KR102458982B1 - 아주반트 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 10몰% 미만의 탄수화물 폴리술페이트 지방산 에스테르를 함유하는 탄수화물 일황산염 지방산 에스테르의 패미리 및 이의 제조 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 일황산염 탄수화물 에스테르는 하나의 황산염 에스테르 및 적어도 하나의 지방산을 포함하며, 특히 백신과 같은 면역학적 제품을 위한 아주반트로서 유용하다.

Description

아주반트{ADJUVANTS}
본 발명은 백신 아주반트(vaccine adjuvants)로서 황산화된 탄수화물 지방산 에스테르의 분야에 관한 것이다.
백신 접종은 인간과 동물의 건강에 있어서 전염병을 예방하고 제어하기 위한 가장 비용 대비 GYH과가 높은 수단 중 하나이다. 백신은 박테리아, 바이러스, 기생충, 재조합 (미생물) 유기체와 같은 변형된 생균 항원, 또는 불활성화된 바이러스, 불활성화된 박테리아, 불활성화된 기생충, 감염성 (미생물) 유기체의 하위 단위, 단백질, 다당류, 펩티드, 당 단백질, 다당류-단백질 접합체, 펩티드-단백질 접합체 등과 같은 불활성화된 (비-복제된) 항원 중의 하나를 함유한다. 많은 경우, 항원에 대한 면역 반응은 너무 낮다. 이때, 아주반트는 면역 반응을 자극하고 그에 따라 백신의 보호 작용을 증진시키기 위해 첨가될 수 있다.
기존의, 신생의 및 재발하는 전염병을 컨트롤하는데 있어서, 아주반트는 결정적인 역할을 한다. 아주반트는 (보호성) 면역 반응을 증가시키고, 반응의 유형을 유도하고, (보호성) 면역의 지속 기간을 증가시키고, (보호성) 면역에 대한 지연-시간을 단축시키며, 항원의 요구 투여량을 감소시키고, 필요한 백신 접종 횟수를 줄이는 것과 같은 상이한 기능을 가질 수 있다. 항원을 아주반트와 결합시킴으로써, 항원 단독에 의한 치료로는 도달할 수 없는 면역 수준에 도달할 수 있다.
또한, 아주반트는 소정의 보호 수준까지 도달하는 데 필요한 항원의 용량을 현저히 줄일 수 있고, 이로써 제품, 운송 및 보관 비용을 절감하고 생산 능력 및 가용성을 높일 수 있다. 저렴한 아주반트는 값비싼 항원의 상당 부분을 대체하고 이들 의약품에 대한 가난한 인간들의 접근을 용이하게 한다.
백반(수산화 알루미늄)은 안전한 아주반트의 전형적인 예이며 몇 가지 인간 백신에 적용된다. 그러나, 많은 경우에 있어서 아주반트 활성은 불충분하고, 보다 강력하지만, 적어도 안전한 아주반트가 필요하다.
또한, 황산염-치환된 탄수화물 지방산 에스테르 유도체가 공지되어 있다. 이들은 일반적으로 술포리피드-탄수화물(SL-탄수화물)이라고 부르며, 아주반트로서 이들의 합성 및 기능은 알려져 있다.
공지된 SL-탄수화물은 지방산(들)에 의한 탄수화물의 히드록실-기의 에스테르화, 및 술폰화제에 의한 탄수화물의 히드록실-기의 에스테르화와 같은 2가지 합성 단계에 의해 제조된다는 공통점이 있다. 이들 반응은 동시에 또는 임의의 순서로 수행될 수 있다. 두 반응은 모두 무작위적 반응이며, 이는 에스테르화에 사용할 수 있는 탄수화물의 상이한 히드록실 기들 사이에 차이가 없거나 제한되어 있음을 의미한다. 따라서, 황산염 기(들)와 지방산(들)은 치환된 탄수화물에 무작위로 분포되어, 다수의 상이한 화학 화합물의 혼합물을 생성시킨다.
무작위 합성 방법에 의해 형성된 화학적으로 구별되는 SL-탄수화물의 수는 탄수화물 주쇄 상의 반응성 부위(히드록실 기)의 수에 의존한다. 탄수화물을 1당량(탄수화물 1몰 당 1몰)의 술폰화제와 접촉시키면 상이한 수의 황산염 기를 갖는 탄수화물이 형성되고 상이한 위치에 황산염 기를 갖는 탄수화물이 형성된다. 예를 들어, 당 업계에 공지된 SL-탄수화물 혼합물은 특히, 황산염 기가 부재(본원에서 'ZERO'라고 언급됨), 하나의 황산염 기가 존재(본원에서 'MONO'라고 언급됨) 또는 다중 황산염 기가 존재(둘 이상의 황산염; 본원에서 'POLY'라고 언급됨)하는 탄수화물 에스테르의 혼합물로 구성된다. ZERO:MONO:POLY의 비는 WO 96/20222호에 개시된 식을 이용함으로써 통계적으로 측정할 수 있다. 이당류(술폰화에 사용 가능한 8개의 히드록실 기를 가짐) 1몰 당 술폰화제 1몰에서 최종 생성물의 ZERO:MONO:POLY의 이론 몰비는 37%:37%:26%이다. 탄수화물 1몰 당 술폰화제의 몰비가 낮을수록 형성되는 폴리올의 %가 감소하고 형성되는 ZERO의 %는 증가한다. 탄수화물 1몰 당 0.2몰의 술폰화제에서, ZERO:MONO:POLY의 이론적인 몰비는 82%:16%:2%이다.
성분들의 혼합물의 의약품으로서의 용도는 제품의 품질, 일관성 및 안전성과 관련하여 중요한 결점과 관련 될 수 있다. 특히 예를 들어 백신에서 아주반트의 경우, 건강한 피검체에서 대규모로 적용된다는 점을 강조하는 것이 중요하다. 따라서, 독성, 효능 및 품질은 중요한 전제 조건이다.
일반적으로 아주반트 활성(효능)과 부작용(독성) 사이에는 관계가 있고, 효능의 증진은 독성의 증가를 수반한다는 것이 일반적으로 인정되고 있다 (참조 예: Hilgers, Methods Mol. Biol. 626 pp. 251-9, 2010). 효능과 독성 사이의 비는 E/T 비라고 부르며, 아주반트를 정의할 때 중요한 매개 변수이다. 선행 기술의 SL-탄수화물을 포함하는 아주반트의 결점은 충분한 안전성의 부족(너무 높은 독성 또는 너무 낮은 E/T-비)이다.
아주반트의 투여량이 증가함에 따라 아주반트 활성 및 독성은 증진한다. 아주반트의 투여량을 줄이면 부작용도 역시 감소한다. 그러나, 허용 가능한 독성 수준에서 충분한 효능이 남아 있는지의 여부는 불확실하다. 따라서, SL-탄수화물 계 아주반트를 포함하여, 현존하는 아주반트보다 높은 효능/독성-비를 갖는 아주반트가 여전히 필요하다. 이러한 개선 사항은 유사한 독성을 갖는 보다 높은 효능, 보다 낮은 독성을 갖는 유사한 효능, 또는 보다 낮은 독성을 갖는 보다 높은 효능을 포함할 수 있다.
WO 01/402490호는 SL-단당류 및 SL-이당류, 이들 SL-단당류 및 SL-이당류의 제조 방법, 및 백신 아주반트로서 이들의 용도를 개시한다. SL-이당류 혼합물은 이당류 1몰 당 1몰당량의 술폰화제 및 이당류 1몰 당 7몰당량의 지방산 염화물(아실 염화물 또는 아코일 염화물이라고도 언급함)과의 반응에서 형성된다. 이것은 6,561가지의 상이한 가능한 화합물의 혼합물을 생성하며, 그의 상대적인 존재는 통계에 의해 측정될 수 있다. 이들 제품은 '코백신 HT(CoVaccine HT)'(영국 BTG plc)라는 이름으로 집중적인 연구 대상이었다. 하나 이상의 몰 당량의 술폰화제 및 하나 이상의 몰 당량의 지방산 염화물을 사용함으로써 수득된 혼합물은 그들의 아주반트 활성에 대해 시험하였다. 그러나, 시험된 SL-탄수화물 유도체의 독성은 인간에서 널리 사용하기에는 너무 높았다.
Hilgers 등(Vaccine 17, pp. 219-228, 1999), Blom과 Hilgers(Vaccine 29, pp. 3791-3801, 2011) 및 EP 2580226호는 SL-탄수화물-계 아주반트 및/또는 백신의 체온 상승 및 국소 자극과 같은 바람직하지 않은 부작용을 개시한다.
Hilgers 등(Vaccine 17, pp. 222-225, 1999)은 한편으로는 SL-탄수화물의 분자량과 다른 한편으로는 아주반트 활성 및 국소 반응성 사이의 관계를 개시한다. 국소 반응은 SL-탄수화물의 분자량 증가에 따라 증가하지만 아주반트 활성은 증가하지 않는다. 또한 1.7℃ 이하의 일시적인 체온 상승과 주사 부위에서의 4주 이하 동안의 팽창은 매우 흔하다. 구토는 예방 접종 이후 첫 1시간 동안 1 내지 25%의 경우에 발생한다. 근육 섬유의 지속적인 경도에서 중간 정도의 육아종성 염증은 백신 접종 이후 8주까지 주입 면에서 관찰된다(SL-시클로덱스트린이 보강된 돼지 키르코백신(circovaccaccine)에 대한 유럽 공공 평가 보고서(European Public Assessment Report, EPAR)).
EP2580226호는 국소적 부작용 및 체온 상승을 포함하는 SL-삼당류의 부작용을 개시한다. 부작용은 중요하며, 건강한 피검체에서 제품을 광범위하게 예방 적용하는 것을 금지한다. 또한 SL-이당류의 경우, 유의한 국소 및 전신 부작용은 Turkstra 등(Vaccine 29, pp. 3791-3801, 2011)에 의해 EP2580226호에 개시된 바와 같이 관찰되었다.
SL-이당류(코백신 HT)를 사용하는 인간의 임상 시험은 SL-이당류를 포함하여 일반적으로 SL-탄수화물과 관련된 또는 유해 반응의 결과로 인해 중단되었다. 공지된 SL-탄수화물-계 아주반트는 인간에게 사용하기에는 부적절한 것으로 간주된다.
WO 2008/005824호는 천연 킬러 T 세포 아고니스트(agonist) 및 생리학적으로 허용되는 비히클을 포함하는 조성물, 및 천연 킬러 T 세포를 자극하고 면역 반응을 강화시키는 방법을 개시한다. 개시된 화합물은 세라미드기 및 임의로 하나 또는 다수의 황산염기를 함유하는 단당류 및 이당류의 합성 유도체이다. 상기 화합물은 당 코어 상에 지방산을 포함하지 않으며, 따라서 본 발명의 화합물과 구별된다.
WO 01/402490호는 SL-단당류 및 SL-이당류 유도체의 혼합물을 반응 혼합물로부터 단리하는 방법을 개시한다. 열거된 기술은 결정화, 침전, 여과, 증발 투석 또는 한외 여과를 포함한다. 이들 방법은 SL-단당류 및 SL-이당류 유도체의 혼합물을 반응 혼합물로부터 단리시키거나, 또는 SL-단당류 및 SL-이당류 유도체의 혼합물을 특정의 부산물로부터 분리하는데 적합할 수 있지만, 이들은 본 발명의 SL-탄수화물의 MONO 이성질체를 POLY 이성질체로부터 정제하기에는 적합하지 않다.
요약하면, SL-탄수화물-계 생성물과 같은 강력한 아주반트의 단점은 그 독성이 상대적으로 높다는 것이며 백반과 같은 안전한 아주반트의 결점은 그 아주반트 활성이 상대적으로 낮다는 것이다.
이와 같이, 동일하거나 보다 낮은 독성에서 보다 높은 효능을 가져서, 백신 접종 동안 면역 반응을 추가로 증진시킬 수 있는 아주반트에 대한 수요가 있다. 본 발명은 이를 달성하는 화합물을 개시한다.
상기를 감안하여, 본 발명의 목적은 우수한 안전성 및 효능 프로파일을 가지며, 제조하기에 용이하고 저렴하며, 고품질 및 안정성이 우수한 아주반트를 제공하는 것이다. 본 발명의 또 다른 목적은 예를 들어, 백신을 제조하기 위한 항원 성분과 조합하여, 아주반트 제형에 사용될 수 있는 화합물을 제공하는 것이다.
본 발명은 적어도 하나의 황산염 기 및 적어도 하나의 지방산에 의해 치환된 탄수화물인 술포리피드-탄수화물을 포함하는 탄수화물 에스테르 혼합물, 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 아주반트로서, 상기 탄수화물 에스테르 혼합물의 10 몰% 미만이 하나 초과의 황산염 기에 의해 치환되는 것인 아주반트에 관한 것이다. 바람직하게는, 상기 탄수화물 혼합물은 황산염 기를 갖지 않는 탄수화물 에스테르 50 몰% 미만, 보다 바람직하게는 25 몰% 이하, 더욱 더 바람직하게는 1 0몰% 미만을 포함한다.
바람직하게는, 상기 탄수화물 에스테르 혼합물의 5몰% 미만, 보다 바람직하게는 2% 미만 및 가장 바람직하게는 약 0%가 하나 초과의 황산염 기에 의해 치환된다.
본 발명에서, 코백신 HT와 같은 술포리피드 탄수화물 혼합물의 독성은 하나 이상의 황산염 기에 의해 치환된 술포리피드 탄수화물("POLY"라고 언급함)의 기에 주로 기인하는 것으로 밝혀졌다. 하나의 황산염 기에 의해 치환된 술포리피드 탄수화물("MONO"라고 언급함)은 우수한 보조 효과를 나타내지만 독성은 현저히 낮다. 이와 같이 MONO가 풍부한 탄수화물 에스테르 혼합물의 효능/독성 비가 향상된다. 코백신 HT를 사용한 인간 시험 중단은 적어도 부분적으로 코백신 HT의 주성분 중의 하나인 POLY의 용인할 수 없이 높은 독성으로 인한 것이므로, 상기 혼합물로부터 POLY를 실질적으로 제거하면 새로운 인체 시험에서 허용가능한 독성이 발생해야 한다.
본 명세서에서, 탄수화물은 바람직하게는 4개 이상 10개 이하의 단당류 단위를 갖는 단당류, 이당류, 삼당류, 또는 선형 또는 환형 다당류이다. 바람직하게는, 탄수화물은 단당류, 이당류, 삼당류, 시클로덱스트린 또는 이들의 혼합물, 보다 바람직하게는 단당류, 이당류 또는 시클로덱스트린 또는 이들의 혼합물, 더욱 바람직하게는 이당류 및/또는 단당류이며, 가장 바람직하게는 상기 탄수화물은 이당류이다.
단당류는 일반식 C5H10O5의 펜토즈 및 일반식 C6H12O6의 헥소즈로부터 선택된 당이다. 또는, 단당류는 알로오스, 알트로오스, 글루코오스, 만노오스, 굴로즈, 이도오스, 갈락토오스, 탈로오스, 프시코오스, 프룩토오스, 소르보오스즈, 타가토오스, 아라비노오스, 리보오스, 자일로오스, 릭소오스, 리불로오스, 자일루로오스 및 이노시톨로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 것이다. 바람직하게는, 단당류는 프룩토오스, 갈락토오스 및 글루코오스로부터 선택된 하나 이상인 것이다.
이당류는 일반식 C12H22O11을 갖는 당이며, 바람직하게는 수크로오스, 말토오스, 락토오스, 락툴로오스, 셀로비오스, 트레할로오스, 겐티오비오스, 투라노오스, 이소말툴로오스 및 멜리비오스로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 것이다. 바람직하게는, 이당류는 락토오스, 말토오스 및 수크로오스로부터 선택된 하나 이상인 것이다. 가장 바람직하게는, 이당류는 말토오스 및/또는 락토오스이다.
