DK165360B - Fremgangsmaade til fremstilling af et immunogent kompleks - Google Patents

Description

i

DK 165360B

Den foreliggendé opfindelse angår en ny fremgangsmåde til fremstilling af et immunogent kompleks, et såkaldt iscom.

Det er kendt, at dræbte virus, f.eks. influenza-5 virus, har en god antigen virkning. De er imidlertid py-rogene selv efter vidtgående rensning. Ved isolering af komponenter, der er vigtige for induktion af protektiv immunitet, er den pyrogene virkning blevet undgået, men immunogeniciteten er ofte ikke tilstrækkelig kraftig.

10 Der må derfor indføres egnede adjuvanser i de vacciner, der indeholder de isolerede antigener (underenheder), for at forøge immunresponsen. På den anden side fremkalder effektive adjuvanser, på den måde, hvorpå de hidtil er blevet anvendt, negative bivirkninger. Adjuvanshol-15 dige vacciner er således ikke bedre end vacciner baseret på det hele virus, hvad angår den pyrogene virkning.

Til forøgelse af immunogeniciteten er der blevet fremstillet detergent-membran-proteiner, som er blevet indesluttet i eller bundet til overfladen af liposomer 20 (EPC-ansøgning 7940083.0). Detergentfrie membranproteiner i liposomer er beskrevet i US-patentskrift nr. 4.148.876. Inkorporering af adjuvanser i sådanne detergentfrie uni lame Hare liposomprodukter er nævnt i US-patentskrift nr. 4.196.191 (uden at der er angivet noget 25 om virkningen deraf). I US-patentskrift nr. 4.117.113 er der beskrevet negativt ladede liposomer indeholdende virusantigen. I sådanne liposomer, der indeholder in-fluenza-hæmaglutinin og neuraminidase, giver inkorporering i liposomer af en adjuvans, mycobakterielle celle-30 vægge, en bedre immunrespons. Bedre immunresponser er også blevet opnået, når adjuvanser, såsom dræbt Mycobacterium tuberculosis, Bordetella pertussis og saponi-ner, er blevet indført i sådanne negativt ladede liposomer, der indeholder difteri-toxoid (US-patentskrift 35 nr. 4.053.585). Alle de ovennævnte lipidholdige membran-proteinprodukter er imidlertid ustabile efter lang op-

DK 165360 B

2 lagring, frysetørring eller skødesløs behandling, f.eks. høj temperatur.

Detergentfrie og lipidfrie proteinmiceller er også blevet fremstillet som vaccine. Det er blevet på-5 vist, at miceller af membranproteiner fra Semliki Porest Virus (SFV) stimulerer dannelsen af cirkulerende antistoffer mod SFV og frembringer en beskyttelse hos mus mod dødelig infektion med SFV. På den anden side var sådanne membranproteinmiceller fra parainfluenza-3-virus 10 ikke effektive til stimulering af antistofdannelsen hos lam eller beskyttelse af dem mod en dosis af et PI-3-virus, der forårsager lungebetændelse, med mindre en olieadjuvans blandedes med micellerne. Olieadjuvanser giver sædvanligvis bivirkninger i form af lokale reak-15 tioner på infektionsstedet (EPC-ansøgning nr.

81102213.6).

I EPC-patentansøgning nr. 0 109 942 er der beskrevet et immunogent protein eller peptidkompleks, som indeholder glycosider, og en fremgangsmåde til fremstil-20 ling deraf. Ifølge fremgangsmåden kan man starte ud fra hele virus, mycoplasma, bakterier, parasitter og animalske celler, men også ud fra rensede peptider eller proteiner eller ud fra proteiner eller peptider, der er syntetiseret eller fremstillet ved hybrid-DNA-teknik.

25 Disse komplekser har en anden morphologisk struk tur under elektronmikroskopet end tilsvarende proteinmiceller fremstillet uden tilsætning af glycosider. Micellerne har en kompleks central kerne med radialt anordnede spidser, medens komplekset ifølge EPC-patentan-30 søgning 0 109 942 har en åben sfærisk struktur bestående af cirkulære underenheder eller dele af den sfæriske struktur. Morphologien er også forskellig fra liposo-mers. Komplekserne og delene deraf har sædvanligvis en lavere sedimentationskorstant end tilsvarende miceller 35 og en højere sedimentationskonstant end den tilsvarende monomere form af protein eller peptid, og højere sedimentationskonstant end liposomer.

DK 165360 B

3

Komplekserne ifølge EPC-patentansøgning nr.

0 109 942, der er blevet fremstillet ved tilsætning af glycosider, har bedre immunogen virkning end tilsvarende proteinmiceller fremstillet uden tilsætning af glycosid 5 eller kompleks mellem et proteinmolekyle og opløselig-gørende middel (monomere former) eller proteinmolekyler bundet til lipid-vesikler, dvs. virosomer, og giver færre bivirkninger, end når proteinmicellerne blandes med glycosiderne eller andre adjuvanser. Dosen af raembran-10 proteiner kan således formindskes til ca. 1/10 eller mere.

Det har nu vist sig, at når man går ud fra rene proteiner eller peptider, har disse tendens til at danne aggregater, dvs. miceller. Dette problem kan over-15 vindes ved tilsætning af lipider, når man fremstiller komplekset.

Også når man går ud fra bakterier, og når hele celler renses, kan der være for ringe mængde lipider til stede, således at der dannes micellér. Dette problem 20 kan overvindes ved tilsætning af lipider.

Det har desuden vist sig, at den nye fremgangsmåde kan anvendes til fremstilling af komplekser med andre antigener end peptider eller proteiner og med antigene determinanter.

25 Den foreliggende opfindelsen angår således en fremgangsmåde til fremstilling af et immunogent kompleks, som indeholder antigener eller antigene determinanter med hydrofobe domæner, ved hvilken virus, mycoplasma, parasitter, animalske celler, antigener eller 30 antigene determinanter med hydrofobe domæner blandes med et eller flere opløseliggørende midler, hvorved der dannes komplekser mellem antigener eller antigene determinanter og opløseliggørende middel, hvorefter antigenerne eller de antigene determinanter skilles fra det op-35 løseliggørende middel i nærværelse af, eller skilles fra det opløseliggørende middel og overføres direkte til en

DK 165360B

4 glycosidopløsning, der indeholder et eller flere glyco-sider med hydrofobe og hydrofile regioner i en koncentration på mindst den kritiske micellulære koncentration, hvorved der dannes et proteinkompleks, som isole-5 res og renses, hvilken fremgangsmåde er ejendommelig ved, at lipiderne tilsættes før komplekset isoleres og renses.

For at forøge opløseliggørelsen og holde de am-fipatiske proteiner eller proteiner med hydrofobe domæ-10 ner naturligt blottede eller blottede ved hjælp af kemisk behandling eller varme (f.eks. 70°C) eller andre molekyler med hydrofobe domæner, dispergeret som monomere i en vandig opløsning, kan tilstedeværelsen af li-pider og/eller polære organiske, med vand blandbare op-15 løsningsmidler være væsentlig. Faktisk anvendes lipider i naturen til dette formål både i dyre- og planteceller. Derfor vil en vilkårlig lipid-lipid-blanding fundet i membraner fra animalske celler eller fra. planteceller være egnet. Visse lipider gør lipidmembraner stivere, 20 f.eks. cholesterol, andre gør dem mere flydende, f.eks. phosphatidylcholin. Der kan også fremstilles syntetiske lipider, som har disse ønskede egenskaber, og der er faktisk ingen begrænsninger med hensyn til at formulere nye lipider, som kan anvendes til disse formål.

25 Hvad angår størrelsen og egenskaberne af lipidet, bestemmes begrænsningerne af opløseligheden i det anvendte system. F.eks. stabiliseres vandige opløsninger af stive lipider (cholesterol) ved tilsætning af mindre stive lipider (phosphatidylcholin) · Polære organiske 30 opløsningsmidler deltager i stabiliseringen af proteinet med hydrofobe egenskaber i opløsning som en proteinmonomer. Følgelig er det ikke muligt at begrænse størrelsen af lipidet med hensyn til dets funktion, da f.eks. længden af en alifatisk kæde, der bestemmer de hydrofobe 35 egenskaber, kan opvejes af en modsvarende polær molekyl-del.

DK 165360B

5

Også sukkerarter har en stabiliserende virkning til opretholdelse af proteiner med blotlagte hydrofobe regioner eller andre molekyler med lignende egenskaber dispergeret som monomere i opløsning. Som sukkerarter 5 kan der anvendes monosaccharider, samt trioser/ tetro-ser, pentoser, hexoser, heptoser og de tilsvarende ke-toser, ikke-reducerende oligosaccharider, såsom saccharose, trehalose og raffinose, reducerende oligosaccharider, såsom maltose, cellobiose, isomaltose, panose, 10 gentiobiose og lactose, og polysaccharider. De kan tilsættes i en mængde på 5-50% af den vandige opløsning.

Som polære organiske, med vand blandbare opløsningsmidler kan der anvendes alkoholer, såsom mono- eller polyvalente alkoholer med op til 10 carbonatomer, 15 såsom ethanol, glycoler, såsom ethylenglycol, ethere, såsom diethylether, og ketoner, såsom acetone.

Lipiderne kan være fedtstoffer eller fedtlignende stoffer, såsom triglycerider eller blandede triglyceri-der, der indeholder fedtsyrer med op til 50 carbonato-20 mer, såsom mættede fedtsyrer med 4-30 carbonatomer, f.eks. smørsyre, capronsyre, caprylsyre, caprinsyre, laurinsyre, myristinsyre, palmitinsyre, stearinsyre, arachidinsyre, behensyre og lignocerinsyre, eller umættede fedtsyrer med op til 30 carbonatomer, såsom hexa-25 decensyre, oliesyre, linolsyre, linolensyre og arachi-donsyre; hydroxy-fedtsyrer, såsom 9,10-dihydroxystearin-syre, umættede hydroxy-fedtsyrer, såsom ricinusolie, forgrenede fedtsyrer; glycerolethere, voksarter, dvs. estere mellem højere fedtsyrer og monovalente alkoholer; 30 phospholipider, såsom derivater af glycerolphosphater, såsom derivater af phosphatidinsyrer, dvs. lecithin, cephalin, inositol-phosphatider, sphingosinderivater med 14-20 carbonatomer; glycolipider, isoprenoider, sulfo-lipider, carotenoider, steroider, såsom cholesterol, 35 cholestanol, caprostanol, phytosteroler, f.eks. stigma-sterol, sitosterol, mycosteroler, f.eks. ergosterol,

DK 165360 B

6 galdesyrer/ f.eks. Sholsyre, deoxycholsyre, chenodeoxy-cholsyre, litocholsyre, steroide glycosider, estere af vitamin A, eller blandinger heraf.

