JPS61129136A - 免疫原性複合体およびその製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、分析、疾患の診断、生物学的標的の探索、又
はワクチン製造用の抗体産生を誘導する為に、免疫原性
を付与したり増強したりすることが望ましい１つ以上の
分子に結合した、免疫原性担体の免疫原性複合体に関す
る。

従来ワクチンは、微生物を死滅させたり弱毒化させて、
無毒化又は非病原性にした全菌体よりできていた。例え
ば異種宿主又は宿主細胞中で培養したり、他の特別な条
件下で培養したりして、ウィルスを弱毒化させてきた。

次世代のワクチンは、感染に対する防御を与える免疫能
の刺激に関与する微生物の特異的な成分にもとずいてい
る。このような成分は、疎水性領域がある場合は、物理
的に規定される各車結合型（例えば蛋白ミセル）にする
ことで免疫原性を増加させることができる（モレインら
（Ｈｏｒｅｉｎ　ｅｔａｌｅ、１９７８年、エンベロー
プのある動物ウィルスに対する有効なサブユニットワク
チン、ネイチャー、第２７６巻。７１５−７１８頁）。

複合体中に疎水性蛋白又はペプチドを導入することによ
り、更に良好な免疫原性効果が得られており（ヨーロッ
パ特許出願箱８３８５０２７３．０号）これはイスコム
（ｉｓｃｏａ＋）という名前が与えられている。

第３および第４世代のワクチンは、組み換えＤＮＡ法又
は合成ペプチド又は炭水化物により得られるペプチド又
は蛋白より成ると予想されている。合成法では、例えば
随時ペプチド、蛋白又は脂質に結合した生物物質から純
粋な形で得ることができる。このような物質が既に多く
得られておりワクチンになる可能性がある。これまでこ
のような物質は、例えば牛血清アルブミンのような担体
構造、又はＫ　Ｌ　Ｈ（Ｋｅｙｈｏｌｅ　Ｌｉｍｐｅｔ
Ｈａｅｍｏｃｙａｎ　ｉ　ｎｅ　）を結合させ、且つア
ジュバント（例えば油性アジュバント）を混合しなけれ
ば、従来法では十分な免疫原性を与えることはできなか
った。しかしこのような物質は、特に担体構造が許容で
なかったり副作用が強い為、ワクチンとしては許容でき
なかった。更に殆どの場合必要な抗原量は、免疫に必要
な吊や微生物中に存在する量より１００から１０００倍
よりも多く、１０００倍以上も必要な場合もある。

従来法で使用する場合既知のアジュバントは、許容でき
ない副作用が出るような大用吊で用いる時のみ有効であ
る。これを避けるため、ムラニルジペプチド（ＭＰＤ）
というアジュバントを抗原（ペプチド）に共有結合させ
ることにより、低濃度のＭＰＤでアジュバント効果が得
られた。アーノン・アール、セーラ・エム、バラント・
エム、シエデイツドーエル（ＡｒｎＯｎ、　Ｒ，、５ｅ
ｌａ、　Ｈ，ｅｔＣｈｅｄｉｄ、　Ｌ、、　）　１９８
０年、プロシーデイングズ・オブ・ナショナル・アカデ
ミ−・オブ・サイエンシズ（Ｐｒｏｃ、　Ｈａ、　Ａｃ
ａｄ、　Ｓｃ、　）　、米国、第７７巻、６７６９−６
７７２頁。この種の複合体を作るのは比較的困難且つ＾
価であり、これまで実験用に限られてきた。

ヨーロッパ特許出願第８３８５０２７３．０号によれば
、蛋白およびペプチド（特に合成したもの）、炭水化物
、糖脂質および他の低分子（例えばビオチン）、および
特に免疫原性が充分強くないものも、免疫原性担体複合
体（所謂イスコム）に結合させることにより（所謂イス
コム）、免疫原性を付与させられることが判明した。

イスコムとはグリコシド（アジュバント）と疎水性の抗
原性蛋白又はペプチドとの複合体である。

これらの蛋白又はペプチドはワクチンの調製に使用でき
るようなものである。このアジュバント（グリコシド）
はイスコム中では、従来法で抗原と混合して用いるのに
必要なアジュバント巾よりもはるかに低い濃度で作用す
ることができる。従ってアジュバントによる副作用の問
題を避けることができる。

本発明では、免疫原性ペプチド又は免疫原性蛋白を含み
、従って免疫応答（特にこれらに対する抗体産生）を刺
激させるイスコムは、前記の分子に結合させることがで
きる。−次イスコムはこれらの分子の結合する担体構造
を形成する。このようにして−次イスコム中のペプチド
および結合した分子に対する抗体が得られる。

例えばワクチンとして使用する予定のペプチドを結合す
る為の一次イスコムは、それ自身ワクチンとして有用な
エンベロープ蛋白を含むことが好ましい。更に異なる微
生物の抗原決定基（エピトープ）を代表する数個のペプ
チドを、それ自身が１又は数個の微生物に対する有用な
ワクチンである一次イスコムに結合させることができる
。こうして多価ワクチンを調製することができる。

この新しい複合体は電子顕微鏡下では、担体分子（即ち
一次イスコム）と同じ形態構造をしている。しかし大き
な分子が一次イスコムに結合する時は形態上の変化が観
察される。本発明に従い約１−１０μｇの量でマウスを
免疫させたが、顕著な副作用もなく抗体が産生じた。投
与量は増加させたり減少させたり２．また２回以上免疫
することが必要なこともある。

一次イスコムに結合する分子は、−次イスコム中のペプ
チド又は蛋白と同様に微生物（下記）かう回収されるか
又は微生物中の抗原決定基を代表するペプチド、蛋白、
炭水化物又は他の分子である。もし大量のイスコムが使
用できる場合は、新に一次イスコムをｙ４製するより準
備したイスコムに、その抗体が産生させるペプチド又は
蛋白を結合させることがより合理的かもしれない。

−次イスコム中のこれらの蛋白又はペプチド複合体は疎
水性でなければれならなかった（ヨーロッパ特許出願第
８３８５０２７３．０号）。本発明では一次イスコムに
結合するこれらの分子は疎水性である必要はなく、ある
種の結合分子（その例は後述する）が必要なだけである
。

ワクチン用に大規模に培養することができないある種の
微生物が存在する。その１つの例はマラリアである。マ
ラリア蛋白の抗原決定単に対応するアミノ酸配列（ペプ
チド）が合成され、これは防御免疫を付与することがで
きると考えられている。しかしこれらのペプチドは免疫
原性が不充分なことがわかった。これらのペプチドはイ
スコムの生成に必要な適切な疎水性がしばしば欠如して
いた。疎水性分子をこれらのペプチドに結合させイスコ
ムを調製することは可能であるが、既に調製しである一
次イスコムにペプチドを結合させる方が、特に技術的又
は免疫原性の面からより適切かもしれない。これは又マ
ラリア及び例えば灰白肺炎（−次イスコム中の複合体結
合ポリオペプチド）の両者に対する複合ワクチンを得る
ことを可能にする。

一次イスコムに結合するペプチドは好ましくは合成品、
又は微生物から生成したものであり、しばしば分析して
抗原決定基を有することを確認する。

抗原決定基エピトープの標準的な大きさは１−４アミノ
酸である。これらのペプチドは４０以下のアミノ酸（１
０−２５個のアミノ酸が適当）を有することが好ましい
。２５個以上のアミノ酸を有するペプチドは合成が困難
であり、折り畳まれて１： 抗原決定基を隠してしまいやすい。

もしペプチドが短くて約１０個以下のアミノ酸しか含有
しない場合、又はもしペプチドが折り畳まれて一次イス
コム中の疎水性部分内に入り込みやすい疎水性基を有す
る場合は、所謂スペーサーを用いて分子を長くして一次
イスコムの外に出すことが適当である。ここでスペーサ
ーとは、６゜７．８，９．１０．１１．１２．１３．１
４゜１５．１６．１７，１８．１９．２０．２１゜２２
．２３．２４．２５．２６個の水酸基（これが脂肪族基
を親水性にする）と、鎖の各末端に例えばＮＨ−、Ｃ０
０Ｈ−、ＳＨ−又はＯＨ−基の結合性官能基（７頁に記
載したようなもの）を有する、２．３．４．５．６．７
，８．９．１０゜１１、又は１２個（好ましくは６．７
．８１１！ｉｌ＞の炭素原子を有する脂肪族鎖（例えば
グルコースアミン）か、又は１．２．３．４．５，６．
７．８゜９．１０．１１．１２．１３．１４．１５．１
６゜１７．１８．１９．２０個のアミノ酸（好ましくは
例えばグリシン又はプロリンのような親水性アミノ酸）
より成るペプチド（例えばポリグリシン又はポリプロリ
ン）である。このスペーサーは下記の結合法の１つを用
いて、末端の官能基を介してまず一次イスコムに結合さ
せ次にペプチドに結合させることが好ましい。

担体分子に結合され得る分子としては、イスコムの調製
に１関して以下に記載される微生物から得られる環状又
は線状蛋白およびペプチド；線状又は環状合成ペプチド
、又は例えばマラリアを代表するアミノ酸配列をもちい
るハイブリッドＤＮＡ法により得られるペプチド、ボ・
リオウイルス由来のペプチド、特にＢ型肝炎ウィルスよ
り得られる２７７−３００ペプチド、特に３２−７４．
１１０−１５６領域のペプチド；及び特に１４４−１４
５のアミノ酸配列を有するペプチド：狂犬病ウィルス、
特に１−５０．２９０−３２０領域及び特に１００−１
７５領域のペプチド；１４０−１４６．１８７−１９６
のアミノ酸配列又はＣｙｓ５２−Ｃｙｓ２７８又は２０
７−２２０領域から選ばれるアミノ酸配列を有するイン
フルエンナウイルスペプチド；口蹄疫ウィルス、特に１
４１−１６０．１４４−１６０．１４６−１５４．１４
４−１５０．１４２−１５８のロ蹄疫つィルスペプチド
；Ｔ−細胞の増殖因子（インターロイキン）、好ましく
は７９−９２．１３９−１５３Ｃ、１１１−１２５及び
１８−３２Ｇのアミノ酸配列を有するペプチド、エプス
タインバーウィルスから得られるペプチド、特に配列Ａ
：ＡＳｐ、Ｖａｌ、Ｇｌｙ、Ｇｌｙ、Ｌｙｓ。

Ｌ’ｌ／Ｓ、Ｈｉｓ、Ｇｌｎ、Ｌｅｖ、Ａｓｐ。

ｃｙｓ、　Ｌｅｕ、ｊｅｕ　：配列Ｂ：Ｈｉｓ。

ＨｉＳ、Ａｌａ、Ｑｌｕ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ。

Ａｓｎ、Ｐｒｏ、Ｃｙｓ、Ｌｅｕ、Ｌｅｕ　：配列Ｃ：
ＡＩａ、ＴｒＤ、ｐｒｏ、ＡＳｎ、Ａｓｎ。

Ｔｈｒ、Ｇｌｕ、Ｔｈｒ、ＡＳＤ、Ｐｈｅ。

Ｌｙｓ、Ｃｙｓ、Ｌｅｕ、Ｌｅｕ：）ＩＴＬＶ　　１□
、２又は３型ウイルスの抗原決定基；血液型物質中のペ
プチドなどがある。

本発明においては一次イスコムに、抗体を作成すること
が好ましいペプチド、ポリペプチドそして特にステロイ
ドホルモン、ペプチドホルモンおよびプロスタグランヂ
ンの群の特別なホルモンを結合させることができる。そ
のホルモンの例としては以下のようなものがある：チロ
トロピン、アデノフルチコトロビン、黄体形成ホルモン
、ゴナドトロピン放出ホルモン（Ｌｌ−ＩＲＨ）　、卵
胞刺徴ホルモン、プロラクチン、生長ホルモン、オキシ
トシン、パップレシン、副甲状腺ホルモン、カルシトニ
ン、インスリン、グルカゴン。又本発明において結合さ
せることのできる酵素に対する抗体を作成することも好
ましい。その例としてはリゾチームとペルオキシダーゼ
がある。これらの酵素は４０個以上のアミノ酸を有して
いる。

又イスコムに炭水化物や炭水化物含有構造、例えばリポ
多糖類、莢膜を有する微生物（例えば大腸菌、特にに−
抗＠１−１３、ヘモフィルスインフルエンザ、髄膜炎菌
）の多糖類、ガングリオシド（例えばＧＭｌ）およびグ
リオーマガングリオシド中の血液型物質中の糖蛋白中の
少糖類等を結合させることも可能である。血液型物質に
対する抗体が産生されれば、血液型の分析に対し実用上
の利点がある。グリオーマガングリオシドは脳腫瘍中の
ガングリオシドにおきる変化により生成される。このグ
リオーマガングリオシドに対する抗体を用いて脳腫瘍が
診断できるかもしれない。

この担体に結合される物質の例としてはリポ蛋白、他の
糖蛋白およびビオチンがある。

これらの分子は、分子中に既に存在するか又は分子に結
合した結合性官能基および一次イスコム中の官能基（例
えば蛋白又はペプチド中のアミノ酸、又はグリコシド中
のＨＯ−、ＣＨＯ−又は）−１００Ｇ−基）を介して一
次イスコムに結合している。この点で既知の結合反応が
利用される。この点で最も好ましい結合反応は： 結合すべき分子　　　　　　　　　　　　　　　−次イ
スコム中の中の官能基　　　　　　活性化試薬　　　　
　　官能基−ＮＨ２ゲルタールアルデヒド　　　　−Ｎ
Ｈ２（−８Ｈ）（α又はε）　カルボジイミド　　　　
　　　−〇０２Ｈジイミドエルテル　　　　　　−ＮＨ
２ジイソシアネート　　　　　　−ＮＨ２（−ＯＨ）Ｍ
ｅＯ−Ｃ１２−トリアジン　−〇Ｈ，−８Ｈ。

ＮＨ２ アリルハロゲナイド　　　　　−Ｎ）−１２，、−ＯＨ
。

５Ｈ −Ｃ０２日　　　カルボジイミド　　　　　　　−ＮＨ
，，（−ＯＨ）−８）Ｉ　　　　　　ＭｅＯ−Ｃｊ！□
−トリアジン　−〇）−１，−８８゜−Ｎ　ｌ−１２ ０）−１団調整９−１０　　　　　　　−ＮＨ２幾つか
の結合法がジャーナル・オブ・イムノロジカル・メソツ
ズ（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｉｍｎ＋ｕｎｏｌｏｇｉｃ
ａ１Ｍｅｔｈｏｄｓ　）第５９巻（１，９８３年）１２
９−１４３頁、２８９−２９９頁：メソツズ・イン・エ
ンザイモロジ−（Ｈｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏ
ｌｏｂｙ　）第９３巻、２８０−３３３頁；アナリテイ
カル・バイオケミストリー（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｂ
ｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　）第１１６巻、４０２−４０
７頁（１９８１年）に記載されており、参考の為それら
もここに引用しである。

本発明の新規な複合体を調製するには、まず担体とイス
コムを作成し、次に免疫原性を付与するべき分子、又は
免疫原性を強めるべき分子をこれらに結合させる。

■、イスコムの調製（−次イスコム） 疎水性領域を有する抗原性蛋白又はペプチドとグリコシ
ドとの免疫原性複合体は、疎水性領域を有する蛋白又は
ペプチドを１つ以上の可溶化剤と混合して、荷電した単
量体抗＠蛋白又はペプチドと可溶化剤とで複合体を作ら
せた後、ミセルを形成するのに必要な少なくとも臨界濃
度の、疎水性又は親水性領域を有する１つ以上のグリコ
シドを含有する゛グリコシド溶液の存在下で、荷電した
単量体抗原性蛋白又はペプチドを可溶化剤から分離する
か、又は可溶化剤から分離して直接上記のグリコシド溶
液に移して、蛋白又はペプチドとグリコシド溶液との複
合体を形成させ、この複合体を単離し精製することによ
り調製される。

グリコシドの疎水性領域に結合する疎水性領域を有する
蛍白又はペプチドは、 Ａ）　エンベロープのあるウィルス、細菌−、マイコプ
ラズマ、寄生体又は動物細胞由来か又はそのものである
、親水性又は疎水性基を有する両親媒性蛋白又はペプチ
ド、又はハイブリッドＤＮＡ法により産生される蛋白又
はペプチド、又は合成分子、 Ｂ）　疎水性基を結合させることにより両親媒性にされ
る親水性蛋白又はペプチド。これらの蛋白又はペプチド
は、ウィルス、細菌、マイコプラズマ、寄生体、動物細
胞より得られるか、又は合成されるか、又はハイブリッ
ドＤＮＡ法により得られる。

