BR112017001121B1

BR112017001121B1 - Adjuvantes

Info

Publication number: BR112017001121B1
Application number: BR112017001121-2A
Authority: BR
Inventors: Lucas A. Th. Hilgers; Peter Paul L. I. Platenburg; Johannes F. Van Den Bosch
Original assignee: Litevax B.V.
Priority date: 2014-07-24
Filing date: 2015-07-24
Publication date: 2023-11-07
Also published as: CN106573047A; CA2954043A1; JP2017522391A; US20170209568A1; BR112017001121A2; KR20170040196A; CN106573047B; HUE047467T2; DK3193923T3; SI3193923T1; HRP20192113T1; EP3193923B1; EP3193923A1; US10342867B2; ES2759542T3; NZ728551A; JP6765371B2; AU2015294769A1; PL3193923T3; KR102458982B1

Abstract

adjuvantes. a presente invenção refere-se a uma nova família de ésteres de ácido graxo de carboidrato monossulfato, que contêm menos de 10% de ésteres de ácido graxo de polissulfato de carboidrato, e a um método de preparação da mesma. os ésteres de carboidrato monossulfato, de acordo com a invenção, compreendem um éster de sulfato e pelo menos um ácido graxo, e são, entre outros, úteis como adjuvantes para produtos imunológicos, como vacinas.

Description

Campo da Invenção

[0001] A presente invenção pertence ao campo dos ésteres de ácido graxo sulfatados como adjuvantes de vacinas.

Antecedentes da Invenção

[0002] A vacinação é um dos meios mais eficazes para prevenir e controlar doenças infecciosas na saúde humana e animal. As vacinas contêm antígenos vivos modificados, como bactérias, vírus, parasitas, (micro)organismos recombinantes ou antígenos inativados (não replicantes), tais como vírus inativados, bactérias inativadas, parasitas inativados, subunidades de (micro)organismos infecciosos, proteínas, polissacarídeos, peptídeos, glicoproteínas, conjugados de polissacarídeo-proteína, conjugados de peptídeo-proteína, etc. Em muitos casos, a resposta imunológica contra antígenos é muito baixa. Em tais casos, um adjuvante pode ser adicionado para estimular a resposta imunológica e, assim, aumentar a ação protetora das vacinas.

[0003] No controle das doenças infecciosas existentes, emergentes e re-emergentes, os adjuvantes desempenham um papel decisivo. Os adjuvantes podem ter diferentes funções, tais como para aumentar a resposta imunológica (protetora), para direcionar o tipo de resposta, para aumentar a duração da imunidade (protetora), para reduzir o tempo de atraso para a imunidade (protetora), para reduzir a dose do antígeno necessária e para reduzir o número de vacinas necessárias. Ao combinar um antígeno com um adjuvante, níveis de imunidade podem ser alcançados que não podem ser atingidos pelo tratamento apenas com antígeno.

[0004] Além disso, um adjuvante pode reduzir significativamente a dose de antígeno necessária para atingir níveis predefinidos de proteção, desse modo reduzindo os custos das mercadorias, transporte e armazenamento e aumentando a capacidade de produção e a disponibilidade. O adjuvante barato substitui grande parte do antígeno caro e promove o acesso a esses produtos medicinais pelas pessoas mais pobres.

[0005] O alume (hidróxido de alumínio) é o exemplo clássico de um adjuvante seguro, e é aplicado em várias vacinas humanas. No entanto, em muitos casos, a atividade adjuvante é insuficiente e carece de um adjuvante mais forte, porém pelo menos igualmente seguro.

[0006] Além disso, os derivados de éster de carboidrato e ácido graxo substituídos com sulfato são conhecidos. Estes são comumente chamados de sulfolipídio- carboidratos (SL-carboidratos), e a síntese e função dos mesmos como adjuvante são conhecidas.

[0007] Os SL-carboidratos conhecidos têm em comum que eles são preparados por duas etapas de síntese, uma esterificação dos grupos hidroxila do carboidrato com o(s) ácido(s) graxo(s) e uma esterificação dos grupos hidroxila do carboidrato com um agente de sulfonação. Essas reações podem ser realizadas simultaneamente ou em qualquer ordem. Ambas as reações são reações aleatórias, o que significa que não nenhuma ou limitada discriminação entre os diferentes grupos hidroxila dos carboidratos disponível para esterificação. Portanto, o(s) grupos(s) sulfato e o(s) ácido(s) graxo(s) são distribuídos aleatoriamente sobre o carboidrato substituído, resultando em uma mistura de muitos compostos químicos diferentes.

[0008] O número de SL-carboidratos quimicamente distintos formados pelos métodos de síntese aleatória depende do número de sítios reativos (grupos hidroxila) na estrutura do carboidrato. Colocar em contato um carboidrato com 1 equivalente (um mol por mol de carboidrato) dos agentes de sulfonação resulta na formação de carboidratos com um número diferente de grupos sulfato e na formação de carboidratos com grupos sulfato nas diferentes posições. Por exemplo, misturas de SL-carboidrato conhecidas na técnica consistem em uma mistura de ésteres de carboidrato, dentre outros, sem grupos sulfato (aqui referida como “ZERO”), com um grupo sulfato (aqui referida como “MONO”) ou vários grupos sulfato (dois ou mais grupos sulfato; aqui referida como “POLI”). A razão de ZERO: MONO: POLI pode ser determinada estatisticamente usando a fórmula mencionada no documento WO 96/20222. Em 1 mol de agente de sulfonação por mol de dissacarídeo (com oito grupos hidroxila disponíveis para sulfonação), a razão molar teórica de ZERO:MONO:POLI no produto final é igual a 37%:37%:26%. A uma razão molar inferior de agente de sulfonação por carboidrato, a % de POLI formado diminui, e a % de ZERO formado aumenta. A 0,2 mol de agente de sulfonação por mol de carboidrato, a razão molar teórica de ZERO:MONO:POLI é igual a 82%:16%:2%.

[0009] O uso de uma mistura de componentes como produto medicinal pode estar associado com desvantagens importantes com relação à qualidade, à consistência e à segurança do produto. Em particular, para adjuvantes, por exemplo, em vacinas, é importante enfatizar que eles são aplicados em grande escala em indivíduos saudáveis. A toxicidade, a eficácia e a qualidade são, portanto, pré- requisitos importantes.

[0010] É geralmente aceito que existe uma relação entre a atividade adjuvante (eficácia) e os efeitos colaterais (toxicidade) e essa o aumento da eficácia é acompanhado pelo aumento da toxicidade (consulte, por exemplo, Hilgers, Methods Mol. Biol. 626 pp. 251-9, 2010). A razão entre a eficácia e a toxicidade é chamada de razão E/T, e é um parâmetro importante na definição dos adjuvantes. Uma desvantagem dos adjuvantes, compreendendo um SL- carboidrato da técnica anterior é a falta de segurança suficiente (toxicidade muito alta ou uma razão E/T muito baixa).

[0011] A atividade adjuvante e a toxicidade aumentam com o aumento da dose do adjuvante. Ao diminuir a dose do adjuvante, os efeitos colaterais também diminuem. No entanto, é incerto se, a um nível de toxicidade aceitável, a eficácia permanece de modo suficiente. Portanto, ainda há uma necessidade de adjuvantes com uma razão de eficácia/toxicidade maior do que a dos existentes, incluindo os adjuvantes à base de SL-carboidrato. Essas melhorias podem incluir maior eficácia com toxicidade semelhante, baixa toxicidade com eficácia semelhante ou maior eficácia combinada com baixa toxicidade.

[0012] O documento WO 01/402490 divulga SL- monossacarídeos e SL-dissacarídeos, um método para a preparação destes SL-monossacarídeos e SL-dissacarídeos e o uso destes como um adjuvante da vacina. Misturas de SL- dissacarídeos são formadas em uma reação com um equivalente molar do agente de sulfonação por mol de dissacarídeo e sete equivalentes molares de cloretos de ácido graxo (também referidos como cloretos de acila) por mol de dissacarídeo. Isso resulta em uma mistura de 6.561 compostos químicos diferentes possíveis, onde a presença relativa deles pode ser determinada por estatísticas. Estes produtos foram sujeitos a intensas pesquisas sob o nome “CoVaccine HT” (BTG plc, Reino Unido). As misturas obtidas usando um ou mais equivalentes molares do agente de sulfonação e um ou mais equivalentes molares do cloreto de ácido foram testadas quanto à sua atividade adjuvante. No entanto, a toxicidade dos derivados de SL-carboidrato testados foi muito alta para o uso generalizado em seres humanos.

[0013] Hilgers et al. (Vaccine 17, pp. 219-228, 1999), Blom & Hilgers (Vaccine 29, pp. 3791-3801, 2011) e EP2580226 divulga efeitos colaterais indesejáveis, como o aumento da temperatura corporal e a irritação local de adjuvantes e/ou vacinas à base de SL-carboidrato.

[0014] Hilgers et al. (Vaccine 17, pp. 222-225, 1999) divulga uma relação entre o peso molecular dos SL- carboidratos, por um lado, e a atividade adjuvante e a reatogenicidade local, por outro lado. A reação local, mas não a atividade adjuvante, aumenta com o aumento do peso molecular do SL-carboidrato. Além disso, um aumento temporário da temperatura corporal de até 1,7 °C e inchaço no local de injeção por até 4 semanas é muito comum. Vômito pode ocorrer em 1 a 25% dos casos durante a primeira hora após a vacinação. Inflamação granulomatosa das fibras musculares persistente e de leve a moderada é observada no lado da injeção durante até 8 semanas após a vacinação (European Public Assessment Report (EPAR) on porcine circovaccine adjuvanted with SL-cyclodextrin).

[0015] O documento EP2580226 divulga eventos adversos dos SL-trissacarídeos, incluindo reações adversas locais e o aumento na temperatura corporal. Os efeitos colaterais são significativos e impedem a aplicação profilática generalizada do produto em indivíduos saudáveis. Também para um SL-dissacarídeo, efeitos colaterais locais e sistêmicos significativos também foram observados, tal como é divulgado por Turkstra et al. (Vaccine 29, pp. 3791-3801, 2011) e em EP2580226.

[0016] Ensaios clínicos humanos usando SL- dissacarídeos (CoVaccine HT) foram descontinuados por razões que podem estar relacionadas com ou a consequência das reações adversas observadas com os SL-carboidratos em geral, incluindo os SL-dissacarídeos. Os adjuvantes à base de SL- carboidrato conhecidos são considerados impróprios para o uso humano.

[0017] O documento WO 2008/005824 divulga composições compreendendo agonistas de células T killer naturais e veículos fisiologicamente aceitáveis, e métodos de estimulação de uma célula T killer natural e de aumentar uma resposta imunológica. Os compostos divulgados são derivados sintéticos de monossacarídeos e dissacarídeos contendo um grupo ceramida e, opcionalmente, um ou vários grupos sulfato. Os compostos não compreendem um ácido graxo no núcleo sacarídeo, e são, portanto, diferentes dos compostos aqui reivindicados.

[0018] O documento WO 01/402490 divulga métodos para isolar uma mistura de derivados de DSL-monossacarídeos e SL- dissacarídeos, a partir da mistura reacional. As técnicas listadas incluem cristalização, precipitação, filtração, diálise de evaporação ou ultrafiltração. Embora esses métodos podem ser adequados para isolar uma mistura de derivados de SL-monossacarídeo e SL-dissacarídeo da mistura reacional, ou para separar uma mistura de derivados de SL- monossacarídeo e SL-dissacarídeo de certos subprodutos, eles não são adequados para purificar isômeros MONO dos SL- carboidratos da presente invenção dos isômeros POLI.

[0019] Em resumo, uma desvantagem dos adjuvantes fortes, como produtos à base de SL-carboidrato, é a sua toxicidade relativamente alta, e uma desvantagem dos adjuvantes seguros, como o alume, é sua atividade adjuvante relativamente baixa.

[0020] Como tal, continua a haver uma necessidade de adjuvantes com uma maior eficácia e toxicidade igual ou menor, para permitir o aumento adicional da resposta imunológica durante a vacinação. A presente invenção divulga compostos que conseguem realizar isso.

Figuras

[0021] Figura 1: Cromatografia em camada fina de alta eficiência (HPTLC) das formulações adjuvantes testadas em coelhos de SL-carboidratos da técnica anterior e de misturas de éster de carboidrato enriquecidas em MONO da presente invenção. Da esquerda para a direita: CoVaccine HT (preparada pela CoVaccine BV), S12 (formulação como a CoVaccine HT preparada internamente), M10-MONO (isolada de M10) G12-MONO (isolada de G12), MONO-M12 (isolada de M12), emulsão de esqualano em água sem um SL-carboidrato, CoVaccine HT (duplicata) e S12 (duplicata).

[0022] Figura 2: Temperatura média corporal (°C) em coelhos um dia após o primeiro (colunas cinza claras) e a segunda imunização intramuscular (colunas cinza escuras) com o antígeno R0.10C recombinante, além de diferentes adjuvantes. A dose do MONO em S12 (uma mistura de ZERO, MONO e POLI), M10-MONO, G12-MONO e M12-MONO foi de 4 mg para a primeira imunização e de 8 mg para a segunda imunização. A dose de alume da primeira e da segunda imunização foi de 110 μg.

[0023] Figura 3: Razão de eficácia/toxicidade em coelhos de apenas antígeno (diamantes abertos), alume (diamantes cinzas), S12 (triângulos pretos), M10-MONO (círculos abertos), G12-MONO (círculos cinzas) e M12-MONO (círculos pretos). A eficácia (eixo y) é expresso como a média geométrica dos títulos de anticorpo obtidos por ELISA (valores de 10log) em comparação com o antígeno R0.10C recombinante (painéis superiores), extrato de gametócito de Plasmodium falciparum (painéis do meio) e extrato de esquizonte de P. falciparum (painéis inferiores) uma semana após a segunda imunização (dia 28). A toxicidade (eixo x) é expressa como a temperatura corporal (°C) um dia após a primeira imunização (dia 1, painéis da esquerda) e um dia após a segunda imunização (dia 22, painéis da direita).