Disse og andre nyttige lipider er beskrevet i: 5 Lipid Biochemistry An Introduction, Ed. M.I. Gurr, A.I. James, 1980 Chapman and Hall, London, New York, University Press Cambridge, hvilket litteratursted gennem denne henvisning skal betragtes som en del af foreliggende beskrivelse.

10 Der anvendes fortrinsvis cholesterol, phosphati- dylcholid, liposomer eller Intralipid ® (Oleum soja fraktionat 200 g, Lechitinum fraktionat vitello ovi 12 g, glycerol 22,5 g, H2O ad 1 1).

Lipiderne kan tilsættes på et vilkårligt trin un-15 der fremgangsmåden, fortrinsvis før tilsætningen af gly-cosidet, men lipider kan også tilsættes efter glycosi-det. Hvis der ikke er lipider til stede, er antigenerne eller de antigene determinanter tilbøjelige til at danne miceller. Tilsætningen af lipider bryder micellerne op, 20 således at komplekset kan dannes.

Lipiderne tilsættes i et molært forhold på mindst 0,1/1 mellem lipider og antigener eller antigene determinanter, fortrinsvis mindst 1/1.

Hvis der benyttes et molært forhold på mere end 25 lOO/l, bliver komplekset klæbrigt og vanskeligt at håndtere. Hvis der anvendes mindre, kan der optræde miceller, og der dannes mindre kompleks. Ved et forhold på 0,1/1 dannes der imidlertid stadig en vis mængde kompleks. Det molære forhold mellem lipider og antigener 30 eller antigene determinanter ligger således fra 0,1/1 til 100/1.

Det kan bevises ved analytiske metoder, der står til rådighed i dag, hvorvidt lipiderne er inkorporerede eller ej. De ved lipidt i Isætning ifølge den- nye frem-35 gangsmåde fremstillede komplekser har den samme morpho-logiske struktur under elektronmikroskopet (EM) (se fi-

DK 165360B

7 guren) og den samme sedimentationskonstant som komplekser fremstillet uden tilsætningen af lipider (se ovenfor) .

Hvis imidlertid de ved lipidtilsætning fremstil-5 lede komplekser ikke renses efterfølgende, er deres omrids i EM tågede, og det antages, at lipider aggregeres på deres overflader. Når komplekserne renses, er deres omrids i EM helt tydelige, og man kan ikke for nærværende bevise, at de indeholder lipider.

10 Som antigener kan der anvendes makromolekylære forbindelser. Foruden proteiner, polypeptider, glyco-proteiner og lipoproteiner kan der også anvendes poly-saccharider, oligosaccharider, polynucleotider eller blandinger heraf.

15 Antigene determinanter, der er egnede til frem stilling af komplekser ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen er f.eks. små polypeptider, små oligosaccharider, oligonucleotider, glycoproteinfragmenter og haptener eller blandinger heraf.

20 Med små polypeptider menes her polypeptider, der omfatter fra mindst 3 og op til ca. 40 aminosyrer. Almindeligvis omfatter en antigen determinant ikke mere end 4-10 aminosyrer. Undertiden er det imidlertid nødvendigt med et noget større antal aminosyrer for at sik-25 re den specifikke struktur af den antigene determinant og/eller immunrespons efter immunisering.

Med små oligosaccharider menes lineære eller forgrenede kæder af sukkerenheder, der omfatter fra mindst 4 og op til ca. 20 sukkerenheder, fortrinsvis fra 6-10 30 sukkerenheder. Disse oligosaccharider kan fremstilles syntetisk eller ved kemisk eller enzymatisk nedbrydning af naturligt forekommende polysaccharider eller glyco-proteiner.

Med oligonucleotider menes forbindelser, der be-35 står af mindst 1 og op til ca. 18 deoxyribonucleotider, eller ribonucleotider, der er opnået syntetisk, eller

DK 165360 B

8 ved enzymatisk eller kemisk spaltning af polynucleoti-der, såsom RNA og DNA. Disse oligonucleotider kan eventuelt være dobbeltstrengede.

Med haptener menes små molekyler, der ikke er im-5 munogene i sig selv, men som bundet til et bærermolekyle bliver immunogene. Eksempler herpå er steroider og prostaglandiner.

Antigenerne eller de antigene determinanter skal have hydrofobe grupper eller mindst én reaktiv gruppe, 10 som kan danne en binding mellem antigenet eller den antigene determinant og hydrofobe forbindelser, f.eks. dem der er nævnt på side 22, sidste afsnit til side 23, tredje afsnit.

Molekyler, der ikke er immunogene i sig selv, 15 kan, hvis de har hydrofobe grupper, komplekseres til is-comer sammen med større grupper, der er immunogene, og som spiller rollen som bærere i iscomkomplekset. Komplekset kan således indeholde blandinger af haptener og antigener.

20 De proteiner eller peptider med hydrofobe domæ ner, der bindes til hydrofobe regioner i glycosiderne, kan være A) amfipatiske proteiner eller peptider med hydrofile og hydrofobe grupper, der stammer fra eller er membranpro-25 teiner eller membranpeptider fra med kappe forsynede vira, bakterier, mycoplasma, parasitter eller animalske celler, eller sådanne proteiner eller peptider, der er fremstillet ved hybrid-DNA-teknik, eller molekyler, der er fremstillet syntetisk, 30 B) hydrofile proteiner eller peptider, der er gjort amfipatiske ved, at der er koblet hydrofobe grupper dertil. Disse proteiner eller peptider kan stamme fra vira, bakterier, mycoplasma, parasitter eller animalske celler eller være syntetiseret eller opnået ved hybrid-DNA-35 teknik.

DK 165360 B

9 C) arafifatiske proteiner eller peptider, der er opnået ved, at utilgængelige hydrofobe dele af hydrofile proteiner er blevet gjort tilgængelige ad kemisk vej eller ved hjælp af høj temperatur. Disse proteiner kan stamme 5 fra de ovenfor nævnte mikroorganismer eller celler eller være opnået ved hybrid-DNA-teknik eller være syntetiseret.

Fremstilling af kompleks.

10 a) Hvad angår fremstillingen af membranproteiner eller membranpeptider stammende fra hele celler eller vira, så omfatter fremstillingen af komplekserne i princippet tre trin: rensning eller isolering af animalske celler eller mikroorganismer eller fragmenter deraf; 15 opløseliggørelse af hydrofobe proteiner og fjernelse af det opløseliggørende middel, idet man samtidig overfører det ønskede antigen i kompleks ved hjælp af glycosid i en immunogen form (immunogent kompleks).

20 Rensning og isolering.

Vira, mycoplasma, bakterier, parasitter og animalske celler koncentreres og renses på kendt måde (se omtalen i "The Tools of Biochemistry", T G Cooper, John Wiley & Sons (1977) New York, der gennem denne henvis-25 ning skal betragtes som en del af foreliggende beskrivelse), f.eks. ved gelfiltrering eller centrifugering gennem en sukkergradient eller gradientcentrifugering gennem percoli eller med huLfiberdialyse. For bakteriers vedkommende kan det være nødvendigt eller mere fordelag-30 tigt først at lysere eller nedbryde cellevæggene (se omtalen i Cota-Robles and Stein, CRC Handbook of Microbiology Vol II (1973) s. 833-844, der gennem denne henvisning skal betragtes som en del af foreliggende beskrivelse) med f.eks. ultralyd eller ved French trykbe-35 handling.

DK 165360B

10

Opløseliggørelse.

De rensede animalske celler eller mikroorganismer eller fragmenter deraf blandes derpå med et ikke-ionisk, ionisk eller Zwitterionisk detergent eller detergent 5 baseret på gallussyre, der benyttes i overskud. Typiske eksempler på egnede ikke-ioniske detergenter er polygly-colestere og polyglycolethere med alifatiske eller ar-alifatiske syrer og alkoholer. Eksempler på disse er alkylpolyoxyethylenethere med den almene formel 10 CnH2n+i(OCH2CH2)xOH, forkortet til CnEx? alkylphenylpo-lyoxyethylenethere indeholdende en phenylring mellem alkylgruppen og polyoxyethylenkæden, forkortet til CnEx, f.eks. Triton X-100 = tert.-CgEg#6 (octylphenol-ether af polyethylenoxid), N-alkanoyl(Ci-C3o)-N-methyl-15 glucamin, f.eks. N-decanoyl- eller -nonanoyl-N-methyl-glucamin, acylpolyoxyethylenestere; acylpolyoxyethylen-sorbitanestere, forkortet til Cn sorbitan Ex, f.eks.

Tween 20, Tween 80, β-D-alkylglucosider,. f.eks. β-D-octylglucosid. De nedenfor nævnte glycosider kan også 20 benyttes, især saponin. Disse er imidlertid svage detergenter og bør derfor benyttes sammen med andre detergenter. Typiske eksempler på egnede ioniske detergenter er gallussyredetergenter, såsom f.eks. desoxycholat og cho-lat. Også konjugerede detergenter, såsom f.eks. tauro-25 deoxycholat, glycodeoxycholat og glycocholat kan benyt tes. Mulige Zwitterioniske detergenter er lysolecitin og syntetiske lysophospholipider. Også blandinger af de ovenfor nævnte detergenter kan benyttes.

Opløseliggørelsen kan også udføres med alkoholer, 30 organiske opløsningsmidler eller små amfipatiske molekyler, såsom heptan-l,2,3-triol, hexan-1,2,3-triol, eddikesyre, vandopløselige peptider og proteiner eller blandinger deraf eller med detergenter.

Det opløseliggørende middel benyttes i overskud i 35 forhold til mængden af lipid og hydrofobe proteiner. Hensigtsmæssigt kan celler eller mikroorganismer og detergenter blandes i vægtforholdet 1:3 til 1:10.

