FI86597C - Foerfarande foer framstaellning av immunkomplex. - Google Patents

Description

86597

Menetelmä immuunikompleksin valmistamiseksi Tämä keksintö koskee uutta menetelmää immuunikompleksin, nk. iskomin, valmistamiseksi.

5 On tunnettua, että tapetuilla viruksilla, esimerkik si influenssaviruksella, on hyvä antigeeninen vaikutus. Ne ovat kuitenkin pyrogeenisiä laajamittaisenkin puhdistuksen jälkeen. Eristämällä komponentteja, jotka ovat tärkeitä suojaavan immuniteetin induktiolle, on pyrogeenisyys väl-10 tetty, mutta immunogeenisyys ei useinkaan ole riittävän voimakas. Siksi tällaisiin eristettyjä antigeenejä (alayksiköitä) sisältäviin rokotteisiin täytyy lisätä soveltuvia apuaineita immuunivasteen lisäämiseksi. Toisaalta tehokkaat apuaineet, käytettäessä niitä tähänastisella ta-15 valla, aiheuttavat negatiivisia sivuvaikutuksia. Apuaineita sisältävät rokotteet eivät siten ole parempia kuin kokonaisiin viruksiin perustuvat rokotteet pyrogeenisen vaikutuksen suhteen.

Immunogeenisyyden lisäämiseksi on tuotettu deter-20 genttikalvoproteiineja, jotka on kiinnitetty tai sidottu 1 i (K)som i en pinnalle (KP-hukemus 7940083.0). US-patentti-julkaisussa 4 148 876 kuvataan detergenteistä vapaita li-posomeissa olevia kalvoproteiineja. US-patenttijulkaisussa 4 196 191 mainitaan apuaineiden sisällyttäminen täl-25 laisiin detergentittömiin unilamellaarisiin liposomituotteisiin (kuvaamatta sen vaikutusta). US-patenttijulkaisussa 4 117 113 kuvataan negatiivisesti varattuja liposo-meja, jotka sisältävät virusantigeeniä. Tällaisissa inf-luenssahemagglutiniidia ja neuraminidaasia sisältävissä 30 liposomeissa saa apuaineen, mykobakteerien soluseinämien, sisällyttäminen aikaan paremman immuunivasteen. Parempia immuunivasteita on myös saatu aikaan, kun apuaineita, kuten tapettua Mycobacterium tuberculosisia, Bordetella pertussisia ja saponiinoja, on tuotu tällaisiin negatii-35 visesti varautuneisiin 1iposomeihin, jotka sisältävät difteriatoksoidia (US-patenttijulkaisu 4 053 585). Kaikki 2 86597 edellä mainitut lipidipitoiset kalvoproteiinituotteet ovat kuitenkin epästabiileja pitkän säilytyksen, kylmäkuivauk-sen tai huolimattoman käsittelyn, esimerkiksi korkean lämpötilan, jälkeen.

5 Myös detergentittömiä ja lipidittömiä proteiinimi- sellejä on tuotettu rokotteiksi. On osoitettu, että Sem-liki Forest -viruksen (SMF) kalvoproteiinien misellit stimuloivat verenkierrossa olevien SFC:n vastaisten vasta-aineiden muodostumista ja antavat hiirissä suojan tappa-10 vaa SFV-infektiota vastaan. Tällaiset parainfluenssa-3-viruksen kalvoproteiinimisellit eivät toisaalta saaneet lampaissa aikaan vasta-ainetuotantoa eivätkä suojanneet niitä keuhkokuumetta aiheuttavalta PI-3-virusannokselta, ellei miselleihin sekoitettu öljyapuainetta. öljyapuai-10 noet Stiii Vei I yleensä ai k.uin sivuvaikutuksin in l oki oi nti -kohdassa esiintyvien paikallisreaktioiden muodossa (EP-hakemusjulkaisu 37 931.

EP-hakemusjulkaisussa 0 109 942 kuvataan immuno-geenistä proteiini- tai peptidikompleksia, joka sisältää 20 glykosideja, ja menetelmää sen valmistamiseksi. Mainitun menetelmän mukaisesti voidaan lähtöaineena käyttää kokonaisia viruksia, mykoplasmoja, bakteereita, loisia tai eläinsoluja, mutta myös puhdistettuja peptidejä tai proteiineja tai yhdistelmä-DNA-menetelmin syntetisoituja tai 25 tuotettuja proteiineja tai peptidejä.

Nämä kompleksit ovat morfologiselta rakenteeltaan erilaisia elektronimikroskoopilla tarkasteltuina kuin vastaavat proteiinimisellit, jotka on tuotettu lisäämättä glykosideja. Miselleissä on tiivis keskusydin, jossa on 30 säteittäisiä piikkejä, kun taas EP-hakemusjulkaisun 0 109 942 mukaisella kompleksilla on avoin pallomainen rakenne, joka koostuu pyöreistä alayksiköistä tai pallo-rakenteen osista. Muoto eroaa myös liposomien muodosta. Komplekseilla ja niiden osilla on yleensä pienempi sedi-35 meni anti ov.ik i o kuin vast aav i I I ,i m i :n < 1 11 > i 1 I ä j.i :;uu π >nip i sodimentaatiovakio kuin vastaavalla proteiinin tai 3 86597 peptidin monomeerisellä muodolla sekä suurempi sedimen-taatiovakio kuin liposomeilla.

EP-hakemusjulkaisun 0 109 942 mukaisilla komplekseilla, jotka on tuotettu lisäten glykosideja, on parem-5 pi immunogeeninen aktiivisuus kuin vastaavilla proteiini-miselleillä, jotka on tuotettu lisäämättä glykosidia tai proteiinimolekyylin ja liukenemisen aikaansaavan aineen välisillä komplekseilla (monomeerisiä muotoja) tai lipi-dirakkuloihin, ts. virosomeihin, sidotuilla proteiinimo-10 lekyyleillä ja ne tuottavat vähemmän sivuvaikutuksia kuin mitä syntyy sekoitettaessa proteiinimisellejä glykosidei-hin tai muihin apuaineisiin. Siten kalvoproteiiniannos voidaan pienentää kymmenesosaksi tai pienemmäksi.

Nyt on käynyt ilmi, että käytettäessä lähtöaineena 15 pelkkiä proteiineja tai peptidejä pyrkivät nämä muodostamaan aggregaatteja, ts. misellejä. Tämä voidaan välttää lisäämällä lipidejä valmistettaessa kompleksia.

Myös käytettäessä lähtöaineena bakteereita tai puhdistettaessa kokosoluja, saattaisi läsnä olla liian 20 vähän lipidejä, niin että muodostuu misellejä. Tämä voidaan välttää lisäämällä lipidejä.

On myös käynyt ilmi, että tätä uutta menetelmää voidaan käyttää muita antigeenejä kuin peptidejä tai proteiineja sisältävien ja antigeenideterminantteja sisältä-25 vien kompleksien valmistukseen.

Siten tämä keksintö koskee menetelmää immuunikompleksin valmistamiseksi, joka sisältää antigeenejä tai antigeenideterminantte ja , joissa on hydrofobisia alueita, jossa menetelmässä viruksia, mykoplasmoja, loisia, eläin-30 soluja, antigeenejä tai antigeenideterminantteja, joissa on hydrofobisia alueita, sekoitetaan yhteen tai useampaan liukenemisen aikaansaavaan aineeseen, jolloin muodostuu antigeenien tai antigeenideterminanttien ja liukenemisen aikaansaavan aineen välisiä komplekseja, minkä jälkeen 35 antigeenit tai antigeenideterminantit erotetaan liukenemisen aikaansaavasta aineesta glykosidiliuoksen läsnä 4 86597 ollessa tai erotetaan liukenemisen aikaansaavasta aineesta ja siirretään suoraan glykosidiliuokseen, joka sisältää yhtä tai useampaa glykosidia, jossa on hydrofobisia ja hydrofiilisiä alueita, pitoisuutena, joka on vähintään 5 kriittinen misellulaarinen pitoisuus, jolloin muodostuu proteiinikompleksi, joka eristetään ja puhdistetaan ja jolle menetelmälle on tunnusmerkillistä se, että lipidit lisätään ennen kompleksin eristämistä ja puhdistamista.

Jotta edistettäisiin liukenemista ja pidettäisiin 10 amfifaattiset proteiinit tai luonnostaan vapaita tai kemiallisella käsittelyllä tai lämmöllä (esimerkiksi 70°C) vapaina pidettyjä hydrofobisia alueita sisältävät proteiinit tai muut hydrofobisia alueita sisältävät molekyylit dispergoituneina monomeereinä vesiliuoksessa, saattaisi 15 lipidien ja/tai polaaristen, veteen sekoittuvien orgaanisten liuottimien läsnäolo olla välttämätöntä. Luonnossa käytetään itse asiassa lipidejä tähän tarkoitukseen sekä eläin- että kasvisoluissa. Siksi mikä tahansa eläin- tai kasvisolujen kalvoissa esiintyvä lipidi-lipidiseos on so-20 veltuva. Jotkut lipidit tekevät lipidikalvot jäykemmiksi, esimerkiksi kolesteroli, jotkut juoksevammiksi, esimerkiksi fosfatidyylikoliini. Voidaan myös tuottaa synteettisiä lipidejä, joilla on nämä vaaditut ominaisuudet eikä ole olemassa juuri mitään rajoituksia, jotka koskisivat 25 uusien lipidien, joita voidaan käyttää näihin tarkoituksiin, formulointia.

Mitä tulee lipidin kokoon ja ominaisuuksiin, rajoitukset määrää liukoisuus käytettävään järjestelmään. Esimerkiksi jäykkien lipidien (kolesterolin) vesiliuokset 30 stabiloidaan lisäämällä vähemmän jäykkiä lipidejä (fosfa-tidyylikoliinia). Polaariset orgaaniset liuottimet osallistuvat liuoksessa proteiinimonomeerinä esiintyvän proteiinin, jolla on hydrofobisia ominaisuuksia, stabilointiin. Johtopäätöksenä on se, ettei ole mahdollista ra-35 joittaa lipidin kokoa, kun kyseessä on sen toiminta, koska esimerkiksi alifaattisen ketjun pituuden, joka määrää 5 86597 hydrofobiset ominaisuudet, vastapainona voidaan käyttää sopivaa polaarista ryhmää.

Myös sokereilla on stabiloiva vaikutus, joka auttaa pitämään vapaita hydrofobisia alueita sisältävät pro-5 teiinit tai muut molekyylit, joilla on saman kaltaisia ominaisuuksia, dispergoituneina liuokseen monomeereinä. Sokereina voidaan käyttää monosakkarideja, kuten trioo-seja, tetrooseja, pentooseja, heksooseja, heptooseja ja vastaavia ketooseja, pelkistämättömiä oligosakkarideja, 10 kuten sakkaroosia, trehaloosia ja raffinoosia, pelkistäviä oligosakkarideja, kuten maltoosia, sellobioosia, iso-maltoosia, panoosia, gentiobioosia ja laktoosia sekä polysakkarideja. Niitä voidaan lisätä 5 - 50 % vesiliuoksen määrästä.

