで3.3時間5から30
係しよ糖勾配で遠心することにより示された。複合物は
ELISA法によりグラジェント中に検出された。
unological MethodsVol 59
pp、 289−299 、1983、本明細書の参照
文献として引用)マウスよりの工ga4rs冷蔵室中で
0.15Mリン酸塩(PC緩衝液、P)12 )の1リ
ツトルに対して透析した。ついで2%のデタージエント
(たとへば)オクチル−β−D−グルコシP〕を加えた
。デタージエントの臨界ミセル濃度(OMO)が低いな
らば、透析を始めるより前にデタージエントを交換すべ
きである。混合物はpc pH7に対し透析した01時
間後に0805チの最終濃度までQ、uil Aを加え
た。冷蔵室中で24時間pH7のPCに対し透析を続け
た0複合物の形成は、Beckman SW −600
−ター中で40000 rpmで3.3時間5から30
係しよ糖勾配で遠心することにより示された。複合物は
ELISA法によりグラジェント中に検出された。
実験1
本発明に準じQ、uil Aを用いて生産された膜蛋白
質複合物と配糖体無添加で生産された相当する膜蛋白質
ミセルとの免疫原性についての比較25頭のマウス(B
ALB O,Bomhollgara。
質複合物と配糖体無添加で生産された相当する膜蛋白質
ミセルとの免疫原性についての比較25頭のマウス(B
ALB O,Bomhollgara。
Denmarlc、約20g)’に5群に分け、各群は
、6週の間隔で2度、緩衝液のみ(PBS ) 、例1
に従い、100μl PBS中インフルエンザの膜蛋白
質およびQuil Aよシ製造の複合物の0.1μgm
O,5μgjおよび5μg、 EPO願811022
13.6により製造の配糖体なしの膜蛋白質ミセルの5
μgで免疫した。
、6週の間隔で2度、緩衝液のみ(PBS ) 、例1
に従い、100μl PBS中インフルエンザの膜蛋白
質およびQuil Aよシ製造の複合物の0.1μgm
O,5μgjおよび5μg、 EPO願811022
13.6により製造の配糖体なしの膜蛋白質ミセルの5
μgで免疫した。
実験終了まで毎週血清を採取した。EiItlSA法で
血清中の免疫反応を測定した。こめ方法は、Volle
r、 Bidwel、およびBartlett 193
[] 。
血清中の免疫反応を測定した。こめ方法は、Volle
r、 Bidwel、およびBartlett 193
[] 。
F!nzyme−’1inked 工mmunoso
rbent As5ay、pp 359−3 7 1
、 Manual of clintcal 工
mmun010g7゜American 5ocie
ty for Microbiology、
−Wa8hingtOn K: 記載サレテイル。
rbent As5ay、pp 359−3 7 1
、 Manual of clintcal 工
mmun010g7゜American 5ocie
ty for Microbiology、
−Wa8hingtOn K: 記載サレテイル。
結果は第6図に示す。明らかに、Q、ui、I Aを用
いて製造した抗原複合物は、Qui’l Aを加えない
相当する蛋白質ミセルよりより良い免疫反応を示す。Q
、ui’l Aを用いて製造した蛋白質膜複合物は、配
糖体無添加の蛋白質ミセルの5μgより高い免疫反応を
おこさせる。
いて製造した抗原複合物は、Qui’l Aを加えない
相当する蛋白質ミセルよりより良い免疫反応を示す。Q
、ui’l Aを用いて製造した蛋白質膜複合物は、配
糖体無添加の蛋白質ミセルの5μgより高い免疫反応を
おこさせる。
実験2
買被合物と、アジュバント添加物としての配糖体と混合
した相当する膜蛋白質ミセルとの免疫効果および副作用
についての比較 The National Veterinary工n
s titute 、 s’we8aenよシの30頭