DK 165360B

11

Celler eller mikroorganismer og opløseliggørende middel blandes i pufret opløsning, eventuelt saltopløsning. Molariteten af saltopløsningen ligger mellem 0,02 og 0,5 M, fortrinsvis mellem 0,05 og 0,25 M. 0,1-0,2 M 5 fortrækkes. Detergenten bør virke i ca. 1 time ved stuetemperatur.

Som salt foretrækkes natriumchlorid, men andre salte kan også komme i betragtning, især salte med alkalimetalioner, jordalkalimetalioner og ammoniumioner og 10 stærke mineralske syrer og organiske syrer såsom eddikesyre, trichloreddikesyre, myresyre og oxalsyre. Som puffer er alle stoffer der pufrer i pH-området 6,5-9 egnede. Når man benytter cholater og desoxycholater foretrækkes pH 8-9, og når man benytter ikke-ioniske deter-15 genter foretrækkes pH 7,4. Når der benyttes organiske syrer til proteinopløseliggørelse kan man udelade puffer.

Fremstillingen af immunogene komplekser.

20 Når celler eller mikroorganismer er blevet oplø- seliggjort, fremstilles en blanding af opløseliggørende middel og celle- eller mikroorganismefragmenter (i det følgende kaldet fragmenter). Blandt fragmenterne er ladede monomere antigene proteiner med hydrofobe regio-25 ner i kompleks med det opløseliggørende middel. Det nye immunogene kompleks ifølge opfindelsen fremstilles ved, at man skiller de ladede monomere antigene proteiner fra det opløseliggørende middel i nærværelse af, eller direkte overfører dem til, et eller flere glycosider, der 30 må have hydrofobe og hydrofile regioner og være til stede i en koncentration, der i det mindste svarer til den kritiske micellekoncentration. Resten af fragmenterne fjernes, før komplekset ifølge den foreliggende opfindelse fremstilles, medens det fremstilles eller bagef-35 ter, fortrinsvis før.

Komplekset ifølge opfindelsen kan fremstilles enten ved at fjerne det opløseliggørende middel fra

DK 165360 B

12 blandingen af opløseliggørende middel, ladede monomere antigene proteiner, glycosid og muligvis andre fragmenter, f.eks. ved dialyse, gelfiltrering eller chromato-grafi, eller ved at skille de ladede monomere antigene 5 proteiner fra nævnte blanding, f.eks. ved gradientcentrifugering, chromatografi eller elektroforese. Det væsentlige træk ifølge opfindelsen er, at de monomere antigene proteiner skilles fra det opløseliggørende middel under samtidig tilstedeværelse af glycosidet, eller at 10 de efter fraskillelse direkte overføres til glycosidet, hvoraf micelleformen bør være til stede. Når de monomere antigene proteiner skilles fra det opløseliggørende middel, således at de kan komme i direkte kontakt med glycosidet, dannes det specielle kompleks ifølge den fore-15 liggende opfindelse. Det antages, at mi celleformen af glycosidet er basis for dannelse af komplekset, og at dette dannes ved tiltrækning mellem hydrofobe regioner på glycosidmicelierne og hydrofobe regioner på membranproteinerne. Mængden af glycosid i komplekset varierer 20 alt efter det anvendte glycosid og de kompleksbundne membranproteiner og ligger mellem 0,5 og 50 vægt%, især mellem 0,5 og 25 vægt%, fortrinsvis mellem 0,5 og 15, ofte mellem 0,5 og 10, og specielt mellem 2 og 8 vægt%.

Hvis de ladede antigene monomere proteiner skilles fra 25 det opløseliggørende middel uden at glycosidet er til stede, vil der imidlertid dannes proteinmiceller af den type, der fremstilles ifølge EPC-ansøgning nr.

81102213.6.

Det er hensigtsmæssigt at fjerne de andre frag-30 menter ved gradientcentrifugering, da sedimentationskonstanten for de involverede komponenter aftager i følgende ordens cellefragment, proteinkompleks med opløseliggørende middel eller ifølge opfindelsen, monomere proteiner og opløseliggørende middel. De andre fragmen-35 ter kan således ved gradientcentrifugering fjernes fra blandingen af opløseliggørende middel, monomere protei-

DK 165360 B

13 ner og andre fragmenter, før glyoosidet tilsættes, og det opløseliggørende middel fjernes, f.eks. ved dialyse, gelfiltrering eller chromatografi, eller de monomere proteiner kan skilles fra det opløseliggørende middel, 5 f.eks. ved elektroforese, chromatografi eller gradientcentrifugering. Ved den sidstnævnte metode er det også muligt at fjerne de andre fragmenter under den samme gradientcentrifugering, medens komplekset dannes. Det er også muligt at fraskille andre cellekomponenter, efter 10 at komplekset er blevet dannet ifølge ovenstående, f.eks. ved centrifugering, affinitetschromatografi eller gelfiltrering. Materialer, der ikke er integreret i is-comer, men bundet til den ved hydrofob interaktion, kan fjernes ved centrifugering gennem en zone af detergent, 15 f.eks. en gradient af sukker eller en sukkeropløsning indeholdende detergent.

Glycosidet kan være et hvilket som helst glyco-sid med hydrofobe og hydrofile regioner. Der benyttes fortrinsvis de saponiner, der er beskrevet i R. Tsches-20 che og Wulf, Chemie und Biologie der Saponine in Fort-schritte der Chemie Organischer Naturstoffe, publiceret af W Herz, H Grisebach, G W Kirby, Vol 30 (1973), især de stærkt polære saponiner, først og fremmest de polære triterpensaponiner såsom de polære sure bisdesmosider, 25 f.eks. saponinekstrakt fra Quillajabark Aralosid A, Chikosetsusaponin IV, Calendula-Glycosid C, Chikuset-susaponin V, Achyranthes-Saponin B, Calendula-Glycosid A, Aralosid B, Aralosid C, Putranjia-Saponin III, Ber-samasaponosid, Putranjia-Saponin IV, Trichosid A, Tri-30 chosid B, Saponasid A, Trichosid C, Gypsosid, Nutanosid, Dianthosid C, Saponasid D, fortrinsvis aescin fra Aescu-lus hippocastanum (T. Patt og W. Winklers Das therapeu-tisch wirksame Prinzip der Rosskastanie (Aesculus hippocastanum), Arzneimittelforschung 10(4), 273-275 (1960) 35 eller sapoalbin fra Gypsophilla struthium (R Vochten, P Joos og R Ruyssen: Physico-chemical properties of sa-

DK 165360 B

14 poalbin and their ’relation to the foam stability, J Pharm Belg 42, 213-226 (1968), især saponinekstrakt fra Quillaja saponaria Molina, først og fremmest den DQ-ekstrakt, der fremstilles ifølge K. Dalsgaard: Saponin 5 Adjuvants, Bull Off Int Epiz 77 (7-8), 1289-1295 (1972) og Quil A, der fremstilles ifølge K. Dalsgaard: Saponin Adjuvants III, Archiv fur die Gesamte Virusforschung 44, 243-254 (1974). Der kan også benyttes blandinger af glycosider. Mængden af tilsat glycosid bør være mindst 10 1-3 gange den kritiske micelledannelseskoncentration (CMC), fortrinsvis mindst 5 gange, især mindst 7-12 gange. Det antages, at glycosidet i dette tilfælde kan bindes til og fange monomerformer af membranproteinerne.

Der benyttes fortrinsvis Quil A, der har en kritisk mi-15 celledannelseskoncentration på 0,03 vægt%. Mængden af Quil A bør da være mindst 0,02 vægt%, især 0,05-0,5 vægt%, fortrinsvis 0,2 vægt%. Ovenstående litteraturste-der vedrørende glycosiderne skal gennem denne henvisning betragtes som en del af foreliggende beskrivelse.

20 Separeringen af de ladede monomere antigene pro teiner fra det opløseliggørende middel er blevet udført ved centrifugering, dialyse, elektroforese og ved forskellige chromatog'rafiske metoder.

25 Centrifugeringsmetoden.

Blandingen af fragmenterede celler eller mikroorganismer og opløseliggørende middel fremstillet som ovenfor beskrevet gradientcentrifugeres og lejres på toppen af f.eks. en sukker- eller saltopløsning, inde-30 holdende opløseliggørende middel, under hvilken der findes en gradient indeholdende glycosidet, såsom en sukkergradient eller en gradient af glycerol eller metriz-amid eller et tungt salt, f.eks. CsCl (dvs. forholdsvis indifferente stoffer, der har egnet vægtfylde, vis-35 kositet til at virke som gradientmateriale), f.eks. med de koncentrationer for en sukkergradient, der er angivet nedenfor.

DK 165360B

15

Gradientsystemet centrifugeres ved mindst 100.000 g. Som sukker kan benyttes monosaccharider såsom lactose og maltose, disaccharider såsom saccharose, men også trioser, tetroser og glycerol. Der benyttes fortrinsvis 5 saccharose. Sukkerkoncentrationen i gradienten kan passende være mindst 5, fortrinsvis 15-25 vaegt% som begyndelseskoncentration (øverst i gradienten),og slutkoncen-trationen er mindst 20, fortrinsvis 45-60 vægt% (nederst i gradienten). Gradienten kan f.eks. bestå af et øvre 10 lag med 5-25 vægt% sukker indhold og et nedre lag med 20-60 vægt% sukkerindhold. Der kan imidlertid også forekomme flere lag, idet koncentrationsforskellene mellem de enkelte lag reduceres tilsvarende. Sukkergradienten indeholder et glycosid eller en blanding af glycosider.

15 Mængden af glycosid bør være mindst 1-3, fortrinsvis mindst 7-12 gange CMC, for - Quil A mindst 0,02, især mindst 0,05-0,5, fortrinsvis mindst 0,2 vægt%. I denne glycosidholdige gradient fraskilles det opløseliggørende middel, og komplekset melem det opløseliggørende middel 20 og proteinet omdannes til protein-glycosid-kompleks.

På toppen af sukkergradienten er der et lag af en opløsning af sukker eller tungt salt, der indeholder opløseliggørende middel eller en blanding af opløseliggørende midler. Lipiderne bliver tilbage i dette lag.

