PT814836E

PT814836E - Adjuvantes para vacinas

Info

Publication number: PT814836E
Application number: PT95942007T
Authority: PT
Inventors: Luuk Hilgers
Original assignee: Dimminaco Ag
Priority date: 1994-12-27
Filing date: 1995-12-21
Publication date: 2001-07-31
Also published as: WO1996020008A1; BR9510263A; DK0814836T3; JPH10511997A; CA2208790A1; MX9704824A; EP0800539A1; ATE248863T1; MX9704822A; EP0814836A1; CA2208849C; EP0800539B1; BE1008978A5; JPH11502192A; AU4324896A; JP4087900B2; DE69531699T2; AU709104B2; GR3035941T3; EP0814836B1

Description

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DESCRIÇÃO "ADJUVANTES PARA VACINAS" A presente invenção tem por objectivo novos adjuvantes para vacinas.

Um adjuvante é definido como sendo uma substância estranha a um organismo vivo, a qual induz uma resposta imunitária por exemplo através da produção de anticorpos logo que é administrada, por exemplo, por via parentérica.

Os anticorpos são substâncias contidas no sangue e outros fluidos do corpo, assim como nos tecidos, que se ligam ao antigene para o tomar intensivo.Os anticorpos constituem um dos mecanismos naturais de defesa do corpo. Eles são altamente específicos e podem matar, ligar ou tomar inofensivo o antigene que induziu a sua formação. O antigene, em contacto com o sistema imunitário, activa então uma série complexa de interacções celulares cujo objectivo é eliminar o antigene e/ou reestabelecer o equilíbrio precedente.

Dois dos aspectos característicos dos antigenes são a sua imunogenicidade, quer dizer a sua capacidade de induzir uma resposta imunitária in vivo (entre outros a formação de anticorpos específicos) e sua antigenicidade, quer dizer a sua capacidade de ser reconhecidos selectivamente pelos anticorpos cujos antigenes estão na sua origem. É conhecida a capacidade de estimular a resposta imunitária deliberadamente administrando um antigene específico por meio de uma vacina. Este procedimento permite obter um estado de memória imunitária no organismo que permite uma respsota mais rápida e mais eficaz do organismo logo que se dá o contacto posterior com o antigene.

Entretanto, alguns antigenes não possuem senão uma v imunogenicidade fraca e induzem uma resposta imunológica insuficiente para conferir ao organismo uma protecção eficaz. A imunogenicidade de um antigene pode ser aumentada administrando em conjunto com substâncias, chamadas adjuvantes, que aumentam a resposta contra o antigene seja agindo directamente sobre o sistema imunitário, seja modificandoas características farmacocinéticas do antigene e aumentando assim o tempo de interacção com o sistema imunitário.

No presente, um grande número de vacinas veterinárias utilizadas e contendo também adjuvantes compreendem ainda as emulsões clássicas de óleo mineral, tais como o adjuvante do tipo emulsão água em óleo mineral (a/o) ou do tipo emulsão óleo mineral em água (o/a). Depois de diversos anos, os investigadores têm desenvolvido esforços no sentido de encontrar alternativas com eficácia semelhante e toxicidade reduzida. As injecções destes adjuvantes clássicos à base de óleo mineral são frequentemente acompanahadas por reacções locais cuja gravidade depende grandemente do tipo de emulsão e da natureza do óleo utilizado. A utilização de adjuvantes à base de óleo mineral é por consequência limitada a animais domésticos (porcos, galinhas, ruminantes, etc) e aos animais de laboratório. -3-

C_J-i O documento EP-A-0 549 074 descreve a utilização dc lipopolissacáridos sintéticos como adjuvantes.

Precedentemente, foi demonstrado que um copolímero sintético de polisacarose e epicloridrina - o Ficoll- contendo grupos sulfato e lipidos (SL-Ficoll), incorporado numa emulsão de esqualano (E) em água (E/A) exercia um efeito adjuvante elevado sobre diferentes espécies de animais - entre os quais porcos- contra diferentes tipos de antigenes, estando aí compreendidos alguns antigens virais importantes [Vaccine, 12, p. 653-660 (1994) e Vaccine, 12, p. 661-665 (1994), EP-A-0 549 074]. Estas formulações de adjuvantes à base de Ficoll são bastante eficazes para substituir formulações clássicas de óleo mineral em água utilizadas em diferentes vacinas porcinas.

Entretanto a toxicidade local, quer dizer a capacidade reactiva destas formulações à base de Ficoll sobre os porcos e ratinhos não se revelou mais fraca que a das formulações clássicas de óleo mineral do tipo O/A.

Por outro lado, para todas as formulações à base de Ficoll, a temperatura tem um efeito pronunciado sobre a etabilidade das emulsões. Algumas destas emulsões permaneceram estáveis durante anos a 4°C mas a fase aquosa e a fase de óleo separam-se após alguns dias a 37°C e dentro de uma dezena de minutos a 60°C. O objectivo da presente invenção é o de propor um adjuvante eficaz para vacinas tendo uma estabilidade acrescida a temperaturas elevadas e revelando uma toxicidade local mais fraca. O objectivo é atingido por um adjuvante para vacinas compreendendo um polissacárido sulfo-lipídico combinado com um composto capaz de formar uma interface [por exemplo, uma emulsão de tipo óleo/água (o/a)].

Uma das vantagens do adjuvante segundo a presente invenção é que ele é mais estável a alta temperatura que os adjuvantes à base de Ficoll.