のモルモットを用いた。1群6頭51!lに分け、イン
フルエンザウィルス(カルチャー 8o1va’lla
)よりの蛋白質ミセル(P)および表1に従い配糖体
QutIA (op) ’ft用い生産の同じインフル
エンザウィルスよりの膜蛋白質複合物(例2で製造)で
免疫した。ワクチン未処理対照として6頭を用いた。G
P複合物からは、しよ糖グラジェント遠心で遊離配糖体
を除いた。表1に結果を示す。p−ミセルもGP−複合
物もほとんど副作用なく、GP複合物は明らかに p−
ミセルよシ高い抗体反応を与えた。10μgの遊離配糖
体とp−1セルとの混合物は副作用が温和であったがア
ジュバント効果はない。1・00μgの遊離グリコシド
の添加で、発赤、にれの形で強い局所的副作用をみた。
した相当する膜蛋白質ミセルとの免疫効果および副作用
についての比較 The National Veterinary工n
s titute 、 s’we8aenよシの30頭
のモルモットを用いた。1群6頭51!lに分け、イン
フルエンザウィルス(カルチャー 8o1va’lla
)よりの蛋白質ミセル(P)および表1に従い配糖体
QutIA (op) ’ft用い生産の同じインフル
エンザウィルスよりの膜蛋白質複合物(例2で製造)で
免疫した。ワクチン未処理対照として6頭を用いた。G
P複合物からは、しよ糖グラジェント遠心で遊離配糖体
を除いた。表1に結果を示す。p−ミセルもGP−複合
物もほとんど副作用なく、GP複合物は明らかに p−
ミセルよシ高い抗体反応を与えた。10μgの遊離配糖
体とp−1セルとの混合物は副作用が温和であったがア
ジュバント効果はない。1・00μgの遊離グリコシド
の添加で、発赤、にれの形で強い局所的副作用をみた。
p−ミセルワクチンよりは高い抗体反応を与えた。
表1
4週の間隔で2度ワクチン処理したあと、赤血球凝集阻
害〔H工〕で測定したモルモット血清中のインフルエン
ザウィルスへの免疫反応 p=インフルエンザウイルスペゾロマーよシ成立つ蛋白
質ミセル(HおよびN)の1μgp+10=1μg蛋白
質ミセル+10μg遊離配糖体 p+100=1μg蛋白質ミセル+100μg遊離配糖
体 GP=配糖体を用いて製造した蛋白買被の1μg(遊離
配糖体含量〈0.1μg) −反応なし + わづかな発赤 +十 中程度の発赤 +++ 強い発赤およびネクローゼ Hニータイター(”1og/l) p p+
10 p+ 100 apM−1:5D(6頭)
7.9士2.37.5−1=1.5 1[1,
3±3.1 9.7−1m0.6局所反応
−+ +++ −なお、ワクチン未処理のモル
モットのタイターは2(6頭) 実験3 例1により製造し10−40%しょ糖勾配でさらに精製
した膜蛋白質複合物の免疫原効果をみた。
害〔H工〕で測定したモルモット血清中のインフルエン
ザウィルスへの免疫反応 p=インフルエンザウイルスペゾロマーよシ成立つ蛋白
質ミセル(HおよびN)の1μgp+10=1μg蛋白
質ミセル+10μg遊離配糖体 p+100=1μg蛋白質ミセル+100μg遊離配糖
体 GP=配糖体を用いて製造した蛋白買被の1μg(遊離
配糖体含量〈0.1μg) −反応なし + わづかな発赤 +十 中程度の発赤 +++ 強い発赤およびネクローゼ Hニータイター(”1og/l) p p+
10 p+ 100 apM−1:5D(6頭)
7.9士2.37.5−1=1.5 1[1,
3±3.1 9.7−1m0.6局所反応
−+ +++ −なお、ワクチン未処理のモル
モットのタイターは2(6頭) 実験3 例1により製造し10−40%しょ糖勾配でさらに精製
した膜蛋白質複合物の免疫原効果をみた。
この調製物の、Qul Aの溶解反応にもとづいて測定
した遊離Q、uil Aの量は0.02重量係以下であ
った。溶解反応は牛歩血球について調べた。血球はアガ
ロースデル中0.05%濃度とした。アガロースデルは
