JP2816337B2 - ワクチン アジュバント - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、改良されたワクチ
ンアジュバント処方、そのアジュバント処方製造の改良
方法、およびその改良処方の使用方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】アジュバントは、ワクチン中の特定の抗
原によって得られる免疫応答を改良するのに有用であ
る。一部の抗原はワクチンとしてアジュバントを用いな
いで投与されるが、効果的なアジュバントの非存在下に
は有用な免疫応答を刺激するのに十分な免疫原性を欠く
抗原は多い。アジュバントはまた、「自足」抗原から得
られる免疫応答を改良し、得られる免疫応答の増強また
は投与抗原量の減量が可能である。

【０００３】実験動物に用いられる標準的なアジュバン
トにはフロインドのアジュバントがある。フロインドの
完全アジュバント（ＦＣＡ）は鉱油とマイクロバクテリ
アの死菌を食塩水に含有するエマルジョンである。フロ
インドの不完全アジュバント（ＦＩＡ）はマイクロバク
テリアを欠いている。ＦＩＡおよびＦＣＡはいずれも著
しい体液性（抗体）免疫を誘導し、ＦＣＡはさらに高レ
ベルの細胞性免疫を誘導する。しかしながら、ＦＩＡも
ＦＣＡも、アジュバントの副作用のために、実験室以外
での使用は許容されない。鉱油は膿瘍や肉芽腫を生じる
ことが知られているし、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒ
ｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）は結核の原因にな
る。

【０００４】多数の天然化合物、たとえばグラム陰性菌
エンドトキシンのリピドＡ部分およびマイコバクテリア
のトレハロースジマイコレートがＦＣＡおよびＦＩＡの
代用として試みられてきた。また、リン脂質のリゾレシ
チンがアジュバント活性をもつことも明らかにされてい
る（Ｂ．Ａｒｎｏｌｄら：Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏ
ｌ．，９：３６３〜３６６，１９７９）。さらに、数種
の合成界面活性剤たとえばジメチルジオクタデシルアン
モニウムブロミド（ＤＤＡ）およびある種の線状ポリオ
キシプロピレン−ポリオキシエチレン（ＰＯＰ−ＰＯ
Ｅ）ブロックポリマー〔プルロニック（Ｐｌｕｒｏｎｉ
ｃ^TM）の登録商標名で市販されている〕がアジュバント
活性をもつことも報告されている（Ｈ．Ｓｎｉｐｐｅ
ら：Ｉｎｔ．Ａｒｃｈｓ．Ａｌｌｅｒｇｙ Ａｐｐｌ．
Ｉｍｍｕｎ．，６５：３９０〜３９８，１９８１）。
Ｒ．ＨｕｎｔｅｒらはＪ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１２７：
１２４４〜１２５０（１９８１）に、ＰＯＰ−ＰＯＥブ
ロックポリマーは、鉱油／水エマルジョンアジュバント
処方の界面活性剤成分として用いた場合、マウスで、ウ
シ血清アルブミン（ＢＳＡ）に対する抗体の生成を増大
させると報告している。これらの天然および合成界面活
性剤はある程度のアジュバント活性を示すが、大部分、
ＦＣＡやＦＩＡを用いて得られるほどの免疫増強作用を
示すことはない。

【０００５】他のアプローチとして、マイコバクテリア
からのアジュバント作用はその細胞壁のムラミルペプチ
ドによることが明らかにされている。アジュバント活性
を残しているこの分子の最小フラグメントは、Ｎ−アセ
チルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミンであ
り、これはムラミルジペプチドまたはＭＤＰとも呼ばれ
ている（Ｆｌｌｏｕｚら：Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈ
ｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，５９：４，１３１７，
１９７４）。多くのＭＤＰ類縁体が製造され、これらも
ＭＤＰと呼ばれている（たとえば、Ａｕｄｉｂｅｒｔ
ら：米国特許第４，１５８，０５２号、Ａｕｄｉｂｅｒ
ｔら：米国特許第４，２２０，６３７号、Ａｕｄｉｂｅ
ｒｔら：米国特許第４，３２３，５５９号、Ｂａｓｃｈ
ａｎｇら：米国特許第４，３２３，５６０号、Ｂａｓｃ
ｈａｎｇら：米国特許第４，４０９，２０９号、Ｂａｓ
ｃｈａｎｇら：米国特許第４，４２３，０３８号、Ｄｅ
ｒｒｉｅｎ ら：米国特許第４，１８５，０８９号、Ｈ
ａｒｔｍａｎｎら：米国特許第４，４０６，８８９号、
Ｊｏｎｅｓ ら：米国特許第４，０８２，７３５
号、Ｊｏｎｅｓ ら：米国特許第４，０８２，７３
６号、Ｌｅ Ｆｒａｎｃｉｅｒら：米国特許第４，４２
７，６５９号、Ｌｅ Ｆｒａｎｃｉｅｒら：米国特許第
４，４６１，７６１号、Ｙａｍａｍｕｒａら：米国特許
第４，３１４，９８８号、Ｙａｍａｍｕｒａら：米国特
許第４，１０１，５３６号およびＹａｍａｍｕｒａら：
米国特許第４，３６９，１７８号参照）。これらの化合
物は水溶液として投与した場合、弱いながら免疫系に刺
激作用を示すが、結果は一般的に、ＦＩＡまたはＦＣＡ
で得られる特異的免疫応答には及ばない。

【０００６】最近、グリコペプチド、非毒性ＰＯＰ−Ｐ
ＯＥブロックポリマー、グリコールエーテルベース界面
活性剤、代謝性油状物、および緩衝食塩水からなるとく
に有効なアジュバント処方がＡｌｌｉｓｏｎらによって
米国特許第４，６０６，９１８号に報告された。この処
方は、ＦＣＡを用いて実験動物に達成される結果と同等
またはそれ以上に優れた強力な体液性および細胞性免疫
応答を誘導できる。しかしながら、この処方は、不安定
で放置すると分離（たとえばクリーミング）する傾向が
ある。本発明者らは、冷蔵しておくと抗原の一次応答増
強能が消失することを認めている。また、完全なアジュ
バント活性を保持した安定な、均一なエマルジョンを工
業的規模で製造することは困難であることも明らかにさ
れている。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】本発明者らは、免疫増
強性グリコペプチドを非毒性Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−テト
ラ（ポリオキシプロピレン−ポリオキシエチレン）−
１，２−ジアミノエタンブロックポリマー（テトラポリ
オール）と処方すると、先行技術におけるある種の欠
点、たとえば毒性および細胞性免疫刺激の欠如等を克服
したアジュバントエマルジョンが得られることを発見し
た。このアジュバントは、ＦＣＡおよびＡｌｌｉｓｏｎ
の組成物と同等のまたはそれ以上の活性を有する。本発
明の処方は製造が容易で、完全な活性を保持し、Ａｌｌ
ｉｓｏｎの組成物より優れた安定性を示す。テトラポリ
オールの非毒性の故に、このアジュバント処方は、鳥類
および哺乳類に投与する抗原の免疫原性を増強するため
のビークルとして安全に使用することができる。

【０００８】本発明者らはまた、ＰＯＰ−ＰＯＥブロッ
クポリマーまたはテトラポリマーのいずれかを用いたア
ジュバントエマルジョンのとくに有利な製造方法を発明
した。この方法によれば、処方の有効性は保持され、そ
の物理的安定性は増強し、冷蔵に対する感受性は低下す
る。とくに、このアジュバントは凍結させても、その有
効性を保持している。

【０００９】

【課題を解決するための手段】発明の要約 本発明の一態様は、連続水相中に分散された油状粒子を
有するエマルジョン型の、抗原の免疫原性を増強するア
ジュバントであって、非毒性テトラポリオールブロック
ポリマーのエマルジョン生成量、およびグリコペプチド
の免疫増強量からなる、アジュバントである。

【００１０】本発明の他の態様は、連続水相中に分散さ
れた油状粒子を有するエマルジョン型の、抗原の免疫原
性を増強するためのアジュバントであって、非毒性テト
ラポリオールのエマルジョン生成量、所望により非毒性
代謝性油状物のエマルジョン生成量、グリコールエーテ
ルベースの界面活性剤のエマルジョン安定化量、水また
は水性溶液、および好ましくは式Ｉ

【化２】 （式中、ＲおよびＲ¹ はそれぞれ独立にＨまたは１個か
ら２２個までの炭素原子を有するアシルであり、Ｒ² は
アルキルまたはアリールであって所望によりハロ、ニト
ロまたは低級アルキルで置換されていてもよく、Ｒ³ は
Ｈ、アルキルまたはアリールであり、Ｒ⁴ はＨまたは低
級アルキルであり、ＸはＬ−アラニル、Ｌ−α−アミノ
ブチリル、Ｌ−アルギニル、Ｌ−アスパラギニル、Ｌ−
アスパルチル、Ｌ−システイニル、Ｌ−グルタミニル、
Ｌ−グルタミル、グリシル、Ｌ−ヒスチジル、Ｌ−ヒド
ロキシプロリル、Ｌ−イソロイシル、Ｌ−ロイシル、Ｌ
−リジル、Ｌ−メチオニル、Ｌ−オルニチニル、Ｌ−フ
ェニルアラニル、Ｌ−プロリル、Ｌ−セリル、Ｌ−スレ
オニル、Ｌ−チロシル、Ｌ−トリプトファニルまたはＬ
−バリルであり、ＹはＤ−グルタミン、Ｄ−イソグルタ
ミンまたはＤ−イソアスパラギンである）で示される誘
導体およびその医薬的に許容される塩であるムラミルジ
ペプチドの免疫増強量からなるアジュバントである。

【００１１】本発明の他の態様は、上述の型のアジュバ
ントであって、非毒性ＰＯＰ−ＰＯＥブロックポリマー
のエマルジョン生成量の代わりにテトラポリオールを用
い、油状粒子の実質的にすべては約８００ｎｍ未満、好
ましくは約３００ｎｍ未満の直径を有するアジュバント
である。

【００１２】本発明の他の態様は、本発明のアジュバン
トを免疫誘導量の抗原と配合したワクチンである。本発
明の他の態様は、ポリマー、油状物、界面活性剤および
水または水性溶液からなる最初の混合物を調製し、この
混合物を乳化して連続水相に分散された油状粒子を有
し、油状粒子の実質的にすべてが約８００ｎｍ未満好ま
しくは約３００ｎｍ未満の直径をもつ油中水型のエマル
ジョンを生成させ、エマルジョンを式Ｉのムラミルジペ
プチド誘導体と配合する本発明のアジュバントの製造方
法である。

【００１３】本発明の他の態様は、上述のエマルジョン
を含有する第一の容器、およびムラミルジペプチド好ま
しくはＮ−アセチルムラミル−Ｌ−スレオニル−Ｄ−イ
ソグルタミンを水性溶液または懸濁液として含有する第
二の容器からなり、各容器の成分の濃度は両容器の内容
物の配合により本発明のアジュバントを生成するように
選択される、本発明のアジュバントを用時調製するため
のキットである。

【００１４】本発明の化の態様は、上述のアジュバント
キットとは、免疫誘導量の抗原を第二の容器に加える
か、または第三の容器中に存在させる点で異なる本発明
のワクチンを製造するためのキットである。本発明の他
の態様は、本発明のワクチンを投与するこからなる、免
疫系を有する動物に免疫応答を誘導する方法である。

