【発明の詳細な説明】
DNAワクチンを伴うサブミクロン水中油型エマルジョンの使用技術分野
本発明は、一般にワクチン組成物に関する。詳細には、本発明は、核酸ワクチ
ンを伴うサブミクロン水中油型エマルジョンの使用に関する。発明の背景
弱毒化病原体またはサブユニットタンパク質抗原を含む多数のワクチン処方物
が開発されている。従来のワクチン組成物は、しばしば、免疫応答を増強するた
めに免疫学的アジュバントを含む。例えば、投与された抗原を吸着および／また
は沈澱させ、そして注射部位に抗原を保持し得る蓄積アジュバントは頻繁に用い
られる。代表的な蓄積アジュバントは、アルミニウム化合物および油中水型エマ
ルジョンを含む。しかし、蓄積アジュバントは、抗原性を増加させるとはいえ、
皮下または筋肉内に注射された場合に、しばしば重篤な持続性局所反応（例えば
、肉芽種、膿腫、および瘢痕）を誘発する。他のアジュバント（例えば、リポポ
リサッカリドおよびムラミルジペプチド）は、注射により発熱性応答および／ま
たはライター症状（インフルエンザ様症状、全身性関節不快（generalized join
t discomfort）およびしばしば前部ブドウ膜炎、関節炎、および尿道炎）を惹起
し得る。サポニン（例えば、Quillaja saponaria）はまた、種々の疾患に対する
ワクチン組成物における免疫学的アジュバントとして使用されている。近頃、安
全な高度に免疫原性のサブミクロン水中油型エマルジョンであるMF59がワクチン
組成物における使用のために開発されている。例えば、Ottら，「MF59--Design
and Evaluation of a Safe and Potent Adjuvant for Human Vaccines」Vaccine
Design:The Subunit and Adjuvant Approach(Powell，M.F.およびNewman，M.J
．編）Plenum Press，New York，1995，277-296を参照のこと。
このようなアジュバントの存在にもかかわらず、従来のワクチンはしばしば、
標的化された病原に対して適切な防御を提供することができない。これに関して
、
細胞内病原体（例えば、多数のウイルス）に対するワクチン接種は、免疫系の細
胞性および体液性の両方の免疫系を標的化するであろうという証拠が増えつつあ
る。
細胞傷害性Ｔリンパ球（CTL）は、細胞内病原（例えば、ウイルスおよび悪性
細胞により生成される腫瘍特異的抗原）に対する細胞媒介性免疫防御において重
要な役割を果たす。CTLは、感染細胞により示されるクラスＩ MHC分子とともに
ウイルス決定基を認識することにより、ウイルスに感染した細胞の細胞傷害性を
媒介する。タンパク質の細胞質発現は、クラスI MHCプロセシングおよびCTLに対
する抗原ペプチドの提示に欠くことができない。しかし、殺傷または弱毒化ウイ
ルスでの免疫は、しばしば、細胞内感染を抑制するのに必要なCTLを生じること
ができない。さらに、免疫を回避する改変体の選択を促進する著しい遺伝的不均
質性および／または迅速な変異速度を提示するウイルス（例えば、HIVまたはイ
ンフルエンザ）に対する従来のワクチン接種技術は、問題がある。従って、ワク
チン接種の別の技術が開発されている。
免疫応答を惹起する目的での哺乳動物組織へのDNAおよびmRNAの直接注射が記
載されている。例えば、米国特許第5,589,466号を参照のこと。本明細書中で「
核酸免疫」と呼ばれる方法は、体液性および細胞媒介性の両方の免疫応答を惹起
することが示されている。例えば、エンベロープ糖タンパク質gp160をコードす
るヒト免疫不全ウイルス１型（HIV-1）DNA構築物で免疫したマウスからの血清は
、免疫アッセイにおいて組換えgp160と反応することが示され、そして注射され
たマウスからのリンパ球は、組換えgp120に応答して増殖することが示された。W
angら，Proc．Natl．Acad．Sci．USA（1993）90:4156-4160。同様に、ヒト成長
ホルモン（hGH）遺伝子のゲノムコピーを含むプラスミドで免疫したマウスは、
抗体に基づく免疫応答を示した。Tangら，Nature（1992）356:152-154。哺乳動
物プロモーターにより駆動されるインフルエンザ核タンパク質をコードするDNA
の筋肉内注射は、マウスをその後の致死的なウイルスのチャレンジに対して防御
し得るCD8＋CTL応答を惹起することが示されている。Ulmerら，Science（1993）
259:1745-1749。注射部位の免疫組織化学的研究は、DNAが骨髄芽球により取り込
まれ、そしてウイルスタンパク質の細胞質生成が少なくとも６ヶ月間実証され
得ることを示した。
アジュバントの従来の使用は、抗原に対する免疫応答を誘発するために抗原と
アジュバントとの同時送達を含んでいた。近頃は、サポニンアジュバントである
QS-21が、HIVに対して指向する裸のDNAワクチンに対する細胞媒介性免疫応答を
増加させることが報告されている。Genetic Engineering News，1997年6月1日、
33頁。
しかし、核酸ワクチンの免疫原性を増強するための他のアジュバント（サブミ
クロン水中油型エマルジョンを含む）の使用は、これまでは記載されていない。
さらに、アジュバントの送達と核酸ワクチンの送達との間の時間的な分離は、以
前に記載されていない。発明の開示
本発明は、サブミクロン水中油型エマルジョンの使用が、核酸ワクチンの免疫
原性を増強するために役立つという驚くべき、そして予期しない発見に基づく。
このようなエマルジョンの使用は、広範な種々の病原体に対する核酸ワクチンの
、免疫原性を増強するための安全でかつ有効なアプローチを提供する。サブミク
ロン水中油型エマルジョンは、目的の遺伝子と同時に投与される必要はないが、
遺伝子の送達の前またはそれに続いて投与され得る。実際、エマルジョンが遺伝
子の送達の前に投与される場合に驚くべき良好な結果がみられる。
従って、１つの実施態様では、本発明は、サブミクロン水中油型エマルジョン
を脊椎動物被験体に投与する工程、および上記被験体の細胞を、目的の抗原をコ
ードする核酸分子を含む組換えベクターで、上記抗原の発現を可能にする条件下
でトランスフェクトし、それにより上記目的の抗原に対する免疫応答を誘発する
工程を包含する免疫方法に関する。
さらなる実施態様では、組換えベクターは、非ウイルス性ベクター、またはウ
イルス性ベクター（例えば、レトロウイルスベクター、ワクシニアベクター、ま
たはカナリアポックスウイルスベクター）である。
なお別の実施態様では、本発明は、MF59を哺乳動物被験体に投与する工程、お
よび上記被験体を、目的のウイルス性抗原をコードする核酸分子を含む組換えベ
クターで、上記抗原の発現を可能にする条件下で免疫し、それにより上記目的の
抗原に対する免疫応答を誘発する工程を包含する免疫方法に関する。
本発明のこれらおよび他の実施態様を、本明細書の開示を考慮すれば、当業者
は容易に行なう。図面の簡単な説明
図1Aおよび1Bは、実施例2aにおいて記載した通りに、レトロウイルスベクター
送達の２日前に指定されたアジュバントが与えられたC3Hマウスからの脾臓細胞
について実施した51Cr放出アッセイの結果を示す。図1Aは、希釈していないレト
ロウイルスベクター6A3を投与したマウスからの結果を示す。図1Bは、1：10で希
釈したレトロウイルスベクター6A3を投与したマウスからの結果を示す。
図２は、実施例３に記載した通りに、レトロウイルスベクター送達の２日前に
指定されたアジュバントで前処置されたマウスにおけるgp120に対する平均IgG1
応答を示す。発明の詳細な説明
本発明の実施は、他に示されない限り、当該分野の技術範囲内にあるウイルス
学、微生物学、分子生物学、組換えDNA技術、および免疫学の従来の方法を用い
る。このような技術は、文献において十分に説明される。例えば、Sambrookら，
Molecular Cloning:A Laboratory Manual（第２版，1989）；DNA Cloning:A Pra
ctical Approach，第I巻および第II巻（D.Glover編）；Oligonucleotide Synthe
sis(N.Gait編，1984);A Practical Guide to Molecular Cloning(1984);Fundame
ntal Virology，第２版，第I巻および第II巻（B.N.FieldsおよびD.M.Knipe編）
；Methods In Enzymology(S.ColowickおよびN.Kaplan編，Academic Press，Inc.