15 Veteen sekoittuvina polaarisina orgaanisina liuot timina voidaan käyttää alkoholeja, kuten mono- ja poly-hydrisiä alkoholeja, joissa on korkeintaan 10 hiiliatomia, kuten etanolia, glykoleja, kuten ctyleeniglykolia, eettereitä, dietyylieetteriä ja ketoneja, kuten asetonia. 20 Lipidit voivat olla rasvoja tai rasvoja muistutta via aineita, kuten triglyseridejä tai triglyseridiseok-sia, jotka sisältävät rasvahappoja, joissa on korkeintaan 50 hiiliatomia, kuten tyydyttyneitä rasvahappoja, joissa on 4 - 30 hiiliatomia, esimerkiksi voihappoa, kaproiini-25 happoa, kapryylihappoa, kapriinihappoa, lauriinihappoa, myristiinihappoa, palmitiinihappoa, steariinihappoa, ara-kidiinihappoa, beheenihappoa tai lignoseriinihappoa tai tyydyttymättömiä rasvahappoja, joissa on korkeintaan 30 hiiliatomia, kuten heksadekeenihappoa, oleiinihappoa, 30 linoleiinihappoa, linoleenihappoa tai arakidonihappoa; hydroksirasvahappoja, kuten 9,10-dihydroksisteariinihap-poa, tyydyttymättömiä hydroksirasvahappoja, kuten risiiniöljyä, haaroittuneita rasvahappoja; glyserolieetterei-tä, vahoja, ts. korkeampien rasvahappojen ja monohydris-35 ten alkoholien estereitä; fosfolipidejä, kuten glyseroli-fosfaattien johdannaisia, kuten fosfatidiinihappojen 86597 johdannaisia, ts. lesitiiniä, kefaliiniä, inositolifos-fatidejä, sfingosiinijohdannaisia, joissa on 14 - 20 hiiliatomia; glykolipidejä, isprenoideja, sulfolipidejä, karotenoideja, steroideja, kuten kolesterolia, kolesta-5 nolia kaprostanolia, fytosteroleja, esimerkiksi stig-mastorolia, sitosterolia, mykosteroleja, esimerkiksi ergosterolia, sappihappoja, esimerkiksi sappihappoa, deoksisappihappoa, kenodeoksisappihappoa, litosappi-happoa, steroidiglykosideja, vitamiini A:n estereitä 10 tai niiden seoksia.

Näitä ja muita käyttökelpoisia lipidejä kuvataan teoksessa Lipid biochemistry an introduction, toim. M.I. Gurr ja A.I. James, Chapman and Hall, London, New York, University Press Cambridge 1980, joka täten mainitaan 15 viitteenä.

Edullisesti käytetään kolesterolia, fosfatidyyli-

R

koliinia, liposomeja tai intralipidiä (Oleum soya fractionate 200 g, Lechitinum fractionate vitello ovi 12 g, glyseroli 22,5 g, täytetään vedellä 1 litraksi).

20 Lipidit voidaan lisätä missä tahansa prosessin vaiheessa, edullisesti ennen glykosidin lisäämistä, mutta lipidit voitaisiin lisätä myös glykosidin jälkeen. Ellei lipidejä ole läsnä, on antigeeneillä tai antigeeni-determinanteilla taipumus muodostaa misellejä. Lipidien 25 lisääminen rikkoo misellit, niin että kompleksi voi muodostua .

Lipidejä lisätään siten, että lipidien ja antigeenien tai antigeenideterminanttien välinen moolisuhde on vähintään 0,1/1, edullisesti vähintään 1/1.

30 Jos käytetään suurempaa moolisuhdetta kuin 100/1, kompleksi tulee tahmeaksi ja vaikeaksi käsitellä. Jos käytetään pienempää moolisuhdetta, saattaisi esiintyä mi-seilejä ja muodostuu vähemmän kompleksia. Suhteen ollessa 0,1/1 muodostuu kuitenkin vielä jonkin verran kompleksia. 35 Lipidien moolisuhde antigeeneihin tai antigeenidetermi-nantteihm on siten 0,1/1 - 100/1.

7 86597 Tällä hetkellä käytettävissä olevilla analyysimenetelmillä ei pystytä osoittamaan, tulevatko lipidit sisällytetyiksi vai eivät. Kompleksit, jotka valmistetaan lisäämällä lipidiä uuden menetelmän mukaisesti, ovat morfo-5 logiselta rakenteeltaan samanlaisia elektronimikroskoopilla tarkasteltuina (EM, ks. kuvio) ja niillä on sama sedimentaatiovakio kuin komplekseilla, jotka on valmistettu lisäämättä lipidejä (ks. edellä).

Ellei komplekseja, jotka on valmistettu lisäämällä 10 lipidejä, kuitenkaan puhdisteta jälkeenpäin, on niiden ääriviivat sameita EM:ssa ja otaksutaan, että lipidit aggregoituvat niiden pinnoille. Kun kompleksit puhdistetaan, ovat niiden ääriviivat EM:ssa aivan selkeitä, eikä voida tällä hetkellä osoittaa, että ne sisältävät lipi-15 dejä.

Antigeeneinä voidaan käyttää makromolekulaarisia yhdisteitä. Proteiinien, polypeptidien, glykoproteiinien ja lipoproteiinien lisäksi voidaan käyttää myös polysakkarideja, oligosakkarideja, polynukleotidejä tai niiden 20 seoksia.

Antigeenideterminantteja, jotka soveltuvat kompleksien valmistamiseen keksinnön mukaisella menetelmällä, ovat esimerkiksi pienet polypeptidit, pienet oligosakkaridit, oligonukleotidit, glykoproteiinifragmentit ja hap-25 teenit tai niiden seokset.

Pienillä polypeptideillä tarkoitetaan tässä poly-peptidejä, jotka sisältävät vähintään kolme ja korkeintaan noin 40 aminohappoa. Yleensä antigeenideterminantti ei sisällä enempää kuin 4-10 aminohappoa. Joskus tarvi-30 taan kuitenkin jonkin verran suurempaa aminohappolukumää-rää antigeenideterminantin spesifisen rakenteen ja/tai immunisoinnin jälkeen syntyvän immuunivasteen takaamiseksi.

Pienillä oligosakkarideilla tarkoitetaan lineaarisia tai haaroittuneita sokeri yksi kkÖkel juju, joiku si-35 sältävät vähintään neljä ja korkeintaan noin 20 sokeri-yksikköä, edullisesti 6-10 sokeriyksikköä. Näitä 86597 oligosakkarideja voidaan valmistaa synteettisesti tai pilkkomalla kemiallisesti tai entsymaattisesti luonnossa esiintyviä polysakkarideja tai glykoproteiineja.

Oligonukleotideilla tarkoitetaan yhdisteitä, jotka 5 koostuvat vähintään yhdestä ja korkeintaan noin 18 deoksi-ribonukleotidista tai ribonukleotidista ja joita saadaan synteettisesti tai pilkkomalla entsymaattisesti tai kemiallisesti polynukleotideja, kuten RNA:ta ja DNA:ta. Nämä oligonukleotidit voivat mahdollisesti olla kaksisäi-10 keisiä.

Hapteeneilla tarkoitetaan pieniä molekyylejä, jotka eivät sinänsä ole immunogeenisiä, mutta tulevat immu-nogeenisiksi kantajamolekyyliin sidottuina. Esimerkkejä ovat steroidit ja prostaglandiinit.

15 Antigeeneissä tai antigeenideterminanteissa tulee olla hydrofobisia ryhmiä tai ainakin yksi reaktiivinen ryhmä, joka voi muodostaa sidoksen antigeenin tai anti-geenideterminantin ja hydrofobisten yhdisteiden, esimerkiksi yhdisteiden, jotka mainitaan sivulla 23 kolmannes-20 sa luvussa - sivulla 25 ensimmäisessä luvussa, välille.

Molekyylit, jotka eivät sinänsä ole immunogeenisiä, voidaan, jos ne sisältävät hydrofobisia ryhmiä, kompleksoida iskomeiksi isompien ryhmien kanssa, jotka ovat immunogeenisiä ja toimivat kantajina iskomikomplek-25 sissa. Kompleksi voi siten sisältää hapteenien ja antigeenien seoksia.

Proteiineja tai peptidejä, jossa on hydrofobisia alueita, jotka sitoutuvat glykosidien hydrofobisiin alu-(' isiin, voi vai o 1 I <i 30 A) amfifaattisia proteiineja tai peptidejä, joilla on hydrofiilisiä ja hydrofobisia ryhmiä, jotka ovat peräisin seuraavista lähteistä tai ovat kapselin käsittävien virusten, bakteerien, mykoplasmain, parasiittien tai eläin-solujen membraaniproteiineja tai membraanipeptidejä tai 35 ovat sellaisia proteiineja tai peptidejä, hybridi-DNA- 9 86597 tekniikalla valmistettuina tai synteettisesti valmistettuja molekyylejä, B) hydrofiilisiä proteiineja tai peptidejä, jotka on tehty amfifaattisiksi kytkemällä niihin hydrofobisia 5 ryhmiä. Nämä proteiinit tai peptidit saattavat olla peräisin viruksista, bakteereista, mykoplasmoista, parasiiteistä, eläinsoluista tai ne saattavat olla syntetisoituja tai saatu hybridi-DNA-tekniikalla, C) amfifaattisia proteiineja tai peptidejä, jotka 10 on saatu hydrofiilisten proteiinien luoksepääsemättömillä hydrofobisilla osilla tekemällä ne luoksepäästäviksi kemiallisin keinoin. Nämä proteiinit saattavat olla peräisin yllä mainituista mikro-organismeista tai soluista tai ne on saatu hybridi-DNA-tekniikalla tai ne on syntetisoitu. 15 Kompleksin valmistus a) Kokonaisista soluista tai viruksista peräisin olevien membraanipeptidien tai membraaniproteiinien valmistus periaatteessa käsittää kolme vaihetta: eläinsolu-jen tai mikro-organismien tai niiden fragmenttien puhdis-20 tamisen ja eristämisen; hydrofobisten proteiinien liuottamisen ja liuottavan aineen poistamisen, samalla kun haluttu antigeeni siirretään kompleksiin immunogeenisessä muodossa olevan glykosidin avulla (immuunikompleksi).

Puhdistus ja eristys 25 Virukset, mykoplasmat, bakteerit, parasiitit ja eläinsolut konsentroidaan ja puhdistetaan tunnetulla tavalla /viitteitä ks. "The Tools of Biochemistry", T.G. Cooper, John Wiley & Sons (1977) New York, joka on tässä yhteydessä liitetty viitteenäj, esimerkiksi geelisuodatuk-30 sella tai sokerigradientin läpi suoritetun sentrifugoin-nin tai perkollin läpi suoritetun gradienttisentrifugoin-nin avulla tai ontelokuidun avulla suoritetulla dialyysillä. Bakteereiden suhteen voi olla tarpeellista tai edullisempaa ensin liuottaa ja pilkkoa solunseinämät /viit-35 teitä, ks. Cota-Robles ja Stein, CRC Handbook of Microbiology osa II (1973) s. 833 - 844, joka on tähän yhtoy- 10 86597 teen liitetty viitteenä7 esim. ultraäänellä tai ranskalaisella puristimella (French press) suoritetun käsittelyn avulla.

Liuottaminen 5 Puhdistetut eläinsolut tai mikro-organismit tai niiden osat sekoitetaan sitten ionittoman, ionisen tai amfoteerisiä ioneja sisältävän detergentin kanssa, jota käytetään ylimääriä. Sopivien, ionittomien detergenttien tyypillisiä esimerkkejä ovat polyglykoliesterit ja poly-10 glykolieetlorit a l.ifaattisten tai aralyylifaattisten happojen ja alkoholein kanssa. Esimerkkejä näistä ovat alkyylipolyoksietyleenieetterit, joiden yleinen kaava on ^n^2n+l (OCI^Ci^) χΟΗ, lyhennettynä <2ηΕχ; alkyylifenyyli-polyoksietyleenieetterit, jotka sisältävät fenyylirenkaan 15 alkyyliryhmän ja polyoksietyleeniketjun, lyhennettyinä C «SE , välissä esim. Triton X-100 = tert-CQ^EQ , (poly- Π X o 7,0 etyleenioksidin oktyylifenolieetteri), asyylipolyoksi-etyleeniesterit; asyylipolyoksietyleenisorbitaaniesterit, lyhennettyinä C -sorbitaani-E , esim. Tween 20, Tween 80,

Π X

20 /V-D-alkyy liglukosidit, esim. /3-D-oktyyliglukosidi. Voidaan käyttää myös alla mainittuja glykosideja, erityisesti saponiinia. Nämä ovat kuitenkin heikkoja doterqenttc-jä ja niitä tulisi käyttää yhdessä muiden detergenttien kanssa. Tyypillisiä esimerkkejä sopivista gallushappode-25 tergenteistä ovat esimerkiksi desoksikolaatti ja kolaat-ti. Voidaan käyttää vieläpä konjugoituja detergenttejä, kuten esimerkiksi taurodeoksikolaattia, glykodeoksiko-laattia ja glykokolaattia. Mahdollisia amfoteerisiä de-tergenttejä ovat lysolesitiini sekä synteettiset lysofos-30 folipidit. Voidaan käyttää vieläpä yllä mainittujen detergenttien seoksia.