電気泳動システム中においた。ここでQuil Aは陽
極へと移動し血球を溶解する。溶解域はロケットの形状
で配糖体の量はロケットの長さに比例し、Qoomas
ie Br1lliant Blueを用いる蛋白質染
色で可視化される。この方法で、0.02係またはそれ
以上の配糖体濃度を測定しうる。
した遊離Q、uil Aの量は0.02重量係以下であ
った。溶解反応は牛歩血球について調べた。血球はアガ
ロースデル中0.05%濃度とした。アガロースデルは
電気泳動システム中においた。ここでQuil Aは陽
極へと移動し血球を溶解する。溶解域はロケットの形状
で配糖体の量はロケットの長さに比例し、Qoomas
ie Br1lliant Blueを用いる蛋白質染
色で可視化される。この方法で、0.02係またはそれ
以上の配糖体濃度を測定しうる。
(5undqui st等、 Biochemical
and Biopb7sicalResearch
OOmmunications Vol、 114 a
1)1) 699−704.1983)。
and Biopb7sicalResearch
OOmmunications Vol、 114 a
1)1) 699−704.1983)。
沈降速度の分析で、追加して精製した材料は非精製材料
と同じ沈降定数を示した0電顕て同じ形態を示した(第
2図および第3図)0マウスをワクチン処理すると、抗
体反応の刺激について、両者は同じ活性を示した。ひと
つの実験で、Quit A−添加で調製し、2度のグラ
ジェント遠心で精製したインフルエンデウィルスの複合
物の1μgtたけ0.1μgは、精製を加えてない対応
する材料と同様に有効であった0上記の結果は、遊離。
と同じ沈降定数を示した0電顕て同じ形態を示した(第
2図および第3図)0マウスをワクチン処理すると、抗
体反応の刺激について、両者は同じ活性を示した。ひと
つの実験で、Quit A−添加で調製し、2度のグラ
ジェント遠心で精製したインフルエンデウィルスの複合
物の1μgtたけ0.1μgは、精製を加えてない対応
する材料と同様に有効であった0上記の結果は、遊離。
uilAが証明できなくても安定で免疫原として有効で
あることを示す。
あることを示す。
実験4
肝炎B (HB)抗原を有する3種のワクチンを、それ
ぞれ、5μg HB抗原量で、4頭のマウスで調べた。
ぞれ、5μg HB抗原量で、4頭のマウスで調べた。
3種のワクチンは、例14により製造のiscomes
、相当する市販ワクチンでインタクトの22 nm粒
子を有するもの、もうひとつは、相当するHB膜蛋白質
mpo願81102213.6に準じ製造のミセルの形
で存在する実□験ワクチンである。抗体反応はKL工8
A法で測定した。
、相当する市販ワクチンでインタクトの22 nm粒
子を有するもの、もうひとつは、相当するHB膜蛋白質
mpo願81102213.6に準じ製造のミセルの形
で存在する実□験ワクチンである。抗体反応はKL工8
A法で測定した。
表2に示すように、iscome処理マウスは、インタ
フ) 22 nm粒子含有およびミセルのHBより、強
い抗体反応を与えた。
フ) 22 nm粒子含有およびミセルのHBより、強
い抗体反応を与えた。
表2
ワクチン
lscom 22nl11粒子 ミセル49
5■て読んだ 1.343 [1,60!1
、 0.569KLI8A吸光値 1.788
α598 0.2401.841 0.
888 0.2731.884 0.892 実験5 病原性の狂犬病株(eve )iscomの試験的感染
でワクチン処理実験を行なった。例4に準じ製造の狂犬
病ウィルスよりのエンベロープ蛋白質を含有し、マウス
について防禦免疫をおこすかをみた。
5■て読んだ 1.343 [1,60!1
、 0.569KLI8A吸光値 1.788
α598 0.2401.841 0.
