DE3855807T2

DE3855807T2 - Einen Tetra-Polyol enthaltendes Impfstoff-Adjuvans

Info

Publication number: DE3855807T2
Application number: DE3855807T
Authority: DE
Inventors: Anthony Clifford Belmont Ca 94002 Allison; Noelene Elva Sunnyvale Ca 94087 Byars; Philip Lewis Rancho Sante Fe Ca 92067 Felgner; Linda Cheryl Sunnyvale Ca 94086 Foster; Cherng-Chyi Saratoga Ca 95070 Fu; William Alfred Los Altos Ca 94022 Lee; Deborah Marilyn Los Altos Ca 94022 Lidgate
Original assignee: Syntex USA LLC
Current assignee: Syntex USA LLC
Priority date: 1987-11-03
Filing date: 1988-11-02
Publication date: 1997-06-12
Anticipated expiration: 2008-11-03
Also published as: NZ226811A; EP0315153B1; EP0315153A3; JPH01157918A; AU2458888A; EP0513861A1; CA1338618C; JP2746272B2; DE3889521D1; EP0315153A2; ES2052674T3; IE883305L; IE63692B1; JPH1053535A; EP0513861B1; ES2097840T3; DE3889521T2; ZA888209B; JP2816337B2; DE3855807D1

Description

Diese Erfindung betrifft verbesserte Impfstoff-Adjuvans- Formulierungen, verbesserte Verfahren zur Herstellung der Adjuvans-Formulierungen und Verfahren zur Verwendung der verbesserten Formulierungen.
Adjuvantien sind zur Verbesserung der Immunantwort brauchbar, die mit irgendeinem speziellen Antigen in einem Impfstoff erhalten wird. Obwohl einige Antigene in Impfstoffen ohne ein Adjuvans verabreicht werden, gibt es viele Antigene, die keine ausreichende Immunogenität aufweisen, um eine brauchbare Immunantwort in Abwesenheit eines effektiven Adjuvans zu stimulieren. Adjuvantien verbessern auch die Immunantwort, die aus "eigenständig ausreichenden" Antigenen erhalten wird, insofern als die erhaltene Immunantwort erhöht werden kann oder die Menge des verabreichten Antigens vermindert werden kann.
Das Standard-Adjuvans zur Verwendung bei Labor-Tieren ist Freund'sches Adjuvans. Komplettes Freund'sches Adjuvans (FCA) ist eine Emulsion, die Mineralöl und abgetötete Mycobakterien in Salzlösung enthält. Unvollständiges Freund'sches Adjuvans (FIA) enthält keine Mycobakterien. Sowohl FIA als auch FCA induzieren eine außergewöhnliche humorale (Antikörper) Immunität, und FCA induziert zusätzlich einen hohen Grad an zellvermittelter Immunität. Weder FIA noch FCA sind jedoch wegen der Nebenwirkungen des Adjuvans zur Verwendung außerhalb des Labors annehmbar. Von Mineralöl ist bekannt, daß es Abszesse und Granulome verursacht, während Mycobacterium tuberculosis das für Tuberkulose verantwortliche Mittel ist.
Mehrere natürlich vorkommende Verbindungen, wie beispielsweise der Lipid-A-Teil des Endotoxins gramnegativer Bakterien und Trehalosedimycolat von Mycobakterien, wurden als Ersatz für FCA und FIA erprobt. Von dem Phospholipid Lysolecithin wurde auch gezeigt, daß es Adjuvans-Wirksamkeit aufweist (B. Arnold et al., Eur. J. Immunol., 9:363-366 (1979)). Ferner wurde von mehreren synthetischen Tensiden, zum Beispiel Dimethyldioctadecylammoniumbromid (DDA) und bestimmten linearen Polyoxypropylen-polyoxyethylen-(POP-POE)-Block-Polymeren (unter dem Warenzeichen Pluronic im Handel erhältlich) berichtet, daß sie Adjuvans-Wirksamkeit aufweisen (H. Snippe et al., Int. Archs. Allergy Appl. Immun., 65, 390-398 (1981)). R. Hunter et al. berichteten in J. Immunol., 127, 1244-1250 (1981), daß POP- POE-Block-Polymere die Bildung von Antikörpern gegenüber Rinderserumalbumin (BSA) in Mäusen erhöhen, wenn sie als die Tensid-Komponente einer Adjuvans-Formulierung aus einer Mineralöl/Wasser-Emulsion verwendet werden. Während diese natürlichen und synthetischen Tenside einen gewissen Grad an Adjuvansizität zeigen, erreichen sie in den meisten Fällen den unter Verwendung von FCA oder FIA erhaltenen Grad an Immunpotenzierung nicht.
Unter Verwendung eines anderen Ansatzes wurde festgestellt, daß die Adjuvans-Wirkung von Mycobakterien auf ein Muramyl-Peptid in der Zellwand zurückzuführen ist. Das kleinste Fragment dieses Moleküls, das die Adjuvans-Wirksamkeit beibehält, ist N-Acetylmuramyl-L-alanyl-D-isoglutamin, allgemein als Muramyldipeptid oder "MDP" bekannt (Ellouz et al., Biochem. & Biophys. Res. Comm., Bd. 59, 4, 1317 (1974)). Zahlreiche Analoga von MDP wurden hergestellt und werden auch als "MDPs" bezeichnet. Siehe zum Beispiel Audibert et al., U.S.-Pat. Nr. 4158052; Audibert et al., U.S.-Pat. Nr. 4220637; Audibert et al., U.S.-Pat. Nr. 4323559; Baschang et al., U.S.-Pat. Nr. 4323560; Baschang et al., U.S.-Pat. Nr. 4409209; Baschang et al., U.S.-Pat. Nr. 4423038; Derrien et al., U.S.-Pat. Nr. 4185089; Hartmann et al., U.S.-Pat. Nr. 4406889; Jones et al., U.S.-Pat. Nr. 4082735; Jones et al., U.S.-Pat. Nr. 4082736; Le Francier et al., U.S.-Pat. Nr. 4427659; Le Francier et al., U.S.-Pat. Nr. 4461761; Yamamura et al., U.S.-Pat. Nr. 4314998; Yamamura et al., U.S.-Pat. Nr. 4101536; und Yamamura et al., U.S.-Pat. Nr. 4369178. Während diese Verbindungen bei der Verabreichung in wäßriger Lösung bei der Stimulierung des Immunsystems schwach wirksam sind, zeigen die Ergebnisse im allgemeinen nicht die mit FIA oder FCA erhaltene spezifische Immunantwort.
Eine besonders effektive Adjuvans-Formulierung, die ein Glycopeptid, ein nicht-toxisches POP-POE-Block-Polymer, ein Tensid auf Glycolether-Basis, ein metabolisierbares Öl und gepufferte Salzlösung umfaßt, wurde kürzlich von Allison et al., U.S.-Pat. Nr. 4606918 beschrieben. Diese Formulierung ist in der Lage, starke humorale und zellvermittelte Immunantworten zu induzieren, die den unter Verwendung von FCA bei Labor-Tieren erreichten Ergebnissen äquivalent oder überlegen waren. Die Formulierung neigt jedoch beim Stehenlassen zu Instabilität und Auftrennung (z.B. Aufrahmen). Wir fanden, daß sie beim Kühlen ihre Fähigkeit verliert, die primäre Antwort auf Antigene zu potenzieren. Es wurde auch gefunden, daß es schwierig ist, eine stabile, homogene Emulsion unter Beibehaltung der vollen Adjuvans-Wirksamkeit im handelsüblichem Maßstab herzustellen.
Wir fanden nun, daß ein immunpotenzierendes Glycopeptid mit einem nicht-toxischen N,N,N',N'-Tetra(polyoxypropylenpolyoxyethylen)-1,2-diaminoethan-Block-Polymer ("Tetra-Polyol") formuliert werden kann, wodurch sich eine Adjuvans-Emulsion ergibt, die bestimmte Probleme des Standes der Technik, zum Beispiel Toxizität und Nicht-Stimulierung zellvermittelter Immunität, überwindet. Dieses neue Adjuvans weist eine Wirksamkeit auf, die gleich oder größer als die Wirksamkeit von FCA ist, und erhöht die Immunogenität deutlich effektiver als Allison's Zusammensetzung. Die Formulierung der vorliegenden Erfindung wird unter vollständiger Beibehaltung der Wirksamkeit leicht hergestellt und zeigt eine größere Stabilität als Allison's Zusammensetzung. Da das Tetra-Polyol nicht-toxisch ist, kann diese Adjuvans-Formulierung als ein Träger zur Steigerung der Immunogenität von Antigenen, die Vögeln und Säugern verabreicht werden, sicher verwendet werden.