):ならびにHandbook of Experimental Immunology，第I巻〜第IV巻（D.M.Weirお
よびC.C.Blackwell編，1986，Blackwell Scientific Publications）を参照のこ
と。
本明細書中および添付の請求の範囲に用いられる場合、単数形の「ａ」、「an
」、および「the」は、内容がそうでないことを明確に示さない限り、複数の指
示を含む。Ｉ．定義
本発明を記載する際に、以下の用語を用い、そして以下に示すように定義され
ることが意図される。
「核酸免疫」により、抗原のインビボでの発現のための、宿主細胞への１つ以
上の選択された抗原をコードする核酸分子の導入が意味される。核酸分子は、レ
シピエント被験体に、非ウイルス性ベクター、ウイルス性ベクター、もしくは細
菌性ベクター（以下にさらに記載されるように）を用いて、例えば、注射、吸入
、経口、鼻腔内、および粘液投与などにより導入され得るか、またはエクスビボ
で、宿主から取り出された細胞中に導入され得る。後者の場合、形質転換された
細胞は、被験体に再導入され、被験体において免疫応答が核酸分子によりコード
される抗原に対して開始し得る。
「抗原」により、宿主の免疫系を刺激して、抗原が提示された場合に細胞性抗
原特異的免疫応答を行なうか、または体液性抗体応答を行なう、１つ以上のエピ
トープを含む分子が意味される。通常、エピトープは、約３〜15個、一般に約５
〜15個の間のアミノ酸を含む。本発明の目的のためには、抗原は、任意のいくつ
かの公知のウイルス、細菌、寄生生物、および真菌に由来し得る。この用語はま
た、任意の種々の腫瘍抗原を意図する。さらに、本発明の目的のために、「抗原
」とは、タンパク質が免疫応答を誘発する能力を保持する限り、ネイティブ配列
に対して改変（例えば、欠失、付加、および置換（一般に天然で保存的である）
）を含むタンパク質をいう。これらの改変は、部位特異的変異誘発を介するかの
ように意図的であり得るか、または抗原を生じる宿主の変異を介するかのように
偶発的であり得る。
抗原または組成物に対する「免疫学的応答」は、被験体における、目的の組成
物において存在する分子に対する体液性および／または細胞性の免疫応答の発現
である。本発明の目的のために、「体液性免疫応答」とは、抗体分子により媒介
される免疫応答をいい、一方、「細胞性免疫応答」は、Ｔリンパ球および／また
は他の白血球により媒介される応答である。細胞性免疫の１つの重要な局面は、
細胞傷害性Ｔ細胞（CTL）による抗原特異的応答を含む。CTLは、主要組織適合遺
伝子複合体（MHC）によりコードされ、そして細胞表面上に発現されるタンパク
質と結合して提示されるペプチド抗原に対する特異性を有する。CTLは、細胞内
微生物の細胞内破壊、またはこのような微生物に感染した細胞の溶解を誘導およ
び促進するのを助ける。細胞性免疫の別の局面は、ヘルパーＴ細胞による抗原特
異的応答を含む。ヘルパーＴ細胞は、その表面上でMHC分子と結合したペプチド
抗原を提示する細胞に対する非特異的エフェクター細胞機能を刺激し、そして活
性を集中するのを助ける。「細胞性免疫応答」はまた、サイトカイン、ケモカイ
ン、ならびに活性化Ｔ細胞および／または他の白血球（CD4＋およびCD8＋Ｔ細胞
に由来する白血球を含む）により生成される他のこのような分子の生成をいう。
細胞性免疫応答を誘発する組成物またはワクチンは、細胞表面でのMHC分子に
関連した抗原の提示によって脊椎動物被験体を感作するように作用し得る。細胞
媒介性免疫応答は、それらの表面で抗原を提示する細胞に対して、またはその付
近に指向される。さらに、抗原特異的Ｔリンパ球は、免疫された宿主のさらなる
保護を可能にするように生成され得る。
細胞媒介性免疫的応答を刺激する特定の抗原または組成物の能力は、多数のア
ッセイ（例えば、リンパの増殖（リンパ球の活性化）アッセイ、CTL細胞傷害性
細胞アッセイ）によって、または感作された被験体中の抗原に特異的なＴリンパ
球をアッセイすることによって決定され得る。このようなアッセイは、当該分野
で周知である。例えば、Ericksonら、J．Immunol．(1993)151：4189-4199；Doe
ら、Eur．J．Immunol．(1994)24：2369-2376；および以下の実施例を参照のこと
。
このように、本明細書中で使用される場合、免疫応答は、CTLの産生、および
／またはヘルパーＴ細胞の産生もしくは活性化を刺激する免疫応答であり得る。
目的の抗原はまた、抗体媒介性免疫応答を誘発し得る。従って、免疫応答は、１
つ以上の以下の影響を含み得る：Ｂ細胞による抗体の産生；ならびに／あるいは
サプレッサーＴ細胞および／または目的の組成物もしくはワクチン中に存在する
抗原に対して特的に指向されるγδＴ細胞の活性化。これらの応答は、感染力を
中和する、および／または免疫された宿主に対する保護を提供するための抗体補
充、または抗体依存性細胞の細胞傷害性（ADCC）を媒介するように作用し得る。
このような応答は、当該分野で周知である、標準的なイムノアッセイおよび中和
アッセイを使用して決定され得る。
「コード配列」または選択された抗原を「コードする」配列は、適切な調節配
列の制御下に配置された場合に、インビボで転写され（DNAの場合）そしてポリ
ペプチドに翻訳される（mRNAの場合）核酸分子である。コード配列の境界は、5'
（アミノ）末端では開始コドンによって、そして3'（カルボキシ）末端では翻訳
停止コドンによって決定される。コード配列として、ウイルスに由来するcDNA、
原核生物または真核生物のmRNA、ウイルスまたは原核生物DNAに由来するゲノムD
NA配列、およびさらに、合成DNA配列が挙げられ得るが、これらに限定されない
。転写終結配列は、コード配列の3'に配置され得る。
「核酸」分子として、原核生物配列、真核生物のmRNA、真核生物のmRNAに由対
するcDNA、真核生物（例えば、哺乳動物）のDNAに由来するゲノムDNA配列、およ
びさらに、合成DNA配列が挙げられ得るが、これらに限定されない。この用語は
また、DNAおよびRNAの任意の既知の塩基アナログを含む配列を捕捉する。
「ベクター」によって、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド、
染色体、ウイルス、ビリオン、組換えウイルスなどのような任意のゲノムエレメ
ントが意味される。これらは、所望の細胞または組織に遺伝子配列を送達し得る
。従って、この用語は、クローニングおよび発現ビヒクル、ならびにウイルスベ
クターを含む。
「作動可能に連結された」は、そのように記載される成分が、それらが通常の
機能を行うように構成される、エレメントの配置をいう。従って、コード配列に
作動可能に連結された所定のプロモーターは、適切な酵素が存在する場合に、コ
ード配列の発現を達成し得る。プロモーターは、それがその発現を指向するよう
に機能する限りは、コード配列と隣接している必要はない。従って、例えば、介
在する、翻訳されないがなお転写される配列が、プロモーター配列とコード配列
との間に存在し得、そしてプロモーター配列はなお、コード配列に対して「作動
可能に連結されている」と考えられ得る。
核酸分子を記載するように本明細書中で使用される場合、「組換え」は、ゲノ
ムのポリヌクレオチド、cDNA、半合成または合成起源を意味する。これは、その
起源または操作によって：（１）それが天然において関連するポリヌクレオチド
の全てまたは一部とは関連しない、そして／または（２）それが天然において連
結されるポリヌクレオチド以外のポリヌクレオチドに連結される。タンパク質ま
たはポリペプチドに関して使用される場合、用語「組換え体」は、組換えポリヌ
クレオチドの発現によって産生されるポリペプチドを意味する。
２つの核酸またはポリペプチド配列は、少なくとも約70％、好ましくは少なく
とも約80〜90％、そして最も好ましくは、少なくとも約95％のヌクレオチドまた
はアミノ酸が、分子の規定された長さにわたって一致する場合、「実質的に相同
」である。本明細書中で使用される場合、実質的に相同はまた、特定の核酸また
はポリペプチド配列に対して同一性を示す配列をいう。実質的に相同である核酸
配列は、例えば、その特定のシステムについて定義されるようなストリンジェン
トな条件下での、サザンハイブリダイゼーション実験において同定され得る。適
切なハイブリダイゼーション条件を規定することは、当該分野の技術範囲内であ
る。例えば、Sambrookら、前出；DNA Cloning、第１巻および第II巻、前出；Nuc
leic Acid Hybridization、前出を参照のこと。このような配列はまた、PCR産物
の直接的な配列決定によって確認され、そしてさらに特徴付けられ得る。
本明細書中で提供される場合、用語、薬剤の「有効量」または「薬学的有効量
」は、毒性はないが、所望の免疫応答および対応する治療効果を提供するための
薬剤の十分な量をいう。以下に指摘されるように、必要とされる実際の量は、被
験体毎に、種、年齢、および被験体の一般的な状態、処置される状態の重篤度、
および目的の特定の抗原、投与の態様などに依存して変化する。任意の個々の場
合において適切な「有効」量は、慣用的な実験を使用して当業者によって決定さ
れ得る。
本明細書中で使用され得る場合、「処置」は、任意の（ｉ）伝統的なワクチン
におけるような、感染または再感染の予防、（ii）症状の軽減または排除、およ
び（iii）患者からの問題の病原体の実質的または完全な排除をいう。処置は、
予防的（感染の前）または治療的（感染後）に行われ得る。
「脊椎動物の被験体」によって、ヒトおよび他の霊長類を含むがこれらに限定
されず、チンパンジーおよび他のサル（ape）およびサル（monkey）種のような
非ヒト霊長類；ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、およびウマのような家畜動物；イヌ
およびネコのような飼いならされた哺乳動物；マウス、ラット、およびモルモッ
トのようなげっ歯類を含む研究室動物；飼いならされた、野生の、および遊戯用
の鳥類（例えば、ニワトリ、シチメンチョウ、および他のジュンケイ類の鳥類、
アヒル、ガチョウ）を含む鳥類などを含む、cordata亜門の任意のメンバーが意
