CN106573047B

CN106573047B - 佐剂

Info

Publication number: CN106573047B
Application number: CN201580041084.6A
Authority: CN
Inventors: 卢卡斯·A·特·希尔格斯; 彼得·保罗·L·I·普拉滕堡; 约翰尼斯·F·范·德·博施
Original assignee: Light Fox Co ltd
Current assignee: Light Fox Co ltd
Priority date: 2014-07-24
Filing date: 2015-07-24
Publication date: 2021-10-12
Anticipated expiration: 2035-07-24
Also published as: BR112017001121B1; CA2954043A1; EP3193923B1; KR102458982B1; US10342867B2; HUE047467T2; SI3193923T1; PL3193923T3; EP3193923A1; DK3193923T3; PT3193923T; AU2015294769B2; AU2015294769A1; JP2017522391A; LT3193923T; ES2759542T3; KR20170040196A; HRP20192113T1; NZ728551A; JP6765371B2

Abstract

本发明涉及一类碳水化合物单硫酸脂肪酸酯及其制备方法，所述碳水化合物单硫酸脂肪酸酯含有小于10摩尔％的碳水化合物多硫酸脂肪酸酯。根据本发明的单硫酸碳水化合物酯包含一个硫酸酯和至少一个脂肪酸，且尤其适用作为用于如疫苗的免疫产品的佐剂。

Description

佐剂

技术领域

本发明涉及作为疫苗佐剂的硫酸化碳水化合物脂肪酸酯的领域。

背景技术

疫苗接种是在人类及动物健康方面用于预防和控制传染性疾病的最经济有效的手段之一。疫苗含有修饰的活抗原，如细菌、病毒、寄生虫、重组(微)生物体，或者灭活(非复制)抗原，如灭活病毒、灭活细菌、灭活寄生虫、传染性(微)生物体的亚基、蛋白质、多糖、肽、糖蛋白、多糖-蛋白质缀合物、肽-蛋白质缀合物等。在很多情况下，针对抗原的免疫应答过低。在这种情况下，可添加佐剂以刺激免疫应答，且由此提高疫苗的保护作用。

在现有、新发及重新出现的传染性疾病的控制中，佐剂起了决定性作用。佐剂可具有不同功能，如提高(保护性)免疫应答、引导应答类型、增加(保护性)免疫力的持续时间、减少(保护性)免疫力的滞后时间、减少所要求的抗原剂量并减少所需疫苗接种的次数。通过将抗原与佐剂组合，可达到通过抗原单独治疗所不能达到的免疫力水平。

而且，佐剂可显著减少达到预定保护水平所需的抗原剂量，由此降低产品、运输及储存成本并且提高生产能力和可用性。便宜的佐剂代替大部分昂贵的抗原并且有助于穷人使用这些医药产品。

明矾(氢氧化铝)是安全佐剂的经典实例并且被应用于若干人类疫苗中。然而，在很多情况下，佐剂活性不够并且需要一种更强但至少同样安全的佐剂。

此外，硫酸酯取代的碳水化合物脂肪酸酯衍生物是已知的。这些通常被称为硫脂-碳水化合物(SL-碳水化合物)，且其合成和作为佐剂的功能是已知的。

已知的SL-碳水化合物的共同之处在于，它们是通过两个合成步骤制备的：用脂肪酸酯化碳水化合物的羟基以及用磺化剂酯化碳水化合物的羟基。这些反应可同时进行或以任何顺序进行。两个反应都是随机(ad random)反应，这意味着在可供酯化的碳水化合物的不同羟基之间不存在或存在有限的差别。因此，硫酸酯基和脂肪酸随机分布在取代的碳水化合物上，产生许多不同化合物的混合物。

通过随机合成法形成的化学上不同的SL-碳水化合物的数目取决于碳水化合物主链上的活性部位(羟基)的数目。碳水化合物与1当量(1摩尔/摩尔碳水化合物)磺化剂接触导致形成具有不同硫酸酯基数目的碳水化合物并且导致形成具有在不同位置处的硫酸酯基的碳水化合物。举例来说，本领域中已知的SL-碳水化合物混合物尤其是由不具有硫酸酯基(在本文中称为‘ZERO’)、具有一个硫酸酯基(在本文中称为‘MONO’)或多个硫酸酯基(两个或更多个硫酸酯基；在本文中称为‘POLY’)的碳水化合物酯的混合物组成。ZERO:MONO:POLY的比率可通过使用WO 96/20222中所公开的公式在统计上测定。在1摩尔磺化剂/摩尔二糖(具有8个可供磺化的羟基)下，在最终产物中 ZERO:MONO:POLY的理论摩尔比是37％:37％:26％。在更低摩尔比率的磺化剂/摩尔碳水化合物下，所形成的POLY％降低，且所形成的ZERO％提高。在0.2摩尔磺化剂/摩尔碳水化合物下，ZERO:MONO:POLY的理论摩尔比是82％:16％:2％。

使用成分混合物作为医药产品可与有关产品的质量、一致性及安全性的重要缺点相关联。特别是对于例如疫苗中的佐剂来说，重要强调的是它们大规模应用于健康受试者中。因此，毒性、功效和质量是重要的先决条件。

通常认为在佐剂活性(功效)与副作用(毒性)之间存在一种关系并且功效的提高伴随着毒性的增加(参见，例如Hilgers,Methods Mol.Biol.第626页.251-9,2010)。功效与毒性之间的比率被称作E/T比，并且是限定佐剂的重要参数。包含现有技术的SL- 碳水化合物的佐剂的缺点是缺乏足够的安全性(毒性过高或E/T比过低)。

佐剂活性和毒性随佐剂剂量的增加而增加。通过减少佐剂的剂量，副作用也减少。然而，不确定的是在可接受的毒性水平下是否保留充分的功效。因此，仍然需要具有比现有佐剂(包括基于SL-碳水化合物的佐剂)更高的功效/毒性比的佐剂。这些改进可包括在类似毒性下的更高的功效、在类似功效下的更低的毒性或更高的功效结合更低的毒性。

WO 01/402490公开了SL-单糖和SL-二糖、用于制备这些SL-单糖和SL-二糖的方法及其作为疫苗佐剂的用途。SL-二糖混合物在使用1摩尔当量磺化剂/摩尔二糖与7 摩尔当量脂肪酸酰氯(也称为酰基氯(acyl chlorides/acoylchloride))/摩尔二糖的反应中形成。这产生了6,561种不同可能的化合物的混合物，其相对存在可通过统计学来确定。这些产物已经是深入研究的对象，其名为‘CoVaccine HT’(BTG plc，英国)。测试通过使用1摩尔当量或多摩尔当量的磺化剂和1摩尔当量或多摩尔当量的脂肪酸酰氯获得的混合物的佐剂活性。然而，所测试的SL-碳水化合物衍生物的毒性过高而不能广泛使用于人类。

Hilgers等人(Vaccine 17,第219-228页,1999)、Blom&Hilgers(Vaccine 29,第3791-3801页,2011)和EP2580226公开了基于SL-碳水化合物的佐剂和/或疫苗的不期望的副作用，如体温升高和局部刺激性。

Hilgers等人(Vaccine 17,第222-225页,1999)公开了一方面SL-碳水化合物的分子量与另一方面佐剂活性和局部反应原性之间的关系。局部反应而非佐剂活性随着SL- 碳水化合物分子量的增加而提高。而且，体温短暂升高至多1.7℃并且在注射部位处肿胀长达4周是非常常见的。在疫苗接种之后首个小时期间1％-25％的病例中发生呕吐。在疫苗接种之后长达8周，在注射侧观察到持续性轻度至中度肌肉纤维的肉芽肿性炎症(针对用SL-环糊精辅佐的猪圆环病毒疫苗的欧洲公众评估报告(EPAR))。

EP2580226公开了SL-三糖的不良事件，包括局部不良反应和体温升高。副作用是显著的并且阻止了所述产品在健康受试者中的广泛预防性应用。同样对于SL-二糖，亦如Turkstra等人(Vaccine 29,第3791-3801页,2011)和EP2580226所公开的，观察到显著的局部和全身副作用。

使用SL-二糖(CoVaccine HT)的人类临床试验已被中止，原因可能与通常关于SL-碳水化合物(包括SL-二糖)观察到的不良反应有关或可能是由于所述不良反应的后果。已知的基于SL-碳水化合物的佐剂被认为不适合人类使用。

WO 2008/005824公开了包含天然杀伤T细胞激动剂和生理上可接受的媒介物的组合物以及刺激天然杀伤T细胞并增强免疫应答的方法。所公开的化合物是含有神经酰胺基团且任选地包含一个或多个硫酸酯基的单糖与二糖的合成衍生物。所述化合物在糖核心上不包含脂肪酸，且因此不同于本文要求保护的化合物。

WO 01/402490公开了将SL-单糖和SL-二糖衍生物的混合物从反应混合物中分离的方法。列举的技术包括结晶、沉淀、过滤、蒸发、透析或超滤。虽然这些方法可适于将SL-单糖和SL-二糖衍生物的混合物从反应混合物中分离或将SL-单糖和SL-二糖衍生物的混合物从某些副产物中分离，但它们不适于从POLY异构体中纯化本发明的 SL-碳水化合物的MONO异构体。

综上所述，如基于SL-碳水化合物的产品的强佐剂的缺点是其相对高的毒性，而如明矾的安全佐剂的缺点是其相对低的佐剂活性。

因而，仍需要在相同或较低毒性下具有更高功效的佐剂，以允许进一步提高疫苗接种期间的免疫应答。本发明公开了实现该需要的化合物。

附图说明

图1：在兔中测试的具有现有技术的SL-碳水化合物的佐剂配方和富含本发明的MONO的碳水化合物酯混合物的佐剂配方的高效薄层色谱(HPTLC)。从左至右： CoVaccineHT(由CoVaccine BV制备)、S12(内部制备的类似CoVaccine HT的配方)、 M10-MONO(从M10中分离)、G12-MONO(从G12中分离)、M12-MONO(从M12中分离)、无SL-碳水化合物的水包角鲨烷乳液、CoVaccine HT(复制品)以及S12(复制品)。

图2：用重组R0.10C抗原加上不同佐剂进行第一次肌内免疫接种(淡灰色柱)和第二次肌内免疫接种(深灰色柱)之后一天，兔的平均体温(℃)。在S12(ZERO、MONO和 POLY的混合物)、M10-MONO、G12-MONO以及M12-MONO中MONO的剂量对于第一次免疫接种为4mg且对于第二次免疫接种为8mg。第一和第二次免疫接种的明矾的剂量是110μg。

图3：在兔中，抗原单独(空心菱形)、明矾(灰色菱形)、S12(黑色三角形)、 M10-MONO(空心圆形)、G12-MONO(灰色圆形)以及M12-MONO(黑色圆形)的功效/毒性比。功效(Y轴)表示为在第二次免疫接种之后一周(第28天)针对重组R0.10C抗原(上面板)、恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)的配子母细胞提取物(中面板)以及恶性疟原虫的裂殖体提取物(下面板)的几何平均ELISA抗体滴度(¹⁰log值)。毒性(X轴)表示为在第一次免疫接种之后一天(第1天，左面板)和第二次免疫接种之后一天(第22天，右面板)的体温(℃)。

图4：在第二次免疫接种之后一周时在接受MONO，即G10-MONO作为佐剂(图 4a)的一只兔和接受POLY，即G10-POLY或M10-POLY作为佐剂的8只兔(图4b-4i) 中注射部位的照片。