Este objectivo é atingido por pm adjuvante para vacinas compreendendo um polissacárido sulfolipídico hidrófobo combinado com um constituinte que permite foimar uma interface, na qual o polissacárido és escolhido dentro do grupo consistindo por ciclodextrina, maltodextrina, inulina e pululano, compreendendo os grupos lipídicos 4 a 22 átomos de carbono e contendo o polissacárido sulfolipídico, em média, pelo menos 0,01 e não mais que 1,0 grupos sulfato por monossacárido, em média pelo menos 0,01 e não mais e 2,0 grupos lipídicos por monossacárido, e a relação entre os grupos sulfato e os grupos lipidícos é uma razão de 0,01 a 2 grupos sulfato por grupo lipídico, mantendo o seu carácter hidrófobo. A expressão "polissacárido" significa um composto tendo pelo menos três unidades açúcar repetitivas ligadas uma à outra de maneira covalente. A expressão "polissacárido sulfo-lipídico" significa um composto tendo pelo menos três unidades repetitivas interligadas uma à outra de maneira covalente pelo menos um grupo de sulfato e pelo menos um grupo lipídico. O polissacárido sulfo-lipídico é um polissacárido hidrófobo. A expressão "polissacárido hidrófobo" significa um polissacárido que é menos solúvel numa fase aquosa orgânica apoiar. -5- A wh O polissacárido sulfo-lipídico é escolhido enlre o grupo constituído pelas ciclodextrinas, a maltodextrina, a inulina e o pullulane.

De preferência, o polissacárido sulfo-lipídica é escolhido entre o grupo constituído pela ciclodextrina, a maltodextrina e a inulina. 0 polissacárido sulfo-lipídico preferido é a ciclodextrina. O polissacárido sulfo-lipídico contém em média pelo menos 0,01 grupo sulfato por monossacárido, mantendo na totalidade o seu carácter hidrófobo. De preferência, o polissacárido sulfo-lipídico contém em média pelo menos 0,12 grupos sulfato por monossacárido, mantendo no total o seu carácter hidrófobo. O polissacárido sulfo-lipídico contém em média pelo menos 1,0 grupo sulfato por monossacárido, mantendo na totalidade o seu carácter hidrófobo. De preferência, o polissacárido sulfo-lipídico não contém em média mais de 0,23 grupos sulfato por monossacárido, mantendo no total o seu carácter hidrófobo.

De preferência, quando o polissacárido sulfolipídico é a maltodextrina, esta contém em média cerca de 0,23 grupos sulfato por monossacárido, manetndo no total o seu carácter hidrófobo.

De preferência quando o polissacárido sulfo-lipídico é a ciclodextrina, esta contém em média cerca de 0,20 grupos sulfato por monossacárido, mantendo no total o seu carácter hidrófobo.

De preferência quando o polissacárido sulfo-lipídico é a inulina, -6-esta contém em média cerca de 0,19 grupos sulfato por monossacárido, mantendo no total o seu carácter hidrófobo.

De preferência quando o polissacárido sulfo-lipídico é o pululano, este contém em média cerca de 0,16 grupos sulfato por monossacárido, mantendo no total o seu carácter hidrófobo. O polissacárido sulfo-lipídico contém em média pelo menos 0,01 grupo grupo lipídico por monossacárido, mantendo na totalidade o seu carácter hidrófobo. De preferência, o polissacárido sulfo-lipídico contém em média pelo menos 1,05 grupo lipídico por monossacárido, mantendo no total o seu carácter hidrófobo. O polissacárido sulfo-lipídico não contém em média mais de 2,0 grupos lipídicos por monossacárido, mantendo na totalidade o seu carácter hidrófobo. De preferência, o polissacárido sulfo-lipídico não contém em média mais de 1,29 grupos sulfato por monossacárido, mantendo no total o seu carácter hidrófobo.

De preferência quando o polissacárido sulfo-lipídico é a maltodextrina, esta contém em média cerca de 1,29 grupos lipídicos por monossacárido, mantendo no total o seu carácter hidrófobo.

De preferência quando o polissacárido sulfo-lipídico é a ciclodextrina, esta contém em média cerca de 1,05 grupos lipídicos por monossacárido, mantendo no total o seu carácter hidrófobo.

De preferência quando o polissacárido sulfo-lipídico é a inulina, esta contém em média cerca de 1,24 grupos lipídicos por monossacárido, mantendo no total o seu carácter hidrófobo. -7- ( •'i

De preferência quando o polissacárido sulfo-lipídico é o pullulano, este contém em média cerca de 1,24 grupos lipídicos por monossacárido, mantendo no total o seu carácter hidrófobo.

Os grupos lipídicos contêm entre 4 e 22 átomos de carbono. A relação entre os grupos sulfato e lipídicos está compreendida entre 0,01 e 2 grupos sulfato por grupo lipídico. A relação entre os grupos sulfato e lipídicos está compreendida entre 0,10 e 0,19 grupos sulfato por grupo lipídico, mantendo no total o carácter hidrófobo do composto.

De preferência, quando o polissacárido sulfo-lipídico é a maltodextrina, a relação entre os grupo sulfato e lipídicos é cerca de 0,18 grupos sulfato por grupo lipídico, mantendo no total o seu carácter hidrófobo.

De preferência, quando o polissacárido sulfo-lipídico é a maltodextrina, a relação entre os grupo sulfato e lipídicos é cerca de 0,19 grupos sulfato por grupo lipídico, mantendo no total o seu carácter hidrófobo.

De preferência, quando o polissacárido sulfo-lipídico é a inulina, a relação entre os grupo sulfato e lipídicos é cerca de 0,15 grupos sulfato por grupo lipídico, mantendo no total o seu carácter hidrófobo.

De preferência, quando o polissacárido sulfo-lipídico é o pullulano, a relação entre os grupo sulfato e lipídicos é cerca de 0,13 grupos sulfato por grupo lipídico, mantendo no total o seu carácter hidrófobo. A expressão "composto formando uma interface" ("Interface-

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Forming Constituent" ou "IFC") significa uma substância que forma, num meio aquoso, uma interface física entre a substância e a fase aquosa. O composto capaz de formar uma interface é escolhido entre o grupo constituído por um líquido não miscível com água (por exemplo: esqualano, óleo de soja, óleo mineral, hexadecano), ou um sólido insolúvel na fase aquosa.