味される。この用語は、特定の年齢は示さない。従って、成体および生まれたば
かりの個体の両方が含まれることが意図される。上記のシステムは、任意の上記
の脊椎動物種における使用が意図される。なぜなら、これらの脊椎動物全ての免
疫システムが同様に作動するからである。
II ．発明を実施するための形態
本発明は、送達される遺伝子がそれ自体が弱い免疫原性であるタンパク質をコ
ードする場合もなお、核酸免疫との組み合わせにおけるサブミクロン（submicro
n）水中油型エマルジョンの使用が、活発な免疫応答を提供し得ることの発見に
基づく。
詳細には、本発明の方法は、細胞媒介性免疫、および／または体液性抗体応答
を提供する。従って、従来の抗体応答に加えて、本明細書中で記載されるシステ
ムは、例えば、クラスＩ MHC分子と発現される抗原との会合を提供し得、その結
果、目的の抗原に対するインビボでの細胞性免疫応答が、開始され得る。これは
、抗原の将来の認識を可能にする、CTLの産生を刺激する。さらに、この方法は
、ヘルパーＴ細胞による抗原特異的応答を誘発し得る。従って、本発明の方法は
、それに対する細胞性および／または体液性免疫応答が所望される、任意の抗原
（抗体、Ｔ細胞ヘルパーピトープおよびＴ細胞細胞傷害性エピトープを誘導し得
る、ウイルス、細菌、真菌、および寄生性の病原体に由来する抗原を含む）を用
いる用途を見出す。このような抗原として、ヒトおよび動物のウイルスによって
コードされ、そして構造的または非構造的タンパク質のいずれかに対応し得る、
抗原が挙げられるがこれらに限定されない。
この技術は、通常は、免疫応答をほとんど誘発しない細胞内ウイルスおよび腫
瘍細胞抗原に対する免疫に特に有用である。例えば、本発明は、ヘルペスウイル
スファミリーに由来する広範な種々のタンパク質（１型および２型単純ヘルペス
ウイルス（HSV）に由来するタンパク質（例えば、HSV-1およびHSV-2糖タンパク
質gB、gD、およびgH）；水痘帯状ヘルペスウィルス（VZV）、エプスタイン-バー
ウイルス（EBV）、およびサイトメガロウイルス（CMV）に由来する抗原に由来す
る抗原（CMV gBおよびgHを含む）；およびHHV6およびHHV7のような他のヒトヘル
ペスウイルスに由来する抗原を含む）に対する免疫応答を刺激するための使用を
見出す。（例えば、サイトメガロウイルスのタンパク質コード内容の概説につい
ては、Cheeら、Cytomegaloviruses（J.K．McDougall編、Springer Verlag 1990
）125-169頁；種々のHSV-1コードタンパク質の考察については、McGeochら、J．
Gen．Virol．(1988)69：1531-1574；HSV-1およびHSV-2 gBおよびgDタンパク質、
ならびにそれをコードする遺伝子の考察については、米国特許第5,171,568号；E
BVゲノム中のタンパク質コード配列の同定については、Baerら、Nature（1984）310
：207-211；ならびにVZVの概説については、DavisonおよびScott．J．Gen．V
irol．(1986)67：1759-1816を参照のこと。）
肝炎ウイルスのファミリー（Ａ型肝炎ウイルス（HAV）、Ｂ型肝炎ウイルス（H
BV）、Ｃ型肝炎ウイルス（HCV）、δ肝炎ウイルス（HDV）、Ｅ型肝炎ウイルス（
HEV）、およびＧ型肝炎ウイルス（HGV）を含む）に由来する抗原をコードするポ
リヌクレオチド配列もまた、本明細書中で記載される技術において便利に使用さ
れ得る。例示の目的で、HCVのウイルスゲノム配列が、配列を得るための方法と
して知られている。例えば、国際公開番号第WO 89/04669号；同第WO 90/11089号
：および同第WO 90/14436号を参照のこと。HCVゲノムは、E1（Ｅとしてもまた知
られる）およびE2（E2/NSIとしてもまた知られる）、およびＮ末端ヌクレオカプ
シドタンパク質（「コア」と呼ばれる）を含む、いくつかのウイルスタンパク質
をコードする（E1およびE2を含むHCVタンパク質の考察については、Houghtonら
、Hepatology（1991）14：381-388を参照のこと）。これらのタンパク質、およ
びその抗原性フラグメントのそれぞれをコードする配列は、本方法における使用
を見出す。同様に、HDVに由来するδ-抗原のコード配列は既知であり（例えば、
米国特許第5,378,814号を参照のこと）、そしてこの配列はまた、本方法におい
て便利に使用され得る。さらに、HBVに由来する抗原（例えば、コア抗原、表面
抗原、sAg）およびプレ表面（presurface）配列（pre-S1およびpre-S2（以前はp
re-Sと呼ばれる））、ならびに上記の組み合わせ(例えば、sAg／pre-S1、sAg／p
re-S2、sAg／pre-S1／pre-S2、およびpre-S1／pre-S2)が、本明細書中での使用
を見出す。例えば、HBV構造の考察については、「HBV Vaccines−from the labo
ratory to license：a case study」Mackett，M.およびWilliamson，J.D.、Huma
n VaccinesおよびVaccination、159-176頁；ならびに米国特許第4,722,840号、
同第5,098,704号、同第5,324,513号；Beamesら、J．Virol．(1995)69：6833-683
8、Birnbaumら、J．Virol．(1990)64：3319-3330；ならびにZhouら、J．Virol．
（1991）65：5457-5464を参照のこと。
他のウイルスに由来する抗原をコードするポリヌクレオチド配列（例えば、以
下のファミリーのメンバーに由来するタンパク質を含むがこれらに限定されない
）もまた、請求される方法における使用を見出す：ピコルナウイルス属（例えば
、ポリオウイルスなど）；カルシウイルス属；トガウイルス属（例えば、風疹ウ
イルス、デング熱ウイルスなど）；フラビウイルス属；コロナウイルス属；レオ
ウイルス属；ビルナウイルス属；ラブドウイルス属（例えば、狂犬病ウイルスな
ど）；フィロウイルス属；パラミクソウイルス属（例えば、おたふくかぜウイル
ス、はしかウイルス、RSウイルスなど）；オルトミクソウイルス属（例えば、Ａ
型、Ｂ型、およびＣ型インフルエンザウイルスなど）；ブンヤウイルス属、アレ
ナウイルス属；レトロウイルス属（例えば、HTLV-1；HTLV-II；HIV-1（HTLV-III
、LAV、ARV、hTLRなどとしてもまた知られる））、これは、HIVIIIb、HIVSF2、H
IVLAV、HIVLAI、HIVMN；HIVCM235、HIVUS4；HIV-2；サル免疫不全ウイルス（SIV
）由来の抗原を含むがこれらに限定されない）。さらに、抗原はまた、ヒトパピ
ローマウイルス（HPV）およびダニ媒介性の脳炎ウイルスから誘導され得る。例
えば、これらおよび他のウイルスの記載については、Virology、第３版（W.K．J
oklik編、1988）；Fundamental Virology、第２版（B.N．FieldsおよびD.M．Kni
pe編、1991）を参照のこと。
より詳細には、任意の上記のHIV単離物に由来するgp120エンベロープタンパク
質をコードする遺伝子（HIVの種々の遺伝子のサブタイプのメンバーを含む）が
既知であり、そして報告されている（例えば、種々のHIV単離物のエンベロープ
遺伝子配列の比較については、Myersら、Los Alamos Database、Los Alamos Nat
ional Laboratory、Los Alamos、New Mexico（1992）；Myersら、Human Retrovi
ruses and Aids、1990、Los Alamos、New Mexico；Los Alamos National Labora
tory；およびModrowら、J．Virol．(1987)61：570-578を参照のこと）。そして
任意のこれらの単離物に由来する配列は、本発明における使用を見出す。さらに
、本発明は、任意の種々のHIV単離物（任意の種々のエンベロープタンパク質（
例えば、gp160およびgp41）、gag抗原（例えば、p24gagおよびp55gag）、および
pol領域に由来するタンパク質を含む）に由来する他の免疫原性タンパク質にも
等しく適用可能である。
上記で説明されるように、インフルエンザウイルスは、本発明が特に有用であ
るウイルスの別の例である。詳細には、インフルエンザＡのエンベロープ糖タン
パク質HAおよびNAが、免疫応答を生じるための特定の目的である。インフルエン
ザＡの多数のHAサブタイプが、同定されている（Kawaokaら、Virology（1990）1 79
：759-767；Websterら、「Antigenic variation among type A influenza vir
uses」、127-168頁、P．PaleseおよびD.W．Kingsbury（編）、Genetics of infl
uenza viruses．Springer-Verlag、New York。従って、任意のこれらの単離物に
由来するタンパク質をコードする遺伝子配列もまた、本明細書中で記載される核
酸免疫技術において使用され得る。
この技術は、分泌抗原（例えば、近傍のウイルスゲノムの全てを含むプロウイ
ルスDNA）の、問題のゲノムの大きな部分への送達のために、使用され得る。
本明細書中に記載される方法はまた、多数の細菌抗原（例えば、Meningococcu
s A、B、およびC、B型Hemophilus influenza（HIB）、およびHelicobacter pylo
riを含むが，これらに限定されない、ジフテリア、コレラ、結核、破傷風、百日
咳、髄膜炎、および他の病理学的状態を生じる生物に由来する抗原）をコードす
るDNA配列を用いる使用を見出す。寄生性の抗原の例として、マラリアおよびラ
イム病を生じる生物に由来する抗原が挙げられる。
さらに、本明細書中に記載される方法は、種々の悪性のガンを処置するための
手段を提供する。例えば、本発明のシステムは、問題のガンに特異的な特定のタ
ンパク質（例えば、活性化された腫瘍遺伝子、胎児抗原、または活性化マーカー
）に対する体液性および細胞媒介性の免疫応答の両方を開始するために使用され