Ｃ）　親水性蛋白の利用できなかった疎水性部分を化学
的方法により利用できるようにした両親媒性蛋白又はペ
プチド。これらの蛋白は上記の微生物又は細胞に由来す
るか又はハイブリッドＤＮＡ法により、又は合成により
得られる。

ａ）　全細胞又はウィルス由来の膜蛋白又は膜ペプチド
の調製に関して、複合体の調製は原則として以下の３段
階より成る：動物細胞又は微生物又はその断片の精製又
は単離；疎水性蛋白の可溶化と可溶化剤の除去、そして
同時に複合体中の目的の抗原をグリコシドを利用して免
疫原性のある形に移動（免疫原性複合体）。

精製と単離 エンベロープを有するウィルス、マイコプラズマ、細菌
、寄生体及び動物細胞を以下のような公知の方法（例え
ば［Ｔｈｅ　Ｔｏｏｌｓ　ｏｆ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔ
ｒｙ　Ｊティー・ジー・クーパー（Ｔ　Ｇ　ｃｏｏｐｅ
ｒ＞　、ジョンウイリーアンドサンズ（Ｊｏｈｎ　１４
ｉ１ｅｙ　＆　５ｏｎｓ　）社（１９７７年）ニューヨ
ーク、を参照、参考の為ここに引用しである）で濃縮し
精製する。例えば遠心分離、超遠心分離、電気泳動およ
び種々クロマトグラフィー法（例えばゲル濾過、疎水性
相互作用、アフィニティークロマトグラフィー）又は糖
密度勾配遠心分離、パーコール又はホローファイバー透
析による濃度勾配遠心分離等である。細菌については、
細胞壁を例えば超音波又はフレンチプレス法を用いてま
ず溶解又は分解することが必要又は有利なことがある（
例えばコタロウブルズどスタイン（Ｃｏｔａ−Ｒｏｂｌ
ｅｓ　ａｎｄ　５ｔｅｉｎ　）、ＣＲＣハンドブック（
ＣＲＣＨａｎｄｂｏｏｋ　ｏｆ　Ｍｉｃｒ。

ｂｉｏｌｏ（１１／　）第２巻（１９７３年）、８３３
−８４４頁を参照、これはここで引用されている〉。

可溶化 精製した動物細胞又は微生物又はその断片を次に非イオ
ン性又は両性イオン性界面活性剤（これらは過剰に使用
する）と混合する。適切な非イオン性界面活性剤の例と
しては脂肪族又はアラリルファテイツク酸およびアルコ
ールを有するポリグリコールエステルおよびポリグリコ
ールエーテルがある。具体例としては一般式Ｃ１Ｈ２ｎ
＋１（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｘＯＨ（短縮形ｃｎＥｘ）を有
するアルキルポリオキシエチレンエーテル；アルキル塁
とポリオキシエチレン鎖の間にフェニル環を有するアル
キルフェニルポリオキシエチレンエーテル（短縮形Ｃφ
Ｅｘ）、例えばトリトンＸ−１００＝３級−ＣφＥ　　
（ポリエチレン８９．６ オキサイドのオクチルフェノールエーテル）、アシルポ
リオキシエチレンエステル；アシルポリオキシエチレン
ソルビタンエステル（短縮形ＣソルビタンＥｘ）　（例
えばツイーン２０、ツイーン８０）、β−Ｄ−アルキル
グリコシド（例えばβ−Ｄ−オクチルグルコシド）があ
る。下記のグリコシド（特にサポニン）も使用可能であ
る。しかしこれらは弱界面活性剤であり他の界面活性剤
と共に使用すべきである。適当なイオン性界面活性剤の
典型的な例としては没食子酸界面活性剤（例えばデスオ
キシコレートおよびコレート）がある。

複合体化界面活性剤（例えばタウロデオキシコレートお
よび、グリコデオキシコレート）も使用可能である。使
用可能性ある両性イオン性界面活性剤としてはリソレシ
チンおよび合成リソリン脂質がある。上記の界面活性剤
の混合物ら使用可能である。

可溶化は又アルコール、有機溶媒又は両親媒性の低分子
（例えばヘプタン−１，２，３−トリオール、ヘキサン
−１，２，３−トリオール、耐酸、水溶性ペプチドおよ
び蛋白又はそれらの混合物、又は界面活性剤をもちいて
も可能である。

脂質および疎水性蛋白の量に比較して界面活性剤は過剰
に使用される。細胞又は微生物および界面活性剤は１：
３から１＝１０の重量比で混合物することが適切である
。

細胞又は微生物および可溶化剤は緩衝化した、おそらく
は生理食塩水中で混合される。生理食塩水のモル濃度は
０．０２から０．５Ｍ（好ましくは０．０５から０．２
５Ｍ）が好ましい。界面活性剤は至温で約１時間作用す
るはずである。

塩としては塩化ナトリウムが好ましいが、他の塩も可能
である、特にアルカリイオン、アルカリ上類イオンおよ
びアンモニウムイオンおよび強鉱酸および有機酸（例え
ば酢酸、トリクロロ酢酸、蟻酸、および蓚酸）との塩も
可能である。緩衝液としては、ｐｉ−１６，５−９の緩
衝液が適切である。

コール酸およびデオキシコール酸を用いるときは、ｐＨ
８−９が好ましく、非イオン性界面活性剤を用いる時は
ｐＨ７，４が好ましい。蛋白の可溶化に有機酸を用いる
時は緩衝液を省略してもよい。

細胞又は微生物を可溶化する時可溶化剤および細胞又は
微生物の断片（以下断片と呼ぶ）の混合物が形成される
。断片の中には可溶化剤との複合体としての荷電した疎
水性領域を有する単量体抗原性蛋白がある。疎水性又は
親水性領域を有しミセルを形成するのに必要な少なくと
も臨界濃度の、１つ以上のグリコシドを含有するグリコ
シド溶液の存在下又は、グリコシド溶液に直接移すこと
により、可溶化剤から荷電した単量体性蛋白を分離して
免疫原性複合体が産生される。本発明の複合体を産生ず
る前、している時、又はしだ後（好ましくはする前）に
残りの断片を除去する。

例えば透析、ゲル濾過、又はクロマトグラフィー法によ
り、可溶化剤、荷電したＱｉ量体抗原性蛋白、グリコシ
ド、およびおそらくは他の断片の混合物から、可溶化剤
を除去するか、又は例えば濃度勾配遠心分離、クロマト
グラフィー又は電気泳動により、上記混合物から荷電し
た単量体抗原性蛋白を分離することにより、担体蛋白が
産生される。基本的に重要な点は、ミセル型が存在する
グリコシドの存在している時単量体抗原性蛋白は可溶化
剤から分離され、又は分離後直接グリコシドに移動され
る。単量体抗原性蛋白は可溶化剤から分離されることに
より、グリコシドと直接接触し、本発明の特別の複合体
が生成する。このグリコシドのミセル型がこの複合体を
作る為の基本であり、複合体はグリコシドミセルの疎水
性領域と膜蛋白の疎水性領域との引力により生成するこ
とが仮定されている。複合体中のグリコシドの借は使用
するグリコシドと複合体結合膜蛋白によって変わり、０
．５から５０重量％（特に０．５から２５千吊％、好ま
しくは０．５から１５、しばしば０．５から１０、およ
び特に２から８重世％のあいだである。しかしグリコシ
ドの存在しない時単量体抗原性蛋白が可溶化剤から分離
される場合、ヨーロッパ特許出願第８１１０２２１３．
６号で産生される型の蛋白ミセルが生成する。

成分の沈降定数は以下の順序で減少する為、濃度勾配遠
心分離により他の成分を除くことが好ましい：細胞断片
、可溶化剤又はグリコシドとの蛋白複合体、単量体蛋白
および可溶化剤。従ってグリコシドを添加する前に他の
成分は濃度勾配遠心分離により、可溶化剤、単量体蛋白
、および他の断片から除去できる。そして可溶化剤は例
えば透析、ゲル濾過、クロマトグラフィーにより除去、
又は単量体蛋白は電気泳動、クロマトグラフィー、濃度
勾配遠心分離により、可溶化剤から分離される。濃度勾
配遠心分離においては、濃度勾配遠心分離をしている時
（複合体が生成している時）、他の成分を除去すること
ができる。又上記のように複合体が生成した後、例えば
遠心分離、アフィニテイクロマトグラフイー、又はゲル
濾過により、他の成分を除去することが可能である。

グリコシドは疎水性及び親水性領域を有する任意のグリ
コシドが使用できる。好ましくは、Ｒ。

チェシエ及びウルツ（ＲＴｓｃｈｅｓｃｈｅ　ａｎｄ　
Ｗｕｌｆ）の［Ｃｈｅｍｉｅ　ｕｎｄ　Ｂｉｏｌｏｇｉ
ｅ　ｄｅｒ　５ａｐｏｎｉｎｃ　１ｎＦｏｒｔｓｃｈｒ
ｉｔｔｅ　ｄｅｒ　Ｃｈｅｍｉｅ　Ｏｒｇａｎｉｓｃｈ
ｅｒＮａｔｕｒｓｔｏｆｆｅ　Ｊ　　（Ｗ、ヘルツ、Ｈ
，グリーゼバツハ、Ｃ、Ｗ、カービイ（Ｗ、　Ｈｅｒｚ
　、　ＩＩ　Ｇｒｉｅｓｅｂａｃｈ。

ＧＷに１ｒｂｙ　）発行）、第３０巻（１９７３年）に
記載のサポニンであり、特に極性酸性ごスデスモシドの
ような極性の強いサポニン、例え、ばキラヤバルクアラ
ロシドＡ　（Ｑｕｉｌｌａｊａｂａｒｋ　Ａｒａｌｏｓ
ｉｄｅ＾）、チクセツサポニンＩＶ　（Ｃｈｉｔｏｓｅ
ｔｓｕｓａｐｏｎｅｎ　ｒＶ　）、カレンデュラグリコ
シドＣ（Ｃａ１ｅｎｄｕｌａ−Ｇｌｙｃｏｓｉｄｅ　Ｃ
）　、チクセツサポニンＶ（Ｃｈｉｋｕｓｅｔｓｕｓａ
ｐｏｎｉｎ　Ｖ　）　、アキランテスーサボニン３　（
Ａｃｈｙｒａｎｔｈｅｓ−３ａｐｏｎｉｎ　Ｂ　）　、
カレンデュラグリコシドＡ　（Ｃａｌｅｎｄｕｌａ−Ｇ
ｌｙｃｏｓｉｄｅ　八）　、アラロシド３　（Ａｒａｌ
ｏｓｉｄｅ　Ｂ　）　、アラロシドＣ（Ａｒａｌｏｓｉ
ｄｅ　Ｃ）　、ブトランシアーサポニン■＜　Ｐｕｔｒ
ａｎｊｉａ−３ａｐｏｎｉｎ　Ｉ［［＞　、ベルサマサ
ボニシド（ＢｅｒＳａｌｌａＳａｐＯｎｉＳｉｄＥ！　
）　、プトランジアーサボニ：ｚ［（Ｐｕｔｒａｎｊｉ
ａ−３ａｐｏｎｉｎ　［Ｖ　）　、’ｒ−リコシドＡ（
Ｔｒｉｃｈｏｓｉｄｅ＾）、トリコツト３　（Ｔｒｉｃ
ｈｏｓｉｄｅ　Ｂ）、サポナシドＡ　（５ａｐｏｎａｓ
ｉｄｅ　Ａ）　、トリコツトＣ（Ｔｒｉｃｈｏｓｉｄｅ
　Ｃ）　、ギブソシド（Ｇｙｐｓｏｓｉｄｅ　）、ヌタ
ノシド（Ｎｕｔａｎｏｓｉｄｅ）　、ジアントシドＣ（
Ｄｉａｎｔｈｏｓｉｄｅ　Ｃ）　、サボナシドＱ　（５
ａｐＯｎａＳｉｄｅＤ）からの抽出物、好ましくはエス
キュラスヒボ力スタヌム（Ａｅｓｃｕｌｕｓ　ｈｉｏｐ
ｏｃａｓｔａｎｕｍ）からのニスシン（ａｅｓｃｉｎｅ
　）　　（Ｔ、バットとＷ、ウィンクラ（Ｔ　Ｐａｔｔ
　ａｎｄ　’ｄ　Ｗｉｎｋｌｅｒ）　：　Ｄａｓｔｈｅ
ｒａｐｅｕｔｉｓｃｈ　Ｗｉｒｋｓａｍｅ　Ｐｒ１ｎｚ
ｉｐ　ｄｅｒＲＯ３ＳｋａＳｔａｎｎｉｅ　　（ニスキ
ュラスヒポ力スタヌム）、アルツナイミテルフオルシュ
ング （Ａｒｚｎｅｉｍｉｔｔｅｌｆｏｒｓｃｈｕｎａ　）第
１０巻く第４号）、２７３−２７５頁（１９６０年））
、又はギプソフイラストルチウム（Ｇｌ／ＤＳＯＤｈｉ
　ｌ　ｌａｓｔｒＬＩｔｈｉｌｌｍ）からのサボアルビ
ン（Ｒ，ボクテン、Ｐ、ジュース及びＲ，ルイセン（Ｒ
Ｖｏｃｈｔｅｎ、　Ｐ　Ｊｏｏｓ　ａｎｄ　ＲＲｕｙｓ
ｓｅｎ　）　：　Ｐｈｙｓｉｃｏ−ｃｈｅｍｉｃａｌ　
ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ　ｏｆｓａｐｏａｌｂｉｎ　　ａ
ｎｄ　　ｔｈｅｉｒ　　ｒｅｌａｔｉｏｎ　　ｔｏ　　
ｔｈｅ　　ｆｏａｔｎｓｔａｂｉ　ｌ　ｉｔｙ、　　ジ
エイ、ファーム、ベルブ（ＪＰｈａｒｍ　Ｂｅ１ｇ）第
４２巻、２１３−２２６頁（１９６８年））、特にキラ
ヤサボナリアモリナ（Ｑｕｉｌｌａｊａ　５ａｐｏｎａ
ｒｉａ　Ｈｏ１ｉｎａ　）からのサポニン抽出物、主に
に、ダルスガード（にＤａｌｓｇａａｒｄ　）　：５ａ
ｐｏｎｉｎ　ＡｄｊｕＶａｎｔＳ　、プルオフイントエ
ピツツ（Ｂｕｌｌ　ＯＮ　Ｉｎｔ　Ｅｐｉｚ　）第７７
巻、第７−８号、１２８９−１２９５頁（１９７２年）
の方法により産生されるＤＱ−油出物、及びに、ダルス
ガード（にＤａｌｓｇａａｒｄ　）　：　５ａｐｏｎｉ
ｎ　Ａｄｊｕｖａｎｔｓ　ｍ、アーキフフイアディーゲ
ザムトビルスフオルシュング（＾ｒｃｈｉｖ　ｆｊｒ　
ｄｉｅ　Ｇｅ５ａｉｔｅ　Ｖｉｒｕｓｆｏｒｓｃｈｕｎ
ｇ　）第４４巻、２４３−２５４頁（１９７４年）の方
法により産生されるキルＡ　（Ｑｕｉｌ　Ａ）である。

又グリコシドの混合物も使用可能である。グリコシドの
添加量は、ミセル形成に必要な最低濃度（ＣＭＣ）の少
なくとも１−３倍、好ましくは少なくとも５倍、特に少
なくとも７−１２倍でなければならない。この場合グリ
コシドは、膜蛋白の１ｉ吊体型に結合、及び捕捉できる
と考えられる。

好ましくは、ミセル形成に必要な最低濃度が０．０３重
量％であるキルＡ（Ｑｕｉｌ＾）を用いる。

従ってキルＡの世は少なくとも０．０２重世％、特に０
．０５−０．５川向％、好ましくは０．２重量％でなけ
ればならない。グリコシドの上記の引用例は参考のため
に示したものである。

荷電した単量体蛋白は、遠心分離、透析、電気泳動及び
種々のクロマトグラフ法により可溶化剤から分離される
。

遠心分離法 上記により調製した断片化した細胞又は微生物と可溶化
剤との混合物は濃度勾配遠心分離される。

これは可溶化剤を含有する糖又は塩溶液の上に重層され
る。この層の下にグリコシドを含有する濃度勾配が存在
する。これは例えば糖の濃度勾配又はグリセロール、メ
トリズアミド又は重い塩（＠えば塩化セシウム）の濃度
勾配（すなわち温度勾配用物質として作用するのに適切
な密度と粘性を有する比較的不活性な物質）である。糖
の場合の例を以下に示す。