25 Koncentrationen af opløseliggørende middel i dette lag er mindre end eller den samme som i den påførte blanding af mikroorganismer eller celler og opløseliggørende middel og kan passende ligge mellem 0,12 og 3 vægt%, fortrinsvis mellem 0,75 og 1,5 vægt%, idet 1 vægt% fore-30 trækkes. Sukker- eller saltkoncentrationen kan være den samme som eller mindre end koncentrationen i det øvre lag af gradienten, fortrinsvis 5-25 vægt%, især 15 vægt%.

Efter centrifugering ved mindst 100.000 g i 35 mindst 16 timer, fortrinsvis i 20 timer ved 20°C, samles de proteinholdige fraktioner og dialyseres mod puffer

DK 165360 B

16

(0,5 M til 0,001 M), fortrinsvis 0,005 M Tris-HCl, 0,01 M NaCl, pH 7,4, eller 0,2 M ammoniumacetatpuffer, pH

7,0, og koncentreres f.eks. som beskrevet i The Tools of Biochemistry af T G Cooper, udgiver John Wiley & Sons 5 (New York 1974), (hvilket litteratursted gennem denne henvisning skal betragtes som en del af foreliggende beskrivelse),f.eks. ved lyofilisering, vakuumdialyse og ultrafiltrering. Under centrifugeringen afsættes alle bestanddele, hvorved det opløseliggørende middel løsnes 10 fra komplekset af protein og opløseliggørende middel, og de monomere proteiner overføres til glycosidet og danner komplekser dermed. Ved den efterfølgende dialyse fjernes sukkeret.

Komplekset kan eventuelt renses yderligere, 15 f.eks. for frit glycosid, ved gradientcentrifugering, f.eks. gennem en sukkergradient, der indeholder 25-60 vægt% sukker, fortrinsvis 10-40 vægt% saccharose. Hvis toppen af gradienten indeholder detergent, -indfanges det frie glycosid endnu mere.

20

Dialysemetoden.

Efter rensning af celler eller mikroorganismerne som ovenfor beskrevet og efter at de er blevet blandet med opløseliggørende middel i det ovenfor nævnte vægt-25 forhold, kan blandingen af celler og opløseliggørende middel i den ovenfor beskrevne puffer alternativt direkte blandes med mindst 1-3, fortrinsvis 7-12 gange CMC, for Quil A 0,05-2 vægt% glycosid, fortrinsvis 0,1-0,2 vægt% glycosid, og dialyseres mod puffer såsom 0,5-0,001 30 M, fortrinsvis 0,005 M Tris-HCl, 0,01 M NaCl, pH 7,4, især 0,2 M ammoniumaceta tpuf fer, pH 7,0. Blandingen af opløseliggørende middel og celler kan indbefatte lipider og ethanol, der er særlig nyttig for immunogene proteiner renset ved affinitetschromatografiske metoder eller 35 syntetisk fremstillede peptider. Ved dialysen fraskilles det opløseliggørende middel i nærværelse af glycosidet.

DK 165360 B

17

Det dannede membranproteinkompleks kan derpå isoleres ved sedimentationsgradientcentrifugering som beskrevet på side 15, første afsnit, idet glycosidadditivet dog udelades, og befries for de andre fragmenter og frit 5 glycosid.

Blandingen af celler eller mikroorganismer og opløseliggørende middel i puffer kan også gradientcentrifugeres og f.eks. lejres på en 5-60 vægt% sukkergradient i ovennævnte puffer, fortrinsvis en 10-20 vægt% 10 saccharosegradient, og centrifugeres ved mindst 150.000 g i mindst 20 minutter, fortrinsvis i 30 minutter ved 250.000 g. De andre fragmenter fraskilles derved fra komplekset mellem opløseliggørende middel og protein.

Den proteinholdige øvre væske, kaldet topfrak-15 tion, udvindes, og glycosidet tilsættes i en mængde på mindst 1-3, fortrinsvis mindst 7-12 gange CMC, for Quil A 0,05-0,5 vægt%, fortrinsvis 0,2 vægt%, og dialyseres mod puffer 0,5-0,001 M, især 0,005 M Tris-HCl, 0,01 M HC1, pH 7,4, fortrinsvis 0,2 M ammoniumacetat. Det op-20 løseliggørende middel fjernes i nærværelse af glycosidet. Yderligere rensning kan udføres ved sedimentationsgradientcentrifugering (se side 16, andet afsnit).

Yderligere rensning kan udføres ved centrifugering gennem en sukkergradient indeholdende 5-60 vægt% sukker, 25 fortrinsvis 10-40 vægt% sukker, og som til sidst indeholder et toplag af sukker med detergent.

Elektroforesemetoden.

Alternativt kan blandingen af fragmenterede mi-30 kroorganismer eller celler og opløseliggørende middel eller den proteinholdige topvæske (hvorfra andre fragmenter og frit opløseliggørende middel er fjernet), der opnås, når denne blanding gradientcentrifugeres, f.eks. med en 5-60 vægt%, fortrinsvis 10-20 vægt% sukkergra-35 dient i puffer, skilles fra det opløseliggørende middel ved elektroforese og overføres i en opløsning, der inde-

DK 165360 B

18 holder mindst 1-3, fortrinsvis mindst 7-12 gange CMC, for Quil A 0,05-0,5 vægt% glycosider, fortrinsvis 0,2 vægt% glycosid. Herved skilles de ladede monomere antigene proteiner fra det opløseliggørende middel. For se-5 parering ved elektroforese er det hensigtsmæssigt, at opløsningen af opløseliggørende middel og puffer ikke indeholder ekstra tilsat salt, der kan forstyrre elek-troforesen og bevirke uacceptabelt høj temperatur. Det er muligt at benytte f.eks. zoneelektroforese med eller 10 uden bærere og isotakoforese med eller uden bærere. Der kan som bærere benyttes sædvanlige stoffer såsom poly-acrylamid, agar, silicagel, stivelse, cellulose, poly vinyl chlor id, ionbytter og Celite ® . Isolering og koncentrering af komplekser udføres som beskrevet på si-15 de 16, første afsnit. Yderligere rensning ved gra dientcentrifugering (se side 16, andet afsnit).

Hvis der i udgangsmaterialet forekommer hydrofobe membranproteiner med forskellige ladninger eller forskellig vægt, er det muligt at skille dem fra hinanden 20 ved elektroforese eller centrifugeringsmetoder og fremstille separate komplekser deraf. Ved disse betingelser er det muligt at skille og berige komplekser af forskellige membranproteiner.

25 Chromatografiske metoder.

De opløseliggjorte proteiner kan om ønsket, efter at være renset for cellefragmenter, skilles fra det opløseliggørende middel ved hjælp af chromatografiske metoder, f.eks. gelfiltrering, eller den antigene struktur 30 adsorberes i et uopløseligt substrat (matrix), der kan bestå af f.eks. cellulose, agarose, dextran, acrylamid og glas. Forskellige ligander kobles til matrixstruktu-ren, der derpå får specifikke egenskaber, der udnyttes under separeringen. Antigenstrukturen adsorberes sædvan-35 ligvis, samtidig med at det anvendte opløseliggørende middel passerer uadsorberet gennem matrixen. Derpå føl-

DK 165360 B

19 ger desadsorption af antigenet. Under desadsorptionstrinnet kan der ske en udskiftning af opløseliggørende middel, salt og pufferstof, idet det opløseliggørende middel kan erstattes af glycosidet, og der dannes kom-5 pleks. Det opløseliggørende stof kan suppleres med lipid og alkohol, som forøger dannelsen af iscomer.

Ved ionbytterchromatografi kobles ladede ligandmolekyler såsom diethylaminoethyl (DEAE) til matrixen og benyttes som kationbyttere. Carboxylmethyl- (CM) eller 10 phosphatgrupper (P) kobles til matrix og anvendes som anionbyttere. Ved udnyttelse af forskelle i nettoladning mellem antigenstrukturer og opløseliggørende middel skilles disse molekyler fra hinanden. I almindelighed er det opløseliggørende middel uladet og proteinet ladet.

15 Eluering foretages med en saltgradient såsom K- eller NaCl eller pH-regulering med phosphatpuffer i nærværelse af et opløseliggørende middel (angående koncentration og eksempler se afsnittet Opløseliggørelse ovenfor). Det opløseliggørende stof kan suppleres med lipid og alko-20 hol, som forøger dannelsen af iscomer. Ved elueringen kan proteinet renses, det opløseliggørende middel udskiftes eller komplekset dannes, hvis glycosidet sættes til elueringsmidlet i stedet for opløseliggørende middel. Salte fjernes derefter ved dialyse.

25 Ved gelfiltrering gøres der brug af det forhold, at det opløseliggørende middel er mindre end antigenstrukturerne og kommer ud i efterfølgende fraktioner.

Ved hjælp af immunoaffinitets-chromatografi kan antistoffer bindes irreversibelt til den ovenfor nævnte 30 matrix, hvorefter den unikke specificitet og affinitet af antistoffer benyttes til rensning af den ønskede antigenstruktur. Det opløseliggørende middel har ingen affinitet til antistoffer. Eluering udføres ved mild denaturering, f.eks. pH-reduktion til ca. 4 og i nær-35 værelse af opløseliggørende middel eller glycosid.

Ved lectin-chromatografi benyttes lectiner, en gruppe proteiner, der er i stand til at reagere rever-

DK 165360 B

20 sibelt med specifikke sukkergrupper, hvilket gør det muligt for dem at binde f.eks. glycoproteiner. Lectinet kobles som ligand til f.eks. Sepharose (Pharmacia, Uppsala) eller købes i handelen i forvejen koblet til en 5 egnet matrix. Detergenter (opløseliggørende midler) har ikke affinitet til det immobiliserede lectin. Den adsor-berede antigenstruktur desadsorberes sædvanligvis ved tilsætning af methyleret sukker, såsom methylmannosid, methylglucosid og N-acetylglycosamin opløst i pufret 10 saltopløsning i nærværelse af opløseliggørende middel eller glycosid.

Ved kovalent chromatografi bindes en antigenstruktur med en thiolgruppe med en kovalent binding til matrix. Thiolgruppen i antigenet bindes selektivt til en 15 aktiveret thiogruppe, der er koblet til en egnet matrix ved hjælp af thio-disulfid-udskiftning. Denne binding er reversibel og efter fjernelse ved vask af det opløseliggørende middel kan den thiolbærende antigenstruktur elueres ved reduktion af disulfidbindingen ved hjælp af 20 mercaptoethanol eller dithiotrietol i nærværelse af opløseliggørende middel eller glycosid.