Liukeneminen voidaan saada aikaan alkoholien, orgaanisten liuottimien tai pienten amfifaattisten molekyylien, kuten esimerkiksi heptaani-1,2,3-trioi in, hok-35 sunni-l,2,3-triolin, etikkahapon, vesiliukoisien pepti- 86597 dien ja proteiinien tai niiden seosten tai detergenttien avulla.

Liuottavaa ainetta käytetään ylimäärin lipidin ja hydrofobisten proteiinien määrään verrattuna. Sopivat so-5 lut ja mikro-organismit sekä detergentti sekoitetaan painosuhteessa 1:3 - 1:10.

Solut tai mikro-organismit sekä liuottava aine sekoitetaan puskuroidussa, mahdollisesti keittosuolaliuoksessa. Keittosuolaliuoksen molaarisuus on 0,02 - 0,5 M, 10 mieluummin 0,05 - 0,25 M. 0,1 - 0,2 M on edullinen. De-tergentin pitäisi vaikuttaa noin tunnin ajan huoneen lämpötilassa .

Natriumkloridi on edullinen suolana, mutta muutkin suolat voidaan ottaa huomioon, erityisesti suolat alkali-15 ionien, maa-alkali-ionien ja ammoniumionien sekä voimakkaiden happojen ja orgaanisten happojen, kuten esimerkiksi etikkahapon, trikloorietikkahapon, muurahaishapon ja oksaalihapon kanssa. Puskureiksi soveltuvat kaikki aineet, jotka puskuroivat pH:n välille 6,5 - 9. Kolaatteja ja 20 desoksikolaatteja käytettäessä pH 8 - 9 on edullinen ja kun käytetään ionittomia detergenttejä, on pH 7,4 edullinen. Orgaanisia happoja käytettäessä proteiinien liuottamiseen, puskuri voidaan jättää pois.

Tmmunogoon ikomplcks ien vaImi s tus 25 Kun solut ja mikro-organismit on liuotettu, muo dostuu liuottavan aineen ja solu- tai mikro-organismi-fragmenttien seos (tässä yhteydessä myöhemmin nimitetty fragmenteiksi). Fragmenttien joukossa on varattuja, mono-meerisiä antigeeniproteiineja, hydrofobisin aluein, komp-30 leksina liuottavan aineen kanssa. Immunogeenikompleksi (primaarinen iskom) valmistetaan erottamalla varatut mo-nomeeriset antigeeniproteiinit liuottavasta aineesta yhden tai useamman glykosidin läsnä ollessa tai suoraan niille siirrettyinä, jolloin glykosideilla täytyy olla 35 hydrofobisia tai hydrofiilisiä alueita ja niitä täytyy olla vähintään kriittisenä misellikonsentraationa.

12 86597

Fragmenttien jäännös poistetaan, ennen kuin keksinnön mukainen kompleksi valmistetaan, samalla kun se valmistetaan tai jälkeenpäin, mieluummin ennen.

Kantajakompleksi voidaan valmistaa joko poistamal-5 la liuottava aine, esim. dialyysin, geelisuodatuksen tai kromatografiän avulla liuottavan aineen, varattujen mono-meeristen antigeeniproteiinien, glykosidin ja mahdollisesti muiden fragmenttien seoksesta tai erottamalla varatut, monomeeriset antigeeniproteiinit mainitusta seoksesta, 10 esim. gradienttisentrifugoinnin, kromatografiän tai elektroforeesin avulla. Olennaisena piirteenä on, että monomeeriset antigeeniproteiinit erotetaan liuottavasta aineesta glykosidien samanaikaisesti ollessa läsnä tai erottamisen jälkeen ne siirretään suoraan glykosidille, jonka 15 misellimuodon tulee olla ]äsnä. Kun monomoerisct antigeeniproteiinit erotetaan liuottavasta aineesta, niin että ne voivat olla suorassa kosketuksessa glykosidin kanssa, muodostuu erityinen kompleksi kyseessä olevan keksinnön mukaisesti. Oletetaan, että glykosidin misellimuoto 20 on perustana kompleksin muodostumiselle ja tämä muodostuu glykosidimisellien pinnalla sijaitsevien hydrofobisten alueiden ja membraaniproteiinien pinnalla sijaitsevien hydrofobisten alueiden välisen vetovoiman avulla. Glyko-sidin määrä kompleksissa vaihtelee riippuen käytetystä 25 glykosidista ja kompleksiin sidotuista membraaniproteii-neista ja se on 0,5 - 50 paino-%, erityisesti 0,5 - 25 paino-%, mieluummin 0,5 - 15, usein 0,5 - 10 ja erityisesti 2-8 paino-%. Jos varatut, monomeeriset antigeeni-proteiinit erotetaan liuottavasta aineesta glykosidin 30 poissa ollessa, muodostuu kuitenkin proteiinimisellejä, jotka ovat sentyyppisiä kuin on valmistettu EPC-hakemuk-sen nro 81102213.6:n mukaan.

On sopivaa poistaa muut fragmentit gradienttisentrifugoinnin avulla, koska kyseessä olevien komponenttien 35 sedimentaatiovakiot pienenevät seuraavassa järjestyksessä: solufragmentti, proteiinikompleksi liuottavan aineen 86597 tai glykosidin kanssa, monomeeriset proteiinit ja liuottava aine. Täten muut fragmentit voidaan poistaa gradient-tisentrifugoinnin avulla seoksesta, jossa on liuottava aine, monomeerisiä proteiineja sekä muita fragmentteja, 5 ennen kuin glykosidi lisätään ja liuottava aine poistetaan, esim. dialyysin, geelisuodatuksen, kromatografiän avulla tai monomeeriset proteiinit poistetaan liuottavasta aineesta, esim. elektroforeesin, kromatografiän tai gradienttisentrifugoinnin avulla. Viimeksi mainitussa me-10 netelmässä on myös mahdollista poistaa muut fragmentit saman gradienttisentrifugoinnin avulla, juuri kun kompleksi muodostuu. On myös mahdollista erottaa muut solukomponen-tit, sen jälkeen kun kompleksi on muodostunut yllä mainitulla tavalla, esim. sentrifugoinnin, a 1 finitcettikroma-15 tografian tai geelisuodatuksen avulla. Aineet, jotka eivät ole liittyneet iskomien rakenteeseen, vaan sitoutuneet niihin hydrofobisten voimien vaikutuksesta, voidaan poistaa sentrifugoimalla detergenttivyöhykkeen läpi, esim. sokerigradientin tai sokeriliuosta sisältävän detergent-20 tigradientin avulla.

Glykosidi voi olla mikä tahansa glykosidi vain hydrofiilisin ja hydrofobisin aluein. Mieluummin käytetään saponiineja, joita kuvataan julkaisussa R. Tcshesche ja Wulf, Chemie and Biologie der Saponine in Fortschritte 25 der Chemie Organischer Naturstoffe, julkaisijat W. Herz, II. Grisebach, G.W. Kirby, osa 30 (1973) erityisesti voimakkaasti polaarisia saponiineja, ensisijaisesti polaarisia triterpeenisaponiineja, kuten esimerkiksi polaarisia, happamia bisdesmosideja, esim. saponiiniuutetta, joka on 30 saatu Quillajabark Aralosidi A:sta, Chikosetsusaponen IV:sta, Calendula-glykosidi C:stä, Chikusetsusaponin V:stä, Achyranthes-Saponin B:stä, Calendula-glykosidi A:sta, Araloside B:stä, Araloside C:stä, Putranjia-Saponin III:sta, Bersamasaponosidista, Putranjia-Saponin IVrstä, 35 Trichoside A:sta, Trichoside B:stä, Saponaside A:sta,

Trichoside C:stä, Gypsosidesta, Nutanosidesta, Dianthoside i4 86597 C:stä, Saponaside D:stä, mieluummin Aesculus hippocasta-numista peräisin olevasta aescinesta (T. Patt ja W. Winkler: Das therapeutisch wirksame Prinzip der Rosskas-tanie (Aesculus hippocastanum), Arzneimittelforschung 10 5 (4), 273 - 275 (1960) tai sapoalbiinia Gypsofila struthiu- mista (R. Vochten, P. Joos ja R. Ruyssen: Physico-chemical properties of sapoalbin and their relation to the foam stability, J. Pharm. Belg. 42, 213 - 226 (1968), erityisesti saponiiniuutetta Quilla ja saponaria Molinasta, en-10 sisijaisesti DQ-uutetta, joka valmistetaan K. Dalsgaardin mukaisesti: Saponin Adjuvants, Bull. Off. Ont. Epiz. 77 (7 - 8), 1289 - 1295 (1972) ja Quil A, joka valmistetaan K. Dalsgaardin mukaan: Saponin Adjuvants III, Archiv fur die Gesamte Virusforschung 44, 243 - 254 (1974). Käyte-15 tään myös glykosidien seoksia. Lisätyn glykosidin määrän tulee olla vähintään 1-3 kertaa niiden kriittisen misel-lin muodostumiskonsentraatio (CMC), mieluummin vähintään orityiseosl i vähintään 7 - 12 kertaa tämä määrä. Oletetaan, että tässä tapauksessa glykosidi voi olla sidottu 20 tai tarttunut membraaniproteiinien monomeerimuotoihin. Mieluummin käytetään Quil A, jolla kriittinen misellien muodostumiskonsentraatio on 0,03 paino-%. Quil A:n määrän tulisi silloin olla vähintään 0,02 paino-%, erityisesti 0,05 - 0,5 paino-%, mieluummin 0,2 paino-%. Glykosideja 25 koskevat, yllä esitetyt sitaatit on sisällytetty tähän yhteyteen viitteinä.

Varattujen monomeeristen antigeeniproteiinien erottaminen liuottavasta aineesta voidaan tehdä sentrifu-goiden, dialyysielektroforeesin ja erilaisten kromatogra-30 fisten menetelmien avulla.

Sentrifugointimenetelmä

Fragmentoitujen solujen tai mikro-organismien ja liuottavan aineen seokselle, joka on valmistettu yllä esitetyllä tavalla, suoritetaan gradienttisentrifugointi ja 35 se kerrostetaan esim. sokeri- tai suolaliuoksen pinnalle, joka sisältää liuottavan aineen ja jossa on gradientti, 15 86597 joka sisältää glykosidin, kuten esimerkiksi sokerigradien-tin tai glyseroligradientti tai metritsiamidi tai raskasmetalli, esim. CsCl (so. suhteellisen inertit aineet, joilla on sopiva tiheys, viskositeetti, jotta ne toimivat 5 gradienttimateriaalina), esimerkiksi sokerigradientille alla annetuin konsentraatioin.

Gradienttijärjestelmää sentrifugoidaan ainakin 100 000 g:llä (riippuu ajasta ja gradientista, käytännön olosuhteiden mukaisesti). Sokerina voidaan käyttää mono-10 sakkarideja, kuten esimerkiksi glukoosia, laktoosia, mal-toosia, disakkarideja, kuten esimerkiksi sakkaroosia, mutta myös triooseja, tetrooseja ja glyseriiniä. Mieluummin käytetään sakkaroosia. Sakkaroosikonsentraatio gardien-tissa on sopivasti ainakin 5, mieluummin 15 - 25 paino-% 15 alkukonsentraationa (gradientissa ylimpänä) ja lopullinen konsentraatio on ainakin 20, mieluummin 45 - 60 paino-% (gradientissa alimpana). Gradientti voi esimerkiksi koostua ylemmästä kerroksesta, jossa on 5-25 paino-% sokeria ja alemmasta kerroksesta, jossa sokeripitoisuus on 20 20 - 60 paino-%. Gradientissa voi kuitenkin olla myös useita kerroksia, jolloin yksityisten kerrosten konsen-traatioerot vähenevät vastaavasti. Sokerigradientti sisältää glykosidin tai glykosidien seoksen. Glykosidin tulisi olla 1-3, erityisesti vähintään 5, mieluummin vähintään 25 7-12 kertaa CMC Quil A:n suhteen, ainakin 0,02, erityi sesti ainakin 0,05 - 0,5, mieluummin vähintään 0,2 pai-no-%. Tässä glykosidia sisältävässä gradientissa erotetaan liuottava aine ja liuottavan aineen ja proteiinin välinen kompleksi muutetaan proteiini-glykosidi-komplek-30 siksi.