Wir haben auch ein besonders vorteilhaftes Verfahren zur Herstellung von Adjuvans-Emulsionen unter Verwendung von Tetra- Polyolen, welches die Wirksamkeit der Formulierungen beibehält, ihre physikalische Stabilität erhöht und ihre Empfindlichkeit gegenüber Kühlung vermindert, erfunden. Bemerkenswerterweise können solche Adjuvans-Emulsionen sogar gefroren werden und behalten noch ihre Wirksamkeit bei.
Ein Aspekt der Erfindung ist ein Adjuvans in Form einer Emulsion mit in einer kontinuierlichen wäßrigen Phase dispergierten Öl-Teilchen zur Potenzierung der Immunogenität eines Antigens, wobei das Adjuvans umfaßt:
eine Emulsions-bildende Menge eines nicht-toxischen Tetra-Polyols; und
eine immunpotenzierende Menge eines Glycopeptids.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist ein Adjuvans in Form einer Emulsion mit in einer kontinuierlichen wäßrigen Phase dispergierten Öl-Teilchen zur Potenzierung der Immunogenität eines Antigens, wobei das Adjuvans eine Emulsions-bildende Menge eines nicht-toxischen Tetra-Polyols; gegebenenfalls eine Emulsions-bildende Menge eines nicht-toxischen metabolisierbaren Öls; gegebenenfalls eine Emulsions-stabilisierende Menge eines Tensids auf Glycolether-Basis; Wasser oder wäßrige Lösung; und eine immunpotenzierende Menge eines Muramyldipeptids, bevorzugt eines Derivats der Formel I:
und der pharmazeutisch annehmbaren Salze davon, umfaßt, worin R und R&sub1; jeweils unabhängig für H oder Acyl mit 1 bis 22 Kohlenstoffatomen stehen, R&sub2; Alkyl oder Aryl, gegebenenfalls mit Halogen, Nitro oder Niederalkyl substituiert, darstellt, R&sub3; H, Alkyl oder Aryl repräsentiert, R&sub4; H oder Niederalkyl bedeutet, X für L-Alanyl, L-α-Aminobutyryl, L-Arginyl, L-Asparginyl, L- Aspartyl, L-Cysteinyl, L-Glutaminyl, L-Glutamyl, Glycyl, L-Histidyl, L-Hydroxyprolyl, L-Isoleucyl, L-Leucyl, L-Lysyl, L-Methionyl, L-Ornithinyl, L-Phenylalanyl, L-Prolyl, L-Seryl, L- Threonyl, L-Tyrosyl, L-Tryptophanyl oder L-Valyl steht, und Y D-Glutamin, D-Isoglutamin oder D-Isoasparagin ist.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist ein Impfstoff, der ein Adjuvans der Erfindung vereinigt mit einer immunogenen Menge eines Antigens umfaßt.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung eines Adjuvans der Erfindung, welches das Herstellen einer ersten Mischung, umfassend das Polymer, Öl, Tensid und Wasser oder wäßrige Lösung; das Emulgieren der Mischung, um eine Emulsion vom Öl-in-Wasser-Typ mit in einer kontinuierlichen wäßrigen Phase dispergierten Öl-Teilchen herzustellen; und das Vereinigen der Emulsion mit einem Muramyldipeptid-Derivat der Formel I umfaßt.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist ein Satz zur extemporalen Herstellung eines Adjuvans der Erfindung, umfassend: einen ersten Behälter, der eine wie oben beschriebene Emulsion enthält, und einen zweiten Behälter, der das Muramyldipeptid, bevorzugt N-Acetylmuramyl-L-threonyl-D-isoglutamin, gegebenenfalls in einer wäßrigen Lösung oder Suspension, enthält, wobei die Konzentrationen der Komponenten in jedem Behälter so gewählt sind, daß die Vereinigung des Inhalts beider Behälter ein Adjuvans der Erfindung liefert.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist ein Satz zur Herstellung eines Impfstoffs der Erfindung, welcher sich von dem oben beschriebenen Adjuvans-Satz dadurch unterscheidet, daß eine immunogene Menge eines Antigens dem zweiten Behälter zugesetzt ist oder in einem dritten Behälter anwesend ist.
Ein Aspekt der Erfindung ist ein Adjuvans in Form einer Emulsion mit in einer kontinuierlichen wäßrigen Phase dispergierten Öl-Teilchen zur Potenzierung der Immunogenität eines Antigens, wobei das Adjuvans umfaßt:
eine Emulsions-bildende Menge eines nicht-toxischen Tetra-Polyols; und
eine immunpotenzierende Menge eines Glycopeptids.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist ein Adjuvans in Form einer Emulsion mit in einer kontinuierlichen wäßrigen Phase dispergierten Öl-Teilchen zur Potenzierung der Immunogenität eines Antigens, wobei das Adjuvans eine Emulsions-bildende Menge eines nicht-toxischen Tetra-Polyols; gegebenenfalls eine Emulsions-bildende Menge eines nicht-toxischen metabolisierbaren Öls; gegebenenfalls eine Emulsions-stabilisierende Menge eines Tensids auf Glycolether-Basis; Wasser oder wäßrige Lösung; und eine immunpotenzierende Menge eines Muramyldipeptids, bevorzugt eines Derivats der Formel I:
und der pharmazeutisch annehmbaren Salze davon, umfaßt, worin R und R&sub1; jeweils unabhängig für H oder Acyl mit 1 bis 22 Kohlenstoffatomen stehen, R&sub2; Alkyl oder Aryl, gegebenenfalls mit Halogen, Nitro oder Niederalkyl substituiert, darstellt, R&sub3; H, Alkyl oder Aryl repräsentiert, R&sub4; H oder Niederalkyl bedeutet, X für L-Alanyl, L-α-Aminobutyryl, L-Arginyl, L-Asparginyl, L- Aspartyl, L-Cysteinyl, L-Glutaminyl, L-Glutamyl, Glycyl, L-Histidyl, L-Hydroxyprolyl, L-Isoleucyl, L-Leucyl, L-Lysyl, L-Methionyl, L-Ornithinyl, L-Phenylalanyl, L-Prolyl, L-Seryl, L- Threonyl, L-Tyrosyl, L-Tryptophanyl oder L-Valyl steht, und Y D-Glutamin, D-Isoglutamin oder D-Isoasparagin ist. Eine bevorzugte Unterklasse ist das Adjuvans, in welchem das Tetra-Polyol Tetronic 1501 ist, speziell in welchem das Muramyldipeptid- Derivat der Formel I N-Acetylmuramyl-L-threonyl-D-isoglutamin ist. Eine bevorzugte Klasse der Erfindung ist das Adjuvans, welches ein nicht-toxisches metabolisierbares Öl einschließt, besonders wenn das Öl Squalen oder Squalan ist. Eine bevorzugte Unterklasse ist das Adjuvans, in welchem das Tensid auf Glycolether-Basis Tween 80 ist, besonders wenn das Wasser oder die wäßrige Lösung isotone gepufferte Salzlösung umfaßt.
