DE69010574T2

DE69010574T2 - Hilfsmittelformulierung die eine Emulsion mit submikronischen Oeltropfen enthält.

Info

Publication number: DE69010574T2
Application number: DE69010574T
Authority: DE
Inventors: Gail Barchfeld; Gary Ott; Nest Gary Van
Original assignee: Chiron Corp
Current assignee: Novartis Vaccines and Diagnostics Inc
Priority date: 1989-05-25
Filing date: 1990-05-25
Publication date: 1994-10-27
Anticipated expiration: 2010-05-26
Also published as: JPH0832638B2; US20090191226A2; CA2017507C; ES2033626T3; HK107695A; US6451325B1; PT94168B; EP0399843A2; DD294633A5; US20030147898A1; ATE108327T1; HUT61203A; ES2033626T1; EP0399843B1; IE901903L; DK0399843T5; IE64766B1; DE69010574D1; CA2017507A1; US6299884B1

Description

Einführung

Technischer Hintergrund

Diese Erfindung betrifft im allgemeinen immunologische Adjuvanzien zur Verwendung in der Erhöhung der Wirksamkeit von Impfstoffen und betrifft insbesondere Adjuvanzien, die Öl-in- Wasser-Emulsionen umfassen.

Hintergrund

Das Aufkommen der neuen Untereinheiten-Impfstoffe, die durch rekombinante DNA-Technologien hergestellt werden, hat die Notwendigkeit für sichere und wirksame Adjuvanzien verstärkt. Traditionelle antivirale Lebendimpfstoffe benötigen keine Adjuvanzien. Abgetötete Virusimpfstoffe sind im allgemeinen viel immunogener als Untereinheiten-Impfstoffe und können sowohl ohne Adjuvanzien als auch mit Adjuvanzien wirksam sein, die eine beschränkte Fähigkeit haben Immunantworten zu stimulieren. Obwohl die neuen Untereinheiten-Impfstoffe, die von rekombinanter DNA stammen, wichtige Vorteile gegenüber den traditionellen Impfstoffen in Hinsicht auf Sicherheit und Produktionskosten bieten, stellen sie im allgemeinen isolierte Proteine oder Gemische von Proteinen dar, die im Vergleich zu ganzen Viren eine begrenzte Immunogenität aufweisen. Solche Substanzen werden in dieser Beschreibung im allgemeinen als molekulare Antigene bezeichnet, um sie von den ganzen Organismen (und Teilen davon) zu unterscheiden, die vorher in Impfstoffen verwendet wurden. Diese Impfstoffe brauchen Adjuvanzien mit bedeutenden imunstimulierenden Fähigkeiten, um bei der Verhütung einer Krankheit ihre volle Wirkung zu erreichen.
Die gegenwärtig in den Vereinigten Staaten für die Verwendung beim Menschen einzigen zugelassenen Adjuvanzien sind Aluminiumsalze (Alaun). Diese Adjuvanzien waren für einige Impfstoffe nützlich, einschließlich solcher gegen Hepatitis B, Diphtherie, Polio, Tollwut und Grippe; aber sie sind möglicherweise für andere Impfstoffe nicht nützlich, besonders, wenn für den Schutz die Stimulierung einer zellvermittelten Immunität notwendig ist. Berichte zeigen, daß Alaun die Wirksamkeit der Keuchhusten- und Typhusimpfstoffe nicht verbessert und nur eine schwache Wirkung bei Adenovirus-Impfstoffen bereitstellt. Die Probleme mit Aluminiumsalzen schließen die Induktion von Granulomen an der Injektionstelle und Unterschiede in den Chargen der Alaunpräparationen ein.
Komplettes Freundsches Adjuvans (CFA) ist ein starker Immunstimulator, der auf experimenteller Grundlage erfolgreich mit vielen Antigenen verwendet wurde. CFA umfaßt drei Komponenten: ein Mineralöl, einen Emulgator, wie Arlacel A, und abgetötete Mycobakterien, wie Mycobacterium tuberculosis. Wäßrige Antigenlösungen werden mit diesen Komponenten gemischt, um eine Wasser-in-Öl-Emulsion herzustellen. Jedoch verursacht CFA schwere Nebenwirkungen, wie Schmerz, Abzessbildung und Fieber, die seine Verwendung in Impfstoffen für den Mensch oder für Tiere verhindert. Diese Nebenwirkungen sind primär auf die Reaktionen des Wirts auf die mycobakterielle Komponente des CFA's zurückzuführen. Unvollständiges Freundsches Adjuvans (IFA) entspricht CFA, jedoch ohne die bakterielle Komponente. Während IFA für die Verwendung in den Vereinigten Staaten nicht zugelassen ist, war es in anderen Ländern für mehrere Impfstofftypen nützlich. IFA wurde erfolgreich in Grippe- und Polioimpfstoffen beim Menschen verwendet und in mehreren Tierimpfstoffen, einschließlich solcher gegen Tollwut, Hundestaupe und Maul- und Klauenseuche. Experimente haben gezeigt, daß sowohl das im IFA verwendete Öl als auch der Emulgator Tumoren in Mäusen verursachen können; dies zeigt, daß ein anderes Adjuvans für die Verwendung beim Menschen eine bessere Wahl wäre.
Muramyldipeptid (MPD) ist die kleinste Einheit des mycobakteriellen Zellwandkomplexes, die die mit CFA beobachtete Adjuvansaktivität hervorruft; vgl. Ellouz et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 59 (1974), 1317. Viele synthetische Analoge von MDP wurden erzeugt, die einen großen Bereich von Adjuvanswirksamkeit und Nebenwirkungen zeigen (Übersicht in Chedid et al., Prog. Allergy 25 (1978), 63). Drei Analoge, die als Impfstoffadjuvanzien besonders nützlich sein können, sind Threonylderivate von MDP; vgl. Byars et al., Vaccine 5 (1987), 223; n-Butylderivate von MDP; vgl. Chedid et al., Infect. and Immun. 35 (1982), 417; und lipophile Derivate von Muramyltripeptid; vgl. Gisler et al. in Immunomodulations of Microbial Products and Related Synthetic Compounds, Y. Yamamura und S. Kotani, Hrsg., Excerpta Medica, Amsterdam (1985), Seite 167. Diese Verbindungen stimulieren wirksam die humorale und zellvermittelte Immunität und zeigen niedrige Toxizitätswerte.
Ein vielversprechendes lipophiles Derivat von MDP ist N-Acetylmuramyl-L-alanyl-D-isoglutaminyl-L-alanin-2-[1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-3(hydroxyphosphoryloxy)]ethylamid (MTP- PE). Dieses Muramyltripeptid weist Phospholipidschwänze auf, die die Assoziation des hydrophoben Teils des Moleküls mit einer Lipidumgebung ermöglichen, während der Muramylpeptidteil mit der wäßrigen Umgebung assoziiert. So kann das MTP-PE selbst als ein Emulgator fungieren, um stabile Öl-in-Wasser- Emulsionen zu bilden.
Ursprüngliche Experimente mit Mäusen in den Laboratorien der Erfinder mit MTP-PE zeigten, daß dieses Adjuvans bei der Stimulierung von anti-HSV-gD-Antikörpertitern gegen das Herpes-simplex-Virus-gD-Antigen wirksam war und daß die Wirksamkeit in hohem Maße verbessert wurde, wenn MTP-PE und gD in Öl (IFA) und nicht in wäßriger Lösung verabreicht wurden. Da IFA nicht für den menschlichen Gebrauch zugelassen ist, wurden andere Verabreichungssysteme auf Ölbasis für MTP-PE und Antigen untersucht. Eine Emulsion von 4% Squalen mit 0,008% Tween 80 und HSV-gD ergab beim Meerschweinchen eine sehr gute Immunität. Diese Formulierung, MTP-PE-LO ("low oil", niedriger Ölgehalt), wurde mit einer Injektionsnadel emulgiert und war sehr instabil. Trotzdem ergab diese Formulierung beim Meerschweinchen hohe Antikörpertiter und einen guten Schutz der immunisierten Meerschweinchen bei einer HSV-Exposition. Die Formulierung war am wirksamsten, wenn sie in den Fußballen verabreicht wurde, ergab aber auch vernünftige Antikörpertiter und Schutz, wenn sie intramuskulär verabreicht wurde. Diese Daten erschienen in 2 Veröffentlichungen (Sanchez-Pescador et al., J. Immunology 141 (1988), 1720-1727 und Technological Advances in Vaccine Development, Lasky et al. (1988), Hrsg., Alan R. Liss, Inc., Seiten 445-469). Die MTP-PE-LO-Formulierung war ebenfalls in Meerschweinchen bei der Stimulierung der Immunantwort auf das in Hefe hergestellte HIV-Hüll-Protein wirksam. Mit der MTP-PE-Formulierung wurden sowohl ELISA-Antikörpertiter als auch Virus-neutralisierende Antikörpertiter auf einen hohen Wert stimuliert. Wurde jedoch die gleiche Formulierung in großen Tieren, wie Ziegen und Pavianen, getestet, waren die Zusammensetzungen nicht so wirksam. Der Bedarf an weiteren Adjuvansformulierungen für die Verwendung mit molekularen Antigenen bei Menschen und anderen großen Tieren ist offensichtlich.

Zusammenfassung der Erfindung

Ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist somit eine Adjuvansformulierung bereitzustellen, die zur Stimulierung von Immunantworten auf molekulare Antigene bei großen Säugetieren geeignet ist.
Überraschend wurde festgestellt, daß eine zufriedenstellende Adjuvansformulierung durch eine Zusammensetzung bereitgestellt wird, die ein metabolisierbares Öl und einen Emulgator umfaßt, wobei das Öl und der Emulgator in Form einer Öl-in-Wasser-Elmusion mit Öltröpfchen vorliegen, die im wesentlichen alle weniger als 1 um Durchmesser aufweisen und wobei die Zusammensetzung kein Blockcopolymer umfaßt. Von solchen Blockcopolymeren nahm man vorher an, daß sie für die Herstellung von submikromischen Öl-in-Wasser-Emulsionen wesentlich sind. Die Zusammensetzung kann auch einen Immunstimulator enthalten (der dem Emulgator entsprechen kann, wenn ein amphipathischer Immunstimulator gewählt wird).

