JPH0751514B2 - 免疫原性複合体の製造法 - Google Patents

免疫原性複合体の製造法

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JPH0751514B2
JPH0751514B2 JP61505483A JP50548386A JPH0751514B2 JP H0751514 B2 JPH0751514 B2 JP H0751514B2 JP 61505483 A JP61505483 A JP 61505483A JP 50548386 A JP50548386 A JP 50548386A JP H0751514 B2 JPH0751514 B2 JP H0751514B2
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Description

【発明の詳細な説明】 本発明は所謂iscom（イスコム）という免疫原性複合体
の製造法に関する。
キルドウイルスたとえばインフルエンザウイルスは良好
な抗原効果を有することが知られている。しかし、これ
らは十分な精製後でも発熱性である。保護免疫を誘導す
るのに重要な成分を分離することにより、発熱効果は回
避できるが、免疫原性の強さがしばしば十分でない。し
たがつて、免疫応答を増すために、適当なアジユバンド
を分離抗原（サブユニツト）含有ワクチンに導入しなけ
ればならない。一方、有効なアジユバンドは今まで使わ
れてきた状態では、ネガテイブな副作用を示す。したが
つて、アジユバンド含有ワクチンは発熱効果について、
全体のウイルスによるワクチンより良くない。
免疫原性を増すために、リポソームの表面にエントラツ
プしまたは結合した界面活性剤膜タン白が製造された
（EPC出願7940083.0）。リポソーム中の界面活性剤を含
まない膜タン白は米国特許第4148876号明細書に記述さ
れている。このような界面活性を含まない単一薄層のリ
ポソーム産物にアジユバントを加えるのは米国特許第41
96191号明細書（その効果については開示なし）に記述
されている。米国特許第4117113号明細書にはネガテイ
ブに荷電したリポソームを含有するウイルス抗原を開示
している。このようなリポソームを含有するインフルエ
ンザヘマグルチニンおよびノイラミニダーゼでは、リポ
ソームにアジユバント、マイコバクテリア細胞壁を加え
ると、すぐれた免疫応答を生ずる。キルドMycobacteria
tuberculosis,Bordetella pertussisおよびサポニンな
どのアジユバントをこのようなネガテイブに荷電したリ
ポソームを含むジフテリアトキソイドに加えた場合、す
ぐれた免疫応答が得られた（米国特許第4053585号明細
書）。しかし、上記のリピド含有膜タン白産物すべては
長期貯蔵、凍結乾燥または高温のような不注意ハンドリ
ング後に不安定である。
界面活性剤を含まないおよびリピドを含まないタン白ミ
セルもワクチンとして製造された。Semliki Forest Vir
us（SEV）の膜タン白ミセルはSFCに対する循環抗体の生
成を刺激しかつSFVによる致命的感染からネズミに保護
物を産生することが証明された。一方、パラインフルエ
ンザ−３−ウイルスのこのような膜タン白ミセルはラム
に抗体生成を刺激したりあるいは油性アジユバントをミ
セルと混合しない限り、肺炎をおこすPI−３−ウイルス
の投与に対しても有効でなかつた。油性アジユバントは
通常感染部位で部分的反応の形で副作用を呈する（EPC
出願81102213.6号）。
EPC特許出願0109942号明細書では、グリコシドを含有す
る免疫原性タン白またはペプチド複合体およびその製造
法を開示している。その方法によれば、全ウイルス、マ
イコプラズマ、細菌、寄生虫、動物細胞だけでなく、精
製ペプチドやタン白、あるいは合成やハイブリドDNA技
術により製造したタン白やペプチドから出発することが
できる。
これらの複合体はグリコシドを添加せずに作つた相当す
るタン白ミセルより電子顕微鏡下では別の形態構造を有
する。このミセルは放射状に並列したスパイクをもつコ
ンパクトな中心コアを有するが、EPC109,942号による複
合体は環状サブユニツト又は周縁構造の一部から成る開
放型周縁構造を有する。形態もリポソームのものとは異
なる。複合体およびその一部は通常相当するミセルより
低い沈降定数、タン白又はペプチドの相当するモノマー
形より高い沈降定数およびリポソームより高い沈降定数
を有する。
グリコシドを添加して製造したEPC109,942号による複合
体はグリコシドを添加しないで又はタン白分子と可溶化
剤（モノマー形）あるいはリピド小胞（即ち、ビロソー
ム）に結合したタン白分子間複合体を添加せずに調製し
た相当するタン白ミセルよりすぐれた免疫原性活性を有
しかつタン白ミセルをグリコシドその他のアジユバント
と混合した時より副作用は少ない。したがつて、膜タン
白は投与量は約1/10以上に減ずることができる。
純粋のタン白又はペプチドから出発する時、集塊体即ち
ミセルを生成し易いことが判明された。このことは複合
体を調製する場合リピドを添加して克服することができ
る。
また細菌から出発する時および全細胞を精製する時、存
在するリピドが非常に少ないので、ミセルを生成しな
い。これはリピドを添加して克服することができる。
この新規方法はペプチド又はタン白以外の抗原および抗
原決定基で複合体を調製するのに使うことができる。
したがつて、本発明はウイルス、マイコプラズマ、寄生
虫、動物細胞、抗原又は疎水領域をもつ抗原決定基を１
種以上の可溶化剤を混合して、抗原又は抗原決定基と可
溶化剤間で複合体と生成し、この後抗原又は抗原決定基
を疎水領域と親水領域をもつ１種以上のグリコシドを少
なくとも臨界ミセル濃度で含有するグリコシド溶液の存
在下可溶化剤から分別するか、あるいは可溶化剤と分別
し直接このグリコシド溶液に移し、そしてタン白複合体
を生成し、単離精製する、疎水領域をもつ抗原又は抗原
決定基を含有する免疫原性複合体の製造法であつて、複
合体の単離精製前にリピドを添加すること特徴とする。
可溶化を促進しかつ両親媒性タン白又は疎水領域をもつ
タン白を天然状態に維持するかあるいは化学処理や熱
（例えば70℃）にさらすか、又は疎水領域をもつ他の分
子を維持するために、水溶液中モノマーとしてのデイス
パーゲート（dispergate）では、リピドおよび／又は水
混和性極性有機溶媒の存在に必須である。実際、動物や
植物細胞の天然リピドがその目的に使われる。したがつ
て、動物細胞又は植物細胞由来の膜にみられるリピド−
リピド混合物が適当である。あるリピド（例えばコレス
テロール）はリピド膜を一層硬くし、他の例えばホスフ
アチジルコリンは一層液状にする。これらの必要な性質
をもつ合成リピドも製造することができ、これらの目的
に使用できる新しいリピドを作るのに実際制限はない。
リピドの大きさや性質について、使用する系における溶
解性により制限がみられる。例えば、硬質リピド（コレ
ステロール）の水溶液は余り硬くないリピド（ホスフア
チジルコリン）を添加して安定化させる。極性有機溶媒
はタン白モノマーとして溶液中疎水性をもつタン白の安
定化に関与する。結局、その機能に関しリピドの大きさ
を制限するのは不可能である。と言うのは疎水性を決定
する脂肪族鎖長はマツチする極性部分によりバランスウ
エイトされうるからである。
また糖はタン白をさらされた疎水領域で維持する安定効
果を有しあるいは類似の性質をもつ他の分子に溶液中モ
ノマーとしてデイスパーゲートする。
糖として、モノサツカライド（例えば、トリオース、テ
トロース、ペントース、ヘキソース、ヘプトースおよび
相当するケトース）、非還元性オリゴサツカライド（例
えば蔗糖、トレハロース、ラフイノース）、還元性オリ
ゴサツカライド（例えば、マルトース、セロビオース、
イソマルトース、パノース、ゲンチオビスオース、ラク
トース）およびポリサツカライドが使われる。水溶液に
対し５−50％の量で添加することができる。
水混和性極性有機溶媒として、炭素原子10個までの１価
又は多価アルコール、例えばエタノール、グリコール
（エチレングリコール等）、エーテル（ジエチルエーテ
ル等）、ケトン（アセトン等）が使用可能である。
リピドは脂肪又は脂肪類似物質例えば炭素原子４−30個
を有する飽和脂肪酸（酪酸、カプロン酸、カプリル酸、
カプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パミチン酸、
ステアリン酸、アラキン酸、ベヘン酸、リグノセリン酸
など）又は炭素原子30個までの不飽和脂肪酸（ヘキサデ
セン酸、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸、アラキ
ドン酸など）、オキシ脂肪酸（9,10−ジヒドロキシステ
アリン酸など）、不飽和オキシ脂肪酸（ヒマシ油な
ど）、分枝鎖脂肪酸などの炭素原子50個までの脂肪酸を
有するトリグリセリド又は混合トリグリセリド、グリセ
ロールエーテル、ワツクス（即ち、高級脂肪酸と一価ア
ルコールのエステル）、ホスホリピド（リン酸グリセロ
ール誘導体、例えばホスフアチジン酸誘導体、即ちレシ
チン、ケフアリン、イノシトールホスフアチド、C14-20
のスピンゴシン誘導体）、グリコリピドイソプレノイ