得る。このような腫瘍抗原として、中でも、MAGE 1、2、3、4などを含む任意の
種々のMAGE（黒色腫関連抗原Ｅ）（Boon，T.、Scientific American（1993年３
月）：82-89）；任意の種々のチロシナーゼ；MART I（Ｔ細胞によって認識され
る黒色腫抗原）、変異体ras、変異体p53：p97黒色脛抗原；CEA（ガン胎児抗原）
が挙げられる。
本発明が広範な種々の疾患を予防または処置するために使用され得ることが、
容易に明らかである。
上記の分子をコードするポリヌクレオチド配列は、組換え方法を使用して（例
えば、遺伝子を発現する細胞に由来するcDNAおよびゲノムライブラリーをスクリ
ーニングすること、または上記を含むことが公知のベクターから遺伝子を誘導す
ることによって）得られ得る。さらに、所望の遺伝子は、所望の遺伝子を含有す
る細胞および組織から、標準的な技術（例えば、フェノール抽出、およびcDNAま
たはゲノムDNAのPCR）を使用して、直接単離され得る。例えば、DNAを得るおよ
び単離するために使用される技術の記載については、Sambrookら、前出を参照の
こと。目的の遺伝子は、クローン化されるよりはむしろ合成によっても産生され
得る。ヌクレオチド配列は、所望の特定のアミノ酸配列について適切なコドンを
用いて設計され得る。一般的には、当業者は、その中で配列が発現される、意図
される宿主について好ましいコドンを選択する。完全な配列が、標準的な方法に
よって調製された重複オリゴヌクレオチドからアセンブリされ、そして完全なコ
ード配列へとアセンブリされる。例えば、Edge、Nature（1981）292：756；Namb
airら、Science（1984）223：1299；Jayら、J．Biol．Chem．(1984)259：6311を
参照のこと。
次に、所望の抗原をコードする遺伝子配列が、所望のコード配列に作動可能に
連結された制御配列を含むベクター中に挿入され得る。これによって、被験体で
ある種におけるインビボでの遺伝子の発現を可能にする。例えば、哺乳動物細胞
での発現のための代表的なプロモーターとして、SV40初期プロモーター、CMVプ
ロモーター（例えば、CMV最初期プロモーター（Chapmanら、Nucl．Acids Res．
（1991）19：3979-3986））、マウス乳線癌ウイルスLTRプロモーター、アデノウ
イルス主要後期プロモーター（Ad MLP）、および単純ヘルペスウイルスプロモー
ターが特に挙げられる。他の非ウイルスプロモーター（例えば、マウスメタロチ
オネイン遺伝子に由来するプロモーター）もまた、哺乳動物での発現のための使
用を見出す。代表的には、転写終結配列およびポリアデニル化配列もまた存在し
、翻訳停止コドンの3'に配置される。好ましくは、コード配列の5'に配置される
、翻訳の開始の最適化のための配列もまた、存在する。転写ターミネーター／ポ
リアデニル化シグナルの例として、Sambrookら、前出に記載されているようなSV
40に由来するもの、およびウシ成長ホルモンターミネーター配列が挙げられる。
スプライスドナーおよびアクセプター部位を含むイントロンもまた、本発明での
使用のための構築物中に設計され得る。
エンハンサーエレメントもまた、哺乳動物構築物の発現レベルを増大させるた
めに、本明細書中で使用され得る。例として、Dijkemaら、EMBO J．(1985)4：76
1に記載されるようなSV40初期遺伝子エンハンサー、Gormanら、Proc．Natl．Aca
d．Sci．USA（1982b）79：6777に記載されるようなラウス肉腫ウイルスの長末端
反復（LTR）に由来するエンハンサー／プロモーター、およびBoshartら、Cell（
1985）41：521に記載されるような、ヒトCMVに由来するエレメント（例えば、CM
VイントロンＡ配列中に含まれるエレメント）が挙げられる。
さらに、例えば、目的の複数の抗原（例えば、１つ以上のウイルス単離物に由
来する抗原）をコードする、キメラ遺伝子配列を含むプラスミドが、構築され得
る。さらに、抗原提示を増強し得る、リンパ球を遺伝子発現の部位に引きつけ得
る、または遺伝子発現の部位に対するリンパ球の集団の拡大を促進し得る、また
は発現される抗原に対して応答するリンパ球の集団の拡大を促進し得る、免疫調
節剤をコードする遺伝子もまた、存在し得る。このような薬剤として、サイトカ
イン、リンホカイン、およびケモカイン（IL-2、改変されたIL-2（cys125→ser1
25）、GM-CSF、IL-12、γ-インターフェロン、IP-10、MIP1α、MIP1β、およびR
ANTESを含むがこれらに限定されない）が挙げられる。さらに、TAPトランスポー
ターのような免疫分子、B7のよう補助的刺激分子、β2M、クラスＩまたはクラス
II MHC遺伝子（同系または同種異系）、および効果的な免疫応答のために必要と
されるが、特異的な阻害または欠失によっては発現されないタンパク質をコード
する他の遺伝子もまた、構築物中での使用を見出す。これは、抗原提示がしばし
ば減少している腫瘍細胞およびいくつかの感染細胞において特に適切である。
上記の配列は、別々のベクターを使用して投与され得るか、または目的の抗原
をコードする遺伝子を保有するベクター上に存在し得る。同じベクター上に存在
する場合は、さらなる遺伝子配列が、２シストロン性遺伝子構造において目的の
抗原をコードする遺伝子に先行し得るか、またはその後に続き得るかのいずれか
である。さらなる制御エレメントが、遠位のコード領域からのRNAの効率的な翻
訳のために、種々の遺伝子の間に配置され得る。あるいは、目的の遺伝子および
モジュレーターの両方をコードする単一のオープンリーディングフレームを有す
るキメラ転写ユニットもまた、構築され得る。キメラタンパク質の合成が可能で
あるように融合物が作製され得るか、あるいは、タンパク質のプロセシングシグ
ナルが、プロテアーゼ（例えば、シグナルペプチダーゼ）による切断、従って、
鋳型RNAの翻訳物に由来する２つ以上のタンパク質の遊離を可能にするのを提供
するように操作され得るかのいずれかである。ポリタンパク質のプロセシングの
ためのこのようなシグナルは、例えば、フラビウイルス、ペスチウイルス（例え
ば、HCV）、およびピコルナウイルス中に存在し、そして構築物中に操作され得
る。プロセシングプロテアーゼもまた、独立して、または抗原および／もしくは
サイトカインコード領域を有するキメラの一部としてのいずれかで、このシステ
ム中で発現され得る。プロテアーゼは、それ自体、プロセシング酵素およびワク
チン抗原の両方であり得る。
一旦完成すると、構築物は、標準的な遺伝子送達プロトコールを使用する核酸
免疫のために使用される。遺伝子送達のための方法は、当該分野で公知である。
例えば、米国特許第5,399,346号、同第5,580,859号、同第5,589,466号を参照の
こと。遺伝子は、脊椎動物被験体に直接送達され得るか、あるいは、被験体に由
来する細胞および被験体中に再移植された細胞に、エキソビボで送達され得るか
のいずれかである。遺伝子は、上記のような非ウイルスベクター、ウイルスベク
ター、または細菌ベクターを使用して送達され得る。
ウイルスに基づく多数のシステムが、哺乳動物細胞への遺伝子の導入のために
開発されている。例えば、レトロウイルスは、遺伝子送達システムのための便利
なプラットフォームを提供する。選択された遺伝子は、当該分野で公知の技術を
使用してベクター中に挿入され得、そしてレトロウイルス粒子中にパッケージさ
れ得る。次いで、組換えウイルスが単離され得、そしてインビボまたはエキソビ
ボのいずれかで被験体の細胞に送達され得る。多数のレトロウイルスシステムが
記載されている（例えば、米国特許第5,219,740号；国際公開番号第WO 91/02805
号および同第WO 93/15207号；MillerおよびRosman、BioTechniques（1989）7：9
80-990；Miller，A.D.、Human Gene Therapy（1990）1：5-14；Scarpaら、Virol
ogy（1991）180：849-852；Burnsら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA（1993）90:8
033-8037；ならびにBoria-LawrieおよびTemin、Cur．Opin．Genet．Develop．（
1993）3：102-109を参照のこと）。
多数のアデノウイルスベクターもまた、記載されている。宿主ゲノム中に組み
込まれるレトロウイルスとは異なり、アデノウイルスは染色体外に存続し、従っ
て挿入による変異誘発に関連する危険性を最小にする（Haj-AhmadおよびGraham
，J．Virol．(1986)57：267-274；Bettら、J．Virol．(1993)67：5911-5921；Mi
tterederら、Human Gene Therapy（1994）5：717-729；Sethら、J．Virol．(199
4)68：933-940；Barrら、Gene Therapy（1994）１：51-58；Berkner，K.L.、Bio
Techniques（1988）6：616-629；ならびにRichら、Human Gene Therapy（1993）4
：461-476）。
さらに、種々のアデノ随伴ウイルス（AAV）ベクターシステムが、遺伝子送達
のために開発されている。AAVベクターは、当該分野で周知の技術を使用して容
易に構築され得る。例えば、米国特許第5,173,414号および同第5,139,941号；国
際公開番号第WO 92/01070号（1992年１月23日に公開された）および同第WO 93/0
3769号（1993年３月４日に公開された）；Lebkowskiら、Molec．Cell．Biol．(1
988)8：3988-3996；Vincentら、Vaccines 90（1990）（Cold Spring Harbor Lab
oratory Press）；Carter，B.J．Current Opinion in Biotechnology（1992）3
：533-539；Muzyczka，N.、Current Topics in Microbiol．and Immunol．(1992