Beschreibung besonderer Ausführungsformen

Die vorliegende Erfindung stellt eine Adjuvanszusammensetzung bereit, umfassend ein metabolisierbares Öl und einen Emulgator, wobei das Öl und der Emulgator in Form einer Öl-in-Wasser-Emulsion mit Öltröpfchen vorliegen, die im wesentlichen alle weniger als 1 um Durchmesser aufweisen. Untersuchungen in den Laboratorien der Erfinder, die in den folgenden Beispielen ausführlich beschrieben werden, zeigen eine überraschende Überlegenheit gegenüber Adjuvanszusammensetzungen, die ein Öl und Emulgatoren enthalten, in denen die Öltröpfchen bedeutend größer sind als jene, die durch die vorliegende Erfindung bereitgestellt werden.
Die einzelnen Komponenten der erfindungsgemäßen Adjuvanszusammensetzungen sind bekannt, obgleich solche Zusammensetzungen nicht in der gleichen Weise zusammengestellt und in einer Tröpfchengröße mit einem solchen kleinen Durchmesser bereitgestellt wurden. Folglich sind die einzelnen Komponenten, obwohl nachstehend allgemein und für bevorzugte Ausführungsformen ausführlicher beschrieben, auf dem Fachgebiet gut bekannt; und die hier verwendeten Begriffe, wie metabolisierbares Öl, Emulgator, Immunstimulator, Muramylpeptid und lipophiles Muramylpeptid sind hinreichend gut bekannt, um diese Verbindungen einem Fachmann ohne weitere Angabe zu beschreiben.
Eine Komponente dieser Formulierungen ist ein metabolisierbares nicht-toxisches Öl, vorzugsweise ein Öl mit 6 bis 30 Kohlenstoffatomen, einschließlich, aber nicht darauf begrenzt, Alkane, Alkene, Alkine und ihre entsprechenden Säuren und Alkohole; Ether und Ester davon sowie Gemische davon. Das Öl kann jedes Pflanzenöl, Fischöl, tierisches Öl oder synthetisch hergestelltes Öl sein, das durch den Körper des Patienten metabolisiert werden kann, dem das Adjuvans verabreicht wird und das für den Patienten nicht-toxisch ist. Der Patient ist ein Tier, üblicherweise ein Säugetier und vorzugsweise ein Mensch. Mineralöl und ähnlich toxische Petroleumdestillatöle sind ausdrücklich von dieser Erfindung ausgeschlossen.
Die erfindungsgemäße Ölkomponente kann jedes langkettige Alkan, Alken oder Alkin sein, oder ein Säure- oder Alkoholderivat davon, entweder als freie Säure, ihr Salz oder ein Ester, wie Mono-, Di- oder Triester, wie die Triglyceride und Ester von 1,2-Propandiol oder ähnliche Polyhydroxyalkohole. Alkohole können unter Verwendung einer mono- oder polyfunktionellen Säure acyliert werden, zum Beispiel Essigsäure, Propionsäure, Citronensäure oder einer ähnlichen Säure. Ether, die von langkettigen Alkoholen stammen, die Öle sind und andere vorgegebene Kriterien erfüllen, können hier ebenfalls verwendet werden.
Die einzelne Alkan-, Alken- oder Alkineinheit, ihre Säure- oder Alkoholderivate weisen 6 bis 30 Kohlenstoffatome auf. Die Einheit kann eine gerade oder verzweigte Kettenstruktur aufweisen. Sie kann völlig gesättigt sein oder eine oder mehrere Doppel- oder Dreifachbindungen aufweisen. Wo Mono- oder Polyester- oder etherbasierende Öle verwendet werden, betrifft die Beschränkung auf 6 bis 30 Kohlenstoffatome die einzelnen Fettsäure- oder Fettalkoholeinheiten, nicht aber die gesamte Kohlenstoffzahl.
Jedes metabolisierbares Öl, insbesondere tierischer oder pflanzlichen Herkunft sowie aus Fisch, kann hier verwendet werden. Es ist wesentlich, daß das Öl durch den Wirt, dem es verabreicht wird, metabolisiert wird, sonst kann die Ölkomponente Abszesse, Granulome oder sogar Karzinome verursachen, oder (bei Verwendung in der tierärztlichen Praxis) das Fleisch geimpfter Vögel und Tiere für den menschlichen Verzehr unbrauchbar machen, was auf die schädliche Wirkung, die das nicht-metabolisierte Öl auf den Konsumenten haben kann, zurückzuführen ist.
Quellen für Pflanzenöle schließen Nüsse, Samen und Getreide ein. Erdnußöl, Sojabohnenöl, Kokosöl und Olivenöl sind Beispiele für die im Handel am meisten erhältlichen Nußöle. Samenöle schließen Färberdistelöl, Baumwollsamenöl, Sonnenblumenkernöl, Sesamsamenöl und ähnliche Öle ein. In der Getreidegruppe ist Kornöl am leichtesten erhältlich; aber das Öl anderer Getreidefrüchte, wie Weizen, Hafer, Roggen, Reis, Abessinisches Liebesgras, Triticale (Hybrid aus Roggen und Weizen, "Triticale") und ähnlicher kann ebenfalls verwendet werden.
Die Technologie zur Gewinnung von Pflanzenölen ist gut entwickelt und gut bekannt. Die Zusammensetzungen dieser und anderer ähnlicher Öle kann beispielsweise dem Merck Index entnommen werden sowie den Materialquellen für Lebensmittel, Ernährung und die Lebensmitteltechnologie.
Die Fettsäureester von Glycerin und 1,2-Propandiol mit 6 bis 10 Kohlenstoffatomen können, da sie nicht natürlich in Samenölen vorkommen, ausgehend von den Nuß- und Samenölen durch Hydrolyse, Trennung und Veresterung der entsprechenden Substanzen hergestellt werden. Diese Produkte sind im Handel unter dem Namen NEOBEE von PVO-International, Inc., Chemical Specialties Division, 416 Division Street, Boongon, NJ und von anderen erhältlich.
Öle jedes tierischen Ursprungs können in den erfindungsgemäßen Adjuvanzien und Impfstoffen verwendet werden. Tierische Öle und Fette sind bei physiologischen Temperaturen meistens aufgrund der Tatsache fest, daß sie als Triglyceride vorliegen und einen höheren Sättigungsgrad als Öle aus Fisch oder Pflanzen aufweisen. Trotzdem können Fettsäuren aus tierischen Fetten durch partielle oder vollständige Triglyceridverseifung gewonnen werden, die die freien Fettsäuren liefert. Fette und Öle aus Säugetiermilch sind metabolisierbar und können deshalb erfindungsgemäß verwendet werden. Verfahren zur Trennung, Reinigung, Verseifung und andere notwendige Mittel zur Gewinnung von reinen Ölen aus tierischen Quellen sind auf dem Fachgebiet gut bekannt.
Die meisten Fische enthalten metabolisierbare Öle, die einfach gewonnen werden können. Zum Beispiel veranschaulichen Lebertran, Haileberöle und Walöl, wie Walrat, mehrere der Fischöle, die hier verwendet werden können. Eine Anzahl von Ölen mit verzweigten Ketten wird biochemisch in Isopreneinheiten mit 5 Kohlenstoffatomen synthetisiert; diese werden im allgemeinen bezeichnet als Terpenoide. Haileberöl enthält das verzweigte ungesättigte Terpenoid 2,6,10,15,19,23-Hexamethyl- 2,6,10,14,18,22-tetracosahexaen, bekannt als Squalen, das hier besonders bevorzugt wird. Squalan, das gesättigte Analog zu Squalen, ist ebenfalls ein besonders bevorzugtes Öl. Fischöle, einschließlich Squalen und Squalan, sind problemlos im Handel erhältlich und können durch Verfahren, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, gewonnen werden.
Die Ölkomponente dieser Adjuvanzien und Impfstofformulierungen liegt in einer Menge von 0,5 bis 20 Vol.-% vor, aber vorzugsweise von nicht mehr als 15% und besonders in einer Menge von 1% bis 12%. Besonders bevorzugt ist die Verwendung von 1% bis 4% Öl.
Der wäßrige Anteil dieser Adjuvanszusammensetzungen ist gepufferte Kochsalzlösung, oder in bevorzugten Ausführungsformen reines Wasser. Da diese Zusammensetzungen für die parenterale Verabreichung bestimmt sind, werden bevorzugt gepufferte Endlösungen hergestellt, die als Impfstoffe verwendet werden, so daß die Tonizität, d.h. die Osmolalität, im wesentlichen gleich ist wie in normalen physiologischen Flüssigkeiten, um eine postadministrative Schwellung oder eine schnelle Absorption der Zusammensetzung aufgrund der unterschiedlichen Ionenkonzentrationen zwischen der Zusammensetzung und den physiologischen Flüssigkeiten zu verhindern. Vorzugsweise wird die Kochsalzlösung auch gepuffert, um einen pH-Wert aufrechtzuerhalten, der mit normalen physiologischen Bedingungen vereinbar ist. In bestimmten Fällen kann es ebenfalls notwendig sein, den pH bei einem bestimmten Wert zu halten, um die Stabilität bestimmter Komponenten der Zusammensetzung, wie der Glycopeptide, zu gewährleisten.
Jeder physiologisch verträgliche Puffer kann hier verwendet werden, aber Phosphatpuffer werden bevorzugt. Andere verträgliche Puffer, wie Acetat-, Tris-, Bicarbonat-, Carbonat- oder ähnliche Puffer, können als Ersatz für Phosphatpuffer verwendet werden. Der pH-Wert der wäßrigen Komponente liegt vorzugsweise zwischen 6,0 und 8,0.
Wird das Adjuvans zuerst hergestellt, wird jedoch reines Wasser als wäßrige Komponente der Emulsion bevorzugt. Eine Erhöhung der Salzkonzentration macht es viel schwieriger, die gewünschte kleine Tröpfchengröße zu erzielen. Wird die Endformulierung des Impfstoffs aus dem Adjuvans hergestellt, kann das antigenische Material in einem Puffer mit einer entsprechenden Osmolalität zugesetzt werden, um die gewünschte Impfstoffzusammensetzung bereitzustellen.
Die Menge der in diesen Zusammensetzungen verwendeten wäßrigen Komponente, ist diejenige Menge, die dazu notwendig ist, den Wert der Zusammensetzung auf eine Einheit zu bringen. Das heißt, eine Menge der wäßrigen Komponente, welche ausreicht, um 100% zu ergeben, wird mit den vorstehend aufgeführten Bestandteilen gemischt, um die Zusammensetzungen auf das gewünschte Volumen zu bringen.
In der Pharmazie wird im allgemeinen eine beträchtliche Anzahl von Emulgatoren und Suspendiermitteln verwendet. Diese schließen natürliche Substanzen ein, wie Gummis von Bäumen, pflanzliches Protein, Polymere auf Zuckerbasis, wie Alginate und Cellulose, und ähnliche Substanzen. Bestimmte Oxypolymere oder Polymere, die ein Hydroxid oder einen anderen hydrophilen Substituenten im Kohlenstoffgerüst aufweisen, weisen eine Grenzflächenaktivität auf, zum Beispiel Povidon, Polyvinylalkohol und mono- und polyfunktionelle Verbindungen auf Glycoletherbasis. Langkettige Verbindungen, die von Fettsäuren stammen, bilden eine dritte umfangreiche Gruppe von Emulgatoren und Suspensionsmitteln, die in dieser Erfindung verwendet werden könnten. Jedes der erwähnten grenzflächenaktiven Mittel ist verwendbar, so lange es nicht-toxisch ist.
Spezifische Beispiele geeigneter Emulgatoren (auch bezeichnet als grenzflächenaktive Mittel oder Detergentien), die erfindungsgemäß verwendet werden können, schließen die folgenden ein:
1. Wasserlösliche Seifen, wie die Natrium-, Kalium-, Ammonium- und Alkanolammoniumsalze der höheren Fettsäuren (C&sub1;&sub0;-C&sub2;&sub2;) und besonders Natrium- und Kaliumtalg und Kokosnußseifen.
2. Anionische synthetische Nichtseifen-Detergentien, die wasserlösliche Salze organischer Reaktionsprodukte der Schwefelsäure sein können, die in ihrer molekularen Struktur ein Alkylradikal aufweisen, das etwa 8 bis 22 Kohlenstoffatome enthält und ein Radikal, ausgewählt aus der Gruppe der Sulfonsäure- und Schwefelsäureesterradikale. Beispiele dieser Detergentien sind die Natrium- oder Kaliumalkylsulfate, die von Talk oder Kokosnußöl stammen; Natrium- oder Kaliumalkylbenzolsulfonate; Natriumalkylglycerylethersulfonate; Natriummonoglyceridsulfonate und -sulfate der Kokosnußölfettsäure; Natrium- oder Kaliumsalze der Schwefelsäureester des Reaktionsprodukts von einem Mol eines höheren Fettalkohols und etwa 1 bis 6 Mol Ethylenoxid; Natrium- oder Kaliumalkylphenolethylenoxidethersulfonate, mit 1 bis 10 Einheiten Ethylenoxid pro Molekül, in denen die Alkylradikale 8 bis 12 Kohlenstoffatome enthalten; das Reaktionsprodukt von Fettsäuren, verestert mit Isaethionsäure und neutralisiert mit Natriumhydroxid; Natrium- oder Kaliumsalze des Fettsäureamids eines Methyltaurids; sowie Natrium- und Kaliumsalze SO&sub3;-sulfonierter C&sub1;&sub0;-C&sub2;&sub4;-α-Olefine.
3. Nichtionische synthetische Detergentien, die durch Kondensation der Alkylenoxidreste mit einer organischen hydrophoben Verbindung hergestellt werden. Typische hydrophobe Gruppen schließen Kondensationsprodukte von Propylenoxid mit Propylenglycol ein, ferner Alkylphenole, das Kondensationsprodukt von Propylenoxid und Ethylendiamin, aliphatische Alkohole, die 8 bis 22 Kohlenstoffatome aufweisen, und Amide der Fettsäuren.
4. Nichtionische Detergentien, wie Aminoxide, Phosphinoxide und Sulfoxide, die semipolare Eigenschaften aufweisen. Spezifische Beispiele der langkettigen tertiären Aminoxide schließen Dimethyldodecylaminoxid und Bis-(2-hydroxyethyl)dodecylamin ein. Spezifische Beispiele der Phosphinoxide sind im US-Patent 3,304,263 zu finden, das am 14. Februar 1967 erteilt wurde und schließen Dimethyldodecylphosphinoxid und Dimethyl-(2-hydroxydodecyl)phosphinoxid ein.
5. Langkettige Sulfoxide, einschließlich solchen, die der Formel R¹-SO-R² entsprechen, wobei R¹ und R² substituierte oder nicht-substituierte Alkylradikale sind; R¹ enthält etwa 10 bis etwa 28 Kohlenstoffatome, wohingegen R² 1 bis 3 Kohlenstoffatome enthält. Spezifische Beispiele dieser Sulfoxide schließen Dodecylmethylsulfoxid und 3-Hydroxytridecylmethylsulfoxid ein.
6. Ampholytische synthetische Detergentien, wie Natrium-3-dodecylaminopropionat und Natrium-3-dodecylaminopropansulfonat.
7. Zwitterionische synthetische Detergentien, wie 3-(N,N-Dimethyl-N-hexadecylammonio)propan-1-sulfonat und 3-(N,N-Dimetyl-N-hexadecylammonio)-2-hydroxypropan-1-sulfonat.
Zusätzlich können alle folgenden Typen von Emulgatoren in einer erfindungsgemäßen Zusammensetzung verwendet werden: (a) Seifen (d.h. Alkalisalze) der Fettsäuren, Harzsäuren und des Tallöls; (b) Alkylarensulfonate; (c) Alkylsulfate, einschließlich grenzflächenaktiver Mittel mit verzweigtkettigen und geradkettigen hydrophoben Gruppen sowie primären und sekundären Sulfatgruppen; (d) Sulfate und Sulfonate mit einer intermediären Verknüpfung der hydrophoben und hydrophilen Gruppen, wie die acylierten Methylfetttauride und die sulfierten Fettmonoglyceride; (e) langkettige Säureester von Polyethylenglycol, besonders die Tallölester; (f) Polyethylenglycolether von Alkylphenolen; (g) Polyethylenglycolether von langkettigen Alkoholen und Mercaptanen und (h) Fettacyldiethanolamide. Da grenzflächenaktive Mittel nach mehr als einer Weise klassifiziert werden können, überschneidet sich eine Anzahl der in diesem Abschnitt dargelegten Klassen von grenzflächenaktiven Mitteln mit vorher beschriebenen Klassen von grenzflächenaktiven Mitteln.