Hydrofob chromatografi.

Denne teknik benytter interaktionen mellem en 25 immobiliseret hydrofob ligand af octyl- eller phenyl-typen og hydrofobe overflader på antigenstrukturen. Alternativt kan denne teknik være en metode til binding af det opløseliggørende middel fra blandingen til liganden, samtidig med at den antigene struktur kan udvindes uad-30 sorberet til fortsat behandling ifølge eksempel 4 (dialysemetoden) . Under andre betingelser kan antigenstrukturen bindes til liganden, og da det opløseliggørende middel ikke har nogen affinitet til liganden, går man frem efter dialysemetoden. Immobilisering ved høj ion-35 styrke udføres med f.eks. ammoniumsulfat, og eluering udføres ved lav ionstyrke med vand eller ethylenglycol.

DK 165360 B

21

Opløseliggørelse af proteiner eller andre immuno-gener med hydrofobe domæner, rensede eller isolerede ved chromatografiske metoder, forøges ved supplering af det opløseliggørende middel med lipid og/eller polære orga-5 niske, med vand blandbare opløsningsmidler, og desuden ved tilsætning af sukkerarter.

Komplekserne kan således indeholde membranproteiner fra bakterier, og det er i så fald fordelagtigt først at nedbryde cellevæggene, før cellematerialet be-10 handles ved ovenstående fremgangsmåde. Eksempler på bakterier, hvoraf der kan udvindes hydrofobe proteiner, er f.eks. Escherichia, Staphylococci, Haemaophilus, f.eks. H. influenzae, Bordetella, f.eks. B. pertussis, Vibrio, f.eks. V. cholerae, Salmonella, f.eks. S. ty-5 phi, S. paratyphi, fortrinsvis adherensfaktor i Coli, f.eks. pili K 88 og porinprotein i f.eks. Salmonella eller ydermembranproteiner fra B. pertussis og Neisseria meningitidis.

Specielt for bakterier, der indeholder en for-20 holdsvis ringe mængde lipider, og for hvilke lipoprotei-nerne og ydermembranproteinerne har stærk hydrofobici-tet, er det hensigtsmæssigt med tilsætning af lipider, sukkerarter eller polære organiske opløsningsmidler.

Eksempler på anvendelige virus med kapper er 25 Orthomyxoviridae såsom influenza A, B, C, Paramyxoviri-dae, især mæslingevirus, fårésygevirus, parainfluenza 1, 2, 3 og 4 virus, hundesyge-virus og kvægpest-virus,

Rhabdoviridae, især rabiesvirus, Retroviridae, især katteleukæmivirus og bovint leukæmi virus, humant immuno-30 defektvirus (HIV), Herpesviridae, især Pseudorabies, Coronaviridae, Togaviridae, såsom EEE, WEE, VEE (eastern, western og Venezuela equinencephalitis), gul-feber-virus, især bovint-virus-diarré-virus, og europæisk svinepestvirus Arenaviridae, Poxviridae, Bunyavi-35 ridae, Iridioviridae, især afrikansk svinepestvirus og, blandt uklassificerede virus, human hepatitis B-virus og Marburg/Ebola-virus.

DK 165360 B

22

Eksempler på 'parasitter, der kan benyttes ifølge den foreliggende opfindelse, er protozoer såsom Toxoplasma, f.eks. Toxoplasma gondii, Plasmodium, f.eks. Plasmodium vivax, malariae, falciparium, Teileria par-5 vum ovale og Filaroidae, fortrinsvis Parafilaria og Onchocerca, Entamoeba histolytica, anaplasma af forskellige typer, Schistosoma såsom Schistosoma haematobium, mansoni, japonicum og Trypanosoma, f.eks. Trypanosoma gambienze, brusei eller congolesi.

10 b) Det er også muligt at gå ud fra hydrofobe ikke-membranproteiner eller fra ikke-hydrofobe proteiner eller peptider. Ikke-hydrofobe proteiner eller peptider kan gøres hydrofobe ved at man kobler hydrofobe grupper til dem eller gør ikke-tilgængelige hydrofobe regioner 15 tilgængelige ved denaturering. Sådanne proteiner kan stamme fra virus med eller uden kappe, bakterier, mycoplasma og parsitter. Eksempler på ikke-indkapslede virus med ikke-hydrofobe proteiner er Picornaviridae (der også menes at have hydrofobe proteiner), f.eks. mund- og 20 -klovesygevirus, poliovirus, Adenoviridae, Parvoviridae, f.eks. katteparvovirus og svineparvovirus, Reoviridae, f.eks. Rotavirus.

Eksempler på mycoplasma er M. pneumoniae, mycoi-des, bovis, suis, hyorinos, orale, salivarium, hominis 25 og fermentans.

Disse proteiner eller peptider kan opnås i renset tilstand som beskrevet under a) Rensning og isolering.

Den hydrofobe gruppe, der kan kobles til de ikke-hydrofobe proteiner, er ligekædede, forgrenede, mættede 30 eller umættede alifatiske kæder, fortrinsvis med 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 eller 30 car-bonatomer, eller hydrofobe aminosyrer eller peptider eller andre hydrofobe strukturer såsom steroider. Længden 35 af den hydrofobe struktur tilpasses størrelsen og arten af proteinet. Som eksempel kan det nævnes, at et peptid

DK 165360 B

23 med 10-15 aminosyrer (mund- og -klovesygevirus) hensigtsmæssigt forsynes med to tyrosingrupper ved amino- eller carboxy-terminalen. Et protein med en molekylvægt på 70.000 dalton kræver ca. 20 hydrofobe aminosyrer. Test-5 ningen udføres empirisk. Man bruger således især peptider med 1-20 aminosyrer, fortrinsvis 1, 2, 3, 4 eller 5 aminosyrer, især valgt- blandt Trp, Ile, Phe, Pro, Tyr,

Leu, Val, især Tyr; cholesterolderivater såsom cholin-syre eller ursodesoxycholinsyre.

10 Disse hydrofobe grupper må bindes til en gruppe, der kan kobles til det ikke-hydrofobe protein, såsom carboxyl-, amino-, disulfid-, hydroxyl-, sulfhydryl-og carbonylgrupper, såsom aldehydgrupper.

Som hydrofobe grupper, der kan kobles, vælges 15 fortrinsvis carboxyl-, aldehyd-, amino-, hydroxyl- og disulfidderivater af methan, ethan, propan, butan, hexan, heptan, octan og peptider indeholdende Cys, Asp,

Glu, Lys, fortrinsvis octanal og Tyr.Tyr-Tyr-Cys, -Asp eller -Glu. De hydrofobe grupper med en gruppe, der kan 20 kobles; må opløses i vand ved hjælp af f.eks. de opløse-liggørende midler og detergenter, der er nævnt ovenfor, eller saltsyre, eddikesyre, 67 vol% eddikesyre, ætselud, ammoniak, afhængigt af hvilket stof der skal opløses. pH-Værdien indstilles derefter i neutral retning, uden 25 at stoffet udfældes; man må her sikre sig, at der ikke opnås en pH-værdi, der denaturerer det protein, hvortil den hydrofobe gruppe skal kobles. Lipid kan forøge oplø-seliggørelsen.

Det hydrofobe molekyle sættes til det ikke-hydro-30 fobe protein i molforholdet 10:1 til 0,1:1, fortrinsvis 1:1.

Hydrofobe grupper med en carboxylgruppe som koblingsmolekyle kan kobles til proteiner ved hjælp af vandopløselige carbodiimider eller blandede anhydrider.

35 I førstnævnte tilfælde aktiveres carboxylgruppen ved pH 5 med carbodiimid og blandes med proteinet opløst i puf-

DK 165360 B

24 fer pH 8 med højt phosphatindhold. I sidstnævnte tilfælde omsættes carboxyforbindelsen med isobutylchlorformiat i nærværelse af triethylamin i dioxan eller acetonitril, og det fremkomne arihydrid sættes til proteinet ved pH 5 8-9. Det er også muligt at omdanne carboxyl gruppen med hydrazin til hydrazid, der sammen med aldehyder og ketoner i periodat-oxiderede sukkerehheder i proteinet giver hydrazonbindinger.

Aminogrupperne kan med salpetersyrling ved lav 10 temperatur omdannes til diazoniumsalte, der giver azo-bindinger med Tyr, His og Lys.

Hydroxylgrupperne kan med ravsyrearihydrid omdannes til hemisuccinatderivater, der kan kobles som carboxyl grupper .

15 Aldehydgrupper kan omsættes med aminogrupper i proteinet til en Schiff'sk base.

Flere koblingsgrupper og -metoder er beskrevet i Journal of Immunological Methods, 59 (1983.) 129-143, 289-299, Methods in Enzymology Vol. 93, pp 280-33 og i 20 Analytical Biochemistry 116, 402-407 (1981), hvilke litteratursteder gennem denne henvisning skal betragtes som en del af den foreliggende beskrivelse.

De således fremstillede proteiner eller peptider, der har modtaget hydrofobe grupper, kompleksbindes der-25 på med glycosid som beskrevet under a), men man kan her ' udlade rensningstrinnene til fjernelse af cellefragmen ter.

c) Det er muligt ud fra hydrofile proteiner med indesluttede hydrofobe domæner at gøre disse tilgængelige 30 ved denaturering af proteinet. Dette gøres f.eks. ved en lav pH-værdi på ca. 2,5 ell.er en høj pH-værdi på ca.

9,5, ved hjælp af 3 M urinstof eller ved høj temperatur, f.eks. over 70°C. Eksempler på sådanne proteiner er im-munoglobuliner IgG, IgM, IgA osv. eller andre globulære 35 proteiner, albumin, proteiner fra ikke med kappe forsynede virus, såsom poliovirusproteiner, kappe-proteiner

DK 165360B

25 fra virus, der laver spalter i den hydrofobe region i proteinet, hvilket ofte er tilfældet med kappe-proteinet fra. retrovirus eller nucleoproteinet fra virus. Immuno-globulinet kan f.eks. være et antiidiotopisk antistof.

5 Proteinerne kan opnås som rensede proteiner som beskrevet under b) og derefter kompleksbindes til glycosid som beskrevet under c).