Eine weitere bevorzugte Unterklasse ist das Adjuvans, in welchem das Tetra-Polyol Tetronic 1501 ist, und das Muramyldipeptid-Derivat der Formel I Murabutid ist.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist ein Adjuvans in Form einer Emulsion vom Öl-in-Wasser-Typ mit in einer kontinuierlichen wäßrigen Phase dispergierten Öl-Teilchen zur Potenzierung der Immunogenität eines Antigens, wobei das Adjuvans ein nicht-toxisches Tetra-Polyol in einer Menge von 0,2 bis 49 %; ein nicht-toxisches metabolisierbares Öl in einer Menge von 0-15 %; ein Tensid auf Glycolether-Basis in einer Menge von 0,05-5 %; Wasser oder wäßrige Lösung; und 0,0001-10 % eines Muramyldipeptid-Derivats der Formel I (% bedeuten Vol./Vol., mit Ausnahme des Muramyldipeptids, worin es für Gew./Vol. steht) umfaßt. Eine bevorzugte Unterklasse ist das Adjuvans, in welchem das Tetra-Polyol Tetronic 1501 ist, besonders wenn das Muramyldipeptid-Derivat der Formel I N-Acetylmuramyl-L-threonyl-D-isoglutamin ist. Eine bevorzugte Klasse ist das Adjuvans, welches ein nicht-toxisches metabolisierbares Öl einschließt, wobei das Öl Squalen oder Squalan ist. Eine gegenwärtig bevorzugte Ausführungsform der Erfindung ist das Adjuvans in Form einer Emulsion vom Öl-in-Wasser-Typ mit in einer kontinuierlichen wäßrigen Phase dispergierten Ol-Teilchen zur Potenzierung der Immunogenität eines Antigens, wobei das Adjuvans Tetronic 1501 in einer Menge von 1-10 %; Squalan oder Squalen in einer Menge von 1-10 %; Tween 80 in einer Menge von etwa 0,2 %; isotone gepufferte Salzlösung (unter Verwendung von Phosphat- Puffern, Acetat-Puffern oder Kombinationen davon); und 0,0001- 10 % N-Acetylmuramyl-L-threonyl-D-isoglutamin umfaßt.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist ein Impfstoff, umfassend ein Adjuvans der Erfindung in Kombination mit einer immunogenen Menge eines Antigens. Geeigneterweise ist dieser ein Impfstoff in Form einer Emulsion vom Öl-in-Wasser-Typ mit in einer kontinuierlichen wäßrigen Phase dispergierten Öl-Teilchen zur Immunisierung eines Tiers, wobei der Impfstoff eine immunogene Menge eines Antigens; eine Emulsions-bildende Menge eines nicht-toxischen Tetra-Polyols; gegebenenfalls eine Emulsionsbildende Menge eines nicht-toxischen metabolisierbaren Öls; gegebenenfalls eine Emulsions-stabilisierende Menge eines Tensids auf Glycolether-Basis; Wasser oder wäßrige Lösung; und eine immunpotenzierende Menge eines Muramyldipeptids, bevorzugt eines Derivats der Formel I, umfaßt. Eine bevorzugte Unterklasse ist der Impfstoff, welcher ein Tetra-Polyol einschließt, besonders wenn das Tetra-Polyol Tetronic 1501 ist. Eine bevorzugte Unterklasse ist der Impfstoff, in welchem das Muramyldipeptid-Derivat der Formel I N-Acetylmuramyl-L-threonyl-D-isoglutamin ist. Eine andere bevorzugte Unterklasse ist der Impfstoff, in welchem das Muramyldipeptid-Derivat der Formel I Murabutid ist. Eine gegenwärtig bevorzugte Ausführungsform ist der Impfstoff, welcher umfaßt: Tetronic 1501 in einer Menge von 1-10 %; Squalan oder Squalen in einer Menge von 1-10 %; Tween 80 in einer Menge von etwa 0,2 %; isotone gepufferte Salzlösung; und 0,0001-10 % N-Acetylmuramyl-L-threonyl-D-isoglutamin.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung des Adjuvans oder Impfstoffs der Erfindung, umfassend das Zusammenmischen der wäßrigen Phase und der Emulsionsbildenden Menge des nicht-toxischen Tetra-Polyols, um eine Emulsion zu bilden.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung eines Adjuvans der Erfindung, umfassend: das Herstellen einer ersten Mischung, umfassend ein nicht-toxisches Tetra-Polyol, gegebenenfalls ein nicht-toxisches metabolisierbares Öl, gegebenenfalls ein Tensid auf Glycolether-Basis und Wasser oder wäßrige Lösung; das Emulgieren der ersten Mischung, um eine Emulsion vom Öl-in-Wasser-Typ mit in einer kontinuierlichen wäßrigen Phase dispergierten Öl-Teilchen herzustellen; und das Vereinigen der Emulsion mit einem Muramyldipeptid-Derivat der Formel I.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist ein Satz zur extemporalen Herstellung eines Adjuvans der Erfindung, umfassend:
einen ersten Behälter, der die Emulsion des Tetra-Polyols in der wäßrigen Phase enthält; und
einen zweiten Behälter, der das Glycopeptid enthält.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist ein Satz zur extemporalen Herstellung eines Impfstoffs der Erfindung, umfassend:
einen ersten Behälter, der die Emulsion des Tetra-Polyols in der wäßrigen Phase enthält; und
einen zweiten Behälter, der das Antigen enthält;
wobei das Glycopeptid in einem dritten Behälter oder in dem ersten oder zweiten Behälter anwesend sein kann.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist ein Satz zur extemporalen Herstellung eines Adjuvans der Erfindung, umfassend: einen ersten Behälter, der eine Emulsion vom Öl-in-Wasser-Typ enthält, die in einer kontinuierlichen wäßrigen Phase dispergierte Öl-Teilchen aufweist, wobei die Emulsion Tetronic 1501, Squalan oder Squalen, gegebenenfalls Tween 80, und isotone gepufferte Salzlösung enthält; und einen zweiten Behälter, der N-Acetylmuramyl-L-threonyl-D-isoglutamin in Pulver-Form (bevorzugt lyophilisiert) oder in wäßriger Lösung oder Suspension enthält, wobei die Konzentrationen der Komponenten in jedem Behälter so gewählt sind, daß die Vereinigung des Inhalts beider Behälter eine Formulierung liefert, die Tetronic 1501 in einer Menge von 1-30 %, Squalan oder Squalen in einer Menge von 1-30 %, gegebenenfalls Tween 80 in einer Menge von etwa 0,2-5 %, 0,0001-30 % N-Acetylmuramyl-L-threonyl-D-isoglutamin und isotone gepufferte Salzlösung umfaßt. Eine bevorzugte Unterklasse ist der Satz, in welchem Tetronic 1501 eingeschlossen ist.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist ein Satz zur extemporalen Herstellung eines Impfstoffs der Erfindung, umfassend: einen ersten Behälter, der eine Emulsion vom Öl-in-Wasser-Typ enthält, die in einer kontinuierlichen wäßrigen Phase dispergierte Öl-Teilchen aufweist, wobei die Emulsion Tetronic 1501, Squalan oder Squalen, gegebenenfalls Tween 80, und isotone gepufferte Salzlösung enthält; und einen zweiten Behälter, der N-Acetylmuramyl-L-threonyl-D-isoglutamin in Pulver- Form (bevorzugt lyophilisiert) oder in wäßriger Lösung oder Suspension und eine immunogene Menge eines Antigens enthält, wobei die Konzentrationen der Komponenten in jedem Behälter so gewählt sind, daß die Vereinigung des Inhalts beider Behälter eine Formulierung liefert, die Tetronic 1501 in einer Menge von 1-10 %, Squalan oder Squalen in einer Menge von 1-10 %, gegebenenfalls Tween 80 in einer Menge von etwa 0,2 %, 0,0001- 10 % N-Acetylmuramyl-L-threonyl-D-isoglutamin, eine immunogene Menge eines Antigens und isotone gepufferte Salzlösung umfaßt. Gegebenenfalls kann das Antigen in einem getrennten dritten Behälter vorliegen. Eine bevorzugte Unterklasse ist der Satz, in welchem Tetronic 1501 eingeschlossen ist.
Wie angegeben, ist geeigneterweise in den Sätzen der Erfindung das Glycopeptid als Pulver, bevorzugt als lyophilisiertes Pulver, anwesend.