Es gibt eine Anzahl von Emulgatoren, die speziell für biologische Bedürfnisse entwickelt wurden und im allgemeinen dafür verwendet werden. Zum Beispiel ist eine Anzahl biologischer Detergentien (grenzflächenaktiver Mittel) auf den Seiten 310-316 des Katalogs Biochemischer und Organischer Verbindungen der Sigma Chemical Company von 1987 aufgeführt. Solche grenzflächenaktiven Mittel werden in vier Grundtypen eingeteilt: anionische, kationische, zwitterionische und nicht- ionische. Beispiele der anionischen Detergentien schließen Alginsäure, Cabrylsäure, Cholsäure, 1-Decansulfonsäure, Desoxycholsäure, 1-Dodecansulfonsäure, N-Lauroylsarcosin und Taurocholsäure ein. Kationische Detergentien schließen Dodecyltrimethylammoniumbromid, Benzalkoniumchlorid, Benzyldimethylhexadecylammoniumchlorid, Cetylpyridiniumchlorid, Methylbenzethoniumchlorid und 4-Picolindodecylsulfat ein. Beispiele der zwitterionischen Detergentien schließen 3-[(3-Cholamidopropyl)-dimethylammonio]-1-propansulfonat (allgemein abgekürzt als CHAPS), 3-[(Cholamidopropyl)-dimethylammonio]-2-hydroxy-1-propansulfonat (im allgemeinen abgekürzt als CHAPSO), N-Dodecyl-N,N-dimethyl-3-ammonium-1- propansulfonat und Lyso-α-phosphatidylcholin ein. Beispiele nicht-ionischer Detergentien schließen Decanoyl-N-methylglucamid, Diethylenglycolmonopentylether, n-Dodecyl-β-D-glucopyranosid, Ethylenoxid-Kondensate von Fettalkoholen (zum Beispiel, diejenigen, welche unter der Handelsbezeichnung Lubrol verkauft werden), Polyoxyethylenether von Fettsäuren (besonders C&sub1;&sub2;-C&sub2;&sub0;-Fettsäuren), Polyoxyethylensorbitanfettsäureether (zum Beispiel, diejenigen, welche unter der Handelsbezeichnung Tween verkauft werden) und Sorbitanfettsäureether ein (zum Beispiel, diejenigen, welche unter der Handelsbezeichnung Span verkauft werden).
Eine besonders nützliche Gruppe der grenzflächenaktiven Mittel sind die nicht-ionischen grenzflächenaktiven Mittel auf Sorbitan-Basis. Diese grenzflächenaktive Mittel werden durch Dehydrierung von Sorbit hergestellt, wobei 1,4-Sorbitan erhalten wird, das dann mit einem oder mehreren Äquivalenten einer Fettsäure umgesetzt wird. Die Fettsäure-substituierte Einheit kann weiter mit Ethylenoxid umgesetzt werden, wobei eine zweite Gruppe von grenzflächenaktiven Mitteln erhalten wird.
Die Fettsäure-substituierten grenzflächenaktiven Sorbitane werden hergestellt durch Umsetzung von 1,4-Sorbitan mit einer Fettsäure, wie Laurinsäure, Palmitinsäure, Stearinsäure, Ölsäure oder einer ähnlichen langkettigen Fettsäure, wobei der 1,4-Sorbitanmonoester, 1,g-Sorbitansesquiester oder 1,4-Sorbitantriester erhalten wird. Die verbreiteten Namen dieser grenzflächenaktiven Mittel schließen zum Beispiel ein Sorbitanmonolaurat, Sorbitanmonopalmitat, Sorbitanmonostearat Sorbitanmonooleat, Sorbitansesquioleat und Sorbitantrioleat ein. Diese grenzflächenaktiven Mittel sind im Handel unter dem Namen SPAN oder ARLACEL erhältlich; üblicherweise mit einer Buchstaben- oder Zahlenbezeichnung, die zwischen den verschiedenen Mono-, Di- und Triester-substituierten Sorbitanen unterscheiden.
Die grenzflächenaktiven Mittel SPAN und ARLACEL sind hydrophil und im allgemeinen in Öl löslich oder dispergierbar. Sie sind auch in den meisten organischen Lösungsmitteln löslich. In Wasser sind sie im allgemeinen unlöslich aber dispergierbar. Im allgemeinen weisen diese grenzflächenaktiven Mittel eine hydrophil-lipophil-Gleichgewichtszahl ("hydrophilic- lipophilic balance number", HLB) zwischen 1,8 und 8,6 auf. Solche grenzflächenaktiven Mittel können einfach durch auf dem Fachgebiet bekannte Mittel hergestellt werden oder sind im Handel zum Beispiel unter der registrierten Marke ATLAS , von ICI America's Inc., Wilmington, DE, erhältlich.
Eine verwandte Gruppe von grenzflächenaktiven Mitteln umfaßt Polyoxyethylensorbitanmonoester und Polyoxyethylensorbitantriester. Diese Substanzen werden durch Zugabe von Ethylenoxid zu einem 1,4-Sorbitanmonoester oder -triester hergestellt. Die Zugabe von Polyoxyethylen wandelt den lipophilen grenzflächenaktiven Sorbitanmono- oder triester in ein hydrophiles grenzflächenaktives Mittel um, das im allgemeinen in Wasser löslich oder dispergierbar und in organischen Flüssigkeiten in unterschiedlichen Graden löslich ist.
Diese im Handel unter der Marke TWEEN erhältlichen Substanzen sind für die Herstellung von Öl-in-Wasser-Emulsionen und Dispersionen nützlich oder für die Solubilisierung von Ölen und um wasserfreie Salben wasserlöslich oder abwaschbar zu machen. Die grenzflächenaktiven Mittel TWEEN können mit verwandten grenzflächenaktiven Sorbitanmono- oder triestern. kombiniert werden, um die Emulsionsstabilität zu erhöhen. Die grenzflächenaktiven Mittel TWEEN weisen im allgemeinen einen HLB-Wert auf, der zwischen 9,6 und 16,7 liegt. Die grenzflächenaktiven Mittel TWEEN sind im Handel von einer Vielzahl von Herstellern erhältlich, zum Beispiel von ICI America's Inc., Wilmington, DE unter der registrierten Marke ATLAS .
Eine dritte Gruppe von nicht-ionischen grenzflächenaktiven Mitteln, die allein oder in Verbindung mit den grenzflächenaktiven Mitteln SPAN , ARLACEL und TWEEN verwendet werden können, sind die Polyoxyethylenfettsäuren, die durch die Umsetzung von Ethylenoxid mit einer langkettigen Fettsäure hergestellt werden. Das am besten erhältliche grenzflächenaktive Mittel diesen Typs wird unter dem Namen MYRJ verkauft und ist ein Polyoxyethylenderivat der Stearinsäure. Die grenzflächenaktiven Mittel MYRJ sind hydrophil und, wie die grenzflächenaktiven Mittel TWEEN , in Wasser löslich oder dispergierbar. Die grenzflächenaktiven Mittel MYRJ können mit grenzflächenaktiven Mitteln TWEEN oder mit grenzflächenaktiven TWEEN /SPAN - oder ARLACEL -Gemischen vermischt werden, um Emulsionen zu erzeugen. Die grenzflächenaktiven Mittel MYRJ können durch Verfahren, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, hergestellt werden oder sie sind im Handel von ICI America's Inc. erhältlich.
Eine vierte Gruppe der nicht-ionischen grenzflächenaktiven Mittel auf Polyoxyethylen-Basis sind die Polyoxyethylenfettsäureether, die von Lauryl-, Acetyl-, Stearyl- und Oleylalkoholen stammen. Diese Substanzen werden, wie vorstehend beschrieben, durch die Zugabe von Ethylenoxid zu einem Fettalkohol hergestellt. Der Handelsname für diese grenzflächenaktiven Mittel ist BRIJ . Die grenzflächenaktiven BRIJ -Mittel können hydrophil oder lipophil sein, abhängig von der Größe der Polyoxyethyleneinheit in dem grenzflächenaktiven Mittel. Obwohl die Herstellung dieser Verbindungen auf dem Fachgebiet möglich ist, sind sie auch einfach im Handel, wie von ICI America's Inc., erhältlich.
Andere nicht-ionische grenzflächenaktiven Mittel, die möglicherweise bei dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden könnten, sind zum Beispiel Polyoxyethylen, Polyolfettsäureester, Polyoxyethylenether, Polyoxypropylenfettether, Bienenwachsderivate, die Polyoxyethylen enthalten, Polyoxyethylenlanolinderivate, Polyoxyethylenfettglyceride, Glycerinfettsäureester oder andere Polyoxyethylensäurealkohol- oder -etherderivate von langkettigen Fettsäuren mit 12 bis 22 Kohlenstoffatomen.
Da das Adjuvans und die erfindungsgemäßen Impfstofformulierungen als Mehrphasensyteme bestimmt sind, wird vorzugsweise ein Emulsion-erzeugendes, nicht-ionisches grenzflächenaktives Mittel gewählt, das einen HLB-Wert im Bereich von etwa 7 bis 16 aufweist. Dieser Wert kann durch die Verwendung eines einzelnen nicht-ionischen grenzflächenaktiven Mittels, wie ein TWEEN , erhalten werden oder kann durch die Verwendung einer Mischung von grenzflächenaktiven Mitteln erzielt werden, z.B., mit einem grenzflächenaktiven Mittel auf der Basis eines Sorbitanmono-, di- oder -triesters; einer Sorbitanesterpolyoxyethylenfettsäure; einem Sorbitanester in Kombination mit einem von Polyoxyethylenlanolin-stammenden grenzflächenaktiven Mittel; einem grenzflächenaktiven Sorbitanester in Kombination mit einem grenzflächenaktiven Polyoxyethylenfettether mit einem hohen HLB-Wert; oder einem grenzflächenaktiven Polyethylenfettether oder einer Polyoxyethylensorbitanfettsäure.
Bei der erfindungsgemäßen Ausführung wird die Verwendung eines einzelnen, nicht-ionischen grenzflächenaktiven Mittels, insbesondere von TWEEN , als Emulsion-stabilisierendes nicht-ionisches grenzflächenaktives Mittel stärker bevorzugt. Das von den vorhergehenden grenzflächenaktiven Mitteln am meisten bevorzugte ist das als TWEEN 80 bezeichnete grenzflächenaktive Mittel, auch bekannt als Polysorbat 80 oder Polyoxyethylen-20-Sorbitanmonooleat.
Eine ausreichende Reduzierung der Tröpfchengröße kann üblicherweise durch das Vorliegen des grenzflächenaktiven Mittels in einer Menge von 0,02 bis 2,5 Gew.-% erreicht werden. Eine Menge von 0,05 bis 1 Gew.-% wird bevorzugt, wobei 0,01% bis 0,5% besonders bevorzugt wird.
Die Weise, auf die die erfindungsgemäße Tröpfchengröße erreicht wird, ist für die erfindungsgemäße Ausführung nicht wichtig. Eine Weise, auf die submikromische Öltröpfchen erhalten werden können, ist durch Verwendung eines im Handel erhältlichen Emulgators, wie des Modells Nr. 11OY, erhältlich von Microfluidics, Newton, MA. Beispiele für andere im Handel erhältliche Emulgatoren schließen das Gaulin Modell 30CD (Gaulin, Inc., Everett, MA) und Rainnie Minilab Typ 8.30H (Miro Atomizer Food and Dairy, Inc., Hudson, WI) ein. Diese Emulgatoren arbeiten mit dem Prinzip hoher Scherkräfte, die entwickelt werden, indem die Flüssigkeiten unter hohem Druck durch kleine Öffnungen getrieben werden. Wenn das Modell 11OY bei 5000-30 000 psi arbeitet, werden Öltröpfchen mit einem Durchmesser von 100-750 nm bereitgestellt.
Die Größe der Öltröpfchen kann variiert werden durch Änderung des Verhältnisses von Detergens zu Öl (das Erhöhen des Verhältnisses verringert die Tröpfchengröße), des Arbeitsdrucks (das Erhöhen des Arbeitsdrucks reduziert die Tröpfchengröße), der Temperatur (das Erhöhen der Temperatur verringert die Tröpfchengröße) und durch die Zugabe eines amphipathischen Immunstimulators (die Zugabe solcher Mittel verringert die Tröpfchengröße). Die tatsächliche Tröpfchengröße variiert mit dem einzelnen Detergens, Öl, Immunstimulator (falls einer verwendet wird) und mit den besonderen gewählten Arbeitsbedingungen. Die Tröpfchengröße kann durch die Verwendung von Größenmeßinstrumenten, wie dem im Handel erhältlichen Sub-Micron Particle Analyzer (Modell N4MD), hergestellt durch die Coulter Corporation, kontrolliert werden und die Parameter können unter Verwendung der vorstehend festgelegten Richtlinien variiert werden, bis im wesentlichen alle Tröpfchen weniger als 1 um Durchmesser aufweisen, vorzugsweise weniger als 0,8 um Durchmesser und besonders bevorzugt weniger als 0,5 um Durchmesser. Mit dem Ausdruck "im wesentlichen alle Tröpfchen" sind mindestens 80% der Tröpfchen (Anzahl) gemeint, vorzugsweise mindestens 90%, stärker bevorzugt mindestens 95% und am meisten bevorzugt mindestens 98%. Die Partikelgrößenverteilung entspricht üblicherweise einer Gauss-Verteilung, so daß der durchschnittliche Durchmesser kleiner ist als die festgesetzten Grenzen.
Die vorliegende Erfindung wird durch Herstellung einer Öl-Emulsion in Abwesenheit anderer Komponenten ausgeführt, von denen vorher entsprechend dem Stand der Technik gelehrt wurde, daß sie mit submikromischen Emulsionen zu verwenden sind, um eine zufriedenstellende Immunogenität zu erzielen; nämlich Polyoxypropylen-Polyoxyethylen-Blockpolymere, wie jene, die für die Verwendung mit Adjuvanzien in den US-Patenten 4,772,466 und 4,770,874 und in der Europäischen Patentanmeldung A2-0315153 beschrieben wurden.
Eine erfindungsgemäße Adjuvanszusammensetzung besteht im wesentlichen aus einem metabolisierbaren Öl in Wasser und einem anderen Emulgator als einem POP-POE-Copolymer. Der Emulgator muß keine spezifische immunstimulierende Aktivität aufweisen, da die Ölzusammensetzung selbst als Adjuvans wirken kann, wenn die Öltröpfchen im submikromischen Bereich liegen. Eine verstärkte immunstimulierende Aktivität kann jedoch durch Einschließen jedes bekannten Immunstimulators in die Zusammensetzung geschaffen werden. Diese Immunstimulatoren können entweder von dem Emulgator und dem Öl verschieden sein, oder der Immunstimulator und der Emulgator können ein und dasselbe Molekül sein. Beispiele für den ersten Fall schließen metabolisierbare Öle ein, gemischt mit abgetöteten Mycobakterien, wie Mycobacterium tuberculosis, und subzellulären Komponenten davon. Weitere immunstimulierende Stoffe schließen die Muramylpeptide ein, die Komponenten der Zellwände solcher Bakterien sind. Eine Anzahl der bevorzugten Muramylpeptide sind nachstehend aufgeführt. Beispiele für den zweiten Fall, den vereinigten Emulgator/Immunstimulator, sind die lipophilen Muramylpeptide, die in den beiden vorstehend zitierten Publikationen von Sanchez-Pescador et al. beschrieben wurden. Diese Substanzen umfassen das basische N-Acetylmuramylpeptid (eine hydrophile Einheit), das als immunstimulierende Gruppe wirkt, schließen aber ebenfalls eine lipophile Einheit ein, die die grenzflächenaktiven Eigenschaften der erhaltenen Verbindung schafft. Solche Verbindungen, sowie andere Typen von amphipathischen immunstimulierenden Stoffen, wirken sowohl als Immunstimulatoren als auch als Emulgatoren und werden in der erfindungsgemäßen Ausführung bevorzugt. Zusätzlich ist es auch möglich, die vorliegende Erfindung unter Verwendung eines amphipathischen immunstimulierenden Stoffes in Kombination mit einem zweiten immunstimulierenden Stoff auszuführen, der nicht amphipathisch ist. Ein Beispiel wäre die Verwendung eines lipophilen Muramylpeptids in Kombination mit einem im wesentlichen unsubstituierten (d.h. im wesentlichen hydrophilen) Muramyldipeptid.
Die bevorzugten erfindungsgemäßen, die Immunantwort stimulierenden Muramylpeptide (oder noch genauer Glycopeptide) sind eine Gruppe von Verbindungen, die verwandt ist mit und im allgemeinen abstammt von N-Acetylmuramyl-L-alanyl-D-isoglutamin, das durch Ellouz et al., Biochem. & Biophys. Res. Comm. 59 (4), (1974), 1317, als kleinste wirksame Einheit in M. tuberculosis, dem mycobakteriellen Bestandteil des kompletten Freundschen Adjuvans, bestimmt wurde, die eine immunologische Adjuvansaktivität besitzt. Eine Anzahl von Dipeptid- und Polypeptid-substituierten Muraminsäurederivaten wurden anschließend entwickelt und es wurde festgestellt, daß sie eine immunstimulierende Aktivität aufweisen.