·图4a：动物821；4组；佐剂G10-MONO；

毒性评分＝0.10；反对数＝1

·图4b：动物825；5组；佐剂G10-POLY；

毒性评分＝5.51；反对数＝324,000

·图4c：动物832；7组；佐剂M10-POLY；

毒性评分＝5.29；反对数＝194,400

·图4d：动物834；5组；佐剂G10-POLY；

毒性评分4.99；反对数97,200

·图4e：动物839；5组；佐剂G10-POLY；

毒性评分＝4.91；反对数＝81,000

·图4f：动物841；5组；佐剂G10-POLY；

毒性评分＝4.29；反对数＝19,440

·图4g：动物843；5组；佐剂G10-POLY；

毒性评分＝4.74；反对数＝54,432

·图4h：动物845；7组；佐剂M10-POLY；

毒性评分＝6.11；反对数＝1,296,000

·图4i：动物850；7组；佐剂M10-POLY；

毒性评分＝5.08；反对数＝121,500

图5：在免疫接种1后的1周加上免疫接种2后的4周时，个体的抗H3N2抗体滴度(y轴)相对于局部反应评分的E/T绘图。在第0天和第21天，用H5N1加上 G10-MONO或M10-MONO(菱形)或用G10-POLY或M10-POLY作为佐剂(方形)对6 只兔子的组进行免疫。在第28天测定抗体滴度和局部反应并且对个体数据绘图。

具体实施方式

鉴于以上内容，本发明的目的为提供一种佐剂，其具有优良的安全性和功效特征，容易制备且价格低廉，并且具有高质量和稳定性。本发明的另一目的为提供可用于佐剂组合物中的化合物，例如与抗原成分组合以制备疫苗。

本发明涉及一种佐剂，其包含含有硫脂-碳水化合物的碳水化合物酯混合物以及药学上可接受的载体，所述硫脂-碳水化合物为被至少一个硫酸酯基和至少一个脂肪酸取代的碳水化合物，其中小于10摩尔％的所述碳水化合物酯混合物被多于一个硫酸酯基取代。优选地，碳水化合物混合物包含小于50摩尔％、更优选25摩尔％或更少、甚至更优选小于10摩尔％的不含硫酸酯基的碳水化合物酯。

优选地，小于5摩尔％、更优选小于2％且最优选约0％的碳水化合物酯混合物被多于一个硫酸酯基取代。

在本发明中，已发现如CoVaccine HT的硫脂碳水化合物混合物的毒性主要是由于被多于一个硫酸酯基取代的硫脂碳水化合物(称为“POLY”)的组。被一个硫酸酯基取代的硫脂碳水化合物(称为“MONO”)呈现良好的佐剂活性，同时具有相当的较小的毒性。如此，富含MONO的碳水化合物酯混合物的功效/毒性比得以改善。因为使用 CoVaccine HT的人类试验的中止至少部分是由于作为CoVaccine HT的一种主要组份的POLY的不可接受的高毒性，所以从混合物中大量除去POLY将在新的人类试验中得到可接受的毒性。

在本文中的碳水化合物是单糖、二糖、三糖或者优选地具有至少4个且不超过10个单糖单元的直链或环状多糖。优选地，碳水化合物是单糖、二糖、三糖、环糊精或其混合物，更优选地是单糖、二糖或环糊精或其混合物，甚至更优选地是二糖和/或单糖，且最优选地，碳水化合物是二糖。

单糖是选自具有通式C₅H₁₀O₅的戊糖和具有通式C₆H₁₂O₆的己糖的糖。或者，单糖是选自由以下组成的组的一种或多种：阿洛糖、阿卓糖、葡萄糖、甘露糖、古洛糖、艾杜糖、半乳糖、塔罗糖、阿洛酮糖、果糖、山梨糖、塔格糖、阿拉伯糖、核糖、木糖、来苏糖、核酮糖、木酮糖以及肌醇。优选地，单糖是选自果糖、半乳糖及葡萄糖的一种或多种。

二糖是具有通式C₁₂H₂₂O₁₁的糖，并且优选地是选自由以下组成的组的一种或多种：蔗糖、麦芽糖、乳糖、乳果糖、纤维二糖、海藻糖、龙胆二糖、松二糖、异麦芽酮糖以及蜜二糖。优选地，二糖是选自乳糖、麦芽糖及蔗糖的一种或多种。最优选地，二糖是麦芽糖和/或乳糖。

三糖是具有通式C₁₈H₃₂O₁₆的糖并且优选地是选自由以下组成的组的一种或多种：棉子糖、松三糖、麦芽三糖、异麦芽三糖、棉子糖、蔗果三糖以及尼吉罗三糖(negerotriose)。优选地，三糖可选自棉子糖、松三糖和/或麦芽三糖。最优选地，三糖选自棉子糖和/或麦芽三糖。

环糊精为具有各种数目的如上限定的单糖的环状多糖。环糊精优选地是α-、β-或γ-环糊精(分别有6、7或8个糖单元)。

在本文中的碳水化合物酯是取代的碳水化合物。取代意味着其他基团经由酯键通过碳水化合物的羟基连接至碳水化合物，以使得本文中取代的碳水化合物是碳水化合物酯。取代使用硫酸酯基，并且使用至少一个脂肪酸。因此，硫酸酯基通过碳水化合物羟基上的酯基共价地结合至碳水化合物，且类似地，脂肪酸通过碳水化合物羟基上的酯基共价地结合至碳水化合物。

在本文中不含硫酸酯基的碳水化合物酯是被一个或多个脂肪酸取代而不被硫酸酯基取代的碳水化合物酯。

在本文中的硫脂碳水化合物是被至少一个硫酸酯基和至少一个脂肪酸取代的碳水化合物。本发明的碳水化合物酯混合物富含单硫酸碳水化合物脂肪酸酯，并且包含小于10摩尔％的被多于一个硫酸酯基取代的碳水化合物酯。

因而，本发明涉及一种佐剂组合物及其作为例如疫苗中的佐剂的用途，所述佐剂组合物包含富含单硫酸碳水化合物脂肪酸酯的碳水化合物酯混合物。

根据本发明的碳水化合物酯混合物包含在羟基上被硫酸酯基(-SO₃ ^-)取代的碳水化合物。在本文中的硫酸酯基可包含中性或离子取代基，其选自由形成一价阳离子的原子和/或分子组成的组。此组的成员的实例包括H⁺、Na⁺、K⁺、Li⁺和NH₄ ⁺及三乙铵 (Et₃NH⁺)。因此，硫酸酯基可例如是-SO₃ ^-、-SO₃H、-SO₃Na、-SO₃K、-SO₃Li或-SO₃NH₄。

另外，每分子碳水化合物，碳水化合物在羟基上被至少一个脂肪酸取代。优选地，碳水化合物被多个脂肪酸取代，如对于单糖是2-4个，对于二糖是2-7个或对于如上限定的较大的碳水化合物是甚至更多个。更优选地，碳水化合物的基本上所有没有被硫酸酯基取代的羟基都被脂肪酸取代。这意味着除了存在硫酸酯基之外，优选地，碳水化合物基本上是脂肪酸饱和的。在这点上，基本上意味着在单个碳水化合物分子上所有没有被硫酸酯取代的羟基中，至少50％、优选至少75％、更优选至少80％或至少 90％、且甚至更优选至少95％被脂肪酸取代。

因而，本发明的碳水化合物酯混合物是富含被一个硫酸酯基和至少一个脂肪酸取代的碳水化合物(即，富含单硫酸碳水化合物脂肪酸酯)的混合物。优选地，本发明的碳水化合物酯混合物包含以下碳水化合物，其中碳水化合物的羟基中的一个被硫酸酯基取代，且其中碳水化合物的基本上所有剩余羟基被脂肪酸取代。本发明的碳水化合物酯混合物包含小于10摩尔％的被多于一个硫酸酯基取代的碳水化合物。

本文中的脂肪酸是本领域中公知的，并且可以是任何脂肪酸。一般来说，本文中的脂肪酸可以是具有介于6与18个之间的碳原子、优选地介于8与12个之间的碳原子的脂肪酸。脂肪酸可以是饱和或不饱和的，并且可以是支链的，但优选是直链的。一般来说，脂肪酸可以是根据通式-O-(C＝O)-(CH₂)_x-CH₃的饱和脂肪酸，其中x在4与 16之间。此外，脂肪酸可以是根据下式之一的不饱和脂肪酸： -O-(C＝O)-(CH₂)_x-CH＝CH-(CH₂)_y-CH₃，其中x+y在4与14之间；或 -O-(C＝O)-(CH₂)_x-CH＝CH-(CH₂)_y-CH＝CH-(CH₂)_z-CH₃，其中x+y+z在2与12之间。

优选地，脂肪酸可具有通用结构-O-(C＝O)-(CH₂)_x-CH₃，其中x可以是4(己酸)、6(辛酸)、8(癸酸)、10(十二烷酸；在本文中也称为月桂酸)、12(十四烷酸，也称为肉豆蔻酸)或14(十六烷酸，也称为棕榈酸)。进一步优选的是具有通用结构 -O-(C＝O)-(CH₂)_x-CH＝CH-(CH₂)_y-CH₃的脂肪酸，其中x+y可以是14(例如油酸)。进一步优选的是具有通用结构-O-(C＝O)-(CH₂)_x-CH＝CH-(CH₂)_y-CH＝CH-(CH₂)_z-CH₃的脂肪酸，其中x+y+z是12(例如亚油酸)。优选地，脂肪酸是直链的，并且具有介于6与18 个之间的碳原子，更优选介于8与12个之间的碳原子。最优选，脂肪酸是癸酸或十二烷酸。

当碳水化合物被超过1个脂肪酸取代时，如上所述的脂肪酸的任何组合都是可能的。一般来说，认为在本发明的上下文中描述了本文所述的特征的任何组合描述。

通常已知的是当制备被一个或多个硫酸酯基和脂肪酸取代的碳水化合物时，形成这些化合物所需的反应随机地进行。因而，在将具有N个羟基的碳水化合物转化为被硫酸酯基和至少一个脂肪酸取代的碳水化合物的过程中，得到的不是由碳水化合物以及添加的硫酸酯和脂肪酸的数量所限定的单分子物质。反之，获得了不同碳水化合物的混合物，其中个体的碳水化合物分子可含有0至N个硫酸酯基、0至N个脂肪酸基、以及0至N个未反应的(游离)羟基。

本发明的碳水化合物通过类似于WO 01/40240中所述的工序形成。然而，与WO 01/40240的差异在于本发明的碳水化合物酯混合物随后通过分级分离而富含被一个硫酸酯基和至少一个脂肪酸取代的碳水化合物，以使得小于10摩尔％的碳水化合物酯混合物被多于一个硫酸酯基取代。优选地，小于5摩尔％的碳水化合物被多于一个硫酸酯基取代，更优选地，小于2摩尔％被多于一个硫酸酯基取代且甚至更优选地，在碳水化合物酯混合物中的实质上所有硫酸碳水化合物酯都被单个硫酸酯基取代。

此差异的作用在于碳水化合物作为佐剂的功效保持稳定或提高，而毒性基本上较低或甚至不存在。因此，在基于SL-碳水化合物的佐剂中获得相对于已知佐剂具有大幅提高的E/T比的佐剂。