[0024] Figura 4: Fotografias do sítio de injeção, uma semana após a segunda imunização em um coelho que recebeu MONO ou G10-MONO, como adjuvante (figura 4a) e 8 coelhos que receberam POLI, G10-POLI ou M10-POLI, como adjuvante (figura 4b a 4i). • Figura 4a: Animal 821; Grupo 4; Adjuvante G10-MONO; Pontuação de toxicidade = 0,10; antilog = 1 • Figura 4b: Animal 825; Grupo 5; Adjuvante G10-POLI; Pontuação de toxicidade = 5,51; antilog = 324.000 • Figura 4c: Animal 832; Grupo 7; Adjuvante M10-POLI; Pontuação de toxicidade = 5,29; antilog = 194.400 • Figura 4d: Animal 834; Grupo 5; Adjuvante G10-POLI; pontuação de toxicidade 4,99; antilog 97.200 • Figura 4e: Animal 839; Grupo 5; Adjuvante G10-POLI; pontuação de toxicidade = 4,91; antilog = 81.000 • Figura 4f: Animal 841; Grupo 5; Adjuvante G10-POLI; Pontuação de toxicidade = 4,29; antilog = 19.440 • Figura 4g: Animal 843; Grupo 5; Adjuvante G10-POLI; Pontuação de toxicidade = 4,74; antilog = 54.432 • Figura 4h: Animal 845; Grupo 7; Adjuvante M10-POLI; Pontuação de toxicidade = 6,11; antilog = 1.296.000 • Figura 4i: Animal 850; Grupo 7; Adjuvante M10-POLI; Pontuação de toxicidade = 5,08; antilog = 121.500

[0025] Figura 5: Gráfico E/T dos títulos de anticorpo anti-H3N2 individuais (eixo y) contra pontuações de reação local 1 semana após a imunização 1 mais 4 semanas após a imunização 2. Grupos de 6 coelhos foram imunizados com H5N1 mais G10-MONO ou M10-MONO (diamantes) ou com o G10-POLI ou M10-POLI como adjuvante (quadrados) no dia 0 e no dia 21. Os títulos e as reações locais do anticorpo foram determinados no dia 28, os dados individuais estão representados graficamente.

Descrição Detalhada

[0026] Em vista do exposto, é um objeto da presente invenção fornecer um adjuvante, que tem uma excelente segurança e perfil de eficácia, que seja fácil e barato para preparar e que tenha uma alta qualidade e estabilidade. É um outro objeto da presente invenção fornecer compostos que podem ser usados em uma composição adjuvante, por exemplo, em combinação com um componente antigênico para preparar uma vacina.

[0027] A presente invenção diz respeito a um adjuvante, que compreende uma mistura de éster de carboidrato que compreende um sulfolipídio-carboidrato, que é um carboidrato substituído com um grupo sulfato e com pelo menos um ácido graxo, em que menos de 10% em mol da mistura de éster de carboidrato é substituída com mais de um grupo sulfato, e um veículo farmaceuticamente aceitável. Preferencialmente, a mistura de carboidratos compreende menos de 50% em mol de um éster de carboidrato sem grupos sulfato, mais preferencialmente, 25% em mol ou menos, e ainda mais preferencialmente, menos de 10% em mol.

[0028] Preferencialmente, menos de 5% em mol, mais preferencialmente, menos de 2% e, mais preferencialmente, cerca de 0% da mistura de éster de carboidrato é substituído com mais de um grupo sulfato.

[0029] Na presente invenção, verificou-se que a toxicidade de uma mistura de sulfolipídio-carboidratos, como CoVaccine HT, foi em grande parte devido ao grupo de sulfolipídio-carboidratos substituídos com mais de um grupo sulfato (referido como “POLI”). Sulfolipídio-carboidratos substituídos com um grupo sulfato (referido como “MONO”) exibem boa atividade adjuvante, tendo consideravelmente menos toxicidade. Como tal, a razão eficácia/toxicidade de uma mistura de éster de carboidrato, enriquecida em MONO, é melhorada. Como a descontinuação dos ensaios com seres humanos com a CoVaccine HT ocorreu pelo menos em parte devido à toxicidade elevada inaceitável do POLI como um dos principais constituintes da CoVaccine HT, a remoção substancial de POLI da mistura deve resultar em uma toxicidade aceitável em novos testes em seres humanos.

[0030] Um carboidrato, no presente contexto, é um monossacarídeo, um dissacarídeo, um trissacarídeo ou um polissacarídeo linear ou cíclico, preferencialmente, com pelo menos 4 e não mais do que 10 unidades monossacarídicas. Preferencialmente, um carboidrato é um monossacarídeo, um dissacarídeo, um trissacarídeo, uma ciclodextrina ou uma mistura dos mesmos, e mais preferencialmente, um monossacarídeo, um dissacarídeo ou uma ciclodextrina, ou uma mistura dos mesmos, e ainda mais preferencialmente, um dissacarídeo e/ou um monossacarídeo e, mais preferencialmente, o carboidrato é um dissacarídeo.

[0031] Um monossacarídeo é um açúcar selecionado de pentoses com a fórmula geral C5H10O5 e de hexoses com a fórmula geral C6H12O6. Alternativamente, um monossacarídeo é um ou mais de um selecionado do grupo consistindo em alose, altrose, glicose, manose, gulose, idose, galactose, talose, psicose, frutose, sorbose, tagatose, arabinose, ribose, xilose, lixose, ribulose, xilulose e inositol. Preferencialmente, um monossacarídeo é um ou mais selecionados dentre a frutose, galactose e glicose.

[0032] Um dissacarídeo é um açúcar com a fórmula geral C12H22O11 e é, preferencialmente, um ou mais selecionado do grupo consistindo em sacarose, maltose, lactose, lactulose, celobiose, trealose, gentiobiose, turanose, isomaltulose e melibiose. Preferencialmente, um dissacarídeo é um ou mais selecionados dentre lactose, maltose e sacarose. Mais preferencialmente, um dissacarídeo é maltose e/ou lactose.

[0033] Um trissacarídeo é um açúcar com a fórmula geral C18H32O16 e é, preferencialmente, um ou mais selecionados do grupo consistindo em rafinose, melezitose, maltotriose, isomaltotriose, rafinose, cestose e negerotriose. Preferencialmente, um trissacarídeo pode ser selecionado dentre a rafinose, melezitose e/ou maltotriose. Mais preferencialmente, um trissacarídeo pode ser selecionado dentre a rafinose e/ou maltotriose.

[0034] Uma ciclodextrina é um polissacarídeo cíclico com um número variado de monossacarídeos, como definido acima. Uma ciclodextrina é, preferencialmente, uma α-, β- ou Y-ciclodextrina (6, 7 ou 8 unidades de açúcar, respectivamente).

[0035] Um éster de carboidrato, no presente contexto, é um carboidrato substituído. Substituição significa que outros grupos estão ligados ao carboidrato, por meio de grupos hidroxila do carboidrato através de uma ligação éster, de modo que os carboidratos substituídos no presente contexto sejam ésteres de carboidrato. A substituição é com um grupo sulfato e com pelo menos um ácido graxo. Assim, os grupos sulfato são covalentemente ligados ao carboidrato através de um grupo éster em um grupo hidroxila de carboidrato, e semelhantemente, os ácidos graxos são ligados covalentemente ao carboidrato através de um grupo éster em um grupo hidroxila de carboidrato.

[0036] Um éster de carboidrato sem grupos sulfato, no presente contexto, é um éster de carboidrato, substituído com um ou mais ácidos graxos, mas não substituído com um grupo sulfato.

[0037] Um sulfolipídio-carboidrato, no presente contexto, é um carboidrato substituído com pelo menos um grupo sulfato e com pelo menos um ácido graxo. A mistura carboidrato-éster da invenção é enriquecida com ésteres de ácido graxo, monossulfato e carboidrato, e compreende menos de 10% em mol de ésteres de carboidrato substituídos com mais de um grupo sulfato.

[0038] Como tal, a presente invenção se refere a uma composição adjuvante que compreende uma mistura carboidrato- éster enriquecida em éster de ácido graxo, monossulfato e carboidrato, e seu uso como um adjuvante, por exemplo, em vacinas.

[0039] Uma mistura carboidrato-éster, de acordo com a invenção, compreende um carboidrato substituído em um grupo hidroxila com um grupo sulfato (-SO- ). Um grupo sulfato, no presente contexto, pode compreender um substituinte neutro ou iônico, selecionado a partir do grupo consistindo em átomos e/ou moléculas, que formam cátions monovalentes. Exemplos de membros desse grupo incluem H+, Na+, K+, Li+ e NH4+, e trietilamônio (Et3NH+). Assim, um grupo sulfato pode, por exemplo, ser SO , -SO3H, -SO-Na, -SO3K, -SO-Li ou - SO3NH4.

[0040] Além disso, o carboidrato é substituído em um grupo hidroxila com pelo menos um ácido graxo por molécula de carboidrato. Preferencialmente, o carboidrato é substituído com uma infinidade de ácidos graxos, como 2 a 4 para monossacarídeos, 2 a 7 para dissacarídeos ou ainda mais para carboidratos maiores, como definido acima. Mais preferencialmente, substancialmente todos os grupos hidroxila dos carboidratos, não substituídos com grupos sulfato, são substituídos com ácidos graxos. Isto significa que o carboidrato é, preferencialmente, substancialmente saturado com ácidos graxos, além da presença de um grupo sulfato. Substancialmente, nesse sentido significa que, de todos os grupos hidroxila não substituídos com sulfato em uma única molécula de carboidrato, pelo menos 50%, preferencialmente pelo menos 75%, mais preferencialmente pelo menos 80% ou, pelo menos, 90%, e ainda mais preferencialmente pelo menos 95% é substituído com um ácido graxo.

[0041] Como tal, a mistura carboidrato-éster da invenção é uma mistura enriquecida em um carboidrato substituído com um grupo sulfato e pelo menos um ácido graxo (ou seja, enriquecida em éster de ácido graxo, monossulfato e carboidrato). Preferencialmente, a mistura carboidrato- éster da invenção compreende os carboidratos, em que um dos grupos hidroxila do carboidrato é substituído com um grupo sulfato, e em que substancialmente todos os grupos hidroxila restantes do carboidrato são substituídos com ácidos graxos. A mistura carboidrato-éster da invenção compreende menos de 10% em mol de carboidratos substituído com mais de um grupo sulfato.

[0042] Ácidos graxos, no presente contexto, são bem conhecidos na técnica, e podem ser qualquer ácido graxo. Geralmente, um ácido graxo no presente contexto pode ser um ácido graxo que tem entre 6 e 18 átomos de carbono, preferencialmente, entre 8 e 12 átomos de carbono. Os ácidos graxos podem ser saturados ou insaturados, e podem ser ramificados, mas são, preferencialmente, lineares. Geralmente, um ácido graxo pode ser um ácido graxo saturado, de acordo com a fórmula geral -O-(C=O)-(CH2)x-CH3, em que x é entre 4 e 16. Além disso, um ácido graxo pode ser um ácido graxo insaturado, de acordo com uma das fórmulas -O-(C=O)- (CH2)x-CH=CH-(CH2)y-CH3, em que x + y é entre 4 e 14, ou -O- (C=O)-(CH2)x-CH=CH-(CH2)y-CH=CH-(CH2)z-CH3, em que x + y + z é entre 2 e 12.

[0043] Preferencialmente, os ácidos graxos podem ser de estrutura geral -O-(C=O)-(CH2)x-CH3, em que x pode ser 4 (ácido hexanoico), 6 (ácido octanoico), 8 (ácido decanoico), 10 (ácido dodecanoico; também referido neste documento como ácido láurico), 12 (ácido tetradecanoico, também conhecido como ácido mirístico) ou 14 (ácido hexadecanoico, também conhecido como ácido palmítico). São adicionalmente preferidos os ácidos graxos com a estrutura geral -O-(C=O)- (CH2)x-CH=CH-(CH2)y-CH3, em que x + y pode ser 14 (por exemplo, o ácido oleico). São adicionalmente preferidos os ácidos graxos com a estrutura geral -O-(C=O)-(CH2)x-CH=CH-(CH2)y- CH=CH-(CH2)z-CH3, em que x + y + z é 12 (por exemplo, o ácido linoleico). Preferencialmente, o ácido graxo é linear e tem entre 6 e 18 átomos de carbono, e mais preferencialmente, entre 8 e 12. Mais preferencialmente, o ácido graxo é o ácido decanoico ou o ácido dodecanoico.

[0044] Quando um carboidrato é substituído com mais de 1 ácido graxo, qualquer combinação de ácidos graxos, como descrita acima, é possível. Geralmente, qualquer combinação das características descritas na presente invenção é considerada como descrita no contexto da presente invenção.

[0045] É geralmente conhecido que, ao fazer carboidratos substituídos com um ou mais grupos de sulfato e com ácidos graxos, as reações necessárias para a formação destes compostos ocorreram ao acaso. Como tal, no processo de transformar um carboidrato com grupos N-hidroxila em um carboidrato substituído com um grupo de sulfato e com pelo menos um ácido graxo, o resultado não é uma única espécie molecular definida pelo carboidrato e a quantidade de sulfato e ácidos graxos adicionados. Em vez disso, uma mistura de carboidratos diferentes é obtida, em que as moléculas de carboidratos individuais podem de 0 a N grupos sulfato, de 0 a N grupos de ácido graxo e de 0 a N de grupos hidroxila que não reagiram (livres).

[0046] Os carboidratos da presente invenção são formados por procedimentos semelhantes aos descritos no WO 01/40240. No entanto, uma diferença com o WO 01/40240 é que a mistura carboidrato-éster da invenção é posteriormente enriquecida em carboidrato substituído com um grupo sulfato e com pelo menos um ácido graxo por fraccionamento, de modo que menos de 10% em peso da mistura carboidrato-éster é substituído com mais de um grupo sulfato. Preferencialmente, menos de 5% em mol do carboidrato é substituído com mais de um grupo sulfato, mais preferencialmente, menos de 2% em mol é substituído com mais de um grupo sulfato e, ainda mais preferencialmente, essencialmente todos os ésteres de carboidrato sulfato na mistura carboidrato-éster são substituídos com um único grupo sulfato.