Nar man går ud fra rensede eller syntetiske proteiner eller peptider ifølge b) eller c), har disse en 10 tendens til at aggregere i form af miceller under fremstillingen af iscomer. Tilsætningen af et eller flere lipider, især cholesterol, bidrager derfor til dannelsen af det primære kompleks. Undertiden er det nyttigt med tilsætning af et polært opløsningsmiddel, f.eks. etha-15 nol. Lipiderne sættes til proteinet eller peptidet, medens de opløseliggørende midler tilsættes. Mængden er ikke afgørende. Molfoholdet mellem lipid og protein eller peptid skal være mindst 1:1. En af de fire ovennævnte fremgangsmåder kan da anvendes. Når der benyttes ra-20 dioaktive lipider, kan der praktisk taget ikke påvises nogen radioaktivitet i det primære immunogene konqaleks.

Hydrofile peptider/polypeptider kan kobles kovalent til fedtsyrer indkorporeret i liposomer, der består af f.eks. cholesterol, phosphatidylcholin og fedtsyrerne 25 i et forhold på 1:7:2. Peptidet/polypeptidet ekstraheres fra liposomerne med et detergent og skilles fra overskud af lipid ved centrifugering i en saccharosegradient (10 til 30% saccharose), der indeholder detergent.

Iscomer kan fremstilles som ovenfor, fortrinsvis 30 ved centrifugerings- eller dialysemetoden. Ved anvendelse af centrifugeringsmetoden kan der benyttes Triton ® X-100 til opløseliggørelse af liposomkomplekset. Ved an-

DK 165360B

26 vendelse af dialysemetoden kan detergentet dialyseres bort (når der f.eks. anvendes octyl-glucosid).

Det ifølge opfindelsen fremstillede immunogene kompleks kan anvendes til specifik immunostimulering hos 5 mennesker og dyr. De kan således anvendes til immunomo-dulation og diagnostik og som vacciner mod sygdomme fremkaldt af bakterier, virus, mycoplasma og parasitter og til fremstilling af antistoffer, f.eks. til forskningsformål.

10 Desuden kan der tilsættes blandinger af amfipati- ske proteiner fra forskellige bakterier eller virus til fremstilling af vacciner mod flere forskellige lidelser.

Komplekserne kan anvendes i humane eller veterinære præparater, der indeholder iscom ifølge opfindel-15 sen, eventuelt sammen med sædvanlige additiver og fyldstoffer, fortrinsvis i form af en pufferopløsning af iscom, dvs. en TN-opløsning. De kan også anvendes som analytisk reagens og bærer for stoffer, som man ønsker at forøge immunogeniciteten af.

20 Opfindelsen beskrives nærmere ved hjælp af de efterfølgende ikke-begrænsende eksempler.

Eksempel 1

Ved en mild denaturering ved lavt pH gøres hydro-25 fobe regioner i molekylet af bovint serumalbumin (BSA 17) tilgængelige for dannelse af iscomer.

2 mg BSA opløst i 0,15 M citratpuffer med pH 2,5 inkuberedes i 2 timer med 2% N-decanoyl-N-methyl-gluc-amin og en ækvimolær mængde lipid (cholesterol/phospha-30 tidylcholin 1:1). Stamopløsningen af lipid indeholdt 10 mg lipid/ml i destilleret vand med 20% N-decanoyl-N-me-thylglucamin. Quil A tilsattes til en koncentration på 0,1%. Blandingen dialyseredes i vidtgående grad mod phossphatpuffer med pH 7,2, først i 6 timer ved lav tem-35 peratur og derefter ved +4°C i 2 dage. Elektronmikroskopi bekræftede, at der dannedes iscomer.

DK 165360 B

27

Til rensning af præparatet for til iscomer ikke bundet materiale centrifugeredes præparatet gennem 20% saccharose, på toppen af hvilken der anbragtes et lag af 200 yl 10% saccharose med 0,1% Triton ® X-100. En Kon-5 tron Tst 54 rotor anvendtes ved centrifugeringen, der udførtes i 10 timer ved 50.000 o/min ved 20°C. De BSA indeholdende iscomer udvandtes fra bunden af centrifuge-rørglasset ved at opløse pelletten i 500 yl phosphatpuf-fer med pH 7,2. Mellem 5 og 10% af BSA'et udvandtes som 10 iscomer.

Immunogeniciteten af BSA-iscomerne afprøvedes ved et immuniseringsforsøg på mus. En gruppe på otte mus immuniseredes en gang med 1 yg BSA i iscomer. En anden gruppe på fem mus immuniseredes en gang med 0,1 vg BSA-15 iscomer. Tilsvarende grupper på otte mus immuniseredes med BSA, der ikke var bundet til iscomer. Efter en måned blev musene åreladt, og serum opsamledes. Serum-antistofferne mod BSA måltes ved en ELISA. Otte mus immuniseret med 1 vg iscomer reagerede med en gennemsnitlig 20 (mean) serumtiter på 1/450/område 1/100 til 1/1500, medens mus immuniseret med 1 eller 0,1 vg BSA, som ikke var bundet til iscomer, ikke reagerede på immunisering med 1 eller 0,1 vg BSA. Tre af musene, der var immuniseret med 0,1 vg BSA-iscomer, reagerede ikke ved lave se-25 rum-antistof-titre mod BSA, medens to af musene gjorde det.

Eksempel 2

En ringe denaturering af BSA afslører hydrofobe 30 regioner i molekylet. Dette kan gøres ved alkalisk pH.

For at drive reaktionen til dannelse af iscomer inkorporeredes der en alkohol, f.eks. ethanol.

2 mg BSA opløst i 0,5 M carbonatpuffer pH 9,6 indeholdende 30% ethanol (ethylenglycol kan også benyt-35 tes) inkuberedes i 6 timer. N-Decanoyl-N-methyl-glucamin tilsattes til en koncentration på 2% sammen med ækvimo-

DK 165360B

28 lære mængder lipid (cholesterol/phosphatidylcholin, se eksempel 1). Quil A tilsattes til en koncentration på 0,1%. Blandingen inkuberedes i 30 til 60 minutter og dialyseredes derefter i vidtgående grad mod phosphatpuf-5 fer med pH 7,2, først natten over ved stuetemperatur og derefter ved 4°C. Iscomerne rensedes for ikke-iscombun-det materiale ved centrifugering som beskrevet i eksempel 1. Elektronmikroskopi bekræftede, at iscom-komplek-serne var til stede. Endvidere sedimenterede disse isco-10 mer i en 10 til 50% saccharosegradient med den samme hastighed som IgM, dvs. 19S. Udvindingen af BSA i isco-mer var mere end 50%.

Eksempel 3 15 2 mg glucagon opløstes i 5,5 M carbonatpuffer med pH 9,6 indeholdende 30% ethanol. Denne glucagonopløsning behandledes på nøjagtig samme måde som bovint serumalbumin (BSA) i eksempel 2. Mere end 50% af glucagonet udvandtes i iscomer. At iscomer dannedes, bekræftedes ved 20 elektronmikroskopi og ved bestemmelse af sedimentationen af komplekserne i en 10 til 50% saccharosegradient under anvendelse af BSA (4S), thyroglobulin (19S) og IgM (19S) som standarder.

25 Eksempel 4 2 mg angiotensin opløstes i 0,5 M carbonatpuffer pH 9,6 indeholdende ethanol. Denne angiotensinopløsning behandledes på samme måde som bovint serumalbumin (BSA) i eksempel 2. Mere end 50% af angiotensinet udvandtes i 30 iscomer. At iscomer dannedes, bekræftedes ved elektronmikroskopi og ved bestemmelse af sedimentationen af komplekserne i en 10 til 50% saccharosegradient under anvendelse af BSA (4S), thyroglobulin (19S) og IgM (19S).

29

DK 16b3t>U B

Eksempel 5

Kappeproteinet gp 340 fra herpesvirus Epstein Barr rekonstitueredes til iscomer.

200 ug gp 340 opløst i 0,15 M phosphatpuffer med 5 pH 7,2 inkuberedes med 70 ug lipid (cholesterol/phospha-tidylcholin 1:1, se eksempel 1) og 2% N-decanoyl-N-me-thyl-glucamin og inkuberedes i 2 timer ved stuetemperatur. Quil A tilsattes til en koncentration på 0,1%. Blandingen dialyseredes i vidtgående grad mod phosphat-10 puffer med pH 7,2, først i 6 timer ved stuetemperatur og derefter ved +4°C i 2 dage. Elektronmikroskopi bekræftede, at der dannedes iscomer. Gp 340-iscomerne rensedes for til iscomer ikke bundet materiale ved centrifugering gennem saccharose som beskrevet i eksempel 1.

15

Eksempel 6

Gp 340-iscomer er blevet fremstillet på forskellige måder, og nedenfor er der beskrevet en anden variant .

20 300 ug gp 340 i 200 ul phosphatpuffer med pH 7,2 sattes til et rørglas, hvor 70 ug cholesterol var tørret til væggen. Triton ® X-100 tilsattes til en koncentration på 2%, og blandingen holdtes i 2 timer ved stuetemperatur. Blandingen i et rumfang på 300 ul anbragtes som 25 et lag på toppen af en gradient, der fra toppen til bunden bestod af 200 μΐ 15% saccharose med 1% Triton X-100 og 12 ml 20% saccharose i phosphatpuffer som ovenfor indeholdende 0,1% Quil A. Centrifugeringen udførtes ved 40.000 o/min i en Beckman SW 40 rotor i 16 timer ved 30 20°C. Gradienten opsamledes fra bunden i 500 ul portioner, og de gp 340 indeholdende fraktioner sporedes ved en ELISA under anvendelse af et gp 340 kaninantiserum. Elektronmikroskopi anvendtes til bekræftelse af, at der dannedes iscomer.

DK 165360 B

30

Eksempel 7

Gp 70 fra felint leukæmivirus, oprenset ved immu-nosorbensteknik fra vævskulturvæske af P 422 celler, denatureredes mildt ved lavt pH som beskrevet for bovint 5 serumalbumin (BSA) i eksempel 1. Den samme metodik som i eksempel 1 anvendtes også til dannelse af gp 70-iscomer.

At der dannedes iscomer, bekræftedes ved elektronmikroskopi. Ca. 10% af gp 70'et integreredes i iscomer.

10 Eksempel 8

Gp 70 fra felint leukæmi virus, oprenset som beskrevet i eksempel 7, denatureredes i ringe grad som beskrevet for bovint serumalbumin (BSA) i eksempel 2.