Os sólidos insolúveis na fase àquosá da presente invenção compreendem sais insolúveis (p. ex. Α1(ΟΗ)3, AIPO4, Alun, oxalato de cálcio), micropartículas, nanopartículas, microsferas e nanosferas de um dos múltiplos polímeros, copolímeros (p. ex., poliacrilato, poli(metilacrilato), policianoacrilato, polilactido, poliglicolido), ou bicamadas lipídicas ou agentes lipófílos (p. ex., fosfolípidos) ou micelas de agentes tensoactivos.

De preferência, o composto "IFC" é um líquido não miscível com a água.

Vantajosamente, o composto formando uma interface é escolhido entre o grupo constituído por óleo de soja, esqualano e hexadecano.

Os adjuvantes estáveis para vacinas são aqueles que compreendem um derivado (hidrófobo) de um polissacárido sulfo-lipídico, um composto formando uma interface e um agente emulsificante.

Além disso, a eficácia dos adjuvantes segundo a presente invenção é comparável ou mesmo superior à dos adjuvantes clássicos e à dos adjuvantes à base de Ficoll. -9-

Pareceria que os polissacáridos sulfolipídicos de pesos moleculares relativamente mais fracos teriam menos toxicidade local.

De acordo com um outro aspecto da presente invenção, propõe-se um processo para preparar uma vacina em emulsão caracterizado pelo facto de emulsionar uma solução aquosa de um antigene em presença de um polissacárido sulfolipídico, um emulsionante e um composto capaz de formar uma interface.

De acordo com um outro aspecto da presente invenção, propõe-se um processo para preparar uma vacina compreendendo um aquantidade imunogénica de um antigene (imunogene) e um adjuvante segundo a presente invenção.

De preferência a concentração de adjuvantes está compreendida entre 0,1 e 100 mg/mL, de preferência entre 2 e 20 mg/mL. A vacina compreende, além do adjuvante, antigenes por exemplo de vírus inactivado, de víus vivo, de bactéria, de sub-unidade, de proteína, de peptido e de virus influenza inactivado cultura MRC-11, ovalbumina (OVA), estirpe de virus de influenza inactivado A/Suíno e ou de vírus de pseudorabies inactivado (iPRV).

Os títulos dos anticorpos medidos foram amis elevados que os obtidos pelas emulsões de óleo mineral em água utilizadas nos produtos comerciais. Foi demonstardo que existe uma actividade sinérgica forte entre os SL-Ficoll e as emulsões, masi pronunciada sobre os porcos que sobre os ratinhos (Hilgers, et al., Vaccine, 12, 661-664, 1994). A resposta de anticorpos nos ratinhos foi aumentada de um modo significativo (Hilgers et al., Vaccine, 12, 653-660,1994).

Concluiu-se que a capacidade reactiva depende do tipo de polissacárido e de óleo incluido ns formulações e que o peso molecular do sacárido é um dos factores importantes.

As ciclodextrinas e seus derivados são bem conhecidas por serem capazes de formar complexos de inclusão com outras substâncias, como p. ex. substâncias de interesse farmacêutico, dentro da cavidade formada pela sua estrutura cíclica.

Entre as vantagens oferecidas por estes complexos de inclusão, pode-se citar o melhoramento da solubilidade, da biodisponibilidade e/ou da estabilidade química, o alongamento do tempo de meia-vida, a diminuição dos efitos secundários bem como certas vantagens na produção tais como uma obtenção mais facilitada de pó seco como material de partida de preparações liquidas.

Os Polissacáridos Sulfo-Lipídico (SLP) à base de ciclodextrina podem desde logo ter aplicações interessantes além da sua utilização como adjuvante descrita acima.

Com efeito, as SL-Ciclodextrinas são agentes tensoactivos pelo facto de terem presentes nas suas moléculas grupos aniónicos (sulfatos) e hidrófobos (cadeias alifáticas). Esta propriedade está na origem da formação de micelas em fase aquosa ou de micelas mistas em presença de outras substâncias tensoactivas, bem como a formação de emulsões de líquidos não miscíveis com a água, suspensões em fase aquosa de partículas insolúveis ou da formação de interfaces entre a fase aquosa e matéria insolúveis liquida ou sólida.

Assim, as SL-Ciclodextrinas apresentam a dupla vantagem de poder formar complexos de inclusão e de serem substâncias tensoactivas.

Elas podem consequentemente ser consideradas como formando uma família de produtos que apresentam propriedades novas susceptíveis de aplicações originais no sector farmacêutico.

Foram obtidas numerosas SL-Ciclodextrinas diferentes; estas distinguem-se pelas suas propriedades físico-químicas resultantes do tipo de Ciclodextrina (p.ex. α, β, γ), do teor em grupos sulfato bem como do teor e da natureza dos grupos lipídicos.

Exemplo 1

Polissacáridos diferentes foram testados pela sua solubilidade nos solventes orgânicos utilizados para a síntese e foram abandonados aqueles insuficientemente solúveis. 4,5 g de maltodextrina (Maltodextrinal5; Amylum, Bélgica), 4,5 g da beta-ciclodextrina (ACROS), 4,5 g da inulina (Dahlia Tubers; Sigma, USA) e 4,5 g do pululano (Hayashibara Co., Ltd, Japão) foram, solubilizados separadamente nas misturas (100 mL) de dimetilformamida anidra e de piridina anidra (relação volúmica 1:1). Durante um curto período de tempo (48 horas), as soluções destes polissacáridos foram secas com a ajuda de tamises moleculares (tamanho 2Á) (Merck, Darmstadt, Alemanha). 6,6 g de cloreto de lauroilo (Merck, Alemanha) foi adicionado e as misturas foram incubadas durante 6 horas a 60°C e durante 18 horas à temperatura ambiente (cerca de 15°C -22°C). De seguida, 0,6 g do ácido clorossulfónico (Merck, Alemanha) numa msitura (10 mL) de dimetilformamida anidra e de piridina anidra foi adicionado e o processo de incubação à temperatura ambiente foi renovado. Os solventes foram eliminados por evaporação a pressão reduzida (200 milibars) durante 1-2 horas a 60°C e dializados utilizando uma membrana de celulose regenerada contendo apenas uma cisão de 10 000 Daltons (SPECTRA/POR) usando uma solução salina tamponada de fosfato isotónico (esta solução salina PBS compreende, por litro de água, 8 g de cloreto de sódio, 0,2 g de cloreto de potássio e 1,15 g de fosfato hidrogenado dissódico tendo um pH de 7,3) e posteriormente usando água ultrapura até não se detectado nenhum vestígio de solvente no filtrado. A relação volúmica entre a solução de diálise (solução salina PBS ou água ultrapura) ,e o remanescente utilizado no decurso da diálise é mantido acima de 10:1 (v/v). A diálise é realizada durante pelo menos 10 dias, sendo a solução de diálise substituída pelo menos uma vez por dia. Os polissacáridos sulfolipídicos (SLP) assim obtidos foram liofilizados à temperatura ambiente, com uma pressão interna inferior a 0,1 mbar e uma armadilha a frio tendo uma temperatura inferior a -25°C. A composição dos SLP foi determinada através do doseamento do polissacárido, dos sulfatos ligados e do conteúdo total em lípidos bem como o conteúdo em lipidos ligados tal como descfrito anteriormente (Vaccine, 12, p. 653-660).