)158：97-129；Kotin，R.M.、Human Gene Therapy（1994）5：793-801；Shellin
gおよびSmith、Gene Therapy（1994）1：165-169；ならびにZhouら、J．Exp．
Med．(1994)179:1867-1875を参照のこと。
目的の抗原をコードする核酸分子を送達するための使用を見出すさらなるウイ
ルスベクターとして、ワクシニアウイルスおよびトリポックスウイルスを含む、
ポックスウイルスのファミリーに由来するウイルスベクターが挙げられる。例示
の目的で、遺伝子を発現するワクシニアウイルス組換え体は、以下のように構築
され得る。特定の抗原をコードするDNAが、最初に、それがワクシニアプロモー
ターおよび横に位置するワクシニアDNA配列（例えば、チミジンキナーゼ（TK）
をコードする配列）に隣接するように、適切なベクター中に挿入される。次いで
、このベクターは、ワクシニアに同時に感染させられる細胞をトランスフェクト
するために使用される。相同組換えは、ワクシニアプロモーターおよび目的の抗
原をコードする遺伝子を、ウイルスゲノム中に挿入するように作用する。得られ
るTK組換え体は、5-ブロモデオキシウリジンの存在下で細胞を培養すること、お
よびそれに対して耐性であるウイルスプラークを採取することによって選択され
得る。
あるいは、トリポックスウイルス（例えば、鶏痘ウイルスおよびカナリアポッ
クスウイルス）もまた、遺伝子を送達するために使用され得る。哺乳動物の病原
体に由来する免疫原を発現する組換えトリポックスウイルスが、鳥類以外の種に
投与された場合に、防御免疫を付与することが公知である。トリポックスベクタ
ーの使用は、ヒトおよび他の哺乳動物種において特に所望される。なぜなら、ト
リポックス属のメンバーは、感受性の鳥類の種においてのみ増殖性で複製し得、
従って、哺乳動物細胞中では感染性ではないからである。組換えトリポックスウ
イルスを産生するための方法は当該分野で公知であり、そしてワクシニアウイル
スの産生に関して上記に記載されているような、遺伝子組換えを使用する。例え
ば、WO 91/12882号；WO 89/03429号；およびWO 92/03545号を参照のこと。
分子結合体ベクター（例えば、Michaelら、J．Biol．Chem．(1993)268：6866-
6869およびWagnerら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA(1992)89：6099-6103に記載
されているアデノウイルスキメラベクター）もまた、遺伝子送達のために使用さ
れ得る。さらに、目的の遺伝子は、例えば、1991年５月２日に公開された国際公
開番号第WO 91/05864号に記載されている、非感染性レトロウイルス様粒子のよ
うな偽ビリオンを使用して送達され得る。
アルファウイルス属のメンバー（例えば、シンドビスウイルスおよびセムリキ
森林ウイルスに由来するベクターであるが、これらに限定されない）もまた、目
的の遺伝子の送達のためのウイルスベクターとしての使用を見出す。本方法の実
施に有用なシンドビスウイルスに由来するベクターの記載については、国際公開
番号第WO 95/07995号を参照のこと。
ワクシニアに基づく感染／トランスフェクションシステムが、宿主細胞中での
目的の遺伝子の誘導性の一時的な発現を提供するために、便利に使用され得る。
このシステムにおいて、細胞は、最初に、バクテリオファージT7 RNAポリメラー
ゼをコードするワクシニアウイルス組換え体を用いてインビトロで感染させられ
る。このポリメラーゼは、それが、T7プロモーターを有する鋳型のみを転写する
という点で、優れた特異性を示す。感染後、細胞は、T7プロモーターによって駆
動される目的のポリヌクレオチドでトランスフェクトされる。ワクシニアウイル
ス組換え体によって細胞質中で発現されるポリメラーゼは、トランスフェクトさ
れたDNAをRNAに転写し、次いでこれは、宿主の翻訳機構によってタンパク質に翻
訳される。この方法は、大量のRNAおよびその翻訳産物の、高レベルの一時的な
細胞質での産生を提供する。例えば、Elroy-SteinおよびMoss、Proc．Natl．Aca
d．Sci．USA（1990）87：6743-6747；Fuerstら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA（
1986）83：8122-8126を参照のこと。
ワクシニアもしくはトリポックスウイルス組換え体での感染、または他のウイ
ルスベクターを使用する遺伝子の送達のための別のアプローチとして、宿主細胞
への導入後に高レベルの発現を導く増幅システムが使用され得る。詳細には、T7
RNAポリメラーゼのコード領域に先行するT7 RNAポリメラーゼプロモーターが、
操作され得る。この鋳型に由来するRNAの翻訳は、T7 RNAポリメラーゼを生成し
、これは次いで、さらなる鋳型を転写する。付随して、その発現がT7プロモータ
ーの制御下にあるcDNAが存在する。従って、増幅鋳型RNAの翻訳によって生成さ
れるT7 RNAポリメラーゼのいくつかは、所望の遺伝子の転写を導く。いくつかの
T7 RNAポリメラーゼが増幅を開始するために必要とされるので、T7 RNAポリメラ
ーゼは、転写反応をプライムするために、鋳型とともに細胞中に導入され得る。
ポ
リメラーゼは、タンパク質として、またはRNAポリメラーゼをコードするプラス
ミド上で導入され得る。T7システム、および細胞を形質転換するためのそれらの
使用についてのさらなる考察は、例えば、国際公開番号第WO 94/26911号；Studi
erおよびMoffatt、J．Mol．Biol．(1986)189：113-130；DengおよびWolff、Gene
（1994）143：245-249；Geoら、Biochem．Biophys．Res．Commun．(1994)200：1
201-1206；GaoおよびHuang、Nuc．Acids Res．(1993)21：2867-2872；Chenら、N
uc．Acids．Res．(1994)22：2114-2120；ならびに米国特許第5,135,855号を参照
のこと。
以下のような、しかしこれらに限定されない細菌ベクターもまた、目的の遺伝
子の送達のために使用され得る：例えば、M．smegmatisおよびM．bovis bacillu
Stoverら、Nature（1991）351：456、ならびにAldoviniおよびYoung、Nature（1
991）351：479を参照のこと）；S．typhimurium、S．sobrinus、およびS．dubli
3）11：143を参照のこと）；ならびにE．coliに由来するベクター；L．monocyto
genesのようなListeria（例えば、Frankelら、J．Immunol．(1995)155：4775を
参照のこと）；Shigellaなど。
目的の遺伝子はまた、被験体またはそれらが由来する細胞への送達の前に、抗
原を伴ってまたは伴わずに、リポソーム中にパッケージされ得る。脂質のカプセ
ル化は、一般的には、安定な結合または捕捉が可能でかつ核酸を保持し得るリポ
ソームを使用して達成される。脂質調製物に対する縮合されたDNAの比は変化し
得るが、一般的にはおよそ1：1（mg DNA：マイクロモル脂質）であるか、または
それ以上の脂質である。核酸の送達のためのキャリアとしてのリポソームの使用
の概要については、HugおよびSleight、Biochim．Biophys．Acta．(1991)1097：
1-17；Straubingerら、Methods of Enzymology（1983）、第101巻、512-527頁を
参照のこと。
本発明での使用のためのリポソーム調製物として、カチオン性（陽性に荷電し
た）、アニオン性（陰性に荷電した）、および中性の調製物が挙げられ、カチオ
ン性リポソームが特に好ましい。カチオン性リポソームは、機能的な形態での、
プラスミドDNA（Felgnerら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA（1987）84：7413-741
6）；mRNA（Maloneら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA（1989）86：6077-6081）；
および精製された転写因子（Debsら、J．Biol．Chem．(1990)265：10189-10192
）の細胞内送達を媒介することが示されている。
カチオン性リポソームは、容易に入手可能である。例えば、N[1-2,3-ジオレイ
ルオキシ）プロピル]-N,N,N-トリエチルアンモニウム（DOTMA）リポソームが、
登録商標Lipofectinのもとで、GIBCO BRL、Grand Island，NYから入手可能であ
る。（Felgnerら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA（1987）84：7413-7416もまた参
照のこと）。他の市販によって入手可能な脂質として、トランスフェクターゼ（
DDAB/DOPE）およびDOTAP/DOPE（Boerhinger）が挙げられる。他のカチオン性リ
ポソームが、当該分野で周知の技術を使用して容易に入手可能な物質から調製さ
れ得る。DOTAP（1,2-ビス（オレオイルオキシ）-3-(トリメチルアンモニオ)プロ
パン）リポソームの合成の記載については、例えば、Szokaら、Proc．Natl．Aca
d．Sci．USA（1978）75：4194-4198；PCT公開番号第WO 90/l1092を参照のこと。
同様に、アニオン性および中性のリポソームが、例えば、Avanti Polar Lipid
s（Birmingham，AL）から容易に入手可能であるか、または容易に入手可能な物
質を使用して簡単に調製され得る。このような物質として、ホスファチジルコリ
ン、コレステロール、ホスファチジルエタノールアミン、ジオレオイルホスファ
チジルコリン（DOPC）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（DOPG）、ジ
オレオイルホスファチジルエタノールアミン（DOPE）などが挙げられる。これら