因此，本发明尤其涉及一种制备包含单硫酸碳水化合物脂肪酸酯(在本文中称为‘MONO’)的碳水化合物酯混合物的方法。所述方法包括合成磺基和脂肪酸取代的碳水化合物的混合物。磺基和脂肪酸取代的碳水化合物也被称为硫脂-碳水化合物(SL-碳水化合物)。随后，通过分级分离将富含被一个硫酸酯基和至少一个脂肪酸取代的SL-碳水化合物(富含单硫酸碳水化合物脂肪酸酯)的碳水化合物酯混合物从碳水化合物酯混合物中分离。

因而，本发明进一步涉及一种用于制备包含单硫酸碳水化合物脂肪酸酯的碳水化合物酯混合物的方法，其中小于10摩尔％的碳水化合物酯混合物被多于一个硫酸酯基取代且其中优选小于50摩尔％的碳水化合物酯混合物是不含硫酸酯基的碳水化合物酯，所述方法包括碳水化合物的酯化和分级分离，其中酯化包括碳水化合物与磺化剂和与反应性脂肪酸酰基化合物的反应以获得碳水化合物酯混合物，且其中分级分离包括从碳水化合物酯混合物中除去具有多于一个硫酸酯基的碳水化合物酯以获得包含单硫酸碳水化合物脂肪酸酯的所述混合物。优选地，分级分离还包括从碳水化合物酯混合物中除去不含硫酸酯基的碳水化合物酯。

优选地，小于5摩尔％、更优选小于2％，且甚至更优选约0％的碳水化合物酯混合物被多于一个硫酸酯基取代。进一步优选地，碳水化合物酯混合物包含小于50摩尔％、优选25摩尔％或更少、甚至更优选小于10摩尔％的不含硫酸酯基的碳水化合物酯。另外，本发明涉及可通过此方法获得的富含单硫酸碳水化合物脂肪酸酯的混合物，以用作佐剂；以及一种佐剂，其包含由此获得的富含单硫酸碳水化合物脂肪酸酯的混合物。

通过碳水化合物的酯化，优选地在溶液中通过碳水化合物的一个或多个游离羟基的酯化而发生碳水化合物的取代。所述取代得到碳水化合物酯。

通过磺化剂与碳水化合物的反应发生硫酸酯基取代。优选的磺化剂是气态SO₃、HClSO₃(氯磺酸)、SO₃-吡啶、SO₃-2-甲基吡啶、SO₃-2,6-二甲基吡啶、SO₃-二甲基甲酰胺、SO₃-三甲基酰胺、SO₃-三乙胺、SO₃-二甲基苯胺(SO₃-dimethylanaline)、SO₃-N-乙基吗啉、SO₃-二乙基苯胺(SO₃-diethylanaline)以及SO₃-二噁烷。最优选的是SO₃-吡啶和SO₃-三乙胺。

通过类似的反应性酰基化合物(即反应性脂肪酸酰基化合物)与碳水化合物的反应发生脂肪酸取代。反应性脂肪酸酰基化合物可以是脂肪酸酰氯、脂肪酸酰溴或脂肪酸酰碘、脂肪酸硫酯、脂肪酸酸酐或脂肪酸酯。优选地，反应性脂肪酸酰基化合物是脂肪酸酰卤、脂肪酸酸酐或脂肪酸硫酯，更优选是脂肪酸酰氯(有时称为酰基氯(acoyl chloride或acylchloride))。

高度优选的反应性脂肪酸酰基化合物是己酰氯、辛酰氯、癸酰氯、十二酰氯(月桂酰氯)、十四酰氯(肉豆蔻酰氯)、十六酰氯(棕榈酰氯)以及十八酰氯(硬脂酰氯和油酰氯)。最优选的是癸酰氯或十二酰氯。

用于取代的优选溶剂是极性溶剂，优选是极性非质子溶剂。进一步优选地，溶剂是无水的。

优选地，溶剂是吡啶、二甲基甲酰胺、N-甲基吡咯烷酮、二甲亚砜、乙腈、硝基甲烷或其混合物。优选地，溶剂是吡啶、二甲基甲酰胺、N-甲基吡咯烷酮或其混合物，且最优选地，溶剂是无水吡啶与无水二甲基甲酰胺的混合物。

反应一般在尽可能小的溶剂体积中完成。优选地，溶剂的体积量与反应性酰基化合物如脂肪酸酰氯的量近似相等。优选地，选择这样的溶剂以使得所述溶剂可易于通过例如沉淀、过滤、结晶或蒸发从反应混合物中除去。

使用反应性酰基化合物的取代优选地在约60℃至70℃的温度下进行4至8小时、优选约6小时的一段时间。此后可能需要让反应混合物在环境温度下静置长达18小时。

使用磺化剂的反应优选地在介于环境温度与70℃之间进行1至4小时的一段时间。此后可能需要让反应混合物在环境温度下静置长达18小时。

在一个实施方式中，碳水化合物首先与磺化剂在环境温度下反应且随后使温度达到约50℃-70℃、优选地55℃-70℃且更优选地约60℃以与反应性酰基化合物进行反应。就此而言，观察到温度对于该过程并不关键。这样的特征容许在宽的温度范围下且在费用节约的宽条件范围下实施该过程。可以预期低至约10℃的环境温度是可接受的。优选的环境温度不低于约15℃，更优选不低于约18℃。此外，使用磺化剂的反应的环境温度优选不高于约50℃，更优选不高于约40℃，最优选不高于约25℃。

碳水化合物可首先与磺化剂反应，接着与至少一个脂肪酸酰氯反应，或反之亦然。优选地，碳水化合物首先与磺化剂反应，接着与反应性酰基化合物反应。进一步优选地，碳水化合物与一定量的磺化剂反应，得到碳水化合物单硫酸酯的最大产率。对于无水碳水化合物，所述量为每摩尔碳水化合物1摩尔磺化剂。对于碳水化合物一水合物，所述量介于每摩尔碳水化合物1摩尔与2摩尔磺化剂之间。

如已提及的，优选使用尽可能少量的溶剂。在这点上，优选的是碳水化合物通过加热溶于溶剂中，得到透明均匀的溶液。特别地，这种制备均匀溶液的方法适用于在有机溶剂中溶解性较差或难以溶于有机溶剂中的碳水化合物，例如蔗糖和乳糖。为了将这些碳水化合物溶于最小量或体积的有机溶剂中，温度优选增至超过80℃、更优选超过90℃。

在一个优选实施方式中，在取代完成之后，将有机溶剂中的取代的碳水化合物用无机或有机碱(如NaOH、NH₄OH、KOH、三乙胺或氨)溶液中和。

可通过冷却回收取代的碳水化合物，导致形成两个或三个或更多个不同的相，所述相中的一个富含取代的碳水化合物。所述取代的碳水化合物可通过本领域中公知的方法回收，包括过滤、倾析、蒸发、萃取等。通过例如在提高的温度和减压下蒸发或用水相洗涤从该相中除去残留溶剂和其他化合物。

在此阶段，如上所述，取代的碳水化合物包含随机地被不同数目的硫酸酯基和不同数目的脂肪酸取代的不同的碳水化合物酯的混合物。在所有情况下，碳水化合物被至少一个脂肪酸取代，即，实质上不存在未反应的碳水化合物。

所述碳水化合物酯混合物因此可包含：

·MONO，即每分子碳水化合物被一个硫酸酯基团取代且被至少一个脂肪酸酯取代的碳水化合物酯(单硫酸碳水化合物脂肪酸酯)。

·POLY，即每分子碳水化合物被多于一个硫酸酯基取代且被至少一个脂肪酸酯取代的碳水化合物酯。

·ZERO，即具有至少一个脂肪酸酯但不含硫酸酯基的碳水化合物酯。

优选地，本发明的碳水化合物酯混合物包含小于10摩尔％的POLY。更优选地，所述混合物包含小于5摩尔％的POLY或甚至更优选地，所述混合物包含小于2摩尔％的POLY。最优选地，所述混合物不包含可检测到的POLY(约0％POLY)。

进一步优选地，所述混合物包含小于50摩尔％ZERO、更优选25摩尔％或更少、甚至更优选小于10摩尔％的ZERO。

通过将包含SL-碳水化合物混合物的反应混合物分级分离使碳水化合物酯混合物富含MONO。分级分离可通过本领域中已知的纯化方法完成，如液体萃取、液相色谱、结晶、电泳、超临界萃取或这样的方法的组合。优选地，富含MONO的碳水化合物酯混合物通过液体萃取或液相色谱分离。更优选地，本发明的碳水化合物酯混合物通过液相色谱分离。

液相色谱的固定相可以是硅石、改性的硅石、氧化铝、硅酸镁载体(Florisil)、阴离子交换树脂，例如，陶氏化学公司的以Amberjet^TM、Amberset^TM和Dowex^TM的商品名下可购得的树脂。

液相色谱的流动相(‘洗脱液’)可以是单一溶剂或选自本领域中已知的有机液体中的两种或更多种溶剂(如正己烷、正庚烷、异丙醇、乙醇、甲醇、三乙胺、三甲胺、氨) 的混合物，以及水。优选地，溶剂是例如由注册机构(例如FDA或EMA)分级为‘受限的溶剂’或‘具有低的潜在毒性的溶剂’所证明的那样安全的。优选的溶剂是正庚烷、异丙醇和三乙胺的混合物，体积比优选地介于90:5:5与50:30:20之间。

在合成完成之后将本发明的碳水化合物酯混合物从反应混合物中分离或从其萃取物中分离。优选地，从含有取代的碳水化合物和副产物的混合物的反应混合物的萃取物中将其分离。萃取物可通过液-液萃取或示差沉淀获得。

优选方法是通过有机溶剂如正庚烷或正己烷萃取反应混合物。更优选的是用正己烷或正庚烷萃取补充有水相的反应混合物以促进相分离。

将反应混合物或萃取物(从其中有待分离出本发明的碳水化合物酯混合物)优选地溶解或稀释于用于液相色谱的洗脱液(流动相)中。

有待分级分离的反应混合物或萃取物的体积在用于液相色谱的柱体积的1/10与1/100之间。用1-10倍的柱体积洗脱该柱。洗脱可使用单一溶剂或具有恒定组成的溶剂混合物(等度洗脱)或在运行期间变化的溶剂混合物而形成梯度(梯度洗脱)。优选地，使用单一溶剂或具有恒定组成的混合物进行洗脱。在每分钟介于1mL与100mL之间的流量下洗脱该柱。所收集的级分在1/10与1/100的柱体积之间。液相色谱在介于4℃与60℃之间、优选地介于15℃与25℃之间(环境温度)进行。

优选地，在两个化学反应完成之后进行分级分离，以使得在脂肪酸取代和/或硫酸酯基取代期间形成的副产物可同时被除去。

在如下所述的实施例中，将富含单硫酸碳水化合物脂肪酸酯的混合物从通过随机合成法制备的碳水化合物酯混合物中分离。制备过程的条件详细地公开于WO96/2008 和EP02580226中。

富含MONO的碳水化合物混合物可通过MONO与POLY的摩尔比来表征。优选地，MONO与POLY的摩尔比是10:1，更优选是20:1，且更优选是50:1或甚至更优选是100:1。

