JP2023524860A - SARS-CoV-2ワクチン - Google Patents
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Abstract
コロナウイルスのSタンパク質、特にSARS-CoV-2 Sタンパク質をコードするRNAレプリコンが記載されている。RNAレプリコンの医薬組成物及びその使用もまた記載されている。
Description
(関連出願の相互参照)
本出願は、2020年5月11日に出願された米国仮出願第63/023,160号の優先権を主張し、その開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本出願は、2020年5月11日に出願された米国仮出願第63/023,160号の優先権を主張し、その開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
(電子的に提出された配列表への参照)
本出願は、「JPI6049WOPCT1_Sequence_Listing」というファイル名で、2021年4月20日に作成された146kbのサイズのASCIIフォーマット配列としてEFS-Webを介して電子的に提出された配列表を含む。EFS-Webを介して提出された配列表は、本明細書の一部であり、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本出願は、「JPI6049WOPCT1_Sequence_Listing」というファイル名で、2021年4月20日に作成された146kbのサイズのASCIIフォーマット配列としてEFS-Webを介して電子的に提出された配列表を含む。EFS-Webを介して提出された配列表は、本明細書の一部であり、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
(導入)
本発明は、ウイルス学及び医学分野に関する。特に、本発明は、安定化させた組換えコロナウイルススパイク(S)タンパク質(特にSARS-CoV-2 Sタンパク質)をコードする自己複製RNA及びSARS-CoV-2によって誘導される疾患を予防するためのワクチンへのこのタンパク質の使用に関する。
本発明は、ウイルス学及び医学分野に関する。特に、本発明は、安定化させた組換えコロナウイルススパイク(S)タンパク質(特にSARS-CoV-2 Sタンパク質)をコードする自己複製RNA及びSARS-CoV-2によって誘導される疾患を予防するためのワクチンへのこのタンパク質の使用に関する。
RNAレプリコンは、RNAウイルスに由来し、必須の構造タンパク質をコードする少なくとも1つの遺伝子が欠失しているレプリコンである。例えば、Zimmer,Viruses,2010,2(2):413-434を参照されたい。こうしたレプリコンは感染力のある後代を産生することができないが、ウイルスRNAを複製し、ウイルスRNAポリメラーゼを転写する能力は依然として保持している。RNAレプリコンによりコード化された遺伝情報は複数回増幅することができ、高レベルの抗原の発現をもたらす。更に、レプリコンRNAの複製/転写は、厳密には細胞質基質に限定されており、cDNA中間体を一切必要とせず、かつ宿主の染色体DNAの組換えや導入も一切必要としない。
SARS-CoV-2は、2019年後期に中国の武漢地区で最初に発見されたコロナウイルスである。SARS-CoV-2はMERS-CoV及びSARS-CoVと同様のβ-コロナウイルスであり、それら全てがコウモリに起源を有する。現在、米国、中国及び他の国の複数の患者から入手可能な複数の配列が存在しているが、これらは病原体保有動物からこのウイルスが単独かつ直近に出現した可能性を示唆している。ウイルスによって引き起こされたこの疾患の名称は、コロナウイルス疾患2019(coronavirus disease 2019)であり、COVID-19と略されている。COVID-19の症状は、確認されているCOVID-19症例について、軽度の症状から重篤な病気及び死といった範囲にわたっている。
上記のように、SARS-CoV-2は、起源であると考えられるコウモリコロナウイルスと強い遺伝類似性を有するが、パンゴリンといった保有中間宿主が関連すると考えられる。分類学的視点からは、SARS-CoV-2は重症急性呼吸器症候群(severe acute respiratory syndrome、SARS)関連コロナウイルス種の株として分類されている。