삼당류는 일반식 C18H32O16의 당이며, 바람직하게는 라피노오스, 멜레지토오스, 말토트리오스, 이소말토트리오스, 라피노오스, 케스토스 및 네게로트리오스로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 것이다. 바람직하게는, 삼당류는 라피노오스, 멜레지토오스 및/또는 말토트리오스로부터 선택될 수 있다. 가장 바람직하게는, 삼당류는 라피노오스 및/또는 말토트리오스로부터 선택된다.
시클로덱스트린은 상기 정의된 바와 같이 다양한 수의 단당류를 갖는 환형 다당류다. 시클로덱스트린은 바람직하게는 α-, β- 또는 γ-시클로덱스트린(각각 6, 7 또는 8개의 당 단위)이다.
본원에서 탄수화물 에스테르는 치환된 탄수화물이다. 치환은 다른 그룹이 에스테르 결합을 통해 탄수화물의 히드록실-기를 통해 탄수화물에 부착됨으로써 본 명세서에서 치환된 탄수화물이 탄수화물 에스테르임을 의미한다. 치환은 황산염 기에 의한 것이고, 적어도 하나의 지방산에 의한 것이다. 따라서, 황산염 기는 탄수화물 히드록실기 상의 에스테르기를 통해 탄수화물에 공유 결합되고, 유사하게는 지방산은 탄수화물 히드록실기 상의 에스테르 기를 통해 탄수화물에 공유 결합된다.
본 명세서에서 황산염 기를 갖지 않는 탄수화물 에스테르는 하나 이상의 지방산에 의해 치환되었지만 황산염 기에 의해 비치환된 탄수화물 에스테르이다.
본 명세서에서 술포리피드 탄수화물은 하나 이상의 황산염 기에 의해 및 하나 이상의 지방산에 의해 치환된 탄수화물이다. 본 발명의 탄수화물 에스테르 혼합물은 일황산염 탄수화물 지방산 에스테르가 풍부하고, 하나 초과의 황산염 기에 의해 치환된 10몰% 미만의 탄수화물 에스테르를 포함한다.
이와 같이, 본 발명은 일황산염 탄수화물 지방산 에스테르가 풍부한 탄수화물 에스테르 혼합물을 포함하는 아주반트 제형, 및 예를 들어 백신에서 아주반트로서 그의 용도에 관한 것이다.
본 발명에 따른 탄수화물 에스테르 혼합물은 히드록실-기 상에서 황산염 기(-SO3 -)에 의해 치환된 탄수화물을 포함한다. 본원에서 황산염 기는 1가 양이온을 형성하는 원자 및/또는 분자로 구성된 군으로부터 선택된 중성 또는 이온성 치환체를 포함할 수 있다. 이 그룹의 구성 예로는 H+, Na+, K+, Li+ 및 NH4 + 및 트리에틸암모늄(Et3NH +)이 포함된다. 따라서, 황산염 기는 예를 들어 -SO3-, -SO3H, -SO3Na, -SO3K, -SO3Li 또는 -SO3NH4일 수 있다.
또한, 탄수화물은 탄수화물 분자 당 적어도 하나의 지방산에 의해 히드록실 기 상에서 치환된다. 바람직하게는, 탄수화물은 단당류의 경우 2 내지 4개, 이당류의 경우 2 내지 7개, 또는 상기 정의된 바와 같은 보다 큰 탄수화물의 경우 그보다 많은 갯수와 같이 다수의 지방산에 의해 치환된다. 보다 바람직하게는, 황산염 기에 의해 비치환된 탄수화물의 히드록실기의 실질적으로 모두는 지방산에 의해 치환된다. 이는 탄수화물이 황산염기의 존재에 더하여 바람직하게는, 지방산에 의해 실질적으로 포화됨을 의미한다. 이러한 관점에서, 실질적으로란, 단일 탄수화물 분자 상에서 적어도 50%, 바람직하게는 적어도 75%, 보다 바람직하게는 적어도 80% 또는 적어도 90%의 황산염에 의해 비치환된 모든 히드록실 기를 의미하며, 더욱더 바람직하게는 적어도 95%가 지방산에 의해 치환된다.
이와 같이, 본 발명의 탄수화물 에스테르 혼합물은 하나의 황산염 기 및 적어도 하나의 지방산에 의해 치환된 탄수화물이 풍부한 혼합물이다(즉, 일황산염 탄수화물 지방산 에스테르가 풍부함). 바람직하게는, 본 발명의 탄수화물 에스테르 혼합물은 탄수화물의 히드록실기 중 하나가 황산염기에 의해 치환되고, 탄수화물의 나머지 히드록실-기의 실질적으로 모두가 지방산에 의해 치환된 탄수화물을 포함한다. 본 발명의 탄수화물 에스테르 혼합물은 하나 초과의 황산염기에 의해 치환된 10몰% 미만의 탄수화물을 포함한다.
본원에서 지방산은 당 업계에 잘 공지되어 있으며, 임의의 지방산일 수 있다. 일반적으로, 본 명세서에서 지방산은 6 내지 18개의 탄소 원자, 바람직하게는 8 내지 12개의 탄소 원자를 갖는 지방산일 수 있다. 지방산은 포화 또는 불포화될 수 있고, 분지될 수 있지만, 바람직하게는 선형이다. 일반적으로, 지방산은 일반식 -O-(C=O)-(CH2)x-CH3(여기서, x는 4 내지 16임)에 따라 포화 지방산일 수 있다. 또한, 지방산은 일반식 -O-(C=O)-(CH2)x-CH=CH-(CH2)y-CH3(여기에서, x+y는 4 내지 14) 또는 일반식 -O-(C=O)CH2)x-CH=CH-(CH2)y-CH=CH-(CH2)z-CH3(여기에서, x+y+z는 2 내지 12임)이다.
바람직하게는, 지방산은 일반식-O-(C=O)-(CH2)x-CH3으로 이루어질 수 있고, 여기서 x는 4(헥사노산), 6(옥타노산), 8(데카노산), 10(도데카노산; 본원에서는 라우르산으로도 언급됨), 12(미리스트산으로도 알려진 테트라데카노산) 또는 14(팔미트산으로도 알려진 헥사데카노산)이다. 일반식 -O-(C=O)-(CH2)x-CH=CH-(CH2)y-CH3의 지방산은 더욱 바람직하며, 여기서 x+y는 14일 수 있다(예를 들어, 올레산). 일반식 -O-(C=O)-(CH2)x-CH=CH-(CH2)y-CH=CH-(CH2)z-CH3의 지방산은 더 바람직하며, 여기서 x+y+z는 12(예를 들어, 리놀레산)이다. 바람직하게는, 지방산은 선형이며, 6 내지 18개의 탄소 원자, 보다 바람직하게는 8 내지 12개의 탄소 원자를 갖는다. 가장 바람직하게는, 지방산은 데카노산 또는 도데카노산이다.
탄수화물이 하나 초과의 지방산에 의해 치환되는 경우, 상기한 바와 같은 임의의 지방산 조합이 가능하다. 일반적으로, 본원에 설명된 특징들의 임의의 조합은 본 발명의 문맥에서 설명된 바와 같이 고려된다.
하나 이상의 황산염 기에 의해 및 지방산에 의해 치환된 탄수화물을 제조할 때 이들 화합물의 형성에 필요한 반응이 무작위로 진행된다는 것은 일반적으로 알려져 있다. 이와 같이, N 히드록실-기를 갖는 탄수화물을 하나의 황산염 기에 의해 및 적어도 하나의 지방산에 의해 치환된 탄수화물로 전환시키는 과정만으로, 그 결과는 탄수화물 및 첨가량의 황산염 및 지방산에 의해 정의된 단일 분자 종이 아니다. 그 대신, 상이한 탄수화물의 혼합물이 얻어지며, 여기서 개별 탄수화물 분자는 0-N 황산염 기, 0-N 지방산 기 및 0-N 미반응된 (유리) 히드록실-기로부터 포함할 수 있다.
본 발명의 탄수화물은 WO 01/40240호에 기술된 바와 유사한 과정에 의해 형성된다. 그러나, WO 01/40240호와의 차이는 본 발명의 탄수화물 에스테르 혼합물이 연속하여 분획화에 의해 하나의 황산염 기에 의해 및 적어도 하나의 지방산에 의해 치환된 탄수화물이 풍부해져서, 10몰% 미만의 탄수화물 에스테르 혼합물이 하나 초과의 황산염 기에 의해 치환된다는 것이다. 바람직하게는, 5몰% 미만의 탄수화물은 하나 초과의 황산염 기에 의해 치환되고, 더욱 바람직하게는 2몰% 미만이 하나 초과의 황산염 기에 의해 치환되고, 더욱 더 바람직하게는 탄수화물 에스테르 혼합물 중의 본질적으로 모든 황산염 탄수화물 에스테르는 하나의 단일 황산염 기에 의해 치환된다.
이러한 차이의 효과는 아주반트로서의 탄수화물의 효능이 안정적으로 유지되거나 증가되는 반면, 독성은 실질적으로 더 낮거나 심지어 부재한다는 것이다. 따라서, 공지된 아주반트에 비해 E/T-비가 상당히 향상된 아주반트가 얻어지고, 그 중에서 SL-탄수화물-계 아주반트가 얻어진다.
따라서, 본 발명은 일황산염 탄수화물 지방산 에스테르(본 명세서에서 'MONO'라고 언급됨)를 포함하는 탄수화물 에스테르 혼합물의 제조 방법에 관한 것이다. 본 방법은 술포- 및 지방산-치환된 탄수화물의 혼합물의 합성을 포함한다. 술포 및 지방산 치환된 탄수화물은 또한 술포리피드-탄수화물(SL-탄수화물)이라고도 한다. 이어서, 하나의 황산염 기에 의해 치환되고 적어도 하나의 지방산에 의해 치환된 SL-탄수화물이 풍부한(일황산염 탄수화물 지방산 에스테르가 풍부함) 탄수화물 에스테르 혼합물은 분획화에 의해 탄수화물 에스테르 혼합물로부터 단리한다.
이와 같이, 본 발명은 또한 탄수화물의 에스테르화 및 분획화를 포함하는 일황산염 탄수화물 지방산 에스테르를 포함하는 탄수화물 에스테르 혼합물의 제조 방법으로서, 상기 탄수화물 에스테르 혼합물의 10몰% 미만은 하나 초과의 황산염 기에 의해 치환되고, 바람직하게는 탄수화물 에스테르 혼합물의 50몰%는 황산염 기를 갖지 않는 탄수화물 에스테르이고, 상기 에스테르화는 탄수화물을 술폰화제 및 반응성 지방산 아실 화합물과 반응시켜, 탄수화물 에스테르 혼합물을 수득하는 것을 포함하고, 상기 분획화는 상기 탄수화물 에스테르 혼합물로부터 하나 초과의 황산염 기를 갖는 탄수화물 에스테르를 제거하여, 일황산염 탄수화물 지방산 에스테르를 포함하는 혼합물을 수득하는 것을 포함하는 것인 탄수화물 에스테르 혼합물의 제조방법에 관한 것이다. 바람직하게는, 분획화는 또한 황산염 기를 갖지 않는 탄수화물 에스테르를 탄수화물 에스테르 혼합물로부터 제거하는 것을 포함한다.
바람직하게는, 탄수화물 에스테르 혼합물의 5몰% 미만, 보다 바람직하게는 2몰% 미만, 및 더욱 더 바람직하게는 약 0몰%는 하나 초과의 황산염 기에 의해 치환된다. 더욱 바람직하게는, 탄수화물 에스테르 혼합물은 황산염 기를 갖지 않는 탄수화물 에스테르 50몰% 미만, 바람직하게는 25몰% 이하, 더욱 바람직하게는 10몰% 미만을 포함한다. 또한, 본 발명은 아주반트로서 사용하기 위한 상기 방법에 의해 수득 가능한 일황산염 탄수화물 지방산이 풍부한 혼합물, 및 이렇게 수득된 일황산염 탄수화물 지방산 에스테르가 풍부한 혼합물을 포함하는 아주반트에 관한 것이다.
탄수화물의 치환은 탄수화물의 유리 히드록실 기 중 하나 이상의 탄수화물, 바람직하게는 용액 중에서의 에스테르화를 통해 일어난다. 이로써 탄수화물 에스테르가 생성된다.
황산염 기에 의한 치환은 술폰화제와 탄수화물의 반응을 통해 일어난다. 바람직한 술폰화제는 기체 SO3, HClSO3(클로로술폰산), SO3-피리딘, SO3-2-메틸피리딘, SO3-2,6-디메틸피리딘, SO3-디메틸포름아미드, SO3-트리메틸아미드, SO3-트리에틸아민, SO3-디메틸아날린, SO3-N-에틸모르폴린, SO3-디에틸아날린 및 SO3-디옥산이다. 가장 바람직한 것은 SO3-피리딘 및 SO3-트리에틸아민이다.
지방산에 의한 치환은 유사 반응성 아실 화합물, 즉 반응성 지방산 아실 화합물과 탄수화물의 반응을 통해 일어난다. 반응성 지방산 아실 화합물은 지방산 염화물, 브롬화물 또는 요오드화물, 지방산 티오에스테르, 지방산 무수물 또는 지방산 에스테르일 수 있다. 바람직하게는, 반응성 지방산 아실 화합물은 지방산 할로겐화물, 무수물 또는 티오에스테르, 보다 바람직하게는 지방산 염화물(때로 아코일 염화물 또는 아실 염화물이라 칭함)이다.
매우 바람직한 반응성 지방산 아실 화합물은 헥사노일 염화물, 옥타노일 염화물, 데카노일 염화물, 도데카노일 염화물(라우로일 염화물), 테트라데카노일 염화물(미리스토일 염화물), 헥사데카노일 염화물(팔미토일 염화물) 및 옥타데카노일 염화물(스테아로일 염화물 및 올레오일 염화물)이다. 데카노일 염화물 또는 도데카노일 염화물이 가장 바람직하다.
바람직한 치환 용매는 극성 용매, 바람직하게는 극성 비양자성 용매이다. 더욱 바람직하게는, 용매는 무수물이다.
바람직하게는, 용매는 피리딘, 디메틸포름아미드, N-메틸피롤리디논, 디메틸술폭시드, 아세토니트릴, 니트로메탄 또는 이들의 혼합물이다. 바람직하게는, 용매는 피리딘, 디메틸포름아미드, N-메틸피롤리디논 또는 이들의 혼합물이고, 가장 바람직하게는 용매는 무수 피리딘과 무수 디메틸포름아미드의 혼합물이다.
반응은 일반적으로 가능한 한 소량의 용매로 수행된다. 바람직하게는, 용매의 용량은 지방산 염화물과 같은 반응성 아실 화합물의 양과 거의 같다. 바람직하게는, 용매(들)는 용매가 예를 들어 침전, 여과, 결정화 또는 증발에 의해 반응 혼합물로부터 용이하게 제거될 수 있도록 선택된다.
반응성 아실 화합물에 의한 치환은 바람직하게는 약 60 내지 70℃의 온도에서 4 내지 8시간, 바람직하게는 약 6시간 동안 수행된다. 이어서, 반응 혼합물을 주위 온도에서 최대 18시간 동안 방치하는 것이 바람직할 수 있다.
술폰화제(들)와의 반응은 바람직하게는 주위 온도 내지 70℃에서 1 내지 4시간 동안 수행된다. 이어서, 반응 혼합물을 주위 온도에서 최대 18시간 동안 방치하는 것이 바람직할 수 있다.
하나의 양태에서, 탄수화물은 먼저 주위 온도에서 술폰화제와 반응하고,이어서 반응성 아실 화합물과의 반응을 위해 온도를 약 50 내지 70℃, 바람직하게는 55 내지 70℃, 및 보다 바람직하게는 약 60℃로 한다. 이와 관련하여, 온도는 공정에 결정적이지 않다는 것을 유의해야 한다. 이러한 특징은 광범위한 온도 및 광범위한 조건 하에서 공정을 동시에 수행할 수 있게 한다. 약 10℃ 정도의 낮은 주변 온도가 받아들여질 수 있다고 기대된다. 바람직한 주위 온도는 약 15℃ 이상, 보다 바람직하게는 약 18℃ 이상이다. 또한, 술폰화제와의 반응을 위한 주위 온도는 바람직하게는 약 50℃ 이하, 보다 바람직하게는 약 40℃ 이하, 가장 바람직하게는 약 25℃ 이하이다.