888 0.2731.884 0.892 実験5 病原性の狂犬病株(eve )iscomの試験的感染
でワクチン処理実験を行なった。例4に準じ製造の狂犬
病ウィルスよりのエンベロープ蛋白質を含有し、マウス
について防禦免疫をおこすかをみた。
表3に示す投与量で、1度マウスをワクチン処理した。
14日問おいてから、マウスに病原性のCVS株でLD
5Qの40倍の投与量で試験感染させた。
5Qの40倍の投与量で試験感染させた。
表3
42 18/19
0.84 15/18
0.17 10/20
−一&−0/20
表は、1000mワクチンが防禦的免疫をおこしている
ことを示す。
ことを示す。
本発明に準する新規抗原複合物は、凍結乾燥した形状と
しても、水性懸濁液としても貯蔵しうる。
しても、水性懸濁液としても貯蔵しうる。
投与には、適当な溶媒、たとへば生理食塩水中に溶液と
するのが有利である。なるべくは、pH7,2−7,6
(D O,I M NaCl溶液を用イルo pHUo
、05 MTriθ−HClで調整する。他の緩衝液も
用いうる。
するのが有利である。なるべくは、pH7,2−7,6
(D O,I M NaCl溶液を用イルo pHUo
、05 MTriθ−HClで調整する。他の緩衝液も
用いうる。
本発明に準する新規蛋白質複合物は、配糖体なして製造
した、アジュバントと混合してない蛋白質ミセルの約1
0倍そしてしばしばそれ以上の強い免疫原効果を示す。
した、アジュバントと混合してない蛋白質ミセルの約1
0倍そしてしばしばそれ以上の強い免疫原効果を示す。
対応する蛋白質ミセルが回し蛋白質量で同じ免疫原効果
を有すべきならば、大量の配糖体または他のアジュバン
トとの混合が必要となり、それだけに副作用も大となる
であろう0 本発明に準する蛋白質複合物はなんらのアジュバントと
混合しなくてもよく、副作用は最小限におさえられる。
を有すべきならば、大量の配糖体または他のアジュバン
トとの混合が必要となり、それだけに副作用も大となる
であろう0 本発明に準する蛋白質複合物はなんらのアジュバントと
混合しなくてもよく、副作用は最小限におさえられる。
さらに、リポソームに結合させた抗原蛋白質に比して、
本発明の新規複合物は安定である。
本発明の新規複合物は安定である。
第1図は、明細書例2記載のように、ウマインフルエン
ザウィルスの蛋白質ミセルおよび本発明による蛋白質複
合体の糖グラジェントでの遠心結果を示す。 第2図は、明細書例6記載の本発明による複合物の電顕
図である。 第3図は、明細書例4記載の本発明による複合物の電顕
図である。 第4図は、明細書例14記載の本発明による複合物の電
顕図を示す。 第5A図及び第5B図は、明細書例19記載の本発明に
よる複合物の電顕図を示す。 第6図は、明細書実験1に記載の、本発明による膜蛋白
質複合物と配糖体無添加で製造された膜蛋白質ミセルの
免疫原性を比較して示す。 代理人 浅 村 晧 図面の浄書(内容に変更なし1 5 15 FIG、1 外画を号 FIG、 2 FIo、3 FIo、4 FIG、5A FIG、5B シ 手続補正書(自発) 昭和58年11月2ヶ日 特許庁長官殿 1、事件の表示 昭和58年特許願第 1951!12 号2、発明の
名称 免疫原性複合物 3、補正をする者 事件との関係 特許出願人 41.代理人 5、補正命令の日付 昭和 年 月 日 6、補正により増加する発明の数 7・補正0対象 、細 書 8、補正の内容 別紙のとおり 明細書の浄書 (内容に変更なし−)。 手続補正書(方式) 昭和3j7年ノ月//日 特許庁長官殿 1、事件の表示 昭和a年特許願第 /、9,1.− /、j、<号2、
発明の名称 菊祿朗tilt咋 3、補正をする者 事件との関係 特許出願人 住 所 4、代理人 5、補正命令の日付 昭和57年 7月87日 6、補正により増加する発明の数 7、補正の対象 図面の浄3 (内容に変更なし) 8、補正の内容 別紙のとおり
ザウィルスの蛋白質ミセルおよび本発明による蛋白質複
合体の糖グラジェントでの遠心結果を示す。 第2図は、明細書例6記載の本発明による複合物の電顕
図である。 第3図は、明細書例4記載の本発明による複合物の電顕
図である。 第4図は、明細書例14記載の本発明による複合物の電
顕図を示す。 第5A図及び第5B図は、明細書例19記載の本発明に