[0047] Um efeito dessa diferença é que a eficácia do carboidrato como um adjuvante permanece estável ou é aumentada, enquanto que a toxicidade é substancialmente mais baixa ou está até mesmo ausente. Assim, um adjuvante com uma razão E/T consideravelmente melhorada é obtido, em relação aos adjuvantes conhecidos, dentre os quais, os adjuvantes à base de SL-carboidrato.

[0048] Portanto, a presente invenção se refere, entre outros, a um método para preparar uma mistura carboidrato- éster compreendendo ésteres de ácido graxo, monossulfato e carboidrato (aqui referidos como “MONO”). O método inclui a síntese de uma mistura de carboidratos substituídos com enxofre e ácido graxo. Os carboidratos substituídos com enxofre e ácido graxo também são chamados de sulfolipídio- carboidratos (SL-carboidratos). Posteriormente, uma mistura carboidrato-éster enriquecida em SL-carboidrato substituída com um grupo sulfato e com pelo menos um ácido graxo (enriquecido em éster de ácido graxo, monossulfato e carboidrato) é isolada a partir da mistura carboidrato-éster por fracionamento.

[0049] Como tal, a invenção pertence adicionalmente a um processo para preparar uma mistura carboidrato-éster que compreende um éster de ácido graxo, monossulfato e carboidrato, em que menos de 10% em mol da mistura carboidrato-éster é substituído com de um grupo sulfato e em que, preferencialmente, menos de 50% em mol da mistura carboidrato-éster é um éster de carboidrato sem grupos sulfato, compreendendo a esterificação e o fracionamento de um carbono, em que a esterificação compreende a reação de um carboidrato com um agente de sulfonação e com um composto reativo de acila de ácido graxo para obter a mistura carboidrato-éster, e em que o fracionamento compreende a remoção dos ésteres de carboidratos com mais de um grupo sulfato a partir da mistura carboidrato-éster para obter a dita mistura que compreende éster de ácido graxo, monossulfato e carboidrato. Preferencialmente, o fracionamento também compreende a remoção dos ésteres de carboidrato sem grupos sulfato da mistura carboidrato-éster.

[0050] Preferencialmente, menos de 5% em mol da mistura carboidrato-éster é substituído com mais de um grupo sulfato, mais preferencialmente, menos de 2% e, ainda mais preferencialmente, cerca de 0%. Ainda mais preferencialmente, a mistura carboidrato-éster compreende menos de 50% em mol, preferencialmente, 25% em mol ou menos, ainda mais preferencialmente, menos de 10% em mol de um éster de carboidrato sem grupos sulfato. Além disso, a invenção se refere à mistura enriquecida no éster de ácido graxo, monossulfato e carboidrato que podem ser obtidos por este método para uso como um adjuvante, e a um adjuvante, compreendendo a mistura assim obtida enriquecida em éster de ácido graxo, monossulfato e carboidrato.

[0051] A substituição do carboidrato ocorre através da esterificação do carboidrato, preferencialmente, em solução, de um ou mais dos grupos hidroxila livres do carboidrato. Isso resulta em um éster de carboidrato.

[0052] A substituição com um grupo sulfato ocorre através da reação de um agente de sulfonação com o carboidrato. Os agentes de sulfonação preferenciais são o SO3 gasoso, HClSO3 (ácido clorossulfônico), SO3-piridina, SO3-2-metilpiridina, SO3-2,6-dimetilpiridina, SO3- dimetilformamida, SO3-trimetilamida, SO3-trietilamina, SO3- dimetilalanina, SO3-N-etilmorfolina, SO3-dietilalanina e SO3- dioxano. Os mais preferidos são a SO3-piridina e a SO3- trietilamina.

[0053] A substituição com um ácido graxo ocorre através da reação do composto acila reativo análogo, ou seja, de um composto do ácido graxo acila reativo com o carboidrato. O composto de ácido graxo acila reativo pode ser um cloreto, brometo ou iodeto de ácido graxo, um tioéster de ácido graxo, anidrido de ácido graxo ou um éster de ácido graxo. Preferencialmente, o composto ácido graxo acila reativo é um haleto, anidrido ou tioéster de ácido graxo, mais preferencialmente, um cloreto de ácido graxo (às vezes chamado de um cloreto de acoíla ou cloreto de acila).

[0054] Os compostos de ácido graxo acila reativo preferencial são cloreto de hexanoíla, cloreto de octanoíla, cloreto de decanoíla, cloreto de dodecanoíla (cloreto de lauroíla), cloreto de tetradecanoíla (cloreto de miristoíla), cloreto de hexadecanoíla (cloreto de palmitoíla) e cloreto de octadecanoíla (cloreto de estearoíla e cloreto de oleoíla). Os mais preferidos são o cloreto de decanoíla ou o cloreto de dodecanoíla.

[0055] Um solvente preferencial para substituição é um solvente polar, preferencialmente, um solvente aprótico polar. Ainda mais preferencialmente, o solvente é anidro.

[0056] Preferencialmente, o solvente é piridina, dimetilformamida, N-metilpirrolidona, dimetilsulfóxido, acetonitrila, nitrometano ou uma mistura dos mesmos. Preferencialmente, o solvente é piridina, dimetilformamida, N-metilpirrolidona ou uma mistura dos mesmos, e mais preferencialmente, o solvente é uma mistura de piridina anidra e de dimetilformamida anidra.

[0057] A reação é geralmente feita no menor volume de solvente possível. Preferencialmente, a quantidade volumétrica de solvente é aproximadamente igual à quantidade de composto acila reativo, como um cloreto de ácido. Preferencialmente, o(s) solvente(s) é/são escolhido(s), de modo que o solvente pode ser facilmente removido da mistura reacional, por exemplo, por precipitação, filtração, cristalização ou evaporação.

[0058] A substituição com o composto acila reativo é, preferencialmente, realizada por um período de 4 a 8 horas, preferencialmente, de cerca de 6 horas, a uma temperatura de cerca de 60 a 70 °C. Pode ser desejável deixar a mistura reacional em repouso depois disso por até 18 horas em temperatura ambiente.

[0059] A reação com o(s) agente(s) de sulfonação é preferencialmente realizada por um período de 1 a 4 horas entre a temperatura ambiente e 70 °C. Pode ser desejável deixar a mistura reacional em repouso depois disso por até 18 horas em temperatura ambiente.

[0060] Em uma modalidade, o carboidrato primeiramente reage com um agente de sulfonação em temperatura ambiente e, posteriormente, a temperatura é ajustada até cerca de 50 a 70 °C, preferencialmente, de 55 a 70 °C e, mais preferencialmente, até cerca de 60 °C para a reação com o composto acila reativo. Sob este aspecto, nota-se que a temperatura não é fundamental para o processo. Tal característica permite que o processo seja realizado em uma ampla faixa de temperaturas e sob uma ampla gama de condições, com economias concomitantes. Está previsto que uma temperatura ambiente tão baixa quanto cerca de 10 °C pode ser aceitável. Temperaturas ambientes preferenciais não são inferiores a cerca de 15 °C, e com mais preferência, não mais baixas do que cerca de 18 °C. Além disso, as temperaturas ambientes para a reação com o agente de sulfonação não são, preferencialmente, maiores do que cerca de 50 °C, mais preferencialmente, não maiores do que cerca de 40 °C, e mais preferencialmente, não maiores do que cerca de 25 °C.

[0061] O carboidrato pode reagir primeiro com um agente de sulfonação e, em seguida, com pelo menos um cloreto de ácido graxo, ou vice-versa. Preferencialmente, o carboidrato reage primeiro com o agente de sulfonação e, em seguida, com o composto acila reativo. Além disso, preferencialmente, o carboidrato reage com uma quantidade do agente de sulfonação que proporciona o máximo rendimento de carboidrato monossulfato. Para os carboidratos anidros, isto é um mol de agente de sulfonação por mol de carboidrato. Para os carboidratos mono-hidratos, isto é entre um e dois mols de agente de sulfonação por mol de carboidrato.

[0062] Como já foi mencionado, é preferível que uma quantidade menor possível de solvente seja usada. Nesse sentido, é preferível que o carboidrato seja dissolvido no(s) solvente(s) por aquecimento, resultando em uma solução transparente e homogênea. Em particular, este método de preparação de uma solução homogênea é adequado para carboidratos que são relativamente pouco solúveis no(s) solvente(s) orgânico(s) ou que são difíceis de se dissolver em solventes orgânicos, por exemplo, sacarose e lactose. Para dissolver esses carboidratos na menor quantidade ou volume de solventes orgânicos, a temperatura é, preferencialmente, aumentada até mais de 80 °C, e mais preferencialmente, até mais de 90 °C.

[0063] Em uma modalidade preferencial, após a substituição ser concluída, os carboidratos substituídos no(s) solvente(s) orgânico(s) são neutralizados com uma solução de uma base orgânica ou inorgânica, como NaOH, NH4OH, KOH, trietilamina ou amônia.

[0064] Os carboidratos substituídos podem ser recuperados por resfriamento, resultando na formação de dois, três ou mais fases distintas, das quais uma é rica no carboidrato substituído. Isto pode ser recuperado pelos métodos conhecidos na técnica, incluindo a filtração, decantação, evaporação, extração e similares. Os solventes residuais e outros compostos são removidos dessa fase, por exemplo, evaporação sob temperatura aumentada e pressão reduzida, ou lavagem com uma fase aquosa.

[0065] Nesse estágio, o carboidrato substituído compreende uma mistura de diferentes ésteres de carboidrato, substituídos aleatoriamente com um número variável de grupos sulfato e um número variável de ácidos graxos, conforme descrito acima. Em todos os casos, o carboidrato é substituído com pelo menos um ácido graxo, ou seja, o carboidrato que é essencialmente ausente.

[0066] A mistura carboidrato-éster, portanto, pode incluir: • MONO, que é um éster de carboidrato, que é substituído com um grupo sulfato por molécula de carboidrato e com pelo menos um éster de ácido graxo (um éster de ácido graxo, monossulfato e carboidrato). • POLI, que é um éster de carboidrato, que é substituído com mais de um grupo sulfato por molécula de carboidrato e com pelo menos um éster de ácido graxo. • ZERO é um éster de carboidrato com pelo menos um éster de ácido graxo, mas que não contém grupos sulfato.

[0067] Preferencialmente, uma mistura carboidrato- éster da invenção compreende menos de 10% em mol de POLI. Mais preferencialmente, a dita mistura compreende menos de 5% em mol de POLI ou até mesmo, mais preferencialmente, a dita mistura compreende menos de 2% em mol de POLI. Mais preferencialmente, a dita mistura não compreende POLI detectável (cerca de 0% de POLI).

[0068] Além disso, preferencialmente, a dita mistura compreende menos de 50% em mol de ZERO, mais preferencialmente, 25% em mol ou menos, e ainda mais preferencialmente, menos de 10% em mol de ZERO.

[0069] A mistura carboidrato-éster é enriquecida em MONO por fracionamento da mistura reacional, compreendendo a mistura SL-carboidrato. O fracionamento pode ser feito por métodos de purificação conhecidos na técnica, como extração líquida, cromatografia líquida, cristalização, eletroforese, extração supercrítica ou uma combinação desses métodos. Preferencialmente, a mistura carboidrato-éster enriquecida em MONO é isolada por extração líquida ou cromatografia líquida. Mais preferencialmente, a mistura carboidrato-éster da invenção é isolada por cromatografia líquida.

[0070] A fase estacionária da cromatografia líquida pode ser sílica, sílica modificada, alumina, Florisil, resinas de troca aniônica, por exemplo, resinas disponíveis sob o nome comercial AmberjetTM, AmbersetTM e DowexTM, da Dow Chemical Company.

[0071] A fase móvel da cromatografia líquida (o “eluente”) pode ser um único solvente ou uma mistura de dois ou mais solventes selecionados a partir de líquidos orgânicos conhecidos na técnica, como o n-hexano, n-heptano, isopropanol, etanol, metanol, trietilamina, trimetilamina, amônia e água. Preferencialmente, os solventes são seguros como, por exemplo, é evidenciado pela classificação das autoridades de registro (por exemplo, FDA ou EMA) como “solventes a serem limitados” ou “solventes com baixo potencial tóxico”. Um solvente preferencial é uma mistura de n-heptano, isopropanol e trietilamina, preferencialmente, a uma razão em volume de entre 90:5:5 e 50:30:20.

[0072] A mistura carboidrato-éster da invenção é isolada da mistura reacional após o término da síntese ou de um extrato da mesma. Preferencialmente, ela é isolada a partir de um extrato da mistura reacional contendo uma mistura de carboidratos substituídos e subprodutos. O extrato pode ser obtido por extração líquido-líquido ou precipitação diferencial.

[0073] Um método preferencial é a extração da mistura reacional por um solvente orgânico, como n-heptano ou n- hexano. É mais preferida a extração com n-hexano ou n-heptano da mistura reacional, suplementada com uma fase aquosa para promover a separação das fases.

[0074] A mistura reacional ou o extrato do qual a mistura carboidrato-éster da invenção é para ser isolada é preferencialmente dissolvida ou diluída no eluente (fase móvel) usado para a cromatografia líquida.

[0075] O volume da mistura reacional ou do extrato a ser fracionado é entre 1/10 e 1/100 do volume da coluna usado para a cromatografia líquida. A coluna é eluída com de 1 a 10 vezes do volume da coluna. A eluição pode ser com um único solvente ou com uma mistura de solventes com composição constante (eluição isocrática) ou uma mistura de solventes que muda durante a análise e forma um gradiente (eluição por gradiente). Preferencialmente, a eluição é com um único solvente ou uma mistura com composição constante. A coluna é eluída a um fluxo de entre 1 e 100 mL por minuto. As frações coletadas são entre 1/10 e 1/100 do volume da coluna. A cromatografia líquida é realizada a entre 4 e 60 °C, preferencialmente, entre 15 e 25 °C (temperatura ambiente).

[0076] Preferencialmente, o fracionamento é realizado após a conclusão das duas reações químicas, de modo que os subprodutos formados durante a substituição com o ácido graxo e/ou a substituição com o grupo sulfato podem ser removidos simultaneamente.