【００１５】

【発明の実施の形態】好ましい態様の詳細な説明 本発明の一態様は、連続水相中に分散された油状粒子を
有し、抗原の免疫原性を増強するためのエマルジョン型
のアジュバントであって、非毒性テトラポリオールまた
はＰＯＰ−ＰＯＥブロックポリマーのエマルジョン生成
量、およびグリコペプチドの免疫増強量からなり、ＰＯ
Ｐ−ＰＯＥブロックポリマーが存在する場合には油状粒
子の実質的にすべては約８００ｎｍ未満の直径を有する
アジュバントである。

【００１６】本発明の他の態様は、連続水相中に分散さ
れた油状粒子を有するエマルジョン型の、抗原の免疫原
性を増強するためのアジュバントであって、非毒性テト
ラポリオールのエマルジョン生成量、所望により非毒性
代謝油状物のエマルジョン生成量、グリコールエーテル
ベースの界面活性剤のエマルジョン安定化量、水または
水性溶液、および好ましくは式Ｉ

【化３】 （式中、ＲおよびＲ¹ はそれぞれ独立にＨまたは１個か
ら２２個までの炭素原子を有するアシルであり、Ｒ² は
アルキルまたはアリールであって所望によりハロ、ニト
ロまたは低級アルキルで置換されていてもよく、Ｒ³ は
Ｈ、アルキルまたはアリールであり、Ｒ⁴ はＨまたは低
級アルキルであり、ＸはＬ−アラニル、Ｌ−α−アミノ
ブチリル、Ｌ−アルギニル、Ｌ−アスパラギニル、Ｌ−
アスパルチル、Ｌ−システイニル、Ｌ−グルタミニル、
Ｌ−グルタミル、グルシル、Ｌ−ヒスチジル、Ｌ−ヒド
ロキシプロリル、Ｌ−イソロイシル、Ｌ−ロイシル、Ｌ
−リジル、Ｌ−メチオニル、Ｌ−オルニチニル、Ｌ−フ
ェニルアラニル、Ｌ−プロリル、Ｌ−セリル、Ｌ−スレ
オニル、Ｌ−チロシル、Ｌ−トリプトファニルまたはＬ
−バリルであり、ＹはＤ−グルタミン、Ｄ−イソグリタ
ミンまたはＤ−イソアスパラギンである）で示される誘
導体およびその医薬的に許容される塩であるムラミルジ
ペプチドの免疫増強量からなるアジュバントである。

【００１７】好ましい亜群は、テトラポリオールがテト
ロニック（登録商標）（Ｔｅｔｒｏｎｉｃ^TM）１５０１
であり、式Ｉのムラミルジペプチド誘導体はとくにＮ−
アセチルムラミル−Ｌ−スレオニル−Ｄ−イソグルタミ
ンであるアジュバントである。好ましい本発明の群は非
毒性代謝性油状物を包含し、油状物はスクアレンまたは
スクアランのアジュバントである。好ましい亜群はグリ
コールエーテルベース界面活性剤はツイーン（登録商
標）（Ｔｗｅｅｎ^TM）８０であり、水または水性溶液は
とくに等張性緩衝食塩水であり、油状粒子の実質的にす
べては約８００ｎｍ未満、好ましくは約３００ｎｍ未満
の直径を有するアジュバントである。他の好ましい亜群
はテトラポリオールがＴｅｔｒｏｎｉｃ^TM１５０であ
り、式Ｉのムラミルジペプチド誘導体はムラブチドであ
るアジュバントである。

【００１８】本発明の他の態様は、連続水相中に分散さ
れた油状粒子を有する水中油型エマルジョンの、抗原の
免疫原性を増強するためのアジュバントであって、非毒
性テトラポリオール０．２〜４９％、非毒性代謝性油状
物０〜１５％、グリコールエーテルベース界面活性剤
０．０５〜５％、水または水性溶液、および式Ｉのムラ
ミルジペプチド誘導体０．０００１〜１０％からなるア
ジュバントである（％は、ムラミルジペプチドの場合、
重量／容量であるほかは、容量／容量である）。好まし
い亜群は、テトラポリオールがＴｅｔｒｏｎｉｃ^TM１５
０１であり、式Ｉのムラミルジペプチド誘導体はとくに
Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−スレオニル−Ｄ−イソグ
ルタミンであるアジュバントである。好ましい群は、非
毒性代謝性油状物を包含し、油状物はスクアレンまたは
スクアランのアジュバントである。

【００１９】現時点において好ましい本発明の態様は、
連続水相中に分散された油状粒子を有する水中油型エマ
ルジョンの、抗原の免疫原性を増強するためのアジュバ
ントであって、Ｔｅｔｒｏｎｉｃ^TM１５０１、１〜１０
％、Ｔｗｅｅｎ^TM８０約０．２％、等張性緩衝食塩水
（リン酸緩衝液、酢酸緩衝液またはその配合物）、およ
びＮ−アセチルムラミル−Ｌ−スレオニル−Ｄ−イソグ
ルタミン０．００１〜１０％からなり、油状粒子の実質
的にすべては約８００ｎｍ未満、好ましくは約３００ｎ
ｍ未満の直径を有するアジュバントである。

【００２０】本発明の他の態様は、連続水相中に分散さ
れた油状粒子を有する水中油型エマルジョンの、抗原の
免疫原性を増強するためのアジュバントであって、非毒
性ＰＯＰ−ＰＯＥブロックポリマーのエマルジョン生成
量、所望により非毒性代謝性油状物のエマルジョン生成
量、グリコールエーテルベース界面活性剤のエマルジョ
ン安定化量、水または水性溶液、および式Ｉのムラミル
ジペプチド誘導体の免疫増強量からなり、油状粒子の実
質的にすべては約８００ｎｍ未満、好ましくは約３００
ｎｍ未満の直径を有するアジュバントである。

【００２１】好ましい亜群は、非毒性ＰＯＰ−ＰＯＥブ
ロックポリマーがＰｌｕｒｏｎｉｃ ^TMＬ１２１であり、
式Ｉのムラミルジペプチド誘導体はとくにＮ−アセチル
ムラミル−Ｌ−スレオニル−Ｄ−イソグルタミンである
アジュバントである。好ましい種類は非毒性代謝性油状
物を包含し、油状物はスクアレンまたはスクアランのア
ジュバントである。好ましい亜種はグリコールエーテル
ベース界面活性剤Ｔｗｅｅｎ^TM８０、水または水性溶液
はとくに等張性緩衝食塩水のアジュバントである。

【００２２】本発明の他の態様は、連続水相中に分散さ
れた油状粒子を有する水中油型エマルジョンの、抗原の
免疫原性を増強するためのアジュバントであって、非毒
性ＰＯＰ−ＰＯＥブロックポリマー０．２〜４９％、非
毒性代謝性油状物０〜１５％、グリコールエーテルベー
ス界面活性剤０．０５〜５％、水または水性溶液、およ
び式Ｉのムラミルジペプチド誘導体０．０００１〜１０
％からなり、油状粒子の実質的にすべては約８００ｎｍ
未満、好ましくは３００ｎｍ未満の直径を有するアジュ
バントである（％は、ムラミルジペプチドの場合の重量
／容量を除き、容量／容量である）。

【００２３】好ましい亜群は、ＰＯＰ−ＰＯＥブロック
ポリマーはＰｌｕｒｏｎｉｃ^TMＬ１２１であり、式Ｉの
ムラミルジペプチド誘導体はとくにＮ−アセチルムラミ
ル−Ｌ−スレオニル−Ｄ−イソグルタミンのアジュバン
トである。好ましい種類は非毒性代謝性油状物を包含
し、油状物はスクアレンまたはスクアランのアジュバン
トである。好ましい亜種はグリコールエーテルベース界
面活性剤Ｔｗｅｅｎ^TM８０のアジュバントである。現時
点で好ましい態様は、連続水相中に分散された油状粒子
を有する水中油型エマルジョンの、抗原の免疫原性を増
強するためのアジュバントであって、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ
^TMＬ１２１、１〜１０％、スクアランまたはスクアレン
１〜１０％、Ｔｗｅｅｎ^TM８０約０．２％、等張性緩衝
食塩水、およびＮ−アセチルムラミル−Ｌ−スレオニル
−Ｄ−イソグルタミンからなり、油状粒子の実質的にす
べては約８００ｎｍ未満、好ましくは約３００ｎｍ未満
の直径を有するアジュバントである。

【００２４】本発明の他の態様は、本発明のアジュバン
トを免疫誘導量の抗原と配合したワクチンである。適当
なワクチンは、連続水相中に分散された油状粒子を有す
る水中油型エマルジョンの、動物の予防接種ワクチンで
あって、抗原の免疫誘導量、非毒性テトラポリオールま
たは非毒性ＰＯＰ−ＰＯＥブロックポリマーのエマルジ
ョン生成量、所望により非毒性代謝性油状物のエマルジ
ョン生成量、所望によりグリコールエーテルベース界面
活性剤のエマルジョン安定化量、水または水性溶液、ム
ラミルジペプチド、好ましくは式Ｉの誘導体の免疫増強
量からなるワクチンである。好ましい亜群はテトラポリ
オールを含有し、テトラポリオールはとくにＴｅｔｒｏ
ｎｉｃ^TM１５０１であるワクチンである。好ましい種類
は、油状粒子の実質的にすべては約８００ｎｍ好ましく
は約３００ｎｍ未満の直径を有するワクチンである。好
ましい亜種は、式Ｉのムラミルジペプチド誘導体がＮ−
アセチルムラミル−Ｌ−スレオニル−Ｄ−イソグルタミ
ンのワクチンである。

【００２５】他の好ましい亜種は、式Ｉのムラミルジペ
プチド誘導体がムラブチドのワクチンである。現時点に
おいて好ましい態様は、Ｔｅｔｒｏｎｉｃ^TM１５０１、
１〜１０％、スクアランまたはスクアレン１〜１０％、
Ｔｗｅｅｎ^TM８０約０．２％、等張性緩衝食塩水、およ
びＮ−アセチルムラミル−Ｌ−スレオニル−Ｄ−イソグ
ルタミン０．０００１〜１０％からなり、とくに、油状
粒子の実質的にすべては約８００ｎｍ未満好ましくは約
３００ｎｍ未満の直径を有するワクチンである。他の好
ましい亜群は、ＰＯＰ−ＰＯＥブロックポリマーを包含
し、そのブロックポリマーはＰｌｕｒｏｎｉｃ^TMＬ１２
１であり、油状粒子の実質的にすべては約８００ｎｍ未
満、好ましくは約３００ｎｍであるワクチンである。好
ましい種類は、式Ｉのムラミルジペプチド誘導体がＮ−
アセチルムラミル−Ｌ−スレオニル−Ｄ−イソグルタミ
ンのワクチンである。他の好ましい種類は、式Ｉのムラ
ミルジペプチド誘導体がムラブチドのワクチンである。
現時点で好ましい態様は、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ^TMＬ１２
１、１〜１０％、スクアランまたはスクアレン１〜１０
％、Ｔｗｅｅｎ^TM８０約０．２％、等張性緩衝食塩水、
およびＮ−アセチルムラミル−Ｌ−スレオニル−Ｄ−イ
ソグルタミン０．０００１〜１０％からなるワクチンで
ある。

【００２６】本発明の他の態様は、水相とエマルジョン
生成量の非毒性テトラポリオールまたはＰＯＰ−ＰＯＥ
ブロックポリマーを一緒に混合してエマルジョンを生成
させることからなる本発明のアジュバントまたはワクチ
ンの製造方法である。