ド、スルホリピド、カロチノイド、ステロイド（コレス
テロール、コレスタノール、カプロスタノール、フイト
ステロール（ステイグマステロールなど）、シトステロ
ール、マイコステロール（エルゴステロールなど）、胆
汁酸（コリン酸、デオキシコリン酸、ケノデオキシコリ
ン酸、リトコリン酸など）、ステロイドグリコシド、ビ
タミンＡのエステル又はその混合体でよい。
これらのおよびその他の有用なリピドは「Lipid Bioche
mistry」M.I.Gurr,A.I.James著、1980,Chapman and Hal
l,London,New York,Univrsity Press Cambridgeに記載
されている。
コレステロールホスフアチジルコリン、リポソーム又は
intralipid （Oleum soya fractionate 200g,Lechiti
num fractionate vitello ovi 12g,グリセロール22.5
g、H2Oで１）を使うのがよい。
リピドは方法中どの段階で添加してもよいが、グリコシ
ドの添加前が望ましく、またリピドはグリコシドの添加
後にも添加できる。リピドが存在しないと、抗原又は抗
原決定基はミセルを形成し易い。リピドを加えるとミセ
ルを壊し、その結果複合体が生成しうる。
リピドは対抗原又は抗原決定基が少なくとも0.1/1のモ
ル比、のぞましくは少なくとも1/1で添加する。100/1以
上のモル比を使うと、複合体に硬くなりかつ取扱いが難
しくなる。モル比が低く過ぎると、ミセルができて、複
合体が余り生成されない。しかし、0.1/1の比では、若
干の複合体が生成される。したがつて、リピド対抗原又
は抗原決定基のモル比は0.1/1〜100/1である。
リピドを加えようと加えまいと、今に入手できる分析方
法により証明できない。新規方法によりリピドを添加し
て調製した複合体は電気顕微鏡下（EM、図参照）ではリ
ピドの添加なしで作つた複合体と同じ形態的構造と同じ
沈降定数を有する。
しかし、リピドの添加により生成した複合体を後で清浄
にしないと、EMのアウトラインは混濁しそしてリピドは
その表面に塊化すると考えられる。複合体を清浄にする
と、EMによるアウトラインは全くきれいで、リピドを含
有することは現在証明できない。
抗原として高分子化合物を使用できる。タン白、ポリペ
プチド、グリコタン白およびリポタン白以外に、ポリサ
ツカライド、オリゴサツカライド、ポリヌクレオチド又
はその混合物も使用可能である。
本発明方法による複合体製造に適する抗原決定基は例え
ば、小さいポリペプチド、小さいオリゴサツカライド、
オリゴヌクレオチド、グリコタン白断片およびハプテン
又はその混合体である。
小さいポリペプチドとは、少なくとも３から約40までの
アミノ酸を含むポリペプチドを意味する。一般に、抗原
決定基に４−10個以下のアミノ酸を含む。しかし時に
は、抗原決定基の特異的構造および／又は免疫化による
免疫応答を確かめるために、幾分多量のアミノ酸が必要
である。
小さいオリゴサツカライドとは、少なくとも４から約20
の糖単位、望ましくは６〜10の糖単位を有する直鎖又は
分枝鎖糖単位を意味する。これらのオリゴサツカライド
は合成、あるいは天然由来のポリサツカライド又はグリ
コタン白を化学的又は酵素的に分解して製造することが
できる。
オリゴヌクレオチドとは、少なくとも１〜約18のデオキ
シリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドから成る化合
物を意味し、これは合成あるいはRNAやDNAの如きポリヌ
クレオチドを酵素的又は化学的切断により得られる。こ
れらのオリゴヌクレオチドは二重鎖であつてもよい。
ハプテンとは、それ自信免疫原性はないが、免疫原性に
なる担体分子に結合する小分子を意味する。例はステロ
イドとプロスタグランデインである。
抗原又は抗原決定基は疎水基を有するかあるいは抗原又
は抗原決定基と疎水性化合物間の結合を生成しうる少な
くとも１つの反応性基をすることである。
それ自身免疫原性でない分子は、疎水基を有する場合、
免疫原性でありかつイスコム複合体にて担体の役割を演
じる一層大きな基と共にイスコムとなりうる。したがつ
て、この複合体はハプテンと抗原の混合物を含みうる。
グリコシドの疎水領域に結合する疎水領域をもつタン白
又はペプチドは Ａ） エンベロープのあるウイルス、細菌、マイコプラ
ズマ、寄生虫又は動物細胞由来かの膜タン白又は膜ペプ
チドから誘導されるか又はそのものである、親水性又は
疎水性基を有する両親媒性タン白又はペプチド、又はハ
イブリドDNA法により産生されるタン白又はペプチド、
又は合成分子、 Ｂ） 疎水性基を結合させることにより両親媒性にされ
る親水性タン白又はペプチド。これらのタン白又はペプ
チドはウイルス、細菌、マイコプラズマ、寄生虫、動物
細胞より得られるか、又は合成されるか、又はハイブリ
ドDNA法により得られる。
Ｃ） 親水性タン白の利用できなかつた疎水性部分を化
学的方法により利用できるようにした両親媒性タン白又
はペプチド。これらのタン白は上記の微生物又は細胞に
由来するか又はハイブリツドDNA法又は合成により得ら
れる。
複合体の調製 ａ） 全細胞又はウイルス由来の膜タン白又は膜ペプチ
ドの調製に関して、複合体の調製は原則として以下の３
段階より成る：動物細胞又は微生物又はその断片の精製
又は単離；疎水性タン白の可溶化と可溶化剤の除去、そ
して同時に複合体中の目的の抗原をグリコシドを利用し
て免疫原性のある形に移動（免疫原性複合体）。
精製と単離 ウイルス、マイコプラズマ、細菌、寄生虫及び動物細胞
を以下のような公知の方法（例えば「The Tools of Bio
chemistry」,I.G.Cooper,JohnWiley＆Sons社（1977年）
ニユーヨーク参照）で濃縮し精製する。例えばゲル濾過
によるか又は糖濃度勾配遠心分離、パーコール又はホロ
ーフアイバー透析による濃度勾配遠心分離等である。細
菌については、細胞壁を例えば超音波又はフレンチプス
法を用いてまず溶解又は分解することが必要又は有利な
ことがある（例えばCota-Robles and Stein、「CRC Han
dbook of Microbiology」第２巻（1973年）、第833−84
4頁参照）。
可溶化 精製した動物細胞又は微生物又はその断片を次に非イオ
ン性、イオン性又は双性イオン性界面活性剤（これらは
過剰に使用する）と混合する。適切な非イオン性界面活
性剤の例としては脂肪族又はアラルリルフアテイツク酸
およびアルコールを有するポリグリコールエステルおよ
びポリグリコールエーテルがある。具体例としては一般
式CnH2n+1（OCH2CH2）xOH（短縮形CnEx）を有するアル
キルポリオキシエチレンエーテル；アルキル基とポリオ
キシエチレン鎖の間にフエニル環を有するアルキルフエ
ニルポリオキシエチレンエーテル（短縮形CnφEx）、例
えばトリトンＸ−100＝３級−C8φE9,6（ポリエチレン
オキサイドのオクチルフエノールエーテル）、アシルポ
リオキシエチレンエステル；アシルポリオキシエチレン
ソルビタンエステル（短縮形CnソルビタンEx）（例えば
ツイーン20、ツイーン80）、β−Ｄ−アルキルグルコシ
ド（例えばβ−Ｄ−オクチルグルコシド）がある。下記
のグリコシド（特にサポニン）も使用可能である。しか
し、これらは弱界面活性剤であり、他の界面活性剤と併
用すべきである。適当なイオン性界面活性剤の代表例と
しては没食子酸界面活性剤（例えばデスオキシコレート
およびコレート）がある。複合体化界面活性剤（例えば
タウロデオキシコレート、グリコデオキシコレートおよ
びグリココレート）も使用可能である。使用可能性ある
双性イオン性界面活性剤としてはリソレシチンおよび合
成リソリン脂質がある。上記の界面活性剤の混合物も使
用可能である。
可溶化は又アルコール、有機溶媒又は両親媒性の低分子
（例えばヘプタン−1,2,3−トリオール、ヘキサン−1,
2,3−トリオール、酢酸、水溶性ペプチドおよびタン白
又はそれらの混合物、又は界面活性剤）を用いても可能
である。
リピドおよび疎水性タン白の量に比較して可溶可剤は過
剰に使用される。細胞又は微生物および界面活性剤は1:
3から1:10の重量比で混合することが適切である。
細胞又は微生物および可溶化剤は緩衝化した、おそらく
は生理食塩水中で混合される。生理食塩水のモル濃度は
0.02から0.5M（好ましくは0.05から0.025M）が好まし
い。界面活性剤は室温で約１時間作用するはずである。
塩としては塩化ナトリウムが好ましいが、他の塩も可能
である、特にアルカリイオン、アルカリ土類イオンおよ
びアンモニウムイオンおよび強鉱酸および有機酸（例え
ば酢酸、トリクロロ酢酸、蟻酸、および蓚酸）との塩も
可能である。緩衝液としては、pH6.5−９で緩衝液する
物質はすべて適切である。コレートおよびデソキシコレ
ートを用いるときは、pH8−９が好ましく、非イオン性
界面活性剤を用いる時はpH7.4が好ましい。タン白の可
溶化に有機酸を用いる時は緩衝化を省略してもよい。
免疫原性複合体の調製 細胞又は微生物を可溶化する時、可溶化剤および細胞又
は微生物の断片（以下断片と呼ぶ）の混合物を生成させ
る。断片の中には可溶化剤との複合体としての荷電した
疎水性領域を有する単量体抗原性タン白がある。疎水性