Soluções de SLP a 1% em peso/volume (p/v) numa solução salina tamponada com fosfato (PBS) contendo 2% volume/volume (v/v) de Tween (R) 80 foram preparados dissolvendo em primeiro lugar os SLP num volume mínimo (20 mL) de metiltertio-butiléter (MercK), adicionando 2 mL de Tween w 80 (MERCK) por g de SLP e evaporando o éter terc-tiobutilmetílico a temperatura elevada (+ 60°C) e à pressão reduzida (50 milibar) até ter sido obtida uma solução viscosa de SLP em Tween 80. Dez ml de água por g de SLP foram adicionados lentamente e de seguida juntaram-se os volumes apropriados de PBS e de óleo. A mistura foi emulsionada utilizando um microfluidizador (Microfluidics Corp., Newton, USA) até que mais nehuma gota de óleo superior a 2 ou 3 pm seja visível ao microscópio (ampliação de 1000 vezes). As emulsões foram armazenadas a 4°C até à sua utilização.

As vacinas foram preparadas misturando um volume de antigene com um volume de adjuvante. Os antigenes foram preparados tal como descrito precedentemente (Vaccine, 12, p. 653-660, e Vaccine, 12, p.661-665). Foram utilizadas duas soluções de antigenes diferentes: a solução compreende a seguinte composição por mL: 10 pg de vírus influenza (da gripe) inactivado cultura MRC-11 (SOLVAY DUPHAR) + 1000 pg OVA (SIGMA) e a solução II compreende por mL: 4,4 pg/mL de virus influenza inactivado cultura A/Suino (SOLVAY DUPHAR), 4,0 pg de virus influenza inactivado da estirpe MRC-11 (SOLVAY DUPHAR), 2,0 pg de virus influenza inactivado da estirpe x-79 (SOLVAY DUPHAR), e 108 TCID50 de vírus de pseudorabies (pseudo-raiva) inactivados (iPRV) (SOLVAY DUPHAR).

Ratinhos fêmea NMRI (Charles River, Alemanha) de 8 a 10 semanas (cerca de 20 g) foram imunizados por injecção na pata com 0,025 mL de vacina e os títulos em anticorpos foram medidos três semanas mais tarde.

Os títulos em anticorpos foram expressos em médias geométricas (2log + DMP). A análise dos títulos de anticorpos foi realizada por testes normalizados e os critérios para a validação foram descritos anteriormente (Vaccine, 12, p. 653-660).

Foram realizados testes de Student para analisar o significado estatístico dos resultados e foi considerado significativo um P < 0,05.

As formulações de adjuvantes foram testadas nos ratos em duas experiências independentes. «wl -14-

Quadro 1: Efeito adjuvante de certas emulsões à base de polissacáridos sulfo-lipídicos (SLP) no óleo e na água (SLP/O/A) sobre os ratos

Adjuvante [mg SLP e mL óleo]/mL n 2log du título de anticorpos contra Mrc 11 OVA média DMP média DMP t Experiência I SL-Maldexl 5/E/A [10/1001 6 13,1 0,7 7,3 0,2 SL-Ciclodex./E/A [10/1001 6 12,9 1,0 7,2 0,6 SL-Inulina/E/A [10/1001 6 12,7 0,8 7,2 0,2 SL-Pululano/E/A [10/1001 6 13,3 0,7 6,9 0,4 SL-Maldexl5/soia/A [10/1001 6 12,8 0,6 6,5 0,7 SL-Ciclodex/soia/A [10/100] 6 13,6 1,1 6,0 0,8 SL-Inulina/soja/A Γ10/100] 6 12,5 0,6 6,8 1,3 SL-Pululano/soja/A [10/100] 6 12,5 0,8 6,6 0,4 SL-Ficoll/E/A [10/1001 6 13,0 0,9 6,9 0,4 SL-Ficoll/soia/A [10/1001 6 12,0 0,6 6,6 0,3 SL-Ficoll/hexadec./A [10/100] 4 12,4 0,9 7,2 0,6 SL-Ficoll/óleo mineral/A [10/100] 4 12,2 0,5 6,8 0,3 Controlo (sem adjuvante) 6 11,3 0,7 3,5 2,0 Experiência II SL-Maldcxl 5/E/A [10/100] 6 13,3 0,8 9,0 U SL-Ciclodex./E/A [10/1001 6 13,0 0,5 8,6 0,8 SL-Inulina/E/A [10/1001 6 12,8 0,9 8,6 0,8 SL-Pululano/E/A [10/1001 6 13,6 0,5 8,8 0,8 SL-Maldex/soja/A [10/100] 6 11,2 0,7 7,4 0,3 - 15- - 15- SL-Ciclodex./soja/A 110/100] 6 11,7 0,5 6,5 1,0 SL-Inulina/soja/A [10/100] 6 11,8 0,5 7,5 0,4 SL-Pululano/soja/A [10/100] 6 10,9 0,8 7,3 0,4 SL-Maldexl5/hexadec./A [10/1001 6 12,2 0,7 8,3 0,8 SL-Ciclodex./hexadec. /A [10/100] 6 12,5 0,6 8,2 0,6 SL-Inulina/hexadec./A [10/100] 6 12,2 0,4 7,4 0,4 SL-Pululano/hexadec./A [10/100] 6 13,2 0,4 7,7 0,2 Controlo (sèm àdjuvante) 6 10,0 0,4 4,2 0,9 SL-Ficoll/E/A [10/1001 2 13,4 0,7 8,5 0,7 soja = óleo de soja hexadec.= hexadecano o. mineral= óleo mineral E = Esqualeno Ν = número de animais DMP = desvio médio padrão MALDEX= maltodextrina 15 Ciclodex. = ciclodextrina A = água