Sokerigradientin huipulla on sokeri- tai raskas-suolaliuoksen muodostama kerros, joka sisältää liuottavan aineen tai liuottavien aineiden seokset? lipidit jäävät tähän kerrokseen. Liuottavan aineen konsentraatio tässä 35 kerroksessa on vähemmän tai sama kuin käytetyssä mikro-organismien tai solujen ja liuottavan aineen seoksessa 16 86597 ja se on sopivasti 0,25 - 3 paino-%, mieluummin 0,75 - 1,5 paino-%, 1 paino-%:n ollessa edullinen. Sokeri- tai suolakonsentraatio voi olla sama tai vähemmän kuin kon-sentraatio alemman glykosidin sisältävän gradientin ylem-5 mässä kerroksessa, mieluummin 5-25 paino-%, erityisesti 15 paino-% sokeria.

Sen jälkeen kun on sentrifugoitu ainakin 100 000 g:llä vähintään 16 tunnin ajan, mieluummin 20 tuntia 20°C:ssa, proteiinia sisältävät jakeet kootaan ja dialy-10 soidaan puskuria vastaan (0,5 - 0,001 M), mieluummin 0,005 M Tris-HCl, 0,01 M NaCl, pH 7,4 tai 0,02 M ammonium-asetaattipuskurissa, pH 7,0 ja ne väkevöidään, esim. kuten T.G. Cooper kuvaa julkaisussa The Tools of Biochemistry, julkaisija John Wiley & sons (Nes York 1974) , joka on tä-15 hän yhteyteen sisällytetty liitteenä, esimerkiksi lyofi-lisoinnin, tyhjössä suoritettavan dialyysin tai ultrasuo-datuksen avulla. Sentrifugoinnin aikana kaikki aineosat .1 äsken Luvat , jolloin liuottava aine irtoaa proteiinin ja liuottavan aineen muodostamasta kompleksista ja raono-20 meeriset proteiinit siirretään glykosidille ja ne muodostavat kompleksin sen kanssa. Tätä seuraavassa dialyysissä poistetaan sokeri.

Kompleksia voidaan puhdistaa edelleen, esimerkiksi glykosidittomaksi, gradienttisentrifugoinnin avulla, esim.

25 käyttämällä sokerigradienttia, joka sisältää 26 - 60 paino-% sokeria, mieluummin 10 - 40 paino-% sakkaroosia. Jos gradientin yläosa sisältää detergenttiä, vapaata glykosi-dia sitoutuu vieläkin enemmän.

Dialyysimenetelmä 30 Solujen tai mikro-organismien yllä kuvatulla ta valla suoritetun puhdistamisen jälkeen ja sen jälkeen, kun ne on sekoitettu liuottavan aineen kanssa yllä kuvatussa painosuhteessa, solujen ja liuottavan aineen seos, joka on yllä kuvatussa puskurissa, voidaan vaihtoehtoises-35 ti suoraan sekoittaa Quil A:n suhteen ainakin 1-3, mieluummin 7-12 kertaisen määrän kanssa 0,05 - 2 paino- 17 86597 %:ista glykosidia, mieluummin 0,2 paino-%:ista glykosidia ja dilysoidaan puskuria vastaan, kuten esimerkiksi 0,5 -0,001 M, mieluummin 0,005 M Tris-HCl, 0,01 M NaCl, pH 7,4; erityisesti 0,2 M ammoniumasetaattipuskuria, pH 7,0 r> vastaan. Solubi lisointiaineen ja solujen seos voi sisältää lipidejä ja etanolia, jotka ovat erityisen käyttökelpoisia immunogeenisille proteiineille, jotka on puhdistettu affiniteettikromatografiällä tai synteettisesti valmistetuille peptideille. Dialyysi erottaa solubilisointiai-10 neen glykosidin läsnä ollessa. Muodostunut membraanipro-teiinikompleksi voidaan sitten eristää laskeumagradientti-sentrifugoinnin avulla esimerkiksi, kuten on kuvattu sivulla 9 neljännessä kokonaisessa kappaleessa, glykosidi-liitännäinen kuitenkin erottuu pois ja vapautuu muista 15 fragmenteista ja vapaasta glykosidista.

Solujen ja mikro-organismien sekä liuottavan airmen seokselle, joka on puskurissa, suoritetaan myös gradient tisontrifugointi ja esimerkiksi se kerrostetaan 5 -60 paino-%;iseen sokerigradienttiin, joka on yllä maini-20 tussa puskurissa, mieluummin 10 - 12 paino-%:iseen sakka-roosigradienttiin ja sentrifugoidaan ainakin 150 000 g, vähintään 20 minuutin ajan, mieluummin 30 minuuttia 250 000 g:llä. Tällöin erotetaan muut fragmentit liuottavan aineen ja proteiinin välisestä kompleksista.

25 Proteiinia sisältävä ylempi liuos, nimeltään huip- pujae, uutetaan ja glykosidia lisätään määrältään ainakin 1-3, mieluummin 7-12 kertainen CMC Quil A:n suhteen, 0,05 - 0,5 paino-%:ina, mieluummin 0,2 paino-%:ina ja se dialysoidaan 0,5 - 0,001 M puskuria, eritysiesti 0,005 M 30 Tris-HCl, 0,01 MIIC1, pl! 7,4; mieluummin 0,2 M ammonium-asetaattia vastaan. Liuottava aine poistetaan glykosidin läsnäollessa. Lisäpuhdistus voidaan suorittaa sedimentaa-tiogradienttisentrifugoinnin avulla (ks. sivu 16, toinen kokonainen kappale). Lisäpuhdistus voidaan suorittaa 35 sentriguoimalla sokerigradientin läpi, joka sisältää 5 -60 paino-% sokeria, mieluummin 20 - 50 tai 10 - 40 paino-% 18 86597 sokeria ja joka mahdollisesti sisältää ylimmässä kerroksessa sokeria yhdessä detergentin kanssa.

Elektro foree s imene telinä

Vaihtoehtoisesti, fragmentoitujen mikro-organismien r> tai solujen ja liuottavan aineen tai proteiineja sisältävän huippuliuoksen (muut fragmentit ja vapaa liuottava aine on poistettu), joka saadaan, kun tätä seosta gradient-tisentrifugoidaan esim. 5-60 paino-%:lla, mieluummin 20 - 50 paino-%:lla tai 10 - 40 paino-%:lla sokerigra-10 dientilla puskurissa, erotetaan elektroforeesin avulla liuottavasta aineesta ja siirretään liuokseen, joka sisältää ainakin 1-3, mieluummin ainakin 7-12 kertaa CMC:n Quil A:n suhteen, 0,05 - 0,5 paino-% glykosideja, mieluummin 0,2 paino-% glykosidia. Varatut, monomeeriset 15 antigeeniproteiinit erotetaan tällöin liuottavasta aineesta. Elektroforeesilla suoritettavaa erottamista varten on sopivaa, että liuottava aine-puskuriliuos oi sisällä y 1 inuiärä i sesl i lisäilyä suolaa, joka voi häiritä elektroforeesia ja saada aikaan erittäin korkean lämpöti-20 lan. On mahdollista käyttää esim. vyöhyke-elektroforeesia kantaja-aineen kanssa tai ilman sitä. Tavalliset aineet, joita voidaan käyttää kantaja-aineina, ovat esimerkiksi polyakryyliamidi, agar, piihappogeeli, tärkkelys, selluloosa, polyvinyylikloridi, ioninvaihtaja, seliitti.

25 Kompleksien eristäminen ja konsentrointi suoritetaan sivulla 10, riveillä 23 - 26 kuvatulla tavalla. Lisäpuh-distus suoritetaan gradienttisentrifugoinnin avulla (ks. sivu 17, toinen kappale).

Jos lähtömateriaalissa on läsnä hydrofobisia mem-30 hraaniprotoiinoja, joilla on erilaiset varaukset tai pai-no, ne on mahdollista erottaa toisistaan elektroloreesi-tai sentrifugointimenetelmien avulla ja valmistaa niistä erillisiä komplekseja. Näitä olosuhteita käyttäen on mahdollista erottaa ja rikastaa erilaisten membraaniproteii-35 nien muodostamia komplekseja.

86597 19

Kromatografiset menetelmät

Liuotetut proteiinit voidaan valinnaisesti, sen jälkeen kun ne on puhdistettu solufragmenttien suhteen, erottaa liuottavasta aineesta kromatografisin menetelmin, 5 esimerkiksi geelisuodatuksen, hydrofobisen kromatografiän tai affiniteettikromatografiän avulla, esim. ioninvaihto-kromatografiällä, siten että antigeenirakenne on adsorboitu liukenemattomaan substraattiin (matriisi), joka saattaa koostua selluloosasta, agarosesta, dekstraanista, ]() akryy 1 i amid ista ja lasista. Erilaisia Ugandoja kytketään matriisirakenteeseen, joka tällöin saa spesifisiä ominaisuuksia, joita käytetään hyväksi erottamisen aikana. Antigeenirakenne adsorboidaan tavallisesti samaan aikaan kuin käytetty liuottava aine läpäisee matriisin adsorboi-15 tumattomana. Sitten seuraa antigeenin deadsorptio. Ennen deadsorptiovaihetta tai sen aikana voi tapahtua liuottavan aineen, suolan ja puskurointiaineen vaihto, siten että liuottava aine syrjäytyy glykosidilla ja kompleksi muodostuu. Liuottavaa ainetta voidaan täydentää lipidil-20 lä ja alkoholilla, mikä edistää iskomien muodostumista.

Ioninvaihtokromatografiässä varattuja ligandimo-lekyylejä, kulini esimerkiksi d ie ( yy I i uin i noe 1 yy 1 i ä (DEAK) kytketään matriisiin ja käytetään kationinvaihtajina. Karboksyylimetyyli- (CM) tai fosfaattiryhmiä (P) kytke-25 tään matriisiin ja käytetään anioninvaihtajina. Nämä molekyylit erotetaan käyttämällä hyväksi eroja kokonaisva-rauksessa antigeenirakenteiden ja liuottavan aineen välillä. Yleensä liuottava aine on varaukseton ja proteiini on varattu. Eluointi suoritetaan suolagradientin avulla, 30 kuten esimerkiksi K- tai NaCl-gradientin avulla tai sopivalla puskurilla, esimerkiksi fosfaattipuskurilla liuottavan aineen läsnä ollessa (mitä konsentraatioon ja esimerkkeihin tulee, ks. kappale Liuottaminen yllä), suoritettavan pH:n säädön avulla. Liuottavaa ainetta voidaan 35 täydentää lipidillä ja alkoholilla, mikä edistää iskomien muodostumista. Eluoimalla voidaan puhdistaa proteiini, 86597 20 ionivaihtaa liuottava aine tai muodostaa kompleksi, jos eluenttiin lisätään glykosidi liuottavan aineen sijasta. Seuraavaksi poistetaan suolat dialyysin avulla.

Geelisuodatuksessa käytetään liuottavaa ainetta, 5 joka on molekyylipainoltaan pienempi kuin antigeenirakenteet ja joka tulee ulos seuraavissa jakeissa.

Immunoaffiniteettikromatografiän avulla vasta-aineet voidaan sitoa irreversiibelisti yllä mainittuun matriisiin, jonka jälkeen vasta-aineiden ainutlaatuista spe-10 sifisyyttä ja affiniteettia käytetään hyväksi halutun antigeenirakenteen puhdistamiseksi. Liuottavalla aineella ei ole affiniteettia vasta-aineita kohtaan. Eluointi suoritetaan lievästi denaturoiden, esimerkiksi laskemalla pH noin arvoon 4 ja liuottavan aineen tai glykosidin läsnä 15 ollessa.