Obwohl diese Glycopeptide eine heterogene Gruppe von Verbindungen sind, können sie allgemein durch die nachstehende Formel I dargestellt werden:
in der die Sauerstoffatome des Pyranrings durch ein Wasserstoffatom, einen Alkyl- oder Acylrest oder ähnliches substituiert sind, oder können durch Substituenten auf Stickstoffbasis ersetzt sein; besonders das Sauerstoffatom in der Position 6. Die 2-Aminogruppe ist ein Acylrest oder ein anderes Amid; die Lactylseitenkette ist modifiziert und ist zum Beispiel eine Ethylgruppe oder einen anderen Alkylrest in der 2-Stellung. Das Peptid ist ein Dipeptid oder ein Polypeptid, das weiter derivatisiert sein kann. Furanosylanaloge der Pyranosylverbindungen weisen ebenfalls eine immunpotenzierende Aktivität auf und sind in dieser Erfindung nützlich.
Unter den erfindungsgemäßen Glycopeptiden sind jene Disaccharide und Tetrasaccharide, die durch meso-α-&epsi;-Diaminopimelinsäure verknüpft sind, wie in den US-Patenten 4,235,771 und 4,186,194 beschrieben.
Glycopeptide, die die Immunantwort stimulieren, die bei der erfindungsgemäßen Ausführung verwendet werden können, sind offenbart in den US-Patenten 4,094,971; 4,101,536; 4,153,684; 4,235,771; 4,323,559; 4,327,085; 4,185,089; 4,082,736; 4,369,178; 4,314,998; 4,082,735 und 4,186,194. Die in diesen Patenten offenbarten Glcyopeptide sind hier durch Bezugnahme eingeschlossen und sind als ein Teil dieser Beschreibung anzusehen, so als wenn sie hier vollständig offenbart worden wären. Die Verbindungen der Japanischen Patentanmeldungen JP 40792227, JP 4079228 und JP 41206696 wären bei der erfindungsgemäßen Ausführung ebenfalls nützlich.
Verfahren zur Herstellung dieser Verbindungen sind offenbart und auf dem Fachgebiet gut bekannt. Ein Beispiel für ein Herstellungsverfahren kann in den US-Patenten 4,082,736 und 4,082,735 gefunden werden. Zusätzlich können ähnliche Herstellungsverfahren in den im vorangegangenen Abschnitt erwähnten US-Patenten gefunden werden.
Bevorzugte Glycopeptide sind jene mit der Formel II:
in der
R ein unsubstituiertes oder substituiertes Alkylradikal mit 1 bis 22 Kohlenstoffatomen oder ein unsubstituiertes oder substituiertes Arylradikal mit 6 bis 10 Kohlenstoffatomen ist;
R¹ und R² gleich oder verschieden sind und ein Wasserstoffatom oder ein Acylradikal mit 1 bis 22 Kohlenstoffatomen darstellen;
R³ ein Wasserstoffatom, einen Alkylrest mit 1 bis 22 Kohlenstoffatomen oder einen Arylrest mit 7 bis 10 Kohlenstoffatomen bedeutet;
R&sup4; ein Wasserstoffatom oder ein Alkylrest ist;
n den Wert 0 oder 1 hat;
X und Z unabhängig voneinander eine Alanyl-, Valyl-, Leucyl-, Isoleucyl-, α-Aminobutyryl-, Threonyl-, Methionyl-, Cysteinyl-, Glutamyl-, Glutaminyl-, Isoglutamyl-, Isoglutaminyl-, Aspartyl-, Phenylalanyl-, Tyrosyl-, Lysyl-, Ornithinyl-, Arginyl-, Histidyl-, Asparaginyl-, Prolyl-, Hydroxyprolyl-, Seryl- oder eine Glycylgruppe darstellen;
R&sup5; eine gegebenenfalls veresterte oder amidierte Carboxylgruppe der terminalen Aminosäure ist; und
Y den Rest -NHCHR&sup6;CH&sub2;CH&sub2;CO- bedeutet, wobei R&sup6; eine gegebenenfalls veresterte oder amidierte Carboxylgruppe darstellt.
Der Alkylrest ist, wenn nicht anders angegeben, ein gerades oder verzweigtes Radikal, das 1 bis 7 Kohlenstoffatome umfaßt; beispielhaft erläutert durch eine Methyl-, Ethyl-, Propyl-, Butyl-, Pentyl-, Hexyl- oder Heptylgruppe oder ein Isomer. Der Niederalkylrest stellt ein Radikal mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen dar.
Eine gegebenenfalls veresterte oder amidierte Carboxylgruppe ist entweder die Carboxylgruppe selbst oder eine Carboxylgruppe, die mit einem Niederalkanolrest verestert ist, wie Methanol, Ethanol, Propanol, Butanol oder der Carbamoylgruppe, die am Stickstoffatom unsubstituiert oder durch einen Alkylrest monosubstituiert oder disubstituiert ist, besonders durch einen Niederalkyl- oder Arylrest, insbesondere eine Phenylgruppe oder einen Arylalkylrest und besonders durch eine Benzylgruppe. Die Carbamoylgruppe kann ebenfalls mit einem Alkylidenradikal substituiert sein, wie einem Butyliden- oder Pentylidenradikal. Zusätzlich kann auch der R&sup5;-Rest der Carbamoylgruppe am Stickstoffatom mit einer Carbamoylmethylgruppe substituiert sein.
Besonders bevorzugte Verbindungen der Formel II sind jene, wobei R und R¹ gleich oder verschieden sind und ein Wasserstoffatom oder ein Acylradikal mit 1 bis 22 Kohlenstoffatomen darstellen; R² eine Methylgruppe bedeutet; R³ ein Wasserstoffatom ist; X eine L-Alanylgruppe darstellt; Y eine D-Isoglutaminylgruppe bedeutet und n den Wert 0 hat.
Eine andere bevorzugte Gruppe der Glycopeptide sind die Verbindungen der Formel II, in denen R und R¹ ein Wasserstoffatom oder einen Acylrest mit 1 bis 22 Kohlenstoffatomen darstellen; R² eine Methylgruppe ist; R³ ein Wasserstoffatom bedeutet; R&sup4; eine Methyl- oder Butylgruppe ist und X eine L-Valyl-, L-Seryl-, L-Alanyl-, L-Threonyl oder L-α-Aminobutyrylgruppe darstellt.
Spezifische Beispiele schließen die folgenden Verbindungen ein:
N-Acetylmuramyl -L-α-aminobutyryl -D- isoglutamin;
6,0-Stearoyl-N-acetylmuramyl-L-α-aminobutyryl- D-isoglutamin;
N-Acetylmuramyl-L-threonyl-D-isoglutamin;
N-Acetylmuramyl-L-valyl-D-isoglutamin;
N-Acetylmuramyl-L-alanyl-D-glutamin-n-butylester;
N-Acetyl-desmethyl-D-muramyl-L-alanyl-D-isoglutamin;
N-Acetylmuramyl-L-alanyl-D-glutamin;
N-Acetylmuramyl-L-seryl-D-isoglutamin;
N-Acetyl(butylmuramyl)-L-α-aminobutyl-D-isoglutamin; und
N-Acetyl(butylmuramyl)-L-alanyl-D-isoglutamin.
Eine wirksame Menge des immunstimulierenden Glycopeptids ist die Menge, wenn sie in Verbindung mit einem Antigen verabreicht wird, die eine Erhöhung des Antikörpertiterwerts über den Titerwert bewirkt, der beobachtet wurde, wenn das Glycopeptid nicht in Kombination verabreicht wurde (typischerweise im Bereich von 0,0001 bis 10% der gesamten Zusammensetzung). Wie erwartet werden kann, kann jedes Glycopeptid einen wirksamen Dosisbereich aufweisen, der sich von dem anderer Glycopeptide unterscheidet. Deshalb kann kein einzelner Dosisbereich angegeben werden, der genau auf jedes mögliche Glycopeptid innerhalb des erfindungsgemäßen Schutzumfangs paßt. Trotzdem kann als allgemeine Regel angegeben werden, daß das Glycopeptid in dem Impfstoff vorzugsweise in einer Menge zwischen 0,001 und 5% (Gew./Vol.) vorliegt. Eine stärker bevorzugte Menge ist 0,01 bis 3% (Gew./Vol.).
Die meisten der vorstehend besprochenen immunstimulierenden Glycopeptide sind im wesentlichen hydrophile Verbindungen. Folglich sind sie für die Verwendung mit einem davon verschiedenen Emulgator bestimmt (der, wie vorstehend besprochen, ebenfalls ein Immunstimulator sein kann). In einigen Fällen weisen die vorstehend beschriebenen Verbindungen einen lipophilen Charakter auf, wie die Verbindungen, die Fettsäuresubstituenten und/oder Arylsubstituenten an der Zuckereinheit umfassen; besonders jene, die ein oder mehrere Acylradikale mit 14 bis 22 Kohlenstoffatomen aufweisen und insbesondere jene, die mehr als einen solchen Acylsubstituenten enthalten. Es ist jedoch ebenfalls möglich, in einem Muramylpeptid einen lipophilen Charakter durch Bereitstellung einer Lipideinheit zu erzielen, die über die Carboxylatgruppe oder die Seitenketten der Peptideinheit gebunden ist. Insbesondere stellen Lipidgruppen, die an die Peptideinheit über die terminale Carboxylatgruppe gebunden sind, eine bevorzugte Gruppierung von Verbindungen dar. Diese Verknüpfung kann einfach entweder direkt geschaffen werden, wie durch Bildung einer Esterbindung zwischen der terminalen Carboxylatgruppe und einem Fettalkohol mit 14 bis 22 Kohlenstoffatomen, oder unter Verwendung einer bifunktionellen Verknüpfungsgruppe, wie Ethanolamin, um die Carboxylatgruppe entweder über eine Ester- oder eine Amidbindung an das Lipid zu binden. Bei dieser erfindungsgemäßen Ausführungsform sind besonders Phospholipide bevorzugt, da die Phosphatgruppen eine einfach zu verknüpfende funktionelle Gruppe bereitstellen. Diacylphosphoglyceride stellen eine solches einfach zu verknüpfendes Phospholipid bereit. Phosphatidylethanolamin, eine leicht erhältliche, natürlich vorkommende Verbindung, kann einfach an die terminale Carboxylatgruppe der Peptideinheit über eine Amidbindung gebunden werden. Andere Lipide, die an die terminale Carboxylgruppe gebunden werden können, schließen Acylglycerine, Phosphatidylcholin, Phosphatidylserin, Phosphatidylinosit, Phosphatidylglycerin, Cardiolipin und Sphingomyelin ein.
Eine Anzahl der bevorzugten amphipathischen immunstimulierenden Peptide weisen die nachstehende Formel III auf:
in der R, R¹-R&sup4;, X, Y, Z und n die vorstehend beschriebenen Bedeutungen aufweisen. L stellt eine Lipideinheit dar, wie die vorstehend beschriebenen Lipideinheiten.
Zusammenfassend stellen die Muraminsäureeinheit und die Peptideinheit des Moleküls zusammen eine hydrophile Einheit bereit. Eine lipophile Einheit liegt ebenfalls in dem Molekül vor; die Lipophilizität wird im allgemeinen durch eine langkettige Kohlenwasserstoffkette geschaffen, die typischerweise in Form einer Fettsäure vorliegt. Die Fettsäure oder andere Radikal-enthaltende Kohlenwasserstoffe können an die Hydroxylgruppe des Zuckers oder an den Peptidanteil des Moleküls entweder direkt gebunden werden, wie durch Umsetzen einer Fettsäure mit einer freien Aminogruppe, die in der Peptideinheit vorliegt, oder über eine Verbindungsgruppe, wie ein Hydroxyalkylamin, das eine Verbindung zwischen einer Carbonsäuregruppe des Peptids und einer funktionellen Gruppe im Lipid, wie einer Phosphatgruppe, durch Erzeugen einer Amidbindung bildet. Phospholipideinheiten werden besonders für die Erzeugung lipophiler Muramylpeptide bevorzugt. Eine Gruppe der bevorzugten Verbindungen schließt Muramyldipeptide und -tripeptide ein, die an eine Phospholipideinheit über eine Hydroxyalkylamineinheit gebunden sind. Ein Beispiel und eine besonders bevorzugte Verbindung ist N-Acetylmuramyl-L-alanyl- D-isoglutaminyl-L-alanin-2-[1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3- (hydroxyphosphoryloxy)]ethylamid (abgekürzt MTP-PE).
Die Adjuvansformulierungen werden im allgemeinen vor dem Kombinieren des Adjuvans mit dem Antigen, das in dem Impfstoff verwendet wird, aus den vorstehend beschriebenen Bestandteilen hergestellt. Das Wort Antigen bezieht sich auf jeden Stoff, einschließlich einem Protein oder einem Protein- Polysaccharid, einem Protein-Lipopolysaccharid, einem Polysaccharid, einem Lipopolysaccharid, einer viralen Untereinheit, einem ganzen Virus oder ganzen Bakterien, der, wenn er für den Blutstrom des Tieres fremd ist, beim Zutritt zu dem Gewebe eines solchen Tiers die Bildung spezifischer Antikörper stimuliert und in vivo oder in vitro spezifisch mit einem homologen Antikörper reagiert. Außerdem stimuliert er die Vermehrung von T-Lymphocyten mit Rezeptoren für das Antigen und er kann mit den Lymphocyten reagieren, um die als zellvermittelte Immunität bezeichnete Reihe von Antworten einzuleiten.
Ein Hapten ist in den Umfang dieser Definition eingeschlossen. Ein Hapten ist der Teil eines antigenischen Moleküls oder antigenischen Komplexes, der seine immunologische Spezifität bestimmt. Im allgemeinen ist ein Hapten ein Peptid oder ein Polysaccharid in natürlich vorkommenden Antigenen. In künstlichen Antigenen kann es ein niedermolekularer Stoff sein, wie ein Arsanilsäurederivat. Ein Hapten reagiert spezifisch in vivo oder in vitro mit homologen Antikörpern oder mit T-Lymphocyten. Alternative Bezeichnungen sind antigenische Determinante, antigenische strukturelle Gruppierung und Hapten-Gruppierung.
Die Formulierung eines erfindungsgemäßen Impfstoffs verwendet eine wirksame Menge eines Antigens. Dies bedeutet, sie schließt eine Menge des Antigens ein, die in Kombination mit dem Adjuvans den Patienten veranlaßt, eine spezifische und ausreichende immunologische Antwort zu erzeugen, die ihm bei einein späterem Kontakt mit einem Virus, Bakterium, Pilz, Mycoplasma oder Parasiten, gegen das/den er immunisiert wurde, Schutz verleiht.
Antigene können durch auf dem Fachgebiet bekannte Verfahren hergestellt werden oder können im Handel erworben werden. Zum Beispiel beschreiben die US-Patente 4,434,157; 4,406,885; 4,264,587; 4,117,112; 4,034,081 und 3,996,907, die hier durch Bezugnahme eingeschlossen sind, Verfahren zur Herstellung von Antigenen für Impfstoffe gegen das Katzenleukämievirus. Andere Antigene können ähnlich hergestellt werden. Antigene innerhalb des Schutzumfanges dieser Erfindung schließen ganze inaktivierte Virusparikel, isolierte Virusproteine und Proteinuntereinheiten, ganze Zellen und Bakterien, Zellmembran und Zellwand-Proteine und ähnliches ein. Erfindungsgemäße Impfstoffe können zur Immunisierung von Vögeln und Säugetieren gegen Krankheiten und Infektionen verwendet werden, einschließlich, ohne Begrenzung darauf, Cholera, Diphtherie, Wundstarrkrampf, Keuchhusten, Grippe, Masern, Meningitis, Mumps, Pest, Kinderlähmung, Tollwut, Rocky-Mountain-Fleckfieber, Röteln, Pocken, Typhus, Fleckfieber, Katzenleukämievirus und Gelbfieber.
Es kann keine Einzeldosisbestimmung festgelegt werden, die eine spezifische Richtlinie für jedes in dieser Erfindung verwendbare Antigen schafft. Die wirksame Menge des Antigens ist eine Funktion seiner arteigenen Aktivität und Reinheit. Es wird beabsichtigt, daß die erfindungsgemäßen Adjuvanszusammensetzungen in Verbindung mit Ganz-Zell- oder Virusimpfstoffen verwendet werden können sowie mit gereinigten Antigenen oder einer Proteinuntereinheit oder mit Peptidimpfstoffen, die durch rekombinante DNA-Techniken oder Synthese hergestellt werden.
Da die erfindungsgemäßen Adjuvanszusammensetzungen stabil sind, kann das Antigen und die Emulsion durch einfaches Schütteln gemischt werden. Andere Techniken, wie der schnelle Durchgang eines Gemisches aus Adjuvans und einer Antigenlösung oder -suspension durch eine kleine Öffnung (wie eine Injektionsnadel), liefern einfach eine nützliche Impfstoffzusammensetzung.
Nachdem die Erfindung nun allgemein beschrieben worden ist, wird sie zum besseren Verständnis durch die folgenden ausführlichen Beispiele erläutert, die, wenn nicht anders angegeben, diese Erfindung nicht begrenzen sollen.