【００２７】本発明の他の態様は、非毒性テトラポリオ
ールまたは非毒性ＰＯＰ−ＰＯＥブロックポリマー、所
望により非毒性代謝性油状物、所望によりグリコールエ
ーテルベース界面活性剤、および水または水性溶液から
なる最初の混合物を調製し、この最初の混合物を乳化し
て連続水相中に油状粒子が分散され、油状粒子の実質的
にすべては約８００ｎｍ未満好ましくは約３００ｎｍ未
満の直径を有する水中油型エマルジョンを生成させ、こ
のエマルジョンを式Ｉのムラミルジペプチド誘導体と合
することからなる本発明のアジュバントの製造方法であ
る。好ましい方法によれば、最初の混合物はマイクロフ
ルイダイザー（登録商標）（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚ
ｅｒ^TM）または他の適当な乳化技術を用いて乳化し、油
状粒子の実質的にすべては約８００ｎｍ未満、好ましく
は約３００ｎｍ未満の直径を有するエマルジョンを得
る。さらに好ましい方法によれば、式Ｉのムラミルジペ
プチド誘導体は水性溶液または懸濁液の形でエマルジョ
ンと合する。

【００２８】本発明の他の態様は、水相中にテトラポリ
オールまたはＰＯＰ−ＰＯＥポリマーのエマルジョンを
含有する第一の容器、およびグリコペプチドを含有する
第二の容器からなる、本発明のアジュバントの用時調製
用キットである。

【００２９】本発明の他の態様は、水相中にテトラポリ
オールまたはＰＯＰ−ＰＯＥブロックポリマーのエマル
ジョンを含有する第一の容器、および抗原を含有する第
二の容器からなり、グリコペプチドは第三の容器または
第一の容器もしくは第二の容器に存在させる、本発明の
ワクチンの用時調製用キットである。

【００３０】本発明の他の態様は、連続水相中に分散さ
れた油状粒子を有する水中油型エマルジョンであって、
Ｔｅｔｒｏｎｉｃ^TM１５０１またはＰｌｕｒｏｎｉｃ^TM
Ｌ１２１、スクアランまたはスクアレン、所望によりＴ
ｗｅｅｎ^TM８０および等張性緩衝食塩水からなるエマル
ジョンを含有する第一の容器、および粉末状（好ましく
は凍結乾燥粉末）または水性溶液もしくは懸濁液として
Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−スレオニル−Ｄ−イソグル
タミンを含有する第二の容器からなり、各容器中の成分
の濃度は、両容器の内容物の配合によりＴｅｔｒｏｎｉ
ｃ^TM１５０１またはＰｌｕｒｏｎｉｃ^TMＬ１２１、１〜
３０％、スクアランまたはスクアレン１〜３０％、所望
によりＴｗｅｅｎ^TM８０約０．２〜５％、Ｎ−アセチル
ムラミル−Ｌ−スレオニル−Ｄ−イソグルタミン０．０
００１〜３０％、および等張性緩衝食塩水になるように
選択される、本発明のアジュバントの用時調製用キット
である。好ましいキットにおいては、Ｔｅｔｒｏｎｉｃ
^TM１５０１が包含される。さらに好ましいキットにおい
ては、油状粒子の実質的にすべては約８００ｎｍ未満、
好ましくは約３００ｎｍ未満の直径を有する。他の好ま
しいキットはＰｌｕｒｏｎｉｃ^TMＬ１２１を包含する。

【００３１】本発明の他の態様は、連続水相中に分散さ
れた油状粒子を有する水中油型エマルジョンであって、
Ｔｅｔｒｏｎｉｃ^TM１５０１またはＰｌｕｒｏｎｉｃ^TM
Ｌ１２１、スクアランまたはスクアレン、所望によりＴ
ｗｅｅｎ^TM８０、および等張性緩衝食塩水からなるエマ
ルジョンを含有する第一容器、および粉末状（好ましく
は凍結乾燥粉末）または水性溶液もしくは懸濁液として
Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−スレオニル−Ｄ−イソグル
タミンと免疫誘導量の抗原を含有する第二の容器からな
り、各容器中の成分の濃度は、両容器の内容物の配合に
よりＴｅｔｒｏｎｉｃ^TM１５０１またはＰｌｕｒｏｎｉ
ｃ^TMＬ１２１、１〜１０％、スクアランまたはスクアレ
ン１〜１０％、所望によりＴｗｅｅｎ^TM８０約０．２
％、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−スレオニル−Ｄ−イソ
グルタミン０．０００１〜１０％、免疫誘導量の抗原お
よび等張性緩衝食塩水からなる処方を生成するように選
択される、本発明のワクチンの用時調製用キットであ
る。所望により、抗原を別の第三の容器中に入れること
もできる。好ましいキットにおいてはＴｅｔｒｏｎｉｃ
^TM１５０１が包含される。さらに好ましいキットにおい
ては、油状粒子の実質的にすべてが約８００ｎｍ未満、
好ましくは約３００ｎｍ未満の直径を有する。他の好ま
しいキットにおいては、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ^TMＬ１２１が
包含される。

【００３２】上述のように、本発明のキットにおいては
グルコペプチドは粉末として存在させるのが適当であ
り、凍結乾燥粉末が好ましい。

【００３３】本発明の他の態様は、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ^TM
Ｌ１２１またはＴｅｔｒｏｎｉｃ^TM１５０１、１〜１０
％、スクアランまたはスクアレン１〜１０％、所望によ
りＴｗｅｅｎ^TM８０約０．２％、等張性緩衝食塩水、Ｎ
−アセチルムラミル−Ｌ−スレオニル−Ｄ−イソグルタ
ミン、および免疫誘導量の抗原からなるワクチンを投与
して、免疫系を有する動物に免疫応答を誘導する方法で
ある。

【００３４】定義 「アルキル」の語は、１個から２２個までの炭素原子を
有し、不飽和結合を含まない、直鎖状または分岐状の基
である。アルキルの例としては、メチル、エチル、プロ
ピル、ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ヘキシル、オクチ
ル、デシル、ドデシル、アイコサニル等を挙げることが
できる。「低級アルキル」は炭素原子１〜７個を有する
アルキル基であって、たとえばメチル、エチル、プロピ
ル、ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ヘキシル、３−メチル
ヘキシル、ヘプチル等である。「シクロアルキル」はシ
クロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロ
ヘキシル、シクロヘプチル等を意味する。

【００３５】「アシル」の語は、式ＲＣＯ−（式中、Ｒ
はＨまたは上に定義したアルキルである）で示される基
である。「低級アシル」の語は、このような基で、Ｒが
Ｈまたは低級アルキルの基を意味する。アシルの例に
は、ホルミル、アセチル、プロピオニル、ブチリル、ペ
ンタノイル、ヘキサノイル、アイコサノイル等が包含さ
れる。低級アシルの例には、ホルミル、アセチル、プロ
ピオニル、ブチリル、ペンタノイル、ヘキサノイル等が
包含される。

【００３６】本明細書に用いられる「ハロ」の語は、フ
ルオロ、クロロ、ブロモおよびヨードを意味する。「ア
ルコキシ」の語は、式ＲＯ（式中、Ｒは上に定義した低
級アルキルまたはシクロアルキルである）で示される基
である。

【００３７】「アリール」の語は、炭素原子６個〜１２
個を含有する、炭素および水素のみかなる芳香族の基で
ある。アリール基の例としては、フェニル、ナフチル等
を挙げることができる。

【００３８】「医薬的に許容される塩」の語は、所望の
薬理学的活性を有し、生物学的にもまた他の点でも望ま
しくないことがない主体化合物の酸付加塩を意味する。
これらの塩は、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸もしくは
リン酸のような無機酸、または酢酸、プロピオン酸、グ
リコール酸、ピルビン酸、マロン酸、コハク酸、リンゴ
酸、マレイン酸、フマール酸、酒石酸、クエン酸、安息
香酸、桂皮酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、エタン
スルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸等のような有機酸
から形成される。

【００３９】本明細書において用いられる「処置」の語
は、鳥類または動物、とくにヒトにおける疾患の任意を
処置に指し、 （ｉ）疾患が予測されるがまだその疾患とは診断されて
いない対象にその疾患が発症するのを予防すること （ii）疾患の阻害、すなわち進行を阻止すること （iii)疾患の緩解、すなわち疾患の退行（患者の免疫系
による抗原の認識がないため持続している疾患が、ワク
チンにより効果的に抗原を提供することで、退行する場
合をいう）

【００４０】本発明でアリール基について用いられる
「置換されていてもよい」の語は、その基が非置換であ
るか、または１個から３個までのハロ、ニトロ、低級ア
ルキルもしくは低級アルコキシ基によって置換されてい
ることを意味する。任意の置換基は同種でも異種でもよ
い。

【００４１】「ムラミルジペプチド誘導体」の語は、式
Ｉ

【化４】 （式中、Ｒ，Ｒ¹ ，Ｒ² ，Ｒ³ およびＲ⁴ はそれぞれ独
立にＨ、アルキル、アシルまたはハロ、ニトロもしくは
低級アルキルで置換されていてもよいアリールであり、
Ｘは１個または数個のアミノ酸であり、ＹはＤ−グルタ
ミン、Ｄ−イソグルタミンまたはＤ−イソアスパラギン
であって、エステル化またはアミド化されていてもよ
い）で示される化合物を包含する。式Ｉにおいて好まし
い化合物は、ＲおよびＲ¹ がＨまたは１個から２２個ま
での炭素原子を有するアシルであり、Ｒ² はメチルであ
り、Ｒ³ は水素であり、ＸはＬ−アラニル、Ｌ−α−ア
ミノブチリル、Ｌ−アルギニル、Ｌ−アスパラギル、Ｌ
−アスパルチル、Ｌ−システイニル、Ｌ−グルタミニ
ル、Ｌ−グルタミル、グリシル、Ｌ−ヒスチジル、Ｌ−
ヒドロキシプロリル、Ｌ−イソロイシル、Ｌ−ロイシ
ル、Ｌ−リジル、Ｌ−メチオニル、Ｌ−オルニチニル、
Ｌ−フェニルアラニル、Ｌ−プロリル、Ｌ−セリル、Ｌ
−スレオニル、Ｌ−チロシル、Ｌ−トリプトファニルま
たはＬ−バリルであり、ＹはＤ−グルタミンまたはＤ−
イソグルタミンである化合物である。

【００４２】とくに好ましいＭＤＰは、Ｎ−アセチルム
ラミル−Ｌ−α−アミノブチリル−Ｄ−イソグルタミ
ン、６−Ｏ−ステアロイル−Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ
−α−アミノブチリル−Ｄ−イソグルタミン、Ｎ−アセ
チルムラミル−Ｌ−スレオニル−Ｄ−イソグルタミン、
Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−バリル−Ｄ−イソグルタミ
ン、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグ
ルタミン、Ｎ−アセチル−デスメチルムラミル−Ｌ−ア
ラニル−Ｄ−イソグルタミン、Ｎ−アセチルムラミル−
Ｌ−アラニル−Ｄ−グルタミンブチルエステル（ムラブ
チド）、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−セリル−Ｄ−イソ
グルタミン、およびＮ−ブチリルムラミル−Ｌ−（α−
アミノブチリル）−Ｄ−イソグルタミンである。他の有
用なＭＤＰは、Ｎ−アセチル−（ｎ−ブチルムラミル）
−Ｌ−α−アミノブチリル−Ｄ−イソグルタミンであ
る。