DEFINITIONEN

Der Begriff "Alkyl" betrifft einen unverzweigten oder verzweigten Rest, der 1 bis 22 Kohlenstoffatome umfaßt und gesättigt ist. Beispiele von Alkyl sind Methyl, Ethyl, Propyl, Butyl, tert.-Butyl, Hexyl, Octyl, Decyl, Dodecyl, Eicosanyl und dergleichen. "Niederalkyl" betrifft einen Alkylrest mit 1 bis 7 Kohlenstoffatomen, zum Beispiel Methyl, Ethyl, Propyl, Butyl, tert.-Butyl, Hexyl, 3-Methylhexyl, Heptyl und dergleichen. "Cycloalkyl" betrifft Cyclopropyl, Cyclobutyl, Cyclopentyl, Cydohexyl, Cycloheptyl und dergleichen.
Der Begriff "Acyl" betrifft Reste der Formel RCO-, worin R H oder Alkyl wie vorstehend definiert ist. "Niederacyl" betrifft solche Reste, worin R H oder Niederalkyl ist. Beispiele von Acylresten schließen Formyl, Acetyl, Propionyl, Butyryl, Pentanoyl, Hexanoyl, Eicosanoyl und dergleichen ein. Beispiele von Niederacyl schließen Formyl, Acetyl, Propionyl, Butyryl, Pentanoyl, Hexanoyl und dergleichen ein.
Der hier verwendete Begriff "Halogen" betrifft Fluor, Chlor, Brom und Iod.
Der Begriff "Alkoxy" betrifft einen Rest der Form RO-, worin R Niederalkyl oder Cycloalkyl wie oben definiert ist.
Der Begriff "Aryl" betrifft aromatische Reste, die ganz aus Kohlenstoff und Wasserstoff bestehen und 6 bis 12 Kohlenstoffatome enthalten. Beispiele von Arylresten sind Phenyl, Naphthyl und dergleichen.
Der Begriff "pharmazeutisch annehmbare Salze" betrifft Säureadditionssalze der vorliegenden Verbindungen, welche die gewünschte pharmakologische Wirksamkeit besitzen und welche weder biologisch noch anderweitig unerwünscht sind. Diese Salze werden mit anorganischen Säuren, wie beispielsweise Chlorwasserstoffsäure, Bromwasserstoffsäure, Schwefelsäure, Salpetersäure oder Phosphorsäure; oder organischen Säuren, wie beispielsweise Essigsäure, Propionsäure, Glycolsäure, Brenztraubensäure, Malonsäure, Bernsteinsäure, Äpfelsäure, Maleinsäure, Fumarsäure, Weinsäure, Citronensäure, Benzoesäure, Zimtsäure, Mandelsäure, Methansulfonsäure, Ethansulfonsäure, p-Toluolsulfonsäure und dergleichen, gebildet.
Der hier verwendete Begriff "Behandlung" umfaßt irgendeine Behandlung einer Krankheit in einem Vogel oder Säuger, speziell einem Menschen, und schließt ein:
(i) Verhindern des Auftretens der Krankheit in einem Patienten, welcher eine Prädisposition gegenüber der Krankheit aufweisen kann, die jedoch bei ihm noch nicht diagnostiziert wurde;
(ii) Hemmen der Krankheit, d.h. ihre Entwicklung zum Stillstand bringen; oder
(iii) Lindern der Krankheit, d.h. einen Rückgang der Krankheit hervorrufen. (Es sollte angemerkt werden, daß eine Impfung den Rückgang einer Krankheit bewirken kann, wenn die Krankheit aufgrund einer ineffektiven Erkennung von Antigenen durch das Immunsystem des Patienten besteht, wobei der Impfstoff effektiv ein Antigen darstellt.)
Der auf Arylreste in der Erfindung angewendete Begriff "gegebenenfalls substituiert" bedeutet, daß der Rest nicht-substituiert oder mit einem bis drei Halogen-, Nitro-, Niederalkyl- oder Niederalkoxyresten substituiert sein kann. Die fakultativen Substituenten können gleich oder verschieden sein.
Der Begriff "Muramyldipeptid-Derivat" schließt Verbindungen der Formel I ein:
worin R, R&sub1;, R&sub2;, R&sub3; und R&sub4; jeweils unabhängig für H, Alkyl, Acyl oder Aryl, gegebenenfalls mit Halogen, Nitro oder Niederalkyl substituiert, stehen; X eine oder mehrere Aminosäuren bedeutet, und Y D-Glutamin, D-Isoglutamin oder D-Isoasparagin ist, die gegebenenfalls verestert oder amidiert sein können. Bevorzugte Verbindungen sind die der Formel I, worin R und R&sub1; für H oder Acyl mit 1 bis 22 Kohlenstoffatomen stehen; R&sub2; Methyl darstellt; R&sub3; Wasserstoff repräsentiert; X für L-Alanyl, L-α- Aminobutyryl, L-Arginyl, L-Asparginyl, L-Aspartyl, L-Cysteinyl, L-Glutaminyl, L-Glutamyl, Glycyl, L-Histidyl, L-Hydroxyprolyl, L-Isoleucyl, L-Leucyl, L-Lysyl, L-Methionyl, L-Ornithinyl, L- Phenylalanyl, L-Prolyl, L-Seryl, L-Threonyl, L-Tyrosyl, L-Tryptophanyl oder L-Valyl steht; und Y D-Glutamin oder D-Isoglutamin ist. Die am meisten bevorzugten MDPs sind: N-Acetylmuramyl- L-α-aminobutyryl-D-isoglutamin; 6-O-Stearoyl-N-acetylmuramyl- L-α-aminobutyryl-D-isoglutamin; N-Acetylmuramyl-L-threonyl-D- isoglutamin; N-Acetylmuramyl-L-valyl-D-isoglutamin; N-Acetylmuramyl-L-alanyl-D-isoglutamin; N-Acetyldesmethylmuramyl-L-alanyl-D-isoglutamin; N-Acetylmuramyl-L-alanyl-D-glutaminbutylester (Murabutid); N-Acetylmuramyl-L-seryl-D-isoglutamin; und N-Butyrylmuramyl-L-(α-aminobutyryl)-D-isoglutamin. Ein anderes brauchbares MDP ist N-Acetyl(n-butylmuramyl)-L-α-aminobutyryl- D-isoglutamin.
Der Begriff "immunpotenzierende Menge" betrifft die Menge an MDP-Derivat, die benötigt wird, um eine Zunahme an Antikörper-Titer und/oder zellvermittelter Immunität, verglichen mit der Titerhöhe, die in Abwesenheit des MDPs beobachtet wird, hervorzurufen, wenn es mit einem Antigen in der Formulierung der Erfindung verabreicht wird. Wie man erkennen kann, kann jedes MDP einen effektiven Dosis-Bereich aufweisen, der sich von anderen MDPs unterscheiden kann. Somit kann kein einzelner Dosis-Bereich, welcher für jedes mögliche Glycopeptid innerhalb des Umfanges dieser Erfindung genau paßt, vorgeschrieben werden. Die immunpotenzierende Menge kann jedoch von einem Fachmann leicht bestimmt werden. Als allgemeine Regel ist das Glycopeptid bevorzugt in einer Menge zwischen 0,001 und 2 % anwesend. Eine bevorzugtere Menge ist 0,005 bis 1 %.
Der Begriff "nicht-toxisches metabolisierbares Öl" betrifft ein Öl mit 6 bis 30 Kohlenstoffatomen, das Alkane, Alkene, Alkine und ihre entsprechenden Säuren und Alkohole, die Ether und Ester davon, und Gemische davon einschließt, jedoch nicht darauf beschränkt ist. Das Öl kann irgendein pflanzliches Öl, Fisch-Öl, Tier-Öl oder synthetisch hergestelltes Öl sein, welches im Körper des Patienten, welchem das Adjuvans verabreicht wird, metabolisiert werden kann, und welches für den Organismus nicht-toxisch ist. Es ist wesentlich, daß das Öl von dem Tier oder Vogel, welchem es verabreicht wird, metabolisiert wird, um die Erzeugung von Abszessen, Granulomen oder Karzinomen zu vermeiden. Nüsse, Samen und Körner sind herkömmliche Quellen pflanzlicher Öle. Synthetische Öle innerhalb des Umfanges der Erfindung schließen "Neobee " (erhältlich von PVO International, Inc., Chemical Specialities Division, 416 Division Street, Boongon, New Jersey) und andere ein. Haifisch-Öl enthält ein verzweigtes, ungesättigtes Öl, das als Squalen, 2,6,- 10,15,19,23-Hexamethyl-2,6,10,14,18,22-tetracosahexen, bekannt ist, welches hier besonders bevorzugt ist. Squalan, das gesättigte Analogon von Squalen, ist auch ein besonders bevorzugtes Öl. Fisch-Öle, einschließlich Squalen und Squalan, sind aus kommerziellen Quellen leicht erhältlich oder können durch in dem Fachgebiet bekannte Verfahren erhalten werden.
Eine "Emulsions-bildende Menge" eines nicht-toxischen metabolisierbaren Öls ist die Menge, welche in Anwesenheit des Tetra-Polyols eine Emulsion bildet. Die Öl-Komponente dieser Adjuvantien und Impfstoff-Formulierungen ist in der Regel in einer Menge zwischen 1 und 30 %, jedoch bevorzugt in einer Menge von 1 bis 10 % anwesend. Die Verwendung einer etwa 5 %igen Konzentration an Öl ist am meisten bevorzugt.