の物質もまた、DOTMAおよびDOTAP出発物質と、適切な比で混合され得る。これら
の物質を使用してリポソームを作製するための方法は、当該分野で周知である。
リポソームは、多層の小胞（MLV）、小さい単層の小胞（SUV）、または大きな
単層の小胞（LUV）を含み得る。種々のリポソーム−核酸複合体が、当該分野で
公知の方法を使用して調製される。例えば、Straubingerら、METHODS OF IMMUNO
LOGY（1983）、第101巻、512-527頁；Szokaら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA（1
978）75：4194-4198；Papahadjopoulosら、Biochim．Biophys．Acta（1975）394
：483；Wilsonら、Cell（1979）17：77）；DeamerおよびBangham、Biochim．Bi
ophys．Acta（1976）443：629；Ostroら、Biochem．Biophys，Res．Commun．(19
77)76：836；Fraleyら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA（1979）76：3348）；Enoc
hおよびStrittmatter，Proc．Natl．Acad．Sci．USA（1979）76：145）；Fraley
ら、J．Biol．Chem．(1980)255：10431；SzokaおよびPapahadjopoulos、Proc、N
atl．Acad．Sci．USA（1978）75：145；ならびにSchaefer-Ridderら、Science（
1982）215：166を参照のこと。
DNAおよび／またはタンパク質抗原もまた、Papahadjopoulosら、Biochem．Bio
phys．Acta．(1975)394：483-491によって記載されるものと同様に、鍋牛殻状の
脂質組成物中に送達され得る。米国特許第4,663,161号および同第4,871,488号も
また参照のこと。
粒子状システムおよびポリマーが、目的の遺伝子のインビボまたはエキソビボ
での送達のために使用され得る。例えば、ポリマー（例えば、ポリリジン、ポリ
アルギニン、ポリオルニチン、スペルミン、スペルミジン、およびこれらの分子
の結合体）は、目的の核酸を導入するために有用である。同様に、DEAEデキスト
ラン媒介性トランスフェクション、リン酸カルシウム沈殿、または他の不溶性の
無機塩（例えば、リン酸ストロンチウム、ベントナイトおよびカオリンを含有す
る珪酸アルミニウム、酸化クロム（III）、珪酸マグネシウム、タルクなど）を
使用する沈殿が、本方法での使用を見出す。遺伝子の導入に有用な送達システム
の概要については、例えば、Felgner，P.L.、Advanced Drug Delivery Reviews
（1990）5：163-187を参照のこと。
さらに、金およびタングステンのような粒子状キャリアを使用する微粒子銃（
biolistic）送達システムが、目的の遺伝子を送達するために特に有用である。
粒子は、送達される遺伝子でコートされ、そして一般的には、「遺伝子銃」によ
る火薬放出を使用して、減圧雰囲気下で高速に加速される。このような技術、お
よびそのために有用な装置の記載については、例えば、米国特許第4,945,050号
；同第5,036,006号；同第5,100,792号；同第5,179,022号；同第5,371,015号；お
よび同第5,478,744号を参照のこと。
組換えベクター（付随する脂質またはキャリアを伴うか、または伴わない）が
、脊椎動物被験体への送達のための組成物中に処方される。これらの組成物は、
予
防的（感染を妨げるため）または治療的（感染後に疾患を処置するため）のいず
れかであり得る。この組成物は、抗原の量がインビボで産生され得るような「治
療有効量」の目的の遺伝子を含み、その結果、免疫応答が、その組成物を投与さ
れる個体中で生成される。必要な正確な量は、他の因子の中でも、処置される被
験体：処置される被験体の年齢および一般的な状態；抗体を合成する被験体の免
疫系の能力；所望される防御の程度；処置される状態の重篤度；選択される特定
の抗原およびその投与の態様に依存して変化する。適切な有効量は、当業者によ
って容易に決定され得る。従って、「治療有効量」は、慣用的な試行によって決
定され得る、比較的広範な範囲に入る。例えば、本発明の目的のためには、有効
用量は、代表的には約１μgから約100mgまでのDNA構築物の範囲であり、より好
ましくは、約10μgから約1mgまでのDNA構築物の範囲である。
組成物は、一般的には、１つ以上の「薬学的に受容可能な賦形剤またはビヒク
ル」（例えば、水、生理食塩水、グリセロール、ポリエチレングリコール、ヒア
ルロン酸、エタノールなど）を含む。さらに、補助的な物質（例えば、湿潤剤ま
たは乳化剤、pH緩衝化物質など）が、このようなビヒクル中に存在し得る。核酸
の取り込みおよび／または発現の特定の促進剤（例えば、ブピバカイン、カルジ
オトキシン、およびスクロースであるが、これらに限定されない）もまた、組成
物中に含まれ得るか、または同時投与され得る。
一旦処方されると、本発明の組成物は、上記のような方法を使用して、被験体
に直接投与され得るか、あるいは、被験体に由来する細胞にエキソビボで送達さ
れ得る。例えば、エキソビボ送達および形質転換された細胞を被験体へ再移植す
るための方法が当該分野で公知であり、そして例えば、デキストラン媒介性トラ
ンスフェクション、リン酸カルシウム沈殿、ポリブレン媒介性トランスフェクシ
ョン、リポフェクトアミンおよびLT-1媒介性トランスフェクション、プロトプラ
スト融合、エレクトロポレーション、ポリヌクレオチドのリポソーム中へのカプ
セル化（対応する抗原を伴うか、または伴わない）、ならびに核へのDNAの直接
的なマイクロインジェクションが挙げられる。
インビボでの組成物の直接的な送達は、一般的には、上記のようなウイルスベ
クターを用いるかまたは用いないで、従来のシリンジまたは遺伝子銃（例えば、
を使用する注射によって達成される。構築物は、皮下、表皮、皮内、粘膜内（例
えば、鼻、直腸および膣）、腹膜内、静脈内、経口的、または筋肉内のいずれか
で注射され得る。例えば、表皮の細胞へのDNAの送達は、皮膚に関連するリンパ
系細胞への接近を提供し、そしてワクチンのレシピエント中でのDNAの一時的な
存在を提供する。投与の他の態様として、経口および肺投与、坐剤、および経皮
塗布が挙げられる。
投薬処置は、単回の用量スケジュールまたは複数回の用量スケジュールであり
得る。複数回の用量スケジュールは、ワクチン接種の最初の過程が１〜10回の別
々の用量を用いて行われ、免疫応答を維持および／または補強するために選択さ
れるその後の時間間隔（例えば、第２回目の用量については１〜４ヶ月）で与え
られる他の用量、そして必要とされる場合は、数ヶ月後にその後の用量が続く。
追加投与は、核酸ワクチンを用い得るか、または送達された核酸構築物によって
コードされる抗原を含むサブユニット抗原組成物を含み得る。投与量レジメは、
少なくとも一部、被験体の要求によって決定され、そして実施者の判断に依存す
る。
疾患の予防が所望される場合は、ワクチンは、一般的には、目的の病原体での
最初の感染の前に投与される。処置（例えば、症状または再発の減少）が所望さ
れる場合は、ワクチンは、一般的には、最初の感染に続いて投与される。
上記に説明されるように、サブミクロン水中油型エマルジョン処方物もまた、
脊椎動物被験体に対して、遺伝子の送達の前に、それと同時に、またはそれに続
いてのいずれかで、投与される。同時の送達が所望される場合は、サブミクロン
水中油型処方物は、核酸組成物中に含まれ得る。あるいは、そして好ましくは、
水中油型エマルジョンは、核酸組成物の送達と同じ部位または異なる送達部位の
いずれかで、遺伝子の送達の前に別々に投与される。核酸免疫の前に投与される
場合は、処方物は、核酸免疫の５〜10日程度前、好ましくは、核酸免疫の３〜５
日前、そして最も好ましくは、目的の核酸での免疫の１〜３日または２日前に、
投与され得る。
本発明での使用に適切なサブミクロン水中油型処方物の例として、無毒性の、
代謝可能な油（例えば、植物油、魚油、動物油、または合成によって調製された
油）が挙げられる。魚油（例えば、タラの肝臓の油、サメの肝臓の油，およびク
ジラの油）が好ましく、サメの肝臓の油中に見出されるスクアレン、2,6,10,15,
19,23-ヘキサメチル-2,6,10,14,18,22-テトラコサヘキサエンが、特に好ましい
。油成分は、約0.5容量％から約20容量％の量で、好ましくは、約15容量％まで
の量で、より好ましくは、約１容量％から約12容量％までの量で、そして最も好
ましくは、１容量％〜約４容量％の油が存在する。
アジュバントの水性部分は、緩衝化された生理食塩水または純粋な水であり得
る。組成物が非経口的に投与される場合は、組成物と生理学液な液体との間の異
なるイオン濃度に起因する、組成物の投与後の腫脹または迅速な吸収を妨ぐため
に、張度（すなわち、重量オスモル濃度）が正常な生理学的な液体と本質的に同
じであるように、最終的な溶液が作製されることが好ましい。水よりもむしろ生
理食塩水が使用される場合、正常な生理学的条件と適合性であるpHを維持するた
めに、生理食塩水を緩衝化することが好ましい。また、特定の例においては、特
定の組成物の成分の安定性を確実にするための特定のレベルでpHを維持すること
が必要であり得る。このように、組成物のpHは、一般的には、pH６〜８であり、
そしてpHは、任意の生理学的に受容可能な緩衝液（例えば、リン酸緩衝液、酢酸
緩衝液、トリス緩衝液、重炭酸緩衝液、または炭酸緩衝液など）を使用して維持
され得る。存在する水性薬剤の量は、一般的には、組成物を所望の最終容量にす
るために必要な量である。
水中油型処方物における使用に適切な乳化剤として、ソルビタンに基づく非イ入手可能な界面活性剤）；ポリオキシエチレンソルビタンモノエステルおよびポ
アセチル、ステアリル、およびオレイルアルコールに由来するポリオキシエチレ
これらに限定されない。これらの物質は、ICI America's Inc.、Wilmington，DE
を含む多数の商業的供給源から容易に入手可能である。これらの乳化剤は、単独