Beispiel 1

Allgemeine Techniken

Die folgenden allgemeinen Techniken wurden in allen folgenden Beispielen, wenn nicht anders angegeben, verwendet.

Materialien

Das MTP-PE wurde von CIBA-GEIGY (Basel, Schweiz) bereitgestellt. Squalen und Tween 80 wurden von Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO) erhalten. CFA und IFA wurden von Gibco (Grand Island, NY) erhalten. Aluminiumhydroxid (Rehsorptar) wurde von Reheis Chemical Co. (Berkeley Heights, NJ) erhalten.

Herstellung der Emulsionen

Verfahren 1: Spritze und Nadel

Ein Gemisch, bestehend aus 4% Squalen, 0,008% Tween 80, 250 ug/ml MTP-PE und Antigen in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), wurde sechsmal durch eine 23-G-Nadel gezogen. Diese Emulsion bestand aus Öltröpfchen mit Größen im Bereich von 10 um und wird bezeichnet als MTP-PE-LO.

Verfahren 2: Kirkland-Emulgator

Das vorstehende Gemisch passierte fünfmal durch einen Kirkland-Emulgator. Diese Emulsion besteht primär aus Öltröpfchen von 1 bis 2 um und wird bezeichnet als MTP-PE-LO-KE. Der Kirkland-Emulgator (Kirkland Products, Walnut Creek, CA) ist eine Version des im Handel erhältlichen Messerschneide-Homogenisators (zum Beispiel Gaulin Modell 30CD und Rainnie Minilab Typ 8.30H) in kleinerem Maßstab, der in der Arbeitskammer etwa 1000 psi erzeugt.

Verfahren 3: Mikroverflüssiger

Gemische, die 0,3 bis 18% Squalen und 0,2 bis 1,0 mg/ml MTP-PE mit oder ohne Tween 80 enthielten, wurden bei 5000 bis 30 000 psi durch den Mikroverflüssiger (Modell Nr. 11OY, Microfluidics Newton, MA) geschickt. Üblicherweise wurden 50 ml der Emulsion 5 Minuten oder 100 ml 10 Minuten in dem Mikroverflüssiger gemischt. Die erhaltenen Emulsionen bestanden aus Öltröpfchen von 100 bis 750 nm, abhängig von der Squalen-, MTP-PE- und der Detergenskonzentration und dem Arbeitsdruck sowie der Temperatur des Mikroverflüssigers. Diese Formulierung wird bezeichnet als MTP-PE-LO-MF.
Zu den vorstehenden Adjuvansformulierungen wurde nach der Herstellung das Antigen zugegeben. Das Antigen und die Emulsion wurden unter Schütteln gemischt. Wurde CFA und IFA verwendet, wurde das Antigen in PBS entweder mit einem gleichen Volumenteil CFA oder IFA gemischt. Das Gemisch wurde durch Passieren einer Injektionsnadel emulgiert, bis eine dicke Emulsion erhalten wurde.

Antigene

Herpes-simplex-Virus-(HSV)-rgD2 ist ein rekombinantes Protein, das in gentechnisch veränderten Ovarzellen des Chinesischen Hamsters produziert wird. Bei diesem Protein ist der normale Verankerungsbereich verkürzt, was ein glycosyliertes Protein ergibt, das in das Gewebekulturmedium sezerniert wird. Das gD2-Protein wurde in dem CHO-Medium zu mehr als 90% Reinheit gereinigt. Das menschliche Immunschwäche-Virus-(HIV)- env-2-3-Protein ist eine rekombinante Form des HIV-Hüllproteins, das in gentechnisch veränderter Saccharomyces cerevisae produziert wird. Dieses Protein stellt den gesamten Proteinbereich des HIV-gp120 dar, ist aber nicht glycosyliert und denaturiert, wenn es aus der Hefe gereinigt wird. HIV-gp120 ist eine vollständig glycosylierte, sezernierte Form von gp120, die in CHO-Zellen auf ähnliche Weise wie das vorstehende gD2-Protein produziert wird.

Immunisierung der Tiere

Die verschiedenen Adjuvans/Antigen-Formulierungen wurden Mäusen intraperitoneal, intramuskulär oder subcutan verabreicht. Meerschweinchen wurden über den Fußballen oder auf intramuskulärem Wege immunisiert. Kaninchen, Ziegen und Paviane wurden auf intramuskulärem Wege immunisiert.

Analyse der Immunantwort

Die Antkörpertiter gegen das immunisierende Antigen wurden durch einen Enzym-gebundenen Immunadsorptionstest (ELISA) bestimmt.

Beispiel 2

MTP-PE-LO-Formulierung in großen Tieren

(Vergleichsbeispiel)

Eine Anzahl von Experimenten wurde durchgeführt; zuerst mit dem HIV-env-2-3-Antigen und später mit dem HSV-gD-Protein unter Verwendung der MTP-PE-LO-Formulierung, um die Immunität in großen Tieren zu stimulieren. Diese Experimente werden nachstehend beschrieben.

1. HIV-env-2-3

a. Meerschweinchen

Meerschweinchen wurden monatlich mit 50 ug/Dosis env-2-3 immunisiert, entweder über den Fußballen oder auf intramuskulärem Wege. Der Impfstoff wurde entweder mit der MTP-PE-LO-Formulierung (4% Squalen, 0,008% Tween 80, 50 ug/Dosis MTP-PE) verabreicht oder absorbiert an Alaun (0,7% Aluminiumhydroxid). Die Seren wurden eine Woche nach jeder Immunisierung gesammelt und auf anti-env-2-3-Antikörper durch ELISA untersucht. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 dargestellt. Die MTP-PE-LO-Formulierung ergab hohe anti-env-2-3- Titer, wenn sie intramuskulär oder über den Fußballen verabreicht wurde. Im Gegensatz dazu ergab Alaun bei beiden Verabreichungswegen viel niedrigere Antikörpertiter. Dieses Experiment zeigt die Wirkamkeit der MTP-PE-LO-Formulierung in Meerschweinchen. Tabelle 1 Vergleich verschiedener Adjuvanzien bei der Bildung von env-2-3-spezifischen Antikörpern als eine Funktion des Injektionsweges a env-2-3-ELISA-Titer Immunisierungsanzahl Adjuvansgruppe Tier # Weg Null Zwei Drei Vier Fünf Sechs Sieben MTP-PE 4% Squalen 0.008% Tween Alaun Durchschnitt Immunisierungsanzahl Adjuvansgruppe Tier # Weg Null Zwei Drei Vier Fünf Sechs Sieben Alaun Durchschnitt a) Meerschweinchen wurden monatlich mit 50'"mg"'g/Dosis env-2-3 mit den verschieden Adjuvanzien immunisiert, entweder über den Fußballen (FP) oder auf intramuskuläre Weise (IM). Seren wurden eine Woche nach jeder Immunisierung gesammelt. b) "_": Aufgrund des Tods des Tieres konnten keine Daten erhalten werden. c) «100: Kein nachweisbares ELISA-Signal bei einer 1:100 Serumverdünnung. d) nt: nicht getestet

b. Ziegen

Paare von Ziegen erhielten bei der Erstimmunisierung 1 mg env-2-3 und 500 ug bei der Zweitimmunisierung mit der MTP-PE-LO-Formulierung, die verschiedene Mengen von MTP-PE im Bereich von 0 bis 500 ug enthielt. Tiere, die als positive Kontrolle dienten, erhielten die Erstimmunisierung mit CFA und die Zweitimmunisierung mit IFA. Eine Gruppe erhielt bei der Erstimmunisierung ebenfalls 100 ug env-2-3, gefolgt von 50 ug bei der Zweitimmunisierung mit der MTP-PE-LO-Formulierung, die 100 ug MTP-PE enthielt. Wie in Tabelle 2 gezeigt, zeigten beide Ziegen, die Freundsches Adjuvans erhielten, hohe Antikörpertiter im Bereich von 2700 bis 62 800. Im Gegensatz dazu zeigten die meisten Ziegen, die die MTP-PE-LO-Formulierung erhielten, eine negative Reaktion mit dem anti- env-2-3-Antikörper. Tiere, die eine Antwort zeigten, entwikkelten nur Titer im Bereich von 100 bis 600. Diese Daten stehen im starken Gegensatz zu den vorstehenden Meerschweinchendaten. Tabelle 2 Antikörperantworten der mit env-2-3 und verschiedenen Dosen von MTP-PE immunisierten Ziegen env-2-3-ELISA-Titer Immunisierung Adjuvans-Formulierung Tierzahl Keine Eine Zwei Freund's a) ST ist die Formulierung mit niedrigem Ölgehalt; 4% Squalen und 0,008% Tween 80. b) «100 zeigt einen env-2-3-ELISA-Titer an, der bei einer 1/100 Serumverdünnung nicht über dem Hintergrund lag. c) < 100 zeigt einen env-2-3-ELISA-Wert bei einer 1/100 Serumverdünnung an, der über dem Hintergrund lag, der aber weniger als das halbe maximale Signal in dem Test erreichte.

c. Hunde

Beagle-Hunde wurden entweder mit 250 ug env-2-3 in MTP-PE-LO (100 ug MTP-PE) oder mit der MTP-PE-LO-Formulierung allein in Intervallen von drei Wochen immunisiert. Zehn Tage nach jeder Immunisierung wurde den Tieren Blut abgenommen und die anti-env-2-3-Antikörpertiter durch ELISA bestimmt. Tabelle 3 zeigt, daß zwei Hunde, die env-2-3 plus Adjuvans erhielten, anti-env-2-3-Titer entwickelten; aber diese Titer erreichten nicht die Werte, die bei Meerschweinchen beobachtet wurden (die maximalen Titer der zwei immunisierten Tiere waren 1700 und 6300). Außerdem entwickelten diese Tiere keine Virus-neutralisierenden Antikörper gegen die homologen (SF2) oder heterologen (BRU oder Zr6) HIV-Stämme. Tabelle 3 ELISA-Titer und Titer neutralisierender Antikörper der Seren von Beagle-Hunden, die mit env-2-3 in MTP-PE-LO-Adjuvans immunisiert wurden a env-2-3 Neutralisationstiter Tier # immunisiert mit Immunisierung-Titer # ELISA HIV-SF2 HIV-BRU HIV-Zr6 O-MTP-PE Kontrolle vor Blut-entnahme
a) Die Hunde erhielten alle 21 Tage intramuskulär 250 ug env-2-3 in Biocin-Adjuvans (100 ug MTP-PE). Zehn Tage nach jeder Immunisierung wurden Blutproben gesammelt.
b) ELISA-Titer «100 werden aufgeführt, wenn kein Signal bei einer 1/100 Serumverdünnung entdeckt wurde.
c) Neutralisations-Titer von < 20 zeigen, daß keine Neutralisation bei der am meisten konzentrierten Serumverdünnung (1/20) beobachtet wurde, die getestet wurde.