[0077] Nos exemplos descritos abaixo, as misturas enriquecidas em ésteres de ácido graxo, monossulfato e carboidrato são isoladas a partir da mistura carboidrato- éster preparada pelos métodos de síntese aleatória. As condições do processo de preparação são divulgadas detalhadamente em WO96/2008 e em EP02580226.

[0078] As misturas de carboidratos enriquecidas em MONO podem ser caracterizadas pela razão molar de MONO em relação ao POLI. Preferencialmente, a razão molar de MONO para POLI é 10:1, mais preferencialmente, 20:1, e mais preferencialmente, 50:1 ou e ainda mais preferencialmente 100:1.

[0079] Além do método de preparação de misturas enriquecidas em MONO, de acordo com a presente invenção, que inclui uma síntese aleatória e purificação por cromatografia líquida, outros métodos de preparação podem ser aplicáveis, os quais resultam em uma mistura carboidrato-éster que compreende éster de ácido graxo, monossulfato e carboidrato, em que menos de 10% em mol da mistura carboidrato-éster é substituído com mais de um grupo sulfato.

[0080] Por exemplo, a síntese regiosseletiva pode ser um método alternativo para preparar (misturas enriquecidas em) MONO. A preparação regiosseletiva pode incluir a proteção temporária dos grupos hidroxila (ou seja, a proteção e a desproteção dos grupos hidroxila) da molécula de carboidrato, ou o uso de uma enzima ou de um catalisador. Uma vantagem da síntese regiosseletiva é que um único isômero é produzido.

[0081] Os métodos para a preparação de misturas enriquecidas em MONO têm a vantagem de serem fáceis, seguros e baratos, e podem ser usados para obter uma grande variedade de misturas de éster de carboidrato enriquecidas em carboidratos substituídos com um grupo sulfato e pelo menos um ácido graxo, em que menos de 10% em mol de carboidrato é substituído com mais de um grupo sulfato. Foi demonstrado que os adjuvantes compreendendo essas misturas têm pouca ou nenhuma toxicidade e eficácia igual ou ainda maior em relação aos adjuvantes de sulfolipídio-carboidrato conhecidos. Por esta razão, a presente invenção se refere a um adjuvante, compreendendo um carboidrato substituído com um grupo sulfato e pelo menos um ácido graxo, em que menos de 10% em mol do carboidrato é substituído com mais de um grupo sulfato, e um veículo farmaceuticamente aceitável, ou seja, um adjuvante que compreende uma mistura carboidrato-éster que compreende um sulfolipídio-carboidrato, que é um carboidrato substituído com um grupo sulfato e com pelo menos um ácido graxo, onde menos de 10% em mol da mistura carboidrato-éster é substituído com mais de um grupo sulfato e em que, preferencialmente, menos de 50% em mol da mistura carboidrato-éster é um éster de carboidrato sem grupos sulfato, e um veículo farmaceuticamente aceitável.

[0082] Um veículo farmaceuticamente aceitável, nesse contexto, é qualquer veículo que pode ser usado para liberar ou administrar o adjuvante e/ou o composto antigênico. Veículos farmaceuticamente aceitáveis preferenciais são uma solução salina fisiológica, uma suspensão de um composto insolúvel em uma solução salina fisiológica ou uma emulsão de um composto imiscível em água (por exemplo, um óleo) e uma solução salina fisiológica, preferencialmente, uma emulsão óleo em água.

[0083] Uma solução salina fisiológica é conhecida na técnica, e é qualquer solução adequada para injeção em um indivíduo vivo, e cuja solução não causará ou causará poucos, por sua mera constituição, efeitos negativos no indivíduo no qual ela é injetada. Preferencialmente, uma solução salina fisiológica é estéril. Além disso, preferencialmente, uma solução salina fisiológica tem um pH e força iônica comparável com a força iônica dos fluidos corporais do indivíduo no qual ela é injetada (“isotônica”).

[0084] Uma solução salina fisiológica pode, por exemplo, incluir sais, como cloreto, brometo, fosfato e/ou citrato de Na, K, Li, NH4, Ca ou Mg. Preferencialmente, uma solução salina fisiológica é solução salina, solução salina tamponada com fosfato, solução salina tamponada com citrato, soluções iônicas isotônicas, soluções não iônicas isotônicas e similares. Mais preferencialmente, a solução salina fisiológica pode ser solução salina ou solução salina tamponada com fosfato. Um exemplo de solução salina é uma solução salina estéril de 0,9% p/v de cloreto de sódio em água.

[0085] Alternativamente, o veículo farmaceuticamente aceitável é uma suspensão de um composto insolúvel em uma solução salina fisiológica. Um composto insolúvel neste contexto é, por exemplo, um composto orgânico ou inorgânico insolúvel, que pode ser usado para absorver o éster de ácido graxo, monossulfato e carboidrato. Preferencialmente, o composto insolúvel é o adjuvante alume conhecido, que é hidróxido de alumínio.

[0086] Em outra modalidade preferencial, o veículo farmaceuticamente aceitável é uma emulsão que compreende um composto imiscível em água e uma solução salina fisiológica. Preferencialmente, o tipo de emulsão é uma emulsão óleo em água. Ainda mais preferencialmente, a emulsão é estéril.

[0087] O composto imiscível em água é, preferencialmente, um líquido, e mais preferencialmente, um óleo. Óleos adequados incluem um ou mais selecionados do grupo consistindo em esqualano, esqualeno, óleo vegetal e óleo mineral. Óleos adequados incluem, por exemplo, óleo de soja, óleo de amendoim, óleo de canola, óleo de oliva, óleo de açafrão, óleo de milho, óleo de amêndoa, óleo de semente de algodão, oleato de etila, miristato de isopropila, palmitato de isopropila, óleo mineral, álcool miristílico, octildodecanol, óleo pérsico, óleo de gergelim, oleato de miristila, oleato de cetila e palmitato de miristila. Outros óleos apropriados incluem óleos biocompatíveis dos ácidos graxos saturados, insaturados e/ou parcialmente hidrogenados, óleo à base de silicone, óleos sintéticos, como triglicerídeos compostos de cadeias saturas e insaturadas dos ácidos graxos C12-C24 como, por exemplo, o éster de gliceroltriglicerídeo do ácido oleico, terpeno, linoleno, esqualano, esqualeno, esqualamina e óleos fluorados, incluindo os perfluorcompostos conhecidos como FC-40, FC-43 FC-72, FC-70, FC-75, perflúor-hexano, brometo de perflúor-octila (também conhecido como perfluorboro), iodeto de perflúor-octila, ou qualquer mistura dos mesmos. É altamente preferível se o óleo for esqualano.

[0088] No caso de uma emulsão, é geralmente preferível que o adjuvante compreenda um óleo a uma concentração entre 1 e 640 g/L, preferencialmente, entre 2 e 480 g/L, e mais preferencialmente, entre 4 e 320 g/L.

[0089] Fases aquosas apropriadas para a emulsão podem ser qualquer solução aquosa injetável, preferencialmente, uma solução salina fisiológica como, por exemplo, solução salina, solução salina tamponada com fosfato, solução salina tamponada com citrato, soluções iônicas isotônicas, soluções não iônicas isotônicas e similares. A quantidade de fase aquosa pode variar e será geralmente entre 616 e 996 g/L como, preferencialmente, entre 616 e 984 por L ou mais preferencialmente, entre 680 e 996 por L.

[0090] Uma formulação adjuvante particularmente preferencial, de acordo com a invenção, compreende uma mistura carboidrato-éster que compreende um sulfolipídio- carboidrato, em que menos de 10% em mol de carboidrato é substituído com mais de um grupo sulfato, como a uma concentração entre 1 e 640 g/L, preferencialmente, entre 1 e 480 g/L, e mais preferencialmente, entre 1 e 320 g/L.

[0091] Excelentes resultados foram obtidos com um adjuvante que compreende uma emulsão óleo em água, em que o óleo é esqualano e a água é a solução salina tamponada com fosfato (“PBS”).

[0092] Opcionalmente, o adjuvante compreende um emulsificante ou um estabilizador, ou uma combinação de emulsificantes e estabilizadores. Qualquer emulsificante ou estabilizador adequado para fins de injeção pode ser usado, incluindo detergentes adequados a este fim. Um exemplo de um emulsionante ou estabilizante adequado é o polissorbato 80 (Montannox 80, obtido junto à Seppic, Paris). Se emulsificantes ou estabilizantes forem usados, eles estão normalmente presentes em uma concentração (total) de 1 a 640 g/L, preferencialmente, de 2 a 480 g/L e, mais preferencialmente, de 4 a 320 g/L.

[0093] Preferencialmente, o adjuvante da invenção é estável e estéril. Preferencialmente, a formulação adjuvante pode ser esterilizada, passando através de um filtro esterilizante com tamanho de poros de 0,05 a 0,40 μm, preferencialmente, de 0,15 a 0,30 μm e, preferencialmente, de cerca de 0,22 μm.

[0094] Em uma modalidade preferencial, o adjuvante da invenção compreende entre 1 e 80 g/L, preferencialmente, entre 4 e 64 g/L ou entre 2 e 40 g/L, mais preferencialmente, entre 4 e 32 g/L e, mais preferencialmente, entre 4 e 20 g/L, de uma mistura carboidrato-éster enriquecida em MONO, como definido em outros lugares, entre 1 e 320 g/L, preferencialmente, entre 2 e 160 g/L ou entre 8 e 256 g/L, mais preferencialmente, entre 4 e 80 g/L, de um óleo, preferencialmente, esqualano e entre 1 e 80 g/L, preferencialmente, entre 4 e 64 g/L ou entre 2 e 40 g/L, mais preferencialmente, entre 4 e 20 g/L, de um emulsificante ou estabilizador , preferencialmente, polissorbato 80, sendo o restante fase aquosa, preferencialmente, PBS.

[0095] Preferencialmente, a composição adjuvante da invenção compreende entre 1 e 80 g/L MONO, mais preferencialmente, entre 2 e 40 g/L MONO, e ainda mais preferencialmente, entre 4 e 20 g/L de MONO.

[0096] O adjuvante da invenção pode ser convenientemente usado clinicamente, de modo a aumentar a resposta imunológica provocada por um componente antigênico. Tal uso é vantajoso em aplicações onde a resistência contra um componente antigênico deve ser aumentada, tal como na vacinação.

[0097] Um componente antigênico é qualquer substância que provoca uma resposta imunológica adaptativa em um animal ou ser humano. Um componente antigênico é geralmente estranho ao corpo (por exemplo, uma bactéria) e, uma vez dentro do corpo, provoca uma resposta imunológica específica pela ativação das células B e T antígeno-específicas. Alternativamente, um componente antigênico também pode ser definido como qualquer molécula ou fragmento molecular que pode ser reconhecido por um receptor do antígeno, como um receptor de células B ou um receptor de células T do sistema imunológico adaptativo.

[0098] O aumento da resposta imunológica significa, por exemplo, que a produção de anticorpos contra o componente antigênico, o número de células B que produzem anticorpos contra o componente antigênico e/ou o número de células T que reconhecem o componente antigênico aumentou em relação à situação normal em que o animal ou o ser humano é exposto a apenas o componente antigênico. Uma maior resposta imunológica pode ser determinada, por exemplo, determinando os títulos dos anticorpos, tal como é conhecido na técnica.

[0099] Um componente antigênico, neste contexto, é qualquer composto que evoca uma resposta imunológica em um ser humano ou animal, e é também geralmente referido como “imunógeno”.

[0100] O adjuvante da invenção aumenta a resposta imunológica ao componente antigênico em seres humanos e animais. Em uma modalidade preferencial, o adjuvante da invenção é usado em seres humanos. Em outra modalidade preferencial, o adjuvante da invenção é usado em animais. Espécies de animais preferenciais são os mamíferos, e incluem porcos, ratos, coelhos, furões, gado, ovelhas, pôneis, macacos, gatos, cães e elefantes. Preferencialmente, um componente antigênico evoca uma resposta imunológica em pelo menos um ser humano.

[0101] É bem sabido que um adjuvante em si não evoca, ou evoca mal, uma resposta imunológica, mas sim, um adjuvante aumenta a resposta imunológica a um componente antigênico. Sabe-se ainda que um adjuvante tem este efeito independentemente do tipo de componente antigênico ao qual a resposta imunológica é direcionada. Portanto, o adjuvante da invenção pode ser usado com qualquer componente antigênico, para aumentar a resposta imunológica. Os componentes antigênicos podem ser usados em vacinas tanto profiláticas como terapêuticas.

[0102] Um componente antigênico pode ser, dentre outras, mas sem se limitar, a um microrganismo inativado, como bactérias, vírus ou parasitas mortos, componentes derivados de tais microrganismos e componentes que imitam os componentes relevantes de tais microrganismos preparados por meios químicos ou biotecnológicos. Um componente antigênico também pode ser um alérgeno derivado de uma planta ou um animal, ou um componente que imita um alérgeno preparado por meios químicos ou biotecnológicos. Um componente antigênico também pode ser um componente do hospedeiro ao qual uma resposta imunológica é desejada para fins terapêuticos, como para o tratamento do câncer e doenças imunológicas e endocrinológicas.

[0103] Exemplos do componente antigênico das vacinas profiláticas incluem o vírus influenza inativado, poliovírus inativado, vírus da raiva inativado, bactéria inativada, subunidades ou produtos de DNA recombinante dos vírus ou bactérias, como a hemaglutinina e a neuraminidase do vírus da gripe, toxoide tetânico, toxoide da difteria, vírus da hepatite B, da malária, papilomavírus e conjugados de polissacarídeo-proteína com o polissacarídeo de Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenza tipo b e Neisseria meningitides. Preferencialmente, o componente antigênico compreende um antígeno da gripe e/ou um antígeno da malária.

[0104] São exemplos do componente antigênico das vacinas contra alergia terapêuticas os alérgenos de grama, artemísia, vidoeiro, carvalho, avelã e arbustos, poeira de casa, animais, fungos, alimentos e insetos.