【００４３】「免疫増強量」の語は、本発明の処分の抗
原を投与した場合、ＭＤＰがなかったときに認められる
抗体力価レベルに比べて、抗体力価および／または細胞
性免疫を増大させるのに必要なＭＤＰ誘導体の量をい
う。予測されるように、各ＭＤＰは、他のＭＤＰと異な
る有効用量範囲を有する。したがって、本発明の範囲内
に包含される各グリコペプチドに正確に適合する単一の
用量範囲を指示することはできない。しかしながら、免
疫増強量は本技術分野の熟練者には容易に決定できるも
のである。一般的に、グリコペプチドは０．００１〜２
％の量を存在させるのが好ましい。さらに好ましい量は
０．００５〜１％である。

【００４４】「非毒性代謝性油状物」の語は、６個から
３０個までの炭素原子を有する油状物で、アルカン、ア
ルケン、アルキン、それらの相当する酸およびアルコー
ル、そのエーテルおよびエステル、ならびにそれらの混
合物であるが、これらに限定されるものではない。油状
物は、植物油、魚油、獣油、また合成された油状物で
も、それらがアジュバントを投与した対象の体内で代謝
され、またその生体に毒性を示さないものであればよ
い。油状物が、それを投与された動物または鳥類によっ
て代謝されることは、膿瘍、肉芽腫または癌腫の生成を
回避するために必須である。ナッツ、種子および穀粒が
植物油の共通の原料である。本発明の範囲内に包含され
る合成油状物には「ネオビー」（登録商標）（Ｎｅｏｂ
ｅｅ^TM，ＰＶＯ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ， Ｉｎ
ｃ．， Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｐｅｃｉａｌｉｔｉｅｓ
Ｄｉｖｉｓｉｏｎ， ４１６ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ Ｓ
ｔｒｅｅｔ， Ｂｏｏｎｇｏｎ， Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅ
ｙから市販されている）等がある。鮫肝油は、スクアレ
ンとして知られている分岐状不飽和油、２，６，１０，
１５，１９，２３−ヘキサメチル−２，６，１０，１
４，１８，２２−テトラコサヘキセンを含有するが、こ
れは本発明にとくに好ましい。スクアレンの飽和類縁体
であるスクアランも好ましい油状物である。スクアレン
およびスクアランを包含する魚油は市販品を容易に入手
できるし、また本技術分野において公知の方法により調
製できる。

【００４５】非毒性代謝性油状物の「エマルジョン生成
量」は、テトラポリオールまたはＰＯＰ−ＰＯＥブロッ
クポリマーの存在下にエマルジョンを生成する量であ
る。これらのアジュバントおよびワクチン処方の油状物
成分は、通常、１〜３０％含有させるが、１〜１０％が
好ましい。とくに約５％濃度の油状物を使用するのが好
ましい。

【００４６】油状エマルジョン粒子のサイズについて用
いられる「実質的にすべて」の語は、粒子の７０％以上
が指示したサイズ（たとえば８００ｎｍまたは３００ｎ
ｍ）未満であること、好ましくは８０％、とくに好まし
くは９５％以上がそのサイズ未満であることを意味す
る。

【００４７】これらのアジュバント組成物の水性部分
は、緩衝、等張性食塩水であることが好ましい。これら
の組成物は非経口投与が意図されるので、組成物と生理
学的液体との間のイオン濃度の差による投与後腫脹や組
成物の急速な吸収を防止するため、これらの溶液は張度
が正常の生理学的液体とほぼ同一になるように処方する
ことが好ましい。また、ｐＨを正常の生理学的状態と適
合性に維持するため、食塩水は緩衝化することが好まし
い。また場合によっては、ある種の組成物成分たとえば
グリコペプチドの安定性を確保するために、ｐＨを特定
のレベルに保持することも必要である。この場合、任意
の生理的に許容される緩衝剤を使用することができる
が、リン酸塩緩衝液を使用することがとくに便利である
ことが明らかにされている。リン酸塩緩衝液の代わり
に、任意の他の許容される緩衝液、たとえば酢酸塩、ト
リス、重炭酸塩、炭酸塩等を使用することもできる。リ
ン酸塩緩衝食塩水またはリン酸塩と酢酸塩の混合物で緩
衝化された食塩水の使用が好ましい。

【００４８】「抗原」の語は、投与すると特定の抗体の
生成を刺激し、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏ
で特異的に対応の抗体と反応する物質、通常はタンパク
質、糖タンパク質、リポタンパク質、糖、多糖またはリ
ポ多糖を意味する。さらに、抗原は、その受容体をもつ
Ｔリンパ球の増殖を刺激し、そのリンパ球と反応して、
細胞性免疫と呼ばれる一連の応答を開始させることがで
きる。

【００４９】本明細書において用いられる「抗原」の語
は、またハプテンと担体の配合物を包含する。ハプテン
は免疫学的特異性を決定する抗原分子または抗原性複合
体の部分であるが、担体の非存在下には免疫応答を刺激
するには十分ではない。通常、ハプテンは比較的小さな
ペプチドまたは多糖であり、天然の抗原のフラグメント
であってもよい。人工抗原においては、たとえばアルサ
ニル酸誘導体のような低分子量物質であってもよい。ハ
プテンはｉｎ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｔｒｏにおい
て、対応抗体またはＴリンパ球と特異的に反応する。ハ
プテンは通常、ワクチンとして形成する前に共有結合ま
たは非共有結合によって、たとえばウシ血清アルブミン
（ＢＳＡ）またはキーホールリンペットヘモシアニン
（ＫＬＨ）のような大きな担体分子に結合させる。たと
えば、ワクチンおよびアジュバントを試験するために用
いられる人工抗原には、ＢＳＡに共有結合させた２，４
−ジニトロフェノール（ＤＮＰ）がある。本発明に使用
するのに適当な抗原には、Ｂ型肝炎（表面）抗原および
インフルエンザ（たとえばＡまたはＢ）抗原がある。Ａ
ＩＤＳおよびヘルペスに対する抗原も使用できる。

【００５０】抗原の「免疫誘導量」の語は、本発明のア
ジュバントと投与した場合、有用な免疫応答を刺激する
のに十分な抗原の量を意味する。免疫誘導量を与えるの
に必要な抗原の量は、たとえば、抗原の濃度を変えた一
連の本発明のワクチンを調製し、このワクチンを適当な
実験運動（たとえばモルモット）に投与し、血清抗体力
価、抗原誘発皮膚腫脹等を測定することによって生じた
免疫応答を検定することにより、本技術分野の通常の熟
練者によれば容易に決定することができる。

【００５１】本明細書において用いられる「テトラポリ
オール」の語は、Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−テトラ（ポリオ
キシプロピレン−ポリオキシエチレン）−１，２−ジア
ミノエタンブロックポリマーを指す。これらの化合物
は、米国特許第２，９７９，５２８号に記載の方法によ
って製造することができ、またＢＡＳＦ−Ｗｙａｎｄｏ
ｔｔｅから商品名Ｔｅｔｒｏｎｉｃ^TMの市販品を入手す
ることができる。

【００５２】Ｔｅｔｒｏｎｉｃ^TMポリオールは、ポリオ
キシプロピレン（ＰＯＰ）部分の平均分子量と分子のポ
リオキシエチレン（ＰＯＥ）部分の総分子量に占める百
分率を示す３個または４個の数字で命名される。最初の
１個または２個の０ではない数字はＰＯＰ部分の平均分
子量を示し、Ｔｅｔｒｏｎｉｃ^TM３０４の場合の５０１
〜１０００からＴｅｔｒｏｎｉｃ^TM１５０１の場合の６
５００〜７０００までの範囲がある。最後の数字はＰＯ
Ｅの百分率を１０％上昇ごとに示していて、Ｔｅｔｒｏ
ｎｉｃ^TM１５０１の１０％からＴｅｔｒｏｎｉｃ^TM１５
０８の８０％までの範囲がある。

【００５３】これらの化合物の特性は、ＰＯＰ部分の分
子量と生成物中のＰＯＥ量によって決定される。本発明
の実施にあたり好ましいテトラポリオールは２５℃で水
に比較的不溶で、低ＨＬＢ値を有する。ＴＬＢ値は好ま
しくは約５．０未満とすべきである。現時点で好ましい
テトラポリオールはＴｅｔｒｏｎｉｃ^TM１５０１、Ｔｅ
ｔｒｏｎｉｃ^TM１３０１、Ｔｅｔｒｏｎｉｃ^TM１１０１
およびＴｅｔｒｏｎｉｃ^TM１５０２であり、さらにＴｅ
ｔｒｏｎｉｃ^TM１５０１およびＴｅｔｒｏｎｉｃ^TM１３
０１が、とくにＴｅｔｒｏｎｉｃ^TM１５０１が好まし
い。必要な性質をもつ他の適当なテトラポリオールは米
国特許第２，９７９，５２８号に記載された方法を用い
て製造でき、これらは本発明の範囲内の均等物と考えら
れるものである。たとえば、ＰＯＰ分子量８，０００、
ＰＯＥ含量８％のテトラポリオールが製造できる。必要
な性質は（ｉ）低ＨＬＢ値（≦５．０、好ましくは≦
２．０）、（ii) 水にほとんどまたは全く溶解しない、
（iii)グリコールエーテル−ベース界面活性剤の添加に
より安定なエマルジョンを生成する、（iv) 毒性がな
い、である。

【００５４】「ＰＯＰ−ＰＯＥブロックポリマー」の語
は、低分子量の反応性化合物、通常はプロピレングリコ
ールに、プロピレンオキシサイド、ついでエチレンオキ
サイドを順次添加して製造されるポリマーを指す。これ
らのブロックポリマーは米国特許第２，６７４，６１９
号（Ｌｕｎｓｔｅｄ）に記載された方法によって製造す
ることができ、ＢＡＳＦ−ＷｙａｎｄｏｔｔｅからＰｌ
ｕｒｏｎｉｃ^TMの登録商標名で市販されている。これら
のポリマーの性質はＰＯＰ核の分子量と製品中のＰＯＥ
百分率によって決定される。ＰＯＰ部分はブロックポリ
マーに疎水性特性を付与し、ＰＯＥ部分は親水性特性を
付与する。好ましいブロックポリマーは適当なテトラポ
リオールを選択するために用いられたのと同じ基準によ
って決定される。本発明の実施に好ましいブロックポリ
マーはＰｌｕｒｏｎｉｃ^TMＬ１２１およびＬ１０１であ
る。

【００５５】Ｐｌｕｒｏｎｉｃ^TMポリオールは、前置さ
れる文字とそれに続く２または３個の数字によって命名
される。前置される文字（Ｌ、ＰまたはＦ）は各ポリマ
ーの物理的状態（液体、ペーストまたはフレーク状固
体）を示す。最初の１個または２個の数字はＰＯＰベー
スの平均分子量であり、最後の数字はＰＯＥの量を示
す。たとえば、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ^TMＬ１０１はポリオキ
シプロピレンベースの平均分子量３，２５０、分子の末
端に１０％のポリオキシエチレンが存在する液体であ
る。好ましいブロックポリマーは約１５°〜４０℃の間
の温度範囲で液体のポリマーである。さらに、液体とペ
ースト、液体、ペーストとフレーク状固体、または液体
とフレーク状固体の混合物で、特定の温度範囲において
液体のポリマー混合物も本発明に有用である。