d. Schweine

Schweine wurden alle 21 Tage mit 1 mg env-2-3 mit MTP-PE-LO (100 ug MTP-PE) immunisiert. Kontrolltieren wurde lediglich das Adjuvans verabreicht. Zehn Tage nach jeder Immunisierung wurden den Tieren Blut abgenommen und die anti- env-2-3-Antikörper-Titer durch ELISA bestimmt. Die Ergebnisse in Tabelle 4 zeigen, daß die zwei immunisierten Tiere nur niedrige anti-env-2-3-Titer (140 bzw. 100) entwickelten und keine nachweisbaren Virus-neutralisierenden Titer gegen den homologen Stamm (SF2) oder die heterologen Stämme (BRU oder Zr6). Tabelle 4 ELISA und neutralisierende Antikörpertiter des Schweins, das mit env-2-3-MTP-PE-LO-Adjuvans immunisiert wurde a Neutralisierende Titer gegen: Tiernummer Antigen Immunisierungsanzahl env-2-3-ELISA-Titer Env-2-3 Adjuvans Kontrolle vor Blut-entnahme Adjuvans Kontrolle vor Blut-entnahme
a) Die Schweine erhielten alle 21 Tage intramuskulär 1 mg env-2-3 in Biocin-Adjuvans (100 ug MTP-PE). Die Seren wurden 10 Tage nach jeder Immunisierung gesammelt.
b) Zeigte sich bei der 1/50 Serumverdünnung kein Signal, wurde das Ergebnis aufgelistet wie Titer von «50.
c) Niedriges aber nachweisbares Signal bei der 1/50 Serumverdünnung.
d) Bei einer 1/20 Serumverdünnung, der am höchsten konzentrierten Verdünnung, die getestet wurde, wurde keine Neutralisation beobachtet.

e. Affen

Rhesusmakaken wurden alle 30 Tage mit 250 ug env-2-3 mit MTP-PE-LO (100 ug MTP-PE) immunisiert. Kontrolltiere erhielten lediglich die Adjuvansformulierung. Eine Woche nach jeder Immunisierung wurde den Tieren Blut abgenommen und die anti-env-2-3-Antikörper-Titer durch ELISA bestimmt. Tabelle 5 zeigt, daß ähnlich wie bei den Hunden alle Tiere Antikörpertiter gegen env-2-3 entwickelten; aber diese Titer lagen nur im Bereich von 300 bis 3100, und damit viel niedriger, als vorher bei den Meerschweinchen beobachtet wurde. Tabelle 5 Titer der env-2-3-spezifischen Antikörper in Seren von Rhesusmakaken, die mit env-2-3 in MTP-PE-LO-Adjuvans immunisiert wurden a Immunisierung Tier Antigen Nummer vor Blutentnahme (Durchschnitt) Adjuvans Kontrolle a) Die Tiere erhielten alle 30 Tage intramuskulär 250 mg des Antigens in Biocin-Adjuvans (100 mg MTP-PE). Die Seren wurden eine Woche nach jeder Imunisierung gesammelt.

2. HSV-gD2

a. Ziegen

Eine Reihe von Adjuvansformulierungen wurden mit gD2 in Ziegen getestet. Die Tiere wurden alle 21 Tage mit 100 ug gD2 mit den verschiedenen Adjuvanzien immunisiert. Zehn Tage nach den zweiten und dritten Immunisierungen wurde den Tieren Blut abgenommen und die anti-gD2-Titer wurden durch ELISA bestimmt. Die folgenden Adjuvansformulierungen wurden verwendet. CFA (1º) gefolgt von IFA (2º & 3º); IFA mit 100 ug MTP-PE; 0,8 mg/ml Aluminiumhydroxid (Alaun); MTP-PE-LO (100 ug MTP-PE); MTP-PE-LO-KE (100 ug MTP-PE) und MTP-PE-LO-KE (12% Squalen, 5,0 mg MTP-PE). Die ELISA-Ergebnisse sind in Tabelle 6 aufgeführt. Ein CFA/IFA-Tier, beide MTP-PE/IFA-Tiere und ein MTP-PE-LO-KE-Tier (5 mg MTP-PE) entwickelten hohe Antikörpertiter (2187 bis 13 172). Ein CFA/IFA-Tier, beide Alaun-Tiere und ein MTP-PE-LO-KE-Tier (5 mg MTP-PE) entwickelten mittlere Antikörpertiter (569 bis 1489). Die MTP-PE-LO-Tiere und die MTP-PE-LO-KE-Tiere entwickelten niedrige anti-gD2-Titer (46 bis 323). So, wie bei den vorstehenden Ergebnissen mit env-2, ruft die MTP-PE-LO-Formulierung in Ziegen keine hohen Antikörpertiter hervor. Die Modifizierung der Emulsion unter Verwendung des Kirkland-Emulgators (1-2 mm Öltröpfchengrößen) verbesserte die Adjuvansleistung nicht. Eine sehr starke Erhöhung der MTP-PE-Dosis (bis 5,0 mg) scheint die Adjuvansleistung zu verbessern. Tabelle 6 Adjuvanswirksamkeit mit gD2 in Ziegen ELISA-Titer nach Gruppe Tier Adjuvans Immunisierungen Alaun MTP-PE-LO-KE (12% Squalen, 5,0 mg MTP-PE)

b. Paviane

Junge Paviane wurden mit gD2 immunisiert, das mit Alaun, MTP-PE-LO-KE, MTP/IFA und mit IFA allein formuliert wurde. Außerdem wurde eine Dosisbereich-Studie für gD2, kombiniert mit Alaun und MTP-PE-LO-KE durchgeführt. Zwei bis drei Jahre alte Paviane (3,4 bis 12 kg) wurden dreimal in dreiwöchigen Intervallen intramuskulär in den Oberschenkel immunisiert. Für die Bestimmung der gD2-spezifischen Antikörper durch ELISA wurden Seren 3 Wochen nach den ersten zwei Immunisierungen und 2 Wochen nach der letzten Impfstoffdosis gesammelt. Bei jedem dieser Zeitpunkte wurde Vollblut für komplette Blutzellanalysen (CBS) entnommen. Paviane, die mit 100 ug an Alaun gebundenes gD2 immunisiert wurden, entwickelten mittlere anti-gD2-Titer von 3349 ± 550. Die drei getesteten Antigendosen von 10 ug, 25 ug und 100 ug des Proteins zeigten keinen signifikanten Unterschied der Titer. Die Antikörperantworten in 4 Gruppen von Tieren, die 10 oder 100 ug gD2 emulgiert mit 250 ug MTP-PE-LO-KE oder 25 ug gD2 emulgiert mit 50 ug oder 1000 ug MTP-PE-LO-KE erhielten, waren ähnlich denen der Gruppen, die mit gD2/Alaun immunisiert (Mittelwerte im Bereich von 1300 bis 3900) und mit 25 ug gD2 und 250 ug MTP-PE-LO-KE geimpft wurden. In diesem Experiment wurde als positive Kontrolle eine Gruppe verwendet, die MTP-PE emulgiert mit IFA erhielt. Tiere, die mit Alaun immunisiert wurden, wiesen Titer auf, die etwa 1% der Titer von MTP/IFA-Impfstoffen entsprachen und mit MTP-PE-LO-KE immunisierte Tiere wiesen Titer im Bereich von 0,5 bis 1,3 der mit MTP/IFA immunisierten Tiere auf. Diese Ergebnisse sind in Tabelle 7 zusammengefaßt. Tabelle 7 HSV-Impfstoffversuch in Pavianen: Antikörpertiter a ELISA-Titer b Gruppe Adjuvanszusammensetzung (mg) gD2-Dosis (mg) Dosis (mg) Blutentnahme % von MTP-PE/IFAC Alaun a) Alle Tiere wurden mit gD2 durch intramuskuläre Verabreichung in den Oberschenkel immunisiert; 4 Tiere/Gruppe. b) 50% Endpunkt-Antikörpertiter, geometrisches Mittel + Standardfehler c) Fraktion der Tiere mit einer positiven gD2-spezifischen Lymphocytenproliferations-Antwort, definiert als Stimulationsindex > 3,0.
In keinem der Tiere wurden ungünstige Reaktionen auf die Impfstoffe beobachtet und die CBC-Profile waren normal.

Beispiel 3

MTP-PE-LO-Formulierung, die bei der Stimulierung der Immunität in großen Tieren wirksam ist

Wie in Beispiel 2 dargelegt, erzielten MTP-PE-LO-Formulierungen, die mit einer Spritze und einer Nadel (Tröpfchengröße 10 um) und dem Kirkland-Emulgator (Tröpfchengröße 1-2 um) hergestellt wurden, in großen Tieren und Menschen (menschliche Daten sind nicht aufgeführt) keine gute Immunstimulierung durch die Impfstoffantigene. Der Mikroverflüssiger, Modell 11OY, wurde dazu verwendet, eine kleine Tröpfchengröße und stabile Emulsionen zu erzeugen. Diese Maschine ist ein mit Hochdruck arbeitender eingetauchter Strahltyp-Emulgator
Eine Reihe von Emulsionen, die in Größe und Stabilität variieren, wurden hergestellt, basierend auf den Konzentrationen von Squalen, Tween 80 und MTP-PE und den physikalischen Parametern Temperatur und Arbeitsdruck. Beispiele der verschiedenen mit dem Mikroverflüssiger hergestellten Emulsionen sind in Tabelle 8 aufgeführt. Durch Veränderung der physikalischen Parameter und der Emulsionszusammensetzung können Tröpfchengrößen von 1 um bis weniger als 0,2 um erreicht werden. Wie in Tabelle 8 dargestellt, sind die Parameter, die die Tröpfchengröße der Emulsion verringern, erhöhte Detergenskonzentration, erhöhtes Verhältnis MTP-PE zu Squalen, erhöhter Arbeitsdruck und erhöhte Arbeitstemperatur. Diese Emulsionen mit kleiner Tröpfchengröße wurden dann als Adjuvanzien für Impfstoffantigene in Ziegen und Pavianen getestet. Tabelle 8 Zusammensetzung und physikalische Parameter der mit dem Mikroverflüssiger hergestellten MTP-PE-Squalen-Emulsionen Formulierung Squalen % Tween 80 % Mannit % Wäßrige Phase Temp. (ºC) Druck (KPSI) Größe (m)

1. HSV-gD2 in Ziegen

Der erste Mikroverflüssiger, der mit dem gD2-Antigen verwendet wurde, war eine Emulsion aus 4% Squalen und 100 ug MTP-PE ohne Tween 80 (MTP-PE-LO-MF #13; die Kennzeichnungen der MTP-PE-LO-MF-Formulierungen mit Zahlen sind willkürlich und nur für die Verwendung als Bezugszahlen bestimmt). Dieses Material wurde in dem Mikroverflüssiger bei niedrigem Druck hergestellt und wies eine Öltröpfchengröße von etwa 0,8 um auf. Ziegen wurden dreimal intramuskulär mit 100 ug gD2 in dieser Formulierung in Intervallen von 21 Tagen immunisiert. Ziegen, die mit 100 ug gD2 in CFA bei der Erstimmunisierung und in IFA bei der Zweit- und Drittimmunisierung immunisiert wurden, dienten als Kontrollen. Zehn Tage nach der zweiten und dritten Immunisierung wurde den Tieren Blut abgenommen und die anti-gD2-Antikörper-Titer durch ELISA bestimmt. Diese Ergebnisse sind in Tabelle 9 dargestellt. Beide Tiere, die die MTP-PE-LO-MF-Formulierung erhielten, zeigten signifikante anti-gD2-Titer. Diese Titer (1661-2966) waren in einem mittleren Bereich angesiedelt, vergleichbar mit den Titern der zwei CFA/IFA-Kontrollziegen (140-24,269). Die MTP-PE-LO-MF- Tiere zeigten Titer, die erheblich höher waren als bei Ziegen, die MTP-PE-LO-Formulierungen erhalten hatten, die in einer Spritze und Nadel oder im Kirkland-Emulgator hergestellt worden waren (vgl. Tabelle 6). In einem zweiten Experiment mit Ziegen wurden alle 21 Tage 100 ug gD2 mit MTP-PE-LO-MF #16 verabreicht. Diese Formulierung bestand aus 4% Squalen, 500 ug/ml MTP-PE und O Tween 80. Die Öltröpfchengröße dieser Emulsion betrug 0,5 bis 0,6 um. Wie aus Tabelle 10 ersichtlich, scheint diese Formulierung sogar höhere Antikörpertiter zu ergeben als die vorherige Formulierung. So verbessert die Reduzierung der Öltröpfchengröße und/oder die Erhöhung der MTP-PE-Konzentration die Adjuvansleistung dieser Emulsion. Tabelle 9 Test des MTP-PE-LO-MF #13 als ein Adjuvans für gD2 in Ziegen ELISA-Titer nach: Gruppe Tiernummer Adjuvans Antigen Immunisierungen a) 4% Squalen, 100 ug/ml MTP-PE, O Tween 80 und H&sub2;O; Öltröpfchengröße etwa 0,8 um. b) N.T.= nicht getestet. Die Tiere starben aus Gründen, die nicht auf die Immunisierung zurückzuführen sind. Tabelle 10 Test von MTP-PE-LO-MF #16 als ein Adjuvans für gD2 in Ziegen ELISA-Titer nach: Tiernummer Adjuvans Antigen Immunisierungen a) MTP-PE-LO-MF#16: 4% Squalen, 500 ug/ml MTP-PE, O Tween 80 und H&sub2;O; Öltröpfchengröße 0,5 bis 0,6 um.