탄수화물은 먼저 술폰화제와 반응한 다음, 적어도 하나의 지방산 염화물과 반응할 수 있거나, 또는 그 반대일 수 있다. 바람직하게는, 탄수화물을 먼저 술폰화제와 반응시킨 후 반응성 아실 화합물과 반응시킨다. 더욱 바람직하게는, 탄수화물은 탄수화물 일황산염의 최대 수율을 제공하는 일정량의 술폰화제와 반응한다. 무수 탄수화물의 경우, 이는 탄수화물 1몰 당 술폰화제 1몰이다. 탄수화물 일수화물의 경우, 이는 탄수화물 1몰 당 1몰 내지 2몰의 술폰화제이다.
언급한 바와 같이, 가능한 한 소량의 용매가 사용되는 것이 바람직하다. 이러한 측면에서, 탄수화물은 가열에 의해 용매(들) 중에 용해되어 균질한 투명 용액을 생성하는 것이 바람직하다. 특히, 균질 용액을 제조하는 이 방법은 유기 용매(들)중에 비교적 불충분하게 용해되거나 유기 용매 중에 용해하기 어려운 탄수화물, 예를 들어 수크로오스 및 락토오스에 적합하다. 이들 탄수화물을 최소의 양 또는 용량의 유기 용매로 용해시키기 위해서는 온도를 바람직하게는 80℃ 초과로, 보다 바람직하게는 90℃ 초과로 높인다.
바람직한 양태에서, 치환이 완료된 후, 유기 용매(들) 중의 치환된 탄수화물을 NaOH, NH4OH, KOH, 트리에틸아민 또는 암모니아와 같은 무기 또는 유기 염기의 용액을 사용하여 중화시킨다.
치환된 탄수화물은 냉각에 의해 회수될 수 있어, 1개 상은 치환된 탄수화물이 풍부한 2개 또는 3개 이상의 별개의 상이 형성될 수 있다. 이는 여과, 경사 분리, 증발, 추출 등을 포함하는 당 업계에 널리 공지된 방법에 의해 회수될 수 있다. 잔류 용매 및 다른 화합물은 예를 들어 승온 및 감압 하에 증발시키거나 수성 상으로 세척함으로써 이 단계에서 제거된다.
이 단계에서, 치환된 탄수화물은 전술한 바와 같이 다양한 수의 황산염 기에 의해 무작위로 치환된 상이한 탄수화물 에스테르와 다양한 수의 지방산의 혼합물을 포함한다. 모든 경우에 있어서, 탄수화물은 적어도 하나의 지방산에 의해 치환된다. 즉, 미반응된 탄수화물은 본질적으로 부존재한다.
따라서 탄수화물 에스테르 혼합물은 다음을 포함할 수 있다:
- MONO는 탄수화물 에스테르 분자이며, 이것은 탄수화물 분자 당 하나의 황산염 기에 의해 및 적어도 하나의 지방산 에스테르에 의해 치환된다(일황산염 탄수화물 지방산 에스테르).
- POLY는 탄수화물 에스테르이며, 이것은 탄수화물 분자 당 하나 초과의 황산염 기에 의해 및 적어도 하나의 지방산 에스테르에 의해 치환된다.
- ZERO는 적어도 하나의 지방산 에스테르가 존재하지만 황산염 기를 함유하지 않는 탄수화물 에스테르이다.
바람직하게는, 본 발명의 탄수화물 에스테르 혼합물은 10몰% 미만의 POLY를 포함한다. 더욱 바람직하게는, 상기 혼합물은 5몰% 미만의 POLY를 포함하거나, 또는 더욱 바람직하게는 상기 혼합물은 2몰% 미만의 POLY를 포함한다. 가장 바람직하게는, 상기 혼합물은 검출 가능한 POLY를 포함하지 않는다(약 0% POLY).
더욱 바람직하게는, 상기 혼합물은 ZERO를 50몰% 미만, 보다 바람직하게는 25몰% 이하, 더욱 바람직하게는 10몰% 미만으로 포함한다.
탄수화물 에스테르 혼합물은 SL-탄수화물 혼합물을 포함하는 반응 혼합물의 분획화에 의해 MONO가 풍부하다. 분획은 액체 추출, 액체 크로마토그래피, 결정화, 전기 영동, 초임계 추출 또는 이러한 방법들의 조합과 같은 당 업계에 공지된 정제 방법에 의해 수행될 수 있다. 바람직하게는, MONO가 풍부한 탄수화물 에스테르 혼합물은 액체 추출 또는 액체 크로마토그래피에 의해 단리된다. 보다 바람직하게는, 본 발명의 탄수화물 에스테르 혼합물은 액체 크로마토그래피에 의해 단리된다.
액체 크로마토그래피의 정지 상은 실리카, 개질된 실리카, 알루미나, 플로리실(Florisil), 음이온-교환 수지, 예를 들어 Dow Chemical Company의 상표명 AmberjetTM, AmbersetTM 및 DowexTM 하에 입수 가능한 수지일 수 있다.
액체 크로마토그래피의 이동 상("용리액")은 n-헥산, n-헵탄, 이소프로판올, 에탄올, 메탄올, 트리에틸아민, 트리메틸아민, 암모니아 및 물과 같은 당 업계에 공지된 유기 액체로부터 선택된 단일 용매 또는 둘 이상의 용매의 혼합물일 수 있다. 바람직하게는, 용매는 예를 들어 등록 기관(예: FDA 또는 EMA)에 의해 '제한되는 용매' 또는 '독성이 낮은 용매'로서 분류되는 것과 같이 안전하다. 바람직한 용매는 바람직하게는 90:5:5 내지 50:30:20의 부피 비의 n-헵탄, 이소프로판올 및 트리에틸아민의 혼합물이다.
본 발명의 탄수화물 에스테르 혼합물은 합성 완료 후 반응 혼합물로부터 또는 그의 추출물로부터 단리된다. 바람직하게는, 이는 치환된 탄수화물과 부산물의 혼합물을 함유하는 반응 혼합물의 추출물로부터 단리된다. 추출물은 액체-액체 추출 또는 분별 침전에 의해 수득될 수 있다.
바람직한 방법은 n-헵탄 또는 n-헥산과 같은 유기 용매를 사용하는 반응 혼합물의 추출이다. 보다 바람직한 것은 상 분리를 촉진시키는 수성 상을 보충한 반응 혼합물의 n-헥산 또는 n-헵탄을 사용하여 추출하는 것이다.
본 발명의 탄수화물 에스테르 혼합물이 단리되어야 하는 반응 혼합물 또는 추출물은 바람직하게는 액체 크로마토그래피에 사용되는 용리액(이동 상) 중에 용해되거나 희석된다.
분획되는 반응 혼합물 또는 추출물의 용량은 액체 크로마토그래피에 사용된 컬럼 용량의 1/10 내지 1/100이다. 컬럼은 컬럼 용량의 1 내지 10배를 사용하여 용리된다. 용출은 단일 용매를 사용하거나, 또는 일정한 조성을 갖는 용매의 혼합물을 사용하거나(등용매 용리), 또는 운전 중에 변화하고 구배를 형성하는 용매의 혼합물을 사용할 수 있다(구배 용리). 바람직하게는 용리는 단일 용매 또는 일정한 조성을 갖는 혼합물을 사용한다. 컬럼은 1분당 1 내지 100mL의 유속으로 용출된다. 수집된 분획은 컬럼 부피의 1/10 내지 1/100이다. 액체 크로마토그래피는 4 내지 60℃, 바람직하게는 15 내지 25℃(주변 온도)에서 수행된다.
바람직하게는, 분획은 두 화학 반응의 완료 후에 수행하여, 지방산에 의한 치환 및/또는 황산염 기에 의한 치환 동안 형성된 부산물을 동시에 제거할 수 있다.
하기 기재된 실시예에서, 일황산염 탄수화물 지방산 에스테르가 풍부한 혼합물은 임의적 합성 방법에 의해 제조된 탄수화물 에스테르 혼합물로부터 단리된다. 제조 방법의 조건은 WO96/2008호 및 EP02580226호에 상세히 개시되어 있다.
MONO가 풍부한 탄수화물 혼합물은 MONO 대 POLY의 몰비를 특징으로 할 수 있다. 바람직하게는, MONO 대 POLY의 몰비는 10:1, 보다 바람직하게는 20:1, 보다 바람직하게는 50:1, 및 더욱 바람직하게는 100:1이다.
본 발명에 따라 MONO가 풍부한 혼합물의 제조 방법에 추가하여, 무작위 합성 및 액체 크로마토그래피에 의한 정제를 포함하며, 일황산염 탄수화물 지방산 에스테르를 포함하는 탄수화물 에스테르 혼합물을 생성하는 다른 제조 방법이 적용될 수 있으며, 상기 탄수화물 에스테르 혼합물의 10몰% 미만이 하나 초과의 황산염 기에 의해 치환된다.
예를 들어, 부위-선택적 합성(regio-selective synthesis)은 MONO(가 풍부한 혼합물)를 제조하는 대안적인 방법이 될 수 있다. 부위-선택적 제법은 탄수화물 분자의 히드록실 기의 일시적 보호(즉, 히드록실 기의 보호 및 탈-보호) 또는 효소 또는 촉매의 사용을 포함할 수 있다. 부위-선택적 합성의 이점은 단일 이성질체가 생성된다는 것이다.
MONO가 풍부한 혼합물을 제조하는 방법은 이들이 용이하고, 안전하고 저렴하다는 이점이 있고, 하나의 황산염 기 및 적어도 하나의 지방산에 의해 치환된 탄수화물이 풍부한 광범위하게 다양한 탄수화물 에스테르 혼합물을 얻는 데 이용될 수 있고, 여기에서 상기 탄수화물의 10몰% 미만은 하나 초과의 황산염 기에 의해 치환된다. 그러한 혼합물을 포함하는 아주반트는 공지된 술포리피드-탄수화물 아주반트에 비해 독성이 거의 또는 전혀 없고 효능은 동등하거나 또는 증가되기조차 한 것으로 나타났다. 이러한 이유로, 본 발명은 하나의 황산염기 및 적어도 하나의 지방산에 의해 치환된 탄수화물, 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하며, 상기 탄수화물의 10몰% 미만은 하나 초과의 황산염 기에 의해 치환된 것인 아주반트, 즉 하나의 황산염 기에 의해 및 적어도 하나의 지방산에 의해 치환된 탄수화물인 술포리피드-탄수화물, 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 탄수화물 에스테르 혼합물을 포함하는 아주반트(이때 상기 탄수화물 에스테르 혼합물의 10몰% 미만은 하나 초과의 황산염 기에 의해 치환되고, 바람직하게는 50몰% 미만의 탄수화물 에스테르 혼합물은 황산염 기를 갖지 않는 탄수화물 에스테르임)에 관한 것이다.
본 명세서에서 약학적으로 허용 가능한 담체는 상기 아주반트 및/또는 항원 화합물을 전달 또는 투여하는데 사용될 수 있는 임의의 담체이다. 바람직한 약학적으로 허용 가능한 담체는 생리 식염수, 생리 식염수 중의 불용성 화합물의 현탁액, 또는 수-비혼화성 화합물(예: 오일) 및 생리 식염수의 에멀젼, 바람직하게는 수-중-유 에멀젼이다.
생리 식염수는 당 업계에 공지되어 있고, 살아있는 피검체 내로의 주사에 적합한 임의의 용액이며, 단지 용액의 단순한 구성에 의해 그것이 주입되는 피검체에 부정적인 영향을 미치지 않거나 거의 일으키지 않을 것이다. 바람직하게는, 생리 식염수는 무균이다. 더욱 바람직하게는, 생리 식염수는 그것이 주입되는 피검체의 체액의 이온 농도(등장성)에 필적하는 pH 및 이온 농도를 갖는다.
생리학적 염 용액은 예를 들어, 염화물, 브롬화물, 인산염 및/또는 시트레이트의 Na, K, Li, NH4, Ca 및/또는 Mg-염과 같은 염을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 생리 식염수는 식염수, 인산염 완충 염수, 구연산 완충 염수, 등장성 이온 용액, 등장성 비이온 용액 등이다. 보다 바람직하게는, 생리 식염수는 염수 또는 인산염 완충 염수일 수 있다. 염수의 예는 0.9w/v% 염화나트륨의 물에 용해된 무균 용액이다.
또는, 약학적으로 허용 가능한 담체는 생리 식염수 중의 불용성 화합물의 현탁액이다. 이러한 맥락에서 불용성 화합물은 예를 들어 일황산염 탄수화물 지방산 에스테르를 흡수하는데 사용될 수 있는 불용성 유기 또는 무기 화합물이다. 바람직하게는, 불용성 화합물은 수산화 알루미늄인 공지된 아주반트 백반이다.
또 다른 바람직한 실시 양태에서, 약학적으로 허용 가능한 담체는 수-비혼화성 화합물 및 생리 식염수를 포함하는 에멀젼이다. 바람직하게는, 에멀젼의 유형은 수중유 에멀젼이다. 더욱 바람직하게는, 에멀젼은 무균이다.
수-비혼화성 화합물은 바람직하게는 액체, 더욱 바람직하게는 오일이다. 적합한 오일은 스쿠알란, 스쿠알렌, 식물 유 및 미네랄 오일로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함한다. 적합한 오일은 예를 들면, 대두유, 낙화생유, 카놀라유, 올리브유, 홍화유, 옥수수 유, 아몬드 유, 면실유, 에틸 올레에이트, 이소프로필 미리스테이트, 이소프로필 팔미테이트, 미네랄 오일, 미리스틸 알코올, 옥틸도데카놀, 행도유, 참기름, 미리스틸 올레에이트, 세틸 올레에이트, 미리스틸 팔미테이트를 포함한다. 다른 적합한 오일은 포화, 불포화 및/또는 부분적으로 수소화된 지방산의 생체 적합성 오일, 실리콘-계 오일, 예를 들어 올레산의 글리세롤 트리글리세라이드 에스테르와 같은 C12-C24 지방산의 포화 및 불포화 사슬로 구성된 트리글리세라이드와 같은 합성 오일, 테르펜, 리놀렌, 스쿠알란, 스쿠알렌, 스쿠알라민, 및 FC-40, FC-43, FC-72, FC-70, FC-75, 퍼플루오로헥산, 퍼플루오로옥틸 브롬화물(일명 퍼플루오로브론), 퍼플루오로옥틸요오딘으로 알려진 퍼플루오로-화합물을 포함하는 불소화 오일, 또는 이들의 임의의 혼합물을 포함한다. 오일이 스쿠알란이면 매우 좋다.
에멀젼의 경우, 아주반트는 농도가 1L 당 1 내지 640g, 바람직하게는 1L 당 2 내지 480g, 더욱 바람직하게는 1L 당 4 내지 320g인 오일을 포함하는 것이 일반적으로 바람직하다.
에멀젼에 적합한 수성 상은 주사 가능한 임의의 수용액, 바람직하게는 예를 들어 염수, 인산염 완충 염수, 시트르산 완충 염수, 등장성 이온 용액, 등장성 비이온 용액 등과 같은 생리 식염수일 수 있다. 수성 상의 양은 다양할 수 있으며, 일반적으로 바람직하게는 1L 당 616 내지 984g 또는 1L 당 680 내지 996g, 보다 바람직하게는 1L 당 680 내지 996g과 같이 1L 당 616 내지 996g일 것이다.
본 발명에 따른 특히 바람직한 아주반트 제형은 술포리피드-탄수화물을 포함하는 탄수화물 에스테르 혼합물을 포함하며, 이때 상기 탄수화물의 10몰% 미만은 1 내지 640g/L, 바람직하게는 1 내지 480g/L, 및 보다 바람직하게는 1 내지 320g/L와 같은 농도로 하나 초과의 황산염 기에 의해 치환된다.
우수한 결과는 오일이 스쿠알란이고 물이 인산염 완충 염수(PBS)인 수중유 에멀젼을 포함하는 아주반트로 달성되었다.