Todas as emulsões SLP/óleo/água aumentaram a resposta humoral contra o vírus da influenza estirpe MRC-11 e contra OVA. Foi demonstrado que existem diferenças no efeito adjuvante entre as diferentes formulações e algumas provocaram actividades iguais ao SL-Ficoll/E/A. Não foi possível observar qualquer efeito devido ao tipo de SLP. No que se refere ao tipo de óleo utilizado, as emulsões compreendendo esqualano (E) deram origem a respostas significativamente mais intensas que as emulsões contendo o hexadecano enquanto o óleo de soja provocava as respostas menos intensas.

Exemplo 2

Porcos de 8 a 10 semanas de idade foram testados para constatar uma eventual presença de anticorpos contra os antigenes virais em questão e foram excluídos os animais com títulos de anticorpos detectáveis. -16-

Uma emulsão mineral óleo em água vendida sob a marca SUVAXYN OAV EMULSION (SOLVAY DUPHAR) assim como formulações de SLP numa emulsão de esqualano em água foram preparadas segundo o método descrito no exemplo 1.

Vacinas contendo formulações com adjuvante foram preparados segundo o método descrito no exemplo 1. o

Formulações de SLP/esqualano/água foram testadas pelo seu efeito adjuvante sobre os porcos com o iPRV e o Vírus Influenza Inactivado - estirpes MRC-11 e A/Suíno, na qualidade de antigenes (Quadro 2). Os animais foram imunizados duas vezes (semanas 0 e 3) e os títulos em anticorpos foram medidos três semanas (semana 6) depois da 2a injecção.

Os títulos em anticorpos contra PRV (anti-PRV) foram aumentados pela semulsões SL-Ficoll/esqualano/água, SL-Inulina/esqualano/água, SL-Ciclodextrina/esqualano/água. Os títulos em anticorpos medidos foram comparáveis ou mais elevados que aqueles obtidos pelas emulsões de óleo mineral na água utilizados nos produtos comerciais. A resposta de anticorpos contra A/Suíno foi também aumentada pelas diferentes formulações SLP/esqualano/água mas certas respostas foram também mais elevadas que as obtidas pelas emulsões óleo/água clássicas. Os títulos em anticorpos contra MRC-11 foram aumentados por diferentes formulações e algumas emulsões SLP/esqualano/água mostraram títulos comparáveis ou mais elevados que as emulsões óleo mineral/água.

Os resultados destas análises são apresentados no Quadro 2. -17- \%Α.γ'θ «Ί

Quadro 2: Efeito de diferentes polissacáridos sulfo-lipídicos combinados com várias emulsões de óleo em água sobre a resposta de anticorpos anti-iPRV/A/suíno/MRC-11 medidos sobre os porcos.

Adjuvante [mg SLP + mL óleo]/pL 2 log dos títulos de anticorpos às 6 semanas iPRV A/Suíno MRC-11 média DMP média DMP média DMP PBS 0,5 0,0 <3,3 0,0 <3,9 0,5 Óleo mineral/A [0/5001 6,5 0,4 10,7 1,3 10,7 0,9 SL-Ficoll/E/A [10/1001 7,8 0,8 11,5 2,9 <12,7 2,4 SL-Maldexl 5/E/A [10/1001 7,5 1,1 8,7 1,1 13,1 1,3 SL-Ciclodex./E/A [10/1001 9,0 1,1 10,1 1,5 >12,9 2,2 SL-Inulina/E/A [10/1001 8,9 1,3 10,3 1,0 >13,7 1,3 DMP = desvio padrão da média E = Esqualeno MALDEX= maltodextrina 15 A = água

Ciclodex. = ciclodextrina A partir de experiências precedentes para testar o efeito adjuvante em paralelo sobre estas duas espécies de animais, foi demonstrado que existe uma actividade sinérgica forte entre os SL-Ficolls e as emulsões e que ela é mais pronunciada sobre os porcos que sobre os ratos (Vaccine, 12, 653-660, 1994; Vaccine, 12, 661-664, 1994). A resposta de anticorpos sobre os ratos foi aumentada de uma maneira significativa e foi demonstrado que existe um efeito pronunciado do tipo de óleo empregue mas não do tipo de polissacárido. O factor de aumento em comparação com animais que não receberam senão o anligene ficou limitado a uma ou duas unidades 2log sobre os ratos. Sobre os porcos, o efeito do adjuvante foi mais pronunciado principalmente porque a resposta contra os antigenes sem adjuvante foi muito fraca. Os títulos em anticorpos antí-iPRV e anti-A/vinho e anti-MRC-11 foram aumentados em mais de seis unidades 2log.

Os adjuvantes à base de óleo mineral aumentam a resposta de anticorpos de uma maneira significativa, mas formulações novas diferentes de adjuvantes provocaram títulos ainda mais elevados. O adjuvante SL-Ficoll/E/W apresentado anteriormente (Vaccine, 12, 653-660, 1994; Vaccine, 12, 661-664, 1994) revelou-se mais eficaz que o óleo mineral, enquanto determinados SLP novos exerceram uma actívidade igual ou superior aos SL-Ficoll.