濃度勾配東予を少なくとも１００．ＯＯＯｇ（これは実
際の状況の時間と′ｆｉｉ度勾配によ１．）変電する）
で遠心分離する。糖としては単糖類（例えばブドウ糖、
乳糖、麦芽糖）、三糖類（例えばショ糖）が用いられる
が、三糖類、四糖類及びグリセリンも使用可能である。

好ましくはショ糖を用いる。濃度勾配中の糖の出発濃度
は少なくとも５、好ましくは１５−２５重量％（濃度勾
配層の最上層）であり、最終濃度は少なくとも２０、好
ましくは４５−６０重量％（ａ度勾配層の最下層）が適
当である。例えば上層が糖含量として５−２５重量％で
、下層が糖含量として２０−６０重量％の濃度勾配がで
きる。しかし数個の層が存在することも可能であり、そ
の場合個々の層の濃度差はそれに応じて減少する。Ｓａ
度勾配はグリコシド又はグリコシドの混合物を含む。グ
リコシドの量はＣＭＣの１−３倍、特に少なくとも５倍
、好ましくは少なくとも７−１２倍である。キルＡ（Ｑ
ｕｉｌ　Ａ）の場合は少なくとも０，０２、特に少なく
とも０８０５−０．５、好ましくは少なくとも０．２重
量％である。このグリコシド含有濃度勾配中で、可溶化
剤は分離され、可溶化剤と蛋白の複合体は蛋白−グリコ
シド複合体に変換する。

糖の濃度勾配の上に、可溶化剤又は可溶化剤の混合物を
含む、糖又は重い塩溶液の層があり、脂質はこの層にと
どまる。この層の可溶化剤のｍｒ５Ｘは、微生物又は細
胞と可溶化剤の混合物として添加した時の濃度以下又は
同じであり、０．２５−３重量％が適当であり、好まし
くは０．７５−１．５重量％であり１重石％が最も好ま
しい。糖又は塩の濃度は、下層にあるグリコシド含有濃
度勾配の上層中の濃度と同じか又はそれ以下であり、好
ましくは糖の５−２５重伍％、特に１５重量％である。

少なくとも１００．０００９で少なくとも１６時間（好
ましくは２０℃で２０時間）遠心分離後、蛋白画分を集
め緩衝液（０，５Ｍ−０，ＯＯＩＭ）、好ましくは０．
００５Ｍトリス−塩酸、０．０１Ｍ　　ＮａＣ１、ｐＨ
７，４、又は０．２Ｍ酢酸アンモニウム緩衝液、ｐＨ７
，４で透析し、Ｔ、Ｃ、クーパー（Ｔ　Ｇ　Ｃｏｏｐｅ
ｒ）のｒ　Ｔｈｅ　Ｔｏｏｌｓ　ｏｆＢｉｏｃｈｅｍｉ
ｓｔｒＮ　、ジョンウイリーアンドサンズ（Ｊｏｈｎ　
Ｗｉｌｅｙ　＆　５ｏｎｓ　）　　（ニューヨーク、１
９７４年）に記載の方法、例えば凍結乾燥、真空透析、
及び限外濾過法で濃縮し全成分を沈降させると、蛋白と
可溶化剤の複合体から可溶化剤がはずれ、単量体蛋白は
グリコシドに移行し複合体を形成する。その後透析する
ことにより糖が除去される。

この複合体をさらに例えば濃度勾配遠心分離（例えば２
０−６０重重畿の糖、好ましくは１０−４０重量％のシ
ョ糖を含む糖のａ度勾配）により、遊離のグリコシドか
ら精製することも可能である。

透析法 上記の様にｌｌｌ１胞又は微生物の精製の棲、及び上記
の重量比で可溶化剤と混合した後、上記の緩衝液中の細
胞と可溶化剤の混合物を、ＣＭＣの少なくとも１−３倍
、好ましくは７−１２倍（キルＡ（Ｑｕｉｔ　Ａ）の場
合は０．０５−２重Ｍ％、好ましくは０．２重量％）と
直接混合し、緩衝液（例えば０．５−０．００１Ｍ、好
ましくは０．００５Ｍトリス−塩酸、０．０１Ｍ　　Ｎ
ａＣ１、ｐ１１７．４、特に０．２Ｍ酢酸アンモニウム
緩衝液、ｐＨ７，０）で透析してもよい。こうしてグリ
コシドの存在下で可溶化剤が分離される。こうしてでき
た膜蛋白複合体を次に、ｌ立立皿１の第１節に記載した
様に（ただしグリコシドは添加しないで）濃度勾配遠心
分離により単離し、他の断片や遊離のグリコシドから分
離する。

緩衝液中の細胞、微生物及び可溶化剤の混合物も濃度勾
配遠心分離が可能であり、例えば−し記緩衝液中の５−
６０重量％の糖濃度勾配、好ましくは１０−１２重量％
のショ糖濃度勾配上に重層し、１５０．０００ｇで少な
くとも２０分、好ましくは２５０．０００ｇで３０分遠
心分離する。こうして可溶化剤と蛋白の複合体から他の
成分が分離される。

上層の蛋白液（上層と呼ぶ）を抽出し、ＣＭＣの少なく
とも１−３倍、好ましくは少なくと５７−１２倍（キル
Ａ　（Ｑｕｉｌ　Ａ）の場合は０．０５−０．５重量％
、好ましくは０．２ｆｆｉ１％）添加し、緩衝液０．５
−０．００１Ｍ、特に０．００５Ｍトリス−塩酸、０．
０１Ｍ　　ＨＣｌｐす７，４、好ましくは０．２Ｍ酢酸
アンモニウムで透析する。

グリコシドの存在下で可溶化剤が除去される。濶度勾配
遠心分離（遠心分離法、第１節参照）によりざらに精製
できる。５−６０重但％の糖、好ましくは２０−５０又
は１０−４０重量％の糖を含有する糖の濃度勾配により
さらに精製できる。

電気泳動法 断片化した微生物又は細胞及び可溶化剤との混合物、こ
の混合物を例えば緩衝液中５−６０重Ｍ％、好ましくは
２０−５０重量％又は１０−４０重Φ％で濃度勾配遠心
分離して得られる上層の蛋白液（他の断片と遊離の可溶
化剤は除去されている）は、電気泳動法により可溶化剤
より分離することもでき、ＣＭＣの少なくとも１−３倍
、好ましくは７−１２倍（キルＡ　（Ｑｕｉｌ　Ａ）の
場合は０．０５−０．５重量％、好ましくは０．２重量
％を含む溶液中に移される。こうして荷電した単聞体抗
原性蛋白□が可溶化剤から分離される。電気泳動により
分離する場合は、電気泳動を妨害し過熱の原因となる余
分の塩が添加されてない可溶化剤−緩衝液が適切である
。担体を含む又は含まないゾーン電気泳動や、担体を含
む又は含まない等速電気泳動を用いることも可能である
。ポリアクリルアミド、寒天、シリカゲル、澱粉、セル
ロース、ポリビニルクロリド、イオン交換体、セライよ
　う　ｔご行　２　ジ　。　吏ｌご、堝貴袈Ｃよ４度勾
β己−ｄＬ含ｋｔこふり行シう。

出発物質中に種々の電荷又は重量を有する疎水性膜蛋白
が含まれていても、電気泳動又は遠心分離によりそれら
をお互に分離し、それらの異なる複合体を作ることがで
きる。こうして種々の膜蛋白の複合体を分離したり増や
したりすることができる。

クロマトグラフ法 細胞断片から精製機可溶化した蛋白はクロマトグラフ法
（例えばゲル濾過、疎水性クロマトグラフィー又は親和
性クロマトグラフィー（例えばイオン交換クロマトグラ
フィー））により、随時可溶化剤から分離することがで
きる。これらのクロマトグラフィーでは抗原構造は、例
えばセルロース、アガロース、デキストラン、アクリル
アミド及びガラスより成る不溶性基層（マトリックス）
上に吸着する。このマトリックス構造には種々のリガン
ドが結合しており、これらの特異的な性質を利用して分
離がなされる。使用する可溶化剤がマトリックス中を吸
着されないで通過する時、ふつう抗原構造は吸着される
。このあと脱着を行なう。脱着段階の前又はその途中に
、可溶化剤、塩及び緩衝液物質の交換があり、可溶化剤
がグリコシドに交換され、複合体が形成される。

イオン交換クロマトグラフィーでは、ジエチルアミノエ
チル（ＤＥＡＥ）のような荷電したりガント分子がマト
リックスに結合しており、陽イオン交換剤として用いら
れる。カルボキシル基（ＣＭ）又はリン酸基（Ｐ）がマ
トリックスに結合している場合は陰イオン交換体として
用いられる。抗原構造と可溶化剤の電荷の差を利用して
これらの分子が分離される。一般的に可溶化剤は荷電し
ておらず蛋白は荷電している。可溶化剤の存在下で塩の
濃度勾配（例えばに−又はＮ　ａ　Ｃ１−）。

又は適当な緩衝液（例えばリンＩ！２緩衝液）によるｐ
Ｈの調節を利用して溶出を行なう（ｍ縮については上記
の可溶化を参照）。溶出中に蛋白がｖｉ製され、可溶化
剤は交換されるか、又は可溶化剤のかわりにもしグリコ
シドが溶離液に加えられている場合は複合体が形成され
る。続いて例えば透析又はゲル濾過により塩を除去する
。

、ゲル濾過の場合は、可溶化剤の分子量が抗＠構造の分
子量より小さいため後の方の両分に出てくることを利用
する。複合体が生成すると抗原含有構造がより大きくな
り、界面活性剤含有部分よりより離れていく。

免疫親和性クロマトグラフィーでは、抗体が前記のマト
リックスに不可逆的に結合し、その後で抗体の特異性と
親和力を用いて目的の抗原構造を精製する。可溶化剤は
抗体に対し全く親和性を右していない。穏和な変性く例
えばｐｔｔを２．５に下げる）及び可溶化剤又はグリコ
シドの存在下で溶出を行なう。

レクチンクロマトグラフィーではレクチンが用いられる
。レクチンは特異的な糖の官能基と可逆的に結合できる
一群の蛋白であり、たとえば糖蛋白に結合することかで
きる。レクチンは例えばセファロース（ファルマシア社
、ウプサラ（１Ｉｐｐｓａｌａ　）　）のようにリガン
ドとして結合しているか、又は適当なマトリックスにす
ぐ結合できる形で市販されている。界面活性剤（可溶化
剤）は固定化されたレクチンに対し全く親和性を有して
いない。吸着した抗原構造はふつう低分子の糖、それも
レクチンに対し粗相性を有するメチル化された糖（例え
ばマンノース、メチルマンノシド、グルコース、メチル
グリフシト及びＮ−アセチルグルコサミン）を、緩衝化
塩溶液に溶解させて可溶化剤又はグリコシドの存在下で
脱着を行なう。

共有結合クロマトグラフィーでは、チオール基を有する
抗原構造が共有結合でマトリックスに結合している。抗
原中のチオール基は、適当なマトリックスに結合した活
性化チオ基に、チオ−ジスルフィド交換により選択的に
結合する。この結合は可逆的であり、洗浄により可溶化
剤を除去した後、可溶化剤又はグリコシドの存在下でメ
ルカプトエタノール又はジチオスレイトールでジスルフ
ィド結合を還元することにより、チオール含有抗原構造
が溶出できる。

疎水性クロマトグラフィー この方法では、例えばアルキル（すなわちオクチル又は
フェニル）のような脂肪族又は芳香族型の固定化した疎
水性リガントと、蛋白又は他の抗原構造の疎水性表面と
の相互作用を利用する。高いイオン強度（例えば硫酸ア
ンモニウム）で吸着し、水又はエチレングリコールなど
の低いイオン強度で溶出する。

複合体が細菌の膜蛋白を含有する場合、上記の方法で細
胞物質を処理する前にまずｍｌ１１壁を破壊することが
有効である。疎水性蛋白の得られる細菌の例としては、
エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　）、スタフィ
ロコッカス（ＳｔａｐｈｙｌＯＣＯＣＣｉ　）　、ヘモ
フィルス（ｔｌａｅｎ＋ｏｐｈｉｌｕｓ　）　　（例え
ばト１．インフルエンザ（１１，１ｎｆｌｕｅｎｚａｅ
）　）　、ボルデテラ（例えばＢ。

バータシス（Ｂ、ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ　）　）　、　ヒ
プ’Ｊ　オ（Ｖｉｂｒｉｏ）　　（例えば■、コレラ（
Ｖ、ｃｈｏｌｅｒａｅ）　）、サルモネラ（ＳａｌＩｌ
ｌｏｎｅｌｌａ）　　（例えばＳ、テイフイ（Ｓ、ｔｉ
Ｄｈｉ　）　、Ｓ、バラテイフイ（Ｓ、ｐａｒａｔｉｐ
ｈｉ）　）などがあり、好ましくはコリ（Ｃｏｌｉ）の
粘着因子（例えばピリに８８　（Ｄｉｌｉ　　Ｋ２Ｓ）
　、及び例えばサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）の
ポリン（ｐｏｒｉｎ　）蛋白、又はＢ、パータシス（Ｂ
、　１）１３ｒｔＬｌｓｓｉｓ　）及びナイセリアメニ
ンジテイデイス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａｍｅｎｉｎｇｉｔ
ｉｄｉｓ）の外側の膜蛋白がある。

エンベロープを有する使用可能なウィルスの例としては
、オルソミキソウィルス（例えばインフルエンザＡ、Ｂ
、Ｃ型）、バラミキソウイルス（特に麻疹ウィルス、お
たふくかぜウィルス、パラインフルエンザ１．２．３及
び４型ウイルス、犬のジステンパーウィルス及び牛疫ウ
ィルス）、桿状ウィルス（特に狂犬病ウィルス）、レト
ロウィルス（特に猫白血病ウィルスと生白血病ウィルス
、ヒトＴ細胞リンパ親和性ウィルスＨＴＬＶ１．２及び
３）、ヘルペスウィルス（特にシュートレービーズ（Ｐ
ｓｅｕｄｏｒａｂｉｅｓ）　、ヘルペスシンプレックス
■及び■、サイトメガロウィルス）、コロナウィルス、
トガウィルス（例えばＥＥＥ、ＷＥＥ、ＶＥＥ　（東部
、西部及びベネズエラ馬脳炎、黄熱病ウィルス、特に牛
下痢ウィルス及びヨーロッパ肝煎つイルスアレナウイル
ス （Ａｒｅｎａｖｉｒｉｄａｅ）　、ポックスウィルス、
ブニアウイルス、特ニハンタンウィルス（Ｈｕｎｔａｎ
　Ｖｉｒｕｓ）、イリデイオウイルス、特にアフリカ豚
熱ウィルス、及び分類されてないものとしてヒトＢ型肝
炎ウィルスやマルプルグーエボラウイルス（Ｈａｒｂｕ
ｒｇ−Ｅｂｏｌａ　ｖｉｒｕｓ　）などがある。

本発明に使用できる寄生体の例としては原生動物があり
、例としてトキソプラズマ（例えばトキソプラズマボン
ブイ（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ　ｇｏｎｄｉｉ　）　）、
マラリア原虫（ＰＩａｓａ＋ｏｄｉｕｍ）　　（例えば
三日前原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ　ｖｉｖａｘ）　、
四日熱原虫（Ｐ、ｍａｌａｒｉａｅ）、熱帯熱原虫（Ｐ
、ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）　）　、ティレリアパルバム
（Ｔｅｉｌｅｒｉａ　ｐａｒｖｕｎ　）　、オパール（
ｏｖａＬｅ　）及びフイラロイデ（Ｆｉｌａｒｏｉｄａ
ｅ）　、好ましくはパラフイラリア（Ｐａｒａｒｉｌａ
ｒｉａ　）及びオンコはルカ（Ｏｒ＋ｃｈｏｃｅｒｃａ
　）　、赤痢アメーバ（ＥｎｔａｍＯｅｂａＨｉｓｔｏ
ｌｇｔｉｃａ　）　、種々の型のアナプラズマ（＾ｎａ
ｐｌａｓｍａ　）　、住血吸虫（Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍ
ａ　）　　（例えばシストソーマへマトピウム（Ｓｃｈ
ｉｓｔｏｓｏｍａｈａｅｌａｔｏｂｉｕｌｌｌ　）　、
？ンソーニ（ｍａｎｓｏｎｉ　）　、ジャポニカム（ｊ
ａｐｏｎｉｃｕｇ　）　）　、及びトリパノソーマ（Ｔ
ｒｙｐａｎｏｓｏｍａ　）　　（例エバｊｊ　ンｌ：’
　７　ｔ−’Ｊ　ハ／　？　−ｖ　（Ｔｒｙｐａｎｏｓ
ｏｍａ　ｏａｗｂｉｅｎｓｅ　）　、ブルセイ’（ｂｒ
ｕｓｅｉ　）又はコンゴレジ（ｃｏｎｇｏｌｅｓｉ　）
　）などがある。