又は親水性領域を有しかつ少なくとも臨界ミセル濃度で
存在する必要のある、１つ以上のグリコシドの存在下こ
の荷電した単量体性抗原タン白を可溶化剤から分離する
か、又はグリコシド溶液に直接移すことにより免疫原性
複合体（主イスコム）が産生される。本発明の複合体を
調製する前、調製中、又は調製後（好ましくはする前）
に残りの断片を除去する。
例えば透析、ゲル透過、又はクロマトグラフイー法によ
り、可溶化剤、荷電した単量体抗原性タン白、グリコシ
ドおよびおそらくは他の断片の混合物から可溶化剤を除
去するか、又は例えば濃度勾配遠心分離、クロマトグラ
フイー又は電気泳動により、上記混合物から荷電した単
量体抗原性タン白を分離することにより、本発明の複合
体を調製することができる。本発明の本質的特徴は、ミ
セル型が存在するグリコシドの同時存在下にモノマー性
抗原タン白を可溶化剤から分離するか、又は分離後直接
グリコシドに移すことである。モノマー性抗原タン白を
可溶化剤から分離し、グリコシドと直接接触するとき、
本発明の特別の複合体が生成する。このグリコシドのミ
セル型がこの複合体を作る為の基本であり、複合体はグ
リコシドミセルの疎水性領域と膜タン白の疎水性領域と
の引力により生成すると考えられる。複合体中のグリコ
シドの量は使用するグリコシドと複合体結合膜タン白に
よつて変わり、0.5から50重量％（特に0.5から25重量
％、好ましくは0.5から15、しばしば0.5から10、および
特に２から８重量％の間）である。しかしグリコシドの
存在しない時モノマー性抗原タン白を可溶化剤から分離
する場合、ヨーロツパ特許出願第81102213.6号で産生さ
れる型のタン白ミセルが生成する。
成分の沈降定数は以下の順序で減少する為、濃度勾配遠
心分離により他の成分を除くことが好ましい：細胞断
片、可溶化剤又はグリコシドとの白複合体、モノマー性
タン白および可溶化剤。従つて、グリコシドを添加する
前に他の断片は濃度勾配遠心分離により、化溶化剤、モ
ノマー性タン白、および他の断片から除去できる。そし
て可溶化剤は例えば透析、ゲル濾過、クロマトグラフイ
ーにより除去、又はモノマー性タン白は電気泳動、クロ
マトグラフイー、濃度勾配遠心分離により、可溶化剤か
ら分離される。濃度勾配遠心分離においては、濃度勾配
遠心分離をしている時（複合体が生成している時）、他
の断片を除去することができる。又上記のように複合体
が生成した後、例えば遠心分離、アフイニテイクロマト
グラフイー、又はゲル濾過により、他の細胞成分を除去
することが可能である。イスコムに組みこまれていない
が、疎水反応により結合している物質は界面活性剤帯、
例えば界面活性剤を含有する糖又は糖溶液の濃度勾配の
遠心分離により除くことができる。
グリコシドは疎水性及び親水性領域を有する任意のグリ
コシドが使用できる。好ましくは、R.TschescheおよびW
ulfの「Chemie und Biologie der Saponine in Fortsch
ritte der Chemie Organischer Naturstoffe」、W.Her
z,H Griesebach,G W Kirby発行、第30巻（1973年）に記
載のサポニンであり、特に極性酸性ビスデスモシドのよ
うな極性の強いサポニン、例えばキラヤバルクアラロシ
ドＡ（Quillajabark Araloside A）、チコセツサポネン
IV（Chikosetsusaponen IV）、カレンデユラーグリコシ
ドＣ（Calendula−Glycoside C）、チクセツサポニンＶ
（Chikusetsusaponin V）、アキランテス−サポニンＢ
（Achyranthes−Saponin B）、カレンデユラーグリコシ
ドＡ（Calendula−Glycoside A）、アラロシドＢ（Aral
oside B）、アラロシドＣ（Araloside C）、プトランジ
ア−サポニンIII（Putranjia−Saponin III）、ベルサ
マサポニシド（Bersamasaponiside）、プトランジア−
サポニンIV（Putranjia−Saponin IV）、トリコシドＡ
（Trichoside A）、トリコシドＢ（Trichoside B）、サ
ポナシドＡ（saponaside A）、トリコシドＣ（Trichosi
de C）、ギプソシド（Gypsoside）、ヌタノシド（Nutan
oside）、ジアントシドＣ（Dianthoside C）、サポナシ
ドＤ（Saponaside D）からのサポニン抽出物、好ましく
はエスキユラスヒポカスタヌム（Aesculus hippocastan
um）からのエスシン（aescine）（T.Pattおよびwinkle
r）:Das therapeutisch Wirksame Prinzip der Rosskas
tannie（エスキユラスヒポカスタヌム）、アルツナイミ
テルフオルシユング（Arzneimittelforschung）第10巻
（第４号）、第273−275頁（1960年））、又はギプソフ
イラストルチウム（Gypsophillastruthium）からのサポ
アルビン（R.Vochten,P.JoosおよびR.Ruyssen）:Physic
o−Chemical properties of sapoalbin and their rela
tion to the foam stability,「J.Pharm.Belg」第42
巻、第213−226頁（1968年））、特にキラヤサポナリア
モリナ（Quillaja saponaria Molina）からのサポニン
抽出物、主にK.ダルスガード（K Dalsgaard）:Saponin
Adjuvants,ブルオフイントエピツツ「Bull off Int Epi
z」，第77巻、第７−８号、第1289−1295頁（1972年）
の方法により産生されるDQ−抽出物、及びK.Dalsgaard:
Saponin Adjuvants III、「Archiv fr die Gesamte V
irusforschung」,444巻、第243−254頁（1974年）の方
法により産生されるキルＡ（Quil A）である。又グリコ
シドの混合物も使用可能である。グリコシドの添加量
は、臨界ミセル形成濃度（CMC）の少なくとも１−３
倍、好ましくは少なくとも５倍、特に少なくとも７−12
倍でなければならない。この場合グリコシドは、膜タン
白のモノマー型に結合、及び捕捉できると考えられる。
好ましくは、臨界ミセル形成濃度が0.03重量％であるキ
ルＡを用いる。従つて、キルＡの量は少なくとも0.02重
量％、特に0.05−0.5重量％、好ましくは0.2重量％でな
ければならない。グリコシドの上記の引用例は参考のた
めに示したものである。
荷電したモノマー性抗原タン白は、遠心分離、透析、電
気泳動及び種々のクロマトグラフ法により可溶化剤から
分離した。
遠心分離法 上記により調製した断片化した細胞又は微生物と可溶化
剤との混合物は濃度勾配遠心分離される。これは可溶化
剤を含有する塩又は煙溶液の上部に層をなす。この層の
下にグリコシドを含有する濃度勾配が存在する。これは
例えば糖の濃度勾配又はグリセロール、メトリズアミド
又は重い塩（例えば塩化セシウム）の濃度勾配（すなわ
ち濃度勾配用物質として作用するのに適切な密度と粘性
を有する比較的不活性な物質）である。糖の場合の例を
以下に示す。
濃度勾配系を少なくとも100,000g（これは実際の状況の
時間と濃度勾配により変化する）で遠心分離する。糖と
しては単糖類（例えばブドウ糖、乳糖、麦芽糖）、二糖
類（例えば蔗糖）が用いられるが、三糖類、四糖類及び
グリセリンも使用可能である。蔗糖を用いるのがよい。
濃度勾配中の糖の出発濃度は少なくとも５、好ましくは
15−25重量％（濃度勾配の最上層）であり、最終濃度は
少なくとも20、好ましくは45−60重量％（濃度勾配層の
最下層）が適当である。例えば上層が糖含量として５−
25重量％で、下層が糖含量として20−60重量％の濃度勾
配ができる。しかし、数個の層が存在することも可能で
あり、その場合個々の層の濃度差はそれに応じて減少す
る。糖濃度勾配はグリコシド又はグリコシドの混合物を
含む。グリコシドの量はCMCの１−３倍、特に少なくと
も５倍、好ましくは少なくとも７−12倍である。キルＡ
の場合は少なくとも0.02、特に少なくとも0.05−0.5、
好ましくは少なくとも0.2重量％である。このグリコシ
ド含有濃度勾配中で、可溶化剤は分離され、可溶化剤と
タン白の複合体はタン白−グリコシド複合体に変換す
る。
糖の濃度勾配の上に、可溶化剤又は可溶化剤の混合物を
含む、糖又は重い塩溶液の層があり、リピドはこの層に
とどまる。この層の可溶化剤の濃度は、微生物又は細胞
と可溶化剤の混合物として添加した時の濃度より低いか
又は同じであり、0.25−３重量％が適当であり、好まし
くは0.75−1.5重量％であり、１重量％が最も好まし
い。糖又は塩の濃度は、下層にあるグリコシド含有濃度
勾配の上層中の濃度と同じか又はそれより下であり、好
ましくは糖の５−25重量％、特に15重量％である。
少なくとも100,000gで少なくとも16時間（好ましくは20
℃で20時間）遠心分離後、タン白画分を集め、緩衝液
（0.5M−0.001M）、好ましくは0.005Mトリスー塩酸、0.