Der wäßrige Teil dieser Adjuvans-Zusammensetzungen ist bevorzugt gepufferte isoosmotische Salzlösung. Da diese Zusammensetzungen zur parenteralen Verabreichung bestimmt sind, ist es bevorzugt, diese Lösungen so zu formulieren, daß die Tonizität im wesentlichen dieselbe wie normaler physiologischer Fluide ist, um eine Schwellung nach der Verabreichung oder eine schnelle Absorption der Zusammensetzung aufgrund unterschiedlicher Ionen-Konzentrationen zwischen der Zusammensetzung und physiologischen Fluiden zu verhindern. Es ist auch bevorzugt, die Salzlösung zu puffern, um einen pH-Wert aufrechtzuerhalten, der mit normalen physiologischen Bedingungen kompatibel ist. In bestimmten Fällen kann es auch erforderlich sein, den pH-Wert in einer speziellen Höhe zu halten, um die Stabilität bestimmter Komponenten der Zusammensetzung, wie beispielsweise der Glycopeptide, sicherzustellen. Irgendein physiologisch annehmbarer Puffer kann hier verwendet werden, aber es wurde gefunden, daß die Verwendung eines Phosphat-Puffers am bequemsten ist. Irgendein anderer annehmbarer Puffer, wie beispielsweise Acetat, Tris, Hydrogencarbonat, Carbonat und dergleichen, kann als Ersatz für einen Phosphat-Puffer verwendet werden. Die Verwendung von Phosphat-gepufferter Salzlösung oder einer mit einer Mischung aus Phosphat und Acetat gepufferten Salzlösung ist bevorzugt.
Der Begriff "Antigen" betrifft irgendeine Substanz, in der Regel ein Protein oder Glycoprotein, Lipoprotein, Saccharid, Polysaccharid oder Lipopolysaccharid, welche nach der Verabreichung die Bildung spezifischer Antikörper stimuliert und spezifisch mit einem homologen Antikörper in vivo oder in vitro reagiert. Ferner stimuliert sie die Proliferation von T-Lymphozyten mit Rezeptoren für das Antigen und kann mit den Lymphozyten reagieren, um die Reihe von Antworten auszulösen, die als zellvermittelte Immunität bezeichnet werden.
Der hier verwendete Begriff "Antigen" schließt auch Kombinationen von Haptenen mit einem Träger ein. Ein Hapten ist ein Teil eines antigenen Moleküls oder antigenen Komplexes, der seine immunologische Spezifität bestimmt, jedoch zur Stimulierung einer Immunantwort in Abwesenheit eines Trägers nicht ausreicht. Im allgemeinen ist ein Hapten ein relativ kleines Peptid oder Polysaccharid und kann ein Fragment eines natürlich vorkommenden Antigens sein. In künstlichen Antigenen kann es eine Substanz mit niedrigem Molekulargewicht, wie zum Beispiel ein Arsanilsäure-Derivat, sein. Ein Hapten reagiert in vivo und in vitro spezifisch mit homologen Antikörpern oder T-Lymphozyten. Haptene werden vor der Formulierung als Impfstoff durch entweder kovalente oder nicht-kovalente Bindung typischerweise an ein großes Träger-Molekül, wie beispielsweise Rinderserumalbumin (BSA) oder Hämocyanin der Schlüssellochschnecke (KLH), gebunden. Zum Beispiel besteht ein herkömmliches künstliches Antigen, das zur Prüfung von Impfstoffen und Adjuvantien verwendet wird, aus kovalent an BSA gebundenem 2,4-Dinitrophenol (DNP). Zur Verwendung in dieser Erfindung geeignete Antigene schließen Hepatitis-B-(Oberflächen)-Antigen und Influenza-(zum Beispiel A oder B)-Antigen ein. Ebenfalls Antigene für AIDS und Herpes.
Der Begriff "immunogene Menge" eines Antigens betrifft eine Menge eines Antigens, die ausreicht, um eine brauchbare Immunantwort zu stimulieren, wenn sie mit einem Adjuvans der Erfindung verabreicht wird. Die zur Bereitstellung einer immunogenen Menge erforderliche Menge eines Antigens wird durch einen Fachmann, zum Beispiel durch die Herstellung einer Reihe von Impfstoffen der Erfindung mit verschiedenen Konzentrationen eines Antigens, die Verabreichung der Impfstoffe an geeignete Labor-Tiere (zum Beispiel Meerschweinchen) und die Untersuchung der resultierenden Immunantwort durch die Messung des Serum-Antikörper-Titers, der durch das Antigen ausgelösten Schwellung in der Haut und dergleichen, leicht bestimmt.
Der hier verwendete Begriff "Tetra-Polyol" betrifft N,- N,N',N'-Tetra(polyoxypropylen-polyoxyethylen)-1,2-diaminoethan- Block-Polymere. Diese Verbindungen können durch das in dem U.S.-Patent Nr. 2979528 offenbarte Verfahren hergestellt werden oder können kommerziell von BASF-Wyandotte unter dem Warenzeichen Tetronic erhalten werden.
Tetronic -Polyole werden mit einer drei- oder vierstelligen Zahl bezeichnet, welche das durchschnittliche Molekulargewicht des Polyoxypropylen-(POP)-Teils und den zum Gesamtmolekulargewicht beigetragenen Prozentsatz des Polyoxyethylen- (POE)-Teils des Moleküls anzeigt. Die erste oder die ersten zwei von Null verschiedenen Stellen zeigen das durchschnittliche Molekulargewicht des POP-Teils an, das im Bereich von 501- 1000 für Tetronic 304 bis 6500-7000 für Tetronic 1501 liegt. Die letzte Stelle zeigt den Prozentsatz von POE in Inkrementen von 10 % an, der im Bereich von 10 % für Tetronic 1501 bis 80 % für Tetronic 1508 liegt. Die Charakteristika dieser Verbindungen werden durch das Molekulargewicht des POP-Teils und die Menge an POE in dem Produkt bestimmt. Bei der Anwendung der Erfindung bevorzugte Tetra-Polyole sind bei 25ºC in Wasser relativ unlöslich und weisen niedrige HLB-Werte auf. Der HLB-Wert sollte bevorzugt niedriger als etwa 5,0 sein. Gegenwärtig bevorzugte Tetra-Polyole sind Tetronic 1501, Tetronic 1301, Tetronic 1101 und Tetronic 1502, speziell Tetronic 1501 und Tetronic 1301, besonders Tetronic 1501. Andere geeignete Tetra-Polyole mit den erforderlichen Eigenschaften können unter Verwendung der in dem U.S.-Patent Nr. 2979528 offenbarten Verfahren hergestellt werden und sollen innerhalb des Umfanges dieser Erfindung als Äquivalente angesehen werden. Zum Beispiel könnte man ein Tetra-Polyol mit einem POP-Molekulargewicht von 8000 und einem POE-Gehalt von 8 % herstellen. Die erforderlichen Eigenschaften sind (i) ein niedriger HLB-Wert (≤ 5,0, bevorzugt ≤ 2,0); (ii) eine geringe oder keine Löslichkeit in Wasser; (iii) die Bildung stabiler Emulsionen unter Zugabe eines Tensids auf Glycolether-Basis; und (iv) das Fehlen von Toxizität.
Eine "Emulsions-bildende Menge" eines Tetra-Polyols ist die Menge, die Mizellen oder eine Emulsion bildet. Für die Zwecke der Erfindung ist dies eine Menge zwischen 0,2 Vol.-% und 49 Vol.-%. Eine bevorzugtere Menge beträgt 0,2 % bis 20 %, und etwa 1-5 % sind noch bevorzugter. Eine Konzentration von 1- 2,5 % ist gegenwärtig am meisten bevorzugt.
Der Begriff "Tensid" betrifft nicht-toxische oberflächenaktive Mittel, die in der Lage sind, die Emulsion zu stabilisieren. Es gibt eine beträchtliche Anzahl emulgierender und suspendierender Mittel, die allgemein in den pharmazeutischen Wissenschaften verwendet werden. Diese schließen natürlich abgeleitete Materialien, wie beispielsweise Gumen, pflanzliches Protein, Alginate, Cellulose-Derivate, Phospholipide (ob natürlich oder synthetisch) und dergleichen, ein. Bestimmte Polymere mit einem hydrophilen Substituenten an der Polymer-Hauptkette, zum Beispiel Povidon, Polyvinylalkohol und Verbindungen auf Glycolether-Basis, weisen eine Tensid-Wirksamkeit auf. Von langkettigen Fettsäuren abgeleitete Verbindungen sind eine dritte wesentliche Gruppe von in dieser Erfindung brauchbaren emulgierenden und suspendierenden Mitteln. Obwohl jedes der vorangehenden Tenside verwendet werden kann, solange sie nichttoxisch sind, sind Tenside auf Glycolether-Basis bevorzugt. Bevorzugte Tenside sind nicht-ionisch. Diese schließen Polyethylenglycole (besonders PEG 200, 300, 400, 600 und 900), Span , Arlacel , Tween , Myrj , Brij (alle von ICI, America's Inc., Wilmington, Delaware erhältlich), Polyoxyethylen, Polyolfettsäureester, Polyoxyethylenether, Polyoxypropylenfettsäureether, Bienenwachs-Derivate, enthaltend Polyoxyethylen, Polyoxyethylenlanolin-Derivate, Polyoxyethylenfettsäureglyceride, Glycerinfettsäureester oder andere Polyoxyethylensäure-Alkohol- oder -Ether-Derivate langkettiger Fettsäuren mit 12-21 Kohlenstoffatomen ein. Das gegenwärtig bevorzugte Tensid ist Tween 80 (anderweitig als Polysorbat 80 für Polyoxyethylen-20-sorbitanmonooleat bekannt), obwohl verstanden werden sollte, daß jedes der oben erwähnten Tenside geeignet ist, nachdem das Fehlen von Toxizität gezeigt ist.
Eine "Emulsions-stabilisierende Menge eines Tensids auf Glycolether-Basis" wird in der Regel durch die Anwesenheit des Tensids in einer Menge von 0,05 bis 5 % bewirkt. Eine Menge von 0,2 % bis 1 % ist bevorzugt.

