JPH05508385A - サブミクロン油滴乳剤を含んで成るアジュバント製剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 サブミクロン油滴乳剤を含んで成るアジュバント製剤１−入 葺土公団 本発明は、一般に、ワクチンの効率を高めるために使用する免疫アジュバント（ ａｄｊｕｖａｎｔｓ）に関し、特に、水中油エマルジョンよりなるアジュバント に関する。

■盈致歪 組換えＤＮＡ技術によって作出された新規サブユニットワクチンの出現は安全で 有効なアジュバントへの要求を強めた。

伝統的な生抗ウィルスワクチンはアジュバントを必要としない、死滅ウィルスワ クチンは、一般に、サブユニットワクチンよりはるかに免疫原性があり、アジュ バントなしで有効であるか、または限られた免疫応答刺激能しか有さないアジュ バントとの共存下で有効である。新しい組換ＤＮＡ由来サブユニットワクチンは 、安全性や生産コストの面で伝統的なワクチンより著しい利点を有するが、一般 に、完全なウィルスに比べて制限された免疫原性しか有さない、分離された蛋白 質または蛋白質混合物を表す、かかる物質は、それらを、ワクチンで以前から用 いられてきた完全な生物（ｏｒｇａｎｉｓｍ）　（及びそれらの部分）と区別す るために、本明細書では、−ａに、分子抗原（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ａｎｔｉｇ ｅｎｓ）と呼ぶ、これらのワクチンは、病気を予防するのに十分な能力に到るた めに、著しい免疫促進能を有するアジュバントを必要とする。

現在、米国でヒトへの使用に対して認可されている唯一のアジュバントはアルミ ニウム塩（アルム）である。これらのアジュバントはＢ型肝炎、ジフテリア、ポ リオ、狂犬病、インフルエンザを初めとするいくつかのワクチンに対して有用で あったが、他のワクチン、特に保護のために細胞性免疫（ｃｅｌｌ−ｍｅｄｉａ ｔｅｄ　ｉｍｍｕｎｉｔｙ）の刺激が必要とされる場合のワクチンに対しては有 用でない、報告によるとアルムは百日咳及び腸チフスワクチンの有効性を改善せ ず、アテツウィルスワクチンについてほんのわずかな効果を示した。アルミニウ ム塩に関する問題として注射部位での肉芽腫の誘導及びアルム製剤のロフト毎の ばらつきが挙げられる。

完全フロインドアジュバント（ＣＦＡ）は実験段階で多くの抗原について成功裏 に使用されてきた強力な免疫刺激剤である。ＣＦＡは３つの成分、すなわち、鉱 油、アーラセルＡ（Ａｒｌａｃｅｌ　Ａ）等の乳化剤及びミコバクテリウム・チ ュバキュロシス（鉦印畑旦ｔｅｒｉ叩ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）等の死滅ミコ バクテエマルジョンを作る。しかしながら、ＣＦＡは痛み、ｍｓ影形成び発熱を はじめとする重篤な副作用を引き起こし、ヒトまたは獣医用のワクチンに使用で きない。副作用は、主として、ＣＦＡのミコバクテリア成分に対する宿主の反応 による。

不完全フロインドアジュバント（ＩＦＡ）は細菌成分を除いたＣＦＡに類似して いる。米国では使用が認可されていないが、他の国ではＩＦＡはいくつかの型の ワクチンに対し有用であった。ＩＦＡはヒトにおいてはインフルエンザ及びポリ オワクチンについて、及び狂犬病、イヌジステンパー及び口蹄疫をはしめとする い（っかの動物ワクチンについて成功裏に使用された。実験によると、ＩＦＡで 使用する油及び乳化剤の両方がマウスに腫瘍を起こす場合があることが判明した 。

このことはヒトへの使用については別のアジュバントを用いる方がよいことを示 している。

ムラミルジペプチド（ｍｕｒａｍｙｌ　ｄｉｐｅｐｔｉｄｅ）（ＭＤＰ）はＣＦ Ａで観察されるアジュバント活性を生じさせる。ミコバクテリア細胞壁複合体（ ｃｏａ＋ｐｌｅｘ）の最小単位である。エロウズ（Ｅｌｌｏｕｚ）ら、（１９７ ４）　Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ｒｅｓ、Ｃｏｗｎ、＋　５９＋　１３ １７参照。広範囲のアジュバント能力及び副作用を示す多くのＭＤＰ類縁体が合 成された。チェディラド（Ｃｈｅｄ　ｉｄ）ら、（１９７８）Ｐｒｏｇ、Ａｌｌ ｅｒｇｙ、　２５＋　６３ｅワクチンのアジュバントとして特に有用であるかも 知れない３つのアナログはＭＤＰのトレオニル誘導体〔ビアーズ（Ｂｙａｒｓ） ら、（１９８７）　Ｖａｃｃｉｎｅ、５　、２２３）、ＭＤＰのｎ−ブチル誘導 体〔チェディー、Ｊドら（１９８２）　Ｉｎｆｅｃｔ。

ａｎｄ　Ｉｍｍｕｎ、共、　４１７　：ｌ及びムラミルトリペプチドの親油性誘 導体〔ギスラー（Ｇｉｓｌｅｒ）ら、（１９８１）、Ｙ、ヤマムラ及びＳ、コタ ニ編、Ｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｉｏｎｓ　ｏｆ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ　Ｐｒ ｏｄｕｃｔｓａｎｄ　Ｒｅ１ａｔｅｄ　５ｙｎｔｈｅｔｉｃ　Ｃｏｍｐｏｕｎｄ ｓ（微生物生産物及びその関連合成化合物の免疫修飾）、Ｅｘｃｅｒｐｔａ　Ｍ ｅｄｉｃａ、アムステルダム、１６７頁〕である。これらの化合物は体液性及び 細胞性の免疫を刺激し、低レベルの毒性を示す。

ＭＤＰの１つの将来有望な親油性誘導体はＮ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル −Ｄ−イソグルタミニルーム−アラニン−２−Ｃ１，２−ジパルミトイル−５ｎ −グリセロ−３−３（ヒドロキシホスホリルオキシ）］エチルアミド（ＭＴＰ− ＰＥ）である。このムラミルトリペプチドは、該分子の疎水部と脂肪環境との会 合（ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）を可能にするリン脂質の尾を有し、他方、ムラミ ルペプチド部は水性環境と会合する（ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ）　、このように、 ＭＴＰ−ＰＥ自身が乳化剤として働いて安定な水中油エマルジョンを生成し得る 。

ＭＴＰ−ＰＥについての本発明者らの実験室での独創的なマウス実験によると、 このアジュバントは単純ヘルペスウィルスｇＤ抗原に対する抗Ｈ３ＶｇＤ抗体力 価を刺激するのに有効であり、またその有効性はＭＴＰ−ＰＥ及びｇＤを水溶液 よりむしろ油（ｒＦＡ）で供給した場合にはるかに改善されることが判明した。

ＩＦＡはヒトの使用に認可されていないので、ＭＴＰ−ＰＥ及び抗原用の他の油 供給系が調査研究された。ｏ、ｏｏｓ％ツイーン８０を含有する４％スクアレン とＨ３ＶｇＤとのエマルジョンがモルモットに非常に良好な免疫を与えた。この 製剤、ＭＴＰ−ＰＥ−ＬＯ（低油）は皮下針を通して乳化されるが、非常に不安 定であった。けれども、この製剤はモルモットで高い抗体力価を与え、また免疫 化したモルモットへのＨ３Ｖチャレンジにおいて良好な保護を与えた。この製剤 はフントバッド（ｆｏｏｔｐａｄ）に供給した際にもっとも有効であったが、筋 肉内に供給した場合にもほどよい抗体力価を与えた。これらのデータは２つの刊 行物に示された〔サンチェズーベスカドール（Ｓａｎｃｈｅｚ−Ｐｅｓｃａｄｏ ｒ）ら、Ｊ、ｆｎｕｎｏｌｏｇｙ　１４１．１７２０−１７２７．１９８８及び ラスキー（Ｌａｓｋｅｙ）ら編、Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌ　Ａｄｖａｎｃｅ ｓ　ｉｎ　Ｖａｃｃｉｎｅ　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ（ワクチン開発における技 術進歩）、アランＲ，Ｌｉ５ｓ（Ａｌａｎ　Ｒ，Ｌｉ５ｓ）社、４４５−４６９ ．１９８８　）。ＭＴＰ−ＰＥ−ＬＯ製剤は酵母生産ＨＩＶエンベロープ蛋白質 に対するモルモット中での免疫応答を刺激するのにも有効であった。ＭＴＰ−Ｐ Ｅ製剤によって、エライザ（ＥＬ　Ｉ　ＳＡ）抗体力価及びウィルス中和抗体力 価の両方が高レベルにまで刺激された。しかしながら、同じ製剤をヤギ、ヒト等 の大型動物で試験したところ、該組成物は有効でなかった。このように、ヒトや 他の大型動物中で分子抗原と共に使用するための別のアジュバント製剤がめられ ていることは明らかである。

ｌ」Ｌ至ＪＬｔ かくの如く、本発明の１つの目的は大型動物中での分子抗原に対する免疫応答を 刺激するのに適したアジュバント製剤を提供することである。

驚＜へきことに、満足すべきアジュバント製剤が、代謝し得る油と乳化剤よりな る組成物であって、油及び乳化剤が、実質上すべてが直径で１ミクロンより小さ な油小滴を有する水中油エマルジョンの形態で存在し、該組成物がポリオキシブ ロビレンーポリオキシエチレンブロックコポリマーの不存在下に存在する組成物 によって提供されることが見出された。

従来、かかるブロックコポリマーはサブミクロン（ミクロンより小さい）水中油 エマルジョンの製造に必須であると考えられていた。本組成物は免疫刺激剤（免 疫賦活剤）　（ｉｍｍｕｎｏｓｔｆｍｕｌａｔｉｎｇ　ａｇｅｎｔ）　（このも のは、両親媒性免疫刺激剤を選択する場合には、乳化剤と同じであることができ る）を含んでいてもよい。

ｌ止煎旦諌至Ｅ五 本発明は代謝性油（ｓｅｔａｂｏｌｉｚａｂｌｅ　ｏｉｌ）と乳化剤よりなるア ジュバント組成物であって、該油と乳化剤が、実質上すべてが直径１ミクロンよ り小さな油小滴を有する水中油エマルジョンの形態で存在するアジュバント組成 物を提供する。後述の実施例で詳細に報告する本発明者らの実験室での研究によ ると、本発明によって提供される組成物は、油及び乳化剤を含有し、油小滴がず っとより大きなアジュバント組成物に比べ驚くべき優位性を示す。

本発明のアジュバント組成物の個々の成分は既知であるが、かかる組成物は、か つて、同様な方法で結合されておらず、かかる小直径の小滴サイズで供給されて いなかった。従って、以下に一般的に及び好ましい態様についである程度詳細に 記述するけれども、個々の成分は当分野で周知であり、本発明で用いる、代謝性 油、乳化剤、免疫刺激剤（ｉｍｍｕｎｏｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇａｇｅｎｔ）、 ムラミルペプチド、親油性ムラミルペプチド等の用語は、これらの化合物を、さ らに説明することなく、当業者に対し記述できるほど十分に周知である。

これらの製剤の１つの成分は、それらに限定される訳ではないが、アルカン、ア ルケン、アルキン及びそれらの対応する酸及びアルコール、それらのエーテル及 びエステル、及びそれらの混合物をはじめとする、代謝され得る、非毒性の油、 好ましくは炭素数６−３０のかがる油である。この油はアジュバントを投与する 対象の体によって代謝されることができ、対象に対し非毒性である、植物油、魚 油、動物油または合成製造した油であることができる。対象は動物、代表的には 哺乳類、好ましくはヒトである。鉱油及び同様な有毒な油留出油は本発明から本 質的に除外される。

本発明の油成分は長鎖のアルカン、アルケンまたはアルキン、またはそれらの酸 またはアルコール誘導体、例えば遊離酸、その塩またはモノ、ジもしくはトリエ ステル（例えばトリグリセリド及び１．２−プロパンジオールや類似のポリヒド ロキシアルコールのエステル）であることができる。アルコールは、モノまたは 多官能酸、例えば酢酸、プロパン酸、クエン酸等を用いてアシル化できる。長鎖 アルコールがら導かれるエーテルであって、油であり、かつここに記述する他の 基準にマツチするエーテルも用い得る。

個々のアルカン、アルケンまたはアルキン部分（■ｏｉｅｔｙ）及びその酸また はアルコール誘導体は６−３０の炭素数を有する。該部分は直鎖または分校鎖構 造を有し得る。それは完全に飽和されていてもよいし、１以上の二重または三重 結合を有していてもよい。モノまたはポリエステルまたはエーテルベースの油を 用いる場合、炭素数６−３０の制限は、全炭素計数でなく、個々の脂肪酸または 脂肪アルコール部分に適用される。