[0105] Exemplos do componente antigênico das vacinas terapêuticas para o tratamento do câncer ou distúrbios imunológicos ou endocrinológicos incluem as (glico)proteínas ou conjugados peptídeo-proteína isolados ou que mimetizam os componentes do hospedeiro, como hormônios ou fatores (por exemplo, hormônio liberador de gonadotrofina, fator de crescimento endotelial vascular, angiotensina) e antígenos de células cancerosas.

[0106] A invenção fornece também uma vacina que compreende um adjuvante, conforme definido acima, e um componente antigênico. Preferencialmente, a vacina compreende uma emulsão óleo em água, e ainda mais preferencialmente, a vacina compreende um ou vários componentes antigênicos, como definido acima.

[0107] Para a preparação de uma vacina, um componente antigênico líquido pronto para uso pode ser misturado com uma formulação adjuvante pronta para uso, de acordo com a presente invenção, a uma razão de volume adequada, como de 1:100 a 100:1, preferencialmente 1:50 a 50:1, mais preferencialmente, de 1:25 a 25:1, e ainda mais preferencialmente, de 1:10 a 10:1. No caso de um componente antigênico liofilizado, o componente antigênico liofilizado pode ser dissolvido em um volume adequado de uma formulação adjuvante pronta para uso, de acordo com a presente invenção, como entre 0,1 e 2 mL para uma única dose da vacina.

[0108] Uma vacina pode compreender, por dose, de 0,01 a 80 mg, preferencialmente, de 0,05 a 80 mg, mais preferencialmente, de 0,05 a 40 mg, mais preferencialmente, de 0,1 a 24 mg, mais preferencialmente, de 0,25 a 20 mg e, mais preferencialmente, de 0,25 a 16 mg de uma mistura carboidrato-éster de acordo com a invenção, como um adjuvante (ou seja, uma mistura de éster de carboidrato que compreende um carboidrato substituído com um grupo sulfato e com pelo menos um ácido graxo, onde menos de 10% em mol de carboidrato é substituído com mais de um grupo sulfato). Ela pode compreender ainda, por dose, de 1 a 320 mg, preferencialmente, de 2 a 160 mg e, mais preferencialmente, de 4 a 80 mg de uma fase líquida imiscível em água, preferencialmente um óleo e, mais preferencialmente, esqualano, e por dose de 0,25 a 80 mg, preferencialmente, de 0,5 a 24 mg e, mais preferencialmente, de 1 a 20 mg (no total) de um ou mais emulsificantes e estabilizantes, preferencialmente, Polissorbato 80 (Montannox 80 PPI). Uma dose de vacina é um único volume de injeção e pode ser, por exemplo, entre 0,1 e 2,0 mL de líquido injetável. A quantidade de componente antigênico é uma dose da vacina que é altamente dependente da identidade do componente antigênico, e pode ser entre 0,1 e 1000 μg por dose, tal como, preferencialmente, entre 1 e 100 μg por dose.

[0109] A invenção também fornece um kit de partes, compreendendo um adjuvante conforme descrito acima e, opcionalmente, que compreende ainda uma preparação que compreende um componente antigênico, como um pó, uma solução ou uma emulsão. Além disso, o kit pode compreender seringas, agulhas, componentes volumétricos e/ou líquidos injetáveis, bem como outros componentes conhecidos na técnica da vacinação para serem adequados para a inclusão em um kit. Pode ser desejável fabricar, transportar e armazenar o adjuvante e o antígeno separadamente ou administrar o adjuvante e o antígeno separadamente. Nesse caso, a formulação adjuvante pode ser fornecida em fracos separados ou em seringas pré-carregadas.

Exemplos

[0110] Os exemplos a seguir são ilustrativos e não limitantes da invenção. Os exemplos demonstram uma segurança inesperadamente alta das misturas de éster de carboidrato enriquecidas em MONO, de acordo com a presente invenção, juntamente com uma resposta imunológica muito aumentada em animais que são injetados com uma vacina que contém o adjuvante da presente invenção. O termo MONO(s) inclui éster(es) de sulfato de ácido graxo de carboidrato com um grupo sulfato por molécula de carboidrato. Além disso, os exemplos demonstram uma toxicidade inesperadamente alta das misturas de éster de carboidrato enriquecidas em POLI. O termo POLI(s) inclui éster(es) de sulfato de ácido graxo de carboidrato com dois ou mais grupos sulfato por molécula de carboidrato. MONOs e POLIs são dois dos três principais constituintes das misturas de éster de carboidrato conhecidas na técnica, por exemplo, a CoVaccine HT.Preparação dos derivados do éster de ácido graxo, monossulfato e carboidrato, de acordo com a presente invenção :

[0111] Os ésteres de ácido graxo, monossulfato e carboidrato, de acordo com a presente invenção, são preparados de acordo com os métodos conhecidos na técnica para a preparação dos SL-carboidratos, exceto que uma etapa de fracionamento é incorporada para separar a mistura enriquecida em MONO da POLI (ésteres de ácido graxo de carboidrato substituídos com dois ou mais grupos sulfato). Preferencialmente, a mistura enriquecida em MONO também é separada de pelo menos parte do ZERO (ésteres de ácido graxo de carboidrato não substituídos com um grupo sulfato).

[0112] A síntese dos derivados de ácido graxo de carboidrato monossulfato incluídos em uma primeira etapa de contato de um carboidrato com um agente de sulfonação e uma segunda etapa de colocar em contato o carboidrato com um composto de ácido graxo acila reativo.

[0113] A separação do MONO do ZERO e POLI é realizada após a primeira etapa do processo de síntese (ou seja, após o contato do carboidrato com o agente de sulfonação) ou após a segunda etapa do processo de síntese (ou seja, após a reação do carboidrato com um composto de ácido graxo acila reativo).

[0114] A separação de MONO do ZERO e POLI e a purificação (simultânea) do MONO de outros subprodutos pode ser feita por cromatografia líquida usando sílica como fase estacionária, e uma mistura de solventes orgânicos como fase móvel.

Exemplo 1: Monossulfato de heptadodecil maltose (“M12- MONO”)

[0115] O mono-hidrato de maltose (0,2 mol; 68,4 g) foi dissolvido em piridina anidra (200 g) e 0,5 equivalente de SO3.piridina (0,1 mol; 15,9 g) em piridina anidra morna (50 °C) (300 g) foi adicionado. A mistura reacional foi agitada durante 1 h em temperatura ambiente, e o teor de sulfato inorgânico foi determinado por cromatografia iônica líquida de alta eficiência (IC-HPLC; Metrohm 821; coluna Metrosep A supp. 5-250/4.0, com solução de carbonato 0,1 mM como eluente e detecção por condutividade). O sulfato inorgânico representa a quantidade de agente de sulfonação que não reagiu com o carboidrato, mas sim, com a água presente no material departida ou entrando na mistura reacional durante o processamento.

[0116] Sílica (400 g) foi seca durante 4 horas a 220 °C e suspensa em piridina anidra (800 mL) e alimentada em uma coluna de vidro seco com conectores de entrada e saída e conectores de PVDF. Após o assentamento da sílica, uma amostra de 50 mL de monossulfato de maltose em piridina anidra foi aplicada. A eluição ocorreu com 1 L de piridina anidra, seguido por 1 L de N,N-dimetilformamida anidra. Frações de 50 mL foram coletadas sob argônio ou nitrogênio seco e foram testadas em HPTLC (placa de sílica, desenvolvida com butanol:isopropanol:ácido acético:ácido fórmico:água = 10:3:26:6:4, pulverizadas com 5% de ácido sulfúrico em metanol e aquecidas durante 20 min a 100 °C) quanto à presença de maltose, monossulfato de maltose ou polissulfato de maltose. A maltose eluiu com piridina anidra e o monossulfato de maltose com N,N-dimetilformamida.

[0117] As frações contendo monossulfato de maltose puro foram coletadas, agrupadas e usadas para análise posterior. O teor de maltose foi quantificado pelo reagente orcinol/ácido sulfúrico, de acordo com Dubois et al (Anal. Chem. 28 pp. 350-355, 1956). Em suma, 50 μL de uma amostra contendo entre 0,1 e 1 μg de carboidrato por mL foram adicionados com 950 μL de reagente orcinol, consistindo em uma solução de 2 g/L de orcinol em ácido sulfúrico a 70%. A mistura foi misturada vigorosamente e incubada durante 20 min a 100 °C. Após arrefecimento, a absorvância foi medida a 550 nm. A concentração de carboidratos foi calculada usando soluções padrão com base no carboidrato não substituído, o mono-hidrato de maltose. Piridina anidra foi adicionada e a solução foi aquecida a 60 °c. Oito equivalentes de cloreto de dodecanoíla foram adicionados, e a mistura reacional foi mantida durante 8 h a 70 °C. A formação de monossulfato de heptadodecil maltose foi monitorada por HPTLC (placa de sílica; desenvolvida com n-hexano:éter dietílico:ácido acético em uma razão em volume de 233:100:3,3, pulverizada com ácido sulfúrico 5% em metanol e aquecida durante 20 min a 100 °C).

Exemplo 2: Monossulfato de heptadodecil sacarose (“S12”)

[0118] A SL-sacarose da CoVaccine HT, compreendendo ZERO, MONO e POLI (aqui referida como “S12”) foi preparada conforme descrito em EP02133969. A sacarose (68,6 g, 0,2 mol) seca durante 4 h a 100 °C foi dissolvida em piridina anidra (188 g; 2,4 mol) e em N,N-dimetilformamida anidra (388; 5,3 mol). A mistura reacional foi mantida sob nitrogênio seco e agitada durante 2 horas a 90 °C, até uma solução límpida ser obtida. Durante o processo de síntese, foram tomadas precauções para evitar o contato com a água e o ar úmido. Após o arrefecimento até a temperatura ambiente, SO3.piridina (32 g; 0,2 mol; 1,0 equivalente) foi adicionado à mistura reacional, sob agitação vigorosa. Após 1 h em temperatura ambiente, foi colhida uma amostra para medir a concentração de sulfato inorgânico por IC-HPLC, conforme descrito no exemplo 1. Posteriormente, a solução foi aquecida a 60 °C, e cloreto de dodecanoíla (311 g; 1,4 mol; 7,1 equivalentes) foi adicionado sob agitação vigorosa. Após 4 horas, uma amostra foi coletada para determinar o grau de esterificação por HPTLC semiquantitativo (placa de sílica; desenvolvida com n-hexano:éter dietílico:ácido acético em uma razão em volume de 233:100:3,3, pulverizada com ácido sulfúrico 5% em metanol e aquecida durante 20 min a 100 °C).

[0119] Uma porção adicional de cloreto de dodecanoíla (75 g; 0,3 mol; 1,7 equivalente; total de 8,8 equivalentes) foi adicionada sob agitação vigorosa. Após 4 horas a 70 °C, uma amostra foi coletada e a análise por HPTLC semiquantitativa revelou que a esterificação estava completa. Os solventes foram removidos sob temperatura aumentada (60 °C) e pressão reduzida (< 20 mBar) em um rotaevaporador (Büchi). O resíduo foi dissolvido em metanol a frio (4 °C) em uma concentração final de 20% p/p. Após agitação vigorosa, a mistura foi mantida de um dia para o outro a 4 °C, formando uma fase inferior marrom viscosa e uma fase superior líquida. A fase superior (metanol) foi coletada e a extração da fase inferior foi repetida várias vezes com metanol a frio (4 °C) com separação de fases de um dia para o outro a 4 °C. Os extratos de metanol (fases superiores) foram agrupados e clarificados por centrifugação durante 5 min a 3.000 rpm (1200 g) em tubos de polipropileno de 50 mL. Os sobrenadantes foram coletados, agrupados e o metanol foi removido por evaporação em temperatura aumentada (40 °C) e sob pressão reduzida (< 20 mBar) em um rotaevaporador (Büchi).

[0120] A composição de S12 foi determinada por HPTLC semiquantitativa, conforme descrito no exemplo 1. Tabela 1: Composição de S12 não fracionada, o equivalente interno da CoVaccine HT, como determinado por HPTLC e expresso como % em mol. Para comparação, a composição da CoVaccine HT original está incluída.

Exemplo 3: Monossulfato de Tetradecil galactose (“G12- MONO”)

[0121] O monossulfato de tetradecil galactose (referido como “G12-MONO” na presente invenção) foi preparado reagindo a galactose de maneira similar a como descrito para a sacarose no exemplo 2. Galactose (36,4 g; 0,2 mol), piridina anidra (161 g), N,N-dimetilformamida anidra (197 g), SO3.pyridine (31,2 g; 0,2 mol; 1 equivalente) e cloreto de dodecanoíla (268 g; 1,2 mol; 6,2 equivalente) reagiram conforme descrito no exemplo 2. O teor de sulfato inorgânico determinado por HPLC-IC foi 11%, fornecendo uma razão média de 0,89 mol de sulfato por mol de galactose. A fração rica em ZERO (aqui referida como “G12-ZERO”) continha 100% p/p de ZERO (Tabela 2). A fração rica em MONO (aqui referida como “G12-MONO”) continha 25% em mols de ZERO e 75% em mols de MONO. Tabela 2: Composição das três frações de derivados de dodecilgalactose obtidas por cromatografia líquida, analisadas por LC-MS e expressas em % em mol

Exemplo 4: Monossulfato de heptadodecil maltose (“M12-MONO”)

[0122] Monossulfato de heptadodecil maltose (aqui referido como “M12-MONO”) foi preparado como descrito no exemplo 2 para o monossulfato de heptadodecil sacarose usando mono-hidrato de maltose (36,6 g; 0,1 mol), piridina anidra (97 g), N,N-dimetilformamida anidra (199 g), SO3.piridina (31,7 g; 0,2 mol; 2 equivalentes) e cloreto de dodecanoíla (224 g; 1,0 mol; 10,4 equivalentes). Para resultar na mistura carboidrato-éster M12, o teor de sulfato inorgânico foi 63%, do qual foi calculada uma razão média de 0,76 mol de sulfato por mol de maltose.

[0123] O resultado do fracionamento de M12 está resumido na tabela 3. M12-MONO continha 78% em mol de Monossulfato de heptadodecil maltose e 22% em mol de hexadodecilmaltose monossulfato, que confirma que o MONO pode ser obtido com menos da quantidade saturada de ácidos graxos. Tabela 3: Composição das três frações de derivados de dodecilmaltose obtidas por uma ou duas cromatografias flash, analisadas por LC-MS e expressas em % molar.