【００５６】好ましいブロックポリマーは、分子量約
２，２５０〜４，３００の範囲のＰＯＰベースを有し、
ＰＯＥ量が１〜３０％のポリマーである。さらに好まし
いポリマーは、ＰＯＰの分子量が３，２５０〜４，００
０でＰＯＥ成分が１０〜２０％のポリマーである。Ｐｌ
ｕｒｏｎｉｃ^TMポリオールＬ１０１、Ｌ１２１およびＬ
１２２はこの定義内に含まれる。最も好ましいポリマー
は、ＰＯＰの分子量が４，０００、ＰＯＥ量が１０％、
またはＰＯＰの分子量が３，２５０、ＰＯＥ量が１０％
ポリマー、たとえば、それぞれＰｌｕｒｏｎｉｃ^TMポリ
オールＬ１２１およびＬ１０１である。

【００５７】テトラポリオールまたはＰＯＰ−ＰＯＥブ
ロックポリマーの「エマルジョン生成量」とは、ミセル
またはエマルジョンを生成する量である。本発明の目的
においては、この量は０．２〜４９容量％である。さら
に好ましい量は０．２〜２０％であり、約１〜５％がも
っと好ましい。現時点で最も好ましい濃度は１〜２．５
％である。

【００５８】「界面活性剤」の語は、エマルジョンを安
定化できる非毒性界面活性剤である。製薬科学において
一般的に使用できる乳化剤および懸濁剤は多数ある。こ
れらには、天然由来の物質、たとえばゴム、植物性タン
パク質、アルギン酸塩、セルロース誘導体、リン脂質
（天然または合成）等が包含される。ポリマー骨格に親
水性置換基を有するある種のポリマー、たとえばポビド
ン、ポリビニルアルコール、およびグリコールエーテル
ベース化合物は界面活性作用を有する。長鎖脂肪酸から
誘導される化合物は、本発明に使用できる乳化剤および
懸濁剤の第三の群である。上述の任意の界面活性剤が非
毒性である限り使用できるが、グリコールエーテルベー
ス界面活性剤が好ましい。

【００５９】好ましい界面活性剤は非イオン性である。
これらには、ポリエチレングリコール（とくにＰＥＧ２
００、３００、４００、６００および９００）、Ｓｐａ
ｎ^TM、Ａｒｌａｃｅｌ^TM、Ｔｗｅｅｎ^TM、Ｍｙｒｊ^TM、
Ｂｒｉｊ^TM、（これらはすべて登録商標であり、ＩＣ
Ｉ，Ａｍｅｒｉｃａ’ｓ Ｉｎｃ．，Ｗｉｌｍｉｎｇｔ
ｏｎ，Ｄｅｌａｗａｒｅから市販されている）、ポリオ
キシエチレン、ポリオーネ脂肪酸エーテル、ポリオキシ
エチレン含有密蝋誘導体、ポリオキシエチレンラノリン
誘導体、ポリオキシエチレン脂肪グリセリド、グリセロ
ール脂肪酸エステル、または１２〜２１個の炭素原子の
長鎖脂肪酸の他のポリオキシエチレン酸アルコールもし
くはエーテル誘導体が包含される。現時点で好ましい界
面活性剤はＴｗｅｅｎ^TM８０（別名、ポリソルベート８
０またはポリオキシエチレン２０ソルビタンモノオレエ
ートとしても知られる）であるが、上述の任意の界面活
性剤が毒性を欠くことが明らかである限り適しているこ
とを理解すべきである。

【００６０】「グリコールエーテルベース界面活性剤の
エマルジョン安定化量」は、通常、界面活性剤０．０５
〜５％量を存在させることによって達成される。０．２
％〜１％の量が好ましい。

【００６１】製法 本発明のアジュバントの成分は市販原料から得ることも
できるし、また本技術分野の通常の熟練者によれば製造
することも可能である。テトラポリーオールは米国特許
第２，９７９，５２８号に記載の方法によって製造でき
るし、またＢＡＳＦ−ｗｙａｎｄｏｔｔｅからのＴｅｔ
ｒｏｎｉｃ^TMの商品名での市販品を入手することもでき
る。ＰＯＰ−ＰＯＥブロックポリマーは、米国特許第
２，６７４，６１９号（Ｌｕｎｓｔｅｄ）に記載された
方法によって製造でき、またＢＡＳＦ−Ｗｙａｎｄｏｔ
ｔｅからのＰｌｕｒｏｎｉｃ^TMの商品名での市販品を入
手することもできる。

【００６２】グリコールエーテルベース界面活性剤、Ｐ
ＥＧ２００、３００、４００、６００および９００、Ｓ
ｐａｎ^TM、Ａｒｌａｃｅｌ^TM、Ｔｗｅｅｎ^TM、Ｍｙｒｊ
^TM、Ｂｒｉｊ^TM等はＩＣＩ，Ａｍｅｒｉｃａ’ｓ Ｉｎ
ｃ．，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，Ｄｅｌａｗａｒｅ等から
市販品を容易に入手できる。

【００６３】非毒性代謝性油状物は様々な原料から入手
できる。たとえば、スクアランおよびスクアレンはＡｌ
ｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．から入手可能で
ある。ＭＤＰは、たとえばＳｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａ
ｌ Ｃｏ．のようなメーカーからの市販品を入手できる
し、また、Ａｕｄｉｂｅｒｔ ら：米国特許第４，１５
８，０５２号、Ａｕｄｉｂｅｒｔ ら：米国特許第４，
２２０，６３７号、Ａｕｄｉｂｅｒｔ ら：米国特許第
４，３２３，５５９号、Ｂａｓｃｈａｎｇ ら：米国特
許第４，３２３，５６０号、Ｂａｓｃｈａｎｇ ら：米
国特許第４，４０９，２０９号、Ｂａｓｃｈａｎｇ
ら：米国特許第４，４２３，０３８号、Ｄｅｒｒｉｅｎ
ら：米国特許第４，１８５，０８９号、Ｈａｒｔｍ
ａｎｎ ら：米国特許第４，４０６，８８９号、Ｊｏｎ
ｅｓ ら：米国特許第４，０８２，７３５号、Ｊ
ｏｎｅｓ ら：米国特許第４，０８２，７３６
号、Ｌｅ Ｆｒａｎｃｉｅｒら：米国特許第４，４２
７，６５９号、Ｌｅ Ｆｒａｎｃｉｅｒら：米国特許第
４，４６１，７６１号、Ｙａｍａｍｕｒａ ら：米国
特許第４，３１４，９９８号、Ｙａｍａｍｕｒａ
ら：米国特許第４，１０１，５３６号、およびＹａｍａ
ｍｕｒａら：米国特許第４，３６９，１７８号に開示さ
れている方法に従って製造できる。これらの記載はすべ
て参考として本明細書に導入する。

【００６４】アジュバントは、ミキサーを用い、乳化に
よって製造される。アジュバントがテトラポリオールを
用いて実験室的規模で、直ちに使用するために製造され
る場合には、単に手で混合してもよい。たとえば、Ｔｗ
ｅｅｎ^TM８０および緩衝食塩水を、試験管中のスクアラ
ンとＴｅｔｒｏｎｉｃ^TM１５０１に２×濃度で添加し、
配合物をボルテックスミキサーを用いて混合し、エマル
ジョンを生成させる。これに抗原とＭＤＰの緩衝食塩水
中２×溶液を加えて、完成ワクチンを形成させる。高速
剪断ミキサーたとえばＧｒｅｅｃｏホモジナイザーミキ
サーを用いることがさらに好ましく、より滑らかで均一
なエマルジョンが生成する。

【００６５】好ましくは、アジュバントエマルジョン
は、テトラポリオールを用いた場合もＰＯＰ−ＰＯＥブ
ロックポリマーを用いた場合も、抗原の添加前に「微小
流動化」する。これは、きわめて高速の剪断ミキサー、
たとえばマイクロフルイダイザー（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉ
ｄａｉｚｅｒ^TM，Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ Ｃｏｒ
ｐ．，Ｎｅｗｔｏｎ，ＭＡから市販されている）を用い
て達成される。Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄａｉｚｅｒ^TMで
は、通常、１００〜５００ｍｌバッチのエマルジョンが
調製される。エマルジョンは、エマルジョン粒子サイズ
が所望のレベル、好ましくは直径８００ｎｍ未満、さら
に好ましくは約３００ｎｍ未満、とくに好ましくは約２
００ｎｍ未満に達するまで約２〜１０回、Ｍｉｃｒｏｆ
ｌｕｉｄａｉｚｅｒ^TMを循環させる。

【００６６】Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄａｉｚｅｒ^TMは剪断
力、攪乱力および空洞化力を合わせもち、２つの流動化
流が相互作用室内で高速度で相互作用して、均一な小エ
マルジョン粒子を生成させる。Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄａ
ｉｚｅｒ^TM以外の装置でも満足できるエマルジョンを製
造することが可能で、十分な安定性と十分に小さな粒子
サイズを生成できる任意のデバイスの使用も本方法の範
囲内であることを理解すべきである。通常、ＭＤＰは乳
化工程後に添加される。ＭＤＰおよび抗原の添加前にエ
マルジョンを保存する場合は、保存は冷蔵および／また
は窒素気相下に行われる。

【００６７】生成したエマルジョンは本技術分野でよく
知られている様々な方法で検定できる。エマルジョンの
安定性は、エマルジョンを室温および冷蔵下に放置し、
ついで相への分離を観察することによって測定する。こ
の検定は、エマルジョンをたとえば４５００ｇで２時間
遠心分離することによって加速できる。

【００６８】粒子サイズは、たとえば光学顕微鏡、遷移
電子顕微鏡、およびレーザー光散乱技術、好ましくはレ
ーザー光量子相関スペクトロスコピー（ＰＣＳ）によっ
て決定できる。ＰＣＳ解析はたとえばＮｉｃｏｍｐ２０
０型レーザー粒子サイザーとＴＣ−１００型コンピュー
ターオートコリレーターを用いて実施できる。

【００６９】生物学的活性は、標準実験室的方法、たと
えば試験アジュバント処方を用いて標準抗原（たとえば
ＢＳＡまたＤＮＰ−ＢＳＡ）で標準実験動物（たとえば
モルモット）に予防接種を行う方法によって検定でき
る。追加免疫の期間および免疫感作を生じる期間が経過
後、動物に標準抗原を投与して、結果を測定する。応答
は、免疫応答の測定技術として容認されている任意の測
定法、たとえば標準抗原に対する血清抗体力価（体液性
免疫）または皮膚試験反応（細胞性免疫）によって定量
化する。

【００７０】投与 一定の効果を生じるのに必要なＭＤＰ誘導体および抗原
の正確な量が、特定の化合物および抗原、処置対象の体
重、年齢および状態によって変動することは、本技術分
野の通常の熟練者には自明のとおりでる。したがって、
必要量を正確を述べることは不可能であるが、この量は
本技術分野の通常の熟練者には公知の方法を用いて容易
に決定することができる。

【００７１】本発明のアジュバントおよびワクチンは一
般には注射によって、とくに筋肉内注射によって、好ま
しくは大きな筋肉に投与される。一般に、最初の予防接
種は、所望の抗原と本発明の処方を用いて行われる。ワ
クチンのブースター投与は数週後（通常２〜６週後、た
とえば４〜６週後）にＭＤＰ成分を含有するまたは含有
しない（好ましくは含有する）本発明のワクチンを用い
て行う。本発明の実施に際しては、一般にワクチン（以
下の例に記載するような）１〜２ｍｌをヒト対象に投与
する。