除根据本发明的富含MONO的混合物的制备方法(其包括随机合成和通过液相色谱的纯化)之外，其他得到包含单硫酸碳水化合物脂肪酸酯的碳水化合物酯混合物(其中小于10摩尔％的碳水化合物酯混合物被多于一个硫酸酯基取代)的制备方法也可适用。

例如，区域选择性合成可以是制备MONO(富含MONO的混合物)的一种替代方法。区域选择性制备可包括碳水化合物分子的羟基的暂时保护(即羟基的保护和去保护) 或者酶或催化剂的使用。区域选择性合成的优点在于产生单一异构体。

用于制备富含MONO的混合物的方法具有的优点在于它们是便利、安全且花费不多的，并且可用于获得富含被一个硫酸酯基和至少一个脂肪酸取代的碳水化合物的各种各样的碳水化合物酯混合物，其中小于10摩尔％的碳水化合物被多于一个硫酸酯基取代。已显示包含这类混合物的佐剂相对于已知的硫脂-碳水化合物佐剂来说几乎没有毒性或没有毒性并且具有等同或甚至提高的功效。为此，本发明涉及一种佐剂，其包含被一个硫酸酯基和至少一个脂肪酸取代的碳水化合物及药学上可接受的载体，其中小于10摩尔％的碳水化合物被多于一个硫酸酯基取代，即，一种佐剂，其包含含有硫脂-碳水化合物的碳水化合物酯混合物及药学上可接受的载体，所述硫脂-碳水化合物是被一个硫酸酯基和至少一个脂肪酸取代的碳水化合物，其中小于10摩尔％的碳水化合物酯混合物被多于一个硫酸酯基取代且其中优选地小于50摩尔％的碳水化合物酯混合物是不含硫酸酯基的碳水化合物酯。

在本文中药学上可接受的载体是可用于递送或施用佐剂和/或抗原性化合物的任何载体。优选的药学上可接受的载体是生理盐溶液、不溶性化合物于生理盐溶液中的悬浮液或与水不混溶的化合物(例如油)与生理盐溶液的乳液，优选是水包油乳液。

生理盐溶液是本领域中已知的，并且是适用于注射到活的对象中的任何溶液，且该溶液不会或几乎不会仅仅由于其组成对其被注射的对象造成负面作用。优选地，生理盐溶液是无菌的。进一步优选地，生理盐溶液具有与其被注射的对象的体液的离子强度相当的pH和离子强度(‘等渗’)。

生理盐溶液可例如包含盐，如Na、K、Li、NH₄、Ca和/或Mg的氯盐、溴盐、磷酸盐和/或柠檬酸盐。优选地，生理盐溶液是盐水、磷酸盐缓冲盐水、柠檬酸盐缓冲盐水、等渗离子溶液、等渗非离子溶液等等。更优选地，生理盐溶液可以是盐水或磷酸盐缓冲盐水。盐水的一个实例是0.9w/v％氯化钠于水中的无菌溶液。

或者，药学上可接受的载体是不溶性化合物于生理盐溶液中的悬浮液。在本文中的不溶性化合物是例如不溶性有机或无机化合物，其可用于吸收单硫酸碳水化合物脂肪酸酯。优选地，不溶性化合物是已知的佐剂明矾，其是氢氧化铝。

在另一优选实施方式中，药学上可接受的载体是包含与水不混溶的化合物与生理盐溶液的乳液。优选地，乳液的类型是水包油乳液。进一步优选地，乳液是无菌的。

与水不混溶的化合物优选是液体、更优选是油。合适的油类包括选自由以下组成的组的一种或多种：角鲨烷、角鲨烯、植物油及矿物油。合适的油类包括例如大豆油、花生油、菜籽油、橄榄油、红花油、玉米油、杏仁油、棉籽油、油酸乙酯、肉豆蔻酸异丙酯、棕榈酸异丙酯、矿物油、肉豆蔻醇、辛基十二烷醇、桃仁油、芝麻油、肉豆蔻油酸酯、鲸蜡油酸酯、肉豆蔻棕榈酸酯。其他合适的油类包括饱和、不饱和和/或部分氢化的脂肪酸的生物相容性油、硅基油、合成油如由饱和与不饱和的C₁₂-C₂₄脂肪酸链构成的甘油三酯(如例如油酸的甘油三酯)、萜烯、亚麻烯(linolene)、角鲨烷、角鲨烯、角鲨胺；以及氟化油，包括已知为FC-40、FC-43、FC-72、FC-70、FC-75的全氟化物、全氟己烷、全氟辛基溴化物(也称为全氟溴烷(perfluorobron))、全氟辛基碘化物；或其任何混合物。高度优选的是，油是角鲨烷。

在乳液的情况下，一般优选的是，佐剂包含在介于1g/L-640g/L之间、优选介于2g/L-480g/L之间、且更优选介于4g/L-320g/L之间的浓度的油。

适用于乳液的水相可以是任何可注射的水溶液，优选生理盐溶液，如例如盐水、磷酸盐缓冲盐水、柠檬酸盐缓冲盐水、等渗离子溶液、等渗非离子溶液等等。水相的量可变化且将通常在616g/L与996g/L之间，如优选介于616g/L与984g/L之间或介于680g/L与996g/L之间，更优选介于680g/L与996g/L之间。

根据本发明的特别优选的佐剂配方包含含有硫脂-碳水化合物的碳水化合物酯混合物，其中小于10摩尔％的碳水化合物被多于一个硫酸酯基取代，如具有介于1 g/L-640g/L之间、优选介于1g/L-480g/L之间、且更优选介于1g/L-320g/L之间的浓度。

使用包含水包油乳液的佐剂达到了优异的结果，其中所述油是角鲨烷且所述水是磷酸盐缓冲盐水(‘PBS’)。

任选地，佐剂包含乳化剂或稳定剂、或乳化剂与稳定剂的组合。可使用适用于注射目的的任何乳化剂或稳定剂，包括适用于此目的的清洁剂。合适的乳化剂或稳定剂的实例是聚山梨醇酯80(巴黎Seppic的Montannox 80)。如果使用乳化剂或稳定剂，那么它们通常以1g/L-640g/L、优选2g/L-480g/L、且更优选4g/L-320g/L的(总)浓度存在。

优选地，本发明的佐剂是稳定且无菌的。优选地，佐剂配方可通过穿过具有0.05μm-0.40μm、优选0.15μm-0.30μm、优选约0.22μm的孔径的除菌过滤器来灭菌。

在优选实施方式中，本发明的佐剂包含介于1g/L与80g/L之间、优选介于4g/L 与64g/L之间或介于2g/L与40g/L之间、更优选介于4g/L与32g/L之间且最优选介于4g/L与20g/L之间的富含(如在别处定义的)MONO的碳水化合物酯混合物；介于1g/L与320g/L之间、优选介于2g/L与160g/L之间或介于8g/L与256g/L之间、最优选介于4g/L与80g/L之间的油，优选角鲨烷；以及介于1g/L与80g/L之间、优选介于4g/L与64g/L之间或介于2g/L与40g/L之间、最优选介于4g/L与20g/L之间的乳化剂或稳定剂，优选聚山梨醇酯80，其余是水相，优选PBS。

优选地，本发明的佐剂组合物包含介于1g/L与80g/L之间的MONO、更优选介于2g/L与40g/L之间的MONO、甚至更优选介于4g/L与20g/L之间的MONO。

本发明的佐剂可适当地在医学上使用，以便提高由抗原成分诱发的免疫应答。该使用对于在其中要使针对抗原成分的抗性得以提高的应用中(如疫苗接种中)是有利的。

抗原成分是在动物或人类中诱发适应性免疫应答的任何物质。抗原成分通常是身体的外来物(例如细菌)，且一旦在身体内，便通过抗原特异性B细胞和T细胞的活化引发特异性免疫应答。或者，抗原成分也可定义为可由抗原受体(如适应性免疫系统的 B细胞受体或T细胞受体)识别的任何分子或分子片段。

提高免疫应答意味着例如相对于其中动物或人仅暴露于抗原成分的正常情况，针对抗原成分的抗体的产生、产生针对抗原成分的抗体的B细胞数目、和/或识别抗原成分的T细胞数目是增加的。如本领域中已知的，提高的免疫应答可通过例如测定抗体滴度来确定。

本文中的抗原成分是在人或动物中诱发免疫应答的任何化合物并且一般还称为‘免疫原’。

本发明的佐剂提高人和动物中针对抗原成分的免疫应答。在一个优选实施方式中，本发明的佐剂被用于人。在另一优选实施方式中，本发明的佐剂被用于动物。优选的动物物种是哺乳动物，且包括猪、大鼠、兔、雪貂、牛、绵羊、小马、猴、猫、狗和象。优选地，抗原成分诱发至少人的免疫应答。

众所周知，佐剂本身不会或几乎不会诱发免疫应答，而是佐剂会提高对抗原成分的免疫应答。进一步已知佐剂具有此作用，与免疫应答所针对的抗原成分的类型无关。因此，本发明的佐剂可与任何抗原成分一起使用，以提高免疫应答。抗原成分在预防性和治疗性疫苗中都可使用。

抗原成分可尤其是但不限于灭活的微生物，如杀死的细菌、病毒或寄生虫、来源于这样的微生物的成分以及模拟这样的微生物的相关成分的通过化学或生物技术手段制备的成分。抗原成分也可以是来源于植物或动物的变应原、或模拟变应原的通过化学或生物技术手段制备的成分。抗原成分也可以是来自出于治疗目的(如治疗癌症、免疫疾病和内分泌疾病)而需要对其进行免疫应答的宿主的成分。

预防性疫苗的抗原成分的实例包括灭活的流感病毒、灭活的脊髓灰质炎病毒、灭活的狂犬病病毒、灭活的细菌、病毒或细菌的亚单位或重组DNA产物，如流感病毒、破伤风类毒素、白喉类毒素、乙型肝炎病毒、疟疾、乳头瘤病毒的血球凝集素和神经氨酸苷酶、以及与来自肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)、b型流感嗜血杆菌、脑膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitides)的多糖的多糖-蛋白质缀合物。优选地，抗原成分包含流感抗原和/或疟疾抗原。

治疗性过敏症疫苗的抗原成分的实例包括来自草、艾蒿、桦木、桤木、榛木和灌木、房屋尘埃、动物、真菌、食物和昆虫的变应原。

用于治疗癌症或免疫病症或内分泌病症的治疗性疫苗的抗原成分的实例包括分离出的或模拟宿主成分(如激素或因子(例如促性腺激素释放激素、血管内皮生长因子、血管紧张素))和癌细胞抗原的(糖-)蛋白或肽-蛋白质缀合物。

本发明还提供一种疫苗，其包含如上限定的佐剂和抗原成分。优选地，所述疫苗包含水包油乳液，且进一步优选地，所述疫苗包含一种或几种如上限定的抗原成分。

对于疫苗的制备，即用型液体抗原成分可与根据本发明的即用型佐剂配方以适当的体积比混合，如1:100-100:1、优选地1:50-50:-1、更优选地1:25-25:1、甚至更优选地1:10-10:1。如果是冻干的抗原成分，冻干的抗原成分可溶于适当体积的根据本发明的即用型佐剂配方中，如对于单次剂量的疫苗介于0.1mL与2mL之间。