よる複合物の電顕図を示す。 第6図は、明細書実験1に記載の、本発明による膜蛋白
質複合物と配糖体無添加で製造された膜蛋白質ミセルの
免疫原性を比較して示す。 代理人 浅 村 晧 図面の浄書(内容に変更なし1 5 15 FIG、1 外画を号 FIG、 2 FIo、3 FIo、4 FIG、5A FIG、5B シ 手続補正書(自発) 昭和58年11月2ヶ日 特許庁長官殿 1、事件の表示 昭和58年特許願第 1951!12 号2、発明の
名称 免疫原性複合物 3、補正をする者 事件との関係 特許出願人 41.代理人 5、補正命令の日付 昭和 年 月 日 6、補正により増加する発明の数 7・補正0対象 、細 書 8、補正の内容 別紙のとおり 明細書の浄書 (内容に変更なし−)。 手続補正書(方式) 昭和3j7年ノ月//日 特許庁長官殿 1、事件の表示 昭和a年特許願第 /、9,1.− /、j、<号2、
発明の名称 菊祿朗tilt咋 3、補正をする者 事件との関係 特許出願人 住 所 4、代理人 5、補正命令の日付 昭和57年 7月87日 6、補正により増加する発明の数 7、補正の対象 図面の浄3 (内容に変更なし) 8、補正の内容 別紙のとおり
Claims (8)
- (1) 配糖体を含有し;そし、て、緩衝化された、
なるべくは塩溶液中で、疎水性領域を有する蛋白質また
はベゾチぜと1種または1種より多くの可溶化剤とを混
合し、それにより荷電を有する単量体性抗原性蛋白質ま
たはペプチ「と可溶化剤とのあいだに複合物を形成させ
、そのあとで、少なくとも臨界ミセル形成濃度とした、
疎水性および親水性の領域を有する配糖体の1種またに
1種より多く含む配糖体溶液の存在で、荷電単量体性、
抗原性蛋白質またにベプチPを可溶化剤より分けるか、
または、それらを可溶化剤より分は直接に配糖体溶液に
移【−1それにより、蛋白質複合体を形成させ、それを
分離し精製してうろことを特徴とする、疎水性領域を有
する抗原性蛋白質またはペプチドを含有する免疫原性複
合物。 - (2) ウィルス、マイコプラズマ、細菌、寄生虫、
動物細胞に由来する、疎水性(ハイVロフオビツク)膜
蛋白質、および、1がら8炭素原子数の脂肪族基、トリ
シトファン(’rrp ) 、イソロイシン(工1e)
、フェニルアラニン(phe ) 、プロリン(Pro
) 、チロシン(Tyr )、ロインy (Leu
)、バリン(Var )のようなアミノ酸1から5個の
小型ペデチP1コリン酸およびコレステロール誘導体よ
り選択した疎水性基と結合させて疎水性となしうる非ハ
イVロフオビツク蛋白質;おだやかな変性により露出さ
せうる、内部に入れこ1れた疎水性基を有する両親媒性
の蛋白質およびペプチド;または合成蛋白質またはペプ
チドまたはハイプリP DNA技術により生成された蛋
白質またはペプチVより、蛋白質およびペプチドを選択
することを特徴とする、上記(1)項記載の免疫原性複
合物。 - (3) ウィルス、マイコプラズマ、細菌、寄生虫、
動物細胞捷たけ疎水性ペプチドまたは蛋白質と、イオン
性、非イオン性、両性イオン性または没食子酸デタージ
エント、アルコール、小型両親媒性分子、水溶性ペプチ
Vまたは蛋白質またはそれらの混合物とを、緩衝化され
た、できれば塩溶液中で混合し、この混合物を、配糖体
を含有するひとつのグラジェント上に存在している、可
溶他剤含有溶液上におき、少なくとも100.0009
で遠心して、蛋白質性分画を分けるか、または、微生物
、蛋白質またはペプチVを、緩衝塩溶液中でデタージエ
ントと混合したあと可溶化剤と反応させ、そして、なる
べくは酢酸アンモニウム緩衝液に対して透析するかまた
はグラジェント上に直接的に層としておき、少なくとも
ioo、ooogで遠心し、そのあとで蛋白質含有頂部
分画を集め、つづいて、配糖体と反応させ、緩衝液なる
べくは酢酸アンモニウムに対し透析するか、捷たは、緩
衝液中微生物、動物細胞、蛋白質またはペデテrと可溶
化剤との混合物か、または、微生物、動物細胞、蛋白質
またにベプチPと可溶化剤との緩衝塩溶液中での混合物
をグラジェントを通して遠心して得られた蛋白質頂部分
画かを、電気泳動により可溶化剤より分け、配糖体を含
有する溶液中に集め、そのあとで得られる蛋白質複合物
を、できれば、凍結乾燥、真空透析または超遠心などで
濃縮し、または、グラジェント遠心でさらに精製するこ
とにより得られることを特徴とする、上記(1)項記載