【００７２】

【実施例】以下の実施例は本技術分野の通常の熟練者に
対する参考のために示すものであって、いかなる意味に
おいても本発明を限定するものではない。

【００７３】例 １（免疫原性） （Ａ） 処方の製造 アジュバント処方は生物学的活性の検定のために次のよ
うに製造した。各エマルジョンは抗原の２×溶液と配合
する前に２×濃度に調製した。処方１ （Ａｌｌｉｓｏｎ，米国特許第４，６０６，９１
８号より）：５．０％Ｐｌｕｒｏｎｉｃ^TMＬ１２１、１
０％スクアラン、０．４％Ｔｗｅｅｎ^TM８０、リン酸緩
衝食塩水（ｐＨ７．４）、所要量；成分を試験管に取
り、ミルク状のエマルジョンが得られるまで、ボルテッ
クスミキサーで混合した。この処方は投与の直前に調製
した。

【００７４】処方２（処方１を冷蔵）：５．０％Ｐｌｕ
ｒｏｎｉｃ^TMＬ１２１、１０％スクアラン、０．４％Ｔ
ｗｅｅｎ^TM８０、リン酸緩衝食塩水（ｐＨ７．４）、所
要量；成分を試験管に取り、ミルク状のエマルジョンが
得られるまでボルテックスミキサーで混合した。この処
方は投与の１日前から冷蔵した。

【００７５】処方３（本発明のテトラポリオール処
方）：５．０％Ｔｅｔｒｏｎｉｃ^TM１５０１、１０％ス
クアラン、０．４％Ｔｗｅｅｎ^TM８０、リン酸緩衝食塩
水（ｐＨ７．４）、所要量；成分を試験管に取り、ミル
ク状のエマルジョンが得られるまでボルテックスミキサ
ーで混合した。

【００７６】処方４（本発明の微細流動化ＰＯＰ−ＰＯ
Ｅアジュバント）：５．０％Ｐｌｕｒｏｎｉｃ^TMＬ１２
１、１０％スクアラン、０．４％Ｔｗｅｅｎ^TM８０、リ
ン酸緩衝食塩水（ｐＨ７．４）、所要量；成分を試験管
に取り、ミルク状のエマルジョンが得られるまでボルテ
ックスミキサーで混合した。ついでこのエマルジョンを
Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄａｉｚｅｒ^TMに４回通した。この
処方は、処方２とともに冷蔵した。

【００７７】次に、各処方に固体Ｎ−アセチルムラミル
−Ｌ−スレオニル−Ｄ−イソグルタミン（Ｔｈｒ−ＭＤ
Ｐ）を５００μｇ／ｍｌ濃度になるように加えて、完全
アジュバント濃厚液を生成させた。この濃厚液を次に２
×濃度の抗原溶液（食塩水中オバルブミン、１ｍｇ／ｍ
ｌ）と混合し、試験ワクチンを製造した。

【００７８】（Ｂ） 生物活性 各試験ワクチン（０．２ｍｌ）を雌性モルモットに投与
した。投与４週後に、各動物に同じ試験ワクチン（ただ
しＴｈｒ−ＭＤＰを含まない）をブースター投与した。
最初の投与から４週間後および６週後に採取した血清サ
ンプルの抗体力価を測定した。６週後、各動物にオバル
ブミンを皮内投与し、紅斑の直径および浸潤の評点を２
４時間後に判定し、細胞性免疫の指標とした。

【００７９】結果を第１表および第２表に示す。各値
は、８匹の動物から得られた平均値である。抗体力価は
赤血球凝集によって測定した。浸潤は肉眼的に１〜３の
評価尺度で判定した（１は皮膚試験部位における弱い応
答、３はきわめて明瞭な腫脹である）。

【表１】

【００８０】

【表２】 結果は、テトラポリオールアジュバントが抗原の免疫原
性の増強に有意に有効であること、また微細流動化ＰＯ
Ｐ−ＰＯＥブロックポリマーアジュバントは少なくとも
対照処方と同等に有効で、優れた保存安定性を有するこ
とを示している。

【００８１】例 ２（物理的性質） 例１（Ａ）において製造した処方について物理的性質を
調べた。 （Ａ） 分離：各処方（１〜４）を４５００×Ｇで３０
分間遠心分離し、ついで放置して層に分離させた。生じ
た分離量を、全体に対する上層を占める容量の百分率で
記録し、評価した。処方１〜３では約１０％が分離し、
処方４での分離は約１％未満であった。

【００８２】（Ｂ） 粒子サイズ：粒子サイズの分布
は、光学顕微鏡（Ｌｅｉｔｚ Ｏｒｔｈｏｌｕｘ II
ＰＯＬ−ＢＫ偏光顕微鏡）、遷移電子顕微鏡（ＴＥＮ、
Ｈｉｔａｃｈｉ ＨＳ ８−１型使用）およびレーザー
光子相関分光系（ＰＣＳ、Ｎｉｃｏｍｐ２００型レーザ
ー粒子サイザーとＴＣ１００コンピューター自動相関
器）で解析した。粒子サイズ分布は最上層と最下層で測
定した。ＴＥＭおよびＰＣＳで解析したサンプルは解析
前に１：１００またはそれ以上に希釈した。結果は処方
１〜３で、粒子サイズ＜０．１μｍ〜約２５μｍ、処方
４で＜０．１μｍ〜約０．３μｍ（３００μｍ）の範囲
であった。

【００８３】例 ３（処方） アジュバント処方例を次のように調製した。 （Ａ） Ｔｅｔｒｏｎｉｃ^TM／Ｔｈｒ−ＭＤＰ： Ｔｅｔｒｏｎｉｃ^TM１５０１ ２．５ｇ スクアラン ５．０ｇ Ｔｗｅｅｎ^TM８０ ０．２ｇ Ｔｈｒ−ＭＤＰ ２５０．０ｍｇ リン酸緩衝食塩水 全容１００．０ｍｌとする Ｔｅｔｒｏｎｉｃ^TM１５０１、スクアランおよびＴｗｅ
ｅｎ^TM８０にリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）８５ｍｌとと
もに適当な容器に取り、機械ミキサー（Ｇｒｅｅｒｃｏ
Ｈｏｍｏｇｅｎｉｚｅｒ−Ｍｉｘｅｒ， ^#ＩＬ−７９
型、Ｇｒｅｅｒｃｏ Ｃｏｒｐ．，Ｈｕｄｓｏｎ，Ｎｅ
ｗ Ｈａｍｐｓｈｉｒｅ）により約４７５０ｒｐｍで約
３０〜６０分間混合する。ついでＴｈｒ−ＭＤＰ（Ｎ−
アセチルムラミル−Ｌ−スレオニル−Ｄ−イソグルタミ
ン）と残りのＰＢＳ １５ｍｌを撹拌下に加え、本発明
のアジュバント処方を得る。

【００８４】（Ｂ） 同様に、上述の（Ａ）と同じく処
理するが、Ｔｈｒ−ＭＤＰの代わりにＮ−アセチルムラ
ミル−Ｌ−α−アミノブチリル−Ｄ−イソグルタミン
（Ａｂｕ−ＭＤＰ）、６−Ｏ−ステアロイル−Ｎ−アセ
チルムラミル−Ｌ−α−アミノブチリル−Ｄ−イソグル
タミン（Ａｂｕ−ＭＤＰステアレート）、Ｎ−アセチル
ムラミル−Ｌ−バリル−Ｄ−イソグルタミン（Ｖａｌ−
ＭＤＰ）、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−
イソグルタミン（ＭＤＰ）、Ｎ−アセチルデスメチルム
ラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ｄｅｓＭ
ｅ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−
Ｄ−グルタミンブチルエステル（ムラブチド）、ｎ−ブ
チリルムラミル−Ｌ−（α−アミノブチリル）−Ｄ−イ
ソグルタミン、およびＮ−アセチルムラミル−Ｌ−セリ
ル−Ｄ−イソグルタミン（Ｓｅｒ−ＭＤＰ）を用いて相
当するアジュバント処方を調製する。

【００８５】（Ｃ） Ｐｌｕｒｏｎｉｃ^TM／Ｔｈｒ−Ｍ
ＤＰ Ｐｌｕｒｏｎｉｃ^TMＬ１２１ ２．５ｇ スクアラン ５．０ｇ Ｔｗｅｅｎ^TM８０ ０．２ｇ Ｔｈｒ−ＭＤＰ ２５０．０ｍｇ リン酸緩衝食塩水 全容１００．０ｍｌとする Ｐｌｕｒｏｎｉｃ^TMＬ１２１、スクアランおよびＴｗｅ
ｅｎ^TM８０にリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）８５ｍｌとと
もに適当な容器に取り、機械的ミキサー（たとえばＧｒ
ｅｅｒｃｏ Ｈｏｍｏｇｅｎｉｚｅｒ−Ｍｉｘｅｒ）に
より約４，７５０ｒｐｍで約５〜１０分間混合する。つ
いでＴｈｒ−ＭＤＰ（Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−スレ
オニル−Ｄ−イソグルタミン）と残りのＰＢＳ １５ｍ
ｌを撹拌下に加える。次に得られたエマルジョンをＭｉ
ｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｒ^TM（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉ
ｃｓ Ｃｏｒｐ．）を通して少なくとも４回処理して、
本発明のアジュバント処方を得る。また、ＭＤＰは微細
流動化工程後に添加してもよい。

【００８６】（Ｄ） 同様に、上述の（Ｃ）と同じく処
理するが、Ｔｈｒ−ＭＤＰの代わりにＮ−アセチルムラ
ミル−Ｌ−α−アミノブチリル−Ｄ−イソグルタミン
（Ａｂｕ−ＭＤＰ）、６−Ｏ−ステアロイル−Ｎ−アセ
チルムラミル−Ｌ−α−アミノブチリル−Ｄ−イソグル
タミン（Ａｂｕ−ＭＤＰステアレート）、Ｎ−アセチル
ムラミル−Ｌ−バリル−Ｄ−イソグルタミン（Ｖａｌ−
ＭＤＰ）、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−
イソグルタミン（ＭＤＰ）、Ｎ−アセチルデスメチルム
ラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ｄｅｓＭ
ｅ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−
Ｄ−グルタミンブチルエステル（ムラブチド）、Ｎ−ブ
チリルムラミル−Ｌ−（α−アミノブチリル）−Ｄ−イ
ソグルタミン、およびＮ−アセチルムラミル−Ｌ−セリ
ル−Ｄ−イソグルタミン（Ｓｅｒ−ＭＤＰ）を用いて相
当するアジュバント処方を調製する。

【００８７】（Ｅ） 同様に、上述のＡおよびＢで製造
したアジュバント処方を、ＣおよびＤに記載した微細流
動化によってさらに改良し、相当する微細流動化Ｔｅｔ
ｒｏｎｉｃ^TM処方を調製する。

【００８８】（Ｆ） Ｔｅｔｒｏｎｉｃ^TM／ムラブチド Ｔｅｔｒｏｎｉｃ^TM１５０１ ２．０ｇ スクアラン ６．０ｇ Ｂｒｉｊ^TM８０ ０．３ｇ ムラブチド ３００．０ｍｇ リン酸緩衝食塩水 全量１００．０ｍｌとする この処方は上述のＡおよびＥに記載したようにして調製
する。

【００８９】（Ｇ） 同様に、上記Ａ〜Ｆに記載したよ
うに操作するが、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ ^TMＬ１２１またはＴ
ｅｔｒｏｎｉｃ^TM１５０１の代わりにＰｌｕｒｏｎｉｃ
^TMＬ１０１またはＴｅｔｒｏｎｉｃ^TM１３０１を用い
て、相当するアジュバントを調製する。