01M NaCl、pH7.4、又は0.2M酢酸アンモニウム緩衝液pH
7.4で透析し、T.G.Cooperの「The Tools of Biochemist
ry」、JohnWilly＆Sons（ニユーヨーク、1974年）に記
載の方法、例えば凍結乾燥、真空透析、及び限外濾過法
で濃縮する。遠心分離中、全成分を沈降させると、タン
白と可溶化剤の複合体から可溶化剤がはずれ、モノマー
性タン白はグリコシドに移行し、複合体を形成する。そ
の後透析することにより糖が除去される。
この複合体をさらに例えば濃度勾配遠心分離（例えば20
−60重量％の糖、好ましくは10−40重量％のショ糖を含
む糖の濃度勾配）により、遊離のグリコシドから精製す
ることも可能である。濃度勾配の上部に界面活性剤が含
まれると、遊離のグリコシドは一層保持される。
透析法 上記の様に細胞又は微生物の精製の後、及び上記の重量
比で可溶化剤と混合した後、上記の緩衝液中の細胞と可
溶化剤の混合物を、CMCの少なくとも１−３倍、好まし
くは７−12倍（キルＡの場合は0.05−２重量％、好まし
くは0.2重量％）と直接混合し、緩衝液（例えば0.5−0.
001M、好ましくは0.005Mトリス−塩酸、0.01M NaCl、p
H7.4、特に0.2M酢酸アンモニウム緩衝液、pH7.0）で透
析してもよい。
可溶化剤と細胞の混合物はアフイニテイクロマトグラフ
法により精製した免疫原性タン白に有用なリピドやエタ
ノール又は合成ペプチドを含んでもよい。グリコシドの
存在下の透析により可溶化剤が分離する。ついで生成し
た膜タン白複合体は既述したように沈降濃度勾配遠心分
離により単離できるが、グリコシド添加剤を除外し、他
の断片や遊離グリコシドを含有しない。
緩衝液中の細胞、微生物及び可溶化剤の混合物も濃度勾
配遠心分離が可能であり、例えば上記緩衝液中の５−60
重量％の糖濃度勾配、好ましくは10−20重量％の蔗糖濃
度勾配上に重層し、150.000gで少なくとも20分、好まし
くは250,000gで30分遠心分離する。こうして可溶化剤と
タン白の複合体から他の断片が分離される。
上層のタン白液（上部フラクシヨンと呼ぶ）を抽出し、
キルA0.05−0.5重量％、好ましくは0.2重量％では、少
なくとも１−３倍、好ましくは少なくとも７−12倍のCM
C量でグリコシドを添加し、そして緩衝液0.5−0.001M、
特に0.005Mトリス−塩酸、0.01M HCl、pH7.4、好まし
くは0.2M酢酸アンモニウムで透析する。グリコシドの存
在下で可溶化剤を除去する。沈降濃度勾配遠心分離（透
析法参照）によりさらに精製できる。界面活性剤を有す
る糖の上層を含有する５−60重量％の糖、好ましくは10
−40重量％の糖を含有する糖の濃度勾配によりさらに精
製できる。
電気泳動法 別法として、断片化した微生物又は細胞及び可溶化剤又
は得られる上層のたん白液（他の断片を遊離の可溶化剤
は除去されている）との混合物を例えば緩衝液中５−60
重量％、好ましくは10−20重量％で濃度勾配遠心分離す
ると、この混合物は電気泳動法により可溶化剤より分離
され、そしてキルＡの場合は0.05−0.5重量％グリコシ
ド、好ましくは0.2重量％を含む溶液中に少なくとも１
−３倍、好ましくは７−12倍CMCで移される。こうして
荷電したモノマー性抗原タン白が可溶化剤から分離され
る。電気泳動により分離する場合は、電気泳動を妨害し
かつ過熱の原因となる余分の塩が添加されてない可溶化
剤−緩衝液が適切である。担体を含む又は含まないゾー
ン電気泳動や、担体を含む又は含まない等速電気泳動を
用いることも可能である。ポリアクリルアミド、寒天、
シリカゲル、澱粉、セルロース、ポリ塩化ビニル、イオ
ン交換体、セライトなどの普通の物質が担体として使用
できる。複合体の単離と濃縮については記述したように
行なう。更に精製は濃度勾配−遠心分離により行なう。
出発物質中に種々の電荷又は重量を含有する疎水性膜タ
ン白が含まれていても、電気泳動又は遠心分離によりそ
れらを互に分離し、それらの異なる複合体を作ることが
できる。こうして種々の膜タン白の複合体を分離したり
増やしたりすることができる。
クロマトグラフ法 細胞断片から精製後可溶化したタン白はクロマトグラフ
法（例えばゲル濾過、疎水性クロマトグラフイー又はア
フイニテイクロマトグラフイー（例えばイオン交換クロ
マトグラフイー））により、随時可溶化剤から分離する
ことができる。これらのクロマトグラフイーでは抗原構
造は、例えばセルロース、アガロース、デキストラン、
アクリルアミド及びガラスより成る不溶性基層（マトリ
ツクス）上に吸着する。このマトリックス構造には種々
のリガンドが結合しており、これらの特異的な性質を利
用して分離がなされる。使用する可溶化剤がマトリツク
ス中を吸着されないで通過する時、抗原構造は通常同時
に吸着される。このあと抗原の脱着を行なう。脱着段階
の前又はその途中に、可溶化剤、塩及び緩衝液物質の交
換があり、可溶化剤がグリコシドに交換され、複合体が
形成される。可溶化剤にはイスコムの生成を促進するリ
ピドやアルコールを補充してもよい。
イオン交換クロマトグラフイーでは、ジエチルアミノエ
チル（DEAE）のような荷電したリガンド分子がマトリツ
クスに結合しており、陽イオン交換体として用いられ
る。カルボキシルメチル（CM）又はリン酸基（Ｐ）がマ
トリツクスに結合している場合は、陰イオン交換体とし
て用いられる。抗原構造と可溶化剤の正味電荷の差を利
用してこれらの分子が分離される。一般的に可溶化剤は
荷電しておらず、タン白は荷電している。可溶化剤の存
在下で塩の濃度勾配（例えばＫ−又はNaCl−）、又は適
当な緩衝液（例えばリン酸緩衝液）によるpHの調節を利
用して溶出を行なう（濃縮については上記の可溶化を参
照）。可溶化薬剤にはイスコムの生成を促進するリピド
やアルコールを補充してもよい。溶出時に、タン白に精
製でき、グリコシドを可溶化剤の代りに溶出液に添加す
ると、可溶化剤は交換するか又は複合体が生成する。塩
類はついで透析により除く。
ゲル濾過の場合は、可溶化剤の分子量が抗原構造の分子
量より小さく、後の方の画分に出てくることを利用す
る。
イムノアフイニテイクロマトグラフイーでは、抗体が前
記のマトリツクスに不可逆的に結合し、その後で抗体の
ユニークな特異性と親和力を用いて目的の抗原構造を精
製する。可溶化剤は抗体に対し全く親和性を有していな
い。温和な変性（例えばpHを約４に下げる）及び可溶化
剤又はグリコシドの存在下で溶出を行なう。
レクチン−クロマトグラフイーではレクチンが用いられ
る。レクチンは特異的な糖の官能基と可逆的に結合でき
る一群のタン白であり、たとえば糖タン白に結合するこ
とができる。レクチンは例えばセフアロース（フアルマ
シア社、ウプサラ）に対するリガンドとして結合してい
るか、又は適当なマトリツクスにすぐ結合できる形で市
販されている。界面活性剤（可溶化剤）は固定化された
レクチンに対し全く親和性を有していない。吸着した抗
原構造は通常低分子の糖、それもレクチンに対し親和性
を有するメチル化された糖（例えばマンノース、メチル
マンノシド、グルコース、メチルグリコシド及びＮ−ア
セチルグルコサミン）を、緩衝化塩溶液に溶解させて可
溶化剤又はグリコシドの存在下で脱着を行なう。
共有結合クロマトグラフイーでは、チオール基を有する
抗原構造が共有結合でマトリツクスに結合している。抗
原中のチオール基は、適当なマトリツクスに結合した活
性化チオ基に、チオージスルフイド交換により選択的に
結合する。この結合は可逆的であり、洗浄により可溶化
剤を除去した後、可溶化剤又はグリコシドの存在下でメ
ルカプトエタノール又はジチオトレイトールでジスルフ
イド結合を還元することにより、チオール含有抗原構造
が溶出できる。
疎水性クロマトグラフイー この技術はオクチル又はフエニル型の固定化疎水性リガ
ンドと抗原構造の疎水面との相互作用を利用する。別法
では、この技術は、抗原構造が吸着されない時に、例４
（透析法）による連続処理のために回収するリガンドは
混合物由来の可溶化剤を結合させる方法でもよい。他の
条件下では、抗原構造はリガンドに結合でき、可溶化剤
はリガンドに対して親和性を有しない。透析方法により
行なう。高イオン強度の固定化は例えば硫酸アンモニウ
ムにより行ない、溶出は水又はエチレングリコールで低
イオン強度で行なう。
クロマトグラフイ方法により精製又は単離した、疎水領
域を有するタン白又はその他の免疫原の可溶化はリピド
および／又は水混和性極性有機溶媒でかつまた糖を添加
して可溶化剤の補足により促進される。
したがつて、複合体は細菌由来の膜タン白を含むことが
でき、細胞材料を上記方法により処理する前に先ず細胞
壁を破壊するのが有利である。疎水性タン白を製造でき
る細菌例は例えばEscherichia,Staphylococci,Haemaoph
ilus（H.influenzaeなど）、Bordetella（B.pertussis
など）、Vibrio（V.chloleeraeなど）、Salmonella（S.