Exemplo 3

Além do efeito adjuvante, outras propriedades são importantes para a avaliação de uma vacina. Entre outras, a reacção local é um aspecto importante, ainda que uma certa reacção reacção no local de injecção seja aceitável em geral para certas espécies de animais. A toxicidade local foi testada in vivo a seguir ao inchamento das patas de ratos após a injecção da vacina. Foi demonstrado que este método é muito sensível.

Formulações de SLP numa emulsão de esqualano em água, de óleo de soja em água, de óleo mineral e de hexadecano em água, assim como uma testemunha sem adjuvante foram preparadas de acordo com o método descrito no exemplo 1.

Vacinas contendo as formulações com adjuvante foram preparadas segundo segundo o método descrito no exemplo 1. -19-

Grupos de seis ralos foram tratados com 25μ1 de vacina por injecção sub-cutânea na planta do pé traseiro esquerdo. A vacina compreendia um volume de solução de antigenes contendo 10pg de MRC-11 e 1 mg de ovalbumina (OVA) por mL de PBS e um volume de adjuvante. A espessura das patas foi medida um dia a seguir e a vários intervalos após a injecção por um aparelho semi-electrónico especialmente desenvolvido para este objectivo pela Universidade do estado de Utrecht nos Países Baixos. A precisão deste aparelho é de cerca de 0,02 mm. O inchamento foi calculado através da subtracção da espessura da pata antes do tratamento e a espessura da pata após o tratamento e foi expressa em 0,01 mm.

Os resultados destas exepriências são apresentados no Quadro 3.

Quadro 3: Capacidade reactiva de diferentes adjuvantes sobre ratos

Experiência I

Adjuvante [mg SLP+pL óleol/mL 2 Inchamento médio (10' mm) Dias 1 2 3 4 7 11 14 18 25 SL-Maldexl 5/E/A [10/100] 169 110 89 65 39 16 18 19 17 SL-Ciclodex./E/A [10/100] 88 21 8 8 9 3 6 12 -1 SL-Inulina/E/A [10/1001 146 145 94 102 44 30 25 26 20 SL-Pululano/E/A [10/1001 235 231 137 112 87 74 60 64 42 -20- SL-Maldcxl5/soja/A [10/100] 30 10 5 0 2 10 5 5 1 SL-Ciclodex./soia/A Γ10/100] 2 0 0 0 0 0 4 10 -7 SL-Inulina/soja/A [10/100] 117 64 13 7 7 10 20 18 1 SL-Pululano/soja/A [10/100] 40 23 7 0 0 0 3 10 -2 SL-Ficoll/E/A [10/1001 196 273 299 305 305 237 177 144 97 SL-Ficoll/soja/A [10/1001 124 59 24 20 26 17 12 7 -5 SL-Ficoll/hexadec./A[ 10/1001 241 277 242 209 92 35 42 49 14 SL-F icoll/o.mineral/A Γ10/100] 233 295 300 292 201 165 120 89 75 Controlo (sem adjuvante) 2 0 0 0 0 0 4 -6 -4 hexadec.= hexadecano o. mineral= óleo mineral E = Esqualeno MALDEX= maltodextrina 15 Ciclodex. = ciclodextrina Soja = óleo de soja A = água

Experiência II

Adjuvante [mg SLP+jjL óleo]/mL Inchamento médio (10'2 mm) Dias 1 2 6 10 17 22 SL-Maldexl 5/E/A [10/1001 133 95 61 30 35 24 SL-Ciclodex./E/A Γ10/1001 62 54 10 15 17 1 SL-Inulina/E/A [10/1001 176 134 71 51 55 48 SL-Pululano/E/A [10/1001 200 199 91 94 77 46 SL-Maldexl5/soia/A Γ10/1001 20 10 7 0 0 0 SL-Ciclodex./soja/A [10/100J 19 16 21 16 11 12 4t rfr -21 - SL-Inulina/sqja/A [10/100] 52 38 22 11 24 0 SL-Pululano/soja/A [10/100] 52 38 11 4 15 0 SL-Maldexl5/hexadec./A [10/1001 108 65 14 14 22 0 SL-Ciclodex./hexadec./A [10/100] 107 74 14 10 25 0 SL-Inulina/hexadec./A[ 10/100] 121 114 46 30 22 0 SL-Pululano/hexadec./A [10/1001 224 213 112 59 40 23 Controlo (sem adjuvante) 2 0 0 0 0 0 SL-Ficoll/E/A Γ10/1001 73 293 325 239 178' 99 MALDEX= maltodextrina 15 hexadec.= hexadecano

Ciclodex. = ciclodextrina Soja = óleo de soja S = Esqualeno A = água

As formulações provocaram diferentes graus de inchamento no ponto de injecção, inchamento este que foi muito forte em certos casos durante os primeiros dias, e que se desfazia lentamente (Quadro 3). Emulsões compreendendo o hexadecano provocaram, em geral, reacções mais fortes que aquelas contendo o óleo de soja. No que se refere aos SLP, as emulsões de esqualano compreendendo SL-Ficoll provocaram inchamentos mais fortes que se mantiveram durante mais de três semanas. As emulsões contendo SL-Maltodextrinal5, SOL-Inulina ou SL-Pululano provocaram reacções de inchamento consideráveis que se desfaziam entretanto mais rapidamente que as provocadas pelo SL-Ficoll e não persistiram senão durante uma a duas semanas. A capacidade de induzir reacção (capacidade reactiva) da SL-Ciclodextrina incluída em diferentes óleos foi muito fraca ou mesmo ausente. Emulsões contendo SL-Ciclodextrina em esqualano ou em hexadecano provocaram alguns inchamentos durante um ou dois dias após a injecção enquanto a SL-Ciclodextrina no óleo de soja não provocou resposta visível. A capacidade reactiva, quer dizer a toxicidade local, testada sobre os ratos, mostrava efeitos pronunciados em função do tipo de óleo e do tipo de polissacárido. Em geral, o SL-Ficoll provocou reacções mais fortes que os outros SLP testados. O SL-Ficoll combinado seja com o esqualano seja com o óleo mineral provocou uma reacção local muito forte e persistente enquanto o SL-Ficoll combinado com o hexadecano e o óleo de soja não originou senão reacções moderadas ou mais fracas respectivamente (Quadro 2). Emulsões à base de esqualano provocaram reacções significativamente mais fortes que as que compreendiam o hexadecano. O óleo de soja não provocou senão reacções fracas. O carácter hidrófobo destes óleos é diferente. O esqualano, o óleo mineral e o hexadecano são hidrocarbonetos fortemente hidrófobos, enquanto o óleo de soja, sendo uma mistura de diferentes substâncias, é menos hidrófobo. O carácter hidrófobo dos diferentes óleos é ilustrado pelo valor F1LB dos detergentes necessários para obter uma emulsão estável em água. O SL-Pululano provocou toxicidades locais mais fortes que os três outros SLP. A SL-Inulina e a SL-Maltodextrinal5 provocaram inchamentos locais consideráveis enquanro a SL-Ciclodextrina não provocou senão uma reacção notável apenas durante um ou dois dias.