で、または組み合わせて使用され得る。乳化剤は、通常は、約0.02重量％から約
2.5重量％（w/w）の量で、好ましくは、0.05重量％から約１重量％の量、そして
最も好ましくは、0.01重量％から約0.5重量％の量で存在する。存在する量は、
一般的には、使用される油の重量の約20〜30％である。エマルジョンはまた、ム
ラミルペプチド（N-アセチル-ムラミル-L-スレオニル-D-イソグルタミン（thr-M
DP）、N-アセチル−ノルムラミル-L-アラニル-D-イソグルタミン（nor-MDP）、N
-アセチルムラミル-L-アラニル-D-イソグルタミニル-L-アラニン-2-(1'-2'-ジパ
ルミトイル-sn-グリセロ-3-ヒドロキシホスホリルオキシ)-エチルアミン（MTP-P
E）などを含むが、これらに限定されない）のような他の免疫刺激剤を含み得る
。免疫刺激性の細菌細胞壁成分（例えば、モノホスホリル脂質Ａ(monophosphony
lipid A)（MPL）、トレハロースジミコール酸（TDM）、および細胞壁骨格（CWS
））もまた、存在する。サブミクロン粒子（すなわち、直径１ミクロン未満であ
り、そしてナノメートルの大きさの範囲未満の粒子）を産生するために、多数の
技術が使用され得る。例えば、市販の乳化機が使用され得る。これは、高圧下で
小さい開口部を通じて液体を押し出すことによって生じる高い剪断力の原理によ
って作動する。市販の乳化機の例として、Model 110Y微量流動化装置（Microflu
idics，Newton,MA）、Gaulin Model 30CD（Gaulin，Inc.，Everett,MA）およびR
ainnie Minilab Type 8.30H（Miro Atomizer Food and Dairy，Inc.，Hudson，W
I）が挙げられるが、これらに限定されない。個々の乳化機の使用についての適
切な圧力は、当業者によって容易に決定される。例えば、Model 110Y微量流動化
装置が使用される場合は、5000から30,000psiでの操作によって、約100から750n
mの直径を有する油滴が生じる。
油滴の大きさは、油に対する界面活性剤の比を変化させること（比の増大は液
滴の大きさを減少させる）、圧力を操作すること（操作圧力の増大は、液滴の大
きさを減少させる）、温度（温度上昇は液滴の大きさを減少させる）、および両
親媒性免疫刺激剤を添加すること（このような試薬の添加は液滴の大きさを減少
させる）によって、変更され得る。実際の液滴の大きさは、特定の界面活性剤、
油、および免疫刺激剤（存在すれば）に関して、そして特定の選択される操作条
件に関して変化する。液滴の大きさは、サイジング機器（例えば、Coulter Corp
orationによって製造された市販のSub-Micron Particle Analyzer（Model N4MD
））の使用によって確認され得、そしてパラメーターは、実質的に全ての液滴が
直径１ミクロン未満であるように、好ましくは、直径約0.8ミクロン未満である
ように、そして最も好ましくは、直径約0.5ミクロン未満であるようにまで、上
記に示される指針を使用して変更され得る。実質的に全てによって、少なくとも
約80％（数で）、好ましくは少なくとも約90％、より好ましくは少なくとも約95
％、そして最も好ましくは少なくとも約98％が意味される。粒子の大きさの分布
は、代表的にはガウス分布であり、その結果、平均的な直径は、示される限界よ
りも小さい。
本明細書中で使用のために特に好ましいサブミクロン水中油型エマルジョンは
、必要に応じて種々の量のMTP-PEを含有するスクアレン／水エマルジョン（例え
ば、「MF59」として公知の、サブミクロン水中油型エマルジョンである（国際公
開番号第WO 90/14837号；Ottら、「MF59--Design and Evaluation of a Safe an
d Potent Adjuvant for Human Vaccines」Vaccine Design：The Subunit and Ad
juvant Approach（Powell，M.F.およびNewman，M.J.編）Plenum Press，New Yor
k，1995、277-296頁」）。MF59は、４〜５％w/vのスクアレン（例えば、4.3％）
、0.
応じて種々の量のMTP-PEを含有し、Model 110Y微量流動化装置（Microfluidics
，Newton，MA）のような微量流動化装置を使用してサブミクロン粒子中に処方さ
れる。例えば、MTP-PEは、約０〜500μg／用量、より好ましくは０〜250μg／用
量、そして最も好ましくは０〜100μg／用量の量で存在し得る。従って、MF59-0
は、MTP-PEを含まない上記のサブミクロン水中油型エマルジョンをいい、一方、
MF59-100は、１用量あたり100μgのMTP-PEを含有する。
本明細書中での使用のための別のサブミクロン水中油型エマルジョンであるMF
ronicブロックポリマーL121、およびthr-MDPを含有し、またサブミクロンエマル
ジョンに微量流動化される。２％のスクアレン、0.2％のTween 80、ならびにモ
ノホスホリル脂質Ａ（MPL）、トレハロースジミコール酸（TDM）、および細胞壁
骨格（CWS）からなる１つ以上の細菌細胞壁成分（好ましくは、MPL＋CWS）（Det
oxTM））を含有する、RibiTMアジュバントシステム（RAS）（Ribi Immunochem，
Hamiltom，MT）もまた、本発明で有用である。
本発明での使用のための種々のサブミクロン水中油型エマルジョン処方物の記
載については、例えば、国際公開番号第WO 90/14837号；Remington：The Scienc
e and Practice of Pharmacy，Mack Publishing Company、Easton，Pennsylvani
a、第19版、1995；Van Nestら、「Advanced adjuvant formulations for use wi
th recombinant subunit vaccines」In Vaccines 92、Modern Approaches to Ne
w Vaccines（Brownら編）Cold Spring Harbor Laboratory Press、57-62頁（199
2）；およびOttら、「MF59--Design and Evaluation of a Safe and Potent Adj
uvant for Human Vaccines」Vaccine Design：The Subunit and Adjuvant Appro
ach（Powell，M.F.およびNewman，M.J.編）Plenum Press，New York（1995）、2
77-296頁を参照のこと。
サブミクロン水中油型エマルジョンに加えて、目的の遺伝子の送達の前に投与
される他のアジュバントもまた、遺伝子によってコードされる抗原の免疫原性を
増強するように作用することがまた、驚くべきことに見出されている。このよう
なアジュバントとして、以下が挙げられるが、これらに限定されない：（１）ア
ルミニウム塩（ミョウバン）（例えば、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウ
ム、硫酸アルミニウムなど）；（２）サポニンアジュバント（例えば、StimulonTM
（Cambridge Bioscience，Worcester，MA））、またはISCOM（免疫刺激複合体
）のようなそれらから生成された粒子；（３）完全フロイントアジュバント（CF
A）および不完全フロイントアジュバント（IFA）；（４）サイトカイン（例えば
、インターロイキン（IL-1、IL-2など）、マクロファージコロニー刺激因子（M-
CSF）、腫瘍壊死因子（TNF）など；（５）細菌のADP-リボシル化毒素（例えば、
コレラ毒素（CT）、百日咳毒素（PT）、またはE．coli熱不安定性毒素（LT）（
特に、LT-K63（ここでは、63位で野生型アミノ酸がリジンに置換されている）、
LT-R72（ここでは、72位で野生型アミノ酸がアルギニンに置換されている）、CT
-S109（ここでは、109位で野生型アミノ酸がセリンに置換されている）、
およびPT-K9/G129（ここでは、９位で野生型アミノ酸がリジンに置換されており
、そして129位でグリシンに置換されている））の無毒化変異体（例えば、国際
公開番号第WO93/13202号および同第WO92/19265号を参照のこと）；ならびに（６
）抗原の免疫原性を増強する免疫刺激剤として作用する他の物質。
III ．実験
以下は、本発明の実施のための特定の実施態様の例である。これらの例は、説
明の目的のみのために与えられ、そしていかなる方法においても、本発明の範囲
を限定することは意図されない。
使用される数（例えば、量、温度など）に関する正確性を確実にするための努
力が行われているが、それについてのいくつかの実験的な誤差および偏差が、当
然、許容されるはずである。
実施例１ HIV プラスミドDNAの投与前に アジュバント処方物で免疫したマウス中でのCTL応答
BALB/cマウスを、４つの処置群に分けた。アジュバントを与えなかった１つの
群を、コントロールとして提供した。群２には、１：１で生理食塩水と混合した
50μlのミョウバンを、前脛骨（TA）筋中に両側から注射した。群３には、生理
食塩水と１：１で混合したMF59-0（4.3％w/vのスタアレン、0.5％w/vのTween 80
59-100（100μg／用量のMTP-PEを含有する改変されたMF59処方物のホモジナイゼ
ーション）を上記のように注射した。（Van Nestら、「Advanced adjuvant form
ulations for use with recombinant subunit vaccines」Vaccines 92、Modern
Approaches to New Vaccines（Brownら編）Cold Spring Harbor Laboratory Pre
ss、57-62頁（1992）；およびOttら、「MF59--Design and Evaluation of a Saf