疫苗可包含每剂量0.01mg-80mg、优选0.05mg-80mg、更优选0.05mg-40mg、更优选0.1mg-24mg、更优选0.25mg-20mg且最优选0.25mg-16mg的根据本发明的碳水化合物酯混合物作为佐剂(即，包含被一个硫酸酯基和至少一个脂肪酸取代的碳水化合物的碳水化合物酯混合物，其中小于10摩尔％的碳水化合物被多于一个硫酸酯基取代)。其可进一步包含每剂量1mg-320mg、优选2mg-160mg、且更优选4mg-80mg 的与水不混溶的液相，优选油，且更优选角鲨烷，以及每剂量(总计)0.25mg-80mg、优选0.5mg-24mg、且更优选1mg-20mg的一种或多种乳化剂或稳定剂，优选聚山梨醇酯80(Montannox 80PPI)。一个剂量的疫苗是单次注射体积，且可以是例如介于0.1 mL与2.0mL之间的可注射液体。疫苗的剂量的抗原成分的量高度取决于抗原成分的特性，并且可以是每剂量介于0.1μg-1000μg之间，如优选每剂量介于1μg与100μg 之间。

本发明还提供一种成套试剂盒(a kit of parts)，其包含如上所述的佐剂，且任选地进一步包含含有抗原成分的制剂，如粉剂、溶液或乳液。试剂盒还可包括注射器、针、体积组件和/或可注射液体、以及在疫苗接种领域中已知适用于纳入试剂盒中的其他组件。可能需要单独地制造、运输及储存佐剂和抗原或单独地施用佐剂和抗原。在此情况下，佐剂配方可供应在单独的小瓶或预填充的注射器中。

实施例

以下实施例是说明性的，且不限制本发明。这些实施例表明了根据本发明的富含MONO的碳水化合物酯混合物的出人意料的高的安全性，与使用含有本发明的佐剂的疫苗注射的动物中的强烈增强的免疫应答的结合。术语MONO包括每碳水化合物分子一个硫酸酯基的碳水化合物脂肪酸硫酸酯。另外，实施例表明了富含POLY的碳水化合物酯混合物的出人意料的高的毒性。术语POLY包括每碳水化合物分子两个或更多个硫酸酯基的碳水化合物脂肪酸硫酸酯。MONO和POLY是本领域中已知的碳水化合物酯混合物(例如CoVaccine HT)的三种主要组分中的两种。

根据本发明的单硫酸碳水化合物脂肪酸酯衍生物的制备：

根据本发明的单硫酸碳水化合物脂肪酸酯根据本领域中已知用于制备SL-碳水化合物的方法来制备，例外的是并入分级分离步骤以将富含MONO的混合物与POLY(被两个或更多个硫酸酯基取代的碳水化合物脂肪酸酯)分离。优选地，还将富含MONO 的混合物与至少部分ZERO(没有被硫酸酯基取代的碳水化合物脂肪酸酯)分离。

单硫酸碳水化合物脂肪酸衍生物的合成包括第一步，将碳水化合物与磺化剂接触；和第二步，将碳水化合物与反应性脂肪酸酰基化合物接触。

在合成工序的第一步之后(即，碳水化合物与磺化剂接触之后)或者合成工序的第二步之后(即，碳水化合物与反应性脂肪酸酰基化合物反应之后)进行MONO与ZERO 和POLY的分离。

MONO与ZERO和POLY的分离及(同时)MONO从其他副产物中的纯化可通过液相色谱(使用硅石作为固定相和有机溶剂混合物作为流动相)来完成。

实施例1：单硫酸七(十二烷基)麦芽糖(‘M12-MONO’)

将麦芽糖一水合物(0.2摩尔；68.4g)溶于无水吡啶(200g)，并且添加在温热的(50℃) 无水吡啶(300g)中的0.5当量的SO₃.吡啶(0.1摩尔；15.9g)。在室温下搅拌反应混合物1h并且通过离子色谱高效液相色谱(IC-HPLC；Metrohm 821；Metrosep A supp 5- 250/4.0柱，0.1mM碳酸盐溶液作为洗脱液，通过电导率检测)测定无机硫酸盐含量。无机硫酸盐代表不与碳水化合物反应但反而与存在于起始材料中或在处理期间进入反应混合物中的水反应的磺化剂的量。

在220℃下干燥硅石(400g)4小时并且将其悬浮在无水吡啶(800mL)中并送入具有入口和出口连接器以及PVDF连接器的干燥玻璃柱中。在硅石沉降之后，施加50mL 麦芽糖单硫酸酯在无水吡啶中的样品。使用1L无水吡啶，然后1L无水N,N-二甲基甲酰胺进行洗脱。将50mL级分在干燥氩气或氮气下收集并且在HPTLC(硅石板，用丁醇:异丙醇:乙酸:甲酸:水＝10:3:26:6:4展开，用在甲醇中的5％硫酸喷雾并且在100℃下加热20min)上测试麦芽糖、麦芽糖单硫酸酯或麦芽糖多硫酸酯的存在。用无水吡啶洗脱麦芽糖且用无水N,N-二甲基甲酰胺洗脱麦芽糖单硫酸酯。

收集含有纯麦芽糖单硫酸酯的级分，将其汇集并用于进一步合成。通过苔黑酚/硫酸试剂确定麦芽糖含量的量(根据Dubois等人(Anal.Chem.28第350-355页,1956))。简单说来，对于每mL含有介于0.1μg与1μg之间的碳水化合物的50μL样品，添加 950μL苔黑酚试剂，所述苔黑酚试剂由2g/L苔黑酚在70％硫酸中的溶液组成。将混合物剧烈混合并且在100℃下培育20min。冷却之后，测量在550nm下的吸光度。通过使用基于未被取代的碳水化合物(麦芽糖一水合物)的标准溶液计算碳水化合物浓度。添加无水吡啶并且将溶液升温至60℃。添加8当量的十二酰氯并且将反应混合物在70℃下保持8h。通过HPTLC(硅石板；用体积比为233:100:3.3的正己烷:二乙醚: 乙酸展开，用在甲醇中的5％硫酸喷雾并且在100℃下加热20min)监测单硫酸七(十二烷基)麦芽糖的形成。

实施例2：单硫酸七(十二烷基)蔗糖(‘S12’)

如EP02133969中所述制备包含ZERO、MONO及POLY的CoVaccine HT的SL- 蔗糖(在本文中称为‘S12’)。将在100℃下干燥4h的蔗糖(68.6g，0.2摩尔)溶于无水吡啶(188g；2.4摩尔)和无水N,N-二甲基甲酰胺(388；5.3摩尔)中。将反应混合物保持在干燥的氮气下并在90℃下搅拌2小时直到获得澄清溶液。合成工序期间，采取预防措施以避免与水和湿空气接触。在冷却至室温之后，在剧烈搅拌下将SO₃.吡啶(32g；0.2 摩尔；1.0当量)添加至反应混合物中。在室温下1h之后，采集样品以便如实施例1 中所述通过IC-HPLC测量无机硫酸盐浓度。随后，将溶液升温至60℃并且在剧烈搅拌下添加十二酰氯(311g；1.4摩尔；7.1当量)。4小时之后，收集样品以通过半定量 HPTLC(硅石板；用体积比为233:100:3.3的正己烷:二乙醚:乙酸展开，用在甲醇中的 5％硫酸喷雾并且在100℃下加热20min)测定酯化度。

在剧烈搅拌下添加另一部分的十二酰氯(75g；0.3摩尔；1.7当量；总计8.8当量)。在70℃下4小时之后，收集样品，并且通过半定量HPTLC的分析显示酯化完成。在提高的温度(60℃)和减压(<20毫巴)下在旋转蒸发器(Büchi)上除去溶剂。将残余物以 20w/w％的最终浓度溶于冷甲醇(4℃)中。剧烈搅拌之后，将混合物保持在4℃下过夜，由此产生褐色粘稠的下层相和液体上层相。收集上层(甲醇)相并且用冷甲醇(4℃)重复萃取下层相若干次，其中在4℃下过夜进行相分离。将甲醇提取物(上层相)汇集并通过在3,000rpm(1200g)下在50mL聚丙烯管中离心5min使其澄清。收集、汇集上清液并且通过在提高的温度(40℃)和减压(<20毫巴)下在旋转蒸发器(Büchi)上蒸发除去甲醇。

如实施例1中所述，通过半定量HPTLC测定S12的组成。

表1：通过HPTLC所测定的未分级分离的S12(内部CoVaccine HT的等同物)的组成，表示为摩尔％。作为对比，纳入原始CoVaccine HT的组成。

实施例3：单硫酸四(十二烷基)半乳糖(‘G12-MONO’)

以如实施例2中针对蔗糖所述的类似方式，通过半乳糖的反应来制备单硫酸四(十二烷基)半乳糖(在本文中称为‘G12-MONO’)。半乳糖(36.4g；0.2摩尔)、无水吡啶(161 g)、无水N,N-二甲基甲酰胺(197g)、SO₃.吡啶(31.2g；0.2摩尔；1当量)以及十二酰氯 (268g；1.2摩尔；6.2当量)如实施例2中所述进行反应。通过IC-HPLC测定的无机硫酸盐含量是11％，得到每摩尔半乳糖0.89摩尔硫酸酯的平均比。富含ZERO的级分(在本文中称为‘G12-ZERO’)含有100w/w％ZERO(表2)。富含MONO的级分(在本文中称为‘G12-MONO’)含有25摩尔％ZERO和75摩尔％MONO。

表2：通过液相色谱获得的十二烷基半乳糖衍生物的三种级分的组成，通过LC-MS分析并表示为摩尔％

实施例4：单硫酸七(十二烷基)麦芽糖(‘M12-MONO’)

单硫酸七(十二烷基)麦芽糖(在本文中称为‘M12-MONO’)如实施例2中针对单硫酸七(十二烷基)蔗糖所述来制备，使用麦芽糖一水合物(36.6g；0.1摩尔)、无水吡啶(97g)、无水N,N-二甲基甲酰胺(199g)、SO₃.吡啶(31.7g；0.2摩尔；2当量)以及十二酰氯(224 g；1.0摩尔；10.4当量)，以产生碳水化合物酯混合物M12。无机硫酸盐含量是63％，由此计算出每摩尔麦芽糖0.76摩尔硫酸酯的平均比。

M12的分级分离结果概括于表3中。M12-MONO含有78摩尔％单硫酸七(十二烷基)麦芽糖和22摩尔％单硫酸六(十二烷基)麦芽糖，这证实了可获得具有小于饱和量的脂肪酸的MONO。

表3：通过一个或两个快速色谱获得的十二烷基麦芽糖衍生物的三个级分的组成，通过LC-MS分析并表示为摩尔％

实施例5：单硫酸七(癸基)麦芽糖(‘M10-MONO’)

如实施例3中针对单硫酸七(十二烷基)蔗糖所述来制备单硫酸七(癸基)麦芽糖(在本文中称为‘M10-MONO’)。采用的量为麦芽糖一水合物(36.6g；0.1摩尔)、无水吡啶(97g)、无水N,N-二甲基甲酰胺(199g)、SO₃.吡啶(31.7g；0.2摩尔；2当量)以及癸酰氯(154.9g；0.8摩尔；9.7当量)。磺化之后，无机硫酸盐含量是63％，由此计算出每摩尔麦芽糖0.76摩尔硫酸酯的平均比。添加癸酰氯之前，添加1当量的LiCl作为无水LiCl在无水吡啶中的溶液，由此产生硫酸锂的沉淀并且将无机硫酸盐从反应混合物中完全除去。