Den samme metodik som i eksempel 2 anvendtes også til 15 dannelse af gp 70-iscomer ved alkalisk pH i nærværelse af ethanol. At der dannedes iscomer, bekræftedes ved elektronmikroskopi. Mere end 50% af gp 70 integreredes i iscomer.

20 Eksempel 9

Gp 120 fra HIV, oprenset fra vævskulturvæske fra HIV-inficerede H9-celler ved immunosorbensteknik, behandledes ved lavt pH som beskrevet for bovint serumalbumin i eksempel 1. Den samme metodik anvendtes også 25 til dannelse af gp 120-iscomer. At der dannedes iscomer, bekræftedes ved elektronmikroskopi.

Eksempel 10

Gp 120 fra HIV, fremstillet ud fra HIV-inficerede 30 H9-celler ved immunosorbensteknik behandledes som beskrevet for bovint serumalbumin (BSA) ved alkalisk pH med methanol til afsløring af hydrofobe regioner i molekylet. Den samme metodik som for BSA i eksempel 2 anvendtes til dannelse af iscomer. At der dannedes isco-35 mer, bekræftedes ved elektronmikroskopi.

DK 165360 B

31

Eksempel 11

Et peptid, der repræsenterer aminosyresekvensen 144-159 i VP1 fra mund- og klovesyge-virus (FMDV), syntetiseredes i fem varianter 5 I. (Tyr3) - FMD

II. N-palmitinsyre - FMD

III. N-caprinsyre - FMD

IV. N-caprinsyre - (FMD)2

V. Lys-caprinsyre - FMD

10 1 mg af peptidet blandedes med en ækvimolær mæng de lipid (cholesterol/phosphatidylcholin 1:1, se eksempel 1), N-decanoyl-N-methyl-glucamin i en koncentration på 2% og Quil A i en slutkoncentration på 0,1%. Blandingen inkuberedes i 30 til 60 minutter ved stuetemperatur 15 og dialyseredes mod phosphatpuffer med pH 7,2. Dialysemembranen havde et afspærringspunkt ved en molekylvægt på 1000. Elektronmikroskopi afslørede, at der dannedes iscomer.

20 Eksempel 12

Et peptid, der repræsenterer aminosyresekvensen (palm)2 Lys Glu Glu Asn Val Glu His Asp Ala i plasmodium falciparum antigen Pf 155 (malaria), syntetiseredes med en palmitinsyre konjugeret til N-terminalen.

25 1 mg af peptidet blandedes med en ækvimolær mæng de lipid (cholesterol/phosphatidylcholin 1:1, se eksempel 1), N-decanoyl-N-methyl-glucamin i en koncentration på 2% og Quil A i en slutkoncentration på 0,1%. Blandingen inkuberedes i 30 til 60 minutter ved stuetemperatur 30 og dialyseredes mod phosphatpuffer med pH 7,2. Dialysemembranen havde et afspærringspunkt ved en molekylvægt på 1000. Elektronmikroskopi afslørede den typiske struktur af iscomer.

DK 165360 B

32

Eksempel 13

Et peptid, der repræsenterer aminosyresekvensen Ala Glu Glu Asn Asp Glu Glu Asn Glu Glu Val Glu Glu Asn Val i plasmodium falciparum antigen Pf 155 (malaria), 5 syntetiseredes. Hver tredje aminosyre er hydrofob, og strukturen af peptidet er en a-helix.

1 mg af peptidet blandedes med en ækvimolær mængde lipid (chlolesterol/phosphatidylchlolin 1:1, se eksempel 1), N-decanoyl-N-methyl-glucamin i en koncentra- 10 tion på 2% og Quil A i en s lutkoncentration på 0,1%. Blandingen inkuberedes i 30 til 60 minutter ved stuetemperatur og dialyseredes mod phosphatpuffer pH 7,2. Dialysemembranen havde et afspærringspunkt ved en molekylvægt på 1000. Elektronmikroskopi afslørede den typiske 15 struktur af iscomer.

Eksempel 14 2 mg af overfladeproteinet frå Hepatitis B (HBs), der var indført i gær ved rekombinant-DNA-teknik og pro- 20 duceret af gærpartiklen, blev opløseliggjort med N-de-canyl-N-methyl-glucamin i en koncentration på 2%. En ækvimolær mængde lipid (cholesterol/phosphatidylcholin 1:1, se eksempel 1) og Quil A tilsattes til en. koncentration på 0,1%. Blandingen inkuberedes ved stuetempera- * 25 tur i 2 timer. Derefter dialyseredes blandingen i vidtgående grad mod phosphatpuffer med pH 7,2, i de første 4 til 6 timer ved stuetemperatur og derefter ved 4°C. Elektronmikroskopi viste den typiske dannelse af iscomer.

30

Eksempel 15 3 mg bovint virus diarrévirus (BVDV) opløst i TN blev opløseliggjort ved tilsætning af Triton (ID X-100 til en koncentration på 1%. Det opløseliggjorte virus hæld- 35 tes på en lectinkolonne bestående af lectinet lens len- 33

UIV IOOOOU D

til immobiliseret på sepharose 4B (Parmacia, Uppsala). Kolonnen ækvilibreredes med TN (0,05 M Tris, 0,1 M NaCl, pH 7,2), og efter indføring af virusmaterialet i kolonnen vaskedes den med 5 kolonnevoluminer TN indeholdende 5 0,1 vol% Triton ® X-100 efterfulgt af 10 kolonnevolumi ner TN. Virus-kappe-proteiner desadsorberedes ved, at der til kolonnerne sattes elueringspuffer bestående af 0,2 M methyl-o-D-mannosid, 0,5vægt% octyl-B-D-glucosid opløst i TN. De virus-kappe-proteiner indeholdende frak-10 tioner opsamledes, og der tilsattes Quila A til 0,1 vægt% og 120 yg lipid (cholesterol/phosphatidylcholin 1:1, se eksempel 1). Blandingen inkuberedes i 30 til 60 minutter ved stuetemperatur og dialyseredes mod phos-phatpuffer med pH 7,2.

15 Eksemplet blev gentaget som ovenfor, idet der dog anvendtes Intralipid ® (Vitrum, Stockholm) i stedet for den ovenfor beskrevne lipidblanding. Dannelsen af isco-mer bekræftedes ved elektronmikroskopi.

20 Eksempel 16 3 mg af en glat og en ru variant af porint protein fra Brucella abortus stamme 2308 højrensedes for kontaminerende proteiner, men med en kontaminering med LPS. Det porine protein blev velvilligt leveret af Dr.

25 A.J. Winter, Department of Veterinary Microbiology, Cornell University, Ithaca, USA. De porine proteiner opløstes i 1 ml phosphatpuffer, 20% saccharose og 350 pg lipid (cholesterol/phosphatidylcholin 1:1, se eksempel 1) natten over ved 4°C. Zvittergent tilsattes til en 30 koncentration på 0,05%, N-decanoyl-N-methyl-glucamin tilsattes til en koncentration på 0,5%, og Quil A tilsattes til en koncentration på 0,1%. Blandingen dialyseredes i vidtgående grad mod phosphatpuffer med pH 7,2 i 2 dage, de første 4 timer ved stuetemperatur. De ved 35 elektronmikroskopi identificerede iscomer rensedes for ikke-iscombundet materiale ved centrifugering som beskrevet i eksempel 1.

DK 165360B

34

Eksempel 17

Nucleoproteinet · fra cytomegalovirus, et herpesvirus - velvilligt leveret af Dr. B. Warren, National Institute of Health, Stockholm, som en rå ekstrakt - de-5 natureredes ved lavt pH som beskrevet i eksempel 1. Is-comer fremstilledes efter metodikken i eksempel 1. Elektronmikroskopi afslørede, at der dannedes iscomer.

Balb/c mus immuniseredes to gange (25 ug, 10 ug) med iscomer fremstillet ud fra de malariapeptider, der 10 er beskrevet i eksempel 13 (A), og en blanding af de peptider, der er beskrevet i eksemplerne 12 og 13 (AB).

Tabel 2

Immu- Titer efter 1. imm. Titer efter 2. imm.

15 nogen

(pep- peptid A peptid B peptid A peptid B

tid)_ A 1:270 1:240 1:1380 1:400 A 1:300 1:220 1:1590 1:660 20 A 1:630 1:480 >1:2100 1:800 AB 1:410 1:250 1:2089 1:500

Eksempel 18

En blanding af glycoproteinet og -nucleoproteinet 25 fra cytomegalovirus blev velvilligt leveret af Dr. B. Warren, National·Institute of Health, Stockholm, som en rå ekstrakt. Dette glycoprotein-nucleoprotein-præparat behandledes ved lavt pH, og iscomer fremstilledes som beskrevet i eksempel 1. Elektronmikroskopi afslørede, at 30 der dannedes iscomer. I tabel 1 er det vist, at aber immuniseret med cytomegalovirus-iscomerne inducerede høj cellemedieret immunitet. For en eventuel fremtidig vaccine mod cytomegalovirus er det vigtigt, at cellemedieret immunitet udløses.

υιν ιοσοου d 35

Tabel 1

Proliferativ reaktivitet af perifere blodceller fra CMV-immuniserede aber overfor CMV-antigen i fast fase

5 Abc Immuniserende Netto cpm^ CM

nr. GMV-antiyen

Oosiu givet titer

med Lymfo- Mono-- PHA

cyter cyter 10 _______ 1 lav - 499+ 229 800+10¾¾ 200 160 høj - < 100 < 100 _ 500 6¾00 2 lav - < 100 < 100 300 400 høj - 700+ 519 < 100 400 24000 !5 høj monocyter 3800+ 1700 n.d. 13000 30000 3 'lav - 854+ 250 < 100 300 500 høj - < 100 < 100 3200 24000 høj monocyter 2800+ 240 n.d. 22000 18000 ¾ lav monocyter 423+ 166 441+ 317 2000 400 20 høj monocyter 3516+ 3202 106+ 160 10000 18000 5 lav monocyter 866+ 709 833+ 288 10000 100 høj monocyter 30200+ 5300 660+ 280 27000 22000 6 lav monociter <100 ¾90+ 440 6000 160 høj monocyter 27000+ 21000 <100 52000 25000 25 7 lav iacomer 36400+ 6500 n.d. 3270.0 2100 8 høj iscoraer 49500+ 9000 n.d. 15300 15000

Human kontrol, CMV seropositiv 37300+ 6500 2600+ 513 45000 12000 30

Human kontrol, CMV seronegativ <100 <100 50000 100 35

DK 165360 B

36 2 Før immunisering havde alle dyr netto cpm på 1000 for lymfocyter og CMV-antigen (546 ±58 cpm for CMV, netto cpm 100); monocyter og CMV (322+208 cpm, netto cpm 100) eller lymfocyter og monocyter med CMV (709±425 cpm for 5 CMV, netto cpm 211±300) (cpm - count per minute = antal pr. minut).

b Før immunisering havde alle dyr CMV IgG titere på 100, undtagen abe nr. 8, der preimmuniseredes med CMV-nucleo-capsid-antigen.