の免疫原性複合物。 - (4) エンベロープを有するウィルス、特に、or
thomyxoviridae、 Paramyxov
iridae。 Retroviridae、 Rabdovirida
e、 Togaviridae。 Hθrpθ5v1rlaaeおよび肝炎Bウィルスより
の膜蛋白質、トキソプラズマ、エンベロープを有しない
ウィルスたとへばPicornaviridae、 P
arvoyiriaae。 Reaviridaeよりの膜蛋白質を選択し、たとへ
ばQuillaja 5aponaria、 Mo11
na、 、Aesculushlppocastanu
m、またFiG7pOphilla struthiu
mよりの配糖体抽出物のようなサポニン、なるべくはD
Q、 Quil A、 aescin、 5apoal
binより配糖体を選択してうろことを特徴とする、上
記(1)から(3)項までのいずれかに記載の免疫原性
複合物。 - (5)配糖体含有糖グラジェントの開始時の濃度を少な
くとも5重量%、なるべくは15−25重量%そして最
終の濃度を少なくとも20重量%、なるべくは45−6
0重量%とし、配糖体含量を、臨界ミセル形成濃度(O
MO)の少なくとも1から3倍、なるべくは少なくとも
5倍、特に7から12倍として、しよ糖のグラジェント
中で遠心してうろことを特徴とする、上記(2)から(
4)項のいずれかに記載の免疫原性複合物。 - (6)可溶化剤と糖とを含有する溶液が、配糖体含有糖
グラジェントの上層中の糖濃度に等しいか、それより低
い、なるべくは5から25重量%の、特に15重量%の
糖を含有し、可溶化剤の濃度は、0.25−3重量%、
なるべくは0.75−1.5重量%、特に1重量%であ
る溶液を用いてうろことを特徴とする、上記(11から
(4)項のいずれかに記載の免疫原性複合物。 - (7)免疫刺激剤、特にワクチンとして用いるための上
記(1)から(6)項のいずれかに記載の免疫原性複合
物。 - (8) できれば、添加物または充填剤と混合した、
上記+11から(7)項のいずれかに記載の免疫原性複
合物を含有することを特徴とする、医および獣医用の薬
剤組成物。 (8)蛋白質またにベプチrと1種または1種より多く
の可溶化剤とを、緩衝化された、できれば塩溶液中で混
合し、荷電単量体性抗原性蛋白質と可溶化剤とのあいだ
に複合物を生成させ、少なくとも臨界ミセル形成濃度と
した、疎水性および親水性の領域を含有する配糖体の1
種または1種以上を含有する溶液の存在で、可溶化剤よ
シ荷電単量体性抗原性蛋白質を分けるか、または、可溶
化剤よp分けそして直接的に配糖体溶液に移行させ、そ
のようにして、蛋白質複合物を形成させ、それを分離し
そして精製することを特徴とする、疎水性領域を有する
抗原性蛋白質またはペゾチドを含有する免疫原性複合物
の製造方法。
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Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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SE8205892A SE8205892D0 (sv) | 1982-10-18 | 1982-10-18 | Immunogent membranproteinkomplex, sett for framstellning och anvendning derav som immunstimulerande medel och sasom vaccin |
SE82058926 | 1982-10-18 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS59186921A true JPS59186921A (ja) | 1984-10-23 |
JPH07112983B2 JPH07112983B2 (ja) | 1995-12-06 |
Family
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JP (1) | JPH07112983B2 (ja) |
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