ｂ）　疎水性非膜蛋白又は非疎水性蛋白又はペプチドか
ら出発することも可能である。非疎水性蛋白又はペプチ
ドは、そこに疎水性基を結合させることにより疎水性に
する。非疎水性蛋白は、エンベロープのある又はないウ
ィルス、細菌、マイコプラズマ、寄生体から得られる。

非疎水性蛋白を有するエンベロープのないウィルスの例
としてはピコルナウィルス（疎水性蛋白もを有すると考
えられる）、例えば口締免疫・ウィルス、ポリオウィル
ス）、アデノウィルス、バルボウイルス（例えば猫ペス
トウィルス及びブタパルボウイルス）、レオウィルス（
例えばロタウィルス）がある。マイコプラズマの例とし
てはＭ、ニューモニー（Ｈ，ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）　
、ミコイデス（ｍｙｃｏｉｄｅｓ）　、ボービス（ｂｏ
ｖｉｓ　）　、スイス（ｓｕｉｓ）　、ヒオリノス（ｈ
ｙｏｒｉｎｏｓ）　、オラーレ（ｏｒａｌｅ　）　、サ
リバリウム（ｓａｌｉｖａｒｉｕｍ）　、ホミニス（ｈ
ｏｍｉｎｉｓ　）及びファーメンタンス（ｒｅｒｍｅｎ
ｔａｎｓ　）がある。

これらの蛋白又ｔよペプチドは、ａ）精製及び単離に記
載した方法で精製して得られる。

非疎水性蛋白に結合し得る疎水性基は、直鎖、分校状、
飽和又は不飽和脂肪族鎖（好ましくは１゜２．３，４．
５．６．７．８．９．１０．１１゜１２．１３．１４．
１５．１６．１７．１８゜１９．２０．２１．２２．２
３．２４．２５゜２６．２７．２８．２９又は３０個の
炭素原子を有する）、又は疎水性アミノ酸又はペプチド
又は他の疎水性構造（例えばステロイド）がある。疎水
性構造の艮ざは蛋白の大きさと性質に合わせる。

例としては、１０−１５個のアミノ酸を右するペプチド
（口蹄疫ウィルス）を、アミノ末端又はカルボキシ末端
の２個のチロシンで作り出す。分子用が７０．０００ダ
ルトンの蛋白には約２０個の疎水アミノ酸が必要である
。これは経験的に試験されている。従って特に用いられ
るものは１−２０個のアミノ酸（好ましくは１．２．３
．４゜５個のアミノ１１ｉ）　　（特にＴｒｐ、１１ｅ
、Ｐｈｅ。

Ｐｒｏ、Ｔｙｒ、１−ｅｕ、Ｖａｒの中から選ば礼るも
の、特にＴｙｒ）を有するペプチド；コレステロール誘
導体（例えばコール酸、ウルソデオキシコールＭ）であ
る。

これらの疎水性基は、非疎水性蛋白に結合し得る官能基
に結合していなければならない。この官能基は第　　頁
に記載したもの（例えばカルボキシル、アミン、ジスル
フィド、ヒドロキシル、スルフ上１：リル及びカルボニ
ルＩＮ？ｌえはアルデヒド基））から選択できる。

疎水性構造における結合基としては、好ましくはカルボ
キシル シル又はスルヒドリル基：およびＣｙｓ，ＡＳＤ。

Ｇｊ！Ｕ．　ｌｊ／Ｓを含有するペプチドが選ばれる。

結合し侍る基を有する疎水性基は、例えば上記の可溶化
剤及び界面活性剤又は塩酸、酢酸、苛性液、アンモニア
（溶解すべき物質により異なる）を用いて、水に溶解し
なければならない。物質が沈澱しない様にｐＨを中性に
調整する：ここでは疎水性基が結合している蛋白を変性
させる様なｐＨにならない様に注意する。

疎水性分子を非疎水性蛋白にモル比を１０：１から０．
１：１（好ましくは１：１）で加える。

結合分子としてカルボキシル基を有する疎水Ｖ４基は、
水溶性カルボジイミド又は混合無水物により蛋白に結合
させる。前者の例ではカルボジイミドを用いてカルボキ
シル基をｐＨ５で活性化し、リン酸含量の多いｌ）８８
の緩衝液中で蛋白と混合りる。

後者の例ではジオキサン又はアセトニトリル中のトリエ
タノールアミンの存在下でカルボキシ化合物をイソブチ
ルクロロフォルメートと反応させ、得られる無水物をｐ
ｉ−１８−９で蛋白に加える。又ヒドラジンを用いてカ
ルボキシル 変え、これが蛋白中の過ヨー素酸で酸化された糖単位中
のアルデヒドやケトンと共にヒドラゾン結合を作ること
も可能である。

アミノ基は亜６１１酸で低温でジアゾニウム塩に変わり
、これがＴｙｒ、Ｈｉｓ及びしｙｓと共にアゾ化合物を
生成する。

ヒドロキシル基は無水コハク酸でヘミサクシネート誘導
体に変換され、これはカルボキシル基として結合される
。

アルデヒド基は蛋白のアミノ基と反応してシッフ塩基と
なる。

こうして作成した疎水性を有する蛋白又はペプチドは次
に、ａ）で記載した様にグルコシドと複合体を形成する
が、ここでは細胞断片を除去する為の精製過程は省略で
きる。

Ｃ）　疎水性基を内含する親水性蛋白から出発して、蛋
白を約２．５の低いＤＨ，３Ｍ尿素又は７０°Ｃ以上の
高温で変性させて、その疎水性基を利用することも可能
である。このような蛋白としては免疫グロブリン（Ｉｑ
Ｃ、ＩｑＭ、ＩｑＡ。

ＩＱＤ及びＩｇＥ）やある種のウィルスの蛋白（たとえ
ばポリオウィルスの蛋白）がある。免疫グロブリンは抗
イデイオタイプ抗体として用いら１れる。この蛋白はｂ
）に記載した様に蛋白として精製され、次にａ）に記載
した様にグリコシドと複合体を形成し、細胞断片を除去
する為の精製過程は省略される。

ｂ）又はＣ）に記載の精製又は合成蛋白又はペプチドか
ら出発する場合は、イスコムのｍ製中にこれらはミセル
として凝集しやすい。従って１つ以上の脂質（特にコレ
ステロール）を加えると一次複合体が生成し易い。可溶
化剤を加える時に脂質を蛋白又はペプチドに加える。脂
質と蛋白又はペプチドのモル比は少なくとも１：１であ
る。次に上記４つの方法のうちの１つを用いる。放射性
の脂質を用いても一次免疫原性複合体には放射能は検出
されない。

親水性ペプチド／ポリペプチドは、例えばコレステロー
ル、フオスファチジルコリン及び脂肪酸が１ニア：２の
比率より成るリポソーム中に取り込まれた脂肪酸に共有
結合することができる。このペプチド／ポリペプチドは
界面活性剤を用いてリポソームから抽出され、界面活性
剤を含有するショ糖濃度勾配（１０−３０％ショ糖）遠
心分離により過剰の脂質から分離することができる。

上記した様に好ましくは遠心分離又は透析法によりイス
コムが作られる。遠心分離法の場合は、リポソーム複合
体の可溶化にトリトンＸ−１００が使用可能である。透
析法の場合は界面活性剤も透析により除去できなければ
ならない（例オクチルグリコシド）。

この−次免疫原性複合体はヒト及び動物で特異的免疫Ｉ
Ｉ　ａ剤として使用し得る。従ってこれらは細菌、ウィ
ルス、マイコプラズマそして寄生体の引き起こす病気に
対するワクチンとして、又研究用に種々の動物細胞のＩ
ｌ！蛋白に対する抗体の産生用に使用し得る。

文種々の疾病に対するワクチンを産生ずる為、種々の細
菌又はウィルスの両親媒性蛋白のＵ合物を加えることも
できる。これは又本発明の担体として使用することも可
能である。

■６本発明の複合体の調製 抗体を産生させる分子は、凍結乾燥した一次イスコム、
又は遠心分離、透析、電気泳動法などによりイスコムを
調製する時に得られる溶液を用いて、又は上記のりＯマ
ドグラフィー法、又はショ糖溶液遠心分離によりさらに
精製した後に残っている溶液を用いて、担体分子に結合
させる。

遠心分離法を用いて調製する場合、−次イスコムは濃度
勾配緩衝液混合液、例えば糖−緩衝液混合液中で得られ
る（遠心分離法参照）。糖は透析又はゲル濾過例えばセ
ファデックス■Ｇ５０により除去する。この場合用いる
緩衝液は、免疫原性にする分子に一次イスコムを結合さ
せるために後で使用する緩衝液である。

透析法の場合は上記の緩衝液で透析することができ、又
はさらに透析又はゲル濾過を行なって緩衝液を変更する
。

クロマトグラフ法又は電気泳動法を用いると一次イスコ
ムは緩衝液中に得られ、溶液をさらに精製する場合は随
時濃度勾配液（例えば糖−緩＊ａ溶液中に得られる。こ
れらの溶液は緩衝液の交換又は凍結乾燥のために、前記
の方法で処理することも可能である。−次イスコムに結
合される分子の溶解度により、結合反応の時のｐＨ及び
用いるべき結合方法が決まる。

分子中のどの基が抗原決定に関係しているのかがわかっ
ていることがしばしばある。結合試薬はこれらの抗原決
定基と反応してはならないが、他の官能基は結合反応中
に反応するようなものを選ぶべきである。天然のペプチ
ド又は蛋白の場合はふつう末端のアミン基又はカルボキ
シル基が使用される。合成ペプチドには例えばチロシン
基又はサクシニル基が付与され、それぞれジアゾニウム
化合物を経て、又はｐＨを約８に調製して一級アミノ基
に結合される。以下の結合方法が好ましい。

官能基は、マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシサク
シニミドエステルとの反応によりお互に結合したシステ
ィン基、ジアゾ化によりアミノ基に結合したスルホヒド
リル基、４−ヒドロキシ−３−ニトロメチルベンズイミ
デート塩酸塩、水溶性カルボジイミド又は混合無水物に
よりアミノ基に結合したカルボキシル基、ジアゾニウム
ｊ２λに変換され、アゾ結合によりＴｙｒ、ｌ−１ｉｓ
及びＬＶＳに結合したアミノ基、無水コハク酸によりヘ
ミサクシネート誘導体に変換されカルボキシル基に結合
した水酸基、アミノ基と反応してシッフ塩基になったア
ルデヒド基、ｐＨ調製（〈５）により一級アミンに結合
した合成ペプチド中のサクシニル基、無水コハク酸と反
応して、カルボキシル基に結合したヘミサクシネート誘
導体を形成する水酸基、たとえば過ヨー素酸でＣＨＯ基
に変換されｐＨを〉８に調製してアミン基に結合したビ
シナルＯＨ基、ゲルタールアルデヒドでアミノ又はスル
フヒドリル基に結合し、ジイミドエステルでアミノ基に
結合しジイソシアネートでアミン又はヒドロキシル基に
結合したアミノ基、メトキシジクロリドトリアジンでお
互に２個と２個が結合したアミノ、ヒドロキシル又はス
ルフヒドリル基、アリールハロゲン化物によりアミノ、
ヒドロキシル又はスルフヒドリル基に結合したアミノ又
はヒドロキシル基、アリールハロゲン化物でスルフヒド
リル基又はアミノ基に結合し、ヨード酢酸又はカルボジ
イミドでアミン基に結合し、マレイミドでスルフヒドリ
ル基に結合°したスルフヒドリル基、ＤＩを９−１０に
調整することによりヒドラジンと結合して一級アミンと
なるアルデヒド、カルボキシル又はアミド基より成る。

アミノ基は下記のようなジアゾ化により別のアミノ基に
結合できる。

蛋白又はペプチドはそのまま室温で約０．１Ｈのホウ酸
緩衝液（ＤＨ９，０）巾約２０１１１８の４−ヒドロキ
シ−３−ニトロメチルベンズイミド塩酸塩（ＭＨＮＢ）
と反応させる。ＭＨＮＢによる蛋白の修飾の程度は反応
時間によりコントロールできる。３０分復反応液を０．
１Ｈのホウ酸緩衝液（Ｄ）１８．０）で−晩透析する。

その後ニトロ基を約１１ｒｒｇ／ｍ１のハイドロサルフ
ァイドナトリウムでＶ温で１−２分間還元する。反応成
分をＯ，ＩＨホウ酸緩衝液（ｐＨ１８，０）を用いセフ
ァデックスＧ−２５のカラムで除去するか、又は０．１
８ホウ酸緩衝液（ｐＨ８，０）を用い４℃で２−６時間
透析し、０．１８ホウ酸緩衝液（ＤＩ＋４）で４℃で一
晩透析する。アミン基は０．１８　　ＮａＮ０．。

（ｐＨ４）を用い０℃で１分間ジアゾ化した後、ｐＨを
急激に８．５に調整する。次に他の蛋白又はペプチド（
好ましくはイスコム）を、好まし、くはｐ　ｔ１８．５
のホウ酸緩衝液に溶解して室温で添加する。

亜硝酸塩は０．１Ｈホウ酸緩衝液（ｐ１４８．０）で透
析して除去する。

この方法は好ましくは一次イス］ムに結合すべき分子が
Ｍ）−ＩＮＢに結合する必要のないＴｙｒ又はＨｉｓを
含有する場合に用いる。この分子はＭＨＮＢ−修飾一次
イスコムに直接結合でき、反応しない分子は全て回収で
きる。Ｍ　ｌ−Ｉ　Ｎ　Ｂはジｖ７−ナル・オブ・アプ
ライド・バイオケミストリー（Ｊｏｕｒｎｕｌ　ｏｆ　
Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　）第１巻
、３０１−３１０頁（１９７９年）に記載の方法で１！
１！できる。

合成ペプチドには合成過程で末端Ｎ−ヒドロキシサクシ
ニミドを付与し、イスコム中の一級アミノ塞に結合させ
る。

サクシニル化したペプチドを低＋１１１（＜５）（好ま
しくは酢酸）で溶解する。次に好ましくはリン酸緩衝液
に溶解した一次イスコムを添加し、ＤＨを約８．０に調
整する。

ビスジアゾベンジジンを用いて一つのペプチドのチロシ
ンを別のペプチドのチロシンと結合させることができる
。

ペプチド中のスルフヒドリル基は、マレイニミドベンゾ
イルーＮ−ヒドロキシサクシニミドエステルとの反応に
よりお互に結合できる。

アミノ基は低温で亜硝酸を用いてジアゾニウム塩に変え
、これはＴｙｒ、ｌ−１ｉｓ及びＬｙＳとアゾ結合を生
成する。

脂質、炭水化物、ペプチド中のカルボキシル基は水溶性
カルボジイミド又は混合無水物を介してペプチド中のア
ミノ基に結合可能である。前者の場合カルボキシル基は
ｐＨ５で、約１Ｏ−１５ｆｆｌＨの強いリン酸緩衝液中
のカルボジイミドにより活性化され、リン酸含量の多い
（０，４−０，５、好ましくは０．２８）緩衝液（ｐＨ
８，０）に溶解させた、蛋白を含有する一次イスコムと
混合される。

後者の場合ジオキサン又はアセトニトリル中のトリエタ
ノールアミンの存在下で、カルボキシ化合物をイソブチ
ルクロロフォルメートと反応させ、得られる無水物を、
ｐＨ８−９でアミノ基を含有するイスコムに加える。カ
ルボキシル基はヒドラジンによりヒドラジドに変換され
、これが蛋白中に存在する過ヨー素酸に酸化された糖単
位中のアルデヒドやケトンにより、ヒドラゾン結合を生
成する。

例えば炭水化物中のヒドロキシル基は無水コハク酸によ
りヘミサクシネート誘導体に変換され、これが例えばペ
プチド中のカルボキシル基に結合する。ビシナルＯＨ基
は例えば過ヨー素酸によりＣＨＯ基に変換され、次にこ
のＣＨＯ基がｐＨを８．０より高く調製することにより
一級アミンと反応してシッフ塩基となる。