2. HIV-env-2-3 und gp120 in Ziegen

Die Mikroverflüssigerpräparationen wurden mit CFA/IFA und dem MTP-PE-LO-KE als Adjuvanzien unter Verwendung der HIV-Antigene env-2-3 und gp120 verglichen. Die Tiere wurden dreimal in Intervallen von 21 Tagen immunisiert mit 100 ug des gp120-Antigens in CFA (1º)/IFA (2º & 3º), in MTP-PE-LO-MF #14 (4% Squalen, 500 ug/ml MTP-PE, O Tween, phosphatgepufferte Kochsalzlösung), in MTP-PE-LO-KE (4% Squalen, 100 ug MTP-PE, 0,008% Tween 80, phosphatgepufferte Kochsalzlösung, emulgiert im Kirkland-Emulgator) und in MTP-PE-LO-MF #15 (4% Squalen, 100 ug MTP-PE, 0,008% Tween 80, phosphatgepufferte Kochsalzlösung). Die Tiere wurden auch mit 100 ug des HIV-Antigens env-2-3 in CFA/IFA und in MTP-PE-LO-MF #14 immunisiert. Zehn Tage nach der zweiten und dritten Immunisierung wurde den Tieren Blut abgenommen und die anti-env-2-3-Antikörpertiter wurden durch ELISA bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 11 dargestellt. Die mit der MTP-PE-LO-MF #14-Formulierung immunisierten Tiere zeigten mit env-2-3 nach zwei Immunisierungen gleiche Titer wie CFA/IFA-Tiere und nach drei Immunisierungen höhere Titer als die CFA/IFA-Tiere. Mit gp120 waren die Ergebnisse nicht ganz so klar. Die MTP-PE-LO-MF #14-Tiere zeigen viel mehr Unterschiede als die CFA/IFA-Tiere. So sind die mittleren Titer für die Mikroverflüssiger-Gruppe niedriger als für die CFA-Gruppe; aber einzelne Tiere, die MTP-PE-LO-MF #14 erhalten hatten, zeigten Titer, die so hoch waren wie bei jedem der Tiere der CFA/IFA-Gruppe. Ein direkter Vergleich der identischen Adjuvanskomponenten (4% Squalen, 100 ug/ml MTP-PE, 0,008% Tween 80, phosphatgepufferte Kochsalzlösung) mit gp120, emulgiert durch zwei unterschiedliche Verfahren (Kirkland- Emulgator und Mikroverflüssiger) veranschaulicht die Wichtigkeit der geringen Tröpfchengröße in der Emulsion. Die Gruppe des Kirkland-Emulgators zeigte nach diesen Immunisierungen einen mittleren Titer von 632, während die Mikroverflüssiger- Gruppe einen mittleren Titer von 3277 zeigte. Tabelle 11 Test von MTP-PE-LO-MF als ein Adjuvans mit den HIV-Antigenen env-2-3 und gp120 ELISA-Titer nach: Gruppe Tiernummer Adjuvans Antigen Immunisierungen Geom. Mittel + SE a) MTP-PE-LO-MF #14: 4% Squalen, 500 mg/ml MTP-PE, O Tween, phosphatgepufferte Kochsalzlösung. b) MTP-PE-LO-KE: 4% Squalen, 100 mg/ml MTP-PE, 0,008% Tween 80, phosphatgepufferte Kochsalzlösung, emulgiert im Kirkland-Emulgator. c) MTP-PE-LO-MF #15: 4% Squalen, 100 mg/ml MTP-PE, 0,008% Tween 80, phosphatgepufferte Kochsalzlösung.

3. HIV-env-2-3 und gp120 in Pavianen

MTP-PE-LO-MF #1 (2% Squalen, 500 ug/ml MTP-PE, O Tween 80, H&sub2;O; Öltröpfchengröße 0,17 um) wurde in Pavianen als Adjuvans mit den HIV-Antigenen env-2-3 und gp120 getestet. MTP-PE in IFA und Alaun wurden als Kontrollen verwendet. Die Tiere wurden in Intervallen von einem Monat immunisiert. Zwei Wochen nach der zweiten Immunisierung wurde den Tieren Blut abgenommen und die Virus-neutralisierenden anti-env-2-3-Antikörpertiter bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 12 dargestellt. Die Antikörpertiter gegen gp120 waren mit MTP-PE-LO-MF #1 höher als mit MTP-PE-IFA. Die anti-env-2-3-Titer waren in den MTP-PE-IFA- und den MTP-PE-LO-MF #1-Gruppen ähnlich. Die mit Alaun erzielten anti-gp120-Titer lagen im gleichen Bereich wie die mit MTP-PE-LO-MF #1 erzielten; aber die mit Alaun erzielten anti-env-2-3-Titer schienen niedriger als die mit den MTP-PE-Aduvanzien erzielten. Tabelle 12 Test von MPT-PE-LO-MF #1 als ein Adjuvans für die HIV-Proteine env-2-3 und gp120 in Pavianen Gruppe Tiernummer Adjuvans Antigen Virus- -ELISA-Titer nach 2 Immunisierungen Neutralisierender Antikörpertiter Alaun b
a: MTP-PE-LO-MF #1: 2% Squalen, 500 mg/ml MTP-PE, O Tween 80, H&sub2;O. Öltröpfchengröße 0,17 um.
b: Alaunantigen, gebunden an 0,8 mg/ml Aluminiumhydroxid

Beispiel 4: Weitere Adjuvans/Antigenformulierungen

Zusätzlich zu den vorstehend erläuterten ausführlichen Beispielen wurde eine Anzahl anderer Antigene in Impfstofformulierungen mit erfindungsgemäßen Adjuvanszusammensetzungen hergestellt. Diese schließen Antigene von Krankheitserregern ein, die für Grippe und Malaria verantwortlich sind, sowie Antigene, die mit HIV und HSV assoziiert sind, und zwar andere, als in den vorhergehenden Beispielen beschrieben sind. Antigene vom Cytomegalovirus (CMV) und Hepatitis C-Virus (HCV) werden ebenfalls beschrieben, da diese Antigene in den gleichen Adjuvansformulierungen verwendet werden können, die für die anderen aufgeführten Antigene beschrieben sind.

Antigene

Grippe-Antigene, die für die Verwendung in Impfstoffpräparationen geeignet sind, sind im Handel erhältlich. Die in den folgenden Beispielen verwendeten Antigene sind Fluogen , hergestellt von Parke-Davis; Duphar, hergestellt von Duphar B.V. und die Grippeimpfstoff-Charge-A41, hergestellt vom Instituto Vaccinogeno Pozzi.
Malaria-Antigene, die für die Verwendung in Impfstoffpräparationen geeignet sind, sind in der US-Patentanmeldung 336,288, eingereicht am 11. April 1989 beschrieben und im US-Patent 4,826,957, erteilt am 2. Mai 1989.
Weitere für die Verwendung in Impfstoffpräparationen geeignete HIV-Antigene sind in der US-Patentanmeldung 490,858 beschrieben, eingereicht am 9. März 1990. Weitere HIV-Antigene können der veröffentlichten Europäischen Patentanmeldung mit der Anmeldungsnummer 181150 (14. Mai 1986) entnommen werden.
Weitere HSV-Antigene, die für die Verwendung in Impfstoffpräparationen geeignet sind, sind in der PCT WO85/04587, veröffentlicht am 24. Oktober 1985, beschrieben und in der PCT WO88/02634, veröffentlicht am 21. April 1988. Gemische von gB- und gD-Antigenen, die verkürzte Oberflächenantigene ohne die Verankerungsbereiche sind, werden besonders bevorzugt.
Cytomegalovirus-Antigene, die für die Verwendung in Impfstoffpräparationen geeignet sind, sind im US-Patent 4,689,225, erteilt am 25. August 1897, beschrieben und in der PCT-Anmeldung PCT/US89/00323, veröffentlicht am 10. August 1989 unter der Internationalen Veröffentlichungsnummer WO 89/07143. Vgl. ebenfalls die US-Anmeldung 367,363, eingereicht am 16. Juni 1989.
Hepatitis C-Antigene, die für die Verwendung in Impfstoffpräparationen geeignet sind, werden in der PCT/US88/04125, in der veröffentlichten Europäischen Anmeldung Nr. 318216 (31. Mai 1989), in der veröffentlichten Japanischen Anmeldung Nr. 1-500565 (eingereicht am 18. November 1988) und in der Kanadischen Anmeldung 583,561 beschrieben. Eine andere Zusammenstellung von HCV-Antigenen ist in der Europäischen Patentanmeldung 90/302866.0, eingereicht am 16. März 1990, beschrieben. Vgl. ebenfalls die US-Anmeldung 456,637, eingereicht am 21. Dezember 1989, und die PCT/US90/01348.
Es sollte angemerkt werden, daß veröffentlichte Ausführungen der vorstehend aufgeführten verschiedenen unveröffentlichten Anmeldungsnummern von einem Registerdienst erhältlich sind, wie dem World-Patent-Index, sowie über eine Auflistung der entsprechenden Anmeldungen in anderen Ländern.

Adjuvansformulierungen und Herstellungstechniken

Die folgenden Zusammenfassungen beschreiben Adjuvansformulierungen und ihre Herstellung sowie die Herstellung von Impfstoffzusammensetzungen unter Verwendung der Adjuvanzien und der verschiedenen antigenen Stoffe. In manchen Fällen werden Zusammenfassungen von Impfstudien bereitgestellt, aber ohne die Ausführlichkeit der vorstehenden Beispiele, da die vorstehend erläuterten Impfstudien bereits eine ausreichende Orientierung für die Verwendung der Impfstoffzusammensetzungen liefern.

Grippe

In einer Reihe von Experimenten wurden Hamster mit einem im Handel erhältlichen Grippeimpfstoff vom Instituto Vaccinogeno pozzi immunisiert. Dieser Impfstoff besteht aus gereinigtem HA aus zwei A-Stämmen (A/Leningrad/360/86 und A/Singapur/6/86) und einem B-Stamm (B/Ann Arbor/1/86). Der Impfstoff wurde allein getestet, mit einer MTP-PE/LO-Emulsion, die mit einem Kirkland-Emulgator (Flouromed Pharmaceutical, Inc., La Mesa, CA) hergestellt wurde und mit einer MTP-PE/MF-Emulsion, die in einem Mikroverflüssiger (Modell 11OY, Microfluidics, Newton, MA) hergestellt wurde. Die ersten zwei sind vergleichbare Zusammensetzungen, während die "MF"-Zusammensetzung eine erfindungsgemäße Zusammensetzung ist. MTP-PE/MF steht für "MTP-PE-Mikroverflüssige"-Emulsion und enthält 4% Squalen und 1,0 mg/ml MTP-PE, emulgiert mit dem Mikroverflüssiger. Die MTP-PE-Kirkland-Emulsion enthielt 4% Squalen, 0,5 mg/ml MTP-PE und 0,008% Tween 80, emulgiert mit dem Kirkland-Emulgator. Die Tiere erhielten drei Immunisierungen mit 8,3 ug von jedem HA-Antigen. In beiden Formulierungen wurde pro Dosis 50 ug MTP-PE verwendet. Nach jeder Immunisierung wurden die ELISA-Titer gegen die immunisierenden Antigene bestimmt und die HAI-Titer wurden nach der zweiten Immunisierung bestimmt. Die ELISA-Titer waren bei beiden getesteten Adjuvansformulierungen wesentlich erhöht.
In anderen Experimenten wurden Hamster entweder allein mit dem im Handel erhältlichen Parke-Davis Fluogen-Impfstoff (HA-A/Shanghai/11/87, A/Taiwan/1/86 und B/Yamagata/16/88) immunisiert oder mit dem im Handel erhältlichen Duphar- Grippeimpfstoff (HA-A/Sechuan/2/87, A/Singapur/6/86 und B/Beijing/1/87), entweder allein oder mit der MF69-Adjuvansformulierung (MF69 besteht aus 5% Squalen, 0,2% Tween 80, 0,8% Span 85 und 400 ug/ml MTP-PE, emulgiert im Mikroverflüssiger). Gleiche Volumenteile des Impfstoffs wurden mit dem MF69-Adjuvans gemischt. Die Tiere erhielten drei Immunisierungen in Intervallen von drei Wochen mit 11,25 ug des Parke-Davis-Impfstoffs oder 7,5 ug des Duphar-Impfstoffs. Die Tiere, die das MF69-Adjuvans erhielten, erhielten Dosen von 50 ug MTP-PE. Die Tiere, die Duphar plus MF69 erhielten, zeigten nach einer und zwei Immunisierungen bedeutend höhere anti-HA-Titer als mit Duphar allein (nach einer Immunisierung waren die mittleren Titer 80fach höher als mit dem Impfstoff allein und 170fach höher nach zwei Immunisierungen). Das MF69- Adjuvans zeigte eine gute Stimulierung der Antikörperantwort auf den Parke-Davis-Impfstoff und erzeugte nach einer, zwei oder drei Immunisierungen mittlere Titer von 2951, 14 927 und 12 878. Diese Titer sind 82-, 29- und 10fach höher als mit dem Impfstoff allein nach einer, zwei bzw. drei Immunisierungen. Für beide Impfstoffe wurden nach zwei Immunisierungen mit MF69 die höchsten Antikörpertiter beobachtet.
In weiteren Experimenten wurde die Immunogenität von zwei im Handel erhältlichen Grippeimpfstoffen, dem Parke- Davis-Fluogen und der Duphar-Influenzauntereinheit, ohne Adjuvans und mit mehreren MTP-PE enthaltenden Adjuvansformulierungen in Ziegen verglichen. Die Tiere wurden intramuskulär mit 0,5 ml jedes Impfstoffs immunisiert, entweder gemischt mit 0,5 ml PBS oder mit 0,5 ml der MTP-PE-Adjuvansformulierungen. Drei Adjuvansformulierungen wurden verglichen: 200 ug MTP-PE gelöst in PBS und 200 ug MTP-PE in zwei verschiedenen mikroverflüssigten Emulsionen, bezeichnet als Gaulin 1/4- und MF 40/4-Emulsionen. Gaulin 1/4 besteht aus 1,6% Squalen und 400 ug/ml MTP-PE, emulgiert im Gaulin-Homogenisator (APV Gaulin, Everett, MA). MTP-PE/MF-40/4 besteht aus 1,6% Squalen, 400 ug/ml MTP-PE, 0,154% Tween 85 und 0,166% Span 85, emulgiert im Mikroverflüssiger (Modell 11OY, Microfluidics, Newton, MA). Die Tiere erhielten 0,5 ml des Impfstoffs, entweder gemischt mit 0,5 ml PBS oder 0,5 ml der aufgeführten Adjuvansformulierung, um ein Injektionsvolumen von 1,0 ml zu bilden. Wie bei den Hamstern, zeigten die Ziegen, die die Grippeimpfstoffe kombiniert mit den Adjuvansemulsionen erhielten, viel höhere Antikörpertiter als die Ziegen, die den Impfstoff allein erhielten. Dies ist früh im Immunisierungsschema besonders ausgeprägt. Nach einer Immunisierung erzeugte die Gaulin-1/4-Emulsion anti-HA-Titer, die 30fach höher waren, als die allein mit dem Parke-Davis- Impfstoff erzeugten. Die MTP-PE/MF-40/4-Emulsion erzeugte anti-HA-Titer, die 130fach höher waren als die allein mit dem Parke-Davis-Impfstoff und 60fach höher als die allein mit dem Duphar-Impfstoff erzeugten. MTP-PE in PBS zeigte nach einer Immunisierung keine Stimulierung des Antikörpertiters. Nach zwei Immunisierungen wurden ähnliche Erhöhungen der Antikörpertiter mit den Emulsionen beobachtet. Die mit den Adjuvansemulsionen beobachtete frühe Stimulierung der anti- HA-Titer ist besonders signifikant, da Grippeimpfstoffe im allgemeinen Erwachsenen als Einfachdosis-Impfstoffe und Kindern als Zweifachdosis-Impfstoffe verabreicht werden. So zeigen die MTP-PE-Emulsionen, wie bei den Hamstern, große Erhöhungen der Immunantwort auf die Grippeimpfstoffe.
In einem anderen Experiment wurde der Duphar-Impfstoff allein und mit der Adjuvansformulierung MF69 verglichen. Der Parke-Davis-Impfstoff wurde allein und mit MF101, MF69, MF-68+MTP-PE und dem Ribi-Adjuvanssystem verglichen, das in dem Gaulen-Homogenisator (Mikroverflüssiger) hergestellt wurde. MF101 besteht aus 1,6% Squalen und 400 ug/ml MTP-PE, emulgiert im Mikroverflüssiger. MF-68 besteht aus 5% Squalen, 0,8% Span 85 und 0,2% Tween 80, emulgiert im Mikroverflüssiger. MF-68+MTP-PE besteht aus MF-68, dem nach dem Emulgieren 400 ug/ml MTP-PE hinzugesetzt wurden. Ribi-MF besteht aus 2% Squalen, 0,4% Tween 20, 250 ug/ml Monophosphoryllipid-A, 250 ug/ml Trehalosedimycolat und 250 ug/ml Zellwandskelett (Ribi Immunochem, Hamilton, Montana), emulgiert im Gaulin-Homogenisator. Alle Adjuvanzien wurden in einer Dosis von 0,5 ml pro Injektion mit gleichen Volumina des Impfstoffs (Antigen) verwendet. MF69 erhöhte den ELISA-Titer gegen den Duphar-Impfstoff erheblich. Alle getesteten Adjuvanzien erhöhten die Immunogenität des Parke-Davis-Impfstoffs erheblich, wie durch Messen des ELISA-Titers und des Hämagglutinationstiters festgestellt wurde.
In einem weiteren Experiment wurden die MF69- und die MF59-Formulierungen (diese unterscheiden sich nur in dem Verhältnis Tween 80 : Span 85, vgl. vorstehende Beschreibungen) in Ziegen als Adjuvanzien mit dem Parke-Davis-Grippeimpfstoff verglichen. Die Tiere wurden einmal mit der Hälfte der menschlichen Impfstoffdosis (7,5 ug von jeder der drei HA-Komponenten) kombiniert mit den Adjuvansformulierungen immunisiert. MTP-PE wurde in einer Dosis von 100 ug in den Formulierungen verwendet. Wie erwartet, ergeben die zwei Formulierungen sehr ähnliche Titer und zwar mit MF69 einen mittleren Titer von 926 und mit MF59 einen mittleren Titer von 821.