本発明ではいずれの代謝性油、特に動物、魚または植物源からの油も用いること ができる。油が投与される宿主によって代謝されることは必須である。そうでな いと、油成分は膿瘍、肉芽腫または癌すら引き起こしかねず、また（獣医による 実行において用いられる場合には）、代謝されなかった油が消費者に与える有害 な作用により、ワクチン化した烏や動物の肉をヒトの消費に受け入れられないも のとする。

植物油源は木の実、種子及び穀類を包含する。木の実油の例としては、もっとも 通常に入手し得る。落花生油、大豆油、やし油及びオリーブ油が挙げられる。種 子油（ｓｅｅｄ　ｏｉｌ）としてはサフラワー油、綿実油、ひまわり油、ごま油 等が挙げられる。穀類群では、とうもろこし油がもっとも容易に利用できるが、 他の穀類、例えば小麦、オート麦、ライ麦、米、テフ（ｔｅｆｆ）　、ライコム ギ等の油も用い得る。

植物油を得る技術は良く開発されており、周知である。これらの及び他の類似の 油の組成は、例えばメルクインデックス、及び食品についての（３ｏｕｒｃｅ） 材料、栄養及び食品技術に見出すことができる。

種子油中に天然には存在しない、グリセロールや１．２−プロパンジオールの６ −１０炭素脂肪酸エステルは木の実や種子油からの適当な出発物質の加水分解、 分離及びエステル化によって製造できる。これらの製品はＰｖＯインターナシゴ ナル社化学専門部（ＰνＯＩｎｔｅｒｎａｔｔｏｎａｌ　Ｉｎｃ、、　Ｃｈｅｍ ｉｃａｌＳｐｅｃｊａｌｔｉｅｓ　Ｄｉｖｉｓｉｏｎ）　、４１６デイヴイジヨ ンストリート（Ｄｉｖｉｓｉｏｎ　５ｔｒｅｅｔ）、ブーンゴン（Ｂｏｏｎｇｏ ｎ）、ＮＪからネオヒ−（ＮＥＯＢＥＥ＠　）の名の下に市販されており、また 他からも入手し得る。

本発明のアジュバント及びワクチンには動物源からの油も用い得る。動物油脂は 、それらがトリグリセライドとして存在し、魚や植物からの油より高い飽和度を 有していることにより、通常、生理的温度で固体である。しかしながら、脂肪酸 は、動物脂肪から遊離脂肪酸を生成する部分的なもしくは完全なトリグリセライ ドケン化によって得ることができる。

哺乳動物の乳からの油脂は代謝され得るので、本発明の実施に用い得る。動物源 から純粋な油を得るために必要な分離、精製、ケン化及びその他の手段のための 操作は当分野で周知である。

たいていの魚は容易に回収し得る、代謝性油を含んでいる。

例えば、タラ肝油、鮫肝油及び鯨蝋等の鯨油は本発明で用い得る魚油のいくつか を例示する。いくつかの分技鎖油から炭素イソプレン単位を用いて生化学的に合 成され、これらは一般にテルペノイドと称せられる。鮫肝油はスクアレン、２゜ ６．１０，１５．１９−２３−へキサメチル−２，６，１０゜１’４，１８．２ ２−テトラコサへキサエンとして知られる分校した不飽和テルペノイドを含有し ているが、このものは本発明では特に好ましい。スクアレンの飽和類縁体である スクアランも特に好ましい油である。スクアレンやスクアランをはじめとする魚 油は商業源（ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌ　５ｏｕｒｃｅｓ）から容易に入手すること ができるか当分野で既知の方法によって得ることができる。

これらのアジュバント及びワクチン製剤の油成分は、容量で、０．５−２０％、 好ましくは１５％未満、特に１−１２％の量存在させる。１−４％の油を用いる のがもっとも好ましい。

これらのアジュバント組成物の水部分（ａｑｕｅｏｕｓ　ｐｏｒｔｉｏｎ）は緩 衝化した塩水（ｂｕｆｆｅｒｅｄ　５ａｌｉｎｅ）であるか、または好ましい１ ！様では、まぜ物で品質を落していない（ｕｎａｄｕｌｔｅｒａｔｅｄ）水であ る。これらの組成物は非経口投与を意図しているので、組成物と生理的流体の間 の差異を示すイオン濃度による、投与後膨張や組成物の急速な吸収を防止するた め、ワクチンとして用いられる最終的な緩衝化溶液を張度、すなわち浸透度（ｏ ｓ＋＋ｏｌａｌｉｔｙ）が正常の生理的流体と本質的に同じであるように仕上げ ることが好ましい。正常の生理的条件と適合するｐ）Ｉを維持するため、塩水を 緩衝化することも好ましい、また、ある場合には、組成物中のある成分、例えば グリコペプチドの安定性を確保するため、ｐＨを特定レベルに維持することも必 要となり得る。

いずれの、生理的に許容される緩衝剤も本発明で用いることができるが、リン酸 塩緩衝剤が好ましい。他の許容される緩衝剤、例えば酢酸塩、トリス、重炭酸塩 、炭酸塩等をリン酸塩緩衝剤の代替物として使用し得る。水性成分のｐＨは好ま しくは６．０−８．０である。

しかしながら、アジュバントを最初に製造する際には、まぜ物をしていない水が エマルジョンの水性成分として好ましい。塩濃度を増すにつれて目的とする小滴 サイズを達成することが困難になる。アジュバントから最終ワクチン製剤を製造 する際、適切な浸透度の緩衝液中の抗原物質を加えて目的とするワクチン組成物 を製造する。

これらの組成物中で用いる水性成分の量は組成物の値（νａｌｕｅ）を単一（ｕ ｎｉｔｙ）に導くのに必要な量である。すなわち、組成物を容量（ｖｏｌｕｍｅ ）に導くために、１００％にするに十分な水性成分の量を上記した他成分と混合 する。

医薬科学では、一般に、実質数の乳化剤及び懸濁液を用いる。これらは天然由来 物質、例えば木からのガム、植物蛋白質、糖ベース重合体（アルギネート、セル ロース等）等を包含する。ある種のオキシ重合体または炭素主軸上にヒドロキシ ドもしくは他の親水性置換基を有する重合体、例えばポビドン（ｐｏｖｉｄｏｎ ｅ）　、ポリビニルアルコール、及びグリコールエーテルベースモノ及びポリ官 能性化合物は界面活性を有する。長鎖脂肪酸由来化合物は本発明で用い得る乳化 剤及び懸濁剤の第三の実質的群を形成する。上記界面活性剤は、非毒性である限 り、いずれも有用である。

本発明で用いることができる通用な乳化剤（界面活性剤または洗剤とも称せられ る）の具体的な例は以下の通りである：１、　水溶性石けん、例えば高級脂肪酸 （Ｃ＋。−０２２）のナトリウム、カリウム、アンモニウム及びアルカノール− アンモニウム塩、特にタロー及びココナツナトリウム及びカリウム石けん ２、　分子構造中に約８−２０の炭素原子とスルホン酸基及び硫酸エステル基よ りなる群から選ばれる基を有する有機硫酸反応産物の水溶性塩によって表し得る アニオン系合成非石けん洗剤。これらの例は、タローまたはやし油から導かれた アルキル硫酸ナトリウムもしくはカリウム；アルキルベンゼンスルホン酸ナトリ ウムもしくはカリウム；アルキルグリセリルエーテルスルホン酸ナトリウム；や し油脂肪酸モノグリセライドスルホン酸及び硫酸ナトリウム；高級脂肪アルコー ル１モルとエチレンオキサイド約１−６モルとの反応産物の硫酸エステルのナト リウムもしくはカリウム塩；アルキルフェノールエチレンオキサイドエーテルス ルホン酸ナトリウムもしくはカリウム（エチレンオキサイドを１分子あたり１− １０単位有し、またアルキル基は８−１２の炭素原子を有する）；脂肪酸をイソ チオン酸でエステル化し、ついで水酸化ナトリウムで中和して得られる反応産物 ；メチルタウリド（ｓｅｔｂｙｌ　ｔａｕｒｉｄｅ）の脂肪酸アミドのナトリウ ムもしくはカリウム塩；ＳＯ５でスルホン化したＣ１゜−ＣＺａα−オレフィン のナトリウム及びカリウム塩である。

３、　アルキレンオキサイドグループと有機疎水性化合物との縮合によって製造 される非イオン系合成洗剤０代表的な疎水性グループはプロピレンオキサイドと プロピレングリコールの縮合産物、アルキルフェノール、プロピレンオキサイド とエチレンジアミンの縮合産物、炭素数８−２２の脂肪族アルコール及び脂肪酸 アミドを包含する。

４、　半極性を有する、アミンオキサイド、ホスフィンオキサイド、スルホキシ ド等の非イオン系洗剤、長鎖三級アミンオキサイドの具体例はジメチルドデシル アミンオキサイド、ビス−（２−ヒドロキシエチル）ドデシルアミンを包含スる 。

ホスフィンオキサイドの具体例は１９６７年２月１４日に発行された米国特許３ ３０４２６３中に見い出され、ジメチルドデシルホスフィンオキサイド及びジメ チル−（２−ヒドロキシドデシル）ホスフィンオキサイドを包含する。

５、　式Ｒ’−Ｓｏ、−Ｒ２（式中、Ｒ１及びＲ２は置換または非置換アルキル 基であり、前者は約１０＝約２８の炭素原子を有し、Ｒ２は１−３の炭素原子を 有する）に相当するものをはじめとする長鎖スルホキシド。これらのスルホキシ ドの具体例はドデシルメチルスルホキシド及び３−ヒドロキシトリデシルメチル スルホキシドを包含する。

６、　両性合成洗剤、例えば３−ドデシルアミノプロピオン酸ナトリウム及び３ −ドデシルアミノプロパンスルホン酸ナトリウム。

７、　双性イオン（ｚｗｉｔｔｅｒｔｏｎｔｃ）合成洗剤、例えば３−（Ｎ、Ｎ −ジメチル−Ｎ−ヘキサデシルアンモニオ）プロパン−１−スルホネート及び３ −（Ｎ、Ｎ−ジメチル−Ｎ−ヘキサデシルアンモニオ）−２−ヒドロキシプロパ ン−１−スルホネート。

さらに、以下のタイプの乳化剤はいずれも本発明の組成物に用いることができる 。（ａ）脂肪酸、ロジン（ｒｏｓｉｎ）酸及びトール油の石けん（すなわち、ア ルカリ塩）、（ｂ）アレーン（ａｒｅｎｅ）スルホン酸アルキル、（Ｃ）分枝鎖 及び直鎖の疎水性基の両方並びに−級及び二級サルフェート基を有する界面活性 剤をはじめとするアルキルサルフェート、（ｄ）ｆｆｌ水性基と親水性基の間の 中間結合を含有するサルフェート及びスルホネート、例えば脂肪アシル化メチル タウリド（ｆａｔｔｙａｙｌａｔｅｄ　ｍｅｔｈｙｌ　ｔａｕｒｉｄｅｓ）及び 硫酸化した脂肪酸モノグリセリド、（ｅ）ポリエチレングリコールの長鎖酸エス テル、特にトール油エステル、（ｆ）アルキルフェノールのポリエチレングリコ ールエーテル、（ｇ）長鎖のアルコール及ヒメルカブタンのポリエチレングリコ ールエーテル、及び（ｈ）脂肪アシル（ｆａｔｔｙ　ａｃｙｌ）ジェタノールア ミド。界面活性剤は１より多くの方法で分類できるので、このバラグラフに掲げ たいくつかのクラスの界面活性剤は前記した界面活性剤のクラスと重複する。

生物学的状況のために特にデザインされ、かつその状況下で通常用いられるいく つかの乳化剤がある。例えば、いくつかの生物学的洗剤（界面活性剤）がそのよ うなものとしてシグマ化学会社（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｍｐａｎ ｙ）によってその生化学及び有機化合物の１９８７年カタログ（ｉｔｓ　１９８ ７　Ｃａｔａｌｏｇｏｆ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　ａｎｄ　Ｏｒｇａｎｉｃ　 Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ）の３１０−３１６真にリストされている。かかる界面活性 剤は４つの基本タイプ、すなわち、アニオン系、カチオン系、双性イオン系、及 び非イオン系に分けられる。アニオン系洗剤の例はアルギン酸、カプリル酸、コ ール酸、１−デカンスルホン酸、デオキシコール酸、１−ドデカンスルホン酸、 Ｎ−ラウロイルサルコシン及びタウロコール酸を包含する。カチオン系洗剤はド デシルトリメチルアンモニウムブロマイド、ヘンザルコニウムクロライド、ベン ジルジメチルヘキサデシルアンモニウムクロライド、セチルピリジニウムクロラ イド、メチルベンゼトニウムクロライド及び４−ピコリンドデシルサルフェート を包含する。双性イオン系洗剤は３−（（３−フロラミドプロビル）−ジメチル アンモニオツー１−プロパンスルホネート（通常ＣＨＡＰＳと略称される）、３ −（（フロラミドプロビル）−ジメチルアンモニオ〕−２−ヒドロキシ−１−プ ロパンスルホネート（一般にＣＨＡＰＳＯと称せられる）、Ｎ−ドデシル−Ｎ、 Ｎ〜ジメチル−３−アンモニオ−ニープロパンスルホネート及びリソ（ｌｙｓｏ ）−α−ホスファチジルコリンを包含する。非イオン系洗剤の例はデカノイル− Ｎ−メチルグルカミド、ジエチレングリコールモノペンチルエーテル、ｎ−ドデ シルβ−〇−グルコピラノシド、脂肪アルコールのエチレンオキサイド縮合物（ 例えば商品名ルブロール（Ｌｕｂｒｏｌ）の下に販売されている）、脂肪酸（特 にＣ＋Ｚ−Ｃ２Ｄの脂肪酸）のポリオキシエチレンエーテル、ポリオキシエチレ ンソルビタントリエステル（例えば商品名ツイーン（Ｔｗｅｅｎ）の下に販売さ れている）及びソルビタン脂肪酸エーテル（例えば商品名スパン（Ｓρａｎ）の 下に販売されている）を包含する。