結合すべき分子は一次イスコム中の蛋白に対し５０：１
から０．１：１、好ましくは１５：１から１＝１のモル
比で結合している。イスコム中の各蛋白に結合した異な
る数の分子について試験をして、各結合分子−次イスコ
ム複合体の免疫原性を最適化させることが適切である。

これは使用する結合方法により、結合分子のｍ反、活性
化剤（官能器を活性化し変換させる）の濃度、活性期間
及び結合時間を変化させることによりコントロールでき
る。

実用上の理由から、−次イスコムに結合される分子はし
ばしば一次イスコム中の蛋白１ｒｎｇに対し１　Ｍ９、
好ましくは２５０−５００μび結合している。−次イス
］ム中の蛋白の量は例えばブラッドフォード（Ｂｒａｄ
ｆｏｒｄ　）法（＋ｎ、Ｈ，ブラッドフォード（ｍ、Ｈ
，Ｂｒａｄｆｏｒｄ）　、アナリテイカル・バイオケミ
ストリー（＾ｎａｌｙｔ　Ｂｉｏｃｈｅｍ）第７２巻（
，１９７６年））により定量する。

もし結合が終了した時に電子顕微鏡により異性が分解し
てミセルになっていることが判明した場合は、これらの
ミセルは界面活性剤、例えばＭＥＧＡ９と１０（Ｎ−（
Ｄ−グルコ−２，３゜４．５．６−ペンタヒドロキシヘ
キシル）−Ｎ−メチル−ノナミド及び−メチルデカミド
）　（バイケミストリー・ジャーナル（Ｂｉｏｃｈｅｍ
　Ｊ　）（１９８２年）第２０７巻、３６３−３６６頁
に記載の方法により調製される）、又はβ−オクチルグ
ルコシド又は例えば　　頁記載のような別の界面活性剤
により、例えばキルＡ（Ｑｕｉｌ　　Ａ）のようなグリ
コシドとの混合物の形でお互に結合させ得る。次に過剰
の試薬及び界面活性剤及びグリコシドは適当な緩衝液、
例えばＰＢＳ、又は揮発性緩衝液（例えば酢酸アンモニ
ウム緩衝液）で透析、又はゲル濾過する。緩衝液は最終
生成物の凍結乾燥（これが最適のステップである）時に
蒸発する。

この新規な抗原性複合体は凍結乾燥又は水性浮遊液の状
態で保存できる。本発明は又、随時好ましくはイスコム
の緩衝液の形（例えばＴＮ−溶液（実施例１参照）又は
生理的塩溶液（例えば０．１８　　ＮａＣＮ、ｐＨ７，
２−７，６））ｒ通常の添加剤や増量剤と共に、本発明
の１つ以上の複合体を活性物質として含有するヒト及び
動物用医療組成物に関する。ｐｌ＋は０．０５Ｍトリス
−ＨＣＪＩで調整できる。

ヒト及び動物の免疫に使用した複合体の量は、１１［！
ｉ１体につき１回又は２回（２週間の間隔をおく）で約
０．１μｇ−１１１１！Ｊに相当する。

いくつかの実施例で本発明をさらに詳しく説明する。

実施例１ ウメア（ＬＩｍｅ５）で単離したバラインフルエンザ−
３−ウィルスＵ２３を、３０重量％のショ糖を用い１０
０．０００ｇで４℃で１時間遠心分離し精製した。下層
を約１０Ｒｇ／ｄになるように０．０５）１　トリス−
ＨＣｌ、ｐＨ７，４と０．１８Ｎａ（１（ＴＮ）に溶解
した。同じ緩衝液（ＴＮ）中の１−５ＲＩ／ｌ１ｄｌの
ＰＩ−３−ウィルスを、ＴＮ１１！ｌｉ液中の約１０　
カウント７分の３日で標識したウィルス（Ａルーコーネ
ン（Ａ　Ｌｕｕ、ｋｋｏｎｅｎ　）、Ｃギャンベルグ（
ＣＧａｍｂｅｒＱ　）　、Ｅレンコーネン（Ｅ　Ｒｅｎ
ｋｏｎｅｎ）　（１９７９年）、ウィルス学（Ｖｉｒｏ
ｌｏＯＶ）第７６巻、５５−５９頁）と共に、２重量％
く最終濃度）のトリトン−Ｘ１００で可溶化した。約２
００μρの試料を、ＴＮ中の１％トリトンＸ−１００を
含有する１５％のショ糖３００ｕｇと、０．２重量％の
キ／Ｌ／Ａ　（Ｑ＋」ｉｌ　Ａ）を含有するＴＮ中の２
０−、５０重量％のショ糖潤度勾１１１２ｄ上に重層し
た。これを ２５０．０００ｇで２０℃で２２時間遠心分離した後、
下部から５００μｍの両分を集めて試料（２０−５０μ
ｇ）の放射能を測定した。放射性蛋白画分を合わせて０
．００５ｍトリス−ＨＣρ、０゜０１８　　ＮａＣＪｌ
　、ｐＨ７，４で透析し、１０ｄのフラスコに入れ、エ
ドワーズ（Ｅｄｗａｒｄｓ　）凍結乾燥機中で１８時間
凍結乾燥した。

この調製液の沈降係数は２４８であった。

この複合体を１０−４０重量％のショ糖潤度勾配で遠心
分離してさらに精製した。

１１璽ユ ウマのインフルエンザウィルス（ツルバラ（Ｓｏｌｖａ
ｌｌａ）　、ツルバラ（ストックホルム）から単離した
）について実施例１の方法を繰返した。

グリコシドを加えないで（すなわち原則としてヨーロッ
パ特許出願第８１１００２２１３．６号明細書の方法で
）実験を繰返し、こうして得られた蛋白ミセルとグリコ
シドを加えて産生じた蛋白複合体を、１０−４０重世％
の糖濃度勾配を用いて２８０．０００ｇで４℃で４時間
、沈降濃度勾配遠心分離をした。その結果を第１図に示
す。第１図には又スタンダードとしてのチログロブリン
の沈降係数も示す（１９３，矢印の部分）。図から蛋白
ミセルの沈降係数が３Ｏ８［・コでグリコシド蛋白複合
体の沈降係数が１９８［Ｏ］であることがわかる。（ウ
ィルスの糖蛋白はガラクトシダーゼ−３Ｆ１−ボロハイ
ドライド法で標識しである。

実施例３ バラインフルエンザ−３−ウィルスのかわりに麻疹ウィ
ルスを用いて実施例１の方法を繰返した。

得られた複合体は電子顕微鏡で観察すると第２図に示す
特徴的な構造を有していた。

実施例４ バンウエーゼルら（Ｖａｎ　Ｗｅｚｅｌ　ｅｔ　ａｔ　
）の方法に従いビルト−ペン（Ｂｉｌｔｈｏｖｅｎ　）
　　（オランダ）で得られた狂犬病ウィルスを、ＴＮで
２η／ｄまで濃縮した。このウィルス１ηを１００ｍＭ
のオクチル−β−Ｄ−グルコシドと共に溶解し、２０°
Ｃで４５分間インキュベートした。この試料を５０重量
％の糖溶液の上に重層し、２５０．００（１で４℃で４
５分間遠心分離した。上層の液を抽出しキルＡ　（Ｑｕ
ｉｌ　Ａ）を０．２重量％になるように加えた。

この試料をセルロースチューブに入れ１０００蔵の０．
１５Ｍ酢酸アンモニウム緩衝液中で２０℃で透析した。

透析７２時間の間数を攪拌し続ｔプ緩衝液は３回交換し
た。透析終了後の試料は狂犬病ウィルス複合体を含有し
ている。この一部を取り、１０−４０重最％の糖溶液を
用い ２８０．０００！Ｊで４℃で４時間遠心分離しさらに精
製した。電子顕微鏡観察により第３図に示す構造が得ら
れた。

実施例５ 麻疹ウィルスを用いて実施例４の方法を繰返した。得ら
れた複合体は実施例３の方法で得られた複合体と同じ構
造を有していた。

実施例６ バラインフルエンザー３−ウィルス（Ｕ−２３＞をショ
糖濃度勾配遠心により精製し、０．０２８バルビタール
緩衝液、Ｄ１１８．０．０．２４８ゲルコール（ＢＧ）
で１０１Ｒ９／ｒＲ１の濃度に溶解した。

ＢＧ−ＩＵｎｉ液中の１−５＃Ｊ／ｌｅのＰＩ−３−、
’フィルスをＢＧ−緩衝液中の約１０５３Ｈ−カウント
／分で標識したウィルス（ルーコーネン（Ｌｕｕｋｋｏ
ｎｅｎ　ｅｔ　ａｔ　）の方法、１９７７年）と共に、
２％のトリトン−Ｘ１００で溶解した。この試料１＃Ｉ
ｉ！を、０．０２８バルビタール緩衝液、ｐｕ８．０と
０．０２重量％のキルＡ（Ｑｕｉｌ＾）を含有する１％
のアガロースゲル上に重層した。このアガロースゲルを
表面積８５厘２及びハさ２５Ｍのチューブに入れた。こ
のチューブの上部及び下部をそれぞれ電気泳動用緩衝液
（０，０２８バルビタール緩衝液、ｐＨ８，０＞に接続
した。上部の容器は陰極に、下部の容器は陽極に接続し
た。５Ｖ／ｍで４時間電気泳動を行なった。試料をゲル
の陽極側に集め、放射能を測定した。この試Ｉｔを０．
１５Ｍ酢酸アンモニウム緩衝液、ｐＨ７，０で透析し、
凍結乾燥により濃縮した。

実施例２と同じ方法で測定するとこの調製物の沈降係数
は約２０８であった。

この複合体を１０−４０重量％のショ糖濃度勾配液 実施例７ トキソプラズマボンブイ（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ　ｏｏ
ｎｄｉｉ　）で感染させたマウスの胃液を、１０ｍのシ
リンジ中のガーゼと綿で濾過し、１０００　ｒｐｍで２
０分間遠心分離し、得られた細胞ベレットをＰＩ３５に
溶かし２回洗浄した（１０００ｒｐｗ＋　、２０分間）
。

最後のベレット（約１−１０Ｉ／１ｇの蛋白）を１　ｍ
Ｑの５％ＭＥＧＡで抽出した（１時間、３回、室温）。

この３回の液を合わせ、１１０００ｒｐで１０分遠心分
離し、０．１％のキルＡ　（Ｑｕｉｌ　Ａ）を添加した
。この混合液を０．０５％の酢酸アンモニウム緩衝液で
４８時間透析した。

実施例８ プラスミドビリに８８を有する大腸菌を機械的に攪拌し
、等電点て３回沈澱させた後、実施例１と同じ方法で処
理した。第２図及び第３図に示す特徴的な構造を有する
複合体が得られた。

実施例９ ボリン蛋白を有するサルモネラで実施例８の方法を繰返
した。第２図及び第３図に示す特徴的な構造を有する複
合体が得られた。

実施例１０ ネコの白血病ウィルスで感染させたネコのエビチル（Ｅ
Ｄｉｔｅｌ）腎細胞を、実施例１の方法で処理した。１
１１られた複合体は第２図及び第３図に示す特徴的な構
造を有していた。

実施例１１ 生白血病ウィルスで形質転換させたエビチル（Ｅｐｉｔ
ｅｌ　）腎細胞を実施例１の方法で処理した。

得られた複合体は第２図及び第３図に示す特徴的な構造
を有していた。

実施例１２ ＴＮ中の２０−５０重量％のショ糖濃度勾配液がキルＡ
（Ｑｕｉｌ　Ａ）のかわりにサポニンを含有することを
除いては実施例１と同じ方法で、パラインフルエンザ−
３−ウィルスＵ−２３を精製し蛋白複合体を得た。市販
の二種類のサポニンを試験した：メルク社（Ｈｅｒｃｋ
　）の“ｌ４ｅｉＳＳ″、レイン（ｒｅｉｎ）　５１４
０００２３、及び３ｃ、リックハルト”Ｓ　ｔｒシュハ
ルト（ミュンヘン）。（サポニンは純粋であった。業者
はサポニンの型を明らかにするのをいやがった。薄層り
ＯマドグラフィーではこれらはキルＡ（Ｑｕｉｌ　Ａ）
とは異なる。）Ｉ！？られた複合体の沈降係数は２４８
であり、実施例３の複合体と同じ構造を有していた。

実施例１３ 実施例３の方法により５Ｒｇの麻疹ウィルスを可溶化し
、ＤＥＡＥセルロース型の陰イオン交換体に添加した。

この陰イオン交換体を２０ｄのカラムに入れ、０．０１
８リン酸！ｌ衝液、ｐＨ７，２、０．５ｆｆｉΦ％のオ
クチル〜β−Ｄ−グル］シトで平衡化させた。この試料
を陰イオン交換体に添加し、吸着しなかった物質をカラ
ムの５倍量の０．０１８リン酸緩衝液、ｐＨ７，２，０
，５重量％のオクチル−β−Ｄ−グルコシドで洗い流し
た。

次に吸着した物質を、０．０１８リン酸、ｐｌ＋７．２
．０゜５重量％のオクチル−β−Ｄ−グルコシドに溶か
したＯ−０，５ＨＮａＧ１の塩濃度勾配をカラムに添加
して溶出させた。麻疹膜蛋白が同定された両分を合わせ
、キルＡ　（Ｑｕｉｌ　八）を０．１重量％になるよう
に加え１．０．０５８酢酸アンモニウム、ｐＨ７、ｏで
透析した。第２図及び第３図に示す特徴的な構造を有す
る複合体が得られた。

実施例１３ａ 麻疹ウィルス（ＲＩＶ−ビルト−ベン （Ｂｉｌｔｈｏｖｅｎ　）　）を実施例３の方法で可溶
化させた。ウィルス−界面活性剤を１００，０ＯＯｘｑ
で２時間遠心分離した。得られた上層を塩含示の少ない
（１０ｍＨリン酸リン酸緩衝液　ＮａＣＪｌ　−ｐＨ７
，２）リン酸緩衝液で透析し、ＤＥＡＥ−セファロース
陰イオン交換体（１０ｍＮリンＷ　−ｐＨ７，２−２−
５ＯＮａＣｊ−０，０５％トリトン−Ｘで平衡化しであ
る）に添加した。同じ緩衝液で吸着しなかった物質を洗
い流した。次に１０１１１ｉ１リンｉｌ１１−５ＯＮａ
Ｃｊ！−０，１％キルＡ（Ｑｕｉｌ　Ａ）を含有する緩
衝液で平衡化させた。吸着した物質は、３０００ｍＨＮ
ａ（ｌを含有する同じ緩衝液で溶出させた。溶出した物
質は、第２図に示す特徴的な構造を有する複合体を含有
していた。

実施例１４ ０ンドン熱帯医学衛生研究所（Ｌｏｎｄｏｎ　５ｃｈｏ
ｏｌｏｆ　Ｔｒｏｐｉｃａｌ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ　ａｎ
ｄ　Ｈｙｇｉｅｎｅ＞　　（イギリス）より入手したＢ
型肝炎ウィルスの２２ｎＩＩ１粒子を、ＴＮ中Ｉ　Ｗｇ
／ｄの濃度になるように再浮遊させた。

２２ｎｍ粒子の蛋白０．３■を２重口％のトリトン−Ｘ
ｌ　００．０．５８　　Ｎａ（Ｊで可溶化し、３７℃で
１６時間インキュベートした。次に実施例１の方法を繰
返し得られた複合体の沈降係数は２０３であった。電子
顕微鏡により、第４図に示り゛構造を有する複合体が観
察された。この構造は第２図の構造とは、これがこの構
造の部分より成る点で異なる。

実施例１５ ＴＮに溶かした３　ｍ９の牛下痢ウィルス（ＢＶＤ）を
、トリトンＸ−１００を１容量％になるように加えて可
溶化した。この混合液をｖ温で２時間攪拌した。この可
溶化したウィルスをレクチンのカラム（レクチンレンチ
イル（Ｌｅｎｔｉｌ）をセファロース４Ｂ（ファルマシ
ア社、ウプサラ）に固定化しである）に添加した。この
カラムはＴＮで平衡化してあり、ウィルス物質を添加後
５倍量のＴＮ（０，１容量％のトリトンＸ−１００を含
有）で洗い、次に１０倍量のＴＮで洗った。緩衝液（Ｔ
Ｎ中、０．２Ｈメチル−α−Ｄ−マンノシド、０、５ｆ
ｆｌｆｆｉ％のオクチル−β−Ｄ−グルコシドが溶解し
ている）をカラムに添加して、ウィルスのエンベロープ
蛋白を溶出させた。ウィルスのエンベロープ蛋白を含む
両分を集め、キルＡ（ＱｕｉｔＡ）を０．１重量％にな
るように加えた。この混合液を０．０５８１ｉｔ酸アン
モニウム、ｐＨ１７，０を用い４℃で３日透析した（緩
衝液１ρを３回交換した）。