e and Potent Adjuvant for Human Vaccines」Vaccine Design：The Subunit an
d Adjuvant Approach（Powell，M.F.およびNewman，M.J.編）Plenum Press，New
York，(1995)、277-296頁を参照のこと）。
３日後、マウスに、レトロウイルスベクターHIV-IT（国際公開番号第WO 91/02
805号；Ziegnerら、AIDS（1995）9：43-50）を与えた。HIV-ITは、HIV-Iタンパ
ク質の発現を促進するrev遺伝子の第1のエキソンが先行する、完全なHIV-IIIIB
env遺伝子をコードする。アジュバントの注射の21日後、プライム化脾臓細胞を
回収し、CTLをインビトロで再刺激し、そしてCTL活性アッセイを行った。
CTLの定量的な決定を、Taswell，J．Immunol．(1981)126：1614-1619によって
記載されているような単一ヒットポアッソンモデルに基づいて、CTL前駆体頻度
アッセイ（CTLp）としても知られる限界希釈アッセイを使用して行った。このア
ッセイを、当該分野で周知の方法を使用して行った。簡潔には、限界希釈アッセ
イのために、インビトロでの再刺激工程を、バルクの脾臓細胞培養物よりもむし
ろクローンについて行う（以下の実施例２を参照のこと）。微量培養プレートの
60個のウェルを、固定した数のプライム化脾臓細胞で満たした。別のセットの60
個のウェルに、種々の数のプライム化細胞を入れた；第３のセットのウェルには
第３の数の細胞を与えた；など。全てのウェルにまた、標的抗原に対して特異的
なウェル中の任意のCTLを刺激するように、照射した標的細胞を与えた。７〜10
日間のインキュベーション後、細胞のアリコートを、放射標識した標的細胞を含
有するウェルに移し、そして51Crの放出を測定した。個々のウェルを、標識した
標的を含有するが、エフェクターは含まないウェルに由来するベースラインの放
出と比較して、CTL活性について「＋」または「−」のいずれかでスコア付けし
た。
投入したプライム化脾臓細胞の各濃度でCTL活性を有するウェルの数を記録し
た後、投入集団中のCTLの頻度を、Taswell，J．Immunol．(1981)126：1614-1619
に示される式に従って計算し得る。（ここで示すデータは、「最小χ2」法によ
って計算した；「最尤」法を使用する計算によって、ほぼ同一の結果を得た。）
これらの数は、プライム化脾臓細胞の中でのCTLの逆の頻度を示す。言いかえれ
ば、MF59-0で予備プライム化し、次いでHIV-ITで免疫した動物の脾臓においては
、およそ17,000個の脾臓細胞のうちの１個が、HIV-ITによってコードされる抗原
についてCTL特異的である；一方、アジュバントを与えなかった動物においては
、55,000個の脾臓細胞のうちの１個未満が、HIV-IT特異的CTLである。括弧内に
は、投入データに基づく頻度の計算についての95％の信頼区間の範囲を示す。こ
の実験におけるMF59-0での予備処理によるCTL活性の増強は、統計学的に有意で
ある；ミョウバンでの予備処理は、CTL活性のさらに弱い増強を示し；そしてMF5
9-100はこの応答に対していかなる影響をも示さないようである。
実施例２ HBV レトロウイルスベクターの投与前に アジュバント処方物で免疫したマウス中のCTL応答
C3Hマウスを、３つのマウス／群の６つの処置群にわけ、そして上記のようにT
A筋中にアジュバント（140mMのNaClと１：１混合した）を注射した。２日後、マ
ウスにレトロウイルスベクター6A3を、同じ筋肉の部位に希釈せずにまたは希釈
してのいずれかで与えた。以下の群を含んだ：
コントロール--未希釈のベクター*ミョウバンでの予備処理；未希釈のベクター
*MF59-0での予備処理；未希釈のベクター
コントロール--希釈したベクター（1：10）
ミョウバンでの予備処理；希釈したベクター（1：10）
MF59-0での予備処理；希釈したベクター（1：10）*
は、再刺激の間のサンプル汚染により、これらの各群中には２つのサンプルし
かない
ベクター6A3は、Ｂ型肝炎コアタンパク質とneoRタンパク質との間の融合物で
ある、キメラタンパク質をコードするレトロウイルスベクターである。例えば、
国際公開番号第WO 93/15207号を参照のこと。以前の研究は、このベクターがC3H
マウスにおいて弱いCTL応答を誘導することを示した。
アジュバントの注射の21日後、脾臓を個々に回収し、そして標準的なCTL活性
アッセイを行った。簡潔には、免疫したBALB/cマウスに由来する脾臓細胞を培養
し、再刺激し、そしてHIV env/rev抗原を発現し、従って、ベクター誘導性のCTL
による溶解に対して感受性である、51Cr標識した標的細胞に対するCTL活性につ
いてアッセイした。既知の方法を使用して、標的細胞（T）をエフェクター（E）
細胞とともに、種々のE：T比で４時間培養した。培養物上清のアリコートを回収
し、そして上清への51Crの放出を、シンチレーションカウンティングによって定
量した。実験ウェルの上清中の51Crを、エフェクターを伴わずにインキュベート
した標的からの放出（「自発的放出」）、および界面活性剤とともにインキュベ
ートした標的（「最大放出」）と比較した。CTL活性の測定値である「比放出％
」を、以下の式を使用して計算する：
種々のE：T比での比放出％を、図１Ａ（未希釈のベクター）および１Ｂ（希釈し
たベクター）にプロットする。見られ得るように、MF59-0は、アジュバントでの
予備処理なしではCTL活性がほとんど見られないようにベクターを希釈した場合
もなお、CTL誘導を有意に増強した。希釈したベクターおよびMF59-0での予備処
理を与えられた３つの動物のうち２つが、予備処理を受けずに未希釈のベクター
を与えられた動物よりも強いCTL応答を示したことに留意することは興味深い。
このことは、ベクター活性が、MF59-0によって10倍以上増強されることを示唆す
る。ミョウバンもまた、本研究において増強効果を示した；しかし、この効果は
、MF59-0を用いて見られる効果よりも弱かった。
ｂ．第２の研究を、上記の研究と平行して行った。ここでは、C3HマウスにMF5
9-0を、レトロウイルスベクター6A3の注射の１日前または２日前のいずれかに、
与えた。CTL前駆体頻度を、実施例１に記載しているように決定した。結果を、
表２に示す。
表１と同様に、結果を、CTLの逆の頻度として示し、95％の信頼限界を括弧内に
示す。MF59-0での予備処理は、6A3抗原に対して特異的なCTLの誘導を有意に増強
する；ここでは、影響は、ベクターの２日前にアジュバントを与えた場合に、よ
り強い。
実施例３ HIV-IT の投与の前にアジュバント処方物で免疫したマウスにおけるIgG誘導
Balb/cマウスを、実施例１に記載するように４つの処置群に分け、そしてそれ
ぞれ140mMのNaClと１：１で組み合わせた、ミョウバン、MF59-0、またはMF59-10
0を、記載するようにTA筋内に投与した。アジュバントの投与の２日後、マウス
に、実施例１に記載するように、HIV-ITレトロウイルスベクターを与えた。９週
目に、マウスに、アジュバントを伴わずに、HIV-ITベクターの追加投与を受容さ
せた。
血清サンプルを、最初の処置の前に、そしてその後に一定の間隔で回収し、そ
してHIV gp120に特異的なIgG1のレベルを、標準的なELISAを使用して決定した。
例えば、Fullerら、AIDS Res．Hum．Retroviruses（1994）10：1433-1441を参照
のこと。結果を、図２に示す。データを、１：100の血清希釈についてのO.D．45
0の平均として示す。見られ得るように、ミョウバンおよびMF59-100での予備処
理の両方が、Ig誘導を増強した。
従って、核酸免疫技術を伴うサブミクロン水中油型エマルジョンの使用が、開
示される。本発明の好ましい実施態様が、いくらか詳細に記載されているが、明
らかなバリエーションが添付の請求の範囲によって規定されるような本発明の精
神および範囲から逸脱することなく行われ得ることが、理解される。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，
ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ
Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ
，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，
ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ
Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ
，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)
，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，
ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，Ｄ
Ｋ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ
，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，
ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，Ｌ
Ｖ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ
，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，
ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，Ｕ
Ｚ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ
(72)発明者 バン ネスト，ギャリー
アメリカ合衆国 カリフォルニア 94608,
エミリービル，ホートン ストリート
4560，カイロン コーポレイション内