特に有用な界面活性剤群はソルビタンベース非イオン系界面活性剤である。これ らの界面活性剤はソルビトールを脱水して１．４−ソルビタンを得、ついでこれ を１当量以上の脂肪酸と反応させることによって製造する。脂肪酸置換部分はさ らにエチレンオキサイドと反応させて第二の界面活性剤群を得ることができる。

脂肪酸置換ソルビタン界面活性剤は、１，４−ソルビタンと脂肪酸、例えばラウ リン酸、バルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸もしくは類似の長鎖脂肪酸と を反応させて１，４−ソルビタンモノエステル、１．４−ソルビタンセスキエス テルまたは１．４−ソルビタントリエステルを生成させることによって製造する 。これらの界面活性剤の通常なものの例として、ソルビタンモノラウレート、ソ ルビタンモノパルミテート、ソルビタンモノステアレート、ソルビタンモノオレ エート、ソルビタンセスキオレエート及びソルビタントリオレエートが挙げられ る。これらの界面活性剤はスパン（ＳＰＡＮ＠　）またはアーラセル（ＡＲＬＡ ＣＥＬ　ｅ）（これらは、通常、種々のモノ、ジ及びトリエステル置換ソルビタ ンを識別する文字もしくは数字の名称を有している）の名の下に商業上人手し得 る。

スパン及びアーラセル界面活性剤は親水性で一般に油に可溶であるか分散し得る 。これらはまたたいていの有機溶媒に可溶である。それらは水には一般に不溶で あるが、分散し得る。一般に、これらの界面活性剤は１．８−８．６の間の親木 性−親油性バランス（ＨＬＢ）を有している。かかる界面活性剤は当分野で既知 手段によって容易に製造できるか、または例えばＩＣＩアメリカ会社（Ｉ］　Ａ ｍｅｒｉｃａ’ｓ　Ｉｎｃ、）　、ウィルミングトン（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ） 、ＤＥからアトラス（ＡＴＬＡＳ　Ｏ）なる登録商標の下に市販されている。

関連する界面活性剤群はポリオキシエチレンソルビタンモジエステル及びポリオ キシエチレンソルビタントリエステルを包含する。これらの物質は１．４−ソル ビタンモノエステルもしくはトリエステルにエチレンオキサイドを付加すること によって製造される。ポリオキシエチレンの付加により、親油性のソルビタンモ ノもしくはトリエステル界面活性剤は、一般に、水に可溶であるか分散できて、 かつ有機液体に変化した程度で可溶である親水性界面活性剤に変化する。

商標ツイーン（ＴＷＥＥＮ　＠　）の下に市販されているこれらの物質は、氷中 油エマルジョン及び分散液を製造するために、または油を可溶化し、無水軟膏（ ａｎｈｙｄｒｏｕｓ　ｏｊｎｔｓｅｎｔｓ）を水溶性にするか水で洗えるように するために有用である。ツイーン界面活性剤は、エマルジョンの安定性を高める ため、関連したソルビタンモノエステルもしくはトリエステル界面活性剤と組み 合わせてもよい。ツイーン界面活性剤は、一般に、９．６−１６．７のＨＬＢ値 を有する。ツイーン界面活性剤はいくつかの製造業者、例えばＩＣＩアメリカ会 社、ウィルミングトン、ＤＢから、登録商標アトラス（ＡＴＬＡＳ　＠　）界面 活性剤の下に市販されている。

単独で、もしくはスパン、アーラセル及びツイーン界面活性剤と共に使用し得る 非イオン界面活性剤の第３の群はエチレンオキサイドと長鎖脂肪酸との反応によ って製造されるポリオキシエチレン脂肪酸である。このタイプでもっとも普通に 入手し得る界面活性剤はミルジ（ＭＹＲＪ・）の名の下に販売されている、ステ アリン酸のポリオキシエチレン誘導体である。ミルジ界面活性剤は、ツイーン界 面活性剤と同様、親水性で水に可溶もしくは分散性である。ミルジ界面活性剤は 、エマルジョン形成における使用に際し、ツイーン界面活性剤とまたはツイーン ／スパンもしくはアーラセル界面活性剤混合物とブレンドすることができる。ミ ルジ界面活性剤は当分野で既知の方法によって製造できるか、またはＩＣＩアメ リカ会社から市販されている。

ポリオキシエチレンベースの非イオン界面活性剤の第４の群はラウリル、アセチ ル、ステアリル及びオレインアルコールから導かれるポリオキシエチレン脂肪酸 エーテルである。

これらの物質は、上記と同様にして、脂肪アルコールへのエチレンオキサイドの 付加によって製造される。これらの界面活性剤の市販基はブリジ（ＢＲＩＪＯ） である。ブリジ界面活性剤はそのポリオキシエチレン部分のサイズによって親水 性Ｔ４または親油であり得る。これらの化合物の製造は当分野で既知の方法によ り行えるが、これらはまたＩＣＩアメリカ会社等の商業源から容易に入手できる 。

本発明の実施に用いられる可能性がある他の非イオン界面活性剤としては、例え ば、ポリオキシエチレン、ポリオール脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンエー テル、ポリオキシプロピレン脂肪エーテル、ポリオキシエチレン含有量ろう、ポ リオキシエチレンラノリン誘導体、ポリオキシエチレン脂肪グリセリド、グリセ ロール脂肪酸エステルまたは他のポリオキシエチレン酸アルコールまたは炭素数 １２−２２の長鎖脂肪酸のエーテル誘導体が挙げられる。

本発明のアジュバント及びワクチン製剤は多相系であるように意図されているの で、約７−１６の範囲のＨＬＢ値を有する非イオン界面活性剤を選ぶことが好ま しい、この値はツイーン界面活性剤等の単一の非イオン系界面活性剤の使用によ って得ることができ、またソルビタンモノ、ジもしくはトリエステルベース界面 活性剤；ソルビタンエステルポリオキシエチレン脂肪酸；ポリオキシエチレンラ ノリン由来界面活性剤と組み合わせたソルビタンエステル；高ＨＬＢポリオキシ エチレン脂肪エーテル界面活性剤；またはポリエチレン脂肪エーテル界面活性剤 もしくはポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸を用いるが如き界面活性剤ブレン ドを使用することによっても達成できる。

本発明の実施におけるエマルジッン安定化非イオン界面活性剤として、非イオン 界面活性剤、特にツイーン界面活性剤を単独で用いるのがより好ましい。上記界 面活性剤の中で、ポリオキシエチレン２０ソルビタンモノオレエートについて、 ツイーン８０として命名された。もしくはポリソルベート８０として知られる界 面活性剤がもっとも好ましい。

小滴サイズの十分な減少は、通常、界面活性剤を重量（Ｗ／Ｗ）で０．０２−２ ．５％の量で存在させることによって行う。０．０５−１％の量が好ましく、０ ．０１−０．５％が特に好ましい。

本発明にいう小滴サイズに到達する経緯は本発明の実施にとって重要でない。サ ブミクロン油小滴を得ることができる１つの方法は市販の乳化機、例えばミクロ フルーイディクス（Ｍｉ（ｒ（＋ｆｌｕｉｄｉｃｓ）社、ニュートン、ＭＡから 入手し得るモデルＮｏ、１１０Ｙを使用することである。他の市販乳化機はボウ リン（Ｇａｕｌｉｎ）モデル３０ＣＤ［ボウリン社、エバーレン）（Ｅｖｅｒｅ ｔｔ）、　ＭＡ）及びレイニー・ミニラブ（Ｒａｉｎｎｉｅ　Ｍｉｎｉｌａｂ） タイプ８．３０Ｈ（ミロアトマイザ−フード・アンド・ダイアリイ社（Ｍｉｎｏ 　Ａｔｏｍｉｚｅｒ　Ｆｏｏｄ　ａｎｄ　Ｄａｉｒｙ　Ｉｎｃ、、ハドソン、罰 〕を包含する。これらの乳化機は、高圧下で小さな開口を通して流体を強制的に 流すことによって生じさせた高剪断力の原理によって働く、モデルｌｌ０Ｙを５ ，０００−３０，０００ｐｓｉ（約３４０−約２０４２気圧）で運転する場合、 １００７５０ｒ＋＋ｗの直径を有する油小滴が得られる。

油小滴のサイズは、油に対する洗剤の比（比を上げると小滴サイズは減少する） 、操作圧（操作圧を上げると小滴サイズは減少する）、温度（温度を上げると小 滴サイズは減少する）を変化させることによって、及び両親媒性免疫刺激剤の添 加（かかる剤の添加によって小滴サイズは減少する）によって、変えることがで きる。実際の小滴サイズは、特定の洗剤、油及び（用いる場合の）免疫刺激剤に よって、及び選んだ特定の操作条件によって変化する。小滴サイズはサイズを測 る装置、例えば市販のコールタ−社（Ｃｏｕｌｔｅｒ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ）製サブミクロン粒子分析機（Ｓｕｂ−Ｍｉｃｒｏｎ　Ｐａｒｔｆｃｌｅ　Ａｎ ａｌｙｚｅｒ）（モデルＮ　４　ＭＤ）の使用によって確かめることができ、ま たパラメーターは、実質上すべての小滴が直径で１ミクロンより小さく、好まし くは０．８ミクロンより小さく、もっとも好ましくは０．５ミクロンより小さく なるまで、上記ガイドラインに沿って変えることができる。実質上すべてとは、 （数で）少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少な くとも９５％、及びもっとも好ましくは少なくとも９８％を意味する。粒径分布 は代表的にはガウス分布であり、その場合、平均直径は記述された限界より小さ くなる。

本発明は満足な免疫原性のためのサブミクロンエマルジョンに関して使用するよ う、従来先行技術で教示されてきた他の成分、すなわち、例えば米国特許４，７ ７２，４６６及び４，７７０．８７４及びヨーロッパ特許比１１１０３１５１５ ３Ａ２においてアジュバントに関して使用するよう記述されたが如きポリオキシ プロピレン−ポリオキシエチレンブロック重合体の不存在下に油エマルジヨンを 製造することによって実施する。

本発明のアジュバント組成物は代謝し得る水中油とＰＯＰ−ＰＯＥ共重合体以外 の乳化剤より本質的になる。乳化剤は特異的免疫刺激活性を有する必要はない。

この理由は、油小滴がサブミクロン範囲にある場合には、油組成物自体がアジュ バントとして機能し得るからである。しかしながら、いずれかの既知の免疫刺激 剤を組成物中に含ましめることによって高められた免疫刺激活性を得ることがで きる。これらの免疫刺激剤は乳化剤や油とは別個のものであってもよく、または 免疫刺激剤と乳化剤が１つの同じ分子であってもよい。前者の場合の例は死滅し たミコバクテリア、例えばミコバクテリウム・チュバキュロシス及びそれらの亜 細胞成分と混合した代謝性油を包含する。付加的な免疫刺激物質はかかる細菌の 細胞壁の成分であるムラミル（ｓｕｒａ■ｙｌ）ペプチドを包含する。いくつか の好ましいムラミルペプチドを下に示す。乳化／免疫刺激共用剤の例は上に引用 したサンチェズ・ベスカドールらの２つの刊行物中に記載された親油性ムラミル ペプチドである。これらの物質は免疫刺激基として働く基本の（ｂａｓｉｃ）Ｎ −アセチルムラミルペプチド（親水性部分）を含有すると共に、化合物に界面活 性性を与える親油性部分も包含する。

かかる化合物、及び他のタイプの両親媒性免疫刺激物質は免疫刺激剤としても乳 化剤としても作用し、本発明の実施に好ましい。さらに、両親媒性免疫刺激物質 を、両親媒性でない第２の免疫刺激物質と組み合わせて使用して本発明を実施す ることも可能である。１つの例は本質的に非置換の（すなわち、本質的に親水性 の）ムラミルジペプチドと組み合わせて親油性ムラミルペプチドを用いることで ある。