Exemplo 5: Monossulfato de Heptadecil maltose (“M10- MONO”)

[0124] Monossulfato de Heptadecil maltose (aqui referido como “M10-MONO”) foi preparado como descrito no exemplo 3, para monossulfato de heptadodecil sacarose. O mono-hidrato de maltose (36,6 g; 0,1 mol), piridina anidra (97 g), N,N-dimetilformamida anidra (199 g), SO3.piridina (31,7 g; 0,2 mol; 2 equivalentes) e cloreto de decanoíla (154,9 g; 0,8 mol; 9,7 equivalentes) foram as quantidades utilizadas. Após a sulfonação, o teor de sulfato inorgânico foi 63%, do qual foi calculada uma razão média de 0,76 mol de sulfato por mol de maltose. Antes da adição de cloreto de decanoíla, um equivalente de LiCl foi adicionado como uma solução de LiCl anidro em piridina anidra, que resultou em um precipitado de sulfato de lítio e na completa remoção de sulfato inorgânico da mistura reacional.

[0125] A análises de LC-MS do M10 fracionado revelou que a fração MONO continha 98% em mol de monossulfato de heptadecil maltose e 2% em mol de hexadecilmaltose dissulfato, indicando um alto grau de pureza (tabela 4).Tabela 4: Composição das três frações de derivados de decilmaltose obtidos por um ou dois mols% de cromatografia flash.

Exemplo 6: Efeitos adjuvantes dos MONOs

[0126] O efeito adjuvante dos ésteres de ácido graxo, monossulfato e carboidrato da presente invenção foi determinado em coelhos. Para essa finalidade, a fração G12- MONO (O-monossulfato O-tetradodecilgalactose 75% mais 25% em mol de O-pentadodecilgalactose) do exemplo 3, a fração M12- MONO (78% em mol de O-monossulfato O-heptadodecilmaltose mais 22% em mol de O-monossulfato O-hexadodecil maltose) do exemplo 4, e a fração M10-MONO (98% em mol de O-monossulfato O-heptadecilmaltose mais 2% em mol de O-dissulfato O- hexadecilmaltose) do exemplo 5 foram formulados em uma emulsão de tamanho submícron de esqualano em água, e comparado com o efeito adjuvante de S12 (análogo interno da vacina CoVaccine HT), alume (conhecido adjuvante seguro) e um controle sem adjuvante.

[0127] Para cada fração MONO, as quantidades adequadas de esqualano (BASF, Alemanha) e de Montannox 80 PPI (Seppic, Paris, França), produzindo uma formulação que passar por poros de 0,22 μm, foram determinadas. As formulações adjuvantes foram preparadas conforme descrito no documento EP1223969, em concentrações finais da fração MONO de 16,0 g por L (16 mg/mL). Misturas de MONO, esqualano, polissorbato 80, água ultrapurificada e solução salina tamponada com fosfato foram passadas três vezes por um emulsionante de alta pressão, ou seja, pelo microfluidizador modelo Y110 sob resfriamento contínuo. As formulações adjuvantes obtidas eram emulsões brancas ou azuladas com baixa viscosidade. Essas formulações passaram por um filtro PES de 0,22 μm (Corning Inc.) e os filtrados foram recuperados em frascos estéreis. A manipulação subsequente das formulações adjuvantes foi realizada sob condições assépticas. As formulações adjuvantes foram mantidas em frascos selados a 4 °C até o uso.

[0128] O adjuvante M10-MONO foi preparado a partir de 4 g da fração M10-MONO, 8 g de esqualano, 4 g de Montannox 80 PPI, 2 g de água ultrapura e 232 g de solução salina tamponada com fosfato (PBS; Fisher Scientific).

[0129] O adjuvante G12-MONO foi preparado a partir de 4 g da fração G12-MONO, 8 g de esqualano, 4 g de Montannox 80 PPI, 2 g de água ultrapura e 232 g de PBS.

[0130] O adjuvante M12-MONO foi preparado a partir de 4 g da fração M12-MONO, 16 g de esqualano, 4 g de Montannox 80 PPI, 2 g de água ultrapura e 224 g de PBS.

[0131] O adjuvante S12 (uma formulação preparada internamente da “CoVaccine HT” foi preparada a partir de 11 g de S12 não fracionado (Exemplo 2; contendo cerca de 4,3 g de ZERO, 5,1 g de MONO e 1,7 g de POLI), 44 g de esqualano, 11 g de Montannox 80 PPI, 2 g de água ultrapura e 182 g de PBS.

[0132] O adjuvante S12 serviu como referência para adjuvantes fortes.

[0133] O alume (SSI, Dinamarca) serviu como referência para os adjuvantes seguros.

[0134] O antígeno sem adjuvante serviu como controle negativo.

[0135] A composição das formulações adjuvantes testadas está resumida na tabela 5.

[0136] As composições das formulações adjuvantes foram verificadas determinando as concentrações de carboidratos usando orcinol/ácido sulfúrico como reagente, e medindo a absorvância a 550 nm, conforme descrito no exemplo 1. Se necessário, as concentrações de M10-MONO, G12- MONO ou M12-MONO nas formulações adjuvantes foram ajustadas até 16,0 g/L.

[0137] Além disso, as formulações adjuvantes foram analisadas por HPTLC e os resultados estão mostrados na figura 1. Um μL da amostra de qualquer formulação adjuvante que compreende uma emulsão de SL-carboidrato, esqualano, Polissorbato 80 e PBS foi aplicado na placa HPTLC. A placa foi desenvolvida em n-hexano, éter dietílico e ácido acético (a uma razão em volume de 233:100:3,3), seca e posteriormente desenvolvida em trietilamina, 2-isopropanol e heptano (a uma razão em volume de 1:3:8). As bandas de carboidrato foram visualizadas por pulverização com uma solução de ácido sulfúrico 5% em metanol, e aquecendo a placa durante 30 minutos a 90 °C.

[0138] Bandas com fator de retenção igual a 1,0 (na parte superior da placa) representam os ZEROs e são detectáveis na formulação de adjuvante da CoVaccine HT e S12, mas não nas de M10-MONO, G12-MONO e M12-MONO. As bandas com fator de retenção entre 0,2 e 0,5 representam os MONOs e são detectáveis em todas as formulações de adjuvante, exceto na emulsão de esqualano em água, sem SL-carboidrato, que foi usada como um veículo farmacêutico e incluída nessa análise de CCF como controle. As bandas com fator de retenção entre 0,0 e 0,1 (parte inferior da placa) representam os POLIs e, em menor extensão, o polissorbato 80. Os POLIs são detectáveis nas formulações adjuvantes de CoVaccine HT e S12, e o polissorbato 80 é detectável em todas as formulações, incluindo na emulsão de esqualano em água sem SL-carboidrato.

[0139] A análise semiquantitativa dos padrões de CCF revelou a % p/p de ZERO, MONO e POLI na CoVaccine HT de 32%, 41% e 28%, respectivamente, e em S12 (a formulação tipo CoVaccine HT, preparada internamente pela LiteVax BV) de 39%, 46% e 15%, respectivamente. Assim, em comparação com a CoVaccine HT original, a formulação adjuvante S12 continha quantidade semelhante de MONO, mas uma quantidade duas vezes menor de POLI

[0140] O antígeno usado para demonstrar a atividade adjuvante dos novos compostos foi uma proteína de fusão de dois antígenos da malária importantes conhecidos como R0.10C, conforme descrito por Theisen et al. (Vaccine, 32, pp. 2623-2630, 2014). Foi demonstrado que o antígeno elicia os anticorpos que bloqueiam a transmissão e o crescimento assexuado de um painel de cepas de Plasmodium falciparum de diferentes origens geográficas (Theisen et al, Vaccine, 32, pp. 2623-2630, 2014). Uma solução estoque de antígeno R0.10C na concentração de 1,33 mg/mL foi fornecida por Radboud UMC, Nijmegen, Holanda. A dose foi de 10 μg de proteína R0.10C por injeção. O volume de vacina foi de 0,5 mL por injeção. As vacinas da primeira imunização consistiam de 8 μL de preparação do antígeno, 242 μL de PBS e 250 μL de formulação adjuvante. Como nenhum efeito colateral foi observado após a primeira imunização, decidiu-se aumentar a dose dos adjuvantes experimentais (grupos 3 a 6) para a segunda imunização com um fator igual a dois. A dose de adjuvante M10-MONO, G12-MONO e M12-MONO da primeira imunização foi igual a 4,0 mg, e a da segunda imunização foi igual a 8,0 mg. A dose de adjuvante S12 da primeira imunização foi igual a 11 mg de SL-sacarose e a dose da segunda injeção foi de 22 mg de SL-sacarose. As vacinas da segunda imunização consistiam em 8 μL de preparação do antígeno mais 492 μL de formulação adjuvante. A dose de alume (Staten Serum Institute, Dinamarca) foi 110 μg para a primeira e para a segunda injeção.Tabela 5: Composição das formulações adjuvantes.

[0141] O grupo dos coelhos foi controlado pela capacidade de resposta adequada para os adjuvantes à base de SL-carboidrato. Para essa finalidade, utilizou-se um lote de CoVaccine HT que comprovadamente gerou um aumento na temperatura corporal de 1 °C, um dia após a injeção, em estudos anteriores com animais. Seis animais do grupo foraminjetados com 0,5 mL deste lote de referência da CoVaccine HT na dose de 20 mg de éster de sulfato de ácido graxo de carboidrato (sacarose) (correspondendo a 6,4 mg de ZERO, 8,2 mg de MONO e 5,6 mg de POLI), 80 g de esqualano e 20 g de polissorbato 80. Um dia após a administração, a temperatura corporal média foi de 40,1 °C (± 0,4), que é cerca de 0,8 °C acima dos valores normais.

[0142] Grupos de seis coelhas pesando de 2 a 3 Kg e com 20 semanas de idade foram imunizadas por via intramuscular, no dia 0, na coxa esquerda (primeira imunização) e no dia 21 na coxa direita (segunda imunização). A temperatura corporal foi determinada em intervalos de tempo diferentes, antes e após o tratamento. Um dia após a primeira e a segunda injeção, alguns aumentos na temperatura corporal foram observados (consulte a tabela 6 e a figura 2), enquanto em outros intervalos de tempo, valores normais foram notados (dados não mostrados).Tabela 6: Temperatura corporal um dia após a primeira e a segunda imunizações.a Significativamente maior do que os outros grupos de quatro adjuvantes tomados em conjunto.

[0143] Nenhuma das três frações MONO (grupos 4, 5 e 6) em doses de 4 e 8 mg, induziu um aumento significativo na temperatura corporal média. A S12 (semelhante à CoVaccine HT), em doses de 11 (contendo 4,3 mg de ZERO, 5,1 mg de MONO e 1,7 mg de POLI) e 22 mg (contendo 8,6 mg de ZERO, 10,2 mg de MONO e 3,4 mg de POLI) produziu um aumento na temperatura corporal, um dia após a primeira e a segunda imunização, de cerca de 0,5 °C, que foi significativamente maior do que a reação global nos outros grupos (grupos 1, 2, 4, 5 e 6). A temperatura corporal voltou para os valores normais um dia depois (dados não mostrados). O aumento da temperatura corporal com S12 foi aproximadamente a metade daquele notado com a CoVaccine HT, que é considerada uma consequência de uma dose duas vezes menor de POLI em S12, em comparação com a CoVaccine HT.

[0144] Uma semana após a segunda vacinação, os animais foram sacrificados e as reações locais foram classificadas em ambos os locais de injeção, conforme descrito em Hilgers (Methods Mol. Biol. 626 pp. 251-9, 2010). A pontuação de cada injeção é o produto do tamanho (comprimento x largura x profundidade, em mm) e a natureza da reação local com as seguintes pontuações arbitrárias: 1 para edema, descoloração e perda da estrutura muscular, 3 para a fibrose, granuloma e tecido conjuntivo, 9 para necrose e pus; e 12 para resíduo de vacina.

[0145] Nenhum dos animais apresentou reações locais moderadas ou graves. Foram observados em alguns animais efeitos adversos brandos. Exceto em um animal (grupo 5), as dimensões das reações locais eram entre 0 e alguns milímetros, e as pontuações arbitrárias das reações locais foram, em sua maioria, 0 e às vezes 1 (indicando a descoloração e a perda da estrutura muscular). De todos os animais testados, apenas um animal apresentou uma pontuação superior a 1, e todos os outros tiveram uma pontuação global igual ou inferior a 1. As reações locais foram inesperadamente baixas e o limite de detecção do sistema de pontuação previsto não foi adequado para discriminar entre estes baixos escores. Portanto, o número de animais por grupo com uma reação local detectável, embora mínima, foi relatado (tabela 7).Tabela 7: Reações locais quatro semanas após a primeira e uma semana da segunda imunização.a As reações locais representam o número de animais dos 6 animais por grupo, exibindo um efeito local significativo, embora mínimo.

[0146] As reações locais dos MONOs foram significativamente inferiores àquelas observadas anteriormente com a CoVaccine HT ou produtos similares.

[0147] Amostras de sangue foram coletadas antes da primeira vacinação (dia 0), três semanas após a primeira imunização (dia 21) e uma semana após a segunda imunização (dia 28). Os títulos de anticorpos foram medidos por ELISA usando o antígeno R0.10C usado para a imunização para revestir as placas de ELISA, conforme descrito por Theisen et al. (Vaccine, 32, pp. 2623-2630, 2014). A média aritmética dos títulos de anticorpos (AMT) e os desvios padrões (SDs) são dadas na tabela 8.Tabela 8: Resposta do anticorpo três semanas após a primeira e uma semana da segunda imunização por ELISA usando R0-10C como antígeno a.a As AMT ± SD antes da primeira imunização no dia 0 foram 25,6 ± 9,3.