Lektiinikromatografiässä käytetään lektiinejä, proteiinien ryhmää, joka pystyy reagoimaan reversiibelis-ti spesifisten sokeriryhmien kanssa, mikä tekee mahdolliseksi sitoa niihin esimerkiksi glykoproteiineja. Lektiini 20 kytketään ligandina, esimerkiksi Sepharoseen (Pharmacia, Uppsala) tai se on kaupallisesti ostettuna, valmiiksi kytketty sopivaan matriisiin. Detergenteillä (liuottavilla aineilla) ei ole affiniteettia liikkumattomaksi tehtyyn lektiiniin. Adsorboitu antigeenirakenne deadsorboi-25 daan tavallisesti lisäämällä pienimolekyylipainoista sokeria, mahdollisesti metyloituna, jolla sokerilla on affiniteettia kyseessä olevaa lektiiniä kohtaan lisäämällä esimerkiksi mannoosia, metyylimannosidia, glukoosia, me-tyyliglykosidia ja N-asetyyliglukosamiinia, puskuroituun 30 suolaliuokseen liuotettuna, liuottavan aineen tai glykosidin läsnä ollessa.

Kovalenttisessa kromatografiässä, antigeenirakenne, jossa on tioliryhmä sidottuna kovalenttisella sidoksella, sidotaan matriisiin. Antigeenissä sijaitseva tio-35 liryhmä sidotaan selektiivisesti aktivoituun tioliryh-mään, joka on kytketty sopivaan matriisiin tiodisulfi- 86597 divaihdon avulla. Tämä sidos on reversiibeli ja pesemällä suoritetun liuottavan aineen poistamisen jälkeen tio-lia kantava antigeenirakenne voidaan eluoida pelkistämällä disu.1 f id isidos merkaptoetanolilla tai ditiotreitolil-5 la, liuottavan aineen tai glykosidin läsnä ollessa.

Hydrofobinen kromatografia Tässä tekniikassa käytetään hyväksi oktyyli- tai fenyylityyppisen immobilisoidun hydrofobisen ligandin ja antigeenirakenteen hydrofobisten pintojen välistä vuoro-10 vaikutusta. Vaihtoehtoisesti tämä tekniikka voi olla menetelmä, jossa liuottava aine sidotaan seoksesta ligandiin samanaikaisesti kuin adsorboitumaton antigeenirakenne voidaan ottaa talteen jatkuvaa käsittelyä varten esimerkin 4 mukaisesti (dialyysimenetelmä). Toisissa olosuhteissa an-15 tigeenirakenne voi sitoutua ligandiin ja koska liuottavalla ainoclla ei ole affiniteettia ligandiin, menetellään dialyysimenctelmän mukaisesti. Suurella ionivahvuu-della immobilisointi suoritetaan esim. käyttäen ammonium-sulfaattia ja eluointi suoritetaan pienellä ionivahvuudel-20 la vedellä tai etyleeniglykolilla.

Kromatografisilla menetelmillä puhdistettujen tai eristettyjen proteiinien tai muiden hydrofobisia domeene-ja sisältävien immunogeenien liukenevuus paranee, kun liuottavaa ainetta täydennetään lipidillä ja/tai polaa-25 reillä orgaanisilla liuottimilla, jotka sekoittuvat veteen ja myös kun siihen lisätään sokereita.

Kompleksit voivat siten sisältää bakteerien mem-braaniproteiineja, jolloin on edullista, että ensin rikotaan soluseinämät ennen kuin solumatoriaalia käsitel-30 lään yllä kuvatulla menetelmällä. Esimerkkejä bakteereista, joista voidaan tuottaa hydrofobisia proteiineja, ovat esim. Escherichia, Staphylococci, Haemaophilus, esim. H. influenzae, Bordetella, esim. B. Pertussis, Vibrio, esim.

V. chlolerae, Salmonella, esim. S. typhi, S. paratyphi, 35 edullisesti Colissa oleva adheesiotekijä, esim. pili K 88 ja poriiniproteiini, esim. Salmonellassa tai ulkomem- 86597 22 braaniproteiinit kannoista B. pertussis ja Neisseria meningitidis .

Erityisesti silloin, kun kyseessä ovat bakteerit, jotka sisältävät suhteellisen vähän lipidejä ja joihin 5 nähden lipoproteiinit ja ulkomembraaniproteiinit ovat vahvasti hydrofobisia, lipidien, sokerien tai polaarien orgaanisten liuottimien lisääminen on sopivaa.

Esimerkkejä käyttökelpoisista viruksista, joilla on kapseli, ovat Orthomyxoviridae, kuten esimerkiksi 10 influenssa A, B, C, Paramyxoviridae, erityisesti tuhkarokkovirus, sikotautivirus, parainfluenssa 1, 2, 3 ja 4 virukset, penikkatautivirus sekä Rhabdoviridae, erityisesti vesikauhuvirus, Retroviridae, erityisesti kissan leukemiavirus ja naudan leukemiavirus, ihmisen immuuni-15 puutosvirus (HIV), Herpesviridae, erityisesti Pseudora-bies, Herpes simplex I ja II, Cytomegalovirus, Cotrona-viridae, Togaviridae, kuten esimerkiksi EEE, WEE, VEE (itäinen, läntinen ja venetsuelalainen hevosen aivotulehdus) , keltakuumevirus, erityisesti härän ripulivirus ja 20 eurooppalainen sikaruttovirus Arenaviridae, Poxviridae, Bunyaviridae, eritysiesti Huntan-virus, Iridoviridae, erityisesti afrikkalainen sikaruttovirus ja luokittelemattomien virusten joukosta ihmisen hepatiitti B -virus sekä Marburg-Kbola-virus.

25 Esimerkkejä parasiiteistä, joita voidaan käyttää kyseessä olevan keksinnön mukaisesti, ovat Protozoa, kuten esimerkiksi Toxoplasma, esimerkiksi Toxoplasma gondii, Plasmodium, esimerkiksi Plasmodium vivax, malariae, falciparium, Teileria parvum, ovale ja Filaroidae, mie-30 luummin Parafilaria ja Onchocerca, Entamoeba histolytica, erityyppiset anaplasmat, Schistosoma, kuten esimerkiksi Schistosoma hematobium, mansoni, japonicum ja Trypanosoma, esimerkiksi Trypanosoma gambiense, brusei tai congolesi.

b) On myös mahdollista aloittaa hydrofobisista 35 proteiineista, jotka eivät ole membraaniperäisiä tai ei-hydrofobisista proteiineista tai peptideistä. Ei-hydrofo- 86597 23 biset proteiinit tai peptidit voidaan tehdä hydrofobisiksi kytkemällä niihin hydrofobisia ryhmiä tai tekemällä luoksepääsemättömät hydrofobiset alueet luoksepäästävik-si denaturoimalla. Ei-hydrofobiset ryhmät saattavat olla 5 peräisin viruksilta, joissa on kotelo tai jotka ovat ilman koteloa, bakteereilta, mykoplasmoilta ja parasiiteiltä. Kapselittomien virusten esimerkkejä, joissa on ei-hydrofobisia proteiineja, ovat Picornaviridae (joilla oletetaan myös olevan hydrofobisia proteiineja) esimerkik-10 si suu-ja-sorkkatautivirus, poliovirus, Adenoviridae,

Parvoviridae, esimerkiksi kissan ruttovirus ja sian parvovirus, Reoviridae, esimerkiksi Rotavirus. Esimerkkejä mykoplasmoista ovat M. pneumoniae, mycoides, bovis, suis, hyorinos, orale, salivarium, hominis ja fermentans.

15 Nämä proteiinit voidaan saada puhdistettuina, ku ten kuvataan kohdassa a) Puhdistus ja eristys.

Hydrofobiset ryhmät, jotka voidaan kytkeä ei-hyd-rofobisiin proteiineihin, ovat suoria, haarautuneita, tyydyttyneitä tai tayydyttymättömiä alifaattisia ketjuja, 20 joissa on mieluummin 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 tai 30 hiiliatomia tai hydrofobisia aminohappoja tai peptidejä tai muita hydrofobisia rakenteita, kuten esimerkiksi steroideja. Hydrofobisen rakenteen 25 pituus sovitetaan proteiinin koon ja luontoon mukaisesti. Esimerkkinä voidaan mainita, että peptidi, jossa on 10 -15 aminohappoa (suu-ja-sorkkatautivirus) saadaan sopivasti esiin, siten että siinä on kaksi tyrosiinia amino-tai karboksipäätteisessä päässä. Proteiini, jonka mole-30 kyyliapino on 70 000 daltonia, tarvitsee noin 20 hydrofobista aminohappoa. Koe tehdään empiirisesti. Täten käytetään erityisesti peptidejä, joissa on 1 - 20 aminohappoa, mieluummin 1, 2, 3, 4, 5 aminohappoa, jotka on erityisesti valittu Trp:n, Ile:n, Phe:n, Pro:n, Tyr:n, Leu:n, 35 Var:n, erityisesti Tyr:n joukosta; kolesterolijohdannaisia, kuten esimerkiksi koliinihappoa, ursodesoksikoliini-happoa.

24 86597 Nämä hydrofobiset ryhmät täytyy kytkeä toiminnalliseen ryhmään, joka voi olla kytketty ei-hydrofobiseen proteiiniin, kuten esimerkiksi karboksyyli-, amino-, di-sulfidi-, hydroksyyli-, sulfhydryyli- ja karbonyyliryh-5 mään, esimerkiksi aldehydiryhmiin.

Hydrofobisiksi ryhmiski, joita voidaan liittää, valitaan edullisesti metaanin, etaanin, propaanin, butaa-nin, hcksaanin, heptaanin, oktaanin ja Cys, Asp, Glu, Lys, edullisesti oktanaalia ja Tyr.Tyr.Tyr-Cys,-Asp tai -Glu 10 sisältävien peptidien karboksyyli-, aldehydi-, amino-, hydroksyyli- ja disulfidijohdannaisia. Hydrofobiset ryhmät, jotka sisältävät kytkeytyvän ryhmän, täytyy liuottaa veteen esimerkiksi edellä mainittujen liuotusaineiden tai detergenttien avulla tai vetykloridihapon, 67 tila-15 vuus-% etikkahappoa sisältävän etikkahapon, lipeäliuoksen tai ammoniakin avulla sen mukaan, mikä aine on liuotettava. pH säädetään sitten neutraalille alueelle aineen saostumatta; tällöin on varmistettava, ettei pH ole alueella, joka denaturoisi proteiinin, johon hydrofobinen ryhmä on 20 liitettävä. Lipidi voi parantaa liukoisuutta.

Hydrofobinen molekyyli lisätään ei-hydrofobiseen proteiiniin moolisuhteissa 10:1 - 0,1:1, mieluummin 1:1.

Hydrofobiset ryhmät karboksyyliryhmän kanssa kyt-kentämolekyylinä voidaan kytkeä proteiiniin vesiliukois-25 ten karbodi-imidien tai seosanhydridien avulla. Ensimmäisessä tapauksessa karboksyyliryhmä aktivoidaan pH 5:ssä karbodi-imidillä ja sekoitetaan proteiinin kanssa, joka on liuotettu puskuriin, jonka pH on 8 ja jolla on korkea fosfaattisisältö. Viimeksi mainitussa tapauksessa karb-30 oksiyhdiste reagoi isobutyyliklooriformaatin kanssa tri-etyyliamiinin läsnä ollessa dioksaanissa tai asetonitrii-lissä ja syntyvä anhydridi lisätään proteiiniin pH 8 -9:ssä. On myös mahdollista muuttaa karboksyyliryhmä hyd-ratsiinin avulla hydratsidiksi, joka yhdessä aldehydien 35 ja ketonien kanssa proteiinissa sijaitsevissa, perjodaa- 86597 25 tiliä hapetetuissa sokeriyksiköissä antaa hydratsonisi-doksia.