本発明の好ましい免疫応答刺激ムラミルペプチド（またはより正確にはグリコペ プチド）は、エロウズ（Ｅｌｌｏｕｚ）　ら、（１９７４）　Ｂｉｏｃｈｅｍ、 　＆　Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ｒｅｓ、Ｇｏａｍ、、　５９（４）、　１３１７によっ て、フロイント完全アジュバントのＭ、チュバキュロシスのミコバクテア成分中 の免疫アジュバント活性を有する最小有効単位であることが決定されたＮ−アセ チルムラミル〜Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミンに関連し、かつ一般にこれか ら導かれる１群の化合物である。結果として、いくつかのジペプチド及びポリペ プチド置換ムラミン酸誘導体が開発され、免疫刺激活性を有することが見−出さ れた。

これらのグリコペプチドは種々の化合物群であるが、一般に下記式■によって表 すことができる：式中、ビラン環酸素は水素、アルキルまたはアシル等によって 置換されているか、または、特に６位酸素は、窒素ペース置換基によって置き代 えることができ、２〜アミノ基はアシル基またはいずれかの他のアミドであり、 ラクチル側鎖は修飾され、例えばエチルもしくは別の２位（ｔｗｏ−ｐｏｓｉｔ ｉｏｎ）アルキル部分であり、及びペプチド官能基は、さらに誘導体化され（ｄ ｅｒｉｖａｔｉｚｅｄ）でいてもよい、ジペプチドまたはポリペプチドである。

ピラノシル化合物のフラノシル類縁体も免疫賦活活性（ｉｍ＋ｍｕｎｏｐｏｔｅ ｎｔｉａｔｉｎｇ　ａｃｔｉｖｉｔいを有し、本発明で有用である。

本発明のグリコペプチド中には米国特許４２３５７７１及び４１８６１９４に記 述されたような、メソーα、ε−ジアミノピメリン酸が結合した三糖類及び三糖 類が含まれる。

本発明の実施に使用し得る免疫応答刺激性グリコペプチドは米国特許４０９４９ ７１．４１０１５３６．４１５３６８４．４２３５７７１．４３２３５５９゜４ ３２７０８５、４１８５０８９．４０８２７３６．４３６９１７８．４３１４９ ９８及び４０８２７３５及び４１８６１９４に記載されている。これらの特許に 開示されたグリコペプチドをここに参考に加入し、これらはここに十分に記載さ れたように本発明の一部とされる。日本特許出願ＪＰ４０７９２２２７．４０７ ９２２８及び４１２０６６９６も本発明の実施に有用である。

これらの化合物を製造する方法はすでに開示されており、当分野で周知である。

製造プロセスの例示は米国特許４０８２７３６及び４０８２７３５に見い出し得 る。付言すれば、類似の製造プロセスは先行パラグラフで掲げた米国特許にも見 い出される。

好ましいグリコペプチドは式■ 〔式中、 Ｒは炭素数１−２２の非置換または置換アルキル基、または炭素数６−１０の非 置換または置換アリール基であり、Ｒ′及びＲ２は同一であるかもしくは異なり 、水素または炭素数１−２２のアシル基であり、 Ｒ３は水素、炭素数１−２２のアルキルまたは炭素数７−１０の了り−ルであり 、 Ｒは水素またはアルキルであり、 ｎは０または１であり、 Ｘ及び２は独立してアラニル、バリル、ロイシル、イソロイシル、α−アミノブ チリル、トレオニル、メチオニル、システイニル、グルタミル、グルタミニル、 イソグルタミル、イソグルタミル、アスパルチル、フェニルアラニル、チロシル 、リジル、オルニチニル、アルギニル、ヒスチジル、アスパラギニル、プロリル 、ヒドロキシプロリル、セリルまたはグリシルであり、 Ｒ５は末端アミノ酸のエステル化もしくはアミド化されていてもよいカルボキシ ル基であり、及びＹは−ＮＨＣＨＲ’　ＣＨ２ＣＨ，Ｃ０−（式中、Ｒ６はエス テル化もしくはアミド化されていてもよいカルボキシル基である）である〕を有 するグリコペプチドである。

アルキルは、他に注記のない場合、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチ ル、ヘキシルまたはへブチルまたはそれらの異性体によって例示される、炭素数 １−７の直鎖または分枝鎖基である。低級アルキルは炭素数１−４の基である。

任意にエステル化またはアミド化されたカルボキシル基は、カルボキシル基自体 、もしくはメタノール、エタノール、プロパツール、ブタノールなど、低級アル カノールでエステル化されたカルボキシル基、またはカルバモイル基である。こ のカルバモイル基は、その窒素原子のところで、未置換のもの、またはアルキル 基（特には、低級アルキル基）、アリール基（特には、フェニル基）もしくはア リールアルキル基（特には、ベンジル基）で−置換もしくは二置換されたもので ある。カルバモイル基は、ブチリデンまたはペンチリデン基といったアルキリデ ン基で置換されていてもよい、さらに、カルバモイル基Ｒ５は、その窒素原子の ところで、カルバモイルメチル基で窒素されていてもよい。

特に好ましい化合物は、式■で示されるものであって、式中、ＲおよびＲ１は、 同一または異なることもあるが、水素、または炭素数１〜２２のアシル基であり 、Ｒ２はメチル基であり、Ｒ３は水素であり、ＸはＬ−アラニル基であり、Ｙは Ｄ−イソグルタミル基であって、ｎはＯである。

グリコペプチド類のまた別の好ましい基は、ＲおよびＲ１が水素または炭素数１ 〜２２のアシル基であり、Ｒｔがメチル基であり、Ｒ２が水素であり、Ｒ４がメ チル基もしくはブチル基であって、ＸがＬ−バリル、Ｌ−セリル、Ｌ−アラニル 、Ｌ−スレオニルもしくはＬ−α−アミノブチリル基となっている、式■で示さ れる化合物である。

特に例えば、以下のような化合物が挙げられる。

・Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−α−アミノブチリル−Ｄ−イソグルタミン、 ・６−０−ステアロイル−Ｎ−アセチルムラミル−し−α−アミノブチリル−Ｄ −イソグルタミン、・Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−スレオニル−Ｄ−イソグルタ ミン、 ・Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−バリル−Ｄ−イソグルタミン、 ・Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−グルタミンｎ−ブチルエステル、 ・Ｎ−アセチル−デスメチル−Ｄ−ムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミ ン、 ・Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−グルタミン、・Ｎ−アセチルムラ ミル−Ｌ−セリル−Ｄ−イソグルタミン、 ・Ｎ−アセチル（ブチルムラミル）−Ｌ−α−アミノブチリル−Ｄ−イソグルタ ミン、および ・Ｎ−アセチル（ブチルムラミル）−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン。

免疫刺激グリコペプチドの有効量は、このグリコペプチドが併用投与されなかっ た際に認められる力価レベルを超えて、抗原と併用投与した場合の抗体価レベル に増加をもたらす量である（一般に、全組成物のｏ、ｏｏｏｔ−ｉｏ％の範囲） 。

周知のことではあるが、各グリコペプチドには、他のグリコペプチドとは異なる 有効投与量があり得る。したがって、単独用量の範囲では、この発明の範囲中で 可能な各グリコペプチドに適確に処方することはできない。しがし、一般には、 このグリコペプチドを０．００１〜５重量％の量でワクチン中に含ませることが 好ましいであろう、より好ましい量は、０．０１〜３重量％である。

上記の免疫刺激グリコペプチドは、基本的には親水性化合物である。したがって 、これらを別個の乳化剤（これは、上記のとおり免疫刺激剤ともなり得る）とと もに使用することが考えられる。上記の化合物が親油性を有することもある。

例えば、糖部分に脂肪酸の置換基および／またはアリール置換基を含む化合物、 特に炭素数１４〜１２からなる１つ以上のアシル基を含む化合物、特にこういっ たアシル基を２つ以上含む化合物が挙げられる。しかし、カルボキシレート基ま たはペプチド部分の側鎖を介して脂質部分を付与することによって、ムラミルペ プチドに親油性を与えることも可能である。特に末端カルボキシレート基を介し てペプチド部分に結合した脂質の基によって、好ましい化合物群が生じる。この 結合は、例えば、末端カルボキシレート基と炭素数１４〜２２の脂肪酸アルコー ルとの間でエステル結合を直接形成することによって、またはエステルまたはア ミド結合を介して脂質にカルボキシレートを結合させる、エタノールアミンなど の三機能性連結基を用いることによって、容易に可能となる。

ホスフェート基が容易に結合可能な機能性基を提供するので、ホスホリピド類は 、この発明のこの実施態様で特に好ましいものである。ジアシルホスホグリセリ ド類は、そういった１つの容易に結合し得るホスホリピドを提供する。ホスファ チジルエタノールアミンは、容易に入手できて天然に存在する化合物であるが、 アミド結合を介してペプチド部分の末端カルボキシレートに容易に結合し得る。

末端カルボキシル基に対する他の脂質には、アクリッグリセロール類、ホスファ チジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファ チジルグリセロール、カルシオリピン、およびスフィンゴミエリンが挙げられる 。

多数の好ましい両性免疫刺激ペプチドは、以下の式■を有するものである。

式中、Ｒ，Ｒ’、Ｒ”、Ｒ３，Ｒ’、Ｘ、Ｙ、Ｚおよびｎは、前記の通りである 。Ｌは、上記の脂質部分のような脂質部分を示す。

すなわち、この分子のムラミン酸部分とペプチド部分が一緒になって、親水性部 分が生じる。この部分中には親油性部分も存在し、この親油性は、長鎖の炭化水 素基によって与えられ、一般には、脂肪酸の形で存在している。この脂肪酸また は他の炭化水素含有基は、糖の水酸基に結合し得るか、分子のペプチド部分に結 合し得る。後者の場合、脂肪酸をペプチド部分に存在するアミノ基と反応させる などして直接結合を起こすか、アミド結合形成によるペプチドのカルボン酸基と ホスフェート基などの脂質中の官能基との間の連結を形成するヒドロキシアルキ ルアミンのような連結基を介して結合し得る。リン脂質部分は、親油性のムラミ ルペプチドを形成する上で特に好ましい。好ましい化合物群には、ヒドロキシア ルキルアミン部分を介してリン脂質部分に結合した、ムラミルジペプチド類およ びトリペプチド類が含まれる。１例であって、特に好ましい化合物は、Ｎ−アセ チルムラミル−Ｌ−７ラニルーＤ−イソグルタミル−し−アラニン−２−（１゜ ２−ジパルミトイル−５ｎ−グリセロ−３−（ヒドロキシホスホリルオキシ）〕 エチルアミド（略称：ＭＴＰ−ＰＥ）がある。

このアジュバント組成物は、一般に、ワクチン中で使用予定の抗原とアジュバン トを組み合わせる前に、上記の成分から調製される。この抗原とは、タンパクま たはタンパク−多糖、タンパクーリホ多糖、多糖、リホ多糖、ウィルスサブユニ ット、完全なウィルスまたは完全な細菌を含むいかなる物質をもさす。これらウ ィルスや細菌は、ある動物の血流中で異物である場合、こういった動物の組織に 接近すると同時に、特異的抗体の形成を刺激し、生体内または生体外で均質な抗 体と特異的に反応する。さらに、その抗原は、これに対する受容体を有するＴ細 胞の増殖を刺激し、リンパ球と反応が可能であって、細胞性免疫と呼ばれる一連 の応答を開始させる。

ハブテンは、この定義中にあり、免疫的特異性を決定する抗原性分子または抗原 複合体の一部である。通常、ハブテンは、天然に存在する抗原中にあるペプチド または多糖である。

人工抗原では、それは、アルサニル酸誘導体のような低分子量物質であることも ある。ハブテンは、生体内または生体外で抗体またはＴ細胞と特異的に反応する であう。さらに別の決定因子は、抗原決定基、抗原構造群およびハブテン群であ る。

この発明のワクチンの製造には、有効量の抗原が使用されるであろう。すなわち 、それには、アジュバントと組み合わせて、被験者に特異的で十分な免疫学的応 答を起こさせ、その結果、被験者を、ウィルス、細菌、真菌、マイコプラズマ、 または寄生虫への暴露から防ぎ、それらに対する免疫力を与える抗原の量が含ま れているであろう。

抗原は、当該分野で既知の方法によって調製されても、市販品として購入するこ ともできる。例えば、米国特許第４．４３４．１５７号、第４，４０６，８８５ 号、第４，２６４．５８７号、第４，１１７，１１２号および第３，９９６，９ ０７号は、ここに参照のために組み込まれたものであって、これらには、ネコの 白血病ウィルスのワクチンを製造する方法が記載されている。この発明の範囲に 入る抗原としては、不活性ウィルス粒子全体、単離されたウィルスタンパクおよ びタンパクのサブユニット、完全な細胞および細菌、細胞膜、細胞壁タンパクな どが挙げられる。この発明のワクチンは、コレラ、ジフテリア、破傷風、百日咳 、インフルエンザ、麻疹、髄膜炎、おたふくかぜ、ベスト、ポリオ、狂犬病、ロ ッキー山熱、風疹、痘癒、腸チフス、発疹チフス、ネコ白血病ウィルスおよび黄 熱病など、あらゆる疾病および怒染症に対して、鳥および動物を免疫するために 使われてもよい。