typhi,S.paratyphiなど）、望ましくはcoliの粘着因子
（pili K88）、Salmonellaなどのポリンタン白又はB.pe
rtussisやNeisseria meningitidis由来の外膜タン白で
ある。
特に、比較的リピド含量が少なくかつリポタン白や外膜
タン白が強い疎水性を有する細菌では、リピド、糖又は
極性有機溶媒を添加するのが適している。
エンベロープを有する使用可能なウイルスの例として
は、オルソミキソウイルス（例えばインフルエンザＡ、
Ｂ、Ｃ型）、パラミキソウイルス（特に麻疹ウイルス、
おたふくかぜウイルス、パラインフルエンザ１、２、３
及び４型ウイルス、犬のジステンパーウイルス及び牛疫
ウイルス）、桿状ウイルス（特に狂犬病ウイルス）、レ
トロウイルス（特に猫白血病ウイルスと牛白血病ウイル
ス、免疫欠損ウイルス（HIV）、ヘルペスウイルス（特
にPseudorabies）、ヘルペスシンプレツクスＩ及びII、
サイトメガロウイルス）、コロナウイルス、トガウイル
ス（例えばEEE、WEE、VEE（東部、西部及びベネズエラ
馬脳炎、黄熱病ウイルス、特に牛下痢ウイルス及びヨー
ロツパ豚熱ウイルスアレナウイルス（Arenaviridae）、
ポツクスウイルス、ブニアウイルス、特にハンタンウイ
ルス（Huntan virus）、イリデイオウイルス、特にアフ
リカ豚熱ウイルス、及び分類されてないものとしてヒト
Ｂ型肝炎ウイルスやマルブルグ−エボラウイルス（Marb
urg-Ebola virus）などがある。
本発明に使用できる寄生虫の例としては原生動物があ
り、例としてトキソプラズマ（例えばトキソプラズマゴ
ンデイ（Toxoplasma gondii））、マラリラ原虫（Plasm
odium）（例えば三日熱原虫（Plasmodium vivax）、四
日熱原虫（P.malariae）、熱帯熱原虫（P.falciparu
m））、テイレリアパルバム（Teileria parvum）、オバ
ール（ovale）及びフイラロイデ（Filaroidae）、好ま
しくはパラフイラリア（Parafilaria）及びオンコセル
カ（Onchocerca）、赤痢アメーバ（Entamoeba Histolgt
ica）、種々の型のアナプラズマ（Anaplasma）、住血吸
虫（Schistosoma）（例えばシストソーマヘマトビウム
（Schistosoma haematobium）、マンソーニ（manson
i）、ジヤポニカム（japonicum））、及びトリパノソー
マ（Trypanosoma）（例えばガンビアトリパノマーマ（T
rypanosoma gawbiense）、ブルセイ（brusei）又はコン
ゴレシ（congolesi））などがある。
ｂ） 疎水性非膜タン白又は非疎水性タン白又はペプチ
ドから出発することも可能である。非疎水性タン白又は
ペプチドは、そこに疎水性基を結合させることにより疎
水性にする。非疎水性タン白は、エンベロープのある又
はないウイルス、細菌、マイコプラズマ、寄生虫から得
られる。非疎水性タン白を有するエンベロープのないウ
イルスの例としてはピコルナウイルス（疎水性タン白を
も有すると考えられる）、（例えば口蹄免疫・ウイル
ス、ポリオウイルス）、アデノウイルス、パルボウイル
ス（例えば猫ペストウイルス及びブタパルボウイル
ス）、レオウイルス（例えばロタウイルス）がある。マ
イコプラズマの例としてはM.ニユーモニー（M.pneumoni
ae）、ミコイデス（mycoides）、ボービス（bovis）、
スイス（suis）、ヒオリノス（hyorinos）、オラーレ
（orale）、サリバリウム（salivarium）、ホミニス（h
ominis）及びフアーメンタンス（fermentans）がある。
これらのタン白又はペプチドは、ａ）精製及び単離に記
載した方法で精製して得られる。
非疎水性タン白に結合し得る疎水性基は、直鎖、分枝
鎖、飽和又は不飽和脂肪族鎖（好ましくは1,2,3,4,5,6,
7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,2
4,25,26,27,28,29又は30個の炭素原子を有する）、又は
疎水性アミノ酸又はペプチド又は他の疎水性構造（例え
ばステロイド）がある。疎水性構造の長さはタン白の大
きさの性質に合わせる。例としては、10−15個のアミノ
酸を有するペプチド（口蹄疫ウイルス）を、アミノ末端
又はカルボキシ末端の２個のチロシンで適当に作り出せ
る。分子量が70,000ダルトンのタン白には約20個の疎水
アミノ酸が必要である。これは実験的になされている。
従つて特に用いられるものは１−20個のアミノ酸（好ま
しくは1,2,3,4,5個のアミノ酸）（特にTrp,Ile,Phe,Pr
o,Tyr,Leu,Varの中から選ばれるもの、特にTyr）を有す
るペプチド；コレステロール誘導体（例えばコリン酸、
ウルソデソキシコリン酸）である。
これらの疎水性基は、非疎水性タン白に結合し得る官能
基に、例えばカルボキシル、アミノ、ジスルフイド、ヒ
ドロキシル、スルフヒドリル及びカルボニル基（例えば
アルデヒド基）結合していなければならない。
結合しうる疎水基として、カルボキシル、アルデヒド、
アミノ、ヒドロキシル、およびメタン、エタン、プロパ
ン、ブタン、ヘキサン、ヘプタン、オクタンおよびCys,
Asp,Glu,Lys、望ましくはオクタナールおよびTyr,Tyr,T
yr−Crs、−Asp又は−Gluを有するペプチドのジスルフ
イド誘導体から選択するのがよい。結合可能な基を有す
る疎水基は、物質を溶解させるものにより、例えば可溶
化剤や上記界面活性剤又は塩酸、酢酸67容量％、苛性ア
ルカリ液、アンモニアにより水溶解性でなければならな
い。ついで物質を沈澱させずにpHを中性方向に調節す
る。疎水基を結合させるタン白を変性させるpHにしない
様にする。リピドは溶解性を促進することができる。
疎水性分子を非疎水性タン白にモル比を10:1から0.1:1
（好ましくは1:1）で加える。
結合分子としてカルボキシル基を有する疎水性基は、水
溶性カルボジイミド又は混合無水物によりタン白に結合
させることができる。前者の例ではカルボジイミドを用
いてカルボキシル基をpH5で活性化し、リン酸含量の多
いpH8の緩衝液中でタン白と混合溶解する。後者の例で
はジオキサン又はアセトニトル中のトリエタノールアミ
ンの存在下でカルボキシ化合物をイソブチルクロロホル
メートと反応させ、得られる無水物をpH8−９でタン白
に加える。又ヒドラジンを用いてカルボキシル基をヒド
ラジドに変え、これがタン白中の過ヨー素酸で酸化され
た糖単位中のアルデヒドやケトンと共にヒドラゾン結合
を作ることも可能である。
アミノ基は亜硝酸で低温でジアゾニウム塩に変わり、こ
れがTyr,His及びLysと共にアゾ結合を生成する。
ヒドロキシル基は無水コハク酸でヘミサクシネート誘導
体に変換され、これはカルボキシル基として結合され
る。
アルデヒド基はタン白のアミノ基と反応してシツフ塩基
となりうる。
いつくかのカツプリング基および方法は「Journal of I
mmunobogical Methods）59（1983）129−143,289−299,
「Methods in Engymology」,Vol.93,280−33および（An
alytical Biochemistry」,116,402−407（1986）に記載
されている。
こうして作成した疎水基を有するタン白又はペプチドは
次に、ａ）で記載した様にグリコシドと複合体を形成す
るが、ここで細胞断片を除去する為の精製工程は省略で
きる。
ｃ） タン白を変性して利用することは、内包された疎
水領域をもつ親水性タン白から可能である。すなわち、
例えば約2.5のpHあるいは約9.5の高pHで、3M尿素又は70
℃以上の高温度で行なう。このようなタン白の例はイム