10

Eksempel 19 300 yg gp 340, et kappe-protein fra Epstein Barr virus (et herpes virus) i 200 ul PBS, sættes til et rørglas, hvor 70 ug cholesterol er tørret til væggen. Tri-15 ton ® X-100 tilsættes, og blandingen holdes ved stuetemperatur i 2 timer. Blandingen i et volumen på 300 ul anbringes som et lag på toppen af en gradient, der fra toppen til bunden består af 200 ul 15% saccharose med 1% TX-100 og 12 ml 20% saccharose i PBS indeholdende 0,1% 20 Quil A. Centrifugeringen udførtes ved 40.000 o/min i en Beckman SW rotor i 16 timer ved 20 °C. Gradienten opsamledes fra bunden i 500 ul portioner. Gp 340'et, blandet med detergent og cholesterol, kan rekonstitueres til iscomer ved dialysemetoden. I dette tilfælde tilsattes 25 Quil A til en slutkoncentration på 0,1% før dialyse. Det foretrækkes da at have en detergent, der let kan dialyseres bort, f.eks. octylglycosid, som anvendtes i dette tilfælde.

Blandingen dialyseredes derefter i 48 timer ved 30 4-6°C mod PBS (TN-puffer er også blevet benyttet). Dannelsen af iscomer verificeredes ved elektronmikroskopi. Fordelen ved at anvende f.eks. kappe-proteiner fra forskellige virus, renset ved forskellige metoder, dvs. en udvalgt metode, er indlysende.

DK 165360 6 37

Eksempel 20

Tre sekvenser hybrid-DNA-produkt fra FeLV gp 70 konjugeredes til stearylamin inkorporeret i liposomer ved to-trinsmetoden med glutaraldehyd. 10 mg (10 mg/ml) 5 liposomer i PBS med pH 7 aktiveredes ved en slutkoncen-tration på 1,25% glutardialdehyd ved stuetemperatur natten over. Overskud af glutardialdehyd fjernedes ved enten dialyse eller gelfiltrering.

3 mg aktiverede liposomer blandedes med 1 mg af 10 hvert FeLV gp 70 polypeptid, voluminet indstilledes på 1 ml, og pH hævedes ved tilsætning af 100 yl 1 M NaCC>3 med pH 9,6. Blandingen inkuberedes natten over og rensedes for ubundet polypeptid ved gelfiltrerig (f.eks. S-300).

Polypeptid-fedtsyren ekstraheredes med 2% N-de-15 canoyl-N-methyl-glucamin (MEGA-10) og skiltes fra overskud af lipid ved centrifugering i en saccharosegradient (5-30% saccharose) indeholdende 0,3% MEGA-10.

Polypeptidet opsamledes, Quil A tilsattes til en slutkoncentration på 1%, og blandingen dialyseredes i 20 vidtgående grad mod PBS, de første 4-6 timer ved stuetemperatur og derefter ved +4°C.

Eksempel 21 3 mg bovint IgG i 0,5 M carbonatpuffer pH 0,6 in-25 deholdende 30% ethanol inkuberedes i 6 timer. N-Deca-noyl-N-methyl-glucamin tilsattes til en koncentration på 2% sammen med ækvimolære mængder lipid (cholesterol/ phosphatidylcholin 1:1, se eksempel 1). Quil A tilsattes til en koncentration på 0,1%. Blandingen inkuberedes i 30 30-60 minutter og dialyseredes derefter i vidtgående grad mod phosphatpuffer med pH 7,2, først natten over ved stuetemperatur og derefter ved 4°C· Iscomerne rensedes for ikke-iscombundet materiale ved centrifugering som beskrevet i eksempel 1. Elektromikroskop! bekræfte-35 de, at der var iscomer til stede. Endvidere sedimentere-

DK 165360B

38 de disse iscomer i en 10-50% saccharosegradient med samme hastighed som IgM, dvs. 19S.

Eksempel 22 5 To peptider, der repræsenterer aminosyresekven- ser fra plasmodium falciparum antigen Pf 155 (malaria) (beskrevet i eksempel 12 og 13) syntetiseredes. Hver peptid anvendtes til dannelse af peptid/protein-iscomer. ffikvimolære mængder peptid, membranprotein og lipid 10 (cholesterol/phosphatidylcholin 1:1, se eksempel 1) blandedes med N-decanyl-N-methyl-glucamin og Quil A til en slutkoncentration på henholdsvis 2% og 0,1%. Blandingen inkuberedes i 30-60 minutter ved stuetemperatur og dialyseredes mod phosphatpuffer med pH 7,2. Dialysemem-15 branen havde en molekylvægt-afspærringsværdi på 1000 kdalton. Elektronmikroskopi afslørede den typiske struktur af iscomer.

Claims (6)

1.Fremgangsmåde til fremstilling af et immunogent kompleks, som indeholder antigener eller antigene determinanter med hydrofobe domæner, ved hvilken virus, mycoplasma, bakterier, parasitter, animalske celler, antige-5 ner eller antigene determinanter med hydrofobe domæner blandes med ét eller flere opløseliggørende midler, hvorved der dannes komplekser mellem antigener eller antigene determinanter og opløseliggørende middel, hvorefter antigenerne eller de antigene determinanter skiΙ-ΙΟ les fra det opløseliggørende middel i nærværelse af, el-ler skilles fra det opløseliggørende middel og overføres direkte til en glycosidopløsning, der indeholder ét eller flere glycosider med hydrofobe og hydrofile domæner i en koncentration på mindst den kritiske micellulære 15 koncentration, hvorved der dannes et proteinkompleks, som isoleres og renses, kendetegnet ved, at der tilsættes lipider, før komplekset isoleres og renses.

• 2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at lipiderne er blandbare med det opløselig-20 gørende middel.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at lipiderne er valgt blandt mexnbranlipider fra dyre- eller planteceller, såsom fedtstoffer, glyce-rolethere, voksarter, phospholipider, sulfolipider, 25 glycolipider og isoprenoider, og at lipiderne tilsættes i et molært forhold mellem lipid og antigener eller antigene determinanter på mindst 0,1.

4. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at lipiderne tilsættes i et molært forhold 30 mellem lipider og antigener eller antigene determinanter på mindst 1.

5. Fremgangsmåde til fremstilling af et immunogent kompleks ifølge krav 1, ved hvilken virus, mycoplasma, bakterier, parsitter, animalske celler, anti- DK 165360B gener eller antigene determinanter blandes med en ionisk, ikke-ionisk, zwitterionisk eller gallussur detergent, alkoholer, små amfipatiske molekyler, vandopløselige peptider eller proteiner eller blandinger her-5 af, blandingen lejres på toppen af en opløsning, der indeholder opløsel'iggørende middel, og som på sin side ligger over en gradient indeholdende glycosid, og centrifugeres, hvorhos fraktionen, der indeholder antigener eller antigene determinanter, isoleres og dialyseres mod 10 pufferopløsning, eller hvorhos mikroorganismerne, de animalske celler, antigenerne eller de antigene determinanter, efter at de er blevet blandet med det opløselig-gørende middel, omsættes med glycosid og dialyseres mod puffer eller lejres direkte på en gradient og centrifu-15 geres, hvorefter fraktionen, der indeholder antigenerne eller de antigene determinanter, opsamles, omsættes med glycosid og dialyseres mod puffer, eller hvorhos blandingen af mikroorganismer, animalske celler, antigener eller antigene determinanter og opløseliggørende middel 20 i pufferen, eller fraktionen, der indeholder antigener eller antigene determinanter, som er opnået, når blandingen af mikroorganismer, animalske celler, antigener eller antigene determinanter og opløseliggørende middel i pufret saltopløsning centrifugeres gennem en gradient, 25 adskilles ved elektroforese eller chromatografisk fra * det opløseliggørende middel og opsamles i en opløsning, der indeholder glycosidet, hvorefter det opnåede kompleks eventuelt koncentreres, f.eks. ved lyofilisering, vakuumdialyse eller ultracentrifugering, eller renses 30 yderligere ved gradient centrifugering, kendetegnet ved, at lipiderne tilsættes, før komplekset koncentreres eller renses.

6. Fremgangsmåde ifølge et vilkårligt af kravene 1-5, kendetegnet ved, at antigenerne eller de 35 antigene determinanter er valgt blandt proteiner, polypeptider, glycoproteiner og lipoproteiner, især blandt - amfipatiske proteiner eller peptider med hydrofile og hydrofobe grupper, der stammer fra eller er membranproteiner eller membranpeptider fra med kappe forsynede virus, bakterier, mycoplasma, parasitter eller animalske 5 celler, eller sådanne proteiner eller peptider, der er fremstillet ved hybrid-DNA-teknik, eller molekyler, der er fremstillet syntetisk, - hydrofile proteiner eller peptider, der er gjort am-fipatiske ved, at der er koblet hydrofobe grupper der- 10 til, hvilke proteiner eller peptider kan stamme fra virus, bakterier, mycoplasma, parasitter eller hele celler eller være syntetiseret eller opnået ved hybrid-DNA-teknik, - amfipatiske proteiner eller peptider, der er opnået 15 ved, at utilgængelige hydrofobe dele af hydrofile proteiner er blevet gjort tilgængelige ad kemisk vej, hvilke proteiner kan stamme fra de ovenfor nævnte mikroorganismer eller celler eller være opnået ved hybrid-DNA-teknik eller være syntetiseret, 20. og blandt polysaccharider, oligosaccharider, oligo-og polynucleotider og haptener.