この発明で使用されることがあるどの抗原に対しても、特定な指針を提示するよ うな単一の命名法はとり得ない。抗原の有効量は、その固有の活性および純度の 関数である。この発明のアジュバント組成物が、完全な細胞またはウィルスのワ クチンとともに使用されることもあり、岨換えＤＮＡ技術または合成法によって 調製された精製抗原またはタンパクサブユニットもしくはペプチドのワクチンと ともに使用される場合もあることが考慮される。

この発明のアジュバント組成物は安定であるために、抗原およびエマルションを 簡単な震盪によって混合することができる。このアジュバントと、抗原の溶液ま たは懸濁液との混合物を小さな穴（皮下注射の針など）に迅速に通過させるなど 、その他の方法によって、有益なワクチン組成物が得られる。

この発明は、ここで一般的に記載したものであって、同様のことは、以下の詳細 な実施例を参照により容易に理解されよう。ただし、これらの実施例は、例示の ために提供したものであって、特記のない限りこの発明を限定する意図はない。

ス−Ｍ 二」Ｌ庖」Ｌ里 特記のない限り、以下の一般的手法を以降の実施例で使用した。

林−料 ＭＴＰ−ＰＥは、チバガイキー社（スイス、バーゼル州）から供与された。スク アレンおよびＴｗｅｅｎ　８０は、シグマ社（ミズリー州セントルイス）から得 られた。ＣＦＡおよびＩＦＡは、ギフコ社にューヨーク州グランドアイランド） から得られた。水酸化アルミニウム（Ｒｅｈｓｏｒｐｔａｒ）は、レーイス社に ュージャージー州バークレイハイツ）から得られた。

エヱ五受〕≦仁１１製 方法１：注射針法。リン酸緩衝液（ＰＢＳ）に溶けた、４％スクアレン、０．０ ０８％Ｔｗｅｅｎ　８０．２５０１！　ｇ　／ｍ１ＭＴＰ−ＰＥおよび抗原の混 合物を２３番ゲージ針に６回通した。

このエマルションは、１０ミクロン次元の油滴サイズからなり、ＭＴＰ−ＰＥ− ＬＯと称する。

方法２：カークランドエマルシファイヤー法。上記の混合物をカークランド乳濁 機に５回通した。このエマルションは、主に１〜２ミクロンの油清からなり、Ｍ ＴＰ−ＰＥ−ＬＯ−ＫＥと称する。このカークランド乳濁機（カークランドブロ ヅクツ社、カリフォルニア州つオールナットクリーク）は、作動室で約１０００ ｐｓｉを生じる、市販の刃つきホモジェナイザ−（例えば、Ｇａｕｌｉｎ　Ｍｏ ｄｅｌ　３０ＣＤおよびＲａ１ｎｎｉｅ　ＭｉｎｉｌａｂＴｙｐｅ　８．３０Ｈ ）の小型機である。

方法３：マイクロフルイダイザー（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｒ）法。

Ｔｗｅｅｎ　８０の有無にかかわらず、０．３−１８％のスクアレンおよび０． ２　１．０ｍｇ／ｍｌのＭＴＰ−ＰＥを含む混合物を、５０００〜３００００Ｐ ＳＩでマイクロフルイダイザー（モデルＮｏ、ｌｌ０Ｙ、ミクロフルイディクス ・ニュートン社、マサセッツ州）を通した。一般に、マイクロフルイダイザー中 でエマルション５０ａｉ１は５分間で、同１００ｍ１は１０分間で混合された。

得られたエマルションは、１００〜７５０ｎｍの油滴からなり、スクアレン、Ｍ ＴＰ−ＰＥ、ならびに界面活性剤濃度およびマイクロフルイダイザーの作動圧お よび温度に依存していた。このエマルションをＭＴＰ−ＰＥ−ＬＯ−ＭＦと称す る。

抗原を調製後、上記のアジュバント配合物に添加した。この抗原およびエマルシ ョンを、震盪によって混合した。ＣＦＡおよびＩＦＡを使用した場合、ＰＢＳ中 の抗原を等量のＣＦＡまたはＩＦＡと混合させた。濃厚なエマルションが得られ るまで、この混合物を皮下注射針に通過させた。

汎−凰 単純ヘルペスウィルス（Ｈ３Ｖ）ｒｇＤ２は、遺伝子工学的に処理したチャイニ ースハムスター卵巣細胞によって作られた組換体タンパクである。このタンパク は、切り出された通常のアンカー領域を有しているため、組織培養液中に分泌さ れるグリコジル化タンパクとなる。このｇＤ２を純度９０％以上にまでＣＨＯ培 地中で精製した。ヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）ｅｎ’ｖ　２−３は、遺伝子 工学的に処理した酵母菌（Ｓａｃｃｈａｒｏｍ　ｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓａｅ） によって作られたＨＩＶエンベロープタンパクの組換体である。このタンパクは 、ＨＩＶｇｐＬ２０の全タンパク領域を表すが、その酵母から精製されるので非 グリコジル化されず、未変成である。ＨＩＶｇｐ１２０は、完全にグリコジル化 されたタンパクであって、上記のｇＤ２と同様の方法でＣＨＯ細胞中で産生され たｇｐ１２０の分泌型であるつ 監立曵九交止 マウスに、腹腔内、筋肉内または皮下の経路で、さまざまなアジュバント／抗原 配合物を注射した。テンジクネズミを、その足の裏または筋肉内から免疫化した 。ウサギ、ヤギおよびヒトを、それらの筋肉内から免疫した。

免１１営［（社）１梶 免疫化抗原に対する抗体の力価を、酵素結合免疫吸収法（ＥＬＩＳＡ）によって 測定した。

裏−施−１ 刑　にお番るＭＴＰ−ＰＥ−ＬＯ （ＪＬＪＬＪＬ） 大型動物で免疫能を刺激するためにＭＴＰ−ＰＥ−ＬＯ配合物を用いて、最初に ＨＩＶｅｎｖ２−３抗原で、後からＨ３ＶｇＤタンパクで、多数の実験を行った 。これらの実験を以下に概説する。

１、ＨＩＶｅｎｖ　２−３ ａ、テンジクネズミ。テンジクネズミを、その足の裏または筋肉内から５０ｕｇ ／用量のｅｎｖ２−３で１力月毎に免疫化した。ワクチンは、ＭＴＰ−ＰＥ−Ｌ Ｏ配合物（４％スクアレン、ｏ、ｏｏｓ％↑−ｅｅｎ　８０．　５０　ｕ　ｇ／ 用量のＭＴＰ−ＰＥ）とともに投与するか、アルム（０，７％水酸化アルミニウ ム）に吸収させた。血清を、各免疫化の１週間後に集め、その抗ｅｎｖ２−３抗 体をＥＬＩＳＡによって解析した。結果を表１に示す。このＭＴＰ−ＰＥ−ＬＯ 配合物は、筋肉内と足の裏の両方に投与した場合、高い抗ｅｎｖ２−３力価を示 した。対照的に、アルムは、両方の経路によっても非常に低い力価を示した。こ の実験によって、テンジクネズミにおけるＭＴＰ−ＰＥ−ＬＯ配合物の有効性が 説明される。

ｂ、ヤギ、一対のヤギに、０ないし５００μｇのさまざまな量のＭＴＰ−ＰＥを 含むＭＴＰ−ＰＥ−ＬＯ配合物とともに、初期の免疫化では１μｇのｅｎｖ　２ 　３を、第２の免疫化では５００μｇのｅｎｖ２−３を投与した。陽性の対照動 物には、ＣＦＡとともに初期の免疫化およびＩＦＡとともに第２の免疫化を行っ た。また、１群には、ＭＴＰ−ＰＥ１００μｇを含むＭＴＰ−ＰＥ−ＬＯ配合物 とともに、初期の免疫化で１００μｇのｅｎｖ２−３を、次の免疫化で５０μｇ のｅｎｖ２−３を投与した０表２に示すように、フロインドアジュバントを投与 された両方のヤギは、２７００から６２８００の高い抗体価を示した。対照的に 、ＭＴＰ−ＰＥ−ＬＯ配合物を投与されたヤギのほとんどは、抗ｅｎｖ２−３抗 体に関して陰性であった。応答のなかった動物だけが、１００〜６００の範囲の 力価を示した。これらの結果は、上記のテンジクネズミとは全く対照的である。

ｌ−■ ｅｎｖ　２−３ＥＬＩＳＡ力価 免疫化 ”：ｓ’ｒは、低い油形成；４％スクアレン、０．００８％Ｔｗｅｅｎ　８０゜ ｂ：　＜＜１００は、希釈率１／１００でバックグラウンドを越えなかったｅｎ ｖ２−３のＥＬＩＳＡ力価を示す。

’　：　＜１００は、この検定法でバックグラウンドを越えないが最大シグナル の半分未満であった、希釈率１／１００でのｅｎｖ２−３のＥＬＩＳＡ力価を示 す。

Ｃ，イヌ。ピーグル大に、ＭＴＰ−ＰＥ−ＬＯ（ＭＴＰ−ＰＥ１００μｇ）中の ２５０μｇのｅｎｖ２−３、またはＭＴＰ−ＰＥ−ＬＯ配合物のみを３週間隔で 免疫化した。各免疫化の１０日後、動物を放血させ、ＥＬＩＳＡによって抗ｅｎ ｖ２−３抗体価を測定した。表３から分かることではあるが、ｅｎｖ２−３およ びアジュバントを投与された２匹のイヌでは抗ｅｎｖ２−３抗体の力価が上がら ず、これらの力価はテンジクネズミの場合にみられたレベル（２匹の免疫化動物 で最大力価１７００および６３００）まで達しなかった。さらに、これらの動物 は、ホモ（ＳＦ２）またはへテロ（ＢＲＵまたはＺｒ６）ＨＩＶ株に対する、ウ ィルスの中和抗体を生じなかった。

表３ １；２１日毎にビオシンアジュバント（１００μｇＭＴＰ−ＰＥ）中に溶けた２ ５０μｇのｅｎｖ２−３を筋注されたイヌ、血液試料を各注射の１０日目に採取 した。

’：１／１００の血清希釈率でシグナルが全く検出されない場合、＜＜１００の ＥＬ　Ｉ　ＳＡ力価を掲示する。

ｃ：＜２０の中和力価は、最も濃縮された試験血清（１／２０で中和が全く認め られないことを示す。

ｄ、ブタ。ブタに、ＭＴＰ−ＰＥ−ＬＯ（ＭＴＰ−ＰＥ１００μｇ）とともにｌ ａｇのｅｎｖ　２　３を免疫化した。対照の動物にはアジュバントのみを投与し た。それぞれの免疫化の１０日後に、動物を放血し、ＥＬ　Ｉ　ＳＡによって抗 ｅｎｖ　２−３抗体価を測定した。表４の結果から分かることではあるが、２匹 の免疫化動物は、低い抗ｅｎｖ−２力価（それぞれ、１４０および１００）のみ を生じ、ホモ（ＳＦ２）またはへテロ（ＢＲＵまたはＺｒ６）に対する、ウィル スの中和力価は検出されなかった。

表４ ａ：ブタには、ビオシンアジュバント（ＭＴＰ−ＰＥ　１００ｕｇ）中のｌａｇ のｅｎｖ２−３を２１日毎に投与した。

血清は、各免疫化の１０日後に採取した。

’：＜＜５Ｑの力価を存する際、１１５０の血清希釈率ではシグナルを示さない ものは掲示しない。

ｃ：１１５０の血清希釈率において低いが検出可能なシグナル。

’：１／２０の血清希釈率では中和は見られず、はとんど濃縮された希釈物を試 験した。

ｅ、サル。アカゲザルに、ＭＴＰ−ＰＥ−ＬＯ（ＭＴＰ−ＰＥ１００μｇ）とと もに２５０μｇのｅｎｖ　２−３を免疫化した。対照の動物には、アジュバント 配合物のみを投与した。各免疫化の１週間後、動物を放血させ、ＥＬＩＳＡによ って抗ｅｎ、ｖ２−３抗体の力価を測定した。表５から分かることではあるが、 イヌと同様に、あらゆる動物にｅｎｖ２−３に対する抗体価が生じたが、これら の力価は３００〜３１００の範囲であって、先のテンジクネズミで見られたもの よりかなり低かった。

’１．　ＨｓＶ　ｇＤ ａ、ヤギ。一連のアジュバント組成物をヤギでｇＤ２を用いた試験した。動物を 、さまざまなアジュバントとともに１００μｇのｇＤ２で２１日毎に免疫した。