[0148] As médias geométricas dos títulos de anticorpos (GMTs) e os desvios padrões (SDs) três semanas após a primeira imunização (dia 21) e uma semana após a segunda imunização, no dia 28) e os antilogs (10GMT) estão representados na tabela 9.Tabela 9: Resposta do anticorpo três semanas após a primeira e uma semana da segunda imunização por ELISA usando R0-10C como antígeno aa GMT ± DESV. PAD. antes da primeira imunização no dia 0 foi igual a 1,4 ± 0,2 e o antilog foi 23,2

[0149] Os títulos de anticorpo contra o extrato de gametócito de Plasmodium falciparum foram medidos conforme descrito em Theisen et al. (Vaccine 32, pp. 2623-2030, 2014). As médias geométricas dos títulos de anticorpos (GMTs) e os desvios padrões (SDs) três semanas após a primeira imunização (dia 21) e uma semana após a segunda imunização (dia 28) e os antilogs (10GMT) estão representados na tabela 10.Tabela 10: Resposta do anticorpo três semanas após a primeira e uma semana da segunda imunização por ELISA usando extrato de gametócito de Plasmodium falciparum como antígeno aa GMT ± DESV. PAD. antes da primeira imunização no dia 0 foi igual a 1,5 ± 0,1 e o antilog foi 32,5.

[0150] Os títulos dos anticorpos também foram medidos na fase assexuada, medidos por ELISA, usando extrato de esquizonte de Plasmodium falciparum como antígeno, conforme descrito por Theisen et al (Vaccine 32, pp. 2623-2030, 2014). As médias geométricas dos títulos de anticorpos (GMTs), os desvios padrões (SDs) e os valores de antilog (10GMT) três semanas após a primeira imunização (dia 21) e uma semana após a segunda imunização (dia 28) estão representados na tabela 11.

[0151] Tabela 11: Resposta do anticorpo três semanas após a primeira e uma semana da segunda imunização por ELISA usando extrato de esquizonte de Plasmodium falciparum como antígeno a.a GMT (SD) antes da primeira imunização no dia 0 não foram determinados.

[0152] Analisando em conjunto estes dados in vivo e como ilustrado na Figura 3, a razão E/T das frações MONO da presente invenção é superior em relação àquela do S12 conhecido, que é uma mistura de ZERO, MONO e POLI. As frações MONO da presente invenção são igualmente ou ligeiramente mais eficazes do que a S12 e significativamente mais eficazes do que o alume. Além disso, as frações MONO da presente invenção são igualmente ou ligeiramente menos tóxicas do que o alume e significativamente menos tóxicas do que o S12. Em outras palavras, formulações adjuvantes enriquecidas com MONO combinam a eficácia da CoVaccine HT (a mistura de ZERO, MONO e POLI e a referência para adjuvantes fortes) com a segurança do alume (a referência para adjuvantes seguros). Adjuvantes com tal razão E/T são candidatos para aplicações generalizadas em produtos existentes e novos, incluindo vacinas.

[0153] A dose de MONO na formulação adjuvante S12 é semelhante à de M10-MONO, M12-MONO e G12-MONO. Outra conclusão a partir dos dados é que a razão E/T de MONO é significativamente maior do que ZERO ou POLI, ou ambos.

Exemplo 7: Otimização da purificação do monossulfato de Heptadecil maltose (“M10-MONO” por cromatografia líquida

[0154] Para melhorar ainda mais o método para o isolamento de uma fração MONO a partir das misturas ZERO, MONO e POLI, realizou-se cromatografia líquida com várias combinações de fases móveis e estacionárias. Resultados excelentes em termos de pureza e rendimento foram obtidos usando sílica seca de alto grau de pureza, com tamanho de poro de 60 Â, tamanho de partícula de 230 a 400 mesh, 40 a 63 μm (Fluka, número de catálogo 60737) e um eluente consistindo em 12% v/v de trietilamina (Sigma-Aldrich, número de catálogo 90340). 12% v/v de 2-isopropanol (Sigma- Aldrich, número de catálogo 24137; Ph.Eur) e 76% v/v de heptano (Sigma-Aldrich, número de catálogo 32287; Ph.Eur). Vinte g de M10 em 60 mL de eluente foram aplicados a uma coluna preparada a partir de 260 g de sílica (seco em uma estufa a vácuo durante pelo menos 3 h a 160 °C e < 100 mBar) em cerca de 500 mL de eluente. A coluna foi eluída em um fluxo de cerca de 3 L por h e frações de 50 mL foram coletadas. Cada fração foi analisada por HPTLC (número de catálogo Uniplate da Sigma-Aldrich, número Z26531-4) com 20% v/v de isopropanol em heptano como eluente. O M10-ZERO foi eluído entre 400 e 600 mL. O M10-MONO foi eluído entre 800 e 3200 mL. O POLI permaneceu na coluna e poderia ser eluída com 100% de 2-isopropanol. Uma única análise de cromatografia líquida resultou em uma recuperação de > 90% de M10-MONO com < 2% ZERO e < 2% POLI, conforme determinado pela análise semiquantitativa de HPTLC.

Exemplo 8: Comparação de MONO e POLI Preparação de MONOs e POLIs

[0155] O éster de sulfato de ácido graxo de galactose, o éster de sulfato de ácido graxo de maltose e o éster de sulfato de ácido graxo de maltotriose foram sintetizados colocando em contato a D-(+)-galactose, D-(+)- maltose e maltotriose com SO3.piridina e cloreto de decanoíla (todos obtidos junto à Sigma-Aldrich), como descrito no exemplo 1.

[0156] Os MONOs do éster de monossulfato de ácido tetradecanoico de galactose, doravante referido como monossulfato de Tetradecil galactose (“G10-MONO”), o éster de monossulfato de ácido heptadecanoico de maltose, acima referido como monossulfato de Heptadecil maltose (“M10- MONO”) e o éster de monossulfato do ácido nona-/decadecanoico de maltotriose (doravante referido como “T10-MONO”) e o POLIs do éster de polissulfato do ácido decanoico de galactose (doravante referido como “G10-POLI”), o éster de polissulfato do ácido decanoico de maltose (doravante referido como “M10-POLI”) e o éster de polissulfato do ácido decanoico de maltotriose (doravante referido como 'T10- POLI”) foram isolados a partir do éster de sulfato de ácido graxo de galactose, do éster de sulfato de ácido graxo de maltose e do éster de sulfato de ácido graxo de maltotriose, respectivamente, por meio de cromatografia líquida preparativa usando sílica seca como a fase estacionária. Esses MONOs foram eluídos com uma mistura de n-heptano, isopropanol e trietilamina (76:12:12% em volume) e os POLIs como uma mistura de isopropanol, trietilamina, metanol e água ultrapura (por exemplo, 50:20:20:10% em volume). As frações foram analisadas por CCF com placas de sílica e n- heptano, isopropanol e trietilamina (76:12:12% em volume) como eluente. As manchas foram visualizadas por pulverização com 5% v/v de ácido sulfúrico em metanol e aquecendo durante 10 a 20 min a 100 °C. As frações com MONOs ou POLIs puros foram agrupadas e evaporadas até a secura.

[0157] Formulações adjuvantes prontas para uso estéreis do tipo óleo em água foram preparadas pela mistura de MONO ou POLI, Tween 80, esqualano e solução salina tamponada com fosfato (PBS), passando as misturas três vezes por um emulsificante de alta pressão, passando as emulsões de tamanho submícron através de um filtro de 0,2 μm e recuperando as emulsões em recipientes esterilizados. As concentrações de MONO ou POLI, Tween 80 e esqualano foram de 40 g/L.

[0158] As formulações aquosas de MONOs e POLIs em PBS foram preparadas pela adição de 1 g de polissorbato 80 por g de MONO ou POLI.

Estabilidade das emulsões de tamanho de partículas submícron contendo MONOs e POLIs

[0159] Após duas semanas a 4 °C ou em temperatura ambiente, as emulsões com um dos POLIs, mas sem POLI ou com um dos MONOs exibiu separação das fases. Isto mostra que os POLIs, mas não os MONOs, têm um efeito prejudicial sobre a estabilidade física das emulsões.

Atividade hemolítica in vitro dos MONOs e POLIs

[0160] A atividade hemolítica dos MONOs e POLIs foi determinada pela mistura das diluições em série das formulações aquosas de qualquer composto em PBS com 1% v/v de hemácias de ovinos em placas de microtitulação em forma de V de 96 poços (Greiner). Após 1 h de incubação em temperatura ambiente, determinou-se a concentração do composto que causou 50% de hemólise (tabela 12). A atividade hemolítica dos MONOs G10-MONO, M10-MONO e T10-MONO foi 100 até > 3000 vezes menor do que os POLIs G10-POLI, M10-POLI e T10-POLI. Tabela 12: Atividade hemolítica de vários MONOs e POLIs.

Efeitos in vivo dos MONOs e POLIs

[0161] Grupos de seis coelhos foram imunizados por via intramuscular no dia 0 (antes da imunização) e no dia 21 com o H5NI cultivado em células de rim canino Madin (gentilmente cedidas pela Medigen Vaccine Corp., Taiwan) a uma dose de 15 μg de HA, com ou sem adjuvante. A resposta imunológica (Tabelas 13 e 14a-c), a temperatura corporal (Tabela 15), o ganho de peso corporal (Tabela 16) e a reação local (Tabela 17 e Figura 4 a até i) foram determinados em intervalos de tempo predefinidos em animais individuais. As análises in vivo e ex vivo foram realizadas como testes cegos individuais, e os tratamentos foram divulgados após o término dos mesmos.

Efeito dos MONOs e POLIs sobre a resposta imunológica

[0162] Foram colhidas amostras de sangue dos 7 grupos de 6 animais nos dias 0, 21 e 28. Os títulos de anticorpo nas amostras de soro individuais do dia 21 e do dia 28, e nos 6 grupos de 7 amostras de soro, do dia 0, foram determinados.

[0163] Os títulos de anticorpo da inibição de hemaglutinação (HI) contra o H5N1 foram medidos conforme descrito pela Organização Mundial da Saúde nos procedimentos laboratoriais “Serological detection of avian influenza A(H7N9) virus infections by modified horse red blood cells hemagglutination-inhibition assay” (2013), com algumas modificações. Em suma, 100 μL de amostras de soro pré- tratadas durante 30 min a 56 °C foram adicionados com 400 μL de PBS frio, contendo 0,5% p/v da fração V de albumina de soro bovino livre de protease (“PBS/BSA”; Sigma) e 50 μL de hemácias de cavalo concentradas. Depois de 30 min sob frio e centrifugação, 100 μL dos sobrenadantes foram recuperados, adicionados com 100 μL de uma solução da enzima destruidora de receptor (filtrado de cólera; Sigma) em PBS/BSA, e foram mantidos de um dia para o outro a 37 °C. Posteriormente, as amostras de soro pré-tratadas foram mantidas durante 30 min a 56 °C para destruir a enzima. 50 μL dessas amostras de soro previamente diluído a 1/10 foram diluídos em série duas vezes em PBS/BSA. 50 μL de uma suspensão de H5N1 em PBS/BSA, contendo 8 unidades de hemaglutinação, foram adicionados e mantidos durante 30 min em temperatura ambiente. Posteriormente, 50 μL de uma suspensão de 0,75% de hemácias concentradas de cavalo em PBS/BSA e a inibição da aglutinação foi determinada após 60 min.

[0164] Os grupos de soro pré-imune produziram um título HI igual a 13 (tabela 13). Após a primeira imunização sem adjuvante, o título foi igual a 34, e com adjuvante, entre 57 e 113. O fator de aumento foi entre 2 e 3. Após a segunda imunização sem adjuvante, o título aumentou até 135, e com adjuvante, entre 359 e 1208. O fator de aumento variou de 3 a 9.Tabela 13: Resposta do anticorpo HI ao H5N1 depois da primeira e da segunda imunização com H5N1 com diferentes adjuvantes a.a GMT ± DESV. PAD. antes da primeira imunização no dia 0 foi igual a 3,7 ± 0,3 e o antilog foi 13.

[0165] Os títulos de anticorpo homólogo ao H5N1 (designado como “H5N1” Medigen Vaccine Corp., Taiwan) e de anticorpo heterólogo (reativo de forma cruzada) para o H1N1 de A/New Jersey (designado como “H1N1”; lote comercial gentilmente fornecido por - Solvay Pharmaceuticals, Weesp, Holanda) e H3N2 A/Panama 2007/1999 (designado como “H3N2”; lote comercial gentilmente fornecido por - Solvay Pharmaceuticals, Weesp, Holanda) foram determinados por ELISA com H5N1, H1N12 e H3N2, como antígeno de revestimento.

[0166] Essas condições foram verificadas em estudos- piloto. As placas de ELISA foram revestidas com 2 μg de antígeno por mL de tampão de revestimento (tampão carbonato; 0,1 M, pH = 9,6). Após a lavagem, as placas foram bloqueadas com 2% p/v de albumina de soro bovino (Sigma-Aldrich) em solução salina tamponada com fosfato. As amostras de soro foram pré-diluídas e diluídas em série em 1% p/v de albumina de soro bovino em solução salina tamponada com fosfato. O conjugado IgG-HRPO anticoelho de cabra (IgG anticoelho de cabra (H&L), o fragmento F(ab)2 - purificado por afinidade, o conjugado de peroxidase de rábano silvestre, 1 mg/mL; Novex, EUA) foi diluído 1/10.000 em 1% p/v de albumina de soro bovino em solução salina tamponada com fosfato. Uma solução pronta para uso de 3,3',5,5'-tetrametilbenzidina (Sigma-Aldrich) foi usada como substrato. A reação enzimática foi interrompida depois de 20 min em temperatura ambiente com um volume de ácido sulfúrico 1 M. Os títulos foram calculados a partir do coeficiente de regressão da parte linear do gráfico da concentração no soro versus o valor de extinção e expressos como os valores logarítmicos da concentração de soro, produzindo uma densidade óptica de 1,0. Nenhuma resposta significativa (valor de log < 1) foi observada na ausência do antígeno de revestimento. Para cada grupo, o título médio geométrico (GMT), o desvio padrão (SD) e o valor antilog foram calculados. Os fatores de crescimento foram calculados dividindo o valor antilog do grupo adjuvante pelo do grupo controle (PBS). Os títulos de ELISA para o H5N1, H1N1 e H3N2 no dia 0 (antes da imunização) eram baixos e foram considerados o sinal de fundo do sistema de teste.