선택적으로, 아주반트는 유화제 또는 안정화제, 또는 유화제 및 안정화제의 조합을 포함한다. 이 목적에 적합한 세제를 포함하여, 주사 목적에 적합한 임의의 유화제 또는 안정화제를 사용할 수 있다. 적합한 유화제 또는 안정화제의 하나의 예는 폴리소르베이트 80(파리 소재의 Seppic 제품 Montannox 80)이다. 유화제 또는 안정화제가 사용되는 경우, 이들은 전형적으로 1L 당 1 내지 640g, 바람직하게는 1L 당 2 내지 480g, 및 보다 바람직하게는 1L 당 4 내지 320g의 (총)농도로 존재한다.
바람직하게는, 본 발명의 아주반트는 안정하고 무균이다. 바람직하게는, 아주반트 제형은 공극 크기가 0.05 내지 0.40㎛, 바람직하게는 0.15 내지 0.30㎛, 바람직하게는 약 0.22㎛인 멸균 필터를 통해 통과시킴으로써 멸균될 수 있다.
바람직한 양태에서, 본 발명의 아주반트는 이미 정의된 대로 1 내지 80g/L, 바람직하게는 4 내지 64g/L 또는 2 내지 40g/L, 보다 바람직하게는 4 내지 32g/L 및 가장 바람직하게는 4 내지 20g/L의 MONO가 풍부한 탄수화물 에스테르 혼합물, 1 내지 320g/L, 바람직하게는 2 내지 160g/L 또는 8 내지 256g/L, 가장 바람직하게는 4 내지 80g/L의 오일, 바람직하게는 스쿠알란, 및 1 내지 80g/L, 바람직하게는 4 내지 64g/L 또는 2 내지 40g/L, 가장 바람직하게는 4 내지 20g/L의 유화제 또는 안정화제, 바람직하게는 폴리소르베이트 80이고, 나머지는 수성 상, 바람직하게는 PBS로 구성된다.
바람직하게는, 본 발명의 아주반트 제형은 1 내지 80g/L MONO, 더욱 바람직하게는 2 내지 40g/L MONO, 더욱 더 바람직하게는 4 내지 20g/L MONO를 포함한다.
본 발명의 아주반트는 항원 성분에 의해 유발된 면역 반응을 증가시키는 것과 같이 의학적으로 적절하게 사용될 수 있다. 이러한 용도는 백신 접종과 같은 항원 성분에 대한 내성이 증진되어야 하는 적용에서 유리하다.
항원 성분은 동물 또는 인간에서 적응 면역 반응을 유발하는 임의의 물질이다. 항원 성분은 일반적으로 신체에 대해 외부 물질(예: 박테리아)이며, 일단 체내에서는 항원-특이적 B 및 T 세포의 활성화에 의해 특이한 면역 반응을 유도한다. 대안적으로, 항원 성분은 적응 면역계의 B-세포 수용체 또는 T-세포 수용체와 같은 항원 수용체에 의해 인식될 수 있는 임의의 분자 또는 분자 단편으로서 정의될 수 있다.
면역 반응의 증가는 예를 들어, 항원 성분에 대한 항체의 생성, 항원 성분에 대한 항체를 생성하는 B 세포의 수, 및/또는 항원 성분을 인식하는 T 세포의 수가 동물 또는 인간이 항원 성분에만 노출되는 정상 상태에 비교하여 증가한다는 의미이다. 증가된 면역 반응은 예를 들어 당 업계에 공지된 바와 같이 항체 역가를 측정함으로써 결정될 수 있다.
본원에서 항원 성분은 인간 또는 동물에서 면역 반응을 일으키는 임의의 화합물이며, 또한 일반적으로는 '면역원'이라고도 불린다.
본 발명의 아주반트는 인간 및 동물에서 항원 성분에 대한 면역 반응을 증가시킨다. 하나의 바람직한 양태에서, 본 발명의 아주반트는 인간에게 사용된다. 또 다른 바람직한 양태에서, 본 발명의 아주반트는 동물에서 사용된다. 바람직한 동물 종은 포유 동물이며, 돼지, 쥐, 토끼, 흰 족제비, 소, 양, 조랑말, 원숭이, 고양이, 개 및 코끼리를 포함한다. 바람직하게는, 항원 성분은 적어도 인간에서 면역 반응을 일으킨다.
아주반트 자체가 면역 반응을 나타내지 않거나 거의 발현하지 못한다는 것은 잘 알려져 있지만, 오히려 아주반트는 항원 성분에 대한 면역 반응을 증가시킨다. 또한, 면역 반응이 유도되는 항원 성분의 유형에 무관하게 아주반트는 이러한 효과를 갖는 것으로 알려져 있다. 따라서, 본 발명의 아주반트는 면역 반응을 증가시키기 위해 임의의 항원 성분과 함께 사용될 수 있다. 항원 성분은 예방 백신 및 치료 백신 모두에서 사용할 수 있다.
항원 성분은 다른 것들 중에서도, 박멸된 박테리아, 바이러스 또는 기생충과 같은 불활성화된 미생물, 그러한 미생물로부터 유래된 성분들, 및 화학적 또는 생물 공학적 수단에 의해 제조된 상기 미생물의 관련된 성분들을 모방하는 성분들일 수 있지만, 이들로만 국한되지는 않는다. 항원 성분은 또한 식물 또는 동물 유래의 알레르겐(allergen), 또는 화학적 또는 생물 공학적 수단으로 제조된 알레르겐을 모방하는 성분일 수 있다. 항원 성분은 또한 암, 면역 및 내분비 계 질환의 치료와 같은 치료 목적으로 면역 반응이 요구되는 숙주 유래의 성분일 수 있다.
예방 백신의 항원 성분의 예로는 인플루엔자 바이러스의 헤마글루티닌 및 노이라미니다제, 파상풍 톡소이드, 디프테리아 톡소이드, B형 간염과 같은 바이러스 또는 박테리아의 불활성화된 인플루엔자 바이러스, 불활성화된 바이러스, 불활성화된 광견병 바이러스, 불활성화된 박테리아, 바이러스, 말라리아, 유두종 바이러스 및 연쇄상 구균 속 폐렴(Streptococcus pneumonia), 혈호균 속 인플루엔자 b형(Haemophilus influenza type b), 나이세리아 속 수막염(Neisseria meningitides)의 다당류와 다당류-단백질 접합체이다. 바람직하게는, 항원 성분은 인플루엔자 항원 및/또는 말라리아 항원을 포함한다.
알레르기 치료용 백신의 항원 성분의 예는 풀, 쑥, 자작 나무, 알더, 헤이즐 및 관목, 집 먼지, 동물, 진균류, 음식 및 곤충으로부터의 알레르겐을 포함한다.
암 또는 면역학적 또는 내분비 장애의 치료용 백신의 항원 성분의 예는 호르몬 또는 인자(예를 들어, 생식선 자극 호르몬 방출 호르몬, 혈관 내피 성장 인자, 안지오텐신 호르몬 또는 호르몬)와 같은 숙주 성분을 분리 또는 모방한 (당-)단백질 또는 펩티드-단백질 접합체 및 암 세포 항원을 포함한다.
본 발명은 또한 상기 정의된 바와 같은 아주반트 및 항원 성분을 포함하는 백신을 제공한다. 바람직하게는, 상기 백신은 수중유 에멀젼을 포함하고, 더욱 바람직하게는 상기 백신은 상기 정의된 바와 같은 하나 또는 몇몇의 항원 성분을 포함한다.
백신의 제조를 위해, 즉시-사용할 수 있는 액체 항원 성분은 본 발명에 따른 즉시-사용할 수 있는 아주반트 제형과 1:100 내지 100:1, 바람직하게는 1:50 내지 50:1, 더욱 바람직하게는 1:25 내지 25:1, 더욱 바람직하게는 1:10 내지 10:1과 같은 적절한 용량 비로 혼합할 수 있다. 동결 건조된 항원 성분의 경우, 동결 건조된 항원 성분은 백신 1회분의 경우 0.1 내지 2 mL와 같이, 본 발명에 따른 즉시-사용할 수 있는 아주반트 제제를 적절한 용량으로 용해시킬 수 있다.
백신은 1회당 0.01 내지 80mg, 바람직하게는 0.05 내지 80mg, 보다 바람직하게는 0.05 내지 40mg, 보다 바람직하게는 0.1 내지 24mg, 보다 바람직하게는 0.25 내지 20mg 및 가장 바람직하게는 0.25 내지 16mg의 본 발명에 따른 탄수화물 에스테르 혼합물을 아주반트로서 포함할 수 있다(즉, 탄수화물의 10몰% 미만이 하나 초과의 황산염 기에 의해 치환되며, 하나의 황산염 기에 의해 및 적어도 하나의 지방산에 의해 치환된 탄수화물을 포함하는 탄수화물 에스테르 혼합물). 이는 1회당 1 내지 320mg, 바람직하게는 2 내지 160mg, 및 보다 바람직하게는 4 내지 80mg의 수-비혼화성 액상, 바람직하게는 오일, 및 보다 바람직하게는 스쿠알란, 및 1회당 0.25 내지 80mg, 바람직하게는 0.5 내지 24mg, 보다 바람직하게는 1 내지 20mg(총)의 하나 이상의 유화제 또는 안정화제, 바람직하게는 폴리소르베이트 80(Motannox 80 PPI)을 포함한다. 백신의 1회분은 단일 주사량이며, 예를 들어 0.1 내지 2.0mL의 주사용 액체일 수 있다. 항원 성분의 양은 백신의 투여량으로서 항원 성분의 정체에 크게 의존하며, 1회당 0.1 내지 1000㎍, 바람직하게는 1회당 1 내지 100㎍이다.
본 발명은 또한 전술한 바와 같은 아주반트를 포함하고, 임의로는 분말, 용액 또는 에멀젼과 같은 항원 성분을 포함하는 제제를 추가로 포함하는 부품들의 키트를 제공한다. 또한, 상기 키트는 주사기, 바늘, 부피측정 부품 및/또는 주사 가능한 액체 뿐만 아니라, 키트에 포함시키기에 적합한 백신 접종 기술 분야에 공지된 다른 부품들을 포함할 수 있다. 아주반트 및 항원을 개별적으로 제조, 수송 및 저장하거나, 또는 아주반트 및 항원을 개별적으로 투여하는 것은 바람직할 수 있다. 이러한 경우, 아주반트 제법은 별도의 바이알 또는 미리 채워진 주사기에서 공급할 수 있다.
도 1은 종래 기술의 SL-탄수화물 및 본 발명의 MONO가 풍부한 본 발명의 탄수화물 에스테르 혼합물의 토끼 시험한 아주반트 제제의 고성능 박층 크로마토그래피(HPTLC)를 도시한다. 왼쪽에서 오른쪽으로: 코백신 HT（코백신 BV으로 제조）、S12（코백신 HT 유사 제제로 사내에서 제조）、M10-MONO（M10로부터 단리）、G12-MONO（G12로부터 단리）、M12-MONO（M12로부터 단리）、SL-탄수화물을 포함하지 않는 수중 수크알란형 에멀젼,코백신 HT（복제물）및 S12（복제물).
도 2는 재조합 R0.10C 항원+상이한 아주반트를 사용한 1차(연회색 컬럼) 및 2차 근육내 면역화(진회색 컬럼) 1일 후b의 토끼의 평균 체온(˚C)을 도시한다. S12（ZERO, MONO 및 POLY의 혼합물), M10-MONO, G12-MONO 및 M12-MONO의 용량은 1차 면역화에서 4mg 및 2차 면역화에서 8mg이었다. 1차 및 2차 면역화의 백반의 용량은 110μg이었다.
도 3은 토끼에서 항원 단독(개방형 마름모), 백반(회색 마름모), S12(검은 삼각형), M10-MONO(개방형 원), G12-MONO(회색 원) 및 M12-MONO(검은 원)의 효능/독성-비를 도시한다. 효능(Y-축)은 2차 면역화 이후 1주(28일)에 재조합 R0.10C 항원(상부 패널), 열대열 원충(Plasmodium falciparum)의 배우자 세포(gametocyte) 추출물(중간 패널) 및 열대열 원충의 분열체(schizont) 추출물(하부 패널)에 대한 기하학적 평균 ELISA 항체 역가(10log 값)로서 표시된다. 독성(X-축)은 1차 면역화 이후 하루(1일, 왼쪽 패널) 및 2차 면역화 이후 하루(22일, 오른쪽 패널)의 체온(˚C)으로서 표시된다.
도 4는 MONO, 즉 G10-MONO를 아주반트로서 접종한 토끼 1마리(도 4a) 및 POLY, 즉 G10-POLY 또는 M10-POLY 중의 하나를 아주반트로서 접종한 토끼 8마리(도 4b 내지 4i)에서 2차 면역화 이후 1주의 주사 부위의 사진을 도시한다.
도 4a: 821번 동물; 4 그룹; 아주반트 G10-MONO; 독성 점수=0.10; 역로그=1.
도 4b: 825번 동물; 5 그룹; 아주반트 G10-POLY; 독성 점수=5.51; 역로그=324,000.
도 4c: 832번 동물; 7 그룹; 아주반트 M10-POLY; 독성 점수=5.29; 역로그=194,400.
도 4d: 834번 동물; 5 그룹; 아주반트 G10-POLY; 독성 점수 4.99; 역로그 97,200.
도 4e: 839번 동물; 5 그룹; 아주반트 G10-POLY; 독성 점수=4.91; 역로그=81,000.
도 4f: 841번 동물; 5 그룹; 아주반트 G10-POLY; 독성 점수=4.29; 역로그=19,440.
도 4g: 843번 동물; 5 그룹; 아주반트 G10-POLY; 독성 점수=4.74; 역로그=54,432.
도 4h: 845번 동물; 7 그룹; 아주반트 M10-POLY; 독성 점수=6.11; 역로그=1,296,000.
도 4i는 850번 동물; 7 그룹; 아주반트 M10-POLY; 독성 점수=5.08; 역로그=121,500.
도 5는 1차 면역화 이후 1주+2차 면역화 이후 4주에 각각의 항-H3N2 항체 역가(y-축) 대 국소 반응 점수의 E/T-플롯을 도시한다. 6 마리 토끼 그룹은 0일과 21일에 H5N1+G10-MONO 또는 M10-MONO(마름모)를 또는 G10-POLY 또는 M10-POLY(네모)를 아주반트로서 접종하였다. 항체 역가 및 국소 반응은 28일에 측정하였고 개별 데이터를 플로팅하였다.
실시예
하기 실시예는 본 발명을 예시할 뿐이고 제한하는 것은 아니다. 실시예는 본 발명의 아주반트를 함유하는 백신을 주사한 동물에서 강력하게 증강된 면역 반응과 조합하여, 본 발명에 따른 MONO(들)가 풍부한 탄수화물 에스테르 혼합물의 예상치 못한 높은 안전성을 입증한다. 용어 MONO는 탄수화물 분자 당 하나의 황산염 기가 존재하는 탄수화물 지방산 황산염 에스테르(들)를 포함한다. 또한, 실시예는 POLY가 풍부한 탄수화물 에스테르 혼합물의 예상치 못한 높은 독성을 입증한다. POLY(들)라는 용어는 탄수화물 분자 당 둘 이상의 황산염 기를 갖는 탄수화물 지방산 황산염 에스테르(들)를 포함한다. MONO들 및 POLY들은 당 분야에 공지된 탄수화물 에스테르 혼합물의 3가지 주성분 중 2가지, 예를 들면, 코백신 HT이다.
본 발명에 따른 일황산염 탄수화물 지방산 에스테르 유도체의 제조:
본 발명에 따른 일황산염 탄수화물 지방산 에스테르는, 분획화 단계가 MONO가 풍부한 혼합물을 POLY(들 이상의 황산염 기에 의해 치환된 탄수화물 지방산 에스테르)로부터 분리하는 과정을 통합하는 것을 제외하고는, SL-탄수화물의 제조를 위해 당 업계에 공지된 방법에 따라 제조한다. 바람직하게는, MONO가 풍부한 혼합물은 또한 적어도 일부의 ZERO(황산염 기에 의해 비치환된 탄수화물 지방산 에스테르)로부터 분리된다.