Aminoryhmät voidaan typpihapon kanssa, alhaisessa lämpötilassa, muuttaa diatsoniumsuoloiksi, jotka Tyr:n, 5 His:n ja Lys:n kanssa muodostavat atsosidoksia.

Hydroksyyliryhmät voidaan sukkiinihappoanhydridin avulla muuttaa hemisukkinaattijohdannaisiksi, jotka voidaan kytkeä kuten karboksyyliryhmät.

Aldehydiryhmät voivat reagoida proteiinissa sijait-10 sevien aminoryhmien kanssa muodostaen Schiffin emäksen.

Lukuisia kytkentäryhmiä ja -menetelmiä on kuvattu julkaisuissa Journal of Immunological Methods, 59 (1983) 129 - 143, 289 - 299, Methods of Enzymology 93 280 - 283 ja Analytical Biochemistry, 116 (1981) 402 - 407, jotka 15 esitetään tässä viitteinä.

Näin valmistetut proteiinit ja peptidit, jotka ovat vastaanottaneet hydrofobisia ryhmiä, sidotaan sitten kompleksiksi glykosidin kanssa, kuten on kuvattu kohdassa a), mutta tässä vaiheessa solufragmenttien poistamiseen käy-20 tetyt puhdistusvaiheet on jätetty pois.

c) On myös mahdollista tehdä hydrofobisia domeene-ja sisäänsä sulkevat hydrofiiliset proteiinit luoksepääs-täviksi denaturoimalla proteiini. Tämä voidaan tehdä esimerkiksi alhaisessa pHrssa, pH-arvossa noin 2,5 tai hy-25 vin emäksisessä liuoksessa pH-arvossa noin 9,5, 3-M ureal-la tai korkeassa lämpötilassa, esim. yli 70°C:ssa. Esimerkkejä tällaisista proteiineista ovat immunoglobuliinit IgG, IgM, IgA jne. tai muut globulaariproteiinit, albumiini, kapseloitumattomista viruksista peräisin olevat 30 proteiinit, kuten poliovirusproteiinit, kuoriproteiinit viruksesta, joka paljastaa proteiinin hydrofobisen alueen, kuten usein on asianlaita retrovirusten kuoriproteiinin tai virusten nukleoproteiinin ollessa kyseessä. Immuno-globuliini voi olla esim. anti-idiotooppinen vasta-aine.

35 Proteiineja voidaan valmistaa puhtaina proteiineina, kuten on kuvattu kohdassa b) ja ne voidaan sitten sitoa 26 8 6 5 9 7 kompleksiksi glykosidiin, kuten on kuvattu kohdassa c).

Kun aloitetaan puhdistetuista tai synteettisistä proteiineista tai peptideistä b):n tai c):n mukaisesti, niillä on taipumus aggregoitua misellien muodossa iskome-5 ja valmistettaessa. Sen tähden yhden tai useamman lipidin, erityisesti kolesterolin, lisäys lisää primaarisen kompleksin muodostusta. Joskus on hyödyllistä lisätä po-laaria liuotinta, esim. etanolia. Lipidit lisätään proteiiniin ja peptidiin samalla, kun liuottavat aineet li-10 sätään. Määrä ei ole ratkaiseva. Lipidin molaarisen suhteen peptidiin tulisi olla vähintään 1:1. Tällöin voidaan käyttää jotain yllä mainitusta neljästä menetelmästä. Kun käytetään radioaktiivisia lipidejä, mitään radioaktiivisuutta ei voida havaita primaarisessa, immuunikompleksissa. 15 Hydrofiiliset peptidit/polypeptidit voivat olla ko- valenttisesti sidotut rasvahappoihin, jotka sisältyvät liposomeihin, jotka koostuvat esimerkiksi kolesterolista, fosfatidyylikoliinista ja rasvahapoista, suhteessa 1:7:2. Peptidi/polypeptidi uutetaan liposomeista detergentin 20 avulla ja erotetaan lipidiylimäärästä sentrifugoimalla sakkaroosigradientissa (10 - 30 % sakkaroosia), joka sisältää detergentin.

Iskomit voidaan valmistaa yllä esitetyllä tavalla, mieluummin sentrifugointi- tai dialyysimenetelmän avulla.

25 Sentrifugointimenetelmää käytettäessä voidaan käyttää

Triton X-100 liposomikompleksin liuottamiseen. Dialyysi-menetelmää käytettäessä pitäisi olla mahdollista dialy-soida detergentti pois (esimerkiksi oktyyliglykosidi).

Keksinnön mukaisesti valmistettua immunogeenikomp-30 leksia voidaan käyttää spesifiseen immuunistimulaatioon ihmisillä ja eläimillä. Niitä voidaan täten käyttää immu-nosäätämiseen ja diagnostisina aineina ja rokotteina bakteerien, virusten, mykoplasmojen ja parasiittien aiheuttamia tauteja vastaan sekä vasta-aineiden valmistamiseksi 35 tutkimustarkoituksiin.

27 86S97

Voidaan myös lisätä erilaisista bakteereista tai viruksista saatuja amfifaattisten proteiinien seoksia lukuisiin tarkoituksiin käytettävien rokotteiden valmistamiseksi .

5 Komplekseja voidaan käyttää ihmis- tai eläinlääke tieteellisissä koostumuksissa, jotka sisältävät keksinnön mukaisia iskomeja, mahdollisesti yhdessä tavanomaisten lisäaineiden ja täyteaineiden kanssa, edullisesti iskomin puskuriliuosmuodossa, esim. TN-liuoksena. Niitä voidaan 10 käyttää myös analyyttisinä aineina ja kantajina aineille, joiden immunogeenisyyttä halutaan lisätä.

Keksintöä kuvataan yksityiskohtaisemmin seuraavien esimerkkien avulla, jotka eivät rajoita keksinnön piiriä.

Esimerkki 1 15 Tekemällä lievä denaturointi alhaisessa pH:ssa tehdään naudan seerumialbumiinimolekyyIin (BSA 17) hydrofobiset alueet saavutettavissa oleviksi iskomien muodostamista varten.

USA (2. my), joka oli liuotettu 0,15 M sitruatti-20 puskuriin (pH 2,5), inkuboitiin kaksi tuntia liuoksen kanssa, joka sisälsi 2 % N-dekanoyyli-N-metyyliglukamii-nia ja yhtä suuren moolimäärän lipidiä (kolesteroli/fos-fatidyylikoliini 1:1). Lipidivarastoliuos sisälsi 10 mg lipidiä/ml tislatussa vedessä ja 20 % N-dekanoyyli-N-me-25 tyyliglukamiinia. Lisättiin Quil A:ta pitoisuudeksi 0,1 %. Seos dialysoitiin perusteellisesti fosfaattipuskuria (pH 7,2) vastaan ensin kuusi tuntia alhaisessa lämpötilassa ja sitten kaksi vuorokautta lämpötilassa 4°C. Elektronimikroskopia vahvisti, että iskomeja muodostui.

30 Valmisteen puhdistamiseksi iskomeihin sitoutumat tomasta materiaalista se sentrifugoitiin 20-%:isen sakka-roosiliuoksen läpi, jonka pinnalla oli 200 ^ul 10-%:ista sakkaroosiliuosta, joka sisälsi 0,1 % Triton X-100. Käytettiin Kontron Tst 54 -roottoria ja sentrifugoitiin 10 35 tuntia kierrosnopeudella 50 000 min ^ lämpötilassa 20°C. BSA sisältävät iskomit otettiin talteen sentrifugiputken 28 86597 pohjalta liuottamalla pelletti 500 ^uljaan fosfaattipuskuria (pH 7,2). 5 - 10 % BSArsta otettiin talteen isko-meina.

BSA-iskomien immunogeenisyys testattiin tekemällä 5 immunisointikoe hiirillä. Kahdeksan hiiren ryhmä immunisoitiin kerran 1 ^ug:lla BSA iskomeissa. Toinen viiden hiiren ryhmä immunisoitiin kerran 0,1 ^.ug:lla BSA-iskome-ja. Vastaavat kahdeksan hiiren ryhmät immunisoitiin isko-meihin sitoutumattomalla BSA:11a. Hiiristä otettiin verta 10 kuukauden kuluttua ja otettiin talteen seerumi. BSA:n vastaiset seerumivasta-aineet mitattiin ELISA:11a. Niillä kahdeksalla hiirellä, jotka oli immunisoitu 1 ^ug:lla is-komeja, keskimääräinen seerumiarvo oli 1/450 (vaihtelu-alue 1/100 - 1/500), kun taas hiiret, jotka oli immunisoi-15 tu 1 tai 0,1 ^ug:lla iskomeihin sitoutumatonta BSA, eivät reagoineet immunisointiin, joka tehtiin 1 tai 0,1 ^ug:lla BSA. Kolme hiiristä, jotka oli immunisoitu 0,1 ^ug:lla BSA-iskomeja, ei reagoinut BSA:iin alhaisilla seerumin vasta-ainemäärillä, kun taas kaksi hiiristä reagoi.

20 Esimerkki 2 BSA:n lievä denaturoiminen vapauttaa molekyylin hydrofobiset alueet. Tämä voidaan tehdä emäksisessä pH:ssa. Reaktion ohjaamiseksi iskomien muodostumisen suuntaan sisällytettiin joukkoon alkoholia, esimerkiksi etanolia.

25 Inkuboitiin BSA:ta (2 mg) liuotettuna 0,5 M karbo- naattipuskuriin (pH 9,6), joka sisälsi 30 % etanolia (myös etyleeniglykolia voidaan käyttää), kuusi tuntia. Lisättiin N-dekanoyyli-N-metyyliglukamiinia pitoisuudeksi 2 % sekä yhtä suuret moolimäärät lipidiä (kolesteroli/fosfatidyy-30 likoliini, ks. esimerkki 1). Lisättiin Quil A:ta pitoisuudeksi 0,1 %. Seosta inkuboitiin 30 - 60 minuuttia ja dia-lysoitiin se sitten perusteellisesti fosfaattipuskuria (pH 7,2) vastaan ensin yön yli huoneen lämpötilassa ja sitten lämpötilassa 4°C. Iskomit puhdistettiin niihin si-35 toutumattomasta materiaalista sentrifugoimalla esimerkissä 1 kuvatulla tavalla. Elektronimikroskopia vahvisti, 86597 29 että läsnä oli iskomikomplekseja. Lisäksi nämä iskomit sedimentoituivat sakkaroosigradientissa 10 —> 50 % sakkaroosia samalla nopeudella kuin IgM, ts. sedimentaatio-vakio oli 19S. Iskomeissa olevan BSA:n saanto oli yli 50 %.

5 Esimerkki 3 2 mg glukagonia liuotettiin 5,5 M karbonaattipus-kuriin (pH 9,6), joka sisälsi 30 % etanolia. Tämä gluka-goniliuos käsiteltiin täsmälleen samalla tavalla kuin naudan seerumialbumiini (BSA) esimerkissä 2. Yli 50 % gluka-10 gonista saatiin talteen iskomeissa. Iskomien muodostuminen varmistettiin elektronimikroskopialla ja määrittämällä kompleksien sedimentaatio sakkaroosigradientissa 10 —> 50 % käyttämällä BSA (4S), tyroglobuliinia (19S) ja IgM (19S) standardeina.

15 Esimerkki 4 2 mg angiotensiiniä liuotettiin 0,5 M karbonaatti-puskuriin (pH 9,6), joka sisälsi etanolia. Tämä angio-tensiiniliuos käsiteltiin samalla tavalla kuin naudan seerumialbumiini (BSA) esimerkissä 2. Yli 50 % angiotensii-20 nistä saatiin talteen iskomeissa. Iskomien muodostuminen varmistettiin elektronimikroskopialla ja määrittämällä kompleksien sedimentaatio sakkaroosigradientissa 10 —> 50 % käyttämällä BSA 84S), tyroglobuliinia (19S) ja IgM:ää (19S) standardeina.