HERSTELLUNG

Die Komponenten des Adjuvans der Erfindung können durch kommerzielle Quellen erhalten werden oder können durch einen Durchschnitts-Fachmann hergestellt werden.
Die Tetra-Polyole können durch das in dem U.S.-Patent Nr. 2979528 offenbarte Verfahren hergestellt werden oder können kommerziell von BASF-Wyandotte unter dem Warenzeichen Tetronic erhalten werden.
Die Tenside auf Glycolether-Basis PEG 200, 300, 400, 600 und 900, Span , Arlacel , Tween , Myrj , Brij und dergleichen sind kommerziell ohne weiteres von ICI, America's Inc., Wilmington, Delaware, und anderen erhältlich.
Die nicht-toxischen metabolisierbaren Öle sind aus einer Vielfalt von Quellen erhältlich: zum Beispiel sind Squalan und Squalen von Aldrich Chemical Co. erhältlich.
Die MDPs können kommerziell aus Quellen, wie beispielsweise Sigma Chemical Co., erhalten werden oder können hergestellt werden, indem man den in Audibert et al., U.S.-Pat. Nr. 4158052; Audibert et al., U.S.-Pat. Nr. 4220637; Audibert et al., U.S.-Pat. Nr. 4323559; Baschang et al., U.S.-Pat. Nr. 4323560; Baschang et al., U.S.-Pat. Nr. 4409209; Baschang et al., U.S.-Pat. Nr. 4423038; Derrien et al., U.S.-Pat. Nr. 4185089; Hartmann et al., U.S.-Pat. Nr. 4406889; Jones et al., U.S.-Pat. Nr. 4082735; Jones et al., U.S.-Pat. Nr. 4082736; Le Francier et al., U.S.-Pat. Nr. 4427659; Le Francier et al., U.S.-Pat. Nr. 4461761; Yamamura et al., U.S.-Pat. Nr. 4314998; Yamamura et al., U.S.-Pat. Nr. 4101536; und Yamamura et al., U.S.-Pat. Nr. 4369178, offenbarten Verfahren folgt, die hier alle durch Bezugnahme eingeschlossen sind.
Das Adjuvans wird durch Emulgierung unter Verwendung eines Mischers hergestellt. Wenn das Adjuvans im Labor-Maßstab unter Verwendung eines Tetra-Polyols zur sofortigen Verwendung hergestellt werden soll, kann es einfach von Hand gemischt werden. Zum Beispiel werden Tween 80 und gepufferte Salzlösung zu Squalan und Tetronic 1501 in ein Test-Röhrchen in zweifacher Konzentration gegeben, und die Kombination wird unter Verwendung eines Wirbelmischers gemischt, wobei eine Emulsion gebildet wird. Zu dieser wird eine zweifache Lösung von Antigen und MDP in gepufferter Salzlösung gegeben, wobei der vollständige Impfstoff gebildet wird. Die Verwendung eines Mischers mit großer Scherkraft, wie beispielsweise eines Greerco-Homogenizer-Mixers, ist bevorzugter, um eine gleichmäßigere, homogenere Emulsion zu bilden.
Bevorzugt wird die Adjuvans-Emulsion vor der Zugabe des Antigens "mikro-fluidifiziert".
Normalerweise wird das MDP nach der Emulgierungsstufe zugegeben. Wenn die Emulsion vor der Zugabe des MDPs und des Antigens aufbewahrt werden soll, kann dies unter Kühlung und/oder unter Stickstoff erfolgen.
Die entstandene Emulsion kann auf vielfältige Arten untersucht werden, die in dem Fachgebiet allgemein bekannt sind. Die Stabilität der Emulsion kann gemessen werden, indem man die Emulsion bei Raumtemperatur und unter Kühlung stehenläßt und nachfolgend hinsichtlich einer Phasentrennung beobachtet. Diese Untersuchung kann durch Zentrifugieren der Emulsion, z.B. zwei Stunden bei 4500 g, beschleunigt werden.
Die Teilchengröße kann zum Beispiel durch optische Mikroskopie, Transmissions-Elektronen-Mikroskopie und Verfahren der Laser-Licht-Streuung, bevorzugt unter Verwendung von Laser- Photonen-Korrelations-Spektroskopie (PCS) bestimmt werden. Eine PCS-Analyse kann zum Beispiel unter Verwendung eines Gerätes zur Teilchengrößenbestimmung mit Laser Nicomp Modell 200 mit einem Autokorrelator-Rechner Modell TC-100 durchgeführt werden.
Die biologische Wirksamkeit kann unter Verwendung von Labor-Standard-Verfahren untersucht werden, indem z.B. ein Standard-Labor-Tier (z.B. ein Meerschweinchen) mit einem Standard-Antigen (z.B. BSA oder DNP-BSA) unter Verwendung einer Test-Adjuvans-Formulierung geimpft wird. Nachdem man die Impfung eine Zeit wirken und die Immunisierung sich eine Zeit entwickeln ließ, wird das Tier mit dem Standard-Antigen gereizt, und die Ergebnisse werden gemessen. Die Antwort kann durch irgendeine in dem Fachgebiet zur Messung von Immunantworten anerkannte Maßnahme, z.B. in Form von Serum-Antikörper-Titer gegen das Standard-Antigen (für humorale Immunität) und einer Haut- Test-Reaktion (für zeilvermittelte Immunität), quantitativ bestimmt werden.

VERABREICHUNG

Für einen Durchschnitts-Fachmann ist es offensichtlich, daß die genauen Mengen an MDP-Derivat und Antigen, die zur Erzeugung einer bestimmten Wirkung benötigt werden, mit den speziellen Verbindungen und Antigenen und mit der Größe, dem Alter und der Krankheit des zu behandelnden Patienten variieren. Somit ist es unmöglich, die benötigten Mengen genau anzugeben, wobei jedoch diese Mengen unter Verwendung von Verfahren, die den Durchschnitts-Fachleuten bekannt sind, leicht bestimmt werden können.
Die Adjuvantien und Impfstoffe der Erfindung werden im allgemeinen durch Injektion, speziell intramuskuläre Injektion, bevorzugt in einen großen Muskel, verabreicht.
Im allgemeinen wird unter Verwendung des gewünschten Antigens und der Formulierung der Erfindung eine Erstimpfung verabreicht. Die Impfung wird mehrere Wochen später (in der Regel 2-6 Wochen, zum Beispiel 4-6 Wochen) unter Verwendung eines Impfstoffes der Erfindung mit oder ohne (bevorzugt mit) der MDP-Komponente "aufgefrischt". Im allgemeinen werden bei der Anwendung der Erfindung 1-2 ml eines Impfstoffes (wie beispielsweise in den Beispielen unten beschrieben) einem Human- Patienten verabreicht.
Die folgenden Beispiele werden als Hilfe für Durchschnitts-Fachleute dargestellt und sollen keineswegs als Einschränkung der Erfindung angesehen werden.