２回目および３回目の免疫から１０日後、動物を放血し、抗ｇＤ２の力価をＥＬ ＴＳＡによって測定した。以下のアジュバント組成物を使用した。ＣＦＡ　（１ °）、次いで、ＩＦＡ（２”および３°）、１００μｇのＭＴＰ−ＰＥを含むＸ 　ＦＡ、０．８＋＋ｇ／ｍｌの水酸化アルミニウム（アルム）　、ＭＴＰ−ＰＥ −ＬＯ（１００μｇのＭＴＰ−ＰＥ）　、ＭＴＰ−ＰＥ−ＬＯ−ＫＥ　（１００ μどのＭＴＰ−ＰＥ）およびＭＴＰ−ＰＥ−ＬＯ−ＫＥ　（１２％スクアレン、 ５、Ｑｓ＋ｇのＭＴＰ−ＰＥ）。ＥＬＩＳＡの結果を表６に示す、１匹のＣＦＡ ／ＩＦＡ動物、ＭＴＰ−ＰＥ／ＩＦＡの両動物、および１匹のＭＴＰ−ＰＥ−Ｌ Ｏ−ＫＥ　（５ｍｇＭＴＰ−ＰＥ）動物は、高い抗体価を示した（２１８７−１ ３．１７２）。１匹のＣＦＡ／ＩＦＡ動物、およびアルムの両動物、および１匹 のＭＴＰ−ＰＥ−ＬＯ−ＫＥ（５μｇＭＴＰ−ＰＥ）は、中程度の抗体価を示し た（５６９１４８９）。ＭＴＰ−ＰＥ−ＬＯの動物、およびＭＴＰ−ＰＥ−ＬＯ −ＫＥの動物は、低い抗ｇＤ２力価を示した（４６−３２３Ｌ　このように、上 記でｅｎｖ−２を使用したときのように、ＭＴＰ−ＰＥ−ＬＯ配合物は、ヤギで 高い抗体価を引き出せない。このエマルシヨンをカークランド乳濁装置を使って 修飾しても（１〜２ミクロンの油滴サイズ）、アジュバントの性能は向上しなか った。ＭＴＰ−ＰＥを大量（５，０＋ｇまで）投与すれば、アジュバントの性能 の向上が認められた。

表−亙 ヤギにおいて　Ｄ２　いたと　のアジュバントの　六１　３６０６　ＣＦＡ／Ｉ ＦＡ　２１８７　１３１７２２　３６１０　アルム　１４８９　７８１ｂ、ヒヒ 、幼若なヒヒを、アルム、ＭＴＰ−ＰＥ−ＬＯ−ＫＥ、ＭＴＰ／ＩＦＡおよびＩ ＦＡ単独とともに配合したｇＤ２で免疫した。さらに、アルムおよびＭＴＰ−Ｐ Ｅ−ＬＯ−ＫＥと配合したｇＤ２に関する用量依存性試験を実施した。

２〜３才のヒヒ（３，４〜１２ｋｇ）を、３週間間隔で筋注によって免疫した。

最初の２回の免疫化から３週間後、およびＥＬｒＳＡによるｇＤ特異的抗体の定 量のため最後のワクチン投与から２週間後、血清を集めた。全血細胞分析（ＣＢ Ｃ）のために３回の時点のそれぞれで、全血を採取した。アルムに結合した１０ ０μｇのｇＤ２で免疫したヒヒは、３３４９±５５０の抗ｇＤ２平均抗体価を生 じた。試験した３種類の抗体用量（１０，２５，１００μｇのタンパク）での力 価に有意差は認められなかった。２５０μｇのＭＴＰ−ＰＥ−ＬＯ−ＫＥととも に乳化した１０まもしくは１００μｇのｇＤ２、または５０ｕｇもしくは１００ ０ｇｇのＭＴＰ−ＰＥ−ＬＯ−ＫＥとともに乳化した２５μｇのｇＤ２を投与し た４群の動物における抗体応答は、２５μｇのｇＤ２および２５０μｇのＭＴＰ −ＰＥ−ＬＯ−ＫＥでワクチン処理したｇＤ２／アルム（平均範囲、１３００〜 ３９００）で免疫した群ある力価を示し、ＭＴＰ−ＰＥ−ＬＯ−ＫＥで免疫した 動物の力価は、ＭＴＰ／ｆ　ＦＡの０．５〜１．３の範囲であった。

これらの結果を表７に総括する。

ワクチンに対する副作用はどの動物においても認められず、ＣＢＣプロフィルは 正常であった。

１Ｍｆｉ主 で　１′シた、に　ｔなＭＴＰ−ＰＥ−ＬＯ至豆立 実施例２で示したように、ＭＴＰ−ＰＥ−ＬＯ配合物は注射器および注射針（〜 １０ミクロン滴下のサイズ）を用いて調製されるが、カークランド乳化機（１〜 ２ミクロンの滴下サイズ）を用いたのでは大型動物およびヒトでワクチンの抗原 に対するよい免疫刺激は得られなかった（データは示さない）。マイクロフルイ ダイザー１１０Ｙ型を用いて小滴で安定なエマルションを調製した。この装置は 、高圧（５０００〜３００００ＰＳＩ）で水中に沈められるジェットタイプの乳 化機である。一連のエマルションは、スクアレン、Ｔｗｅｅｎ　８０およびＭＴ Ｐ−ＰＥ、ならびに温度および操作圧といった物理的バラメーターバラメーに基 づいて、サイズおよび安定性を変えることによって調製される。このマイクロフ ルイダイザーを使ったつくられた数々のエマルションの例を表８に示す。

物理的パラメータおよびエマルション濃度を変えて、１ミクロンから０，２ミク ロンまでの油滴サイズを変えることができる。表８に示すように、エマルション の滴÷サイズを低下させるパラメータは、スクアレンに対する界面活性剤濃度の 増加、ＭＴＰ−ＰＥ濃度の増加、操作圧の増大、および操作温度の増大である。

これらの小滴サイズのエマルションは、次いで、ヤギおよびヒトでワクチン抗原 のためのアジュバントとして試験にかけられた。

１、ヤギで使用したＨ３ＶｇＤ２ ｇＤ２抗原を用いて使用した最初のマイクロフルイダイザーでは、Ｔｗｅｅｎ　 ８０を含まない４％スクアレン、１００μｇ／ｍ１ＭＴ　Ｐ　Ｐ　Ｅエマルショ ン（ＭＴＰ−ＰＥ−ＬＯ−ＭＦ＃１３　；ＭＴＰ−ＰＥ−ＬＯ−ＭＦ配合物の番 号づけは任意であって、参照番号として使っただけである）を使用した。この物 質は、そのマイクロフルイダイザー中で低圧下で作られたものであって、約０． ８ミクロンの油滴サイズを有していた。この配合物中の１００μｇのｇＤ２を用 いて２１日間隔で３回筋肉内から免疫した。最初にＣＦＡ中に、２回目にＩＦＡ 中に溶けた１００μｇのｇＤ２で免疫したヤギは、対照とした。２回目および３ 回目の免疫化の１０日後に、この動物を放血させ、抗ｇＤ２抗体の力価をＥＬＩ ＳＡによって測定した。結果を表９に示す。ＭＴＰ−ＰＥ−ＬＯ−ＭＦと投与さ れた両動物は、有意な抗ｇＤ２力価を示した。これらの力価１６６１〜２９６６ は、２匹のＣＦＡ／ＩＦＡ対照ヤギ（１４０−２４，２６９）の力価に比べて中 間の値であった。

ＭＴＰ−ＰＥ−ＬＯ−ＭＦ動物は、注射器および注射針、またはカークランド乳 化機で調製したＭＴＰ−ＰＥ−ＬＯを投与されたヤギより有意に高い力価を示し た（表６参照）。ヤギでの第２の実験では、１００μｇのｇＤ２をＭＴＰ−ＰＥ −ＬＯ−ＭＦ＃１６とともに２１日毎に投与した。この配合物は４％のスクアレ ン、５００μｇ／■ｌのＭＴＰ−ＰＥおよびＯＴｗｅｅｎ　８０からなるもので ある。このエマルションの油清サイズは０．５〜０．６ミクロンであった。表１ ０に見られるように、この配合物は、従来の配合物より高い抗体価をもつようで あった。こうして、油滴サイズの減少、および／またはＭＴＰ−ＰＥの増加によ って、このエマルシヨンのアジュバント性能が改善される。

ヤギにおいＴ　Ｄ２に　るＭＴＰ−ＰＥ−ＬＯ−ＭＦの賎 ”　：　４９’Ｇスクアレン、１００ｔＩｇ／ｍ１ＭＴＰ−ＰＥ、ＯＴｗｅｅｎ ８０、水、約０．８ミクロンの油滴サイズゝ：Ｎ、τ、＝試験せず、免疫化きは 無関係の原因で死亡した動物。

ｌ−刊 ヤギにおけるｇＤ２のアジュバントとしてのＭＴＰ−ＰＥ−ＬＯ−ＭＦ＃１３の 試験 （ａ）ＭＴＰ−ＰＥ−ＬＯ−ＭＦ＃１６−４％スクアレン、５００１１　ｇ／ｍ １ＭＴ　Ｐ　−Ｐ　Ｅ、　ＯＴｗｅｅｎ　８０．１−ｉｚｏ。油滴サイズ０．　 ５〜０．６ミクロン。

２、　ヤギにおけるＨＩＶｅｎｖ２−３及びｇｐ１２０ＨＩＶ抗原ｅｎｖ２−３ 及びｇＰ１２０を用いて、マイクロフルイダイザ−（ｍｉｃｒｏｌｌｕｔｄｉｚ ｅｒ）調製物をアジュバントとしてのＣＦＡ／ＩＦＡ及びＭＴＰ−ＰＥ−ＬＯ− ＫＥと比較した。動物を２１日間隔で３回、ＣＦＡ　（１°）／ＩＦＡ　（２’ 　＆３’　）　、ＭＴＰ−ＰＥ−ＬＯ−ＭＦ＃１４　（４％スクアレン、５００ 　ｕ　ｇ／ａ＋ｌ、　ＭＴＰ−ＰＥ、ＯＴｗｅｅｎ　、リン酸緩衝液）、ＭＴＰ −ＰＥ−ＬＯ−ＫＥ　（４％スクアレン、１００ミクロンＭＴＰ−ＰＥ、０．０ ０８％Ｔｓｅｅｎ　８０、Ｋｉｒｋｌａｎｄ乳化剤中に乳化されたリン酸緩衝液 ）及びＭＴＰ−ＰＥ−ＬＯ−ＭＦ＃１５　（４％スクアレン、１００μｇＭＴＰ −ＰＥ、ｏ、ｏｏｓ％Ｔｗｅｅｎ　８０、リン酸緩衝液）中ｇＰ１２０抗原１１ ００ｕにより免疫感作した。動物をまたＣＦＡ／ＩＦＡ中又はＭＴＰ−ＰＥ−Ｌ Ｏ−ＭＦ＃１４中１００μｇのＨＩＶ抗原ｅｎｖ２−３により免疫感作した。第 ２及び第３免疫の２０日後に動物の採血を行い、そして抗−ｅｎｖ２−３抗体力 価をＥＬ　Ｉ　ＳＡにより決定した。結果を表１１に示す。ｅｎｖ２−３につい て、ＭＴＰ−ＰＥ−ＬＯ−ＭＦ＃１４製剤により免疫感作された動物は２回の免 疫後のＣＦＡ／ＩＦＡ動物と同等の力価を示し、そして３回の免疫の後のＣＦＡ ／ｒＦＡ動物より高い力価を示した。ｇｐ１２０については、結果は完全には明 瞭ではなかった。ＭＴＰ−ＰＥ−ＬＯ−ＭＦ＃１４動物はＣＦＡ／ＩＦＡ動物よ り非常に大きな多様性を示す、従って、マイクロフルイダイザ一群の平均力価は ＣＦＡ群より低いが、ＭＴＰ−ＰＥ−ＬＯ−ＭＦ＃１４を投与された個々の動物 はＣＦＡ／ＩＦＡ群の動物と同様に高い力価を示した。２つの異る方法（Ｋｉｒ ｋｌａｎｄ乳化剤対マイクロフルイダイザー）により乳化されたｇｐ１２０の同 じアジュバント成分（４％スクアレン、１００μｇ／＊ＩＭＴＰ−ＰＥ、０．０ ０８％Ｔｗｅｅｎ　８０、リン酸緩衝液）の直接比較は乳剤における小滴サイズ の重要性を示す。Ｋｉｒｋｌａｎｄ乳化荊群はこれ乳化色群感作の後６３２の平 均力価を示し、他方マイクロフルイダイザ一群は３２７７の平均力価を示した。

３、　ヒヒにおけるＩ（ＩＶｅｎｖ　２−３及びｇｐ１２０ヒヒにおいてＨＩＶ 抗原ｅｎｖ　２　３及びｇｐ１２０を用いてアジュバントとしてＭＴＰ−ＰＥ− ＬＯ−ＭＦ＃１（２％スクアレン、５００　ｕ　ｇ　／ｍ１ＭＴ　Ｐ　−Ｐ　Ｅ 、　ＯＴｗｅｅｎ８０、ＨｔＯ１油滴サイズす０．１７ミクロン）を試験した。