ノグロブリンIgG,IgM,IgA等又はその他の球状タン白、
アルブミン、ポリオウイルスタン白のような非エンベロ
ープウイルス由来タン白、エンベロープタン白又はレト
ロウイルス又はウイルスのヌクレオタン白の場合のよう
なタン白の疎水領域を失なっているウイルス由来のエン
ベロープタン白である。イムノグロブリンは例えば抗イ
ジオタイプ抗原でない。タン白はｂ）に記載のように精
製タン白として得ついでｃ）のようにグリコシドに結合
して複合体とすることができる。
ｂ）又はｃ）に記載の精製又は合成タン白又はペプチド
から出発する場合は、イスコムの調製中にこれらはミセ
ルとして凝集しやすい。従つて、１つ以上のリピド（特
にコレステロール）を加えると一次複合体が生成し易
い。時々エタノールのような極性溶媒を添加するのが有
用である。可溶化剤を加える時にリピドをタン白又はペ
プチドに加える。リピドとタン白又はペプチドのモル比
は少なくとも1:1である。次に上記４つの方法のうちの
１つを用いることができる。放射性のリピドを用いても
一次免疫原性複合体に放射能は検出されない。
親水性ペプチド／ポリペプチドは、例えばコレステロー
ル、ホスフアチジルコリン及び脂肪酸が1:7:2の比率よ
り成るリポソーム中に取り込まれた脂肪酸に共有結合す
ることができる。このペプチド／ポリペプチドは界面活
性剤を用いてポリソームから抽出され、界面活性剤を含
有する蔗糖濃度勾配（10−30％蔗糖）遠心分離により過
剰のリピドから分離する。
上記した様に好ましくは遠心分離又は透析法によりイス
コムを作ることができる。遠心分離法を使うことによ
り、リポソーム複合体の可溶化にトリトンＸ−100が使
用可能である。透析法の場合は界面活性剤も透析により
除去できなければならない。（例オクチルグリコシ
ド）。
本発明により調製したこの免疫原性複合体はヒト及び動
物で特異的免疫刺激剤として使用し得る。従つて、これ
らの細菌、ウイルス、マイコプラズマおよび寄生虫の引
き起こす病気のワクチンとしてイムノモジユレーシヨン
および診断用に、又研究用に抗体の産生に使用し得る。
又種々の疾病に対するワクチンを産生する為、種々の細
菌又はウイルスの両親媒性タン白の混合物も加えること
もできる。
この複合体は望ましくはイスコムの緩衝液、即ちTN−溶
液の形で通常の添加剤やフイラーと共に本発明のイスコ
ムを含むヒト又は動物用の組成物に使用できる。
またこれは分析試薬としておよび免疫原性を増大するこ
とを要する物質の担体として使用することもできる。
本発明は次の例により更に詳述する。
例１ 低pHで温和に変性することにより、ウシ血清アルブミン
（BSA17）分子の疎水領域をイスコムの生成に利用す
る。
0.15Mクエン酸緩衝液pH2.5に溶解したBSA2gを２％Ｎ−
デカノイル−Ｎ−メチル−グルカミンと等モル量のリピ
ド（コレステロール／ホスフアチジルコリン1:1）で２
時間温置した。リピドのストツク溶液は20％Ｎ−デカノ
イル−Ｎ−メチル−グルカミンと共に蒸留水中10mgリピ
ド/mlであつた。キルＡを0.1％濃度に加えた。混合物を
先ず低温度で６時間、ついで＋４℃で２時間リン酸緩衝
液pH7.2で十分透析した。電子顕微鏡でイスコムの生成
が確認された。
イスコムに結合しない物質由来の調製物を精製するため
に、その調製物を20％糖で遠心分離し、その上部に200
μ10％蔗糖と0.1％トリトン−Ｘ−100が層を形成して
いた。Kontron Tst 54ローターを遠心分離に使用し、20
℃/50,000rpmで10時間行なつた。イスコム含有BSAは500
μリン酸緩衝液pH7.2にペレツトを溶解して遠沈管の
底より回収した。BSA5〜10％の間でイスコムとして回収
した。
BSA−イスコムの免疫原性はマウスの免疫実験で試験し
た。１群８匹のマウスをイスコム中BSA1μｇで一度免疫
した。列の群の５匹のマウスは0.1μgBSA−イスコムで
一度免疫した。対応する群の８匹のマウスはイスコムに
結合させないBSAで免疫した。１ケ月後、マウスを瀉血
し血清を採つた。BSAに対する血清抗体はELISA法で測定
した。イスコム１μｇで免疫化させた８匹のマウスは1/
450（1/100〜1/1500）の平均血清滴定値で感応したが、
イスコムに結合しないBSA1又は0.1μｇで免疫化したマ
ウスはBSA1μｇ又は0.1μｇによる免疫に感応しなかつ
た。BSAイスコム0.1μｇで免疫化したマウス３匹はBSA
に対し感応せず、低い血清抗体滴定であり、２匹は感応
した。
例２ BSAを僅かに変性させると、分子の疎水領域を示す。こ
れはアルカリpHで行なうことができる。反応がイスコム
の生成を伴なうように、エタノール等のアルコールを加
えた。
30％エタノール（エチレングリコールも使用できる）を
含有する0.5M炭酸緩衝液pH9.6に溶解したBSA2mgを６時
間温置した。Ｎ−デカノイル−Ｎ−メチル−グルカミン
を等モル量のリピド（コレステロール／ホスフアチジル
コリン、例１参照）と共に２％濃度で加えた。キルＡを
0.1％濃度で加えた。混合物を30〜60分放置してから、
先ず室温で一晩、ついで４℃でリン酸緩衝液pH7.2で十
分透析した。イスコムは例１に記載のように遠心分離し
てイスコム未結合物質から精製した。イスコム複合体が
存在することが電子顕微鏡で確認した。更に、これらの
イスコムはIgMと同じ速度、即ち19Sで10〜50％等濃度勾
配で沈降した。イスコム中のBSAの回収は50％以上であ
つた。
例３ グルカゴン2mgを30％エタノール含有炭酸緩衝液5.5M、p
H9.6に溶解した。このグルカゴン溶液は例２におけるウ
シ血清アルブミン（BSA）と同じように正確に処理し
た。50％以上のグルカゴンをイスコムにて回収した。イ
スコムの生成は電子顕微鏡により確認しそして標準とし
てBSA（4S）、チログロブリン（19S）およびIgM（19S）
を用いて、10〜50％糖濃度勾配にて複合体の沈降を測定
して確認した。
例４ 2mgアンジオテンシンをエタノール含有0.5M炭酸緩衝液p
H9.6に溶解した。このアンジオテンシン溶液を例２にお
けるウシ血清アルブミン（BSA）と同じように処理し
た。50％以上のアンジオテンシンをイスコムに回収し
た。イスコムの生成は電子顕微鏡およびBSA（4S）、チ
ログロブリン（19S）とIgM（19S）を使つて10〜50％蔗
糖濃度勾配にて複合体の沈降を測定して確認した。
例５ ヘルペスウイルスEpstein Barr由来のエンベロープタン
白gp340を再構成してイスコムとした。
0.15Mリン酸緩衝液pH7.2に溶解した200μｇのgp340をリ
ピド（コレステロール／ホスフアチジルコリン1:1、例
１参照）70μｇ、および２％Ｎ−デカノイル−Ｎ−メチ
ル−グルカミンと共に温置しかつ室温で２時間おいた。
キルＡを0.1％濃度で加えた。混合物を室温で６時間、
ついで＋４℃で２日間リン酸緩衝液pH7.2で十分透析し
た。電気顕微鏡でイスコムの生成を確認した。gp340イ
スコムは例１に記載のように蔗糖を通して遠心分離して
イスコムに結合しない物質から精製した。
例６ gp340イスコムを別法で調製し、以下にその変法を記述
する。
200μリン酸緩衝液pH7.2中gp340を300μｇを、70μｇ
コレステロールを壁面に乾燥させた管に加えた。トリト
ンＸ−100を２％濃度で加え、混合物を室温で２時間保
つた。300μの混合物は、上部から底部まで１％トリ
トンＸ−100を有する200μ15％蔗糖および0.1％キル
Ａを有する上記リン酸緩衝液中12mlの20％蔗糖から成る
濃度勾配の上部で層を形成した。遠心分離は20℃/16時
間ベツクマンSW40ローターで40,000rpmで行なつた。グ
ラジエントを500μ部で低部から集取し、gp含有フラ
クシヨンはgp340ウサギ抗血清を使つてELISA法でトレー
スした。イスコムの生成は電子顕微鏡で確認した。