コロナウイルスは、宿主細胞受容体への結合、及びウイルスと宿主の細胞膜の融合を媒介する大きな三量体のスパイク糖タンパク質(S)を有するエンベロープRNAウイルスであり、Sタンパク質は主要な表面タンパク質である。Sタンパク質は、N末端S1サブユニット及びC末端S2サブユニットから構成されており、これらはそれぞれ受容体の結合及び膜融合を担う。α-、β-及びΔ-コロナウイルスのCoV三量体S構造の近年の低温電子顕微鏡法(cryogenic electron microscopy、cryoEM)再構成により、S1サブユニットは2つの異なるドメインであるN末端ドメイン(S1NTD)及び受容体結合ドメイン(S1RBD)を含むことが明らかになった。SARS-CoV-2は、S1RBDを使用し、ヒトアンジオテンシン変換酵素2(angiotensin-converting enzyme 2、ACE2)に結合する。
コロナウイルス科のSタンパク質は、クラスI融合タンパク質として分類され、融合を担う。Sタンパク質は、不安定な融合前立体配座から安定した融合後立体配座へと不可逆的にタンパク質をリフォールディングすることで、ウイルスと宿主の細胞膜を融合させる。他の多くのクラスI融合タンパク質と同様に、コロナウイルスSタンパク質は、融合及び進入に必要とされる立体配座の変化を誘導するため、受容体結合及び受容体切断が必要となる(Belouzard et al.(2009);Follis et al.(2006);Bosch et al.(2008),Madu et al.(2009);Walls et al.(2016))。SARS-CoV2のプライミングは、S1サブユニットとS2サブユニットとの間(S1/S2)の境界のフューリン切断部位でのフューリンによるSタンパク質の切断、及び融合ペプチド(S2’)上流の保存された部位でのTMPRSS2によるSタンパク質の切断に関与している(Bestle et al.(2020);Hoffmann et.al.(2020))。
融合前立体配座から融合後立体配座をリフォールディングするため、リフォールディングする必要がある2つの領域が存在する。これらはリフォールディング領域1(refolding region 1、RR1)及びリフォールディング領域2(refolding region 2、RR2)と呼ばれる(図1)。全てのクラスI融合タンパク質について、RR1は融合タンパク質(fusion protein、FP)及びヘプタッドリピート1(heptad repeat 1、HR1)を含む。切断及び受容体結合後、三量体中の3つのプロトマー全てのらせん、ループ及び鎖の伸長は、連続した長い三量体ヘリカルコイルドコイルへと変形する。続いてRR1のN末端セグメントに配置されているFPは、ウイルス膜から離れて伸びることが可能であり、標的細胞の近位膜に挿入する。次に、RR1に対してC末端に配置され、膜貫通領域(transmembrane region、TM)に近く、ヘプタッドリピート2(HR2)を含むリフォールディング領域2(RR2)は、融合タンパク質のもう一方の側に移動し、HR1コイルドコイル三量体とHR2ドメインとを結合し、6ヘリックスバンドル(six-helix bundle、6HB)を形成する。
SARS CoV-2 Sタンパク質といったウイルス融合タンパク質がワクチン成分として使用される場合、タンパク質の膜融合機能は重要ではない。実際のところ、ウイルスに結合することができる反応性抗体を誘導するためには、ウイルスに対するワクチン成分の模倣のみが重要である。したがって、頑強で有効なワクチン成分を開発するためには、準安定状態の融合タンパク質が融合前立体配座で維持されることが望ましい。SARS CoV-2 Sタンパク質といった、融合前立体配座が安定化した融合タンパク質は有効な免疫応答を誘導することができると考えられている。
近年、コロナウイルスSタンパク質を含む様々なクラスI融合タンパク質を安定化するためにいくつかの試みを行ってきた。特に良い成果をあげたアプローチは、ベースヘリックスに先行するRR1末端におけるいわゆるヒンジループの安定化であると示されていた(国際公開第2017/037196号、Krarup et al.(2015);Rutten et al.(2020),Hastie et al.(2017))。このアプローチはまた、SARS-CoV、MERS-CoV及びSARS-CoV2について示されているように、コロナウイルスSタンパク質についても良い成果をあげることが証明されている(Pallesen et al.(2016);Wrapp et al.(2020))。ヒンジループ中のプロリン変異は実際にコロナウイルスSタンパク質の発現を増大させるが、Sタンパク質は依然として不安定である傾向があり得る。したがって、例えばツールとして(例えば、モノクローナル抗体単離のためのベイト)使用することができるSタンパク質のワクチン設計を改善するため、更なる安定化が望まれている。