分级分离的M10的LC-MS分析显示MONO级分含有98摩尔％单硫酸七(癸基) 麦芽糖和2摩尔％二硫酸六(癸基)麦芽糖，指示具有高纯度(表4)。

表4：通过一个或两个快速色谱获得的癸基麦芽糖衍生物的三个级分的组成，摩尔％

实施例6：MONO的佐剂作用

在兔中测定本发明的单硫酸碳水化合物脂肪酸酯的佐剂作用。为此目的，在水包角鲨烷的亚微乳液中配制实施例3的级分G12-MONO(75摩尔％O-单硫酸O-四(十二烷基)半乳糖加上25摩尔％O-五(十二烷基)半乳糖)、实施例4的级分M12-MONO(78 摩尔％O-单硫酸O-七(十二烷基)麦芽糖加上22摩尔％O-单硫酸O-六(十二烷基)麦芽糖)以及实施例5的级分M10-MONO(98摩尔％O-单硫酸O-七(癸基)麦芽糖加上2摩尔％O-二硫酸O-六(癸基)麦芽糖)，并且与S12(内部CoVaccine HT类似物)、明矾(已知的安全佐剂)以及无佐剂的对照的佐剂作用相比较。

对于每种MONO级分，测定产生可穿过0.22μm的配方的角鲨烷(巴斯夫，德国) 和Montannox 80PPI(Seppic，法国巴黎)的适当量。如EP1223969中所述以16.0g MONO级分/L(16mg/mL)的最终浓度制备佐剂配方。使MONO、角鲨烷、聚山梨醇酯 80、超纯水及磷酸盐缓冲盐水的混合物在连续冷却下穿过高压乳化器(即Microfluidizer Model Y110)三次。所获得的佐剂配方是具有低粘度的白色或偏蓝色乳液。使这些配方穿过0.22μm PES过滤器(康宁公司(Corning Inc.))并且将滤液回收于无菌瓶中。佐剂配方的后续处理在无菌性条件下进行。将佐剂配方保持在4℃下的密封瓶中待用。

佐剂M10-MONO由以下制备：4g级分M10-MONO、8g角鲨烷、4g Montannox 80PPI、2g超纯水以及232g磷酸盐缓冲盐水(PBS；Fisher Scientific)。

佐剂G12-MONO由以下制备：4g级分G12-MONO、8g角鲨烷、4g Montannox 80PPI、2g超纯水以及232g PBS。

佐剂M12-MONO由以下制备：4g级分M12-MONO、16g角鲨烷、4g Montannox 80、2g超纯水以及224g PBS。

佐剂S12(内部所制备的‘CoVaccine HT’配方)由以下制备：11g未分级分离的 S12(实施例2；含有大约4.3g ZERO、5.1g MONO和1.7g POLY)、44g角鲨烷、11g Montannox80PPI、2g超纯水以及182g PBS。

佐剂S12充当强佐剂的基准。

明矾(SSI，丹麦)充当安全佐剂的基准。

不含佐剂的抗原充当阴性对照。

所测试的佐剂配方的组成概括于表5中。

如实施例1中所述通过使用苔黑酚/硫酸作为试剂测定碳水化合物浓度并测量550nm下的吸光度来确认佐剂配方的组成。如果需要的话，将M10-MONO、G12-MONO 或M12-MONO在佐剂配方中的浓度调节至16.0g/L。

另外，通过HPTLC分析佐剂配方且结果示于图1中。将包含SL-碳水化合物、角鲨烷、聚山梨醇酯80以及PBS的乳液的佐剂配方的1μL样品施加于HPTLC板上。将该板在正己烷、二乙醚和乙酸(体积比为233:100:3.3)中展开，干燥且随后在三乙胺、 2-异丙醇和庚烷(体积比为1:3:8)中展开。通过用5％硫酸在甲醇中的溶液喷雾并在 90℃下加热板30min来观测碳水化合物样点。

具有滞留因子1.0的样点(在板的顶部处)代表ZERO，并且其在CoVaccine HT和S12的佐剂配方中是可检测到的，而在M10-MONO、G12-MONO和M12-MONO的那些佐剂配方中没有检测到。具有介于0.2与0.5之间的滞留因子的样点代表MONO，并且其在除了没有SL-碳水化合物的水包角鲨烷乳液(其被用作药物载体并且作为对照被包括在此TLC分析中)之外的所有佐剂配方中都是可检测到的。具有介于0.0与0.1 之间的滞留因子的样点(在板的底部处)代表POLY，且很小一部分代表聚山梨醇酯80。 POLY在CoVaccine HT和S12的佐剂配方中是可检测到的，并且聚山梨醇酯80在包括不含SL-碳水化合物的水包角鲨烷乳液的所有配方中都是可检测到的。

TLC图形的半定量分析显示ZERO、MONO和POLY在CoVaccine HT中的w/w％分别是32％、41％和28％，且在S12(通过莱特弗克斯有限公司(LiteVax BV)内部制备的类似CoVaccine HT的配方)中分别是39％、46％和15％。因此，与原始CoVaccine HT 相比，S12佐剂配方含有类似量的MONO，但两倍低的量的POLY。

用于表明新型化合物的佐剂活性的抗原是被称为R0.10C的两种重要疟疾抗原的重组融合蛋白(如Theisen等人(Vaccine,32,第2623-2630页,2014)所述)。已表明该抗原引发阻断不同地理来源的恶性疟原虫株组的传播和无性生长的抗体(Theisen等人,Vaccine,32,第2623-2630页,2014)。浓度为1.33mg/mL的R0.10C抗原的储备溶液由荷兰奈梅亨市的Radboud UMC提供。剂量是每次注射10μg R0.10C蛋白。疫苗体积是每次注射0.5mL。首次免疫接种的疫苗由8μL抗原制剂、242μL PBS和250μL佐剂配方组成。因为在首次免疫接种之后没有观察到副作用，所以决定将用于第二次免疫接种的实验佐剂(3-6组)的剂量增加两倍。首次免疫接种的M10-MONO、G12-MONO 和M12-MONO佐剂的剂量是4.0mg且第二次免疫接种的剂量是8.0mg。首次免疫接种的S12佐剂的剂量是11mg SL-蔗糖，且第二次注射的剂量是22mg SL-蔗糖。第二次免疫接种的疫苗由8μL抗原制剂加上492μL佐剂配方组成。对于第一和第二次注射明矾(Staten Serum Institute，丹麦)剂量都是110μg。

表5：佐剂配方的组成

对兔群组进行控制以得到针对基于SL-碳水化合物的佐剂的充分响应性。为此目的，使用了在早先的动物研究中经证实在注射之后一天产生1℃的体温升高的一批CoVaccine HT。用0.5mL此参考批次的CoVaccine HT以20mg碳水化合物(蔗糖)脂肪酸硫酸酯(相当于6.4mg ZERO、8.2mg MONO和5.6mg POLY)、80g角鲨烷和20g 聚山梨醇酯80的剂量注射该群组的六只动物。施用之后一天，平均体温是40.1(± 0.4)℃，这超过了正常值约0.8℃。

对2-3kg和20周龄的六只雌性兔的组在第0天于左大腿上进行肌内免疫(首次免疫接种)且在第21天于右大腿上进行肌内免疫(第二次免疫接种)。在治疗之前和之后，在不同时间间隔下测定体温。在首次和第二次注射之后一天，观察到体温的一些增加 (参见表6和图2)，而在其他时间间隔下观察到正常值(数据未示出)。

表6：在第一和第二次免疫接种之后一天的体温

^a显著高于所有其他四个佐剂组。

在4mg和8mg的剂量下三个MONO级分(4、5和6组)中没有一个导致平均体温的显著增加。在11mg(含有4.3mg ZERO、5.1mg MONO和1.7mg POLY)和22mg(含有8.6mg ZERO、10.2mg MONO和3.4mg POLY)的剂量下的S12(类似CoVaccine HT) 在第一和第二次免疫接种之后一天造成体温升高约0.5℃，这显著高于其他组(1、2、4、 5和6组)中的总反应。一天后体温恢复到正常值(数据未示出)。在S12下的体温增加约为关于CoVaccine HT观察到的体温增加的一半，这被认为是与CoVaccine HT相比在S12中的两倍低的剂量的POLY的结果。

在第二次免疫接种之后一周，对动物施以安乐死并且如Hilgers(MethodsMol.Biol. 626第251-9页,2010)中所述在两个注射部位处对局部反应评分。每个注射部位的评分是尺寸的乘积(长度x宽度x深度，以mm为单位)以及具有以下任意分数的局部反应的性质：对于水肿、变色及肌肉结构的丧失评分为1；对于纤维化、肉芽肿及结缔组织评分为2；对于坏死和脓评分为9；对于疫苗残留评分为12。

没有一只动物展现中度或重度局部反应。在几只动物中观察到轻度不良事件。除一只动物(5组)之外，局部反应的尺寸都介于0与几毫米之间，且局部反应的任意分数大多是0且有时是1(指示变色和肌肉结构的丧失)。从所有测试动物来看，仅一只动物具有大于1的分数，且所有其它都具有1或更小的总分。局部反应出人意料地低并且所预期的评分系统的检测限不适于区分这些低分。因此，报告了具有尽管最小但可检测到的局部反应的每组动物数量(表7)。

表7：在首次免疫接种之后四周及第二次免疫接种之后一周的局部反应

^a局部反应代表从每组6只动物中展现尽管最小但显著的局部效应的动物数量。

MONO的局部反应显著低于先前使用CoVaccine HT或类似产物所观察到的那些局部反应。

在首次免疫接种之前(第0天)、首次免疫接种之后三周(第21天)和第二次免疫接种之后一周(第28天)收集血液样品。如Theisen等人(Vaccine,32,第2623-2630页,2014)所述通过ELISA，使用用于免疫接种的抗原R0.10C包被ELISA板来测量抗体滴度。算术平均抗体滴度(AMT)和标准偏差(SD)于表8中给出。

表8：使用R0-10C作为抗原，通过ELISA测定首次免疫接种之后三周和第二次免疫接种之后一周的抗体应答^a

^a第0天首次免疫接种之前的AMT±SD为25.6±9.3。

首次免疫接种之后三周(第21天)和第二次免疫接种之后一周(第28天)的几何平均抗体滴度(GMT)和标准偏差(SD)以及反对数(10^GMT)示于表9中。

表9：使用R0-10C作为抗原，通过ELISA测定首次免疫接种之后三周和第二次免疫接种之后一周的抗体应答^a

^a第0天首次免疫接种之前的GMT±SD为1.4±0.2且反对数为23.2

如Theisen等人(Vaccine 32,第2623-2030页,2014)所述测量针对恶性疟原虫的配子母细胞提取物的抗体滴度。首次免疫接种之后三周(第21天)和第二次免疫接种之后一周(第28天)的几何平均抗体滴度(GMT)和标准偏差(SD)以及反对数值(10^GMT)示于表 10中。

表10：使用恶性疟原虫的配子母细胞提取物作为抗原，通过ELISA测定首次免疫接种之后三周和第二次免疫接种之后一周的抗体应答^a

^a第0天首次免疫接种之前的GMT±SD为1.5±0.1且反对数为32.5。

如Theisen等人(Vaccine 32,第2623-2030页,2014)所述，还使用恶性疟原虫的裂殖体提取物作为抗原通过ELISA测量针对无性阶段的抗体滴度。首次免疫接种之后三周(第21天)和第二次免疫接种之后一周(第28天)的几何平均抗体滴度(GMT)、标准偏差(SD)以及反对数值(10^GMT)示于表11中。