例７ F422細胞の組織培養液から免疫吸着法で精製したネコ白
血病ウイルス由来gp70は例１でウシ血清アルブミン（BS
A）について記述したように低pHで温和に変性させた。
例１の同じプロトコールを使い、gp70イスコムを得た。
イスコムの生成は電気顕微鏡により確認した。約10％の
gp70をイスコムに統合させた。
例８ 例７に記述したように精製したネコ白血病ウイルス由来
のgp70を例２のようにウシ血清アルブミン（BSA）につ
いてゆつくり変性させた。例２と同じプロトコールを使
用し、エタノールの存在下アルカリpHでgp70イスコムを
得た。イスコムの生成は電子顕微鏡により確認した。50
％以上のgp70をイスコムに統合させた。
例９ 免疫吸着技術によりHIV−感染H9−細胞の組織培養液か
ら精製したHIVのgp120を例１においてウシ血清アルブミ
ンについて記述したように低pHで処理した。同じプロト
コールを使い、gp120イスコムを得た。イスコムの生成
は電子顕微鏡により確認した。
例10 免疫吸着法によりHIV感染H9細胞から調製したHIVのgp12
0をアルカリpHとエタノールによりウシ血清アルブミン
（BSA）について記述したように処理し、分子の疎水領
域を得た。BSAについて例２に記述した同じプロトコー
ルを使いイスコムを得た。イスコムの生成は電子顕微鏡
により確認した。
例11 口蹄疫ウイルス（FMDV）のVP1のアミノ酸配列144−159
を示すペプチドは５つのバリアントで合成した。
I. （Try3）−FMD II. Ｎ−パルミチン酸−FMD III. Ｎ−カプリン酸−FMD IV. Ｎ−カプリン酸−（FMD）２ V. Lys−カプリン酸−FMD ペプチド1gを等量のリピド（コレステロール／ホスフア
チジルコリン1:1、例１参照）、２％濃度のＮ−デカノ
イル−Ｎ−メチル−グルカミンおよび最終濃度0.1％の
キルＡと混合した。混合物を室温で30〜60分温置し、リ
ン酸緩衝液pH7.2で透析した。透析膜の分画分子量は100
0であつた。電気顕微鏡によりイスコムの生成を確認し
た。
例12 Plasmodium falciparum抗原Pf155（マラリア）のアミノ
酸配列（パーム）2Lys Glu Glu Asn Val Glu His
Asp Alaを示すペプチドをＮ−末端結合パルミチン酸
で合成した。
このペプチド1gを等モル量のリピド（コレステロール／
ホスフアチジルコリン1:1、例１参照）、２％濃度のＮ
−デカノイル−Ｎ−メチル−グルカミンおよび0.1％の
最終濃度のキルＡと混合した。混合物を室温で30〜60分
温置し、リン酸緩衝液pH7.2で透析した。透析膜の分画
分子量は1000であつた。電子顕微鏡は典型的なイスコム
の構造を示した。
例13 Plasmodium falciparum抗原Pf155（マラリア）のアミノ
酸配列Ala Glu Glu Asn Asp Glu Glu Asn Glu
Glu Val Glu Glu Asn Valを示すペプチドを合成
した。すべて３つのアミノ酸は疎水性であり、ペプチド
の構造はα−ヘリツクスである。
このペプチド1gを等モルのリピド（コレステロール／ホ
スフアチジルコリン1:1、例１参照）、２％濃度のＮ−
デカノイル−Ｎ−メチル−グルカミンおよび最終濃度0.
1％のキルＡと混合した。混合物を室温で30〜60分温置
し、リン酸緩衝液pH7.2で透析した。透析膜の分画分子
量は1000であつた。電子顕微鏡は典型的なイスコムの構
造を示した。
例14 組換えDNA技術により酵母に導入しかつその酵母粒子に
生成したHepatitis B（HBs）の表面タン白2mgを２％濃
度のＮ−デカノイル−Ｎ−メチル−グルカミンで可溶化
させた。等モル量のリピド（コレステロール／ホスフア
チジルコリン1:1、例１参照）およびキルＡを0.1％濃度
に添加した。混合物を室温で２時間温置した。その後混
合物をリン酸緩衝液pH7.2で、最初は室温で４〜６時間
ついで４℃で十分透析した。電気顕微鏡により典型的な
イスコムの生成をみた。
例15 TNに溶解したウシウイルス下痢ウイルス（BVDV）3mgに
１％濃度でトリトンＸ−100を添加して溶解した。この
可溶化ウイルスはセフアロース4B（フアルマシア、アプ
サラ）に固定化したレクチンレンズレンテイルから成る
レクチンカラムに適用した。カラムをTN（0.05Mトリ
ス、0.1M NaCl、pH7.2）で平衡化し、ウイルス物質を
カラムに導入した後、0.1容量％トリトンＸ−100含有５
カラム容量TNついで10カラム容量TNで洗つた。ウイルス
をエンベロープしたタン白は、0.2Mメチル−α−Ｄ−マ
ンノシド、TNに溶解した0.5重量％のオクチル−β−Ｄ
−グルコシドから成る緩衝液をカラムに添加して溶出
し、脱着した。ウイルスをエンベロープしたタン白を含
むフラクシヨンを集取し、キルＡを0.1重量％、120μｇ
のリピド（コレステロール／ホスフアチジルコリン1:
1、例１参照）に加えた。混合物を室温で30〜60分温置
し、リン酸緩衝液pH7.2で透析した。
この例は上記のように繰り返えしたが、イントラリピド
（Vitrum、ストツクホルム）を上記のリピド混合物と代
替した。イスコムの生成は電気顕微鏡により確認した。
例16 Brucella abortus株2308由来のポリンタン白の平滑およ
び粗バリアント3mgをコンタミン白からしかしLPSによる
混合物で十分精製した。ポリンタン白はA.J.Winter博
士、コーネル大学獣医微生物学部より供与された。この
ポリンタン白をリン酸緩衝液1ml、蔗糖20％、リピド
（コレステロール／ホスフアチジルコリン1:1、例１参
照）に４℃で一晩溶解した。
Zvittergentを0.05％濃度で添加し、Ｎ−デカノイル−
Ｎ−メチル−グルカミンを0.5％濃度およびキルＡを0.1
％濃度で加えた。混合物をリン酸緩衝液pH7.2で２日
間、最初は室温で４時間十分に透析した。電顕で同定し
たイスコムを例１に記述した遠心分離によりイスコム未
結合物質から精製した。
例17 B.Warren博士、ストツクホルムの国立衛生研究所より粗
抽出物として供与された巨大細胞ウイルス、ヘルペスウ
イルスのヌクレオタン白を例１に記載のように低pHで変
性させた。イスコムは例１のプロトコールにより調製し
た。電顕はイスコムの生成をした。
例13（Ａ）に記載のマラリアペプチドおよび例12と13
（AB）に記載のペプチド混合物から作つたイスコムでBa
lb/cマウスを２度（25μｇ、10μｇ）免疫化させた。
例18 グリコタン白と巨大細胞ウイルスのヌクレオタン白の混
合物を粗抽出物としてB.Wahren博士、国立衛生研究所、
ストツクホルムより受けた。このグリコタン白−ヌクレ
オタン白標品を低pHで処理し、イスコムを例１に記載の
ように調製した。電顕はイスコムの生成を示した。表１
には巨大細胞ウイルスイスコムで免疫させたサルは高い
細胞媒介性免疫を誘導したことを示す。巨大細胞ウイル
スに対する将来のワクチンについては、細胞媒介性免疫
を誘導することが肝要である。
２免疫前、すべての動物は白血球とCMV抗原（546±58cp
m/CMV、正味cpm100）を有する正味cpm1000;単核細胞とC
MV（322±208cpm、正味cpm100）又はCMVをもつ白血球と
単核細胞（709±425cpm/CMV、正味cpm211±300）を有し
た。ｂ 免疫前、すべての動物は、CMVナブレオカプシド抗原
で予め免疫したサルNo.8を除いて、CMV IgG力価100を
有した。
例19 300μｇのgp340、200μPBS中エプスタインバーウイル
ス（ヘルペスウイルス）由来のエンベロープタン白を、
70μｇのコレステロールを壁面に乾燥させた管に加え
た。トリトンＸ−100を加え、混合物を室温で２時間保
持する。300μ容量の混合物は濃度勾配の上部で層を