新しいSARS-CoV-2ウイルスが2019年後期にヒトで初めて観察されてから、COVID-19の結果として1億5000万人を超える人々がこれに感染し、300万人を超える人々が死亡した。SARS-CoV-2及びコロナウイルスは、より一般的には有効な処置を欠いているため、未だ対処されていない大きな医学的要求につながっている。更には、コロナウイルス誘発性疾患(COVID-19)を予防するために利用可能なワクチンは現在存在していない。現在、病気を予防するための最善の方法は、このウイルスへの曝露を回避することである。
COVID-19といった新興感染性疾患が公衆衛生に対して大きな脅威を示すことから、コロナウイルス誘発性呼吸器疾患を予防するために使用することができる新規ワクチンが緊急に必要とされている。
本発明につながる研究では、SARS-CoV-2に対する保護免疫応答を誘導するための免疫原として有用であると実証されている特定の安定化されたSARS-CoV-2 Sタンパク質が構築された。
本明細書では、組換え融合前SARS CoV-2 Sタンパク質又はその断片又はそのバリアントをコードするRNAレプリコンを提供する。このSARS CoV-2タンパク質は、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号12、配列番号14又はそれらの断片から選択されるアミノ酸配列を含む。
特定の態様では、RNAレプリコンは、5’から3’末端に向かって、
(1)RNAウイルスの非構造タンパク質による媒介増幅に必要な5’非翻訳領域(5'untranslated region、5’-UTR)、
(2)RNAウイルスの非構造タンパク質のうち少なくとも1つ、好ましくは全てをコードするポリヌクレオチド配列、
(3)RNAウイルスのサブゲノムプロモータ、
(4)組換え融合前SARS CoV-2 Sタンパク質又はその断片又はそのバリアントをコードするポリヌクレオチド配列、及び
(5)RNAウイルスの非構造タンパク質による媒介増幅に必要な3’非翻訳領域(3'untranslated region、3’-UTR)を順に含む。
(1)RNAウイルスの非構造タンパク質による媒介増幅に必要な5’非翻訳領域(5'untranslated region、5’-UTR)、
(2)RNAウイルスの非構造タンパク質のうち少なくとも1つ、好ましくは全てをコードするポリヌクレオチド配列、
(3)RNAウイルスのサブゲノムプロモータ、
(4)組換え融合前SARS CoV-2 Sタンパク質又はその断片又はそのバリアントをコードするポリヌクレオチド配列、及び
(5)RNAウイルスの非構造タンパク質による媒介増幅に必要な3’非翻訳領域(3'untranslated region、3’-UTR)を順に含む。
特定の態様では、RNAレプリコンは、5’から3’末端に向かって、
(1)αウイルスの5’非翻訳領域(5’-UTR)、
(2)αウイルスの非構造遺伝子nsp1の5’複製配列、
(3)ウイルス種の下流ループ(downstream loop、DLP)モチーフ、
(4)自己プロテアーゼペプチドをコードするポリヌクレオチド配列、
(5)αウイルスの非構造タンパク質nsp1、nsp2、nsp3及びnsp4をコードするポリヌクレオチド配列、
(6)αウイルスのサブゲノムプロモータ、
(7)組換え融合前SARS CoV-2 Sタンパク質又はその断片又はそのバリアントをコードするポリヌクレオチド配列、
(8)αウイルス3’非翻訳領域(3’UTR)、並びに
(9)任意選択で、ポリアデノシン配列を順に含む。
(1)αウイルスの5’非翻訳領域(5’-UTR)、
(2)αウイルスの非構造遺伝子nsp1の5’複製配列、
(3)ウイルス種の下流ループ(downstream loop、DLP)モチーフ、
(4)自己プロテアーゼペプチドをコードするポリヌクレオチド配列、
(5)αウイルスの非構造タンパク質nsp1、nsp2、nsp3及びnsp4をコードするポリヌクレオチド配列、
(6)αウイルスのサブゲノムプロモータ、
(7)組換え融合前SARS CoV-2 Sタンパク質又はその断片又はそのバリアントをコードするポリヌクレオチド配列、
(8)αウイルス3’非翻訳領域(3’UTR)、並びに
(9)任意選択で、ポリアデノシン配列を順に含む。