Entre outras características, os SLP diferem no seu peso molecular que decresce de SL-Ficoll = ao do SL-Pululano > SL-Inulina > SL-Maltodextrinal5 > SL-Ciclodextrina. Pode ser observado um paralelismo entre a capacidade reactiva e o peso molecular pode ser mas é ainda necessário prosseguir a investigação para poder estabelecer uma relação directa. A este respeito concluiu-se que a capacidade reactiva depende do tipo de polissacárido e do óleo incluídos nas formulações c que o peso molecular do polissacárido é um factor importante.

Exemplo 4

Foram sintetizados derivados sulfo-lipídicos de Maltodextrinal5, de Inulina, de Ciclodextrina, e de Pululano e incorporados em emulsões de óleo em água à base de esqualano, de óleo mineral, de hexadecano e de óleo de soja e a sua estabilidade foi estudada in vitro.

Os SLP da presente invenção foram sintetizados de acordo com o método descrito no exemplo 1 e misturados em emulsões óleo em água de esqualano, hexadecano e óleo de soja e a estabiliddae destas foi estudada in vitro.

Formulações de SLP numa emulsão de esqualano em água, de óleo de soja em água e de hexadecano em água foram preparadas de acordo com o método descrito no exemplo 1. A estabilidade das emulsões foi testada expondo as formulações a temperatura elevada durante um certo período de tempo. Em geral, as emulsões são menos estáveis a alta temperatura e o teste à temperatura elevada foi considerado como fornecedor de indicações sobre o comportamento a longo termo à temperatura mais fraca. A estabilidade das emulsões foi determinada a 37°C. Alíquotas estéreis de 5 mL de emulsão foram incubadas a 37°C e verificou-se cada dia a formação de gotículas de óleo, o aparecimento de uma fase oleosa e outras modificações, por inspecção das emulsões a olho nu.

Os SLP com uma relação S/L dc cerca de 0,1/1,0, foram incorporados em emulsões do tipo óleo em água à base de esqualano, de hexadecano e de óleo de soja.

Alíquotas estéreis compreendendo 0,01% (p/v) de timerosal (SIGMA) foram incubadas a 37°C e oO estado das emulsões foi estabelecido a diferentes intervalos de tempo por inspecção a olho nu.

Os resultados destas experiências são apresentados no Quadro 4.

Quadro 4: Estabilidade de diferentes emulsões de diferentes óleos compreendendo SLP numa concentração final de 1% (p/v) SLP, 2% (v/v) TWEEN 80, 10% (v/v) de óleo em PBS.

Adjuvante [mg SLP + pL óleol/mL Estabilidade a 37°C no dia: 1 2 7 10 14 21 28 35 46 53 115 SL-Maldex 15/E/A [10/1001 + + + + + + + + + + ±/+ SL-Ciclodex 15/E/A [10/1001 + + + + + + + + + + ±/+ SL-Inulina/E/A [10/1001 + + + + + + + + + + + SL-Pululano/E/A [10/1001 + + + + + + + + + - — SL-Maldex 15/soj a/A [10/1001 + + + + + + + + + + + SL-Ciclodex./soja/A [10/100] + + + + + + + + + + + SL-Inulina/soja/A [10/100] + + + + + + + + + + + SL-Pululano/soja/A [10/100] + + + + + + + + + + - SL-Maldex 15/hexadecano/A ΠΟ/1001 + + + + + + + + + + + -25- -25- SL-Ciclodcx./hcxadccano/A [10/100] 1 1 1 -1- + + + + + + + SL-Inulina/hexadecano/A Γ10/100] + + + + + + + + + + + SL-Pululano/hexadecano/A Γ10/100] + + + + + + + + + + - MALDEX= maltodextrina 15 Ciclodex. = ciclodextrina Soja = óleo de soja hexadec.= hexadecano E = Esqualano A = água (W, water) + + olho nu +/+ = duas fases; fase oleosa e fase aquosa transparente = duas fases; fase oleosa e fase aquosa branca = pequenas gotículas de óleo sobre a fase aquosa visíveis a olho nu = emulsão homogénea branca, sem gotículas de óleos visíveis a

Os novos SLP (SL-Pululano, SL-Inulina, SL-Maltodextrinal5, e SL-Ciclodextrina) incorporados nas emulsões de óleo de squalano, de hexadecano ou de óleo de soja são de uma estabilidade notável. As emulsões de SL-Inulina, SL-Ciclodextrina e SL-Maltodextrinal5 em esqualano permaneceram estáveis mais de 53 dias a 37°C. Este é considerado um melhoramento importante em comparação com as emulsões de SL-Ficoll/esqualano/água. Apesar do valor preditivo limitado do teste de estabilidade a 37°C , esta observação corresponde a uma resistência acrescida contra os factores de desestabilização.

Todas as emulsões, com excepção de SL-Pululano/esqualano/água, -26- permanecem estáveis durante pelo menos 53 dias a 37°C. Após 115 dias, a maior parte das emulsões constituídas por SL-Maltodextrinal5, SL-Ciclodextrina e SL-Inulina permanecem estáveis, enquanto as emulsões com esqualano e hexadecano mostravam algumas gotículas de óleo sobre a emulsão.