일황산염 탄수화물 지방산 유도체의 합성은 탄수화물을 술폰화제와 접촉시키는 제1단계 및 상기 탄수화물을 반응성 지방산 아실 화합물과 접촉시키는 제2단계를 포함한다.
MONO를 ZERO 및 POLY로부터 분리하는 것은 합성 과정의 첫 단계 이후(즉, 탄수화물을 술폰화제와 접촉시킨 후) 또는 합성 과정의 2차 단계 이후(즉, 탄수화물과 반응성 지방산 아실 화합물의 반응 후)에 수행한다.
MONO를 ZERO 및 POLY로부터 분리하고 MONO를 다른 부산물로부터 (동시에) 정제하는 것은 실리카를 고정상으로서 사용하고 유기 용매의 혼합물을 이동상으로서 사용하는 액체 크로마토그래피를 통해 수행할 수 있다.
실시예 1: 일황산염 헵타(도데실) 말토오스('M12-MONO')
말토오스 일수화물(0.2몰, 68.4g)을 무수 피리딘(200g)에 용해시키고, 따뜻한(50℃) 무수 피리딘(300g) 중 0.5당량의 SO3·피리딘(0.1몰, 15.9g)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반하고 무기 황산염 함량을 이온-크로마토그래피 고성능 액체 크로마토그래피(IC-HPLC; Metrohm 821; Metrosep A supp 5-250/4.0 컬럼, 용리액으로서 0.1mM 탄산염 용액, 전도도에 의한 검출)로 측정하였다. 무기 황산염은 탄수화물과 반응하지 않는 술폰화제의 양을 나타내지만, 출발 물질에 존재하거나 공정 중에 반응 혼합물에 유입되는 물의 대신에 탄수화물과 반응하지 않는 술폰화제의 양을 나타낸다.
실리카(400g)를 220℃에서 4시간 동안 건조시키고 무수 피리딘(800mL)에 현탁시키고 투입구 및 배출구 커넥터 및 PVDF의 커넥터가 구비된 건식 유리 컬럼에 공급하였다. 실리카를 침전시킨 후, 무수 피리딘 중 50mL의 말토오스 일황산염 샘플을 도포하였다. 용리는 1L의 무수 피리딘, 이어서 1L의 무수 N,N-디메틸포름아미드로 수행하였다. 50mL의 분획물은 건조한 아르곤 또는 질소 하에 수집하고, 말토오스, 말토오스 일황산염 또는 말토오스 폴리술페이트의 존재를 확인하기 위하여 HPTLC 상에서 시험하였다(실리카 플레이트, 부탄올:이소프로판올:아세트산:포름산:물=10:3:26:6:4로 전개하고, 메탄올 중의 5% 황산을 분무하고 100℃에서 20분 동안 가열함). 말토오스는 무수 피리딘으로 용리되었고, 말토오스 일황산염은 무수 N,N-디메틸포름아미드로 용리되었다.
순수한 말토오스 일황산염을 함유하는 분획물을 수집하고, 모으고, 추가 합성에 사용하였다. 말토오스 함량은 Dubois 등(Anal. Chem. 28 pp. 350-355, 1956)에 따라 오르시놀/황산 시약에 의해 정량화하였다. 간단히 말하면, mL 당 0.1 내지 1μg의 탄수화물을 함유한 샘플 50μL에 70% 황산 중 2g/L의 오시시놀 용액으로 구성된 950μL 오르시놀 시약을 첨가하였다. 혼합물을 격렬하게 혼합하고 100℃에서 20분 동안 배양하였다. 냉각 후 550nm에서의 흡광도를 측정하였다. 탄수화물 농도는 비치환된 탄수화물, 말토오스 일수화물에 기초한 표준 용액을 사용하여 계산하였다. 무수 피리딘을 첨가하고 그 용액을 60℃로 가온하였다. 8당량의 도데카노일 염화물을 첨가하고, 반응 혼합물을 70℃에서 8시간 동안 유지시켰다. 일황산염 헵타(도데실) 말토오스의 형성은 HPTLC로 모니터링하였다(실리카 플레이트; 용량비 233:100:3.3의 n-헥산:디에틸에테르:아세트산으로 전개하고, 메탄올 중의 5% 황산으로 분무하고 100℃에서 20분 동안 가열함).
실시예 2: 일황산염 헵타(도데실) 수크로오스( 'S12')
ZERO, MONO 및 POLY를 포함하는 코백신 HT의 SL-수크로오스(본원에서 'S12'라고 언급됨)를 EP02133969호에 기술된 바와 같이 제조하였다. 100℃에서 4시간 동안 건조한 수크로오스(68.6g, 0.2몰)를 무수 피리딘(188g, 2.4몰)과 무수 N,N-디메틸포름아미드(388g, 5.3몰)에 녹였다. 반응 혼합물은 건조한 질소 하에 유지시키고 투명한 용액이 얻어질 때까지 90℃에서 2시간 동안 교반하였다. 합성 과정 동안 물과 습한 공기와의 접촉을 피하기 위해 주의를 기울였다. 실온으로 냉각시킨 후, 격렬하게 교반하면서 반응 혼합물에 SO3·피리딘(32g; 0.2몰, 1.0당량)을 첨가하였다. 실온에서 1시간 후, 샘플을 취하여 실시예 1에 기재된 바와 같이 IC-HPLC로 무기 황산염 농도를 측정하였다. 이어서, 용액을 60℃로 가온하고, 격렬하게 교반하면서 도데카노일 염화물(311g; 1.4몰; 7.1당량)를 첨가하였다. 4시간 후, 샘플을 수집하여 에스테르화 정도는 반-정량적 HPTLC로 측정하였다(실리카 플레이트; 용량비 233:100:3.3의 n-헥산:디에틸에테르:아세트산으로 전개하고, 메탄올 중의 5% 황산을 분무하고 100℃에서 20분 동안 가열함).
도데카노일 염화물의 추가 분량(75g; 0.3몰, 1.7당량, 총 8.8당량)은 격렬한 교반 하에 첨가하였다. 70℃에서 4시간 후, 샘플을 수집하고 반-정량적 HPTLC로 분석하여 에스테르화가 완료되었음을 확인하였다. 용매는 회전 증발기(Buchi 제품)에서 승온(60℃) 및 감압(<20mBar)으로 용매를 제거하였다. 잔류물은 냉 메탄올(4℃) 중에서 최종 농도 20w/w%로 용해시켰다. 격렬하게 교반한 후, 혼합물을 밤새 4℃에서 유지시켜 갈색 점성의 하부 상 및 액체 상부 상을 생성시켰다. 상부(메탄올) 상을 수집하고 하부 상의 추출은 밤새 4℃에서 상 분리하면서 냉 메탄올(4℃)로 여러 번 반복하였다. 메탄올 추출물(상부 상)을 모으고 50mL 폴리프로필렌 튜브에서 3,000rpm으로 5분 동안 원심 분리하여 정화시켰다(1,200g). 상등액을 수집하고, 모으고, 메탄올은 회전 증발기(Buchi 제품)에서 승온(40℃) 및 감압(<20mBar)으로 증발시켜 제거하였다.
S12의 조성은 실시예 1에 기술된 바와 같이 반-정량적 HPTLC에 의해 측정되었다.
미분획물 S12의 성분(코백신 HT의 내부 당량)(HPTLC에 의해 측정되고 몰%로 표시되고; 비교를 위해 원래의 코백신 HT의 성분이 포함되어 있음)
시험 항목 도데실수크로오스의 플래시 크로마토그래피 분획물의 조성
ZERO MONO POLY
S12 39% 46% 15%
코백신 HT 32% 41% 28%
실시예 3: 일황산염 테트라(도데실) 갈락토오스('G12-MONO')
일황산염 테트라(도데실) 갈락토오스(본원에서 'G12-MONO'라고 언급됨)는 실시예 2에서 수크로오스에 대해 기술된 바와 유사한 방식으로 갈락토오스를 반응시켜 제조하였다. 갈락토오스(36.4g, 0.2몰), 무수 피리딘(161g), 무수 N,N-디메틸포름아미드(197g), SO3·피리딘(31.2g; 0.2몰, 1당량) 및 도데카노일 염화물(268g; 1.2몰, 6.2당량)는 실시예 2에 기재된 바와 같이 반응시켰다. IC-HPLC로 측정된 무기 황산염 함량 11%이고, 이때 평균비는 갈락토오스 1몰 당 0.89몰의 황산염을 제공한다. ZERO가 풍부한 분획물(본원에서는 'G12-ZERO'라고 언급됨)은 100w/w% ZERO를 함유하고 있다(표 2). MONO-풍부한 분획물(본원에서 'G12-MONO'라고 언급됨)은 25몰%의 ZERO 및 75몰%의 MONO를 함유하였다.
액체 크로마토그래피에 의해 수득된 도데실갈락토오스 유도체의 3가지 분획물의 조성(LC-MS에 의해 분석되고 몰%로 표시됨)
도데실 갈락토오스의 플래시 크로마토그래피 분획물의 조성
ZERO MONO POLY
황산염 함량 0 1 1 ≥2
지질 함량 5 4 3 ≤3
G12-ZERO 분획물 100% 0% 0% 0%
G12-MONO 분획물 25% 75% 0% 0%
실시예 4: 일황산염 헵타(도데실) 말토오스('M12-MONO')
일황산염 헵타(도데실)말토오스(본원에서 'M12-MONO'라고 언급됨)는 일황산염 헵타(도데실) 수크로오스에 대해 실시예 2에 기재된 바와 같이 말토오스 일수화물(36.6g; 0.1몰), 무수 피리딘(97g), 무수 N,N-디메틸포름아미드(199g ), SO3·피리딘(31.7g; 0.2몰; 2당량) 및 도데카노일 염화물(224g; 1.0몰; 10.4당량)을 사용하여 제조하였다. 탄수화물 에스테르 혼합물 M12를 산출하기 위해 무기 황산염 함량은 63%이었고, 이로부터 말토오스 몰 당 0.76몰의 황산염의 평균 비를 계산하였다.
M12의 분획화 결과는 표 3에 요약되어 있다. M12-MONO는 78몰%의 일황산염 헵타(도데실) 말토오스 및 22몰%의 일황산염 헥사(도데실) 말토오스를 함유하는데, 이는 MONO가 포화된 지방산의 양보다 적게 수득될 수 있음을 확인한다.
1회 또는 2회의 플래시 크로마토그래피에 의해 수득된 도데실말토오스 유도체의 3가지 분획물의 조성(LC-MS에 의해 분석되고 몰%로 표시됨)
도데실말토오스의 플래시 크로마토그래피 분획물의 조성
ZERO MONO POLY
황산염 함량 0 0 1 1 2 3
지질 함량 8 7 7 6 6 5
M12-ZERO 분획물 61% 28% 11% 0% 0% 0%
M12-MONO 분획물 0% 0% 78% 22% 0% 0%
M12-POLY 분획물 0% 0% 0% 0% 87% 13%
실시예 5: 일황산염 헵타(데실) 말토오스('M10-MONO')
일황산염 헵타(데실) 말토오스(본원에서 'M10-MONO'라고 언급됨)는 일황산염 헵타(데실) 수크로오스에 대해 실시예 3에 기술된 바와 같이 제조하였다. 말토오스 일수화물(36.6g; 0.1몰), 무수 피리딘(97g), 무수 N,N-디메틸포름아미드(199g), SO3·피리딘(31.7g; 0.2몰; 2당량) 및 데카노일 염화물(154.9g; 0.8몰; 9.7당량)가 사용된 양이었다. 술폰화 후, 무기 황산염 함량은 63%이었고, 이로부터 말토오스 1몰 당 0.76몰의 황산염의 평균 비가 계산되었다. 데카노일 염화물을 첨가하기 전에, 무수 피리딘 중의 무수 LiCl의 용액으로서 1당량의 LiCl을 첨가하여 황산 리튬의 침전물을 생성시키고 반응 혼합물로부터 무기 황산염을 완전히 제거하였다.
분획화된 M10의 LC-MS 분석은 MONO 분획물이 98몰%의 일황산염 헵타(데실) 말토오스 및 2몰%의 이황산염 헥사(데실) 말토오스를 함유함을 나타냈는데, 이는 높은 순도를 나타내는 것이다(하기 표 4).
1회 또는 2회의 플래시 크로마토그래피에 의해 수득된 데실말토오스 유도체의 3가지 분획물의 조성(몰%)
데실말토오스의 플래시 크로마토그래피 분획물의 조성
ZERO MONO POLY
황산염 함량 0 0 1 1 2 3
지질 함량 8 7 7 6 6 5
M10-ZERO 분획물 89% 11% 0% 0% 0% 0%
M10-MONO 분획물 0% 0% 98% 0% 2% 0%
M10-POLY 분획물 0% 0% 17% 0% 74% 9%
실시예 6: MONO의 보조 효과
본 발명의 일황산염 탄수화물 지방산 에스테르의 보조 효과를 토끼에서 측정하였다. 이 목적을 위해, 실시예 3의 분획물 G12-MONO(75몰% O-일황산염 O-테트라(도데실) 갈락토오스+25몰% O-펜타도데실갈락토오스), 실시예 4의 분획물 M12-MONO(78몰%의 O-일황산염 O-헵타(도데실) 말토오스+22몰%의 O-일황산염 O-헥사(도데실) 말토오스) 및 실시예 5의 분획물 M10-MONO(98몰%의 O-일황산염 O-헵타(데실) 말토오스+2몰%의 O-이황산염 O-헥사(데실) 말토오스)를 수중 스쿠알란의 서브미크론 에멀젼으로 제형하였고, S12(사내 코백신 HT 유사체), 백반(안전한 공지의 아주반트) 및 아주반트를 갖지 않는 대조군의 보조 효과와 비교하였다.
각각의 MONO 분획물에 대해, 0.22μm를 통과할 수 있는 조성물을 산출하는 적절한 양의 스쿠알란(독일 소재의 BASF 제품) 및 몬타녹스 80 PPI(프랑스 파리 소재의 Seppic 제품)를 측정하였다. 아주반트 제형은 EP1223969호에 기술된 바와 같이 1L 당 16.0g MONO 분획물(16mg/mL)의 최종 농도로 제조하였다. MONO, 스쿠알란, 폴리소르베이트 80, 초순수 및 인산염 완충 염수의 혼합물을 연속 냉각 하에 고압 유화제, 즉 미세유동화기(Microfluidizer Model Y110)를 통해 3회 통과시켰다. 수득된 아주반트 제형은 점도가 낮은 백색 또는 청색 에멀젼이었다. 이들 조성물을 0.22㎛ PES 필터(Corning Inc. 제품)를 통해 통과시키고 여액을 멸균 병으로 회수하였다. 이후의 아주반트 제형의 취급은 무균 조건 하에서 수행되었다. 아주반트 제형은 사용하기 전까지 밀봉된 병에 4℃로 보관하였다.
아주반트 M10-MONO는 분획물 M10-MONO 4g, 스쿠알란 8g, 몬타녹스 80 PPI 4g, 초순수 2g 및 인산염 완충 염수(PBS; Fisher Scientific 제품) 232g으로 제조하였다.
아주반트 G12-MONO는 4g의 G12-MONO 분획물, 8g의 스쿠알란, 4g의 몬타녹스 80 PPI, 2g의 초순수 및 232g의 PBS로 제조하였다.
아주반트 M12-MONO는 4g의 분획물 M12-MONO, 16g의 스쿠알란, 4g의 몬타녹스 80, 2g의 초순수 및 224g의 PBS로 제조하였다.
아주반트 S12(사내에서 제조한 '코백신 HT' 제제)는 11g의 비분획된 S12(실시예 2; 약 4.3g의 ZERO, 5.1g의 MONO 및 1.7g의 POLY를 함유함), 44g의 스쿠알란, 11g의 몬타녹스 80 PPI, 2g의 초순수 및 182g의 PBS로 제조하였다.
아주반트 S12는 강력한 아주반트에 대한 척도로서 사용되었다.
백반(덴마크 소재의 SSI 제품)은 안전한 아주반트에 대한 척도로서 사용되었다.
아주반트를 갖지 않는 항원은 음성 대조군으로서 사용되었다.
시험된 아주반트 제형의 조성은 표 5에 요약하였다.