特定の態様では、DLPモチーフは、東部ウマ脳炎ウイルス(Eastern equine encephalitis virus、EEEV)、ベネズエラウマ脳炎ウイルス(Venezuelan equine encephalitis virus、VEEV)、エバーグレーズウイルス(Everglades virus、EVEV)、ムカンボウイルス(Mucambo virus、MUCV)、セムリキ森林ウイルス(Semliki forest virus、SFV)、ピクスナウイルス(Pixuna virus、PIXV)、ミドルバーグウイルス(Middleburg virus、MTDV)、チクングニアウイルス(Chikungunya virus、CHIKV)、オニョンニョンウイルス(O'Nyong-Nyong virus、ONNV)、ロスリバーウイルス(Ross River virus、RRV)、バーマ森林ウイルス(Barmah Forest virus、BF)、ゲタウイルス(Getah virus、GET)、サギヤマウイルス(Sagiyama virus、SAGV)、ベバルウイルス(Bebaru virus、BEBV)、マヤロウイルス(Mayaro virus、MAYV)、ウナウイルス(Una virus、UAV)、シンドビスウイルス(Sindbis virus、SINV)、アウラウイルス(Aura virus、AURAV)、ワタロアウイルス(Whataroa virus、WHAV)、ババンキウイルス(Babanki virus、BABV)、キジラガフウイルス(Kyzylagach virus、KYZV)、西部ウマ脳炎ウイルス(Western equine encephalitis virus、WEEV)、ハイランドJウイルス(Highland J virus、HJV)、フォートモーガンウイルス(Fort Morgan virus、FMV)、ヌドゥムウイルス(Ndumu、NDUV)及びバギークリークウイルスからなる群から選択されるウイルス種に由来する。
特定の態様では、自己プロテアーゼペプチドは、ブタテシオウイルス-1 2A(porcine tesehovirus-1 2A、P2A)、口蹄疫ウイルス(foot-and-mouth disease virus、FMDV)2A(F2A)、ウマ鼻炎Aウイルス(Equine Rhinitis A Virus、ERAV)2A(E2A)、Thosea asignaウイルス2A(Thosea asigna virus 2A、T2A)、細胞質多角体病ウイルス2A(cytoplasmic polyhedrosis virus 2A、BmCPV2A)、軟化病ウイルス2A(Flacherie Virus 2A、BmIFV2A)及びこれらの組み合わせからなる群から選択され、自己プロテアーゼペプチドはP2Aのペプチド配列を含むことが好ましい。
特定の態様では、RNAレプリコンであって、5’から3’末端に向かって、
(1)配列番号18のポリヌクレオチド配列を有する5’-UTR、
(2)配列番号19のポリヌクレオチド配列を有する5’複製配列、
(3)配列番号20のポリヌクレオチド配列を含むDLPモチーフ、
(4)配列番号22のP2A配列をコードするポリヌクレオチド配列、
(5)配列番号24、配列番号25、配列番号26及び配列番号27の核酸配列をそれぞれ有するαウイルスの非構造タンパク質nsp1、nsp2、nsp3及びnsp4をコードするポリヌクレオチド配列、
(6)配列番号16のポリヌクレオチド配列を有するサブゲノムプロモータ、
(7)配列番号1~4、12及び14又はそれらの断片又はそれらのバリアントからなる群から選択されたアミノ酸配列を有する融合前SARS CoV-2 Sタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列、並びに
(8)配列番号28のポリヌクレオチド配列を有する3’UTRを順に含む、RNAレプリコンを本明細書で提供する。
(1)配列番号18のポリヌクレオチド配列を有する5’-UTR、
(2)配列番号19のポリヌクレオチド配列を有する5’複製配列、
(3)配列番号20のポリヌクレオチド配列を含むDLPモチーフ、
(4)配列番号22のP2A配列をコードするポリヌクレオチド配列、
(5)配列番号24、配列番号25、配列番号26及び配列番号27の核酸配列をそれぞれ有するαウイルスの非構造タンパク質nsp1、nsp2、nsp3及びnsp4をコードするポリヌクレオチド配列、
(6)配列番号16のポリヌクレオチド配列を有するサブゲノムプロモータ、