対照としてＩＦＡ中ＭＴＰ−ＰＥ及びアルムを使用した。動物を１ケ月間隔で免 疫感作した。第２回免疫感作から２週間後、動物から採血し、そして抗−ｅｎｖ ２−３抗体ウィルス中和力価を決定した。結果を表１２に示す、ｇｐ１２０に対 する抗体力価はＭＴＰ−ＰＥ−Ｉ　ＦＡを用いるよりもＭＴＰ−ＰＥ−ＬＯ−Ｍ Ｆ＃１を用いる場合に高かった。抗−ｅｎｖ２−３力価はＭＴＰ−ＰＥ−Ｉ　Ｆ Ａ及びＭＴ　Ｐ　−Ｐ　Ｅ−ＬＯ−ＭＦ＃１群において類似していた。アルムを 用いて達成される抗−ｇＰ１２０力価はＭＴＰ−ＰＥ−ＬＯ−ＭＦ＃１を用いた 場合と同じ範囲にあったが、アルムを用いて達成される抗−ｅｎｖ２−３力価は ＭＴＰ−ＰＥアジュバントを用いる場合より低いようであった。

■ｌ　゛　のアジュバント　、ＴＩ 前記の詳細な例に加えて、本発明のアジュバント組成物を含有するワクチン製剤 として多数の他の抗原が調製された。

これらは、インフルエンザ及びマラリアの病原体からの抗原、並びに前の例にお いて記載したもの以外のＨｒＶ及びＨＳＶに関連する抗原を包含する。サイトメ ガロウィルス（ＣＭＶ）及び肝炎Ｃウィルス（ＨＣＶ）からの抗原も、他の示さ れた抗原について記載したのと同じアジュバント製剤中で使用することができる ので、これらも記載される。

汎−厘 ラクチン製剤において使用するために適当なインフルエンザ抗原は商業的に入手 可能である。次の例において使用される抗原はＰａｒｋｅ−Ｄａｖｉｓにより製 造されるフルオゲン（Ｆｌｕｏｇｅｎ）（商標）　、Ｄｕｐｈａｒ　Ｂ、Ｖ、に より製造されるドウファール（Ｄｕｐｈａｒ）　、及びインステイトウド・ワク チン製剤・ボチー（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｏ　Ｖａｃｃｉｎｏｇｅｎｏ　Ｐａｚｚｉ ）により製造されるインフルエンザワクチンハツチＡ４１である。

ワクチン製剤中で使用使用するために適当なマラリア抗原は、１９８９年４月１ １日に出願された米国特許出願Ｎｏ、３３６゜２８８、及び１９８９年５月２日 発行の米国特許Ｎｏ、４．８２６．９５７に記載されている。

ラクチン製材において使用するために適当な追加のＨｒＶ抗原に１９９０年３月 ９日に出願された米国特許出願Ｎｏ、４９０゜８５８に記載されている。さらに 、追加のＨＩＶ抗原については公開されたヨーロッパ出願Ｎｏ、１８１１５０（ １９８６年５月１４日）を参照のこと。

ワクチン製剤において使用するのに適当な追加のＨＳＶ抗原は１９８５年１０月 ２４日に公開されたＰＣＴ　ＷＯ３５１０４５８７、及び１９８８年４月２１日 に公開されたＰＣＴ　ＷＯ３８１０２６３４に記載されている。アンカー領域を 欠く端が切除された表面抗原であるｇＢ及びｇＤ抗原の混合物が特に好ましい。

ワクチン製剤中に使用するのに適当なサイトメガロウィルス抗原は１９８７年８ 月２５日発行の米国特許Ｎｏ、４．６８９．２２５、及び国際公開Ｎｏ、　ＷＯ ３９／　０７１４３として１９８９年８月１０日に公開されたＰＣＴ出願ＰＣＴ ／ＵＳ８９１００３２３中に記載されている。

ラクチン製剤中に使用するのに適する肝炎Ｃ抗原はＰＣＴ／ｕｓｓ８１０４１２ ５　、公開されたヨーロッパ出＠Ｎｏ、３１８２１６（１９８９年５月３１日） 、特開平Ｎｏ、１−５００５６５　（１９Ｂ　８年１１月１８日出願）、及びカ ナダ出１１Ｎｏ、５８３．５６１に記載されている。異るセットのＨＣＶ抗原が １９９０年３月１６日に出願されたヨーロッパ特許出願９０／３０２８６６．０ に記載されている。

さらに、１９８９年１２月２１日出願の米国特許出願Ｎｏ、４５６゜６３７、及 びＰＣＴ／ＵＳ９０１０１３４Ｂを参照のこと。

なお、上記の種々の公開された出願番号の公表物はインデックスサービス、例え ばワールド・パテント・インデックス（Ｗｏｒｌｄ　Ｐａｔｅｎｔ　Ｉｎｄｅｘ ）及び他の国における対応出願のリストから得ることができる。

アジュバント　び゛ 次の要約は、アジュバント製剤及びそれらをいかにして製造するか、並びにアジ ュバント及び種々の抗原物質を用いて調製されたワクチン組成物を記載する。幾 つかの場合、上記の例のように詳細にではなくワクチン投与研究要約が記載され るが、これはすでに記載されたワクチン投与研究がワクチン組成物の使用のため に十分な手引きを与えるからである。

インフルエンザ 一連の実験において、インステイトウド・ワタチノゲノ・ボチーからの市販のイ ンフルエンザワクチンによりハムスターを免疫した。このワクチンは２個のＡ株 （Ａ　／　Ｌｅｎ　ｉｎｇｒａｄ／３６０　／８６及びＡ　／Ｓｉｎｇａｐｏｒ ｅ　／　６　／８６）及び１個のＢ株（Ｂ　／Ａｎｎ　Ａｒｂｏｒ　／　１　／ ８６）からの精製されたＨＡから成る。

このワクチンを単独で、Ｋｉｒｋｌａｎｄ乳化剤（Ｆｌｕｏｒｏｇｅａｄ　Ｐｈ ａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ、　Ｉｎｃ、、　Ｌａ　Ｍｅｓａ、　ＣＡ）を用いて 作られたＭＴ　Ｐ　−ＰＥ／ＬＯ乳剤と共に、及びマイクロフルイダイザー（モ デル１１０　ＹＳＭｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ、　Ｎｅｗｔｏｎ、　ＭＡ）中で 作られたＭＴＰ−Ｐ　Ｅ／Ｍ　Ｆ乳剤と共に試験した。最初の２つは比較組成物 であり、他方ｒＭＦ、組成物は本発明の組成物である。ＭＴＰ−ＰＥ／ＭＦはｒ ＭＴ　Ｐ　−Ｐ　Ｅマイクロフルイダイザー」乳剤と称され、そしてマイクロフ ルイダイザーにより乳化された４％スクアレン及び１．（１＋ｇ／ｍ１ＭＴＰ− ＰＥを含有する。Ｍ　Ｔ　Ｐ　−Ｐ　Ｅ　Ｋｉｒｋｌａｎｄ乳剤は４％スクアレ ン、０．５ｍｇ／ｍ１ＭＴ　Ｐ　−Ｐ　Ｅ、及び０，００８％Ｔｗｅｅｎ　８０ 　（Ｋｉｒｋｌａｎｄ乳剤剤により乳化）を含んでいた。動物は８．３μｇの各 ＨＡ抗原を含む３回の免疫を受けた。。ＭＴＰ−ＰＥは両方の製剤中で投与当り ５０μｇで使用された。ＥＬＩＳＡ力価を各免疫後に免疫抗原に対して決定し、 そしてＨＡＩ力価を第二免疫後に決定した。ＥＬＩＳＡ力価は、試験した広アジ ュバント製剤により実質的に増加した。

他の実験においては、市販のＰａｒｋｅ−Ｄａｖｉｓ　Ｆｌｕｏｇｅｎワクチン （ＨＡ　Ａ／Ｓｈａｎｇｈａｉ／１１／８７．　Ａ／Ｔａｉｗａｎ／　１　／　 ８６及びＢ　／Ｙａｍａｇａｔａ／１６／８８）又は市販のＤｕｐｈａｒインフ ルエンザワクチン（ＨＡ　Ａ／５ｅｃｈｕａｎ　／　２　／　８７　、　Ａ／Ｓ ｉｎｇａｐｏｒｅ　／　６／８６及びＢ　／Ｂａｉｊｉｎｇ　／　１　／８７） を単独で、又はＭＦ６９アジュバント製剤（ＭＦ６９は５％スクアレン、０．２ ％Ｔｗｅｅｎ８０、０．８％５ｐａｎ　８５及び４００μｇ／ｍ１ＭＴＰ−ＰＥ 、マイクロフルイダイザー中で乳化）と共に用いて免疫感作した。

同体積のワクチンをＭＦ６９アジュバントと混合した。動物は１１．２５μｇの Ｐａｒｋｅ−Ｄａｖｉｓワクチン又は７．５μｇのＤｕｐｈａｒワクチンによる ３回の免疫感作を３週間の間隔で受けた。ＭＦ６９アジュバントを投与された動 物に５０μｇのＭＴＰ−ＰＥを受けた。Ｄｕｐｈａｒ及びＭＦ６９を投与された 動物は、１又は２回の免疫の後Ｄｕｐｈａｒ単独よりも有意に高い抗−ＭＡ力価 を示した（ワクチン単独よりも、１回の免疫の後平均力価は８０倍高く、そして ２回の免疫の後１７０倍高い）。

ＭＦ６９アジュバントはＰａｒｋｅ−Ｄａｖｉｓワクチンに対する抗体応答の良 好な刺激を示し、１回、２回又は３回の免疫の後２９５１．１４，９２７及び１ ２８７Ｂの平均力価を生じさせた。これは、それぞれ１回、２回又は３回の免疫 の後ワクチンのみに比べて８２倍、２９倍及び１０倍高い。両ワクチンについて 、ピーク抗体価はＭＦ６９による２回の免疫の後に見られた。

更なる実験において、２種類の市販のインフルエンザワクチンＰａｒｋｅ−Ｄａ ｖｉｓ　Ｆｌｏｏｇｅｎ及びＤｕｐｈａｒサブユニットインフルエンザの免疫原 性をヤギにおいて、アジュバント無し及び幾つかのＭＴＰ−ＰＥ含をアジュバン ト製剤を用いて比較した。

０．５１のＰＢＳ又は０．５ｍｌのＭＴＰ−ＰＥアジュバント製剤と混合された ０、５ｍｌの各ワクチンにより動物を筋肉内免疫した。３種類のアジュバント製 剤、すなわちＰＢＳに溶解したＭＴＰ−ＰＥ２００ｕｇ、並びにＧａｕｌｉｎ　 １　／　４及びＭＦ　４０／４乳剤と称する２種類の異るマイクロフルイダイザ ー乳荊中ＭＴＰ−ＰＥ２００μｇを比較した。Ｇａｕｌｉｎ　１　／　４はＧａ ｕｌｉｎホモジナイザー（ＡＰＶ　Ｇａｕｌｉｎ、　Ｅｖｅｒｅｔｔ、　ＭＡ） 中で乳化された１、６％スクアレン及び４００μｇ／ｍ１ＭＴＰ−ＰＥから成る 。ＭＴＰ−ＰＥ／ＭＦ−４０／４は、マイクロフルイダイザ−（Ｍｏｄｅｌ　ｌ ｌ０Ｙ、　Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ、　Ｎｅｗｔｏｎ、　ＭＡ）中で乳化さ れた１、６％スクアレン、４００μｇ／ｓ＋ＩＭＴＰ−ＰＥ、０．１５４％Ｔｗ ｅｅｎ　８５及び０．１６６％５ｐａｎ　８５から成る＊　１．　Ｏｍｌの注射 体積が生ずるように０．５ｍｌのＰＢＳ又は０．５ｍｌの示されるアジュバント 製剤と混合された０゜５ｍｌのワクチンを動物に投与した。ハムスターの場合の ように、アジュバント乳剤と組合わされたインフルエンザワクチンを投与された ヤギはワクチンのみを投与されたヤギよりも非常に高い抗体価を示した。これは 特に、免疫スケジュールの早い時期に顕著である。１回の免疫の後、Ｇａｕｌｉ ｎ　１　／　４乳剤はＰａｒｋｅ−Ｄａｖｉｓワクチン単独に比べて３０倍以上 高い抗−ＨＡ力価を生じさせた。ＭＴＰ−ＰＥ／ＭＦ−４０乳剤は、Ｐａｒｋｅ −Ｄａｖｔｓワクチン単独よりも１３０倍高く、そしてＤｕｐｈａｒワクチン単 独よりも６０倍高い抗−ＨＡ力価を生じさせた。

ＰＢＳ中のＭＴＰ−ＰＥは１回の免疫の後抗体価の刺激を示さなかった。２回の 免疫の後、乳剤を用いて抗体価の類似の上昇が見られた。インフルエンザワクチ ンは一般に成人に１回投与ワクチンとしてそして小児には２回投与ワクチンとし て投与されるので、アジュバント乳剤を用いて見られる抗−ＨＡ力価の早期刺激 は特に有意義である。従って、ハムスターにおけると同様に、ＭＴＰ−ＰＥ−乳 剤はインフルエンザワクチンへの免疫応答の大きな増加を示す。