25 Esimerkki 5

Epstein Barr -herpesviruksen vaippaproteiini gp 340 käsiteltiin iskomeiksi.

gp 340 (200 ^ug), joka oli liuotettu 0,15 M fosfaattipuskuriin (pH 7,2), inkuboitiin seoksessa, joka si-30 sälsi 70 ^ug lipidiä (kolesteroli/fosfatidyylikoliini 1:1, ks. esimerkki 1) ja 2 % N-dekanoyyli-N-metyyligluka-miinia, kaksi tuntia huoneen lämpötilassa. Lisättiin Quil A:ta pitoisuudeksi 0,1 %. Seos dialysoitiin perusteellisesti fosfaattipuskuria (pH 7,2) vastaan ensin kuusi tun-35 tia huoneen lämpötilassa ja sitten kaksi vuorokautta lämpötilassa 4°C. Elektronimikroskopia vahvisti, että iskomeja 86597 30 muodostui, gp 340 -iskomit puhdistettiin niihin sitoutumattomasta materiaalista sentrifugoimalla sakkaroosin läpi esimerkissä 1 kuvatulla tavalla.

Esimerkki 6 5 gp 340 -iskomeja valmistettiin eri tavoilla ja seu- raavassa kuvataan erästä varianttia.

300 ug gp 340 2 ^ulissa fosfaattipuskuria (pH 7,2) lisättiin putkeen, jonka seinämälle oli kuivattu 70 ^,ug kolesterolia. Lisättiin Triton X-100 pitoisuudeksi 2 % 10 ja seosta pidettiin kaksi tuntia huoneen lämpötilassa.

Seos, jonka tilavuus oli säädetty 300 ^uliksi, laitettiin kerrokseksi gradientille, jonka yläosa koostui 200 ^ulista 15-%:ista sakkaroosiliuosta, joka sisälsi 1 % Triton X-100 ja alaosa 12 ml:sta 20-%:ista sakkaroosiliuosta edellä 15 kuvatussa fosfaattipuskurissa, joka sisälsi 0,1 % Quil A. Sentrifugoitiin Beckman SW 40 -roottorissa kierrosnopeu-della 40 000 min 1 16 tuntia lämpötilassa 20°C. Gradient-ti otettiin tlateen pohjasta alkaen 500 ^,ul:n annoksina ja gp 340 sisältävät fraktiot tunnistettiin ELISAlla käyt-20 tämällä kaniinin gp 340 -antiseerumia. Elektromikrosko-pialla todettiin se, että iskomeja muodostui.

Esimerkki 7 F 422 -solujen kudosviljelmänesteestä immuunisor-benttimenetelmällä puhdistetusta kissan leukemiavirukses-25 ta peräisin oleva gp 70 denaturoitiin alhaisessa pH:ssa esimerkissä 1 naudan seerumialbumiinin yhteydessä (BSA) kuvatulla tavalla. Myös gp 70 -iskomit muodostettiin esimerkin 1 mukaisella menettelyllä. Iskomien muodostuminen varmistettiin elektronimikroskopialla. Noin 10 % gp 70:stä 30 integroitui iskomeihin.

Esimerkki 8

Esimerkin 7 mukaisesti puhdistetun kissa leukemia-viruksen gp 70 denaturoitiin lievästi esiemrkissä 2 naudan seerumialbumiinin (BSA) yhteydessä kuvatulla tavalla. 35 Myös gp 70 muodostettiin esimerkin 2 mukaista menettelyä noudattaen emäksisessä pH:ssa etanolin läsnä ollessa.

31 86597

Iskomien muodostuminen varmistettiin elektronimikroskopialla. Yli 50 % gp 70:stä integroitui iskomeihin.

Esimerkki 9 HIV-infektoitujen H9-solujen viljelmänesteestä im-5 muunisorbenttimenetelmällä puhdistetun HlV:n gp 120 käsiteltiin alhaisessa pHrssa esimerkissä 1 naudan seerumial-bumiinin yhteydessä kuvatulla tavalla. Samaa menettelyä käytettiin myös gp 120 -iskomien muodostukseen. Iskomien muodostuminen varmistettiin elektronimikroskopialla.

10 Esimerkki 10 HIV-infektoiduista H9-soluista immuunisorbenttime-netelmällä valmistetun HIV:n gp 120 käsiteltiin naudan seerumialbumiinin (BSA) yhteydessä kuvatulla tavalla al-kalisessa pH:ssa ja etanolin läsnä ollessa molekyylin hyd-15 rofobisten alueiden paljastamiseksi. Iskomien muodostukseen käytetti.in esimerkissä 2 BSA:n yhteydessä kuvattua menettelyä. Iskomien muodostuminen varmistettiin elektronimikroskopialla .

Esimerkki 11 20 Peptidi, jossa on suu- ja sorkkatauti-viruksen (FMDV) VPl:n aminohapposekvenssi 144 - 159 syntetisoitiin viitenä muunnoksena

I. (Tyr)3-FMD

II. N-palmitiinihappo-FMD

25 III. N-kapriinihappo-FMD

IV. N-kapriinihappo-(FMD)^

V. Lys-kapriinihappo-FMD

1 mg peptidiä sekoitettiin yhtä suuren moolimäärän kanssa lipidiä (kolesteroli/fosfatidyylikoliini 1:1, ks.

30 esimerkki 1), N-dekanoyyli-N-metyyliglukamiinin ollessa läsnä pitoisuutena 2 % ja Quil A:n loppupitoisuutena 0,1 %. Seosta inkuboitiin 30 - 60 minuuttia huoneen lämpötilassa ja dialysoitiin fosfaattipuskuria (pH 7,2) vastaan. Dialyysikalvon läpäisyrajana oli molckyy1ipaino 35 1 000. Elektronimikroskopia osoitti, että iskomeja muo dostui .

86597 32

Esimerkki 12

Peptidi, jossa on Plasmodium falciparum -antigeenin Pf 155 (malaria) aminohapposekvenssi (palm)2 Lys Glu Glu Asn Vai His Asp Ala, syntetisoitiin siten, että palmitii-5 nihappo oli liittyneenä N-päähän.

1 mg tätä peptidiä sekoitettiin yhtä suuren mooli-määrän kanssa lipidiä (kolesteroli/fosfatidyylikoliini 1:1, ks. esimerkki 1) N-dekanoyyli-N-metyyliglukamiinin ollessa läsnä pitoisuutena 2 % ja Quil A:n loppupitoisuu-10 tena 0,1 %. Seosta inkuboitiin 30 - 60 minuuttia huoneen lämpötilassa ja dialysoitiin fosfaattipuskuria (pH 7,2) vastaan. Dialyysikalvon läpäisyraja oli molekyylipaino 1 000. Elektronimikroskopia osoitti tyypillisen iskomira-kenteen.

15 Esimerkki 13

Peptidi, jolla on Plasmodium falciparum -antigeenin Pf 155 (malaria) aminohapposekvenssi Ala Glu Glu Asn Asn Glu Glu Asn Glu Glu Vai Glu Glu Asn Vai, syntetisoitiin. Joka kolmas aminohappo on hydrofobinen ja peptidin 20 rakenne on (^.-kierre.

1 mg peptidiä sekoitettiin yhtä suuren moolimäärän kanssa lipidiä (kolesteroli/fosfatidyylikoliini 1:1, ks. esimerkki 1) N-dekanoyyli-N-metyyliglukamiinin ollessa läsnä pitoisuutena 2 % ja Quil A:n loppupitoisuutena 0,1 %. 25 Seosta inkuboitiin 30 - 60 minuuttia huoneen lämpötilassa ja dialysoitiin fosfaattipuskuria (pH 7,2) vastaan. Dialyysikalvon läpäisyraja oli molekyylipaino 1 000. Elektronimikroskopia osoitti tyypillisen iskomirakenteen.

Esimerkki 14 30 2 mg hiivaan yhdistelmä-DNA-menetelmin viedyn ja hiivahiukkasen tuottaman Hepatitis B:n (HBs) pintaproteiinia tehtiin liukenevaksi N-dekanoyyli-N-metyyliglukamii-nilla, jota käytettiin pitoisuutena 2 %. Lisättiin yhtä suuri moolimäärä lipidiä (kolesteroli/fosfatidyylikolii-35 ni 1:1, ks. esimerkki 1) ja Quil A:ta pitoisuudeksi 0,1 %. Seosta inkuboitiin huoneen lämpötilassa kaksi tuntia.

33 86597

Sen jälkeen seosta dialysoitiin perusteellisesti fosfaattipuskuria (pH 7,2) vastaan ensin 4-6 tuntia huoneen lämpötilassa ja sitten lämpötilassa 4°C. Elektronimikroskopia osoitti tyypillisen sikomien muodostumisen.

5 Esimerkki 15 TN:ään liuotettu naudan virusripulivirus (bovine virus diarrhea virus, BVDV) (3 mg) tehtiin liukenevaksi lisäämällä Triton X-100 pitoisuudeksi 1 %. Liukoiseen muotoon saatettu virus laitettiin lektiinikolonniin, joka 10 koostui Sepharose 4B:hen immobilisoidusta linssilektiinis-tä (Pharmacia, Uppsala). Kolonni tasapainotettiin TN*:llä ja kun virusmateriaali oli laitettu kolonnille, tämä huuhdottiin viiden kolonnin tilavuudella TN, joka sisälsi 0,1 tilavuus-% Triton X-100 ja sen jälkeen 10 kolonnin ti-15 lavuudella Tn. Virusvaippaproteiinit deadsorboitiin eluoin-tipuskurilla, joka sisälsi 0,1 mol/1 metyyli-<*-D-mannosidia ja 0,5 paino-% oktyyli-/\-D-glukosidia liuotettuina TN:ään ja joka lisättiin kolonneihin. Virusvaippaproteiineja sisältävät fraktiot otettiin talteen, lisättiin Quil A:ta 20 pitoisuudeksi 0,1 paino-% ja 120 ^,ug lipidiä (kolesteroli/ fosfatidyylikoliini 1:1, ks. esimerkki 1). Seosta inkuboi-tiin 30 - 60 minuuttia huoneen lämpötilassa ja dialysoitiin fosfaattipuskuria (pH 7,2) vastaan.

*(0,05 mol/1 Trisiä, 0,1 mol/1 NaCl, pH 7,2) 25 Toistettiin edellä oleva esimerkki, mutta käytet tiin intralipidiä* edellä kuvatun lipidiseoksen sijasta. Iskomien muodostuminen vahvistettiin elektronimikroskopialla .

*Vitrun, Tukholma 30 Esimerkki 16

Brucella abortus -kannan 2308 poriiniproteiinin sileä ja karkea variantti (3 mg) olivat hyvin puhtaita kontaminoivista proteiineista, mutta sisälsivät LPS-kon-taminaatiota. Poriiniproteiinin toimitti ystävällisesti 35 A.J. Winter, Department of Veterinary Microbiology,

Cornell University, Ithaca, USA. Poriiniproteiinit 34 86597 liuotettiin 1 ml:aan fosfaattipuskuria, joka sisälsi 20 % sakkaroosia ja 350 ^ug lipidiä (kolesteroli/fosfa-tidyylikoliini 1:1, ks. esimerkki 1), pitämällä niitä tässä seoksessa yön yli lämpötilassa 4°C. Lisättiin Zvitter-5 gentiä pitoisuudeksi 0,05 %, N-dekanoyyli-N-metyyligluka-miinia pitoisuudeksi 0,1 % ja Quil A:ta pitoisuudeksi 0,1 %. Seos dialysoitiin perusteellisesti fosfaattipuskuria (pH 7,2) vastaan kaksi vuorokautta, ensimmäiset neljä tuntia huoneen lämpötilassa. Elektronimikroskopialla iden-10 tifioidut iskomit puhdistettiin iskomeihin sitoutumattomasta materiaalista sentrifugoimalla esimerkissä 1 kuvatulla tavalla.