(7)配列番号1~4、12及び14又はそれらの断片又はそれらのバリアントからなる群から選択されたアミノ酸配列を有する融合前SARS CoV-2 Sタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列、並びに
(8)配列番号28のポリヌクレオチド配列を有する3’UTRを順に含む、RNAレプリコンを本明細書で提供する。
特定の態様では、(a)P2A配列をコードするポリヌクレオチド配列は配列番号21を含み、RNAレプリコンはポリアデノシン配列を更に含み、ポリアデノシン配列はレプリコンの3’末端に配列番号29を有することが好ましい。
特定の態様では、RNAレプリコンは、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号11、配列番号13のポリヌクレオチド配列又はそれらの断片を含む。
配列番号30又は配列番号31のポリヌクレオチド配列を含むRNAレプリコンもまた提供される。
本明細書に記載のRNAレプリコンをコードするDNA配列を含む核酸もまた提供される。核酸は、DNA配列の5’末端に操作可能に連結されたT7プロモータを更に含むことが好ましく、T7プロモータは配列番号17のヌクレオチド配列を含むことがより好ましい。
本明細書に記載のRNAレプリコンを含む組成物もまた提供される。
本明細書で提供されるRNAレプリコンを含む、COVID-19に対するワクチンもまた提供される。
COVID-19に対して対象にワクチン接種するための方法もまた提供される。この方法は、本明細書に記載の組成物及び/又はワクチンを対象に投与することを含む。
対象におけるSARS-CoV-2の感染症及び/又はこの複製を低減するための方法もまた提供される。この方法は、本明細書に記載の組成物又はワクチンを対象に投与することを含む。特定の実施形態では、組成物又はワクチンは1回目の投与及び2回目の投与からなるプライム・ブースト投与で投与され、1回目の投与は免疫応答を刺激し、2回目の投与は免疫応答を増加させる。プライム・ブースト投与は例えば、同種プライム・ブーストであり得る。1回目の投与及び2回目の投与は、同一ベクター(例えば、RNAレプリコン)から発現される同一の抗原(例えば、SARS-CoV-2スパイクタンパク質)を含む。プライム・ブースト投与は例えば、異種プライム・ブーストであり得る。1回目の投与及び2回目の投与は、同一又は異なるベクター(例えば、RNAレプリコン、アデノウイルス、mRNA又はプラスミド)から発現される同一の抗原又はそのバリアント(例えば、SARS-CoV-2スパイクタンパク質)を含む。異種プライム・ブースト投与のいくつかの実施形態では、1回目の投与は、SARS-CoV-2スパイクタンパク質又はそのバリアントを含むアデノウイルスベクターを含み、2回目の投与は、SARS-CoV-2スパイクタンパク質又はそのバリアントを含むRNAレプリコンベクターを含む。異種プライム・ブースト投与のいくつかの実施形態では、1回目の投与は、SARS-CoV-2スパイクタンパク質又はそのバリアントを含むRNAレプリコンベクターを含み、2回目の投与は、SARS-CoV-2スパイクタンパク質又はそのバリアントを含むアデノウイルスベクターを含む。特定の態様では、同種プライム・ブースト投与又は異種プライム・ブースト投与に使用されるRNAレプリコンワクチンは、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号11、配列番号13のポリヌクレオチド配列又はこれらの断片を含む。
本明細書に記載の核酸及び/又はRNAレプリコンを含む単離された宿主細胞もまた提供される。
RNAレプリコンを作製する方法もまた提供される。この方法は、本明細書に記載の核酸をインビボ又はインビトロで転写することを含む。
上述の「発明の概要」及び以降の「発明を実施するための形態」は、添付の図面と併せて読むことでより良好に理解されるであろう。本発明は、図面に示される正確な実施形態に限定されない点が理解される必要がある。
SARS CoV-2 Sタンパク質の融合ドメインの、保存要素の概略図である。ヘッドドメインは、N末端(NTD)ドメイン、受容体結合ドメイン(RBD)並びにドメインSD1及びSD2を含有する。融合ドメインは、融合ペプチド(FP)、リフォールディング領域1(RR1)、リフォールディング領域2(RR2)、膜貫通領域(TM)及び細胞質側末端を含有する。S1とS2との間の切断部位、及びS2’切断部位は矢印で示されている。
細胞に基づくELISA発光強度の図である。データは平均±SEMとして表されている。
RNAレプリコンの概略図である。