最終生成物を凍結乾燥し、電子顕微鏡で見ると第４図に
示す複合体の部分である（複合体）構造が観察された。

この調製物の沈降係数は２０３であった。

実施例１６ バンウエーゼルら（Ｖａｎ　Ｗｅｚｅｌ員ａｔ　）の方
法（デベロツブビオルスタンダード（Ｄｅｖｅｌｏｐ　
ＢｉｏｌＳｔａｎｄａｒｄ）　（１９７８年）、第４１
巻、１５９−１６８頁）に従いＲＩＶ−ビルト−ペン（
Ｂｉ　１ｔｈｏｖｅｎ　）で調製した、精製した死んだ
ポリオウィルスを、可溶化剤（例えば２％のドデシル硫
酸ナトリウム）を含有するＴＮのような緩衝液中で、３
７℃で２時間可溶化した。ウィルスのカブジッド蛋白を
、０．１％ドデシル［ｊナトリウムを含有する１０％ポ
リアクリルアミドゲル中で電気泳動して分離した。ゲル
中の蛋白の位防を同７後、適当なストリップを切り取り
、電気泳動で蛋白を溶出させた。ＶＰ−３（分子量約２
６にダルトン）はカブジッド蛋白の１つであった。ＶＰ
−３含有溶液にトリトンＸ−１００を最終濃度２％にな
るように加えた。次にこの混合液を実施例１の方法に従
い、蛋白複合体（イスコム）の調製に使用した。

電子顕微鏡により第３図の特徴的な構造が観察された。

実施例１７ ホルマリンで死滅させた精製ポリオウィルス（ＲＩＶビ
ルト−ペン（Ｂｉｌｔｈｏｖｅｎ　）　テａｌ）　ヲ６
７容量％の酢１ｉｆｔ　（０，１８Ｍｃ＋（１１□含有
）に溶解させた。次にウィルス物質を １００．０００ｇで１時間超遠心分離し、ウィルス蛋白
のみを含有する上澄液を取り、０．１ｆｆｉｆｉ％（Ｄ
　＊ルＡ　（Ｑｕｉｔ　Ａ）　（７）存在下Ｔ：　０　
、０１１４　ト’）ス、０．１４８　　ＮａＣＮ　、ｐ
Ｈ７，４で透析した。

得られた複合体の構造は、実施例３の複合体と同じであ
った。

実施例１８ 国立衛生試験所（Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔ
ｅ　ｏｆＨｅａｌｔｈ）　　（オランダ）より凍結乾燥
状態で入手した髄膜炎菌（Ｎｅ１ｓｓｅｒｉａ　ｍｅｎ
ｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）の外膜蛋白を、２重社％のオクチ
ル−β−Ｄ−グルコシド含有ＴＮに溶解した。ここに０
．１重量％のキルＡ　（Ｑｕｉｔ　Ａ）を加え実施例４
の方法で処理した。

実施例２の方法で測定すると、得られた複合体の沈降係
数は２Ｏ３であった。

実施例１９ 疎水性アミノ酸を有するペプチド。ロ蹄疫つィルス１４
４−１４９、オーカウフベーレン（０にａｕｆｂｅｈｒ
ｅｎ）　、　０　、１　、２　、３及び４個のチロシン
を１端に結合させ合成したＶＰ１を用いたく市販）。こ
のペプチドを極めて少量の６７重量％の酢酸に溶解し、
２５％アンモニアで中和し、蒸留水で０．５８酢酸アン
モニウムに希釈した（界面活性剤の＠終濃度は２％）。

０．１％のグリコシドを加え、混合液を０．０５８の酢
酸アンモニウム、ｐＨ７で透析した（透析チューブ、５
ｐｅｃ　ｔ　ｒａＰｏｒ　６　ＭＷＣＯ１、０００）　
。

生成した複合体の電子顕微鏡像を第５図に示す。

図から長さ２２０−４０ｎ及び幅１０ｎｎ＋の電子密度
の濃い球形の粒子があるのがわかる。又その他の大きさ
の粒子も見られる。

第５ａ図は３個のチロシンが結合したペプチドの電顕像
であり、第５ｂ図は４個のチロシンが結合したペプチド
の電顕像である。

実施例２０ 公知の方法（Ｍ、バンデンブランデン、Ｊ、Ｌ。

デコーエン、し、カナレック及びロイシャールト（ＨＶ
ａｎ　ｄｅｎ　Ｂｒａｎｄｅｎ、　Ｊ　Ｌ　　ｄｅ　Ｃ
ｏｅｎ、　Ｌ　Ｋａｎａｒｅｋａｎｄ　Ｒｏｙ　５ｃｈ
ａｅｒｔ　）（１９８１年）、及びモレキュラー・イム
ノロシイ（Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ
）第１８巻、６２１−６３１＠、１９８１年）に従い精
製、又は硫安法１１ｉ１Ｌ１．Ｅ、コンラディー、Ｍ、
ゴベンダー、Ｌ、ピサ−（Ｊ　Ｅ　Ｃｏｎｒａｄｉｅ、
　ＭＧｏｖｅｎｄｃｒ、　Ｌ　　Ｖｉｓｓｅｒ　）　、
ジャーナル・オアー−１’ムノロジカル・メソツズ（Ｊ
ｏｕｒｎａｌ　ｏｒｌｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｈｅ
ｔｈＯｄＳ　）第５９巻、２８つ一２９９頁、１９８３
年）により増やしたマウスの［ｑＧを、１１の０．１５
Ｍリン１（ＰＣ）緩衝液、ｐｌ＋２．５で冷蔵苗で一晩
透析した後、２％の界面活性剤（例えばオクチル−β−
Ｄ−グルコシド）を加えた。界面活性剤の濃度がミセル
を形成させるのに必要な最低の濃度（ＭＣＭ）より低い
場合は、透析をする前に界面活゛性剤を交換しなりれば
ならない。この混合液をＰｃｔ）＋１７で透析した。

一時後キルＡ　（Ｑｕｉｔ　Ａ）を最終濃度が０．０５
％になるように加え、冷蔵室中で２４時間Ｐ　Ｃｌｌ　
７で透析を続けた。

５−３０％シヨ糖濃度勾配を用い４０．０００ｒａｍ　
　（ベックマン５Ｗ−６００−ター）で３．３時間遠心
分離することにより複合体が生成した。

濃度勾配中の複合体をＥＬＩＳＡ法で検出した。

実施例２１： 鳥の気管支炎ウィルス（Ａｖｉａｎ　Ｂｒｏｎｃｈｉｔ
ｉｓＶｉｒｕｓ　　（コロナ　イルス科））からのイス
コムの調製。０．５ｉｄの丁Ｎ−緩衝液（０，０５）１
１−リスと０．１８　　Ｎａ（１）中の、シ］糖濃度勾
配遠心で精製した５ｍｇの鳥気管支炎ウィルスに、界面
活性剤（オクチルグルコシド）を２％になるように添加
し、３７℃で１時間、室温で２時間インキュベートして
可溶化させた。この混合液をショ糖濃度勾配（底の部分
にＴＮ中３０％のショ糖３ｄとその上のＴＮ中１０％の
ショ糖（１％のオクチルグルコシドと０．１％のキルＡ
　（Ｑｕｉｌ　Ａ）を含む）より成る）上に重層した。

ＴＳＴ５４Ｃｏｎｔｒｏｎ　ローターを用い２０℃で５
０．００Ｏｒｐｍで２時間遠心分離した。

濃度勾配液上層の２ｒｄ、を集め、１ρの０．０５Ｈ酢
酸アンモニウムを用い６℃で透析したく３日間の透析中
緩衝液を３回交換した）。透析後調製液を、Ｔ　Ｓ　Ｔ
　４１　　ｃｏｎｔｒｏｎｏ−ターを用いＴＮ中１０％
ショ糖１０ｄで、２０℃において４０、ＯＯＯｒｐｍで
６時間遠心分離した。ベレットを１ｄのＴＮＩ衝液に溶
解させた。

電子顕微鏡によりイスコムの典型的な形が観察されたく
第２図参照）。

実施例２２ ネコの白血病ウィルス（レトロウィルス科）からのイス
コムの調製。ネコ白血病ウィルス（ＦｅＬＶ）生成の為
に、ＦＬ７４又はＦ４２２リンパ芽球ｍ胞株をウルツら
（Ｗｏｌｆｆ　ｅｔ　ａｌ　）の方法により浮遊液で培
養した。毎日培地を採取し５ｔｕａ破片を低速度の遠心
分離により除去した。ミリポア■フィルター（分画分子
ｆｆ１１００．０００）を用いて限外濾過により濃縮し
た後、３０％（Ｗ／賀〉ショ糖層で２回超遠心分離をし
てさらに精製した。得られたベレットを、２％トリトン
Ｘ−１００と０．０２％ジチオビス−ｎ−二１−　ロピ
リジンを含有するＴＮ！１１１ｉ液（０，０５Ｈトリス
及び０．１）Ｉ　　ＮａＣｊ　、ｐＨ７，４）で可溶化
させた。前記した遠心分離法によりイスコムを調製した
。可溶化ウィルス２００μｇを、１％トリトンＸ−１０
０を含有するＴＮ中８％のシヨ糖２００μ層の層（これ
は０．２％キルＡ（Ｑｕｉｌ八）を含有する１０−４０
％のショ糖の直線状密度勾配５１ｄｌに重層しである）
の上に添加した。５Ｗ５０ローターを用いて１５０，０
００ｇで２０°Ｃで４時間遠心分離をした。ａ度勾配液
を５００ｇｇ画分ずつ集め、１０％ＳＤＳポリアクリル
アミドゲル電気泳動（ＳＤＳ　−ＰＡＧＥ）によりＱＤ
７０／８５含有画分を確認した。ｏｏ７０／８５の存在
をドツトプロット法でさらに確認した。

これらの両分から５μｍの試料を取りニトロセルロース
フィル−に添加し、５％アルブミン含有ＴＮ！ｉｌｊ液
に３０分間浸し、ＴＮ緩衝液で洗った。

次に西洋ワサビベルオキシダーぜ（ＨＲＰ）で標識した
抗ｇｏ７０／８５抗体を添力ｕし、ＴＮ緩衝液で洗浄し
て結合を証明した。イスコムの存在は陰性位相差電子顕
微鏡により確認した。ローリ−（ＬＯＷｒＹ　）の方法
により蛋白含量を測定した。ポリアクリルアミドゲルを
走査してｇｐ７５／８５の量を測定した。調製物を凍結
乾燥して保存した。

ネコの免疫実験においてイスコムは中和抗体を誘導し、
抗原投与実験の感染に対する防御能を誘導した。。

実施例２３ 熱帯熱原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ　ｆａｌｃｉｐａｒ
ｕｍ　）　　（原生動物）からのイスコムの調製。１Ｔ
Ｗｇの熱帯熱原虫（トロフオゾイト、シゾント及びメロ
ゾイト）を５００ｇｇのＴＮ！！！ｉ液（１％ＭＥＧＡ
含有）に浮遊させた。低速度（３，ＯＯＯｒｐｍ　＞で
３０分遠心（室温）して細胞及び細胞残漬を分離沈澱し
た。浮遊液を３０℃で１時間、室温で２時間インキュベ
ートした。次にＴＮ緩衝液中３０％のシヨ糖、Ｍ！の不
連続な８１度勾配（チューブの最下層）上に、この浮遊
液を重層させた。その上に１．５−の１０％ショ糖、１
％ＭＥＧＡ（、ＴＮＮ出血液中そして０．１％キルＡ（
Ｑｕｉｌ八）を重層した。

ＴＳＴ５５　Ｃｏｎｔｒｏｎローター中テｌｔｉ勾配置
１Ｌｅ５０、ＯＯＯｒｐｍで３時間（２０℃）遠心分離
した。密度勾配上層の３ｆｄを取り、１ｇの０．１８酢
酸アンモニウムで透析した（３日間の透析中波を３回交
換した）。次に調製液を集め、１３ｄの遠沈管中の１０
％ショ糖の上に重層し、ＴＳＴ４１　　Ｃｏｎｔｒｏｎ
ローターを用い４０．ＯＯＯｒｐｍて６時間（２０℃）
遠心分離した。１ｑられたベレットを５００μｇのＴＮ
緩衝液中に溶解した。電了顕微鏡により、イスコムの典
型的な形を有する粒子が確認された。

実施例２４ 白日ぜき菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ　Ｐｅｒｔｕｓｓｉ
ｓ）の外膜蛋白からのイスコムの調製。凍結乾燥した百
日ぜき菌を３４０ｄの蒸留水に浮遊させ、フレンチプレ
スで破砕した。次に浮遊液を６６℃に加熱し、等量のフ
ェノール水溶液（９０％フェノールと１０％蒸留水）（
６６℃）を添加した。この混合液をシェーカーで２０分
間攪拌した後５℃に冷却し、３０００　ｒｌ）ｍで２０
分遠心分離した。水層を採取しＭＥＧＡを２％になるよ
うに、モしてＳＤＳを０．１％になるように添加した後
、調製液を３０００　ｒｏｍで２０分遠心分離し上澄液
を採取した。この混合液をミリポア■フィルター（排除
分子ｍ１ｏｏ、ｏｏｏ＞を用いて限外濾過し、ローリ−
（ＬｏｗｒＶ　）　　（１）の方法により蛋白濃度を測
定し、２０Ｒｇ蛋白／ｄに調整した。次に０１２％にな
るようにキルＡ（Ｑｕｉｔ＾）を加え、１ｇの０．１５
Ｍ酢酸アンモニウムで透析（６℃）した。

３日間の透析中波を３回交換した。電子顕微鏡によりイ
スコムの典型的な形態を有する粒子が観察された。

実施例２５ １０ｄのＨＩＮＩＰＲ８ウィルスを１００μｇの２０％
Ｎ−デカニル−Ｎ−メチル−グルカミンで可溶化し室温
で１時間インキュベートした。

２０％のショ糖（ミセル形成に最低必要な濃度以上の界
面活性剤を含有）を用いる遠心分離により、棟構造から
可溶化膜蛋白を分離した。膜蛋白を採取し、キルＡ　（
Ｑｕｉｌ　Ａ）を最終濃度０．１％になるように添加し
た。この液を最初の４−６時間は室温で、次に４℃で０
．９％ＮａＣＪで透析した。

実施例２６ ２００μｇのＰＢＳ中の３００μグのｇｐ３４０（エプ
スタインバーウィルス（ヘルペスウィルスの１種）のエ
ンベロープ蛋白）をチューブ（壁に７０μｇのコレステ
ロールが乾燥付着している）に加える。トリトンＸ−１
００を加えて室温で２時間放置する。３００μｍの混合
液をショ糖濁度勾配（上から下までは１％ＴＸ−１００
を含有する２００μｇの１５％ショ糖及び０．１％のＯ
Ａを含有するＰＢＳ中２０％のショ糖より成る）に重層
する。ベックマン５Ｗ４０ローター中で４０，０ＯＯｒ
ｐＨｌで１６時間（２０℃）遠心弁−１した。下層の濃
度勾配液を５００１ずつ採取した。界面活性剤及びコレ
ステロールと混合した０ｐ３４０は透析法によりイスコ
ム中へ復元できる。この場合透析する前にキルＡ　（Ｑ
ｕｉｔ　Ａ）を最終濃度が０．１％になるように添加し
た。次に容易に透析可能な界面活性剤（例えばここで使
用したようなオクチルグリコシト）を有することが好ま
しい。

次にａ合液をＰＢＳ　（ＴＮ緩衝液も使用した）で４−
６°Ｃで４８時間透析した。電子顕微鏡でイスコムの形
成を確認した。異なる方法により精製した異なるウィル
スのエンベロープ蛋白のようなものを使用する利点は明
らかである。