Esimerkki 17

Sytomegaloviruksen, erään herpesviruksen, nukleo-15 proteiini - jonka ystävällisesti toimitti raakauutteena tri B. Warren, National Institute of Health, Tukholma -denaturoitiin alhaisessa pHrssa esimerkissä 1 kuvatulla tavalla. Iskomit valmistettiin esimerkin 1 mukaisella menettelyllä. Elektronimikroskopia osoitti, että iskomeja 20 muodostui.

Balb/c-hiiret immunisoitiin kahdesti (25 ^ug, 10 yug) esimerkissä 13 kuvatuilla malariapeptideistä valmistetuilla iskomeilla (A) ja esiemrkeissä 12 ja 13 kuvattujen peptidien seoksella (AB).

25 Taulukko 2

Immuno- Määrä 1. immunisoinnin Määrä 2. immunisoinnin geeni jälkeen_jälkeen _

(pepti- peptidi A peptidi B peptidi A peptidi B

30 dl) A 1:270 l:2M0 1:1380 1:U00 A 1:300 1:220 1:1590 1:660 A 1:630 1:U80 >1:2100 1:800 AB 1:U10 1:250 1:2089 1:500 86597 35

Esimerkki 18

Sytomegaloviruksen glykoproteiinin ja nukleopro-teiinin seoksen toimitti raakauutteena ystävällisesti tri B. Wahren, National Institute of Health, Tukholma.

5 Tämä glykoproteiini-nukeoproteiinivalmiste käsiteltiin alhaisessa pHrssa ja valmistettiin iskomit esimerkissä 1 kuvatulla tavalla. Elektronimikroskopia osoitti, että is-komeja muodostui. Taulukossa I osoitetaan, että sytomega-lovirusiskomeilla immunisoiduissa apinoissa indusoitui 10 voimakas soluvälitteinen immuniteetti. Suunniteltavan sy-tomegalovirusrokotteen kannalta on tärkeää, että muodostuu soluvälitteinen immuniteetti.

Taulukko 1 CMV:lläimmunisoitujen apinoiden ääreisverisolujen 15 proliferatiivinen reaktiivisuus CMV-antigeenia koh taan kiinteässä faasissa 2

Apina Immunisoiva CMV- Nettopulssimäärän Uiiv nro antigeeni annet- neliö i SD IgG- 20 Annos tu yhdistettynä määrä

Lymfosyy- Monosyy- PHA

tit tit 1 pieni - 4 99+ 22 9 800 + 1044 200 160 25 suuri - < 100 < 100 500 6400 2 pieni - < 100 < 100 300 400 suuri - 700+ 519 <100 400 24000 suuri monosyytt. 3800 + 1700 n.d. 13000 30000 3 pieni - 854+ 250 < 100 300 500 30 suuri - < 100 < 100 3200 24000 suuri monosyytt. 2800+ 240 n.d. 22000 18000 4 pieni monosyytt. 423+ 166 441^ 317 2000 400 suuri monosyytt. 3516+ 3202 106+ 160 10000 18C00 36 86597 5 pieni monosyytt. 866·*- 709 833+ 288 10000 100 suuri monosyytt. 30200+ 5300 660+ 280 27000 22000 6 pieni monosyytt. <100 490+ 440 6000 160 suuri monosyytt. 27000+ 21000 < 100 52000 25000 5 7 pieni iskomeihin 36400+ 6500 n.d. 32700 2100 9 pieni iskomeihin 49500+ 9000 n.d. 15300 15000

Ihmisvertailunäyte, CMV -seropositiivinen 37300+ 6500 2600+ 513 45000 12000 10

Ihmisvertailunäyte CMV -ceronegatiivinen < 100 < 100 50000 100 2

Ennen immunisointia kaikilla eläimillä nettopulssimäärä 15 oli 1 000 min ^ lymfosyyteillä ja CMV-antigeenilla (546 ί 58 min ^ CMVillä, nettopulssimäärä 100 min ^); monosyyteillä ja CMV:llä (322 i 208 min nettopulssimäärä 100 min *) tai lymfosyyteillä ja monosyyteillä yhdessä CMV:n kanssa (709 t 425 min * CMVrllä, nettopulssi-20 määrä 211 t 300 min tutkittaessa ^Kaikkien eläinten CMV-IgG-määrät olivat 100 ennen immunisointia, paitsi apinalla nro 8, joka oli esi-immuni-soitu CMV-nukleokapsidiantigeenilla.

Esimerkki 19 25 300 ^,ug gp 240, Epstein Barr -viruksen (herpesvi rus) vaippaproteiinia, lisätään 200 ^ulissa PBS putkeen, jonka seinille on kuivattu 70 ^ug kolesterolia. Lisätään Triton X-100 ja seosta pidetään huoneen lämpötilassa kaksi tuntia. Seos, jonka tilavuus on 300 ^ul, laitetaan gra-30 dientin päälle, jonka yläosa koostuu 200 ^ulista liuosta, joka sisältää 15 % sakkaroosia ja 1 % TX-100, ja alaosa 12 ml:sta liuosta, joka sisältää 20 % sakakroosia ja 0,1 % Quil A:ta PBS:ssä. Seosta sentrifugoitiin kierrosnopeudel-la 40 000 min Beckman SW -roottorissa 16 tuntia lämpö-35 tilassa 20°C. Gradientti otettiin talteen pohjalta alkaen 500 yul:n annoksina. Detergenttiin ja kolesteroliin 37 86597 sekoittunut gp 340 voidaan siirtää iskomeihin dialysoi-malla. Tässä tapauksessa lisättiin Quil A:ta loppupitoi-suudeksi 0,1 % enne dialyysiä. Tällöin on edullista käyttää detergenttiä, joka on helposti dialysoitavissa pois, 5 esimerkiksi oktyyliglykosidia, jota käytettiin tässä tapauksessa .

Sitten seosta dialysoitiin 48 tuntia lämpötilassa 4 - 6°C:ssa PBS vastaan (myös TN-puskuria on käytetty). Iskomien muodostuminen varmistettiin elektronimikrosko-10 pialla. Esimerkiksi eri menetelmillä puhdistettujen eri virusvaippaproteiinien käytön, ts. valitun menetelmän, edut ovat ilmeisiä.

Esimerkki 20

FeLV gp 70:n hybridi-DNA-tuotteen kolme sekvenssiä 15 konjugoitiin liposomeihin sisällytettyyn stearyyliamiiniin kaksivaiheisella glutaraldehydimenetelmällä. 10 mg (10 mg/ ml) liposome ja aktivoitiin PBS:ssa (pH 7) glutaraldehy-dillä (loppupitoisuus 1,25 %) huoneen lämpötilassa yön yli. Ylimääräinen glutardialdehydi poistettiin joko dialy-20 soimalla tai geelisuodatuksella.

3 mg aktivoituja liposomeja sekoitettiin 1 mg:aan kutakin FeLV fp 70 -polypeptidiä, säädettiin tilavuus 1 ml:ksi ja nostettiin pH lisäämällä 100 ^,ul 1 M NaCO^-liuosta (pH 9,6). Seosta inkuboitiin yön yli ja se puh-25 distettiin sitoutumattomasta polypeptidistä geelisuodatuksella (esimerkiksi S-300) .

Polypeptidi-rasvahappo uutettiin 2-%:isella N-de-kanoyyli-N-metyyliglukamiinilla (MEGA-10) ja erotettiin ylimääräisestä lipidistä sentrifugoimalla sakkaroosigra-30 dientilla (5 —> 30 % sakkaroosia), joka sisälsi 0,3 % MEGA-10.

Polypeptidi otettiin tlateen, lisättiin Quil A:ta loppupitoisuudeksi 1 % ja seos dialysoitiin perusteellisesti PBS vastaan, ensin 4-6 tuntia huoneen lämpötilas-35 sa ja sitten 4°C:ssa.

38 86597

Esimerkki 21 3 mg naudan IgG:tä inkuboitiin kuusi tuntia 0,5 M karbonaattipuskurissa (pH 0,6), joka sisälsi 30 % etanolia. Lisättiin N-dekanoyyli-N-metyyliglukamiinia pitoisuu-5 deksi 2 % ja samalla yhtä suuret moolimäärät lipidiä (ko-lesteroli/fosfatidyylikoliini 1:1, ks. esimerkki 1). Lisättiin Quil Aita pitoisuudeksi 0,1 %. Seosta inkuboitiin 30 - 60 minuuttia ja dialysoitiin sitten perusteellisesti fosfaattipuskuria (pH 7,2) vastaan ensin yön yli huoneen 10 lämpötilassa ja sitten lämpötilassa 4°C. Iskomit puhdistettiin iskomeihin sitoutumattomasta materiaalista sentri-fugoimalla esimerkissä 1 kuvatulla tavalla. Elektronimikroskopia osoitti, että iskomeja oli läsnä. Lisäksi nämä iskomit sedimentoituivat sakkaroosigradientissa 10 —> 15 50 % samalla nopeudella kuin IgM, ts. sedimentaatiovakio oli 19S.

Esimerkki 22

Syntetisoitiin kaksi peptidiä, joissa oli Plasmodium falciparum -antigeenin Pf 155 (malaria) (kuvattu 20 esimerkeissä 12 ja 13) aminohapposekvenssit. Kumpaakin peptidiä käytettiin peptidiproteiini-iskomien muodostukseen. Yhtä suuret moolimäärät peptidiä, kalvoproteiinia ja lipidiä (kolesteroli/fosfatidyylikoliini 1:1, ks. esimerkki 1) sekoitettiin N-dekanoyyli-N-metyyliglukamiinin 25 ja Quil A:n kanssa, joiden loppupitoisuudet olivat 2 ja . . : vastaavasti 0,1 %. Seosta inkuboitiin 30 - 60 minuuttia huoneen lämpötilassa ja dialysoitiin fosfaattipuskuria (pH 7,2) vastaan. Dialyysikalvon läpäisyraja oli molekyy-lipaino 1 000 kD. Elektronimikroskopia osoitti tyypilli-30 sen iskomirakenteen.

Claims (6)

86597 39

1. Menetelmä immunogeenisen kompleksin, joka sisältää antigeenisiä proteiineja tai peptidejä, joissa on 5 hydrofobisia alueita, jolla kompleksilla on avoin pallomainen rakenne, jonka muodostavat pyöreät alayksiköt tai pallomaisen rakenteen osat, ja jolla kompleksilla yleensä on alempi sedimentaatiovakio kuin vastaavilla miselleillä ja suurempi sedimentaatiovakio kuin proteiinin tai pepti-10 din vastaavalla monomeerisellä muodolla, valmistamiseksi amfipaattisista proteiineista tai peptideistä tai niitä sisältävistä viruksista, bakteereista, mykoplasmoista, parasiiteistä tai eläinsoluista, jolloin sekoitetaan vähintään yksi edellä mainituista komponenteista vähintään 15 yhden liuottavan aineen kanssa, jolloin komplekseja muodostuu amfipaattisten antigeenisten proteiinien tai peptidien ja liuottavan aineen välillä, minkä jälkeen amfi-paattiset antigeeniset proteiinit tai peptidit erotetaan liuottavasta aineesta, liuottavan aineen läsnäollessa tai 20 erotettuna liuottavasta aineesta, ja ne siirretään suoraan liuokseen, jossa on vähintään yksi triterpeenisaponiini, jossa on hydrofobisia ja hydrofiilisiä alueita pitoisuudessa, joka on vähintään kriittinen misellipitoisuus (CMC), tunnettu siitä, että lipidit lisätään ennen 25 kompleksin eristystä ja puhdistusta.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että lipidit ovat liuottavaan aineeseen sekoittuvia.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, t u n-30 n e t t u siitä, että lipidit valitaan eläin- tai kasvi- soluissa esiintyvistä kalvolipideistä.

4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että lipidit valitaan fosfolipideistä ja isoprenoideista. 35 40 86 597

5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että lipidit ovat fosfatidyylikoliinia ja kolesterolia.

6. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, t u n-5 n e t t u siitä, että lipidejä lisätään siten, että lipidien ja antigeenien tai antigeenideterminanttien mooli-suhde on vähintään 0,1, edullisesti vähintään 1. 41 Patentkrav 8 6 5 9 7