SMARRT-1159によりコード化されたCoV2スパイク抗原の概略図である。
RNAレプリコンコンストラクトの同種プライム・ブースト投与後に誘発されたスパイクタンパク質特異性抗体のELISAアッセイ結果の図である(SMARRT-1159及びSMARRT-1158)。図5Aは、プライム・ブースト投与の概略図である。図5Bは、14日目のスパイクタンパク質特異性抗体のELISAアッセイ結果のグラフである。図5Cは、27日目のスパイクタンパク質特異性抗体のELISAアッセイ結果のグラフである。図5Dは、42日目のスパイクタンパク質特異性抗体のELISAアッセイ結果のグラフである。図5Eは、54日目のスパイクタンパク質特異性抗体のELISAアッセイ結果のグラフである。
RNAレプリコンコンストラクトの同種プライム・ブースト投与後に誘発されたスパイクタンパク質特異性抗体のELISAアッセイ結果の図である(SMARRT-1159及びSMARRT-1158)。図5Aは、プライム・ブースト投与の概略図である。図5Bは、14日目のスパイクタンパク質特異性抗体のELISAアッセイ結果のグラフである。図5Cは、27日目のスパイクタンパク質特異性抗体のELISAアッセイ結果のグラフである。図5Dは、42日目のスパイクタンパク質特異性抗体のELISAアッセイ結果のグラフである。図5Eは、54日目のスパイクタンパク質特異性抗体のELISAアッセイ結果のグラフである。
RNAレプリコンコンストラクトの同種プライム・ブースト投与後に誘発されたスパイクタンパク質特異性抗体のELISAアッセイ結果の図である(SMARRT-1159及びSMARRT-1158)。図5Aは、プライム・ブースト投与の概略図である。図5Bは、14日目のスパイクタンパク質特異性抗体のELISAアッセイ結果のグラフである。図5Cは、27日目のスパイクタンパク質特異性抗体のELISAアッセイ結果のグラフである。図5Dは、42日目のスパイクタンパク質特異性抗体のELISAアッセイ結果のグラフである。図5Eは、54日目のスパイクタンパク質特異性抗体のELISAアッセイ結果のグラフである。
RNAレプリコンコンストラクトの同種プライム・ブースト投与後に誘発されたスパイクタンパク質特異性抗体のELISAアッセイ結果の図である(SMARRT-1159及びSMARRT-1158)。図5Aは、プライム・ブースト投与の概略図である。図5Bは、14日目のスパイクタンパク質特異性抗体のELISAアッセイ結果のグラフである。図5Cは、27日目のスパイクタンパク質特異性抗体のELISAアッセイ結果のグラフである。図5Dは、42日目のスパイクタンパク質特異性抗体のELISAアッセイ結果のグラフである。図5Eは、54日目のスパイクタンパク質特異性抗体のELISAアッセイ結果のグラフである。
RNAレプリコンコンストラクトの同種プライム・ブースト投与後に誘発されたスパイクタンパク質特異性抗体のELISAアッセイ結果の図である(SMARRT-1159及びSMARRT-1158)。図5Aは、プライム・ブースト投与の概略図である。図5Bは、14日目のスパイクタンパク質特異性抗体のELISAアッセイ結果のグラフである。図5Cは、27日目のスパイクタンパク質特異性抗体のELISAアッセイ結果のグラフである。図5Dは、42日目のスパイクタンパク質特異性抗体のELISAアッセイ結果のグラフである。図5Eは、54日目のスパイクタンパク質特異性抗体のELISAアッセイ結果のグラフである。
RNA複製コンストラクトの同種プライム・ブースト投与の27日目に誘発された中和抗体産生の結果のグラフである(SMARRT-1159及びSMARRT-1158)。
免疫化動物の脾臓でT細胞を分泌するスパイクタンパク質の特異的IFNγのELISpot結果の図である。図7Aは、14日目に脾臓でT細胞を分泌するスパイクタンパク質の特異的IFN γを測定するアッセイ結果のグラフである。図7Bは、54日目に脾臓でT細胞を分泌するスパイクタンパク質の特異的IFN γを測定するアッセイ結果のグラフである。
免疫化動物の脾臓でT細胞を分泌するスパイクタンパク質の特異的IFNγのELISpot結果の図である。図7Aは、14日目に脾臓でT細胞を分泌するスパイクタンパク質の特異的IFN γを測定するアッセイ結果のグラフである。図7Bは、54日目に脾臓でT細胞を分泌するスパイクタンパク質の特異的IFN γを測定するアッセイ結果のグラフである。