아주반트 제형의 조성은 오르시놀/황산을 시약으로서 사용하여 탄수화물 농도를 측정하고 실시예 1에 기재된 바와 같이 550nm에서의 흡광도를 측정함으로써 확인하였다. 필요하다면, 아주반트 제형 중의 M10-MONO, G12-MONO 또는 M12-MONO의 농도를 1L 당 16.0g으로 조정하였다.
또한, 아주반트 제형은 HPTLC에 의해 분석하고 결과를 도 1에 도시하였다. SL-탄수화물, 스쿠알란, 폴리소르베이트 80 및 PBS의 에멀젼으로 구성된 아주반트 제형의 1μL 샘플을 HPTLC 플레이트 상에 도포하였다. 플레이트를 n-헥산, 디에틸 에테르 및 아세트산(용량 비 233:100:3.3) 중에서 전개시키고, 건조시킨 후 트리에틸아민, 2-이소프로판올 및 헵탄(용량 비 1:3:8) 중에서 전개시켰다. 탄수화물 반점은 메탄올 중의 5% 황산 용액을 플레이트를 분무하고 90℃에서 30분 동안 가열하여 시각화하였다.
유지 계수가 1.0(플레이트 정상임)인 반점은 ZWRO(0)를 나타내며 코백신 HT 및 S12의 아주반트 제형에서는 검출 가능하지만 M10-MONO, G12-MONO 및 M12-MONO의 아주반트에서는 검출되지 않는다. 유지 계수가 0.2 내지 0.5인 반점은 MONO를 나타내며, SL-탄수화물이 결핍된 수중 스쿠알란 에멀젼을 제외하고 모든 아주반트 제형에서 검출 가능하며, 이는 제약용 담체로서 사용되며 이 TLC 분석에서 대조군으로서 포함되었다. 유지 계수가 0.0 내지 0.1인 반점(플레이트의 바닥)은 POLY를 나타내며 보다 약하게 확장하는 폴리소르베이트 80을 나타낸다. POLY는 코백신 HT 및 S12의 아주반트 제형에서 검출 가능하며 폴리소르베이트 80은 SL-탄수화물이 갖지 않는 수중 스쿠알란형 에멀젼을 포함한 모든 제형에서 검출 가능하다.
TLC 패턴의 반-정량 분석은 코백신 HT에서 각각 32%, 41% 및 28%의 ZERO, MONO 및 POLY의 w/w%를 나타내었고 S12(Lite Vax BV에서 사내 제조한 코백신 HT-유사 제제)에서는 각각 39%, 46% 및 15%로 나타내었다. 따라서, 원래의 코백신 HT와 비교하여, S12 아주반트 제형은 비슷한 양의 MONO를 함유하지만 POLY의 양은 2배 낮았다.
신규한 화합물의 아주반트 활성을 입증하는데 사용된 항원은 Theisen 등이 기술한 바와 같이 R0.10C로 알려진 2가지 중요한 말라리아 항원의 재조합 융합 단백질이었다(Vaccine, 32, pp. 2623-2630, 2014). 항원은 상이한 지리적 기원의 열대열 원충 변종 패널의 전염 및 무성 생식을 차단하는 항체를 유도하는 것으로 밝혀졌다(Theisen 등, Vaccine, 32, pp. 2623-2630, 2014). 농도가 1mL 당 1.33mg인 R0.10C 항원의 원액은 네덜란드 Nijmegen 소재의 Radboud UMC에 의해 제공되었다. 1회분은 주사 1회당 10μg의 R0.10C 단백질이었다. 백신 용량은 주사 1회당 0.5mL이었다. 1차 면역화의 백신은 항원 제제 8μL, PBS 242μL 및 아주반트 제형 250μL로 구성되었다. 1차 면역화 이후에 부작용이 관찰되지 않았으므로, 2차 면역화를 위한 실험 아주반트(그룹 3 내지 6)의 1회분을 2배로 늘리기로 결정하였다. 1차 면역화에서 M10-MONO, G12-MONO 및 M12-MONO 아주반트의 1회분은 4.0mg이었고 2차 면역화에서는 8.0mg이었다. 1차 면역화에서 S12 아주반트의 1회분은 11mg SL-수크로오스이었고 2차 주사 시에는의 22mg SL-수크로오스이었다. 2차 면역화의 백신은 8μL의 항원 제제와 492μL의 아주반트 제형으로 구성되었다. 백반(덴마크 소재의 Staten Serum Institute 제품)의 1회분은 1차 및 2차 주사 모두의 경우에 110μg이었다.
아주반트 제형의 조성
시험 항목 아주반트 제형의 조성
SL-탄수화물 유도체 스쿠알란 몬타녹스 80 PPI 초순수
 PBS
(250g까지)
유형 g g g g g
S12 S12 11.0 44.0 11.0 2.0 182
M10-MONO M10-MONO 분획물 4.0 8.0 4.0 2.0 232
G12-MONO G12-MONO 분획물 4.0 8.0 4.0 2.0 232
M12-MONO M12-MONO 분획물 4.0 16.0 4.0 2.0 224
토끼의 코호트(cohort)는 SL-탄수화물-계 아주반트에 대한 적절한 반응을 제어하였다. 이 목적을 위해, 초기 동물 실험에서 주사 이후 1일에 체온이 1°C 상승하는 것으로 입증된 코백신 HT의 배치를 사용하였다. 코호트의 동물 6마리에게 20mg의 탄수화물(수크로오스) 지방산 황산염 에스테르(ZERO 6.4mg, MONO 8.2mg 및 POLY 5.6mg에 상응함), 스쿠알란 80g 및 20g의 폴리소르베이트 80의 1회분으로 코백신 HT의 참조 배치 0.5mL를 주사하였다. 투여 이후 1일에서 평균 체온은 정상 값보다 약 0.8℃ 높은 40.1(±0.4)˚C이었다.
2 내지 3kg의 20주령 암컷 토끼 6마리 그룹은 0일에 좌측 대퇴부에서(1차 면역화) 및 21일에 우측 대퇴부에서(2차 면역화) 근육내 접종하였다. 체온은 처치 이전과 이후에 상이한 시간 간격으로 측정하였다. 1차 및 2차 주사 이후 1일에 체온이 다소 증가(표 6 및 도 2 참고)한 반면, 기타 시간 간격에서는 정상 값이었다(데이터는 표시되지 않음).
1차 및 2차 면역화 이후 1일의 체온
그룹 시험 항목 1차 면역화 이후 1일의 체온 2차 면역화 이후 1일의 체온
평균 표준편차
(SD)		 평균 SD
1 아주반트 부재 38.9 0.2 39.3 0.4
2 백반 39.1 0.3 39.5 0.4
3 S12 39.4a 0.3 39.7a 0.5
4 M10-MONO 38.9 0.4 39.2 0.5
5 G12-MONO 39.1 0.5 39.3 0.2
6 M12-MONO 39.0 0.5 39.2 0.4
a 함께 접종한 나머지 4가지 아주반트 그룹보다 유의하게 높다.
3 가지 MONO 분획물(그룹 4, 5 및 6) 중 어느 것도 1회분 4mg 및 8mg이 평균 체온의 유의한 증가를 유발하지 않았다. S12(코백신 HT-유사물)는 1회분 11mg(4.3mg의 ZERO, 5.1mg의 MONO 및 1.7mg의 POLY를 함유함) 및 22mg(8.6mg의 ZERO, 10.2mg의 MONO 및 3.4mg의 POLY를 함유함)에서 1차 및 2차 면역화 이후 1일에 약 0.5℃의 체온을 상승시켰고, 이는 나머지 그룹(그룹 1, 2, 4, 5 및 6)의 전반적인 반응보다 유의하게 높았다. 체온은 하루 후에 정상 값으로 돌아왔다(데이터는 표시되지 않음). S12를 사용하는 경우 체온 상승은 코백신 HT 경우에 나타난 체온의 약 절반이었으며, 이는 코백신 HT에 비해 S12에서 POLY의 2배 낮은 1회분의 결과로 간주된다.
2차 면역화 이후 1주에, 동물을 안락사시키고 국소 반응은 Hilgers(Methods Mol. Biol. 626 pp. 251-9, 2010)에 기술된 바와 같이 주사 부위 2곳에서 점수내었다. 주사 부위 각각의 점수는 국소 반응의 크기(mm 단위의 길이x폭x깊이) 및 특성의 산물이고, 이때 다음과 같은 임의의 점수를 갖는다: 부종, 변색, 및 근육 구조의 상실의 경우는 1점, 섬유증, 육아종 및 결합 조직의 경우는 3점, 괴사 및 고름의 경우는 9점; 및 백신 잔류물의 경우는 12점.
동물 중 어느 것도 중등 또는 극심한 국소 반응을 나타내지 않았다. 약간의 동물에서 경미한 부작용이 나타났다. 동물 1마리(그룹 5)를 제외하고, 국소 반응의 크기는 0 내지 몇 mm이었고 국소 반응의 임의의 점수는 대부분 0이었고 때로는 1(근육 구조의 변색과 상실을 나타냄)이었다. 시험한 모든 동물들 중에서, 오직 1 마리 만이 점수가 1보다 높았고, 나머지 모든 동물들은 전체 점수가 1 이하이었다. 국소 반응은 예기치 않게 낮았으며 예상되는 채점 시스템의 탐지 한계는 이들 낮은 점수 사이의 차별에 부적합하였다. 따라서, 검출 가능한 국소 반응이 있는 그룹당 동물의 수는 최소한이지만 보고되었다(하기 표 7).
1차 면역화 이후 4주 및 2차 면역화 이후 1주의 국소 반응
그룹 시험 항목 코드 1차 면역화 이후 4주의 검출 가능한 불리한 국소 반응을 보이는 동물의 수a 2차 면역화 이후 1주의 검출 가능한 불리한 국소 반응을 보이는 동물의 수a
1 아주반트 부재 0/6 0/6
2 백반 0/6 1/6(홍조)
3 S12 1/6(홍조) 2/6(홍조/팽창)
4 M10-MONO 0/6 0/6
5 G12-MONO 1/6(변색, 근육 구조 상실) 1/6(육아종)
6 M12-MONO 0/6 0/6
a 국소 반응은 그룹당 6마리의 동물 중에서 유의하지만 최소한의 국부 효과를 나타내는 동물의 수를 나타낸다.
MONO의 국소 반응은 이전에 코백신 HT 또는 유사 제품의 경우에 관찰된 국소 반응보다 유의하게 낮았다.
혈액 샘플은 1차 면역화 이전(0일), 1차 면역화 이후 3주(21일) 및 2차 면역화 이후 1주(28일)에 채취하였다. 항체 역가는 Theisen 등에 의해 기술된 바(Vaccine, 32, pp. 2623-2630, 2014)와 같이 ELISA 플레이트를 코팅하기 위한 면역화에 사용된 항원 R0.10C를 사용하는 ELISA에 의해 측정되었다. 산술 평균 항체 역가(AMTs, Arithmetic mean antibody titres)와 표준편차(SDs)는 하기 표 8에 제공한다.
R0-10C를 항원으로서 사용하는 ELISA에 의한, 1차 면역화 이후 3주 및 2차 면역화 이후 1주의 항체 반응a
그룹 시험 항목 1차 면역화 이후 3주의 항체 반응 2차 면역화 이후 1주의 항체 반응
AMT SD AMT SD
1 아주반트 부재 46.5 22.3 1,763.3 2206.5
2 백반 48.7 39.7 1,923.8 1223.6
3 S12 1,992.6 1,797.7 106,070.7 70,664.9
4 M10-MONO 1,271.3 1,159.8 105,679.8 58,322.7
5 G12-MONO 479.8 231.5 60,490.8 26,248.5
6 M12-MONO 258.7 202.5 35,888.8 25,921.5
a 1차 면역화 이전 0일에서의 AMT±SD는 25.6±9.3이었다.
1차 면역화 이후 3주(21일) 및 2차 면역화 이후 1주(28일)의 기하 평균 항체 역가(GMTs)와 표준 편차(SDs) 및 역로그(10GMT)는 하기 표 9에 나타내었다.
R0-10C를 항원으로서 사용하는 ELISA에 의한, 1차 면역화 이후 3주 및 2차 면역화 이후 1주의 항체 반응a
그룹 시험 항목 1차 면역화 이후 3주의 10로그 항체 반응 2차 면역화 이후 1주의 10로그 항체 반응
GMT SD 역로그 GMT SD 역로그
1 아주반트 부재 1.6 0.2 41.9 2.9 0.6 804.5
2 백반 1.6 0.2 40.8 3.2 0.3 1,553.4
3 S12 3.1 0.4 1,325.6 5.0 0.2 91,061.2
4 M10-MONO 2.9 0.4 882.8 4.9 0.3 88,308.0
5 G12-MONO 2.6 0.2 428.2 4.7 0.2 55,964.3
6 M12-MONO 2.3 0.4 183.1 4.4 0.4 26,822.5
a 1차 면역화 이전 0일에서의 GMT±SD는 1.4±0.2이었고 역로그는 23.2이었다.
열대열 원충의 배우자 세포 추출물에 대한 항체 역가는 Theisen 등에 의해 기술된 바(Vaccine, 32, pp. 2623-2630, 2014)와 같이 측정하였다. 1차 면역화 이후 3주(21일) 및 2차 면역화 이후 1주(28일)의 기하 평균 항체 역가(GMTs)와 표준 편차(SDs) 및 역로그 값(10GMT)은 하기 표 10에 나타내었다.
열대열 원충의 배우자 세포 추출물을 항원으로서 사용하는 ELISA에 의한, 1차 면역화 이후 3주 및 2차 면역화 이후 1주의 항체 반응a
그룹 시험 항목 1차 면역화 이후 3주의 10로그 항체 반응 2차 면역화 이후 1주의 10로그 항체 반응
GMT SD 역로그 GMT SD 역로그
1 아주반트 부재 1.5 0.1 31.7 1.8 0.2 57.3
2 백반 1.6 0.2 39.5 2.0 0.1 102.2
3 S12 1.9 0.2 72.3 3.8 0.1 6,511.3
4 M10-MONO 2.2 0.2 152.9 3.9 0.2 7,976.9
5 G12-MONO 1.8 0.3 59.4 3.7 0.3 4,971.6
6 M12-MONO 1.7 0.1 51.5 2.8 0.2 586.3
a 1차 면역화 이전 0일에서의 GMT±SD는 1.5±0.1이었고 역로그는 32.5이었다.
항체 역가는 또한 Theisen 등에 의해 기술된 바(Vaccine 32, pp. 2623-2630, 2014)와 같이 열대열 원충의 분열체 추출물을 항원으로서 사용하는 ELISA에 의해 측정된 무성상 단계에 대하여 측정하였다. 1차 면역화 이후 3주(21일) 및 2차 면역화 이후 1주(28일)의 기하 평균 항체 역가(GMTs), 표준 편차(SDs) 및 역로그 값(10GMT)은 하기 표 11에 나타내었다.
열대열 원충의 분열체 추출물을 항원으로서 사용하는 ELISA에 의한, 1차 면역화 이후 3주 및 2차 면역화 이후 1주의 항체 반응a
그룹 시험 항목 1차 면역화 이후 3주의 10로그 항체 반응 2차 면역화 이후 1주의 10로그 항체 반응
GMT SD 역로그 GMT SD 역로그
1 아주반트 부재 1.6 0.1 43.5 1.7 0.2 54.1
2 백반 1.8 0.2 67.1 2.0 0.3 108.2
3 S12 NT NT NT 2.8 0.3 671.7
4 M10-MONO NT NT NT 3.0 0.2 991.3
5 G12-MONO NT NT NT 2.8 0.3 671.6
6 M12-MONO NT NT NT 2.5 0.4 297.5
a 1차 면역화 이전 0일에서의 GMT(SD)는 측정되지 않았다.