実施例２７ 疎水性ペプチドから得られるイスコム。疎水性末端を有
するペプチドからのイスコム、例えば　　Ｔｙｒ　　−
ＦＭＤ １”ｙｒ　　−ＦＭＤ パルミチン酸−ＦＭＤ ミリスチン酸−ＦＭＤ １００μｇの２０％オクチルグルコシド、Ｎ−デカニル
−Ｎ−メチルグルカミン又は任意の透析可能な界面活性
剤に、１ｒＲｇのペプチドを溶解し、５０μｇの界面活
性剤−緩衝液溶液中の等モル（±２０％）のコレステロ
ールを加え、緩衝液とキル△（Ｑｕｉｌ　八）を添加し
て最終濃度をｉ！Ｆ／ｄペプチド及び０．１％キルＡ（
Ｑｕｉｌ＾）とし、 ＰＢＳ又は他の適当な緩衝液で最初の２４　ｆｆ、′ｉ
間は室温で透析する（透析バッグのＭｗｌｏｏｏ）。

実施例２８ ７℃胞の増殖因子インターロイキン■の一部のアミノ酸
配列１３９−１５３を７ミノ末端に２個のチロシンをつ
けて合成した。

このペプチドをジアゾ化によりイスコム中のグリコール
蛋白に結合させた。

このイスコムはインフルエンザウィルスＨ２Ｎ２／ＰＲ
−８株から得られた糖蛋白より成っており、実施例１及
び２の方法に従い遠心分離法により調製した。

１勺のイスコム調製物（イスコム中の蛋白量として計算
）を０．１８のホウ酸緩衝液、１）Ｈ９，５に溶解した
（　１　＃＋９／ｍ１．＞。固体のＭＨＮＢ　（メチル
−４−ヒドロキシ−３−ニトロベンゾ−イミド）５■を
添加して活性化した。ＭＨＮＢが完全に溶解するまでこ
の混合液を攪拌した後、室温で２時間インキュベートし
たくレフミラー、プレイプラー、ホツベセイサー（Ｒｅ
ｆ　Ｈｉｉｌｌｅｒ、　Ｐｌｅｉｄｅｒｅｒ。

Ｈｏｐｐｅ　−５ｅｙｌｅｒ）の２フイジオルケム（Ｚ
　　Ｐｈｙｓｉｏｌ　ＣｈｅＩｍ）第３５９巻、４０７
−４１１頁（１９７８年）、ミラー、プレイプラー（Ｈ
ｕｌｌｅｒ、　Ｐｌｅｉｄｅｒｅｒ　）　、ジャーナル
・オブΦアプライド・バイオケミストリー（Ｊｏｕｒｎ
ａｌ　ｏｒ＾ｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｃｈｅｍ　）第１巻
、３０１−３１０頁（１９７９年））。次にこの混合液
を０．１８ホウ酸、ｐＨ８，０で透析しく４℃）、ジチ
オナイト（１＃＋９／ｄ）で還元しく室温で１−２分間
）。

０．１Ｈホウ酸、ｐＨ８，０で４℃で２−６時間、そし
て０．１８ホウ酸、ｐＨ４，０で４℃で一晩透析した。

この混合液にＮａＮＯ２（６，９Ｉｌｔｇ／ｄ）を加え
て苛酷な溶液（１００■／ｌｌ１１蒸留水）からジアゾ
化し、氷水浴上で１分間インキュベートした後１１１を
急速に８．５に調整した（ホウ砂及びＮａ０Ｈ）、ＩＲ
ｇのペプチドを５０−１００１の０．１Ｈホウ酸、ｐＨ
８，５に溶解し、次に溶液に添加して完全に混合した後
、温度をＶ温まで上げ、溶液を２時間インキュベートし
た。

この混合液を次に０．１Ｍホウ酸、ｐＨ８で４℃で一晩
透析した。透析チューブのカットオフ値は１０００であ
る。次に１％ＭＥＧＡ　（又は２％β−オクチルグルコ
シド）＋０．１％キルＡ（Ｑｕｉｔ　Ａ）を添加した後
、室温で３０分間インキュベートした。次にこの混合液
をＰＢＳに対して空温で２−４時間、次に４℃で一晩透
析した（通常の透析チューブ）。電子顕微鏡によりイス
コム複合体の存在を確認した。

ミラーとプレイプラー（Ｈｊｌｌｅｒ　Ｊ。

Ｐｆｌｅｉｄｅｒｅｒ、　Ｇ　Ａ　）、（１９７９年）
、ジャーナル・オブ・アプライド・バイオケミストリー
（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ＾ｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ）第１巻、３０１−３１０頁記載の方法により調製し
たイスコム複合体の形で約１０μｇのペプチドを用い５
匹のマウスをそれぞれ免疫した。免疫後の血清中の抗体
の応答はＥＬＩＳＡ法で測定した（酵素はアルカリ性ホ
スファターゼを使用した）。免疫していないマウスの血
清試料による４　０５　ｎｆｆ１における吸光度（バッ
クグラウンド）は０．０１％以下であった。免疫したマ
ウスの血清は、１：１００又はそれ以上で証明される抗
体を含有しており、読み値はバックグラウンドより１０
倍又はそれ以上高かった。ペプチドのみで免疫した時は
抗体応答は全くみられなかった。

実施例２９ ＶＩＰ　　ＦＭＤウィルス（口蹄疫）の２０個のアミノ
酸より成る配列（１４１−１６０）を３種類合成した： １、付加物のない１５個のアミノ酸： ２．１５個のアミノ酸＋アミノ末端の２個の追加のアミ
ノ酸； ３．１５個のアミノ酸＋１個のＮ−ヒドロキシ号りシニ
ミドエステル。

これらのペプチドを３つの結合法でイスコム（実施例１
の方法に従いインフルエンザウィルス）−１２Ｎ２／Ｐ
Ｒ−８株の糖蛋白ヨリｗ４製）に結合させた。

第１のペプチドはカルボジイミド法（カルボジイミドカ
ップリングを参照）によりＣ０ＯＨ末端を介してイスコ
ムに結合させた。

２５０ｕｇのペプチドを２５０１の２５ｍＭリン酸緩衝
液、ｌ）＋１５に溶解し、 ２．５ｍｓのＥＤＣ（１−Ｉチル−３−（３−ジメチル
アミノプロピル マ）を２５０μｇの蒸留水に溶解し、ペプチドと混合し
た。次にこのペプチドを室温で２分インキユベートした
。　　　　　　□ 次にこの混液に、５００μｇの０．４８リン酸緩衝液、
ｐＨ８に溶解した１１９のイスコム（蛋白量として計算
）を加え、室温で一晩反応させた。次にこの混合液を４
℃でＰＢＳで一晩透析した。

結合収率は２７％であり、これは−次イスコム中の蛋白
１分子につき約５個のＦＭＤＶ−ペプチドに相当する。

第２のペプチドはチロシンを介してジアゾ化によりイス
コムに結合させた（実施例２８を参照）。

ペプチドの５５％が一次イスコムに結合し、これは−次
イスコム中の蛋白１分子当たり約１３個のペプチドに相
当する。

第３のペプチド。Ｎ−ヒドロキシサクシニミドペプチド
のイスコムへの結合。遠心分離法により産生じたインフ
ルエンザウィルスの１■のイスコム：Ｊ４製物（８２Ｎ
２／Ｐｒ−８）（ジアゾカップリング参照）を０．０５
８リン酸緩衝液、ｐＨ５で透析した。

１■のサクシニルペプチドを２５μｍの濃酢酸に溶解し
た後、このペプチド＋イスコム調製物を混合し、少量の
０．２８Ｎａ　　ＨＰＯ２−３分間ｐＨ８にした。この
混合液を室温で４時間インキュベートした。

次に１％ＭＥＧＡＩＯ（又は２％β−オクヂルグルコシ
ド）とｏ、１％のキルＡ　（Ｑｕｉｌ　Ａ）を添加した
後、この混合液を室温で３０−６０分インキュベートし
た。次にこの混合液をＰＢＳに対し室温で２−４時間そ
して４℃で一晩透析した。

実施例３０ ごオチンーイスコム複合体。インフルエンザウィルス（
血清型Ａ１サブタイプＡＥｑ　２ＢＥｑ　２、ツルバラ
（Ｓｏｌｖａｌｌａ）　／　７９株）の糖蛋白ヨリイス
コムを得た（実施例１及び２の方法による）。

ツルバラ（Ｓｏｌｖａｌｌａ）イスコム１η（蛋白とし
て計算）を１１ｄの０．１１４　　ＮａＨＣＯ３、ＤＨ
８ニＷｊＷｌシ、１００１１　　（ＤＭＳＯ中の苛酷な
溶成２Ｉ！ｇ／Ｉｄからの０．２１１１９）のＮ−ヒド
ロキシサクシニミドペプチド（シグマ社）を加えた後、
１ｑられた溶液を室温で４時間インキュベートし、ＰＢ
Ｓに対し４℃で一晩透析した。電子顕微鏡によりイスコ
ム複合体の存在を確認した。

３匹１７）マウス（Ｂａｌｂ／ｃ）をそれぞれ５ｏｕ１
の結合体（結合体の総重堡として計算）で２回（１４日
間間隔）免疫した。第１回目の免疫後金てのマウスの抗
体価は１／１００．０００以上であった（ＥＬＩＳＡ法
で測定）、ＥＬ　ＩＳＡプレートのウェル（穴）をビオ
チン化ＢＳＡ　（午血清アルブミン）で被覆した。分析
中ビオチンを露出させる為にＢＳＡを用いた。免疫した
マウスより得た抗体はどれも、ＢＳＡのみを被覆したプ
レートと反応しなかった。マウスに副作用は全く認めら
れなかった。　　　・ 実施例３１ ナカネカワイ（Ｎａｋａｎｅ　Ｋａｗａｉ）　　（１９
７４年）のベルオキシダービ標識抗体によるＰＲ８−一
次イスコムへのペルオキシダーゼの結合。新しい結合法
、■、ヒストケム・サイトケム（Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｃ
ｙｔｏｃｈｅｍ　）第２２巻、１０８４頁。

１ｙ（７）ＨＲＰ（ペルオキシダーゼ）を２ｏ。

ｌの０．３８　　ＮａＨＣＯ３、ｐＨ８，１に溶解し、
２０μｍの１％ＦＤＮＢ　（フルオロジニトロベンゼン
）を添加し、室温で１時間インキュベートし一級アミノ
基をブロックした。次に２００ｕｆＪ　（７）０．０８
８　Ｎａ　ＩＯ４’Ｅ：加、を空ｍＴ−３０分インキュ
ベートしてビシナルＯＨ基をＣｕＯ基に変換した。２０
０μｍのｏ、ｉｓ＋ｉエチレングリコールを加え、室温
で１時間インキュベー１〜して反応しなかったＮａＩＯ
４を除去した。

活性化ペルオキシダーゼと１　ｔｔｒｇ（蛋白として計
算）のインフルエンザウィルス１」２Ｎ２株ＰＲ−８イ
スコム（実施例１の方法で調製）を０、ＯＩＨＮａＨＣ
Ｏ３、ｐＨ９，５ｔ−一晩透析した。

ＰＲ−８＋ＨＲＰ溶液を混合し室温で少なくとも４時間
インキュベートした。シヨ糖１０−４０％の濃度勾配遠
心分離により、結合体を非結合のＨＲＰから分離した（
イスコムのあとにｌ−Ｉ　ＲＰ活性が出た）。電子顕微
鏡によりイスコム複合体の存在を確認した。

前記の実施例の分子の結合を濃度勾配遠心分離によりコ
ントロールした。イスコム複合体と共に、イスコムに結
合した放射能標識ペプチドが現われ、Ｓ値が約１９３の
ところ（すなわちイスコム自身と同じ）に出現した。

実施例３２ マラリアペプチド、オクタペプチド（Ｑ　ｌ　ｕ　−Ｇ
ｌｕ−Ａｓｕ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｈｉｓ−八５ｐ−Ａｌ
ａ）とのイスコムの調製。インフルエンザウィルスＰＲ
８株のエンベロープ蛋白を用いる透析法（実施例２５に
記載）により一次イスコムを調製した。

ＰＢＳ中の１ｄのＰＲ８イスコム（０，９８＃Ｉ９／−
）を１．５６ηマラリア／ペプチドと混合した； １０ｔｌｆＪの２５％ゲルタールアルデヒドを最終濃度
０．２５％になるように加えた； ゆっくり攪拌しながら室温で２４時間インキュベートし
た； 調製物をＰＢＳに対し４℃で２４時間透析した。

ブラッドフォード（Ｂｒａｄｆｏｒｄ　）の方法（アナ
リテイカル・バイオケミストリー（Ａｎａｌｙｔ　Ｂｉ
ｏｃｂｅｍ）１９７６年、２４８−２５４頁）により総
蛋白含量は１．０２Ｒｇ／ｄであった。

計算により約２５％のペプチドがＰＲ８イスコムに結合
していた。電子顕微鏡により典型的なイスコムが観察さ
れた。

５０μｇの結合体を５匹のマウスの皮下に投与した。２
週間血液を採取し血清をｉｌｌ製した。同時に第２回目
の５０μびの結合体を投与した。再び２週間後にマウス
の血液から血清を調製した。

マウスのプール血清を用いてＥＬＩＳＡ法により、血清
の抗体応答を試験した。

ＥＬＩＳＡ法はプラスチックトレイ（Ｎｕｎｃ９６Ｆ２
−６９６２０ＰＳ　　ＳＨ）中で行なった。

牛血清アルブミン（ＢＳＡ）に結合したペプチドで被覆
した（前記したようにＢ５Ａｌ１！Ｊとペプチド１■を
ゲルタールアルデヒドで結合し最終濃度を０．２５％と
した）。この混合液を上記のように透析した。被覆緩衝
液（０，０５８炭酸緩衝液、ＤＨ９，６）中１μｇ／Ｉ
ｒｒＩｌの結合体（ＢＳＡ−ペプチド）を使用し、トレ
イ中各ウェルに１００μρずつ添加した。４℃で一晩イ
ンキユベートした。

リン酸緩衝液（０，０５％のツイーン８０含有）で２回
洗浄した後、異なる希釈率の血清を添加した。室温で１
時間インキュベートし、上記のように洗浄した後、西洋
ワサビ標識ウサギ抗マウス血清（ダコバツツ（Ｄａｋｏ
ｐａｔｔｓ　）　、−１ベンハーゲン）を加えた。次に
室温で１時間インキュベートしたｔ１２Ｍ！（トリメチ
ルベンジジン）を添加した。

１０分後反応を停止さぜ、４０５　ｎｍで吸光度を読み
とった。

族」：　　第１回目のワクチン投与後２週間目にプール
血清の抗体価は１：３００を示した。第２回目のワクチ
ン投与後抗体価はに７００に上昇した。

どのマウスにも免疫に帰因する副作用はみられなかった
。ペプチドを用いる従来の免疫法では、ペプチドを蛋白
（例えばＢＳＡ又はＫ　Ｌ　Ｈ）に結合させ、次にこの
結合体を油性アジュバント（例えばフロイント不完全又
は完全アジュバント）と混合し乳化させる。これは局所
的又は全身的反応という形の重大な副作用を引きおこす
。このタイプのアジュバントはヒトのみならず動物のワ
クチンにも不適である。

実施例３３ デカペプチド（Ｇｌｕ−Ｈｉｓ−Ｔｒｏ−３ｌ）ｒ−Ｔ
Ｖｒ−ＧＩＶ−ＬｅＬＪ−ＡｒＱ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ）で
ある黄体化ホルモン放出ホルモン（ＬＨＲＨ）の調製。

インフルエンザウィルスＰＲ８株のエンベロープ蛋白を
用い、実施例２５に記載の透析法により一次イスコムを
調製した。

Δ群（第１表を参照）では、実施例３２記載の一段階法
によりＰＢＳ中１１＋ｔｉ！のＰＲ８イスコム（１■／
ｒｄ）と１１ｎｇのペプチドを用いて結合させた。

Ｂ、Ｃ，Ｄ及びＥ群（第１表を参照）では２段階法で結
合させた。１ｄのＰＢＳ中１１ｆｔｇのＰＲ８イスコム
に、１．２５％のゲルタールアルデヒド水溶液を最終濃
度が０．２５％になるように加え、この混合液を０．９
％ＮａＣｊに対し室温で一晩透析した。１００１１の０
．９％ＮａＣ，Ｑ中１ｒＩｔｇのペプチドを添加し混合
後、５０μｇの１Ｈ炭酸緩衝液、ｐＨ９，５を添加し、
４℃で２４時間インキュベートした。次にこの混合液を
ＰＢＳで２４時間透析した。

ブラッドフォード（Ｂｒａｄｆｏｒｄ　）の方法で蛋白
含量を測定し１　Ｒｇ／ｄに希釈した。

計算により約２５％のペプチドがＰＲ８イスコムに結合
していた。電子顕微鏡により典型的なイスコム構造が観
察された。

第１表に示すように１回当たり０．１μｇから３μｑの
山で４週間の間隔を置いて２回マウスの皮下に注射して
免疫させた。免疫時に血液を深取し、第２回の免疫後４
週間後にも血液を採取した。