[0167] Os títulos de anticorpo anti-H5N1 após a primeira e a segunda imunização sem adjuvantes foram 11.676 e 488.299, respectivamente, e os adjuvantes proporcionaram aumentos de até 5 vezes (Tabela 14a).

[0168] O título do anticorpo anti-H1N1, depois de duas imunizações sem adjuvantes, foi igual a 7.911, e os adjuvantes proporcionaram aumentos de até 3 vezes (tabela 14b).

[0169] Os títulos de anticorpo anti-H3N2 após a primeira e a segunda imunização foram 444 e 776, respectivamente, e os adjuvantes proporcionaram aumentos de até 6 vezes (Tabela 14c).

[0170] Em comparação com o G10-POLI, o G10-MONO proporcionou respostas de anticorpo vi ELISA ao H5N1, H3N2 e H1N1. Em comparação com o M10-POLI, o M10-MONO produziu respostas superiores para o H3N2 e o H1N1 mas respostas semelhantes ao H5N1. Assim, o MONO exibe atividade pelo menos igual e, muitas vezes, melhor do que o POLI correspondente.

[0171] Surpreendentemente, a imunização com G10-POLI e M10-POLI resultou em títulos menores de H3N2 e H1N1, às vezes até mesmo menores do que a imunização sem adjuvante. Uma explicação é que as porções antigênicas do imunógeno são destruídas por G10-POLI e M10-POLI. Tal efeito prejudicial dos POLIs é uma séria desvantagem, porque tem uma influência negativa sobre a qualidade e a estabilidade da vacina. Como estes efeitos dramáticos ocorrerem já dentro de alguns dias após a mistura do antígeno e de adjuvante, e mantendo as misturas em baixa temperatura (4 °C), a presença do POLI em uma preparação de vacina deve ser evitada tanto quanto possível.

[0172] Como o H5N1 usado para a imunização e H3N2 e H1N1 usados para a detecção foram cultivados em diferentes substratos e purificados, os anticorpos anti-H3N2 e anti- H1N1 reconhecem antígenos virais reativos de forma cruzada. Os efeitos nocivos nas porções antigênicas reativas de forma cruzada tornam os POLIs impróprios como adjuvantes para uma vacina contra a gripe universal baseada em antígenos reativos de forma cruzada.Tabela 14a: Efeito sobre diferentes adjuvantes na resposta de anticorpo via ELISA ao H5N1 (o imunógeno) após a imunização com H5N1 a.a GMT ± DESV. PAD. antes da primeira imunização no dia 0 foi igual a 1,23 ± 0,38 e o antilog foi 17.Tabela 14b: Efeito de diferentes adjuvantes na resposta de anticorpo via ELISA ao H5N1 após a coelhos aa GMT ± DESV. PAD. antes da primeira imunização no dia 0 foi igual a 0,29 ± 0,23 e o antilog foi 2.Tabela 14c: Efeito de diferentes adjuvantes na resposta de anticorpo via ELISA ao H3N2 após a imunização com H5N1 em coelhos aa GMT ± DESV. PAD. antes da primeira imunização no dia 0 foi igual a 0,52 ± 0,33 e o antilog foi 3.

Efeito dos MONOs e POLIs sobre a temperatura corporal

[0173] A temperatura corporal dos coelhos individuais foi medida em vários intervalos diários, antes e após a imunização. O aumento da média ± SD na temperatura corporal, um e dois dias após a primeira imunização, está representado na tabela 15. Em comparação com o homólogo POLI, G10-MONO e M10-MONO proporcionaram os menores aumentos na temperatura corporal. Tabela 15: Aumento na temperatura corporal um e dois dias depois da primeira imunização.

Efeito dos MONOs e POLIs sobre o ganho de peso corporal

[0174] O ganho de peso corporal dos coelhos individuais foi monitorado e o aumento da média ± SD em duas semanas após a primeira imunização estão representados na tabela 16. Os animais experimentais eram jovens e ainda assim esperava-se que crescessem, de modo que o menor ganho de peso corporal reflete a inibição do crescimento como um efeito colateral indesejado do tratamento. Verificou-se que, sob condições semelhantes de alojamento e alimentação dos animais, o G10-POLI produziu um ganho de peso corporal significativamente menor do que o G10-MONO.Tabela 16: Aumento do peso corporal após a primeira imunização.

Efeito dos MONOs e POLIs sobre as reações locais após a imunização

[0175] As reações locais foram analisadas no dia 28 e a pontuação média geométrica (GMS) ± SD e o valor antilog de cada grupo estão representados na tabela 17. Uma semana após a segunda imunização, o G10-POLI e o M10-POLI forneceram pontuações de 12.261 e 2.364, respectivamente, enquanto o G10-MONO e o M10-MONO forneceram pontuações significativamente mais baixas, de 51 e 22, respectivamente. As dimensões das reações locais para os POLIs foram de até 2 cm de diâmetro, e mostraram granuloma e necrose, conforme ilustrado nas Figuras 4b a i).Tabela 17: Reação local no sítio de injeção após a primeira e a segunda imunizações.

[0176] Estes efeitos adversos dos POLIs, mas não dos MONOs, ilustram inequivocamente a presente invenção. Um exemplo notável é o G10-MONO em comparação com o G10-POLI. Em comparação com o G10-POLI, o G1O-MONO revela uma resposta de anticorpo anti-H3N2 40 vezes maior e ao anti-H1N1 5 vezes maior uma semana após a segunda vacinação, um ganho de peso corporal 4 vezes maior nas duas semanas após a segunda imunização, um aumento 2 vezes menor na temperatura corporal após a primeira imunização e uma pontuação de reação local 240 vezes menor uma semana após a segunda imunização.

[0177] A combinação dos dados sobre a eficácia, por exemplo, o título de anticorpo anti-H3N2 e a toxicidade, por exemplo, a pontuação da reação local uma semana após a segunda imunização, revela uma razão de eficácia/toxicidade de G10-MONO de 2050/51 = 40 e de G10-POLI de 54/12.261 = 0,0044. Isto significa que a razão E/T do G10-MONO é 9,082 vezes maior do que a do seu homólogo POLI.

[0178] Da mesma forma, as razões E/T calculadas de M10-MONO e M10-POLI são 4711/22 = 214 e 635/2364 = 0,2686, respectivamente, o que significa uma razão E/T 797 vezes maior de M10-MONO em comparação com o M10-POLI.

[0179] Esta diferença nas razões E/T de MONOs e POLIs é adicionalmente ilustrada na figura 5, representando dados individuais de animais imunizados com MONO ou POLI.

[0180] Em suma, ao contrário dos MONOs, os POLIs têm desvantagens e inconvenientes importantes. Os efeitos adversos in vitro dos POLIs observados, como alta atividade hemolítica, rápida desestabilização das emulsões e destruição dos epítopos antigênicos, têm uma influência negativa sobre a qualidade e a estabilidade de uma vacina contendo POLI. Os efeitos in vivo adversos dos POLIs, como os eventos adversos locais e sistêmicos, têm um efeito negativo sobre o desempenho in vivo, a razão E/T e, consequentemente, a razão benefício/risco de uma vacina. Portanto, a presença da POLI nos produtos medicinais, incluindo as vacinas, deve ser evitada tanto quanto possível.

[0181] Verificou-se que os ésteres de ácido graxo de sulfato de carboidrato sem ésteres de ácido graxo de polissulfato de carboidrato (POLIs) proporcionaram vantagens importantes como produtos medicinais e/ou adjuvantes de vacina. Em geral, o desenvolvimento e a exploração comercial de produtos medicinais contendo vários ingredientes ativos com perfis distintos de atividade é extremamente complexo, requer grandes esforços e apresenta riscos elevados de fracasso.

[0182] A segurança, a eficácia e a qualidade são os três principais fatores de sucesso dos produtos medicinais, incluindo as vacinas e os compostos com uma influência negativa em um desses três fatores devem ser evitados tanto quanto possível. A presente invenção se refere aos ésteres de ácido graxo de sulfato de carboidrato sem ésteres de polissulfato, como adjuvantes de vacina promissores.

Claims

1. Adjuvante caracterizado pelo fato de compreender uma mistura de éster de carboidrato que compreende um sulfolipídio-carboidrato, que é um carboidrato substituído com pelo menos um grupo sulfato e com pelo menos um ácido graxo, em que menos de 10% em mol da mistura de éster de carboidrato é substituída com mais de um grupo sulfato, e um veículo farmaceuticamente aceitável, em que a substituição do carboidrato significa que o substituinte está conectado ao carboidrato através do grupo hidroxila do carboidrato.

2. Adjuvante, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que menos de 5% em mol, preferencialmente menos de 2% em mol da mistura carboidrato- éster é substituído com mais de um grupo sulfato.

3. Adjuvante, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a mistura carboidrato-éster compreende 50% em mol ou menos, preferencialmente 25% em mol ou menos, mais preferencialmente, 10% em mol ou menos de um éster de carboidrato sem grupos sulfato.

4. Adjuvante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o carboidrato é um monossacarídeo, um dissacarídeo, um trissacarídeo, uma ciclodextrina ou uma mistura dos mesmos.

5. Adjuvante, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que - o monossacarídeo é um ou mais selecionado do grupo consistindo em alose, altrose, glicose, manose, gulose, idose, galactose, talose, psicose, frutose, sorbose, tagatose, arabinose, ribose, xilose, lixose, ribulose, xilulose e inositol; - o dissacarídeo é um ou mais selecionado do grupo consistindo em sacarose, maltose, lactose, lactulose, celobiose, trealose, gentiobiose, turanose, isomaltulose e melibiose; - o trissacarídeo é um ou mais selecionado do grupo consistindo em rafinose, melezitose, maltotriose, isomaltotriose, rafinose, cestose e negerotriose; e/ou - a ciclodextrina é uma α-, β- ou y-ciclodextrina.

6. Adjuvante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que um dos grupos hidroxila do carboidrato é substituído com um grupo sulfato, e em que substancialmente todos os grupos hidroxila restantes do carboidrato são substituídos com ácidos graxos.

7. Adjuvante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que o ácido graxo possui entre 6 e 18 átomos de carbono.

8. Adjuvante, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o ácido graxo tem 8 a 12 átomos de carbono.

9. Adjuvante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que o veículo farmaceuticamente aceitável é uma solução salina fisiológica, uma suspensão de um composto orgânico ou inorgânico insolúvel em uma solução salina fisiológica ou uma emulsão de um composto imiscível em água e uma solução salina fisiológica.

10. Adjuvante, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que a emulsão de um composto imiscível em água e uma solução salina fisiológica compreende uma emulsão óleo em água.

11. Adjuvante, de acordo com a reivindicação 9 ou 10, caracterizado pelo fato de que o óleo é um ou mais selecionado do grupo consistindo em esqualano, esqualeno, um óleo vegetal e um óleo mineral.

12. Adjuvante, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o óleo é esqualano.

13. Uso de um adjuvante, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo fato de ser para preparar um medicamento para aumentar uma resposta imunológica evocada por um componente antigênico.

14. Uso, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que o componente antigênico é um micro-organismo morto, como uma bactéria, um vírus ou um parasita, ou um componente ou uma mistura de componentes derivados de um microrganismo ou de um componente, ou de uma mistura de componentes que mimetiza o componente antigênico relevante de um microrganismo preparado pela tecnologia do DNA recombinante ou química, ou em que o componente antigênico é um alérgeno ou um componente hospedeiro, para o qual uma resposta imunológica é desejada para fins terapêuticos.

15. Vacina caracterizada pelo fato de compreender um adjuvante, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 12 e um componente antigênico.

16. Vacina, de acordo com a reivindicação 15, caracterizada pelo fato de que o componente antigênico é um micro-organismo morto, como uma bactéria, um vírus ou um parasita, ou um componente ou uma mistura de componentes derivados de um microrganismo ou de um componente, ou de uma mistura de componentes que mimetiza o componente antigênico relevante de um microrganismo preparado pela tecnologia do DNA recombinante ou química, ou em que o componente antigênico é um alérgeno ou um componente hospedeiro, para o qual uma resposta imunológica é desejada para fins terapêuticos.

17. Kit de partes caracterizado pelo fato de compreender um adjuvante, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 12 e, opcionalmente, um componente antigênico.

18. Mistura carboidrato-éster caracterizada pelo fato de compreender um sulfolipídio-carboidrato, o qual é um carboidrato substituído com pelo menos um grupo sulfato e com pelo menos um ácido graxo, em que menos de 10% em mol da mistura de éster de carboidrato é substituída com mais de um grupo sulfato.

19. Mistura carboidrato-éster, de acordo com a reivindicação 18, caracterizada pelo fato de que um dos grupos hidroxila do carboidrato é substituído com um grupo sulfato, e em que substancialmente todos os grupos hidroxila restantes do carboidrato são substituídos com ácidos graxos.

20. Processo para preparar uma mistura carboidrato- éster compreendendo um éster de ácido graxo carboidrato monossulfato caracterizado pelo fato de que menos de 10% em mol da mistura carboidrato-éster é substituído com mais de um grupo sulfato, compreendendo a esterificação e o fracionamento de um carboidrato, em que a esterificação compreende a reação de um carboidrato com um agente de sulfonação e com um composto reativo de ácido graxo acila para obter a mistura carboidrato-éster, e em que o fracionamento compreende a remoção dos ésteres de carboidratos com mais de um grupo sulfato a partir da mistura carboidrato-éster para obter a mistura compreendendo um éster de ácido graxo, monossulfato e carboidrato.

21. Processo, de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que o fracionamento compreende ainda remover os ésteres de carboidrato sem grupos sulfato a partir da mistura carboidrato-éster.

22. Mistura carboidrato-éster caracterizada pelo fato de poder ser obtida pelo processo conforme definido na reivindicação 20 ou 21.

23. Mistura carboidrato-éster caracterizada pelo fato de poder ser obtida pelo processo conforme definido na reivindicação 20 ou 21, para uso como um adjuvante.

24. Adjuvante, caracterizado pelo fato de compreender uma mistura carboidrato-éster que pode ser obtida pelo processo conforme definido na reivindicação 20 ou 21.