이들 생체내 데이터를 함께 취하고 도 3에 도시된 바와 같이, 본 발명의 MONO 분획물의 E/T-비는 ZERO, MONO 및 POLY의 혼합물인 공지된 S12의 E/T-비보다 우수하다. 본 발명의 MONO 분획물은 S12와 동등하거나 그보다 약간 더 효과적이며 백반보다 유의하게 더 효과적이다. 또한, 본 발명의 MONO 분획물은 백반과 동등하거나 그보다 약간 덜 독성이 있고 S12보다 유의하게 덜 독성이 있다. 즉, MONO가 풍부한 아주반트 제형은 코백신 HT(ZERO, MONO 및 POLY의 혼합물이고 강력한 아주반트의 척도임)의 효능을 백반(안전한 아주반트의 척도)의 안전성과 결합한 것이다. 그러한 E/T-비를 가진 아주반트는 백신을 포함한 기존의 및 신규한 면역학적 제품에서 광범위한 적용 대상이다.
S12 아주반트 제형에서 MONO의 투여량은 M10-MONO, G12-MONO 및 M12-MONO의 투여량과 유사하다. 그 데이터의 또 다른 결론은 MONO의 E/T-비가 ZERO 또는 POLY 또는 둘 모두의 E/T-비보다 유의하게 높다는 것이다.
실시예 7: 액체 크로마토그래피에 의한 일황산염 헵타(데실) 말토오스('M10-MONO')의 정제의 최적화
ZERO, MONO 및 POLY의 혼합물로부터 MONO 분획물을 단리하는 방법을 추가로 개선하기 위해, 액체 크로마토그래피를 정지상 및 이동상의 다양한 조합으로 수행하였다. 기공 크기 60Å, 메쉬 입자 크기 230 내지 400의 고-순도 등급의 건조된 40 내지 63μm의 실리카(Fluka의 카탈로그 번호 60737), 및 12v/v%의 트리에틸아민(Sigma-Aldrich의 카탈로그 번호 90340), 12v/v%의 2-이소프로판올(Sigma-Aldrich의 카탈로그 번호 24137; 유럽 약전) 및 76v/v%의 헵탄(Sigma-Aldrich의 카탈로그 번호 32287; 유럽 약전)으로 구성된 용리액을 사용하여 순도 및 수율 면에서 우수한 결과를 얻었다. 용리액 60mL 중의 20g의 M10을 용리액 약 500mL 중의 실리카 260g(진공 오븐에서 160℃ 및 <100mBar에서 적어도 3시간 동안 건조됨)으로부터 준비된 컬럼에 도포하였다. 상기 컬럼을 약 3L/h의 유속으로 용출시키고 50mL의 분획물을 채취하였다. 각 분획물은 헵탄 중의 20v/v%의 이소프로판올을 용리액으로서 갖는 HPTLC(Sigma-Aldrich Uniplate의 카탈로그 번호 Z26531-4)에 의해 분석되었다. M10-ZERO는 400 내지 600mL에서 용출되었다. M10-MONO는 800 내지 3,200mL에서 용출되었다. POLY는 컬럼 상에 남아 있었고 100% 2-이소프로판올로 용출시킬 수 있었다. 단일 액체 크로마토그래피를 수행한 결과, 반-정량적 HPTLC 분석에 의해 측정된 바와 같은 회수율은 M10-MONO는 >90%이었고, ZERO는 <2%이었고 POLY는 <2%이었다.
실시예 8: MONO와 POLY의 비교
MONO 및 POLY의 준비
갈락토오스 지방산 황산염 에스테르, 말토오스 지방산 황산염 에스테르 및 말토트리오스 지방산 황산염 에스테르는 실시예 1에 기술한 바와 같이 D-(+)-갈락토오스, D-(+)-말토오스 및 말토트리오스를 SO3·피리딘 및 데카노일 염화물(모두 Sigma-Aldrich로부터 얻음)와 접촉시킴으로써 합성하였다.
MONO, 즉 본원에서 일황산염 테트라(데실) 갈락토오스('G10-MONO')라고 언급된 갈락토오스 테트라데카노산 일황산염 에스테르, 본원에서 일황산염 헵타(데실) 말토오스라고 언급된 말토오스 헵타데카노산 일황산염 에스테르('M10-MONO') 및 말토트리오스 노나-/데카데칸산 일황산염 에스테르(본원에서 'T10-MONO'라고 언급됨)와 같은 MONO와 POLY, 즉 갈락토오스 데카노산 폴리술페이트 에스테르(본원에서 'G10-POLY'라고 언급됨), 말토오스 데카노산 폴리술페이트 에스테르(본원에서 'M10-POLY'라고 언급됨) 및 말토트리오스 데카노산 폴리술페이트 에스테르(본원에서 'T10-POLY'라고 언급됨)는 각각 건식 실리카를 고정상으로서 사용하는 예비 액체 크로마토그래피에 의해 갈락토오스 지방산 황산염 에스테르, 말토오스 지방산 황산염 에스테르 및 말토트리오스 지방산 황산염 에스테르로부터 단리하였다. MONO는 n-헵탄, 이소프로판올 및 트리에틸아민(76:12:12 용량%)의 혼합물로 용출되었고, POLY는 이소프로판올, 트리에틸아민, 메탄올 및 초순수(예: 50:20:20:10 용량%)의 혼합물로 용출되었다. 분획물은 n-헵탄, 이소프로판올 및 트리에틸아민(76:12:12 용량%)을 용리액으로서 및 실리카 플레이트를 사용하는 TLC로 분석하였다. 스팟은 메탄올 중의 5v/v% 황산을 분무하고 100℃에서 10 내지 20분 동안 가열함으로써 가시화하였다. 순수한 MONO 또는 POLY가 존재하는 분획물을 모으고 증발시켜 건조시켰다.
수중유 유형의 즉시-사용 가능한 무균 아주반트 제형은 MONO 또는 POLY, 트윈 80(Tween 80), 스쿠알란 및 인산염 완충된 염수(PBS)를 혼합하고, 그 혼합물을 고-압 유화기를 통해 3회 통과시키고, 그 서브미크론 에멀젼을 0.2㎛ 필터를 통과시키고, 그 에멀젼을 멸균된 용기 내에서 회수함으로써 제조하였다. MONO 또는 POLY, 트윈 80 및 스쿠알란의 농도는 40g/L이었다.
PBS 중의 MONO 및 POLY의 수성 조성물은 MONO 또는 POLY 1g 당 1g의 폴리소르베이트 80을 첨가함으로써 제조하였다.
MONO 및 POLY를 함유한 서브미크론 에멀젼의 안정성
4℃ 또는 실온에서 2주 후, POLY들 중의 하나가 존재하지만 POLY가 부재하거나 MONO들 중의 하나가 존재하는 에멀젼은 상 분리를 나타냈다. 이것은 MONO가 아닌 POLY가 에멀젼의 물리적 안정성에 유해한 효과를 갖는다는 것을 보여준다.
MONO 및 POLY의 시험관내 용혈 활성
MONO 및 POLY의 용혈 활성은 PBS 중의 택일된 화합물의 수성 조성물의 연속 희석액을 96개-웰 V-형 마이크로타이터 플레이트(microtiter plates)(Greiner 제품)에서 1v/v% 양의 적혈구와 혼합함으로써 측정하였다. 50% 용혈률을 제공하는 화합물의 농도는 주위 온도에서 1시간 동안 인큐베이션한 후에 측정하였다(하기 표 12). MONO, 즉 G10-MONO, M10-MONO 및 T10-MONO의 용혈 활성은 POLY, 즉 G10-POLY, M10-POLY 및 T10-POLY의 용출 활성보다 100배 내지 >3,000배 낮았다.
다양한 MONO 및 POLY의 용혈 활성
엔트리 화합물 50% 용혈률을 제공하는 농도(mg/mL)
A G10-MONO >10
B G10-POLY 0.003
C M10-MONO >10
D M10-POLY 0.3
E T10-MONO >10
F T10-POLY 0.1
MONO 및 POLY의 생체내 효과
그룹당 6마리 토끼 그룹은 0일('전-면역') 및 21일에 Madin Canine Kidney Cells(대만 소재의 Medigen Vaccine Corp.이 친절하게 제공함) 상에서 아주반트 유무에 상관없이 1회분 15μg HA로 H5N1으로 근육내 접종하였다. 면역 반응(하기 표 13 및 14a-c), 체온(하기 표 15), 체중 증가(하기 표 16) 및 국소 반응(하기 표 17 및 도 4a-i)은 개별 동물에서 예정된 시간 간격으로 측정하였다. 생체 내 및 생체 외 분석은 단일 블라인드 테스트로서 수행되었고, 처리는 테스트 완료 후에 기재하였다.
면역 반응에 대한 MONO 및 POLY의 효과
그룹당 6마리의 7개 동물 그룹의 혈액 샘플은 0일, 21일 및 28일에 수집하였다. 21일 및 28일의 개별적 혈청 샘플에서 및 0일의 7개 혈청 샘플의 6개 풀(pool)에서의 항체 역가를 측정하였다.
H5N1에 대한 혈장 응집 억제(HI, Hemagglutination Inhibition) 항체 역가는 세계보건기구에 의해 실험실 절차 '말 적혈구의 일부 변형된 혈장 응집-억제 분석에 의한 조류 인플루엔자 A(H7N9) 바이러스 감염의 혈청학적 검출'(2013년)에 기술된 바와 같이 측정하였다. 간단히 말해, 56˚C에서 30분 동안 전처리한 혈청 샘플 100μL에 프로테아제 갖지 않는 0.5w/v%의 소 혈청 알부민 분획물 V를 함유하는 냉 PBS('PBS/BSA'; Sigma 제품) 400μL 및 포장된 말 적혈구 50μL를 첨가하였다. 차가운 상태에서 30분 동안 원심분리한 후, 상등액 100μL를 회수하였고, PBS/BSA 중의 수용체 분해 효소(콜레라 여과수; Sigma 제품)의 용액 100μL를 첨가하고 37°C에서 밤새 보관하였다. 그 후, 전-처리된 혈청 샘플은 56℃에서 30분 동안 유지시켜 효소를 파괴시켰다. 1/10로 미리-희석시킨 이들 혈청 샘플 50μL는 PBS/BSA 중에서 순차적으로 2배 희석시켰다. 8개의 혈장 응집 단위를 함유하는 PBS/BSA 중의 H5N1 현탁액 50μL를 첨가하고, 실온에서 30분 동안 유지시켰다. 이어서, 60분 후에 PBS/BSA 중의 포장된 말 적혈구 0.75%의 현탁액 50μL 및 응집 억제율을 측정하였다.
전-면역 혈청의 풀은 HI 역가가 13이었다(하기 표 13). 아주반트를 갖지 않는 1차 면역화 이후의 HI 역가는 34이었고 아주반트 존재 시에는 57 내지 113이었다. 증가 배수는 2 내지 3이었다. 아주반트를 갖지 않는 2차 면역화 이후의 HI 역가는 135로 증가하였고, 아주반트 존재 시에는 359 내지 1,208로 증가하였다. 증가 배수는 3에서 9로 다양하였다.
H5N1로 1차 및 2차 면역화 이후 H5N1에 대한, 상이한 아주반트의 HI 항체 반응a
그룹 아주반트 1차 면역화 이후 3주 2차 면역화 이후 1주
　 GMT SD 역로그 증가 배수 GMT SD 역로그 증가 배수
1 PBS 5.1 0,4 34 7.1 0,8 135
2 G10-MONO 6.2 0,2 76 2 8.5 1,0 359 3
3 G10-POLY 5.8 0,9 57 2 8.6 0,4 381 3
4 M10-MONO 6.6 1,2 95 3 9.3 0,7 640 5
5 M10-POLY 6.8 0,8 113 3 10.2 0,7 1,208 9
a 1차 면역화 이전 0일에서의 GMT±SD는 3.7±0.3이었고 역로그는 13이었다.
H5N1(대만 소재의 Medigen Vaccine Corp.의 'H5N1'로 지정됨)에 대한 동종 항체 역가, 및 A/뉴저지 H1N1('H1N1'으로 지정됨; 네덜란드 Weesp 소재의 Solvay-Pharmaceuticals가 친절하게 제공하는 시판용 배치)과 A/파나마 2007/1999 H3N2('H3N2'로 지정됨; 네덜란드 Weesp 소재의 Solvay-Pharmaceuticals가 친절하게 제공하는 시판용 배치)에 대한 이종(교차-반응성) 항체 역가는 H5N1, H1N12 및 H3N2를 코팅 항원으로서 사용하는 ELISA로 측정하였다.
시험 조건은 예비 시험에서 검증되었다. ELISA 플레이트는 코팅 완충액(탄산염 완충액; 0.1M; pH=9.6) 1mL 당 항원 2μg으로 코팅하였다. 상기 플레이트는 세척 후, 인산염 완충 염수 중의 2w/v% 소 혈청 알부민(Sigma-Aldrich 제품)으로 차단시켰다. 혈청 샘플은 미리 희석시키고 연속하여, 인산염 완충 염수 중의 1w/v% 소 혈청 알부민 중에서 희석시켰다. 염소 항-토끼 IgG-HRPO 접합체(염소 항-토끼 IgG(H&L), F(ab)2 단편 - 친화성 정제된, 서양 고추냉이 퍼옥시다제 접합체, 1mg/mL; 미국 소재의 Novex 제품)는 1 w/v%의 소 혈청 알부민을 인산염 완충 염수 중에 1/10,000 희석시켰다. 기질로서 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘(Sigma-Aldrich 제품)의 즉시-사용할 수 있는 용액을 사용하였다. 효소 반응은 1 용량의 1M 황산을 사용하여 실온에서 20 분 후에 중단하였다. 역가는 적정 값에 대한 혈청 농도의 플롯의 선형 부분의 회귀 계수로부터 계산하고, 광학 밀도 1.0을 산출하는 혈청 농도의 로그 값으로서 나타내었다. 코팅 항원이 갖지 않는 경우에는 유의한 반응(log 값 <1)이 나타나지 않았다. 각 그룹에 대하여 기하 평균 역가(GMT), 표준 편차(SD) 및 역 로그 값을 계산하였다. 증가 배수는 아주반트 그룹의 역로그 값을 대조군(PBS) 그룹의 역로그 값으로 나누어 계산하였다. 0일(전-면역)에서의 H5N1, H1N1 및 H3N2에 대한 ELISA 역가는 낮았으며 시험 시스템의 배경으로 간주되었다.
아주반트를 갖지 않는 1차 및 2차 면역화 이후의 항-H5N1 항체 역가는 각각 11,676 및 488,299이었고 아주반트는 5배까지 증가시켰다(하기 표 14).
아주반트를 갖지 않는 2차 면역화 이후의 항-H1N1 항체 역가는 7,911이었고 아주반트는 3배까지 증가시켰다(하기 표 15).
1차 및 2차 면역화 이후의 항-H3N2 항체 역가는 각각 444 및 776이었고, 아주반트는 반응을 6배까지 증가시켰다(하기 표 16).
G10-POLY와 비교하여, G10-MONO는 H5N1, H3N2 및 H1N1에 대해보다 높은 ELISA 항체 반응을 나타냈다. M10-POLY와 비교하여, M10-MONO는 H5N1에 대한 반응과 유사하지만 H3N2와 H1N1에 대한 반응보다는 더 높은 반응을 나타내었다. 따라서, MONO는 상응하는 POLY보다 적어도 동등하고 종종은 보다 높은 활성을 나타낸다.
놀랍게도, G10-POLY 및 M10-POLY가 존재하는 면역화는 H3N2 및 H1N1에 대한 역가가 낮아지고, 때로는 아주반트를 갖지 않는 면역화보다 오히려 더 낮은 역가를 초래한다. 이는 면역원의 항원성 부분이 G10-POLY 및 M10-POLY에 의해 파괴되는 것을 설명한다. POLY의 이러한 유해한 효과는 심각한 단점인데, 백신의 품질과 안정성에 부정적인 영향을 미치기 때문이다. 이들 극적인 효과는 항원과 아주반트를 혼합하고 그 혼합물을 저온(4℃)에서 유지한 후 수일 이내에 이미 발생하기 때문에, 백신 제제 중의 POLY의 존재가 가능한 한 많이 배제되어야 한다.