試験抗原としてＢＳＡに結合したペプチドを用いて実施
例３２に記載の方法により、ＥＬＩＳＡで免疫応答を測
定した。

４０５　ｎｍにおいて陽性の読み値を与えるマウスの血
清の希釈倍数により抗体価を表わした。

結果を第１表に示す。全てのマウスは血清の抗体価に応
じて応答した。免疫後１μｑ以上のペプチドで免疫した
５匹のうち３匹のマウスはしＨＲＨに対する抗体を有し
ていた。

２回の免疫後金てのマウスは抗体価の上界に応じて応答
した。０．１μ３で免疫したマウスも良好な抗体応答を
示した。

１回又は２回の免疫後もｎ１作用（例えば局所又は全身
反応）は認められなかった。

第　　１　　表 ＥＬＩＳＡ抗体価 第　　２　　表 ＥＬＩＳＡ抗体価 実施例３４ ０蹄疫（ＦＭＤ）ペプチド（１６個のアミノ酸（Ｌｅｕ
−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−
Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａ
ｒｑ−Ｔｙｒ−１ｅｕ）によるイスコムの調製。実施例
２５に記載のようにインフルエンザウィルスＰＲ８株の
エンベロープ蛋白を用いて一次イスコムを調製した。

実施例３３に記載のように１　ｍＶのＰＲ８イスコムと
１１ｍｇのペプチドを用いてゲルタールアルデヒドによ
る２段階法で結合を行なった。

ブラッドフォード（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）の方法により結
合後の蛋白金回を測定し１１１ｇ／ＩＩｌに希釈した。

計算により約２５％のペプチドがＰＲ８イスコムに結合
していた。

電子顕微鏡によりイスコムの典型的な形態が観察された
。

第２表に示したようにＰＲ８イスコムに結合した１μ３
又は２μｇのペプチドを４’ａ間の間隔で２回マウスの
皮下に免疫した。

ＢＳＡに結合したＦＭＤペプチドを試験抗原として使用
し実施例３２及び３２に記載のＥＬＩＳＡでマウスの血
清につき、マウスの抗体応答を測定した。抗体価は、４
０５ｎ−において陽性の読み値を示すマウスの血清の希
釈率で表わした。

その結果を第２表に示す。免疫後２週及び４週後に血清
の抗体応答を測定しても、１回の免疫では、マウスの血
清に抗体は認められなかった。第２回目の免疫後４週間
後に免疫したマウスの血清を試験すると、全てのマウス
でペプチドに対する血清抗体が認められた。

免疫に帰因する０１作用（局所又は全身反応）はどのマ
ウスにも認められなかった。

実施例３５ ｑｐ１２０で増やした１−ＩＴＬＶ−１イスコムの調製
。レトロウィルス化のウィルスは精製するとふつうエン
ベ０−膜蛋白の外側かはなれる。この外側の部分は防御
免疫の誘導に必須である。この外側の部分はウィルスの
培養液より得られた組織培養液、又はウィルスの精製中
に得られる液（例えばウィルスの超遠心分離後の上澄液
）から回収できる。

１１ｄのＰＢＳ中の１０ａｙのＨＴＬＶ−ＩＩＩウィル
スを１％Ｎ−デカニル−Ｎ−メチルグルカミン可溶化す
る。この混合液を室温で１時間インキュベートする。

ショ糖（例えば２０％）（ＰＢＳ中同じ界面活性剤（例
えば０．５％と０．１％キルＡ　（Ｑｕｉｌ　Ａ）を含
有）による遠心分離によって、可溶化した膜蛋白を核酸
や付着した蛋白から分離する。

ショ糖、界面活性剤及びキルＡ　（Ｑｕｉｌ　Ａ）の両
分（膜蛋白を含有）を０．０５８の酢酸アンモニウム（
！ｌｌ液液決定的に重要ではない）で、最初の６時間は
Ｖ温で以後は４℃で透析する。

レンズレクチン（ｌｅｎｓ　ｌｅｃｔｉｎ　）を用いる
アフイニテイクロマトグラフイー又はセファロースに結
合した抗ｇｐ−１２０により組織培養液より増やした１
１１１！中の０．　３ａｄ！のｑｏ１２０を、最終濃度
０．２５％のゲルタールアルデヒドを用い室温で一晩イ
ンキユベートする。次にこれを０．９％のＮａＣＮで透
析する。

上記のようにＩＩしたＨＴＬＶ−１１１のイスコム２ｄ
に１５０μｐの１Ｍ炭酸緩衝液、ｐＨ９．５を加えた。

調製液を４℃で２４時間インキュベートした後、ＰＢＳ
に対して４℃で２４時間透析した。

電子顕微鏡でイスコムの典型的な形が観察された。

実施例３６ ＦｅＬＶ　　ＱＤ７０からの３種の配列のハイブリッド
ＤＮＡ生成物を、ゲルタールアルデヒド２段階法（実施
例３３参照）でリポソーム中のステアリルアミンに結合
させた。ＰＢＳ，ｐＨ７中の１０１９（１０■／ＩＩＩ
ｉりのリポソームを、最終濃度１、２５％ゲルタールア
ルデヒドでｖ温で一晩活性化した。過剰のゲルタールア
ルデヒドは透析又はゲル濾過により除去した。

３ｑの活性化したリポソームを１１ＩＩｇの各ＦｅＬＶ
　　ａｐ７０ポリペプチドと混合し溶液の懸は１Ｗｔ１
に調製し、１００μｇの１ＨＮａｃｏ３、ｐＨ９．６を
加えｒｏｌを上ケｔｃ。コノ混合液を一晩インキユベー
トし、ゲル濾過（例えばＳ　−　３００）により精製し
たポリペプチドを非結合のものから分離した。

このポリペプチド−脂肪酸を２％のＮ−デカノイル−Ｎ
−メチルグルカミン（ＭＥＧＡ−１０）で抽出し、シヨ
糖Ｃ度勾配（５−３０％のショ糖）（０．３％ＭＥＧＡ
−１０を含有）により過剰の脂質から分離した。

このポリペプチドを採取し、キルＡ（Ｑｕｉｌ＾）を最
終濃度０．１％になるように加え、混合液をＰＢＳに対
して最初の４−６時間は室温で、以後は４℃で透析した
。

【図面の簡単な説明】

第１図はチログロブリンの沈降係数を示１′。 第２図は麻疹ウィルス複合体の電子顕微鏡写真である。 第３図は狂犬病ウィルス複合体の電子顕微鏡写真である
。 第４図はＢ型肝炎ウィルス複合体の電子顕微鏡写真であ
る。 第５Ａ図は３つのチロシンに結合したペプチドの電子顕
微鏡写真である。 第５８図は４つのチロシンに結合したペプチドの電子顕
微鏡写真である。

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. （１）免疫原性複合体において、ウィルス、マイコプラ
   ズマ、細菌、寄生体、動物細胞又は、疎水性領域を有す
   る蛋白又はペプチドを、１つ以上の可溶化剤と混合して
   、蛋白又はペプチドと可溶化剤との複合体を形成させた
   後、ミセルを形成するのに必要な少なくとも臨界濃度の
   、疎水性又は親水性領域を有する１つ以上のグリコシド
   を含有するグリコシド溶液の存在下で、該蛋白又はペプ
   チドを可溶化剤から分離するか、又は可溶化剤から分離
   して直接グリコシド溶液に移してグリコシド溶液と蛋白
   複合体を形成させることにより調製される担体分子に、
   ペプチド、蛋白、炭水化物、リポ蛋白、糖脂質又は低分
   子（例えばビオチン）から選ばれる１つ以上の分子が、
   公知の方法により結合分子中の官能性結合基と担体分子
   中の官能基により結合した担体分子より成ることを特徴
   とする、上記免疫原性複合体。
2. （２）担体に結合する分子は１−４０個、特に１０−２
   ５個のアミノ酸を有するペプチドから選ばれ、アミノ酸
   の数が１０以下の時このペプチドは官能基を介して２−
   １２個の炭素原子及び６−２６個の水酸基を有する脂肪
   族鎖又は１−２０個のアミノ酸（好ましくは親水性アミ
   ノ酸）を有するペプチドに結合することができ、特にマ
   ラリア、ポリオ、特に２７７−３００、Ｂ型肝炎ウィル
   スより得られるペプチド、特に３２−７４、１１０−１
   ５６領域のペプチド、及び特に１４４−１４５のアミノ
   酸配列を有するペプチド、狂犬病ウィルス、特に１−５
   ０、２９０−３２０領域及び特に１００−１７５領域の
   ペプチド、１４０−１４６、１８７−１９６のアミノ酸
   配列又はＣｙｓ５２−Ｃｙｓ２７８又は２０７−２２０
   領域から選ばれるアミノ酸配列を有するインフルエンザ
   ウィルスペプチド、口蹄疫ウィルス、特に１４１−１６
   ０、１４４−１６０、１４６−１５４、１４４−１５０
   、１４２−１５８の口蹄疫ウィルスペプチド、Ｔ−細胞
   の増殖因子、好ましくは７９−９２、１３９−１５３Ｃ
   、１１１−１２５及び１８−３２Ｃのアミノ酸配列を有
   するペプチド、エプスタイン−バーウィルスから得られ
   るペプチド、特に配列Ａ：【アミノ酸配列があります】
   配列Ｂ：【アミノ酸配列があります】 配列Ｃ：【アミノ酸配列があります】 血液型物質中の ＨＴＬＶ　１、２又は３型ウィルスペプチドからの抗原
   決定基；ペプチド、ポリペプチド及び大きい蛋白、特に
   ステロイドホルモン、ペプチドホルモン及びプロスタグ
   ランヂンホルモン（例えばチロトロピン、アデノコルチ
   コトロピン、黄体形成ホルモン、ゴナドトロピン放出ホ
   ルモン、卵胞刺激ホルモン、プロラクチン、生長ホルモ
   ン、オキシトシン、バソプレシン、副甲状腺ホルモン、
   カルシトニン、インスリン、グルカゴン）、及びリゾチ
   ームやペルオキシダーゼ等の酵素；炭水化物及び炭水化
   物含有構造、例えばリポ多糖類、莢膜を有する微生物（
   例えば大腸菌、特にＫ−抗原１−１３、ヘモフイルスイ
   ンフルエンザ、髄膜炎菌）の多糖類、ガングリオシド（
   例えばＧＭ１）およびグリオーマガングリオシド中の血
   液型物質中の糖蛋白中の少糖類を含有する、特許請求の
   範囲第１項に記載の免疫原性複合体。
3. （３）担体は、エンベロープのあるウィルス、特にオル
   ソミキソウィルス、パラミキソウィルス、レトロウィル
   ス、ラブドウィルス、トガウィルス、ヘルペスウィルス
   及びＢ型肝炎ウィルスの膜蛋白、トキソプラズマ、エン
   ベロープのないピコルナウィルス、パルボウィルス、レ
   オウィルスの膜蛋白を選ぶことにより得られ、グリコシ
   ドは例えばキラヤサブナリアモリナ（Ｑｕｉｌｌａｊａ
   　ｓａｐｎａｒｉａ　ｍｏｌｉｎａ）、アエスキユラス
   ヒポカスタヌム（Ａｅｓｃｕｌｕｓ　ｈｉｐｐｏｃａｓ
   ｔａｎｕｍ）、又はギボフイラスツルチム（Ｇｙｐｏｐ
   ｈｉｌｌａ　ｓｔｒｕｔｈｉｍ）、好ましくはＤＱ、Ｑ
   ｕｉｌ　Ａ、アエスシン（ａｅｓｃｉｎ）、サポアルビ
   ン（ｓａｐｏａｌｂｉｎ）等から得られるグリコシド抽
   出物のようなサポニンから選ばれる、特許請求の範囲第
   １項又は第２項に記載の免疫原性複合体。
4. （４）蛋白およびペプチドを、ウィルス、マイコプラズ
   マ、細菌、寄生体、動物細胞から得られる疎水性膜蛋白
   又は非膜蛋白および非疎水性蛋白（この非疎水性蛋白は
   、脂肪族官能基から選んだ疎水性基、疎水性ペプチドお
   よび他の疎水性構造、例えばコール酸やコレステロール
   誘導体のようなステロイド、穏和な変性処理により露出
   する隠れた疎水性基を有する両親媒性蛋白又はペプチド
   から選ばれる疎水性基を結合させることにより疎水性に
   なる）；又はハイブリッドＤＮＡ法により得られる合成
   蛋白又はペプチドから選択することにより、担体を得る
   特許請求の範囲第１項から第３項までのいずれか１項に
   記載の免疫原性複合体。
5. （５）担体は、ウィルス、マイコプラズマ、細菌、寄生
   体、動物細胞又は疎水性ペプチド又は蛋白を、緩衝化し
   たおそらくは生理食塩水中で、イオン性、非イオン性、
   両性イオン性、又は没食子酸界面活性剤、アルコール、
   両親媒性低分子、水溶性ペプチド又は蛋白、又はそれら
   の混合液から選ばれる可溶化剤と混合し、この混合液を
   グリコシドを含有する濃度勾配のあるグリコシド上にあ
   る可溶化剤を含有する溶液上に重層し、少なくとも １００，０００ｇで遠心分離し、蛋白画分を単離し、緩
   衝液で透析するか、又は微生物、細胞、蛋白又はペプチ
   ドを、緩衝化生理食塩水で可溶化剤と混合した後、グリ
   コシドと反応させ緩衝液（好ましくは酢酸アンモニウム
   ）で透析し、直接濃度勾配上に重層し少なくとも１００
   ，０００ｇで遠心分離した後、蛋白を含有する上層画分
   を集め、グリコシドと反応させ緩衝液（好ましくは酢酸
   アンモニウム）で透析するか、又は微生物、動物細胞、
   蛋白又はペプチドと可溶化剤との緩衝液中の混合液、又
   は微生物、細胞、蛋白又はペプチドと可溶化剤との緩衝
   化生理食塩水中の混合液を濃度勾配により遠心分離して
   得られる上層の蛋白画分を、電気泳動又はクロマトグラ
   フィー法により可溶化剤から分離し、グリコシドを含む
   溶液中に集め、得られる蛋白複合体をおそらくは濃縮（
   例えば凍結乾燥、真空透析又は限外濾過）、又は濃度勾
   配遠心分離法によりさらに精製することにより得る、特
   許請求の範囲第１項から第４項までのいずれか１項に記
   載の免疫原性複合体。
6. （６）特許請求の範囲第１項から第５項までのいずれか
   １項に記載の免疫原性複合体の調製法において、ウィル
   ス、マイコプラズマ、細菌、寄生体、動物細胞、又は疎
   水性領域を有する蛋白又はペプチドを、１つ以上の可溶
   化剤と混合し、蛋白又はペプチドと可溶化剤との間で複
   合体を形成させた後；ミセルを形成するのに必要な少な
   くとも臨界濃度の疎水性又は親水性領域を有する１つ以
   上のグリコシドを含有するグリコシド溶液の存在下で、
   該蛋白又はペプチドを可溶化剤から分離するか、又は蛋
   白又はペプチドを可溶化剤から分離し直接グリコシド溶
   液に移し、グリコシドとの蛋白、複合体が形成した後、
   該複合体を単離精製して担体分子を調製した後、この担
   体分子を、ペプチド、蛋白、炭水化物、リポ蛋白、糖脂
   質又はビオチンに、担体に結合する分子の官能性結合基
   と担体分子中の官能基との間で結合させることを特徴と
   する、上記免疫原性複合体。
7. （７）官能基を結合させる時に、結合すべき分子の約１
   ｍｇ（好ましくは２５０−５００μｇ）を、（蛋白含量
   として）約１ｍｇの担体分子と反応させる、特許請求の
   範囲第６項に記載の方法。
8. （８）特許請求の範囲第１項から第６項までのいずれか
   １項に記載の少なくとも１つの免疫原性複合体を活性物
   質として、任意には薬理学的に許容される添加剤との混
   合物として含有することを特徴とする、免疫刺激性組成
   物。
9. （９）特許請求の範囲第１項から第６項までのいずれか
   １項に記載の少なくとも１つの免疫原性複合体を活性物
   質として含有することを特徴とする、ワクチン。
10. （１０）特許請求の範囲第１項から第５項までのいずれ
    か１項に記載の少なくとも１つの免疫原性複合体より成
    ることを特徴とする、試薬。