成し、上部〜下部まで200μ15％蔗糖/1％TX−100およ
び0.1％キルＡを含有する12ml20％蔗糖/PBSから成る。
遠心分離はベツクマンSWローターにて20℃、16時間40,0
00rpmで行なつた。グラジエントを500μ部で下部から
集取した。界面活性剤とコレステロールと混合したgp34
0は透析法によりイスコムに再構成することができる。
その場合、キルＡは透析前、0.1％の最終濃度で添加し
た。例えばこの場合に使つたオクチルグリコシドを容易
に透析しうる界面活性剤を有することが望ましい。
混合物はついでPBS（TN緩衝液を使つた）に対し４〜６
℃で48時間透析した。イスコムの生成は電顕で確認し
た。例えば各種方法（即ち、選択方法）で精製した各種
ウイルスのエンベロープタン白を使う利点は自明であ
る。
例20 FeLV gp70からの３種の配列のハイブリドDNA生成物
を、グルタールアルデヒド２段階法でリポソーム中に組
みこんだステアリルアミンに結合させた。PBS、pH7中の
10mg（10mg/ml）のリポソームを、最終濃度1.25％グル
タールアルデヒドで室温で一晩活性化した。過剰のグル
タールアルデヒドは透析又はゲル濾過により除去した。
3mgの活性化したリポソームを1mgの核FeLV gp70ポリペ
プチドと混合し、溶液の量は1mlに調製し、100μの1M
NaCO3、pH9.6を加えてpHを上げた。この混合液を一晩
インキユベートし、ゲル濾過（例えばＳ−300）により
精製したポリペプチドを非結合のものから分離した。
このポリペチド−脂肪酸を２％のＮ−デカノイル−Ｎ−
メチルグルカミン（MEGA−10）で抽出し、蔗糖濃度勾配
（５−30％の蔗糖）（0.3％MEGA−10を含有）で遠心分
離により過剰のリピドから分離した。
このポリペチドを採取し、キルＡを最終濃度0.1％にな
るように加え、混合液をPBSに対して最初の４−６時間
は室温で、以後は４℃で透析した。
例21 30％エタノールを含有する0.5M炭酸緩衝液pH0.6中ウシI
gG3mgを６時間温置した。Ｎ−デカニル−Ｎ−メチル−
グルカミンを等モル量のリピド（コレステロール／ホス
フアチジルコリン1:1、例１参照）と共に２％濃度で加
えた。キルＡを0.1％濃度で加えた。混合物を30〜60分
温置しついで室温それから４℃で一晩リン酸緩衝液pH7.
2で十分透析した。イスコムは例１に記載のように、遠
心分離によりイスコム未結合物質から精製した。電顕に
よりイスコムの存在を確認した。更にこれらのイスコム
はIgMと同じ割合で（即ち、19S）10〜50％蔗糖濃度勾配
で沈降した。
例22 Plasmodium falciparum抵原Pf155（マラリア）（例12と
13に記述した）のアミノ酸配列を示す２つのペプチドを
合成した。各ペプチドはペプチド／タン白イスコムを得
るのに使つた。等モル量のペプチド、膜タン白およびリ
ピド（コレステロール／ホスフアチジルコリン1:1、例
１参照）を夫々最終濃度２％と0.1％でＮ−デカニル−
Ｎ−メチル−グルカミンとキルＡと混合した。混合物を
室温で30−60分温置し、リン酸緩衝液pH7.2で透析し
た。透析膜の分画分子量は1000kdであつた。電顕は典型
的なイスコムの構造を示した。

Claims (6)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】ウイルス、マイコプラズマ、細菌、寄生
    虫、動物細胞疎水領域をもつ抗原又は抗原決定基を１つ
    以上の可溶化剤と混合して、抗原又は抗原決定基と可溶
    化剤間に複合体を生成し、その後抗原又は抗原決定基を
    少なくとも臨界ミセル濃度で疎水領域と親水領域をもつ
    １つ以上のグリコシドの存在下可溶化剤から分離する
    か、あるいは可溶化剤と分離して、ついで少なくとも臨
    界ミセル濃度で疎水領域と親水領域をもつ１つ以上のグ
    リコシドを含有するグリコシド溶液に直接移し、タン白
    複合体を生成し、それを単離精製する、疎水領域をもつ
    抗原又は抗原決定基含有免疫原性複合体の製造法におい
    て、この複合体を単離精製する前にリピドを添加するこ
    とを特徴とする、上記複合体の製造法。
  2. 【請求項２】リピドを可溶化剤に混和する、請求の範囲
    第１項記載の方法。
  3. 【請求項３】リピドを動物又は植物細胞中の膜リピド、
    例えば脂肪、グリセロールエーテル、ワツクス、ホスホ
    リピド、スルホリピド、グリコリピド、イソプレノイド
    から選択され、およびリピドはリピド／抗原又は抗原決
    定基モル比が少なくとも0.1で添加する、請求の範囲第
    １項記載の方法。
  4. 【請求項４】リピド／抗原又は抗原決定基モル比を少な
    くとも１でリピドを添加する、請求の範囲第１項記載の
    方法。
  5. 【請求項５】ウイルス、マイコプラズマ、細菌、寄生
    虫、動物細胞、抗原又は抗原決定基をイオン性、ノニオ
    ン性、双性イオン又は没食子酸界面活性剤、アルコール
    類、両親媒性小分子、水溶性ペプチド又はタン白あるい
    はその混合物と混合し、グリコシド含有濃度勾配に対し
    順次存する可溶化剤含有溶液の上面に層状化したこの混
    合物を遠心分離し、抗原又は抗原決定基を含むフラクシ
    ヨンを単離し、緩衝溶液で透析するか、又は微生物、動
    物細胞、抗原又は抗原決定基を可溶化剤と混合した後グ
    リコシドと反応させついで緩衝液で透析し又は濃度勾配
    で直接層状化して遠心分離した後、抗原又は抗原決定基
    を含有するフラクシヨンを集取し、グリコシドと反応さ
    せそして緩衝液で透析するか、あるいは微生物、動物細
    胞、抗原又は抗原決定基と可溶化剤の緩衝混合液又は微
    生物、動物細胞、抗原又は抗原決定基および可溶化剤の
    緩衝液塩水混合液を濃度勾配遠心分離して得られる抗原
    又は抗原決定基含有フラクシヨンを電気泳動又はクロマ
    トグラフイで可溶化剤から分別しそしてグリコシド含有
    溶液を集取し、その後、生成複合体を凍結乾燥、真空透
    析又は超遠心分離等により濃縮してもよく、あるいはさ
    らに濃度勾配遠心分離により精製する、請求の範囲第１
    項記載の免疫原性複合体の製造法において、複合体を濃
    縮又は精製した後、リピドを添加することを特徴とす
    る、上記複合体の製造法。
  6. 【請求項６】抗原又は抗原決定基はタン白、ポリペプチ
    ド、グリコタン白およびリポタン白のうち、特に −エンベロープしたウイルス、細菌、マイコプラズマ、
    寄生虫又は動物細胞由来の膜タン白又は膜ペプチド、あ
    るいはハイブリドDNA技術により生成したそのようなタ
    ン白又はペプチドあるいは合成分子から誘導した、ある
    いはそのままの親水基と疎水基をもつ両親媒性タン白又
    はペプチド、 −結合する疎水基により両親媒性になつた親水性タン白
    又はペプチド、このタン白又はペプチドはウイルス、細
    菌、マイコプラズマ、寄生虫、全細胞から誘導されるあ
    るいは合成やハイブリドDNA技術により得ることができ
    る。 −化学的手段により利用できる親水性タン白の利用しが
    たい疎水性部分により得られる両親媒性タン白又はペプ
    チド、このタン白は上記の微生物又は細胞から誘導又は
    ハイブリドDNA技術により得られ、又は合成することが
    できる −およびポリサツカライドのうち、オリゴサツカライ
    ド、オリゴ−やポリヌクレオチドおよびハプテンから選
    択される、請求の範囲第１項から第５項のいずれか１項
    記載の方法。
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