Lisboa, 18 de Abril de 2001

ALBERTO CANELAS.

Agente Oficia! da Propriedade industrial RUA VICTOR CORDON, 14 1200 LISBOA

Claims

-1- REIVINDICAÇÕES 1. Adjuvante para vacinas, compreendendo um polissacárido

sulfolipídico hidrofobo combinado com um constituinte com o qual forma uma interface, na qual o polissacárido sulfolipídico é escolhido dentro do grupo constituído pels ciclodextrinas, pela maltodextrina, a inulina e o pululano, compreendendo os grupos lipídicos 4 a 22 átomos de carbono em que o polissacárido sulfolipídico contem em média pelo menos 0,01 e não mais que 1,0 grupos sulfato por monossacárido, em média pelo menos 0,01 e não mais e 2,0 grupos lipídicos por monossacárido, e a relação entre os grupos sulfato e os grupos lipidícos é uma razão de 0,01 a 2 grupos sulfato por grupo lipídico, mantendo o seu carácter hidrófobo.
2. Adjuvante de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o polissacárido sulfolipídico ser uma ciclodextrina.
3. Adjuvante de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o polissacárido sulfolipídico conter, em média, pelo menos 0,12 grupos sulfato por monossacárido e mantendo totaolmente o seu carácter hidrófobo.
4. Adjuvante de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o polissacárido sulfolipídico não conter, em média, mais de 0,23 grupos sulfato por monossacárido, mantendo completamente o seu carácter hidrófobo.
5. Adjuvante de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o polissacárido sulfolipídico ser o de maltodextrina e conter, em média, 0,23 -2-grupos sulfato por monossacárido, mantendo completamente o seu carácter hidrófobo.
6. Adjuvante de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o polissacárido sulfolipídico ser o de ciclodextrina e conter, em média, 0,20 grupos sulfato por monossacárido, mantendo completamente o seu carácter hidrófobo. +
7. Adjuvante de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o polissacárido sulfolipídico ser o inulina e conter, em média, 0,19 grupos sulfato por monossacárido, mantendo completamente o seu carácter hidrófobo.
8. Adjuvante de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o polissacárido sulfolipídico ser o de pululano e conter, em média, 0,16 grupos sulfato por monossacárido, mantendo completamente o seu carácter hidrófobo.
9. Adjuvante de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o polissacárido sulfolipídico não conter, em média, mais de 1,05 grupos lipídicos por monossacárido, mantendo completamente o seu carácter hidrófobo.
10. Adjuvante de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o polissacárido sulfolipídico não conter, em média, mais de 1,29 grupos lipídicos por monossacárido, mantendo completamente o seu carácter hidrófobo.
11. Adjuvante de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o polissacárido sulfolipídico ser o de maltodextrina e conter, em média, 1,29 -3-grupos lipídicos por monossacárido, mantendo complelamenle o seu carácter hidrófobo.
12. Adjuvante de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o polissacárido sulfolipídico ser o de ciclodextrina e conter, em média, 1,05 grupos lipídicos por monossacárido, mantendo completamente o seu carácter hidrófobo.
13. Adjuvante de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o polissacárido sulfolipídico ser o de pululano e conter, em média, 1,24 grupos lipídicos por monossacárido, mantendo completamente o seu carácter hidrófobo.
14. Adjuvante de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o polissacárido sulfolipídico ser o de pululano e conter, em média, 1,24 grupos sulfato por monossacárido, mantendo completamente o seu carácter hidrófobo.
15. Adjuvante de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a relação entre os grupos sulfato e os grupos lipídicos ser uma relação de 0,10-0,19 grupos sulfato por grupo lipídico, mantendo completamente o carácter hidrófobo do composto.
16. Adjuvante de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o polissacárido sulfolipídico ser o de maltodextrina contendo uma relação entre os grupos sulfato e os grupos lipídicos de aproximadamente 0,18 grupos sulfato por grupo lipídico, mantendo completamente o seu carácter hidrófobo. -4-
17. Adjuvante de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o polissacárido sulfolipídico ser o de ciclodextrina contendo uma relação entre os grupos sulfato e os grupos lipídicos de aproximadamente 0,19 grupos sulfato por grupo lipídico, mantendo completamente o seu carácter hidrófobo.
18. Adjuvante de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o polissacárido sulfolipídico ser.o de inulina contendo uma relação entre os grupos sulfato e os grupos lipídicos de aproximadamente 0,15 grupos sulfato por grupo lipídico, mantendo completamente o seu carácter hidrófobo.
19. Adjuvante de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o polissacárido sulfolipídico ser o de maltodextrina contendo uma relação entre os grupos sulfato e os grupos lipídicos de aproximadamente 0,13 grupos sulfato por grupo lipídico, mantendo completamente o seu carácter hidrófobo.
20. Adjuvante de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o constituinte formando uma interface ser escolhido dentro do grupo consistindo num líquido não miscível com a água e uma substância sólida que é insolúvel numa fase aquosa.
21. Adjuvante de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o líquido não miscível com a água ser escolhido dentro do grupo consistindo em esqualano, óleo de soja, um óleo mineral e hexadecano.
22. Utilização de polissacárido sulfolipídico de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 21 como adjuvante no interior das vacinas. -5-
23. Processo para a preparação de uma vacina em emulsão, caracterizado por se emulsionar uma solução aquosa de um antigene, um polissacárido sulfolipídico seguindo qualquer uma das reivindicações 1 a 21, formando um dos constituintes uma interface e um agente emulsionante.
24. Vacina compreendendo uma quantidade imunogénica de um antigene e um adjuvante compreendendo um polissacárido sulfolipídico seguindo qualquer uma das reivindicações 1 a 21 e um constituinte formando uma interface. Lisboa, 18 de Abril de 2001

ALBERTO CANELAS Agente Oficial da Propriedade Industria! Rua VICTOR CORDON, 14 1200 LISBOA