表11：使用恶性疟原虫的裂殖体提取物作为抗原，通过ELISA测定首次免疫接种之后三周和第二次免疫接种之后一周的抗体应答a

^a未测定第0天首次免疫接种之前的GMT(SD)。

总体考虑这些体内数据且如图3中所示，本发明的MONO级分的E/T比优于已知的S12(其是ZERO、MONO和POLY的混合物)的E/T比。本发明的MONO级分与 S12等效或比S12稍微更有效，并且比明矾显著地更有效。另外，本发明的MONO级分与明矾相比有同等或稍微更小的毒性且与S12相比有显著更小的毒性。换言之，富含MONO的佐剂配方结合了CoVaccine HT(ZERO、MONO和POLY的混合物且为强佐剂的基准)的功效与明矾(安全佐剂的基准)的安全性。具有这样的E/T比的佐剂是广泛应用于现有和新型免疫产品(包括疫苗)的候选物。

MONO在S12佐剂配方中的剂量类似于M10-MONO、G12-MONO和M12-MONO 的剂量。从该数据得到的另一结论是，MONO的E/T比显著高于ZERO或POLY的 E/T比或这两者的E/T比。

实施例7：通过液相色谱纯化单硫酸七(癸基)麦芽糖(‘M10-MONO’)的优化

为了进一步改进用于将MONO级分从ZERO、MONO和POLY的混合物中分离的方法，使用固定相与移动相的各种组合进行液相色谱。用以下条件获得纯度和产率的优异结果：干燥的硅石，高纯度级别，孔径

230-400目粒度，40-63μm(Fluka，目录编号60737)以及由12v/v％的三乙胺(Sigma-Aldrich，目录编号90340)、12v/v％的 2-异丙醇(Sigma-Aldrich，目录编号24137；Ph.Eur)及76v/v％的庚烷(Sigma-Aldrich，目录编号32287；Ph.Eur)组成的洗脱液。将在60mL洗脱液中的20g M10施加于由在约500mL洗脱液中的260g硅石(在160℃和<100毫巴下在真空烘箱中干燥至少3h) 制备的柱上。以约3L/h的流速洗脱该柱并收集50mL的级分。通过 HPTLC(Sigma-Aldrich Uniplate目录编号Z26531-4)，用庚烷中的20v/v％异丙醇作为洗脱液分析每种级分。在介于400mL与600mL之间下洗脱M10-ZERO。在介于800 mL与3200mL之间下洗脱M10-MONO。POLY保留在柱上并且可用100％的2-异丙醇洗脱。单次液相色谱运行产生>90％的M10-MONO的回收率，其中通过半定量 HPTLC分析测定具有<2％的ZERO和<2％的POLY。

实施例8：MONO与POLY的比较

MONO和POLY的制备

如实施例1中所述通过将D-(+)-半乳糖、D-(+)-麦芽糖和麦芽三糖与SO3.吡啶和癸酰氯(所有都是由Sigma-Aldrich获得)接触来合成半乳糖脂肪酸硫酸酯、麦芽糖脂肪酸硫酸酯和麦芽三糖脂肪酸硫酸酯。

通过制备型液相色谱使用干燥硅石作为固定相从半乳糖脂肪酸硫酸酯、麦芽糖脂肪酸硫酸酯和麦芽三糖脂肪酸硫酸酯中分别分离出MONO，即半乳糖四(癸酸)单硫酸酯(在上文称为单硫酸四(癸基)半乳糖(‘G10-MONO’))、麦芽糖七(癸酸)单硫酸酯(在上文称为单硫酸七(癸基)麦芽糖(‘M10-MONO’))和麦芽三糖九/十(癸酸)单硫酸酯(在本文中称为‘T10-MONO’)和POLY，即半乳糖癸酸多硫酸酯(在本文中称为‘G10-POLY’)、麦芽糖癸酸多硫酸酯(在本文中称为‘M10-POLY’)和麦芽三糖癸酸多硫酸酯(在本文中称为‘T10-POLY’)。使用正庚烷、异丙醇和三乙胺(76:12:12体积％)的混合物洗脱MONO 并且使用异丙醇、三乙胺、甲醇和超纯水(例如，50:20:20:10体积％)的混合物洗脱 POLY。通过TLC使用硅石板以及正庚烷、异丙醇和三乙胺(76:12:12体积％)作为洗脱液分析级分。通过用甲醇中的5v/v％的硫酸喷雾并在100℃下加热10-20min观测点样。汇集具有纯MONO或POLY的级分并蒸发至干燥。

无菌的、即用型水包油型佐剂配方通过以下操作来制备：将MONO或POLY、 Tween80、角鲨烷以及磷酸盐缓冲盐水(PBS)混合，使该混合物穿过高压乳化器三次，使亚微乳液穿过0.2μm过滤器并且在无菌容器中回收乳液。MONO或POLY、Tween 80以及角鲨烷的浓度是40g/L。

通过每g MONO或POLY添加1g聚山梨醇酯80来制备MONO和POLY在PBS 中的水性配方。

含有MONO和POLY的亚微乳液的稳定性

在4℃或室温下两周之后，具有POLY中的一种(而非不具有POLY或具有MONO 中的一种)的乳液展现出相的分离。这表明POLY而非MONO对乳液的物理稳定性具有有害作用。

MONO和POLY的体外溶血活性

通过在96孔V形微量滴定板(Greiner)中将任一种化合物在PBS中的水性配方的系列稀释液与1v/v％绵羊红细胞混合来测定MONO和POLY的溶血活性。在环境温度下培育1h之后，测定得到50％溶血的化合物浓度(表12)。MONO(G10-MONO、 M10-MONO和T10-MONO)的溶血活性是POLY(G10-POLY、M10-POLY和T10-POLY) 的100倍至>3000倍低。

表12：各种MONO和POLY的溶血活性

条目	化合物	得到50％溶血的浓度(mg/mL)
			A	G10-MONO	>10
B	G10-POLY	0.003
			C	M10-MONO	>10
D	M10-POLY	0.3
			E	T10-MONO	>10
F	T10-POLY	0.1

MONO和POLY的体内效应

在第0天(‘免疫前’)和第21天使用剂量为15μg HA的在Madin犬肾细胞(由MedigenVaccine公司友情提供)上生长的H5N1(使用或不使用佐剂)对六只兔子的组进行肌内免疫。在个体动物中在预定的时间间隔下测定免疫应答(表13和14a-c)、体温(表15)、体重增加(表16)以及局部反应(表17和图4a-i)。进行体内和离体分析作为单盲测试并且在其完成之后公开治疗。

MONO和POLY对免疫应答的影响

在第0天、第21天及第28天收集6只动物的7个组的血液样品。测定第21天和第28天的个体血清样品中的抗体滴度及第0天的7个血清样品中的6个池中的抗体滴度。

如世界卫生组织在实验室程序‘Serological detection of avian influenza A(H7N9) virus infections by modified horse red blood cells hemagglutination-inhibition assay’(2013) 中所述(有一些修改)测量针对H5N1的血细胞凝集抑制(HI)抗体滴度。简单说来，将 100μL的在56℃下预处理30min的血清样品与400μL含有0.5w/v％的无蛋白酶的牛血清白蛋白级分V(‘PBS/BSA’；Sigma)的冷PBS以及50μL浓集的马红细胞一起添加。冷却和离心30min之后，回收100μL上清液，并且添加100μL受体破坏酶(霍乱滤液；Sigma)在PBS/BSA中的溶液并在37℃下保持过夜。随后，在56℃下保持预处理的血清样品30min以破坏酶。将50μL的预稀释为1/10的这些血清样品在PBS/BSA中连续稀释两倍。添加50μL的在含有8个血细胞凝集单位的PBS/BSA中的H5N1悬浮液并且在室温下保持30min。随后，在60min之后测定0.75％的浓集的马红细胞在 PBS/BSA中的50μL悬浮液和凝集抑制。

免疫前血清的池得到13的HI滴度(表13)。在无佐剂的首次免疫接种之后，滴度是34并且使用佐剂的滴度是介于57与113之间。增加倍数在2与3之间。在不使用佐剂的第二次免疫接种之后，滴度增至135且使用佐剂时是介于359与1208之间。增加倍数在3至9之间变化。

表13：使用具有不同佐剂的H5N1在第一和第二次免疫接种之后针对H5N1的 HI抗体应答^a

^a第0天首次免疫接种之前的GMT±SD为3.7±0.3且反对数为13。

通过ELISA使用H5N1、H1N12和H3N2作为包被抗原来测定针对H5N1(指定为‘H5N1’，Medigen Vaccine Corp.)的同源抗体滴度以及针对A/New Jersey H1N1(指定为‘H1N1’；由荷兰韦斯普的Solvay-Pharmaceuticals友情提供的商业批次)和 A/Panama 2007/1999H3N2(指定为‘H3N2’；由荷兰韦斯普的Solvay-Pharmaceuticals友情提供的商业批次)的异源(交叉反应性)抗体滴度。

在试验性研究中确认测试条件。用2μg抗原/mL包被缓冲液(碳酸盐缓冲液；0.1 M；pH＝9.6)包被ELISA板。洗涤之后，用磷酸盐缓冲盐水中的2w/v％的牛血清白蛋白(Sigma-Aldrich)阻断板。将血清样品预稀释并在磷酸盐缓冲盐水中的1w/v％的牛血清白蛋白中连续稀释。将山羊抗兔IgG-HRPO缀合物(山羊抗兔IgG(H&L)、F(ab)2 片段(亲和纯化的)、辣根过氧化物酶缀合物，1mg/mL；Novex，美国)在磷酸盐缓冲盐水中的1w/v％牛血清白蛋白中稀释为1/10,000。使用3,3',5,5'-四甲基联苯胺 (Sigma-Aldrich)的即用型溶液作为底物。在室温下20min之后用1体积的1M硫酸中止酶促反应。由血清浓度相对于消光值的绘图的线性部分的回归系数计算滴度并且表示产生1.0的光密度的血清浓度的log值。在包被抗原不存在时没有观察到显著的应答 (log值<1)。对每个组计算几何平均滴度(GMT)、标准偏差(SD)和反对数值。通过将佐剂组的反对数值除以对照(PBS)组的反对数值来计算增加倍数。在第0天(免疫前)针对 H5N1、H1N1及H3N2的ELISA滴度是低的并且被视为测试系统的本底。

未使用佐剂的第一和第二次免疫接种之后的抗H5N1抗体滴度分别是11,676和488,299且使用佐剂得到高达5倍增加(表14a)。

未使用佐剂的两次免疫接种之后的抗H1N1抗体滴度是7,911且使用佐剂得到高达3倍增加(表14b)。

第一和第二次免疫接种之后的抗H3N2抗体滴度分别是444和776且使用佐剂得到高达6倍的应答增加(表14c)。

与G10-POLY相比，G10-MONO得到针对H5N1、H3N2及H1N1的更高ELISA 抗体应答。与M10-POLY相比，M10-MONO得到针对H3N2和H1N1的更高应答，但针对H5N1得到类似应答。因此，与相应的POLY相比MONO呈现至少相等且通常更佳的活性。