Malaria

Eine Impfstudie unter Verwendung von MF59 (vorstehend beschrieben) als Adjuvans wurde begonnen. Ein Gemisch im Handel erhältlicher Antigene aus dem Sporozoit, dem Merozoit und den erythrocytären Stadien dieser Krankheit wurde verwendet: Falc. 2.3-Circumsporozoit-Antigen, HP-195-Merozoit- Antigen und SERA-1-Antigen, das das Stadium der roten Blutkörperchen repräsentiert. Impfstoffzusammensetzungen wurden wie vorstehend beschrieben hergestellt und zwar durch Mischen von gleichen Volumina des vorher hergestellten MF59-Adjuvans und der Antigenzusammensetzung.

HIV

Ein Immunisierungsexperiment wurde durchgeführt, um die Produktion von neutralisierenden Antikörpern durch eine Anzahl von verschiedenen gp120-Antigenen zu vergleichen. Einzelheiten der Herstellung der Antigene sind in der US-Anmeldung 490,858, eingereicht am 9. März 1990, erläutert. Ein Antigen war ein in Hefe hergestelltes gp120-Analog (env-2-3), das denaturiert und nicht glycosyliert ist. Ein anderes Antigen war ein glycosyliertes gp120, das seine natürliche Konfiguration beibehielt. Beide gp120-Stoffe wurden von derselben genetischen Quelle, dem HIV-1-SF-2-Isolat, abgeleitet. Die Antikörperproduktion wurde in Pavianen gemessen. Bei anfänglichen Studien unter Verwendung von Öl-enthaltenden Adjuvanzien mit Partikelgrößen von mehr als 1 um wurden Titer produziert, die niedriger sind als jene, die mit herkömmlichen Alaunadjuvanzien produziert wurden. Bei späteren Studien mit Adjuvanzien mit submikromischen partikeln jedoch wurden Antikörpertiter produziert, die mindestens 10mal höher waren als mit Alaun. Die anfängliche submikromische Zusammensetzung enthielt 2% Squalen und 0,500 mg/ml MTP-PE in Wasser und wies Öltröpfchen mit durchschnittlich etwa 0,17 um Durchmesser auf. Impfstoffzusammensetzungen unter Verwendung von MF59 (vorstehend beschrieben) oder MF58 (MF59, aber mit exogen hinzugegebenem MTP-PE) als Adjuvans in Pavianen erwiesen sich sogar noch wirksamer bei der Stimulierung der Antikörperproduktion als die anfänglich verwendete submikromische Zusammensetzung. MF59 wurde bei einer Menge von 0,100 mg MTP-PE in einer 1:2 Verdünnung verwendet.

Herpes-simplex-Virus

Zusätzlich zu den vorstehend beschriebenen gD2-Experimenten wurden weitere Experimente unter Verwendung von MF59 und verschiedenen Mengen von MTP-PE und der Antigene durchgeführt. Ausreichende Antikörpertiter in Meerschweinchen (intramuskuläre Verabreichung) wurden unter Verwendung von 0,003 bis 0,250 mg gD2 mit dem MF59-Adjuvans und 0,050 mg MTP-PE erzielt und unter Verwendung von 0,010 bis 0,100 mg gD2 mit MF59 und 0,100 mg MTP-PE.

Cytomegalovirus

Impfstofformulierungen können durch Mischen von 0,001 bis 0,250 mg der CMV-Antigene in 0,5 ml physiologischer Kochsalzlösung mit 0,5 ml MF59-Adjuvans hergestellt werden, das 0,050 mg MTP-PE enthält. MF69, MF101 und andere Adjuvanzien mit submikromischen Partikeln können in der gleichen Weise verwendet werden.

Hepatitis C-Virus

Impfstofformulierungen können durch Mischen von 0,001 bis 0,250 mg der HCV-Antigene in 0,5 ml physiologischer Kochsalzlösung mit 0,5 ml MF59-Adjuvans hergestellt werden, das 0,050 mg MTP-PE enthält. MF69 und MF101 und andere Adjuvanzien mit submikromischen Partikeln können in der gleichen Weise verwendet werden.
Obwohl die vorstehende Erfindung durch Erläuterungen und Beispiele im einzelnen genauer beschrieben wurde, ist es für den Fachmann offensichtlich, daß im Lichte der erfindungsgemäßen Lehren bestimmte Änderungen und Modifikationen durchgeführt werden können, ohne den Charakter oder den Schutzumfang der beigefügten Ansprüche zu verlassen.

Claims

1. Adjuvanszusammensetzung, umfassend:

(1) ein metabolisierbares Öl und

(2) einen Emulgator,

wobei das Öl und der Emulgator in Form einer Öl-in-Wasser-Emulsion mit Öltröpfchen vorliegen, dadurch gekennzeichnet, daß im wesentlichen alle Öltröpfchen weniger als 1 um Durchmesser aufweisen und wobei die Zusammensetzung kein Blockcopolymer umfaßt.

2. Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei das Öl ein tierisches Öl ist.

3. Zusammensetzung nach Anspruch 2, wobei das Öl ein ungesättigter Kohlenwasserstoff ist.

4. Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei das Öl ein Terpenoid ist.

5. Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei das Öl ein Pflanzenöl ist.

6. Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei die Zusammensetzung 0,5 bis 20 Vol.-% des Öls in einem wäßrigen Medium umfaßt.

7. Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei der Emulgator ein nicht-ionisches Detergens umfaßt.

8. Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei der Emulgator einen Polyoxyethylensorbitanmono-, -di- oder -triester oder einen Sorbitanmono-, -di- oder -triester umfaßt.

9. Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei der Emulgator einen Polyoxyethylensorbitanmono-, -di- oder -triester und einen Sorbitanmono-, -di- oder -triester umfaßt.

10. Zusammensetzung nach Anspruch 8 oder 9, wobei die Zusammensetzung 0,02 bis 2,5 Gew.-% des Emulgators umfaßt.

11. Zusammensetzung nach Anspruch 10, wobei die Zusammensetzung außerdem einen getrennten Immunstimulator umfaßt.

12. Zusammensetzung nach Anspruch 11, wobei der Immunstimulator Aluminiumoxid oder eine Bakterienzellwand-Komponente umfaßt.

13. Zusammensetzung nach Anspruch 12, wobei die Zusammensetzung 0,0001 bis 1 Gew.-% des Immunstimulators umfaßt.

14. Zusammensetzung nach Anspruch 11, wobei der Immunstimulator ein Muramylpeptid umfaßt.

15. Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei der Emulgator auch als Immunstimulator wirkt.

16. Zusammensetzung nach Anspruch 15, wobei die Zusammensetzung 0,01 bis 0,5 Gew.-% des Immunstimulators umfaßt.

17. Zusammensetzung nach Anspruch 15, wobei der Immunstimulator ein lipophiles Muramylpeptid umfaßt.

18. Zusammensetzung nach Anspruch 17, wobei das Peptid ein Muramyldipeptid oder ein Muramyltripeptid umfaßt.

19. Zusammensetzung nach Anspruch 18, wobei das Peptid außerdem ein Phospholipid umfaßt.

20. Zusammensetzung nach Anspruch 19, wobei das Phospholipid ein Phosphoglycerid umfaßt.

21. Zusammensetzung nach Anspruch 14, wobei das Peptid eine Verbindung der Formel

ist, in der R ein Wasserstoffatom oder die COCH&sub3;'-Gruppe bedeutet;

R¹, R² und R³ unabhängig voneinander ein Wasserstoffatom oder eine Lipideinheit bedeuten;

R&sup4; ein Wasserstoffatom oder einen Alkylrest darstellt;

X und Z unabhängig voneinander eine Aminoacyleinheit bedeuten, ausgewählt als Alanyl, Valyl, Leucyl, Isoleucyl, α-Aminobutyryl, Threonyl, Methionyl, Cysteinyl, Glutamyl, Isoglutamyl, Glutaminyl, Isoglutaminyl, Aspartyl, Phenylalanyl, Tyrosyl, Tryptophanyl, Lysyl, Ornithinyl, Arginyl, Histidyl, Asparaginyl, Prolyl, Hydroxyprolyl, Seryl und Glycyl;

n den Wert 0 oder 1 hat;

Y den Rest -NHCHR&sup5;CH&sub2;CH&sub2;CO- bedeutet, wobei R&sup5; eine gegebenenfalls veresterte oder amidierte Carboxylgruppe darstellt; und

L eine OH-Gruppe, einen Rest NR&sup6;R&sup7;, wobei R&sup6; und R&sup7; unabhängig voneinander ein Wasserstoffatom oder einen Niederalkylrest bedeuten, oder eine Lipideinheit darstellt.

22. Zusammensetzung nach Anspruch 21, wobei R&sup4; eine Methylgruppe, X einen Alanylrest und Y einen Isoglutaminylrest darstellt.

23. Zusammensetzung nach Anspruch 21, wobei n den Wert 1 hat, Z einen Alanylrest, R eine Acetylgruppe und R¹, R² und R³ alle ein Wasserstoffatom bedeuten.

24. Zusammensetzung nach Anspruch 23, wobei L eine Phospholipideinheit umfaßt.

25. Zusammensetzung nach Anspruch 24, wobei die Phospholipideinheit ein Diacylphosphoglycerid umfaßt.

26. Zusammensetzung nach Anspruch 21, wobei das Peptid N- Acetylmuramyl-L-alanyl-D-isoglutaminyl-L-alanin-2-[1,2- dipalmitoyl-sn-glycero-3-(hydroxy-phosphoryloxy)]ethylamid ist.

27. Zusammensetzung nach Anspruch 21, wobei mindestens einer der Reste R¹ und R² einen Acylrest mit 1 bis 22 Kohlenstoffatomen darstellt.

28. Zusammensetzung nach Anspruch 21, wobei mindestens einer der Reste R¹, R² und R³ einen Acylrest mit 14 bis 22 Kohlenstoffatomen darstellt.

29. Verwendung einer Adjuvanszusammensetzung nach einem der vorangehenden Ansprüche für die Herstellung einer Impfstoff Zusammensetzung für die Impfung.

30. Impfstoffzusammensetzung, umfassend:

(1) ein immunstimulierende Menge eines antigenen Stoffes und

(2) eine immunstimulierende Menge des Adjuvans von Anspruch 1.

31. Impfstoffzusammensetzung nach Anspruch 30, wobei der antigene Stoff ein Malaria-, menschlicher Immunschwächevirus-, Herpes-simplex-Virus-, Cytomegalovirus- oder Hepatitis C-Virus-Antigen ist.

32. Impfstoffzusammensetzung nach Anspruch 31 zur Verwendung bei der Impfung.