【００９０】（Ｈ） Ｐｌｕｒｏｎｉｃ^TM／Ｓｅｒ−Ｍ
ＤＰ濃厚液 Ｐｌｕｒｏｎｉｃ^TMＬ１２１ ２．５ｇ スクアラン ５．０ｇ Ｔｗｅｅｎ^TM８０ ０．２ｇ Ｓｅｒ−ＭＤＰ ２５０．０ｍｇ リン酸緩衝食塩水 全量１００．０ｍｌとする Ｐｌｕｒｏｎｉｃ^TMＬ１２１、スクアラン、およびＴｗ
ｅｅｎ^TM８０をＰＢＳ（全量５０ｍｌとする）とともに
適当な容器に取り、機械的ミキサー（Ｇｒｅｅｒｃｏ
Ｈｏｍｏｇｅｎｉｚｅｒ−Ｍｉｘｅｒ）により約４７５
０ｒｐｍで約５〜１０分間混合する。生成したエマルジ
ョンをついでＭｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｒ^TMに４〜１
０回通して処理し、エマルジョン濃厚液を得る。Ｓｅｒ
−ＭＤＰおよび残りのＰＢＳは第二の成分として提供
し、用時調製用アジュバントの２成分キットを製造す
る。使用に際しては、所望量の抗原をＳｅｒ−ＭＤＰ溶
液に加え、生じた溶液をエマルジョン成分と激しく混合
する。

【００９１】（Ｉ） 同様に、上記Ａ〜Ｇに記載した成
分を用いて上記Ｈのように操作し、相当するアジュバン
トキットを調製する。

【００９２】（Ｊ） ワクチン：本発明のワクチンは上
述の処方のいずれかに適当量の抗原を添加することによ
り調製する。適当な抗原には、Ｂ型肝炎、インフルエン
ザ（たとえばＡまたはＢ）、ＡＩＤＳおよびヘルペスの
抗原が包含される。ワクチンには所望により、２種以上
の抗原を含有させることもできる。たとえば、ジフテリ
ア、百日咳および結核の抗原を単一の処方で同時投与す
ることができる。

【００９３】製造を容易にするために、使用するＰＢＳ
の小部分をアジュバントの調製に使わないで残してお
き、たとえば上述のアジュバントを１００ｍｌでなく９
０ｍｌを用いて調製し、残したＰＢＳは抗原の溶解また
は懸濁に使ってもよい。抗原／ＰＢＳ溶液をついで（わ
ずかに）濃いエマルジョンと混合し、最終のワクチンを
調製する。また、さらに好ましくは、２倍の濃度のアジ
ュバントエマルジョン（ＭＤＰを含まない）を２倍の濃
度の抗原／ＭＤＰ溶液と混合する。

【００９４】例 ４（新たに調製したエマルジョンと凍
結エマルジョンの比較） １０％ｖ／ｖスクアラン、５％ｖ／ｖ Ｐｌｕｒｏｎｉ
ｃ^TMＬ１２１および０．４％ポリソルベート８０をリン
酸緩衝食塩水中に含有する２倍濃度の微細流動化エマル
ジョンを、処方４（例１）のように調製して試験に用い
た。一方のエマルジョンは使用まで７日間凍結保存し、
他方は新たに調製して室温に保存した。ワクチンを調製
した日に、新鮮なまたは解凍したエマルジョンにＴｈｒ
−ＭＤＰを添加した。８匹の雌性モルモットからなる群
を免疫処置にワクチンを使用する直前に、２ロットのエ
マルジョンに等容の２倍濃度のオバルブミンを加えた。
ワクチン構成成分の最終濃度は、リン酸緩衝食塩水９
２．３３％、スクアラン５％、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ^TMＬ１
２１、２．５％、ポリソルベート８０、０．１７％、Ｔ
ｈｒ−ＭＤＰ２５０μｇ／ｍｌ、オバルブミン１．０ｍ
ｇ／ｍｌであった。

【００９５】第０日および第２８日にモルモットにそれ
ぞれワクチン０．２ｍｌを接種し、第２８日および第４
２日に採血を行い、第４２日にオバルブミン１０μｇで
皮膚試験を実施した。

【００９６】得られた結果は以下に示すように、凍結材
料の効果は新たに調製したエマルジョンの場と同等であ
ることを示している。

【表３】 ^a力価は、検定条件で光学密度の読みが０．５吸収単位
なるような血清の希釈度の逆数のｌｏｇ₃ で示す。^b平
均血清希釈度の逆数で示した力価

【００９７】

【表４】 ^a応答を示さず、皮膚試験を実施しなかった動物１匹が
含まれている

【００９８】例 ５（肝炎ウイルスワクチン） Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原（ＨＢｓＡｇ）０．５μｇま
たは０．１μｇを微細流動化アジュバント（例１処方４
に従って調製、冷蔵しない）に取るかまたはａｌｕｍ
（市販されている肝炎ワクチン）に吸着させたワクチン
を各群８匹の雌性ハートレーモルモットに皮下接種し
た。食塩水中ＨＢｓＡｇおよびａｌｕｍに吸着されたＨ
ＢｓＡｇはＭｅｒｃｋ Ｓｈａｒｐ ａｎｄ Ｄｏｈｍ
ｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから
提供された。アジュバントプレパレーションは９２．３
３％ＰＢＳ、５％スクアラン、２．５％Ｐｌｕｒｏｎｉ
ｃ Ｌ１２１、０．１７％ポリソルベート８０、１００
μｇ／ｍｌ Ｔｈｒ−ＭＤＰおよび１．０μｇ／ｍｌま
たは０．２μｇ／ｍｌ ＨＢｓＡｇからなる。各動物に
は第０日および第４週にワクチン０．５ｍｌを投与し
た。第４，６および１５週に採血を行った。抗体力価は
ＥＬＩＳＡ法によって測定した。本発明のワクチンの方
がはるかに優れていた。

【００９９】

【表５】

【０１００】例 ６（インフルエンザウイルスワクチ
ン） 材料および方法 ６〜７週齢の雌性ＢＡＬＢ／ｃＪマウス１０〜１１匹を
１群とし、１９８７〜１９８８インフルエンザ季節に製
造された３価ワクチンを皮下に接種した。使用されたイ
ンフルエンザウイルスは、Ａ／Ｔａｉｗａｎ，Ａ／Ｌｅ
ｎｉｎｇｒａｄおよびＢ／Ａｎｎ Ａｒｂｏｒであっ
た。抗原濃度は赤血球凝集素（ＨＡ）のμｇ数で示す。
ワクチンは、本発明の微細流動化アジュバント〔２．５
％Ｐｌｕｒｏｎｉｃ^TMＬ１２１、５．０％スクアラン、
０．１７％ポリソルベート８０、５００μｇ／ｍｌ Ｔ
ｈｒ−ＭＤＰ、（０．１μｇ／ｍｌインフルエンザ）９
２．３３％ＰＢＳを含有し、例１の処方４のように調製
された。冷蔵していない〕０．１ｍｌ中に各株のＨＡ
０．０１μｇがマウスに投与されるように希釈した。１
群のマウスにはインフルエンザ抗原を含まないアジュバ
ント（Ｔｈｒ−ＭＤＰを含む）を投与した。各群のマウ
スは次にように予防接種された。 １）対照−アジュバントのみ ２）アジュバント中各株０．０１μｇ ３）アジュバント中各株０．０１μｇ

【０１０１】第１群および第２群は０および３週に予防
接種を行い、第３群は０週にのみ予防接種を実施した。
各マウスから、逆眼窩叢を介してエーテル麻酔下、３，
５および９週に５０μｌの血液を採取した。血清は群ご
とにプールした。１３週目にエーテル麻酔下にマウスを
放血させ、血清は個々におよびプールして保存した。

【０１０２】以下の表には１３週の全群からの血清につ
いて測定した平均力価を示す。０．０１μｇの用量レベ
ルでは、１回接種群と２回接種群の間で、抗−Ａ／Ｔａ
ｉｗａｎまたは抗−Ａ／Ｌｅｎｉｎｇｒａｄの力価につ
いて有意差は認められなった。しかしながら、１回接種
群で誘導された抗−Ｂ／Ａｎｎ Ａｒｂｏｒの力価は２
回接種群に比して有意に低かった（群２と３の比較）。

【０１０３】

【表６】 ^a力価は光学密度０．５吸収単位を与える血清希釈度の
逆数のｌｏｇ₃ である^b 試験した最低希釈は１／２７すなわち１／３³ であっ
た^c ２匹の血清は力価３．１および３．２を示し、一方残
りのＢ血清では抗体は検出されなかった

【０１０４】例 ７ 例４のオバルブミンワクチンを、Ｔｗｅｅｎ^TM８０を含
めないほかは、例１の処方４と同様にして調製した。

【０１０５】例 ８ 例４のオバルブミンワクチンを、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ^TMＬ
１２１を１．２５％しか含有させなかったほかは、例１
の処方４と同様にして調製した。

【０１０６】例 ９（他のワクチン） 例４のオバルブミンワクチンを、オバルブミンの代わり
に以下の抗原を用いるほかは、例１の処方４と同様に操
作してワクチンを調製した。

【０１０７】ＨＩＶ（ヒト免疫不全症ウイルス） プラスモジウム・イエリー（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｙ
ｏｅｌｌｉ）ペプチド インフルエンザウイルス（ＡおよびＢ型） アデノウイルス 単純ヘルペスウイルス１型糖タンパク室ｇＤ１ 黒色腫抗原（マウスおよびヒト） 口蹄疫ウイルス Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原 Ａ型肝炎ウイルス パラインフルエンザ３糖タンパク質 ＳＩＶ（シミアン免疫不全症ウイルス） ジストママンソニセルカリア 葉酸ヒドラーゼ ポリオウイルス マウスイデイオタイプ抗体 細菌性トキソイド ヒト腫瘍関連抗原 シミアンレトロウイルス（１および２型ペプチド） Ｄ型シトロウイルス パラサイト抗原 ＬＨＲＨ マウスＩｇＧペプチド ウシ流産菌タンパク質 ＨＩＶタンパク質 線維芽細胞成長因子（αおよびβ） ＩＬ−６ 単純ヘルペスウイルス２型初期遺伝子２２ ネコ白血病ウイルス （ワクチン中のＭＤＰ重量は試験する動物種によってわ
ずかながら変動させた。一部の場合、エマルジョンは抗
原およびＭＤＰ添加前に冷蔵されていない）

【０１０８】例１０ ２．５％Ｔｅｔｒｏｎｉｃ １５０１ ５％スクアラン ０．２％Ｔｗｅｅｎ ８０ リン酸緩衝食塩水所要量 ２５０μｇ／ｍｌ Ｔｈｒ−ＭＤＰ オバルブミン からなる微細流動化アジュバント中のオバルブミンワク
チンを例１の処方４と同様にして調製した（冷蔵しな
い）。

【０１０９】体重３５０〜４００ｇの雌性Ｓｉｍ：（Ｈ
Ａ）モルモット８匹の群を使用した。動物の頂部の皮下
に、上記処方０．２ｍｌを注射した。各動物は第０日に
ＯＡ２００μｇおよびＴｈｒ−ＭＤＰ５０μｇ、第２８
日にＯＡ５０μｇおよびＴｈｒ−ＭＤＰ５０μｇを投与
された。第２８日および第４２日に心臓穿刺によって採
血し、第４２日には皮内にＯＡ１０μｇを投与して皮膚
試験を行った。皮膚試験における直径と浸潤は２４時間
および４２時間後に測定した。抗体力価は、ＥＬＩＳＡ
による受動赤血球凝集によって測定した（以下参照）。