BEISPIEL 1

(Immunogenität)

(A) Herstellung der Formulierungen:

Adjuvans-Formulierungen wurden zur Untersuchung der biologischen Wirksamkeit wie folgt hergestellt. Jede Emulsion wurde vor der Vereinigung mit einer zweifachen Lösung eines Antigens in zweifacher Konzentration hergestellt.

Formulierung 1

(von Allison, U.S. 4606918): 5,0 % Pluronic L121, 10 % Squalan, 0,4 % Tween 80, aM Phosphat-gepufferte Salzlösung (pH 7,4); die Komponenten wurden in ein Test-Röhrchen gegeben und mit einem Wirbelmischer gemischt, bis eine milchige Emulsion erhalten wurde. Diese Formulierung wurde unmittelbar vor der Verabreichung hergestellt.

Formulierung 2

(Tetra-Polyol-Formulierung der Erfindung): 5,0 % Tetronic 1501, 10 % Squalan, 0,4 % Tween 80, aM Phosphat-gepufferte Salzlösung (pH 7,4); die Komponenten wurden in ein Test-Röhrchen gegeben und mit einem Wirbelmischer gemischt, bis eine milchige Emulsion erhalten wurde.
Anschließend wurde festes N-Acetylmuramyl-L-threonyl-D- isoglutamin (Thr-MDP) bis zu einer Konzentration von 500 µg/ml zu jeder Formulierung gegeben, um das vollständige Adjuvans-"Konzentrat" zu bilden. Das Konzentrat wurde anschließend mit einer Lösung eines Antigens (Ovalbumin in Salzlösung, 1 mg/ml) in zweifacher Konzentration gemischt, um einen Test-Impfstoff zu bilden.

(B) Bio-Wirksamkeit:

0,2 ml jedes Test-Impfstoffes wurden 8 weiblichen Meerschweinchen verabreicht. Vier Wochen nach der Verabreichung erfolgte an jedem Tier eine Auffrischung mit demselben Test-Impfstoff (jedoch ohne das Thr-MDP). Der Antikörper-Titer wurde in Serum-Proben gemessen, die 4 und 6 Wochen nach der ersten Verabreichung entnommen wurden. Nach 6 Wochen erhielt jedes Tier Ovalbumin intradermal, und der Durchmesser des Erythems und die Stärke der Infiltration wurden nach 24 Stunden als ein Anzeichen zellvermittelter Immunität bestimmt.
Die Ergebnisse sind in den Tabellen 1 und 2 angegeben. Jede Eintragung stellt den aus 8 Tieren erhaltenen Mittelwert dar. Antikörper-Titer wurden durch Hämagglutination bestimmt. Die Infiltration wurde auf einer Skala von 1-3 visuell bewertet (wobei 1 die schwächste Antwort war, und 3 eine sehr deutliche Schwellung an der Test-Stelle der Haut darstellte). TABELLE 1 Ergebnisse der Antikörper-Titer TABELLE 2 Ergebnisse der zellvermittelten Immunität Die Ergebnisse zeigen, daß die Tetra-Polyol-Adjuvantien die Immunogenität von Antigenen deutlich effektiver erhöhen.

BEISPIEL 2

(Formulierungen)
Beispiele von Adjuvans-Formulierungen wurden wie folgt hergestellt:

(A) Tetronic /Thr-MDP:

Tetronic 1501 2,5 g
Squalan 5,0 g
Tween 80 0,2 g
Thr-MDP 250,0 mg
Phosphat-gepufferte Salzlösung aM auf 100,0 ml
Das Tetronic 1501, Squalan und Tween 80 werden in ein geeignetes Gefäß mit 85 ml Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS) gegeben und werden mit einem mechanischen Mischer (Greerco Homogenizer-Mixer Modell #1L-79, Greerco Corp., Hudson, New Hampshire) bei etwa 4750 UpM etwa 30-60 Minuten gemischt. Anschließend werden das Thr-MDP (N-Acetylmuramyl-L- threonyl-D-isoglutamin) und die restlichen 15 ml PBS eingerührt, wobei eine Adjuvans-Formulierung der Erfindung hergestellt wird.
(B) Indem man wie in Teil (A) oben vorgeht, jedoch das Thr-MDP durch N-Acetylmuramyl-L-α-aminobutyryl-D-isoglutamin (Abu-MDP), 6-O-Stearoyl-N-acetylmuramyl-L-α-aminobutyryl-D- isoglutamin (Abu-MDP-Stearat), N-Acetylmuramyl-L-valyl-D-isoglutamin (Val-MDP), N-Acetylmuramyl-L-alanyl-D-isoglutamin (MDP), N-Acetyldesmethylmuramyl-L-alanyl-D-isoglutamin (desMe- MDP), N-Acetylmuramyl-L-alanyl-D-glutaminbutylester (Murabutid), N-Butyrylmuramyl-L-(α-aminobutyryl)-D-isoglutamin und N- Acetylmuramyl-L-seryl-D-isoglutamin (Ser-MDP) ersetzt, werden ähnlich die entsprechenden Adjuvans-Formulierungen hergestellt.

(C) Tetronic /Murabutid:

Tetronic 1501 2,0 g
Squalan 6,0 g
Brij 80 0,3 g
Murabutid 300,0 mg
Phosphat-gepufferte Salzlösung aM auf 100,0 ml
Die Formulierung wird wie in Teil (A) oben beschrieben hergestellt.
(D) Indem man vorgeht, wie in den Teilen (A)-(C) oben beschrieben, jedoch Tetronic 1501 durch Tetronic 1301 ersetzt, werden ähnlich die entsprechenden Adjuvantien hergestellt.
(E) Impfstoffe: Impfstoffe der Erfindung werden durch die Zugabe einer geeigneten Menge an Antigen zu irgendeiner der oben beschriebenen Formulierungen hergestellt. Geeignete Antigene schließen Antigene für Hepatitis B, Influenza (zum Beispiel A oder B), AIDS und Herpes ein. Der Impfstoff kann, wenn gewünscht, mehr als ein Antigen enthalten, zum Beispiel können Antigene für Diphtherie, Keuchhusten und Tuberkulose in einer Einzelformulierung gemeinsam verabreicht werden.
Zwecks Einfachheit der Herstellung kann ein kleiner Teil des verwendeten PBS von der Adjuvans-Zubereitung zurückgehalten werden, z.B. kann man die oben beschriebenen Adjuvantien unter Verwendung von 90 ml statt 100 ml herstellen, und das zurückgehaltene PBS zum Lösen/Suspendieren des Antigens (der Antigene) verwenden. Die Antigen/PBS-Lösung wird anschließend zur Herstellung des endgültigen Impfstoffes mit der (schwach) konzentrierten Emulsion gemischt. Alternativ und bevorzugter wird eine Adjuvans-Emulsion (ohne MDP) zweifacher Konzentration mit einer Antigen/MDP-Lösung zweifacher Konzentration gemischt.

Claims

1. Adjuvans in Form einer Emulsion mit in einer kontinuierlichen wäßrigen Phase dispergierten Öl-Teilchen zur Potenzierung der Immunogenität eines Antigens, wobei das Adjuvans umfaßt:

eine Emulsions-bildende Menge eines nicht-toxischen N,N,N',N'-Tetra(polyoxypropylen-polyoxyethylen)-1,2- diaminoethan-Block-Polymers ("Tetra-Polyols"); und eine immunpotenzierende Menge eines Glycopeptids.