他の実験において、Ｄｕｐｈａｒワクチンを単独で及びアジュバント製剤ＭＦ６ ９を用いて比較した。　Ｐａｒｋｅ−Ｄａｖｉｓワクチンを単独で、並びにＭＦ ＩＯＩ、ＭＦ６９．ＭＦ−８６＋ＭＴＰ−ＰＥ、及びＧｕａｌｅｎホモジナイザ ー（マイクロフルイダイザー）中で作られたＲｉｂｉアジュバント系を用いて比 較した。

ＭＦ−１０１はマイクロフルイダイザー中で乳化された１゜６％スクアレン及び ４００μｇ　／ａ＋］ＭＴ　Ｐ　−Ｐ　Ｅから成る。

ＭＦ−６８はマイクロフルイダイザー中で乳化された５％スクアレン、０．８％ ５ｐａｎ　８５及び０．２％Ｔｗｅｅｎ　８０から成る。

ＭＦ−６８＋ＭＴＰは、４００μｇ７’ａｌのＭＴＰ−ＰＥが乳化後に添加され たＭＦ−６８から成る。リビーＭＦはＧａｕｌｉｎホモジナイザー中で乳化され た２％スクアレン、０．４％Ｔｗｅｅｎ　２０．　２５０　ｕ　ｇ　／ｍｌモノ ホスホリルリビドＡ、２５０μｇ／ｍｌトレハロースジミコレート及び２５０μ ｇ　／ｍ１ｌｌｉ胞壁骨格（Ｒｉｂｉ　Ｉａ＋ｍｕｎｏｃｂｅｍ＋　Ｈａｍｉｌ ｔｏｎ　Ｍｏｎｔａｎａ）から成る。すべてのアジュバントは同体積のワクチン （抗原）と共に０゜５ｍｌ／注射の投与量で使用された。ＭＦ６９はＤｕｐｈａ ｒワクチンへのＥＬＩＳＡ力価を有意に上昇させた。また、試験したアジュバン トのすべてが、ＥＬＩＳＡ力価及びヘマグルチネーション力価により測定したＰ ａｒｋｅ−Ｄａｖｔｓワクチンの免疫原性を上昇させた。

更なる実験において、ＭＦ６９及びＭＦ５９製剤（７ｗｅｅｎ８０　：　５ｐａ ｎ　８５の比率においてのみ異る；前記参照のこと）をアジュバントとして、ヤ ギにおけるＰａｒｋｅ−Ｄａｖｉｓインフルエンザワクチンを用いて比較した。

アジュバント製剤と組合わせた半分のヒトワクチン投与量（７，５μｇずつの３ 種類のＨＡ酸成分により動物を一回免疫した。製剤中１００μｇの量でＭＴＰ− ＰＥを用いた。予想通り、この２種類の製剤はＭＦ６９と非常に類似した力価を 示した。すなわち、ＭＦ６９は平均力価９２６を示し、そしてＭＦ５９は８２１ と平均力価を示した。

マラリア ワクチン投与研究がアジュバントとしてＭＦ５９（前記）を用いて開始された。

この病気の胞子小体、分裂小体及び赤血球段階からの商業的に入手可能な抗原の 混合物を用いた：Ｆａｌｃ、２．　３胞子率体周囲抗原、ＨＰ１９５分裂小体抗 原、及び５ＥＲＡＩ赤血段階抗原。ワクチン組成物を上記の様にして、すなわち 、同体積のあらかじめ調製したＭＦ５９アジュバント及び抗原組成物を混合して 調製する。

ＨＩＶ 多数の異るｇｐ　１２０抗原による中和抗体の生産を比較するため免疫実験を行 った。抗原の調製の詳細は１９９０年３月９日出願の米国特許出１１ｔＮｏ、４ ９０．８５８に記載されている。１つの抗原は酵母において生産されたａｐ１２ ０Ｍ［似体（ｅｎｖ２−３）であって変更され且つグリコジル化されていないも のであった。他の抗原は、その天然コンフィグレーションを維持しているグリコ ジル化ｇｐ１２０であった。両ｇｐ１２０材料は同じ遺伝子源であるＨＩＶ−Ｉ ＳＦ−２単離体に由来した。抗体生産をヒトにおいて測定した。１ミクロンより 大きい粒子サイズを有する油含有アジュバントは常用のミョウバンアジュバント により生成する力価より低い力価を生成した。しかしながら、サブミクロン粒子 のアジュバントを用いての後の研究は、ミョウバンを用いるよりも少なくとも１ ０倍高い抗体価を生成した。最初のサブミクロン組成物は水中に２％スクアレン 及びｏ、ｓｏｏ■ｇ／ｇ＋ＩＭＴ　Ｐ　−Ｐ　Ｅを含有し、そして平均直径約０ ．１５ミクロンの油滴を有していた。ＭＦ５９（前記）又はＭＦ５８　（ＭＦ５ ９、しかし外部から添加されたＭＴＰ−ＰＥを含む）を用いるワクチン組成物は 、ヒしにおけるアジュバントとして、使用される最初のサブミクロン組成物より 、抗体生産の刺激において一層有効であることが証明された。ＭＦ５９は、０． １００ｍｇＭＴＰ−ＰＥの率で１＝２の希釈で使用された。

ヘルペスウィルス 前記のｇＤ２実験に加えて、ＭＦ５９及び種々の置のＭＴＰ−ＰＥ及び抗原を用 いて追加の実験が行われた。モルモット（筋肉内投与）において０．００３〜０ ．２５０ｍｇのｇＤ２をＭＦ５９アジュバント及び０．０５Ｏｎ＋ｇのＭＴＰ− ＰＥと共に用いて、あるいはｏ、ｏｉｏ〜０．１００ｍｇのｇＤ２をＭＦ５９及 び０．１００ｍｇのＭＴＰ−ＰＥと共に用いて、満足すべき抗体価が得られた。

サイトメガロウィルス ０．５閘ｌの生理的食塩水中０．００１〜０．２５０ｍｇのＣＭＶと、０．０５ ０ａ＋ｇのＭＴＰ−ＰＥを含むＭＦ５９アジュバント０．５閘ｌとを混合するこ とによりワクチン製剤を得ることができる。同様にしてＭＦ６９、ＭＦＩＯＩ及 び他のサブクローン粒子アジュバントを用いることができる。

肝３Ｊ≧と工四２工 ０、　５閘ｌの生理的食塩水中０．　００１〜０．　２５０ｍｇのＨＣＶ抗原と 、０．０５０ｍｇのＭＴＰ−ＰＥを含有するＭＦ５９アジュバント０．５閘ｌと を混合することによりワクチン製剤を調製することができる。同様にして、ＭＦ ６９．ＭＦｌｏｌ及び他のサブミクロン粒子アジュバントを使用することかでき る。

前記の発明を、明瞭な理解の目的で説明及び例により幾分詳細に記載したが、添 付された請求の範囲の本質及び範囲を逸脱することな（ある種の変化及び変更を 行うことができることは、本発明の教示に照らして当業者に明らかであろう。

補正書の翻訳文提出書 （特許法第１８４条の８） 平成３年１１月２５日

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．（１）代謝可能な油、及び （２）乳化剤、 を含んで成り、該油及び該乳化剤が水中油乳剤の形で存在し、該乳剤の油滴の実 質上すべてが直径１ミクロン未満であり、そしてポリオキシプロピレン−ポリオ キシエチレンブロックコポリマーの非存在下に存在するアジュバント組成物。 ２．前記油が動物油である、請求項１に記載の組成物。 ３．前記油が不飽和炭化水素である、請求項２に記載の組成物。 ４．前記油がテルペノイドである、請求項１に記載の組成物。 ５．前記油が植物油である、請求項１に記載の組成物。 ６．前記組成物が、水性媒体中に０．５〜２０容量％の油を含んで成る、請求項 １に記載の組成物。 ８．前記乳化剤がポリオキシエチレンソルビタンモノ−、ジ−もしくはトリ−エ ステル又はソルビタンモノ−、ジ−もしくはトリエーテルである請求項２０に記 載の組成物。 ９．前記組成物が０．０１〜０．５重量％の前記乳化剤を含んで成る、請求項８ に記載の組成物。 １０．前記組成物が別の免疫刺激剤をさらに含んで成る、請求項９に記載の組成 物。 １１．前記免疫刺激剤がミョウバン又は細菌細胞壁成分を含んで成る、請求項８ に記載の組成物。 １２．前記組成分が０．０００１〜１．０重量％の前記免疫刺激剤を含んで成る 、請求項１１に記載の組成物。 １３．前記免疫刺激剤がムラミルペプチドを含んで成る、請求項１１に記載の組 成物。 １４．前記乳剤剤がさらに免疫刺激剤として機能する、請求項１に記載の組成物 。 １５．前記組成物が０．０１〜０．５重量％の前記免疫刺激剤を含んで成る、請 求項１４に記載の組成物。 １６．前記免疫刺激剤が親脂性ムラミルペプチドを含んで成る、請求項１４に記 載の組成物。 １７．前記ペプチドがムラミルジペプチド又はムラミルトリペプチドである、請 求項１６に記載の組成物。 １８．前記ペプチドがさらにリン脂質を含んで成る、請求項１７に記載の組成物 。 １９．前記リン脂質がホスホグリセリドを含んで成る、請求項１８に記載の組成 物。 ２０．前記ペプチドが次の式： ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、ＲはＨ又はＣＯＣＨ３であり；Ｒ１，Ｒ２及びＲ３は独立にＨ又は脂質 成分を表わし；Ｒ４は水素又はアルキルであり； Ｘ及びＺは独立にアラニル、バリル、ロイシル、イソロイシル、α−アミノブチ リル、スレオニル、メチオニル、システイニル、グルタミル、イソグルタミル、 グルタミニル、イソグルタミニル、アスパルチル、フェニルアラニル、チロシル 、トリブトファニル、リジル、オルニチル、アルギニル、ヒスチジル、アスパラ ギニル、プロリル、ヒドロキシプロリル、セリル、及びグリシルから成る群から 選択されたアミノアシル成分を示し； ｎは０又は１であり； Ｙは−ＮＨＣＨＲ５ＣＨ２ＣＨ２ＣＯ−であり、ここでＲ５は場合によってはエ ステル化又はアミド化されているカルボキシル基であり；そして ＬはＯＨ，ＮＲ６Ｒ７（式中、Ｒ６及びＲ７は独立にＨ又は低級アルキル基を示 す）、又は脂質成分である〕で表わされる化合物である、請求項１４に記載の組 成物。 ２１．Ｒ４がメチルであり、Ｘがアラニルであり、そしてＹがイソグルタミニル である、請求項２０に記載の組成物。 ２２．ｎが１であり、Ｚがアラニルであり、Ｒがアセチルであり、そしてＲ１， Ｒ２及びＲ３がすべてＨである、請求項２０に記載の組成物。 ２３．Ｌがリン脂質成分を含んで成る、請求項２２に記載の組成物。 ２４．前記リン脂質成分がジアシルホスホグリセリドである請求項２３に記載の 組成物。 ２５．前記ペプチドがＮ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミ ニル−Ｌ−アラニン−２−〔１，２−ジバルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−（ ヒドロキシホスホリルオキシ）エチルアミドである、請求項２０に記載の組成物 。 ２６．Ｒ１およびＲ２の少なくとも一方が１〜２２個の炭素原子を含有するアシ ル基を表わす、請求項２０に記載の組成物。 ２７．Ｒ１，Ｒ２及びＲ３の少なくとも１つが炭素原子数１４〜２２個を含有す るアシル基を表わす、請求項２０に記載の組成物。 ２８．（１）免疫刺激量の抗原物質、及び（２）免疫刺激量の請求項１に記載の アジュバント、を含んで成るワクチン組成物。 ２９．宿主動物において免疫応答を刺激する方法であって、該動物に、連続水性 相中サブミクロンの代謝可能な油滴の免疫刺激量の存在下、及びポリオキシプロ ピレン−ポリオキシエチレンブロックコポリマーの非存在下で、保護抗原を投与 することを含んで成る方法。 ３０．前記油滴が乳化剤をさらに含んで成る、請求項２９に記載の方法。 ３１．前記油滴がさらに、前記油及び前記乳化剤とは別の免疫刺激剤を含んで成 る、請求項３０に記載の方法。 ３２．前記免疫刺激剤がミョウバン又は細菌細胞壁成分を含んで成る請求項３１ に記載の方法。 ３３．前記免疫刺激剤がムラミルペプチドを含んで成る、請求項３１に記載の方 法。 ３４．前記乳化剤が免疫刺激剤としても有効である、請求項３０に記載の方法。 ３５．前記免疫刺激剤が親脂性ムラミルペプチドを含んで成る、請求項３４に記 載の方法。