惊人地，用G10-POLY和M10-POLY的免疫接种产生针对H3N2和H1N1的低滴度，有时甚至低于未使用佐剂的免疫接种。一种解释是免疫原的抗原性部分被 G10-POLY和M10-POLY破坏。POLY的这种有害作用是严重的缺点，因为其对疫苗的质量和稳定性具有消极影响。由于在抗原与佐剂混合并将混合物保持在低温(4℃)下之后的几天内已经发生了这些巨大影响，所以应尽可能避免POLY在疫苗制剂中的存在。

由于用于免疫接种的H5N1与用于检测的H3N2和H1N1在不同的底物上生长并且纯化，所以抗H3N2和抗H1N1抗体识别交叉反应性的病毒抗原。对交叉反应性抗原性部分的有害作用致使POLY不适合作为用于基于交叉反应性抗原的通用流感疫苗的佐剂。

表14a：在用H5N1免疫接种之后不同佐剂对H5N1(免疫原)的ELISA抗体应答的影响^a

^a第0天首次免疫接种之前的GMT±SD为1.23±0.38且反对数为17。

表14b：在兔中用H5N1免疫接种之后不同佐剂对针对H1N1的ELISA抗体应答的影响^a

^a第0天首次免疫接种之前的GMT±SD为0.29±0.23且反对数为2。

表14c：在兔中用H5N1免疫接种之后不同佐剂对针对H3N2的ELISA抗体应答的影响^a

^a第0天首次免疫接种之前的GMT±SD为0.52±0.33且反对数为3。

MONO和POLY对体温的影响

在免疫接种之前和之后在不同的每日间隔下测量个体兔的体温。首次免疫接种之后一天和两天体温的平均值±SD增加示于表15中。与相应POLY对应物相比， G10-MONO和M10-MONO得到较少的体温增加。

表15：首次免疫接种之后一天和两天体温的增加

MONO和POLY对体重增加的影响

监测个体兔子的体重增加并且首次免疫接种之后两周的平均值±SD增加示于表16中。实验动物是年轻的并且预期仍生长，由此较小的体重增加反映作为治疗的不期望的副作用的生长抑制。发现在圈养和喂养动物的类似条件下，G10-POLY与 G10-MONO相比得到显著较少的体重增加。

表16：首次免疫接种之后体重的增加

免疫接种之后MONO和POLY对局部反应的影响

在第28天分析局部反应并且每组的几何平均分数(GMS)±SD和反对数值示于表17中。第二次免疫接种之后一周，G10-POLY和M10-POLY分别得到12,261和2,364 的分数，而G10-MONO和M10-MONO得到显著较低的分数，分别是51和22。如图 4b-i中所示，针对POLY的局部反应的尺寸达到直径2cm并且显示出肉芽肿和坏死。

表17：在第一和第二次免疫接种之后注射部位处的局部反应

POLY而非MONO的这些副作用清楚地说明了本发明。突出的例子是G10-MONO 对比G10-POLY。与G10-POLY相比，G10-MONO在第二次免疫接种之后一周展现 40倍高的抗H3N2抗体应答和5倍高的抗H1N1抗体应答；在首次免疫接种之后两周展现4倍高的体重增加；在首次免疫接种之后展现2倍低的体温增加且在第二次免疫接种之后一周展现240倍低的局部反应评分。

将关于功效(例如抗H3N2抗体滴度)和毒性(例如第二次免疫接种之后一周的局部反应评分)的数据结合，显示出G10-MONO的功效/毒性(E/T)比为2050/51＝40且 G10-POLY的为54/12,261＝0.0044。这意味着G10-MONO的E/T比是其POLY对应物的E/T比的9,082倍高。

类似地，所计算的M10-MONO和M10-POLY的E/T比分别是4711/22＝214和635/2364＝0.2686，这意味着与M10-POLY相比，M10-MONO的E/T比是797倍高。

MONO与POLY的E/T比的该差异进一步示于图5中，示出了用MONO或POLY 对动物进行免疫的个体数据。

总之，与MONO对比，POLY具有重要的劣势和缺点。所观察到的POLY的不良体外作用(如高溶血活性、乳液的快速去稳以及抗原表位的破坏)对含有POLY的疫苗的质量和稳定性都具有消极影响。POLY的不良体内作用如全身和局部不良事件对体内性能、E/T比以及由此疫苗的益处/风险比具有消极影响。因此，应尽可能避免POLY 在包括疫苗的医药产品中的存在。

已发现，不含碳水化合物多硫酸脂肪酸酯(POLY)的碳水化合物硫酸脂肪酸酯具有作为医药产品和/或疫苗佐剂的重要优点。一般说来，含有具有不同活性特征的多种活性成分的医药产品的开发和商业利用是极其复杂的，需要巨大的努力并且伴有失败的高风险。

安全性、功效和质量是包括疫苗和化合物的医药产品的三个关键成功因素，应尽可能避免对这三个因素中的一个的消极影响。本发明涉及作为有前景的疫苗佐剂的缺少多硫酸酯的碳水化合物硫酸脂肪酸酯。

Claims

1.一种佐剂，所述佐剂包含含有硫脂-碳水化合物的碳水化合物脂肪酸硫酸酯混合物以及药学上可接受的载体，所述硫脂-碳水化合物为被至少一个硫酸酯基和至少一个脂肪酸取代的碳水化合物，其中小于2摩尔％的所述碳水化合物脂肪酸硫酸酯混合物被多于一个硫酸酯基取代，其中所述碳水化合物为单糖、二糖、三糖、环糊精或其混合物，并且其中所述脂肪酸具有介于6与18个之间的碳原子。

2.根据权利要求1所述的佐剂，其中所述碳水化合物脂肪酸硫酸酯混合物包含50摩尔％或更少的不含硫酸酯基的碳水化合物酯。

3.根据权利要求1所述的佐剂，其中所述碳水化合物脂肪酸硫酸酯混合物包含25摩尔％或更少的不含硫酸酯基的碳水化合物酯。

4.根据权利要求1所述的佐剂，其中所述碳水化合物脂肪酸硫酸酯混合物包含10摩尔％或更少的不含硫酸酯基的碳水化合物酯。

5.根据权利要求1所述的佐剂，其中

·所述单糖为选自由以下组成的组的一种或多种：阿洛糖、阿卓糖、葡萄糖、甘露糖、古洛糖、艾杜糖、半乳糖、塔罗糖、阿洛酮糖、果糖、山梨糖、塔格糖、阿拉伯糖、核糖、木糖、来苏糖、核酮糖、木酮糖和肌醇；

·所述二糖为选自由以下组成的组的一种或多种：蔗糖、麦芽糖、乳糖、乳果糖、纤维二糖、海藻糖、龙胆二糖、松二糖、异麦芽酮糖和蜜二糖；

·所述三糖为选自由以下组成的组的一种或多种：棉子糖、松三糖、麦芽三糖、异麦芽三糖、蔗果三糖和尼吉罗三糖；和/或

·所述环糊精为α-环糊精、β-环糊精或γ-环糊精。

6.根据权利要求1所述的佐剂，其中所述碳水化合物的羟基中的一个被所述硫酸酯基取代，且其中所述碳水化合物的所有剩余羟基都被脂肪酸取代。

7.根据权利要求1所述的佐剂，其中所述脂肪酸具有8-12个碳原子。

8.根据权利要求1所述的佐剂，其中所述药学上可接受的载体为生理盐溶液、不溶性有机或无机化合物在生理盐溶液中的悬浮液或者与水不混溶的化合物与生理盐溶液的乳液。

9.根据权利要求8所述的佐剂，其中所述与水不混溶的化合物与生理盐溶液的乳液包含水包油乳液。

10.根据权利要求9所述的佐剂，其中所述油为选自由以下组成的组的一种或多种：角鲨烷、角鲨烯、植物油和矿物油。

11.根据权利要求10所述的佐剂，其中所述油为角鲨烷。

12.根据权利要求1所述的佐剂，所述佐剂用于医学用途。

13.根据权利要求12所述的佐剂，所述佐剂用于提高由抗原成分诱发的免疫应答。

14.根据权利要求13所述的佐剂，其中所述抗原成分是杀死的微生物，或来源于微生物的成分或成分混合物，或模拟微生物的相关抗原成分的通过化学或重组DNA技术制备的成分或成分混合物，或者其中所述抗原成分是变应原或宿主成分，需要针对所述变应原或宿主成分的免疫应答以用于治疗目的。

15.根据权利要求14所述的佐剂，其中所述杀死的微生物是细菌、病毒或寄生虫。

16.一种疫苗，所述疫苗包含根据权利要求1-15中任一项所述的佐剂和抗原成分。

17.根据权利要求16所述的疫苗，其中所述抗原成分是杀死的微生物，或来源于微生物的成分或成分混合物，或模拟微生物的相关抗原成分的通过化学或重组DNA技术获得的成分或成分混合物，或者其中所述抗原成分是变应原或宿主成分，需要针对所述变应原或宿主成分的免疫应答以用于治疗目的。

18.根据权利要求17所述的疫苗，其中所述杀死的微生物是细菌、病毒或寄生虫。

19.一种成套试剂盒，所述成套试剂盒包含根据权利要求1-15中任一项所述的佐剂且任选地包含抗原成分。

20.一种包含硫脂-碳水化合物的碳水化合物脂肪酸硫酸酯混合物，所述硫脂-碳水化合物是被至少一个硫酸酯基和至少一个脂肪酸取代的碳水化合物，其中小于2摩尔％的所述碳水化合物脂肪酸硫酸酯混合物被多于一个硫酸酯基取代，其中所述碳水化合物为单糖、二糖、三糖、环糊精或其混合物，并且其中所述脂肪酸具有介于6与18个之间的碳原子。

21.根据权利要求20所述的碳水化合物脂肪酸硫酸酯混合物，其中所述碳水化合物的羟基中的一个被所述硫酸酯基取代，且其中所述碳水化合物的所有剩余羟基都被脂肪酸取代。

22.一种用于制备根据权利要求20所述的包含单硫酸碳水化合物脂肪酸酯的碳水化合物脂肪酸硫酸酯混合物的方法，其中小于2摩尔％的所述碳水化合物脂肪酸硫酸酯混合物被多于一个硫酸酯基取代，所述方法包括碳水化合物的酯化和分级分离，其中所述酯化包括碳水化合物与磺化剂和与反应性脂肪酸酰基化合物的反应以获得所述碳水化合物脂肪酸硫酸酯混合物，且其中分级分离包括从所述碳水化合物脂肪酸硫酸酯混合物中除去具有多于一个硫酸酯基的碳水化合物酯以获得包含单硫酸碳水化合物脂肪酸酯的碳水化合物脂肪酸硫酸酯混合物，其中所述碳水化合物为单糖、二糖、三糖、环糊精或其混合物。

23.根据权利要求22所述的方法，其中分级分离进一步包括从所述碳水化合物脂肪酸硫酸酯混合物中除去不含硫酸酯基的碳水化合物酯。

24.一种碳水化合物脂肪酸硫酸酯混合物，所述碳水化合物脂肪酸硫酸酯混合物通过权利要求22或23获得。

25.一种碳水化合物脂肪酸硫酸酯混合物，所述碳水化合物脂肪酸硫酸酯混合物通过权利要求22或23获得，所述碳水化合物脂肪酸硫酸酯混合物被用作佐剂。

26.一种佐剂，所述佐剂包含通过权利要求22或23获得的碳水化合物脂肪酸硫酸酯混合物。