2. Adjuvans nach Anspruch 1 in Form einer Emulsion mit in einer kontinuierlichen wäßrigen Phase dispergierten Öl- Teilchen zur Potenzierung der Immunogenität eines Antigens, wobei das Adjuvans umfaßt:

eine Emulsions-bildende Menge eines nicht-toxischen Tetra-Polyols;

gegebenenfalls eine Emulsions-bildende Menge eines nichttoxischen metabolisierbaren Öls;

eine Emulsions-stabilisierende Menge eines Tensids auf Glycolether-Basis;

Wasser oder wäßrige Lösung; und

eine immunpotenzierende Menge eines Muramyldipeptid- Derivats der Formel (I)

und der pharmazeutisch annehmbaren Salze davon, worin R und R&sub1; jeweils unabhängig für H oder Acyl mit 1 bis 22 Kohlenstoffatomen stehen;

R&sub2; Alkyl oder Aryl, gegebenenfalls mit Halogen, Nitro oder Niederalkyl substituiert, darstellt;

R&sub3; H, Alkyl oder Aryl repräsentiert;

R&sub4; H oder Niederalkyl bedeutet;

X für L-Alanyl, L-α-Aminobutyryl, L-Arginyl, L-Asparginyl, L-Aspartyl, L-Cysteinyl, L-Glutaminyl, L-Glutamyl, Glycyl, L-Histidyl, L-Hydroxyprolyl, L-Isoleucyl, L- Leucyl, L-Lysyl, L-Methionyl, L-Ornithinyl, L-Phenylalanyl, L-Prolyl, L-Seryl, L-Threonyl, L-Tyrosyl, L- Tryptophanyl oder L-Valyl steht; und

Y D-Glutamin, D-Isoglutamin oder D-Isoasparagin ist.

3. Adjuvans nach Anspruch 1 oder 2, in welchem das Tetra- Polyol Tetronic 1501 ist, welches ein durchschnittliches Molekulargewicht des Polyoxypropylen (POP) -Abschnitts von 6500 - 7000 und einen Prozentsatz an Polyoxyethylen (POE) von 10% aufweist.

4. Adjuvans nach Anspruch 3, welches ein nicht-toxisches metabolisierbares Öl einschließt, wobei das Öl Squalen oder Squalan ist.

5. Adjuvans nach Anspruch 3 oder 4, in welchem das Tensid auf Glycolether-Basis Tween 80 ist.

6. Adjuvans nach Anspruch 3, 4 oder 5, in welchem das Wasser oder die wäßrige Lösung isotone gepufferte Salzlösung umfaßt.

7. Adjuvans nach irgendeinem der Ansprüche 2 - 6, in welchem es sich bei dem Muramyl-Dipeptid-Derivat der Formel I handelt um:

N-Acetylmuramyl-L-threonyl-D-isoglutamin,

N-Acetylmuramyl-L-α-aminobutyryl-D-isoglutamin,

6-O-Stearoyl-N-acetylmuramyl-L-α-aminobutyryl-D-isoglutamin,

N-Acetylmuramyl-L-valyl-D-isoglutamin,

N-Acetylmuramyl-L-alanyl-D-isoglutamin,

N-Acetyl-desmethylmuramyl-L-alanyl-D-isoglutamin,

N-Acetylmuramyl-L-alanyl-D-glutaminbutylester,

N-Acetylmuramyl-L-seryl-D-isoglutamin oder N-Butyrylmuramyl-L-α-aminobutyryl-D-isoglutamin.

8. Adjuvans nach irgendeinem der vorangehenden Ansprüche in Form einer Emulsion vom Öl-in-Wasser-Typ, die in einer kontinuierlichen wäßrigen Phase dispergierte Öl-Teilchen aufweist, zur Potenzierung der Immunogenität eines Antigens, wobei das Adjuvans umfaßt:

ein nicht-toxisches Tetra-Polyol in einer Menge von 0,2 bis 49%;

ein nicht-toxisches metabolisierbares Öl in einer Menge von 0 - 15%;

ein Tensid auf Glycolether-Basis in einer Menge von 0,05 - 5%;

Wasser oder eine wäßrige Lösung; und 0,0001 - 10% eines Muramyldipeptid-Derivats der Formel I.

9. Adjuvans nach Anspruch 8 in Form einer Emulsion vom Öl- in-Wasser-Typ, die in einer kontinuierlichen wäßrigen Phase dispergierte Öl-Teilchen aufweist, zur Potenzierung der Immunogenität eines Antigens, wobei das Adjuvans umfaßt:

Tetronic 1501 in einer Menge von 1 - 10%;

Squalan oder Squalen in einer Menge von 1 - 10%;

Tween 80 in einer Menge von etwa 0,2%;

isotone gepufferte Salzlösung; und

0,0001 - 10% N-Acetylmuramyl-L-threonyl-D-isoglutamin.

10. Impfstoff in Form einer Emulsion vom Öl-in-Wasser-Typ, die in einer kontinuierlichen wäßrigen Phase dispergierte Öl-Teilchen aufweist, zur Immunisierung eines Tieres, wobei der Impfstoff umfaßt:

eine immunogene Menge eines Antigens; und

ein Adjuvans nach irgendeinem der Ansprüche 1 - 9.

11. Verfahren zur Herstellung des Adjuvans nach irgendeinem der Ansprüche 1 - 9, umfassend das Zusammenmischen der wäßrigen Phase und der Emulsions-bildenden Menge des nicht-toxischen Tetra-Polyols, um eine Emulsion zu bilden.

12. Verfahren nach Anspruch 11, in welchem das Glycopeptid der Mischung nach Bildung der Emulsion zugegeben wird.

13. Verfahren zur Herstellung des Impfstoffs nach Anspruch 10, umfassend das Mischen des Antigens mit dem Adjuvans.

14. Satz zur extemporalen Herstellung eines Adjuvans nach irgendeinem der Ansprüche 1 - 9, umfassend:

einen ersten Behälter, der die Emulsion des Tetra- Polyols in der wäßrigen Phase enthält; und

einen zweiten Behälter, der das Glycopeptid enthält.

15. Satz nach Anspruch 14 zur extemporalen Herstellung eines Adjuvans der Erfindung, umfassend:

einen ersten Behälter, der eine Emulsion vom Öl-in- Wasser-Typ enthält, die in einer kontinuierlichen wäßrigen Phase dispergierte Öl-Teilchen aufweist, wobei die Emulsion Tetronic 1501, Squalan oder Squalen, Tween 80 und isotone gepufferte Salzlösung enthält, und

einen zweiten Behälter, der N-Acetylmuramyl-L-threonyl- D-isoglutamin enthält;

wobei die Konzentrationen der Komponenten in jedem Behälter so gewählt sind, daß die Vereingung des Inhalts beider Behälter eine Formulierung liefert, die Tetronic 1501 in einer Menge von 1 - 30%, Squalan oder Squalen in einer Menge von 1 - 30%, Tween 80 in einer Menge von etwa 0,2 - 5%, 0,0001 - 30% N-Acetylmuramyl-L-threonyl- D-isoglutamin und isotone gepufferte Salzlösung umfaßt.

16. Satz zur extemporalen Herstellung eines Impfstoffs nach Anspruch 10, umfassend:

einen zweiten Behälter, der das Antigen enthält; wobei das Glycopeptid in einem dritten Behälter oder in dem ersten oder zweiten Behälter anwesend sein kann.

17. Satz nach Anspruch 16 zur extemporalen Herstellung eines Impfstoffs der Erfindung, umfassend:

einen ersten Behälter, der eine Emulsion vom Öl-in- Wasser-Typ enthält, die in einer kontinuierlichen wäßrigen Phase dispergierte Öl-Teilchen aufweist, wobei die Emulsion Tetronic 1501, Squalan oder Squalen, Tween 80 und isotone gepufferte Salzlösung umfaßt; und

einen zweiten Behälter, der N-Acetylmuramyl-L-threonyl- D-isoglutamin und eine immunogene Menge eines Antigens enthält;

wobei die Konzentrationen der Komponenten in jedem Behälter so gewählt sind, daß die Vereinigung des Inhalts der beiden Behälter eine Formulierung liefert, die Tetronic 1501 in einer Menge von 1 - 10%, Squalan oder Squalen in einer Menge von 1 - 10%, Tween 80 in einer Menge von etwa 0,2%, 0,0001 - 10% N-Acetylmuramyl-L- threonyl-D-isoglutamin, eine immunogene Menge eines Antigens und isotone gepufferte Salzlösung umfaßt.