【０１１０】

【表７】

【０１１１】

【表８】

【０１１２】例１１ 上述の試験では、重大な副作用は全く認められなかっ
た。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ノエレーン エルバ バイヤーズ アメリカ合衆国 カリフォルニア州 サ ニーベイル，サイラキュース ドライブ 1092 (72)発明者 チェリング−チ フ アメリカ合衆国 カリフォルニア州 サ ラトガ，シャドウ オウクス ウェイ 14050 (72)発明者 デボラ マリリン リドゲイト アメリカ合衆国 カリフォルニア州 ロ ス アルトス，アーボレダ ドライブ 325 (72)発明者 フィリップ ルイズ フェルグナー アメリカ合衆国 カリフォルニア州 ラ ンチョ サンタ フェ，ラス パロマス 5412 (72)発明者 リンダ チェリル フォスター アメリカ合衆国 カリフォルニア州 サ ニーベイル，カロリナ アベニュー 733 (72)発明者 ウィリアム アルフレッド リー アメリカ合衆国 カリフォルニア州 ロ ス アルトス，アンダーソン ドライブ 749 (58)調査した分野(Int.Cl.⁶，ＤＢ名) A61K 39/39 A61K 39/00 A61J 3/00 ＢＩＯＴＥＣＨＡＢＳ（ＳＴＮ) ＣＡ（ＳＴＮ) ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ)

Claims (19)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 連続水相中に分散された油状粒子を有す
   るエマルジョン型の、抗原の免疫原性を増強するための
   アジュバントにおいて、非毒性テトラポリオールブロッ
   クポリマーのエマルジョン生成量、およびグリコペプチ
   ドの免疫増強量からなるアジュバント
2. 【請求項２】 連続水相中に分散された油状粒子を有す
   るエマルジョン型の、抗原の免疫原性を増強するための
   アジュバントにおいて、非毒性テトラポリオールのエマ
   ルジョン生成量、所望により非毒性代謝性油状物のエマ
   ルジョン生成量、グリコールエーテルベースの界面活性
   剤のエマルジョン安定化量、水または水性溶液、および
   式Ｉ 【化１】 （式中、ＲおよびＲ¹ はそれぞれ独立にＨまたは１個か
   ら２２個までの炭素原子を有するアシルであり、Ｒ² は
   アルキルまたはアリールであって所望によりハロ、ニト
   ロ、または低級アルキルで置換されていてもよく、Ｒ³
   はＨ、アルキルまたはアリールであり、Ｒ⁴ はＨまたは
   低級アルキルであり、ＸはＬ−アラニル、Ｌ−α−アミ
   ノブチリル、Ｌ−アルギニル、Ｌ−アスパラギニル、Ｌ
   −アスパルチル、Ｌ−システイニル、Ｌ−グルタミニ
   ル、Ｌ−グルタミル、グリシル、Ｌ−ヒスチジル、Ｌ−
   ヒドロキシプロリル、Ｌ−イソロイシル、Ｌ−ロイシ
   ル、Ｌ−リジル、Ｌ−メチオニル、Ｌ−オルニチニル、
   Ｌ−フェニルアラニル、Ｌ−プロリル、Ｌ−セリル、Ｌ
   −スレオニル、Ｌ−チロシル、Ｌ−トリプトファニルま
   たはＬ−バリルであり、ＹはＤ−グルタミン、Ｄ−イソ
   グルタミンまたはＤ−イソアスパラギンである）で示さ
   れるムラミルジペプチド誘導体またはその医薬的に許容
   される塩の免疫増強量からなる特許請求の範囲第１項に
   記載のアジュバント
3. 【請求項３】 テトラポリオールはＮ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′
   −テトラ（ポリオキシプロピレン−ポリオキシエチレ
   ン）−１，２−ジアミノエタン ブロックポリマー（テ
   トロニック１５０１）である特許請求の範囲第１項また
   は第２項のいずれか一つに記載のアジュバント
4. 【請求項４】 非毒性代謝性油状物としてスクアレンま
   たはスクアランを含有する特許請求の範囲第３項に記載
   のアジュバント
5. 【請求項５】 グリコールエーテルベース界面活性剤は
   ポリオキシエチレンソルビタンモノオリエート（ツイー
   ン８０）である特許請求の範囲第３項または第４項のい
   ずれか一つに記載のアジュバント
6. 【請求項６】 水または水性溶液は等張性緩衝食塩水で
   ある特許請求の範囲第３項から第５項までのいずれか一
   つに記載のアジュバント
7. 【請求項７】 式Ｉのムラミルジペプチド誘導体は、Ｎ
   −アセチルムラミル−Ｌ−スレオニル−Ｄ−イソグルタ
   ミン、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−α−アミノブチリル
   −Ｄ−イソグルタミン、６−Ｏ−ステアロイル−Ｎ−ア
   セチルムラミル−Ｌ−α−アミノブチリル−Ｄ−イソグ
   ルタミン、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−バリル−Ｄ−イ
   ソグルタミン、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−
   Ｄ−イソグルタミン、Ｎ−アチセル−デスメチルムラミ
   ル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン、Ｎ−アセチル
   ムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−グルタミンブチルエステ
   ル、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−セリル−Ｄ−イソグル
   タミン、またはＮ−ブチリルムラミル−Ｌ−α−アミノ
   ブチリル−Ｄ−イソグルタミンである特許請求の範囲第
   １項から第６項までのいずれか一つに記載のアジュバン
   ト
8. 【請求項８】 式Ｉのムラミルペプチド誘導体は、Ｎ−
   アセチルムラミル−Ｌ−スレオニル−Ｄ−イソグルタミ
   ンである特許請求の範囲第７項に記載のアジュバント
9. 【請求項９】 式Ｉのムラミルジペプチド誘導体は、Ｎ
   −アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−グルタミンブ
   チルエステルである特許請求の範囲第７項に記載のアジ
   ュバント
10. 【請求項１０】 連続水相中に分散された油状粒子を有
    する水中油型エマルジョンの、抗原の免疫原性を増強す
    るためのアジュバントにおいて、非毒性テトラポリオー
    ル０．２〜４９％、非毒性代謝性油状物０〜１５％、グ
    リコールエーテルベース界面活性剤０．０５〜５％、水
    または水性溶液、および式Ｉのムラミルジペプチド誘導
    体０．０００１〜１０％からなる特許請求の範囲第１項
    から第９項までのいずれか一つに記載のアジュバント
11. 【請求項１１】 連続水相中に分散された油状粒子を有
    する水中油型エマルジョンの、抗原の免疫原性を増強す
    るためのアジュバントにおいて、Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−
    テトラ（ポリオキシプロピレン−ポリオキシエチレン）
    −１，２−ジアミノエタン ブロックポリマー（テトロ
    ニック１５０１）、１〜１０％；スクアランまたはスク
    アレン１〜１０％；ポリオキシエチレンソルビタンモノ
    オリエート（ツイーン８０）０．２％；等張性緩衝食塩
    水；およびＮ−アセチルムラミル−Ｌ−スレオニル−Ｄ
    −イソグルタミン０．０００１〜１０％からなる特許請
    求の範囲第１０項に記載のアジュバント
12. 【請求項１２】 連続水相中に分散された油状粒子を有
    する水中油型エマルジョンの、動物を免疫感作するため
    のワクチンにおいて、抗原の免疫誘導量および特許請求
    の範囲第１項から第１１項までのいずれか一つに記載の
    アジュバントからなるワクチン
13. 【請求項１３】 水相とエマルジョン形成量の非毒性テ
    トラポリオールブロックポリマーを一緒に混合してエマ
    ルジョンを生成させることからなる特許請求の範囲第１
    項から第１２項までのいずれか一つに記載のアジュバン
    トまたはワクチンの製造方法
14. 【請求項１４】 エマルジョン生成後、混合物にグリコ
    ペプチドを添加する特許請求の範囲第１３項に記載の方
    法
15. 【請求項１５】 エマルジョンに抗原を添加してワクチ
    ンを生成させる特許請求の範囲第１３項または第１４項
    のいずれか一つに記載の方法
16. 【請求項１６】 水相中テトラポリオールポリマーのエ
    マルジョンを含有する第一の容器、およびグリコペプチ
    ドを含有する第二の容器からなる、特許請求の範囲第１
    項から第１１項までのいずれか一つに記載のアジュバン
    トを用時調製するためのキット
17. 【請求項１７】 連続水相中に分散された油状粒子を有
    し、エマルジョンはＮ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−テトラ（ポリ
    オキシプロピレン−ポリオキシエチレン）−１，２−ジ
    アミノエタン ブロックポリマー（テトロニック１５０
    １）、スクアランまたはスクアレン、ポリオキシエチレ
    ンソルビタンモノオリエート（ツイーン８０）および等
    張性緩衝食塩水からなる、水中油型エマルジョンを含有
    する第一の容器、ならびにＮ−アセチルムラミル−Ｌ−
    スレオニル−Ｄ−イソグルタミンを含有する第二の容器
    からなり、各容器の成分の濃度は両容器の内容物の配合
    によりＮ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−テトラ（ポリオキシプロピ
    レン−ポリオキシエチレン）−１，２−ジアミノエタン
    ブロックポリマー（テトロニック１５０１）、１〜３
    ０％、スクアランまたはスクアレン１〜３０％、ポリオ
    キシエチレンソルビタンモノオリエート（ツイーン８
    ０）０．２〜５％、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−スレオ
    ニル−Ｄ−イソグルタミン０．０００１〜３０％、およ
    び等張性緩衝食塩水からなる処方を生成するように選択
    される、本発明のアジュバントを用時調製するための特
    許請求の範囲第１６項に記載のキット
18. 【請求項１８】 水相中テトラポリオールブロックポリ
    マーのエマルジョンを含有する第一の容器、および抗原
    を含有する第二の容器からなり、グリコペプチドは第三
    の容器または第一もしくは第二の容器中に含有させた、
    特許請求の範囲第１２項に記載のワクチンの用時調製用
    キット
19. 【請求項１９】 連続水相中に分散された油状粒子を有
    し、エマルジョンはＮ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−テトラ（ポリ
    オキシプロピレン−ポリオキシエチレン）−１，２−ジ
    アミノエタン ブロックポリマー（テトロニック１５０
    １）、スクアランまたはスクアレン、ポリオキシエチレ
    ンソルビタンモノオリエート（ツイーン８０）および等
    張性緩衝食塩水からなる、水中油型エマルジョンを含有
    する第一の容器、ならびにＮ−アセチルムラミル−Ｌ−
    スレオニル−Ｄ−イソグルタミンおよび免疫誘導量の抗
    原を含有する第二の容器からなり、各容器の成分の濃度
    は両容器の内容物の配合によりＮ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−テ
    トラ（ポリオキシプロピレン−ポリオキシエチレン）−
    １，２−ジアミノエタン ブロックポリマー（テトロニ
    ック１５０１）、１〜１０％、スクアランまたはスクア
    レン１〜１０％、ポリオキシエチレンソルビタンモノオ
    リエート（ツイーン８０）０．２％、Ｎ−アセチルムラ
    ミル−Ｌ−スレオニル−Ｄ−イソグルタミン０．０００
    １〜１０％、抗原の免疫原性量、および等張性緩衝食塩
    水からなる処方を生成するように選択される、本発明の
    ワクチンを用時調製するための特許請求の範囲第１８項
    に記載のキット