면역화에 사용된 H5N1 및 검출에 사용된 H3N2와 H1N1이 상이한 기질 상에서 재배되고 정제될 때, 항-H3N2와 항-H1N1 항체는 교차-반응성, 바이러스성 항원을 인식한다. 교차-반응성 항원성 부분에 대한 유해한 효과는 교차-반응성 항원을 기반으로 하는 범용 인플루엔자 백신을 위한 아주반트로서는 POLY가 부적합하게 만든다.
H5N1을 사용한 면역화 이후 H5N1(면역원)에 대한 ELISA 항체 반응에 대한 상이한 아주반트의 효과a
그룹 아주반트 GMT SD 역로그 증가 배수
21일(1차 면역화 이후 3주)
1 PBS 4.07 0.30 11,676
2 G10-MONO 4.51 0.47 32,580 3
3 G10-POLY 4.16 0.27 14,576 1
4 M10-MONO 4.63 0.20 42,674 4
5 M10-POLY 4,77 0.25 59,068 5
28일(2차 면역화 이후 1주)
1 PBS 5.69 0.20 488,299
2 G10-MONO 6.14 0.19 1,377,014 3
3 G10-POLY 5.88 0.15 764,064 2
4 M10-MONO 6.37 0.06 2,364,597 5
5 M10-POLY 6.42 0.42 2,635,128 5
a 1차 면역화 이전 0일에서의 GMT±SD는 1.23±0.38이었고 역로그는 17이었다.
토끼에서 H5N1을 사용한 면역화 이후 H1N1에 대한 ELISA 항체 반응에 대한 상이한 아주반트의 효과a
그룹 아주반트 GMT SD 역로그 증가 배수
28일(2차 면역화 이후 1주)
1 PBS 3.90 0.31 7,911
2 G10-MONO 4.32 0.37 21,117 3
3 G10-POLY 3.63 0.43 4,278 <1
4 M10-MONO 4.35 0.42 22,312 3
5 M10-POLY 4.22 0.21 16,732 2
a 1차 면역화 이전 0일에서의 GMT±SD는 0.29±0.23이었고 역로그는 2이었다.
토끼에서 H5N1을 사용한 면역화 이후 H3N2에 대한 ELISA 항체 반응에 대한 상이한 아주반트의 효과a
그룹 아주반트 GMT SD 역로그 증가 배수
21일(1차 면역화 이후 3주)
1 PBS 2.65 0.50 444
2 G10-MONO 3.10 0.43 1,245 3
3 G10-POLY 1.91 0.39 81 <1
4 M10-MONO 3.12 0.33 1,329 3
5 M10-POLY 2.74 0.55 550 1
28일(2차 면역화 이후 1주)
1 PBS 2.89 0.44 776
2 G10-MONO 3.31 0.50 2,050 3
3 G10-POLY 1.73 0.53 54 <1
4 M10-MONO 3.67 0.65 4,711 6
5 M10-POLY 2.80 0.29 634 <1
a 1차 면역화 이전 0일에서의 GMT±SD는 0.52±0.33이었고 역로그는 3이었다
체온에 대한 MONO 및 POLY의 효과
면역화 이전과 이후에 매일 다양한 간격으로 토끼 각각의 체온을 측정하였다. 1차 면역화 이후 1일 및 2일의 체온의 평균±SD는 하기 표 17에 나와 있다. 상응하는 POLY 대조군과 비교하여, G10-MONO 및 M10-MONO는 체온이 더 낮게 상승하였다.
1차 면역화 이후 1일 및 2일의 체온 상승
1차 면역화 이후 1일(°C) 1차 면역화 이후 2일(°C)
그룹 아주반트 평균 SD 평균 SD
1 PBS 0,1 0,2 0,0 0,2
2 G10-MONO 0,3 0,4 0,0 0,2
3 G10-POLY 0,4 0,4 0,0 0,5
4 M10-MONO 0,5 0,4 0,1 0,2
5 M10-POLY 0,7 0,4 0,5 0,3
체중 증가에 대한 MONO 및 POLY의 효과
토끼 각각의 체중 증가를 모니터링하였고, 1차 면역화 이후 2주 동안의 평균 체중±SD 증가를 하기 표 18에 나타낸다. 실험 동물은 어리고 여전히 성장할 것으로 예상되었으므로, 보다 작은 체중 증가는 처치균의 바람직하지 않은 부작용으로서 성장 억제를 반영한다. 동물의 유사한 사육 및 배식 조건 하에서 G10-POLY는 G10-MONO보다 체중 증가가 유의하게 더 작았다.
1차 면역화 이후의 체중 증가
0일 개시일에서의 체중(g) 1차 면역화 이후 1주의 체중 증가(g) 1차 면역화 이후 2주의 체중 증가(g)
그룹 아주반트 평균 SD 평균 SD 평균 SD
1 PBS 3,332 316 41 76 80 50
2 G10-MONO 3,347 271 75 77 138 110
3 G10-POLY 3,292 217 17 25 38 21
4 M10-MONO 3,387 295 35 51 49 73
5 M10-POLY 3,292 242 38 111 53 40
면역화 이후 국소 반응에 대한 MONO 및 POLY의 효과
국소 반응은 28일째에 분석하였고, 각 그룹의 기하 평균 점수(GMS)±SD 및 역로그 값은 하기 표 19에 나타낸다. 2차 면역화 이후 1주에, G10-POLY 및 M10-POLY는 각각 12,261점 및 2,364점을 나타낸 반면, G10-MONO 및 M10-MONO는 각각 유의하게 보다 낮은 51점과 22점을 나타내었다. POLY에 대한 국소 반응의 면적은 직경이 2cm 이하이었고, 도 4b-i에 도시한 바와 같이 육아종과 괴사를 나타내었다.
1차 및 2차 면역화 이후 주사 부위에서의 국소 반응
그룹 아주반트 1차 면역화 이후 4주의 반응성 2차 면역화 이후 1주의 반응성
　 　 GMS SD 역로그 GMS SD 역로그
1 PBS 0,10 0,00 1 0,10 0,00 1
2 G10-MONO 0,21 0,28 2 1,70 1,40 51
3 G10-POLY 0,75 1,60 6 4,09 1,99 12.261
4 M10-MONO 1,26 1,32 18 1,34 1,37 22
5 M10-POLY 1,73 1,78 53 3,37 2,67 2.364
MONO가 아닌 POLY의 이러한 부작용은 본 발명을 명백하게 설명한다. 주목할만한 예는 G10-MONO 대 G10-POLY이다. G10-MONO는 G10-POLY와 비교하여, 2차 면역화 이후 1주에 항-H3N2 항체 반응이 40배나 더 높았고 항-H1N1 항체 반응은 5배 더 높았으며, 1차 면역화 이후 2주 동안 체중 증가는 4배 더 컸고, 1차 면역화 이후 체온 상승은 2배 더 낮았으며, 2차 면역화 이후 1주에 국소 반응 점수는 240배 더 낮은 것으로 판명되었다.
2차 면역화 이후 1주의 효능, 예를 들어 항-H3N2 항체 역가 및 독성, 예를 들어 국소 반응 점수에 대한 데이터를 결합함으로써 효능/독성(E/T)-비는 2,050/51의 G10-MONO가 40이고 54/12,261의 G10-POLY는 0.0044인 것으로 판명된다. 이는 G10-MONO의 E/T-비가 그의 POLY 대응물의 E/T-비보다 9,082배 더 크다는 뜻이다.
유사하게, M10-MONO 및 M10-POLY의 계산된 E/T-비는 각각 4,711/22=214 및 635/2,364=0.2686이며, 이는 M10-MONO를 M10-POLY와 비교할 때 그 E/T-비가 797배 더 크다는 뜻이다.
MONO와 POLY의 E/T-비의 차이는 MONO 또는 POLY 중의 하나에 의해 접종된 동물들의 개별 데이터를 나타내는 도 5에 추가 설명되어 있다.
요컨대 MONO와는 달리, POLY는 중요한 장점과 단점이 있다. 고 용혈 활성, 에멀젼의 신속한 불안정화 및 항원성 항원결정기의 파괴와 같이 관찰된 POLY의 시험관내 부작용은 POLY를 함유한 백신의 품질과 안정성에 부정적인 영향을 미친다. 전신 및 국소 유해 사례와 같은 POLY의 생체내 부작용은 백신의 생체내 성능, E/T-비 및 따라서 이익/위험 비에 대하여 부정적인 효과를 보인다. 따라서 백신을 포함한 의약품에서 POLY의 존재는 가능한 한 피해야 한다.
탄수화물 폴리술페이트 지방산 에스테르(POLY)가 배제된 탄수화물 황산염 지방산 에스테르는 의약품 및/또는 백신 아주반트로서 중요한 이점을 갖는다는 것이 밝혀졌다. 일반적으로 뚜렷한 활성 프로파일을 갖는 여러 활성 성분을 함유한 의약품의 개발 및 상업적 개발은 극도로 복잡하고 막대한 노력이 필요하며 실패 위험이 높다.
안전성, 효능 및 품질은 백신을 포함하여 의약품의 3가지 중요한 성공 요인이며, 이들 3가지 요인 중의 하나에 대해 부정적인 영향을 미치는 화합물은 가능한 한 많이 배제해야 한다. 본 발명은 유망한 백신 아주반트로서, 폴리술페이트 에스테르를 함유하지 않는 탄수화물 황산염 지방산 에스테르에 관한 것이다.

Claims (25)

  1. 적어도 하나의 황산염 기 및 적어도 하나의 지방산에 의해 치환된 탄수화물인 술포리피드-탄수화물을 포함하는 탄수화물 에스테르 혼합물, 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 아주반트로서, 상기 탄수화물 에스테르 혼합물의 10몰% 미만이 하나 초과의 황산염 기에 의해 치환된 것이고,
    상기 탄수화물이 단당류, 이당류, 삼당류 또는 이들의 혼합물이며,
    상기 탄수화물의 히드록실-기 중에서 하나는 황산염 기에 의해 치환되고, 나머지는 모두 지방산에 의해 치환된 것이며,
    상기 지방산이 6 내지 18개의 탄소 원자를 갖는 것인 아주반트.
  2. 제1항에 있어서, 상기 탄수화물 에스테르 혼합물의 5 몰% 미만이 하나 초과의 황산염 기에 의해 치환된 것인 아주반트.
  3. 제1항에 있어서, 상기 탄수화물 에스테르 혼합물이 황산염 기를 갖지 않는 탄수화물 에스테르의 50 몰% 이하를 포함하는 것인 아주반트.
  4. 삭제
  5. 제1항에 있어서, 상기 단당류가 알로오스, 알트로오스, 글루코오스, 만노오스, 굴로오스, 이도오스, 갈락토오스, 탈로오스, 프시코오스, 프룩토오스, 소르보오스, 타가토오스, 아라비노오스, 리보오스, 자일로오스, 릭소오스, 리불로오스, 자일루로오스 및 이노시톨로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상이고;
    상기 이당류가 수크로오스, 말토오스, 락토오스, 락툴로오스, 셀로비오스, 트레할로오스, 겐티오비오스, 투라노오스, 이소말툴로오스 및 멜리비오스로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상이고; 또는
    상기 삼당류가 라피노오스, 멜레지토오스, 말토트리오스, 이소말토트리오스, 케스토스 및 네게로트리오스로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 아주반트.
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 제1항에 있어서, 상기 지방산이 8 내지 12개의 탄소 원자를 갖는 것인 아주반트.
  9. 제1항에 있어서, 약학적으로 허용 가능한 담체가 생리 식염수, 생리 식염수 중의 불용성 유기 또는 무기 화합물의 현탁액, 또는 수-비혼화성 화합물과 생리 식염수의 에멀젼인 것인 아주반트.
  10. 제9항에 있어서, 수-비혼화성 화합물과 생리 식염수의 상기 에멀젼이 수중유형 에멀젼을 포함하는 것인 아주반트.
  11. 제10항에 있어서, 상기 수중유형 에멀젼을 구성하는 오일이 스쿠알란, 스쿠알렌, 식물 유 및 미네랄 오일로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 것인 아주반트.
  12. 제11항에 있어서, 상기 오일이 스쿠알란인 아주반트.
  13. 제1항에 따른, 의학적 용도를 위한 아주반트.
  14. 제13항에 있어서, 항원 성분에 의해 유발된 면역 반응을 증진시키기 위한 아주반트.
  15. 제14항에 있어서, 상기 항원 성분이 박테리아, 바이러스 또는 기생충, 또는 미생물로부터 유래된 성분 또는 성분들의 혼합물과 같은 살균된 미생물이거나; 또는 화학적 또는 재조합 DNA 기술에 의해 제조된 미생물의 관련된 항원 성분을 모방하는 성분 또는 성분들의 혼합물이거나, 또는 상기 항원 성분이 치료의 목적으로 면역 반응이 요구되는 알레르겐 또는 숙주 성분인 아주반트.
  16. 제1항 내지 제3항, 제5항 및 제8항 내지 제15항 중의 어느 한 항에 따른 아주반트 및 항원 성분을 포함하는 백신.
  17. 제16항에 있어서, 상기 항원 성분이 박테리아, 바이러스 또는 기생충, 또는 미생물로부터 유래된 성분 또는 성분들의 혼합물과 같은 살균된 미생물이거나; 또는 화학적 또는 재조합 DNA 기술에 의해 제조된 미생물의 관련된 항원 성분을 모방하는 성분 또는 성분들의 혼합물이거나, 또는 상기 항원 성분이 치료의 목적으로 면역 반응이 요구되는 알레르겐 또는 숙주 성분인 백신.
  18. 제1항 내지 제3항, 제5항 및 제8항 내지 제15항 중의 어느 한 항에 따른 아주반트 및 항원 성분을 포함하는 백신용 키트.
  19. 적어도 하나의 황산염 기 및 적어도 하나의 지방산에 의해 치환된 탄수화물인 술포리피드-탄수화물을 포함하는 탄수화물 에스테르 혼합물로서, 상기 탄수화물 에스테르 혼합물의 10 몰% 미만이 하나 초과의 황산염 기에 의해 치환된 것인 탄수화물 에스테르 혼합물로서,
    상기 탄수화물이 단당류, 이당류, 삼당류 또는 이들의 혼합물이며,
    상기 탄수화물의 히드록실-기 중에서 하나는 황산염 기에 의해 치환되고, 나머지는 모두 지방산에 의해 치환된 것이며,
    상기 지방산이 6 내지 18개의 탄소 원자를 갖는 것인 탄수화물 에스테르 혼합물.
  20. 삭제
  21. 탄수화물의 에스테르화 및 분획화를 포함하는, 일황산염 탄수화물 지방산 에스테르를 포함하는 탄수화물 에스테르 혼합물의 제조방법으로서,
    상기 탄수화물 에스테르 혼합물의 10몰% 미만이 하나 초과의 황산염 기에 의해 치환되고, 상기 에스테르화가 탄수화물을 술폰화제 및 반응성 지방산 아실 화합물과 반응시켜, 탄수화물 에스테르 혼합물을 수득하는 것을 포함하고,
    상기 분획화가 상기 탄수화물 에스테르 혼합물로부터 하나 초과의 황산염 기를 갖는 탄수화물 에스테르를 제거하여, 일황산염 탄수화물 지방산 에스테르를 포함하는 혼합물을 수득하는 것을 포함하며,
    상기 탄수화물이 단당류, 이당류, 삼당류 또는 이들의 혼합물이며,
    상기 탄수화물의 히드록실-기 중에서 하나는 황산염 기에 의해 치환되고, 나머지는 모두 지방산에 의해 치환된 것이며,
    상기 지방산이 6 내지 18개의 탄소 원자를 갖는 것인, 탄수화물 에스테르 혼합물의 제조방법.
  22. 제21항에 있어서, 상기 분획화가 상기 탄수화물 에스테르 혼합물로부터 황산염 기를 갖지 않는 탄수화물 에스테르를 제거하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  23. 제21항 또는 제22항에 따라 수득 가능한 탄수화물 에스테르 혼합물.
  24. 아주반트로서 사용하기 위한 제21항 또는 제22항에 의해 수득 가능한 탄수화물 에스테르 혼합물.
  25. 제21항 또는 제22항에 따라 수득 가능한 탄수화물 에스테르 혼합물을 포함하는 아주반트.
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