アデノウイルスコンストラクト及びRNAレプリコンコンストラクトの異種プライム・ブースト投与後に誘発されたスパイクタンパク質特異性抗体のELISAアッセイ結果である(Ad26NCOV030及びSMARRT-1159)。図8Aは、プライム・ブースト投与の概略図である。図8Bは、14日目のスパイクタンパク質特異性抗体のELISAアッセイ結果のグラフである。図8Cは、27日目のスパイクタンパク質特異性抗体のELISAアッセイ結果のグラフである。図8Dは、42日目のスパイクタンパク質特異的IgG力価のELISAアッセイ結果のグラフである。図8Eは、54日目にスパイクタンパク質特異的IgG力価のELISAアッセイ結果のグラフである。
アデノウイルスコンストラクト及びRNAレプリコンコンストラクトの異種プライム・ブースト投与後に誘発されたスパイクタンパク質特異性抗体のELISAアッセイ結果である(Ad26NCOV030及びSMARRT-1159)。図8Aは、プライム・ブースト投与の概略図である。図8Bは、14日目のスパイクタンパク質特異性抗体のELISAアッセイ結果のグラフである。図8Cは、27日目のスパイクタンパク質特異性抗体のELISAアッセイ結果のグラフである。図8Dは、42日目のスパイクタンパク質特異的IgG力価のELISAアッセイ結果のグラフである。図8Eは、54日目にスパイクタンパク質特異的IgG力価のELISAアッセイ結果のグラフである。
アデノウイルスコンストラクト及びRNAレプリコンコンストラクトの異種プライム・ブースト投与後に誘発されたスパイクタンパク質特異性抗体のELISAアッセイ結果である(Ad26NCOV030及びSMARRT-1159)。図8Aは、プライム・ブースト投与の概略図である。図8Bは、14日目のスパイクタンパク質特異性抗体のELISAアッセイ結果のグラフである。図8Cは、27日目のスパイクタンパク質特異性抗体のELISAアッセイ結果のグラフである。図8Dは、42日目のスパイクタンパク質特異的IgG力価のELISAアッセイ結果のグラフである。図8Eは、54日目にスパイクタンパク質特異的IgG力価のELISAアッセイ結果のグラフである。
アデノウイルスコンストラクト及びRNAレプリコンコンストラクトの異種プライム・ブースト投与後に誘発されたスパイクタンパク質特異性抗体のELISAアッセイ結果である(Ad26NCOV030及びSMARRT-1159)。図8Aは、プライム・ブースト投与の概略図である。図8Bは、14日目のスパイクタンパク質特異性抗体のELISAアッセイ結果のグラフである。図8Cは、27日目のスパイクタンパク質特異性抗体のELISAアッセイ結果のグラフである。図8Dは、42日目のスパイクタンパク質特異的IgG力価のELISAアッセイ結果のグラフである。図8Eは、54日目にスパイクタンパク質特異的IgG力価のELISAアッセイ結果のグラフである。
アデノウイルスコンストラクト及びRNAレプリコンコンストラクトの異種プライム・ブースト投与後に誘発されたスパイクタンパク質特異性抗体のELISAアッセイ結果である(Ad26NCOV030及びSMARRT-1159)。図8Aは、プライム・ブースト投与の概略図である。図8Bは、14日目のスパイクタンパク質特異性抗体のELISAアッセイ結果のグラフである。図8Cは、27日目のスパイクタンパク質特異性抗体のELISAアッセイ結果のグラフである。図8Dは、42日目のスパイクタンパク質特異的IgG力価のELISAアッセイ結果のグラフである。図8Eは、54日目にスパイクタンパク質特異的IgG力価のELISAアッセイ結果のグラフである。
血清中のIgG1(図9A)及びIgG2(図9B)アイソタイプレベルのELISAアッセイ結果の図である。
血清中のIgG1(図9A)及びIgG2(図9B)アイソタイプレベルのELISAアッセイ結果の図である。
異種プライム・ブースト投与の56日目に誘発された中和抗体産生結果のグラフである。
免疫化動物の脾臓でT細胞を分泌するスパイクタンパク質の特異的IFNγのELISpot結果の図である。図11Aは、脾臓でT細胞を分泌するスパイクタンパク質の特異的IFN γを測定する、ペプチドプール1のアッセイ結果のグラフである。図11Bは、脾臓でT細胞を分泌するスパイクタンパク質の特異的IFNγを測定する、ペプチドプール2のアッセイ結果のグラフである。
免疫化動物の脾臓でT細胞を分泌するスパイクタンパク質の特異的IFNγのELISpot結果の図である。図11Aは、脾臓でT細胞を分泌するスパイクタンパク質の特異的IFN γを測定する、ペプチドプール1のアッセイ結果のグラフである。図11Bは、脾臓でT細胞を分泌するスパイクタンパク質の特異的IFNγを測定する、ペプチドプール2のアッセイ結果のグラフである。
上で説明した通り、SARS-CoV-2及び他のコロナウイルスのスパイクタンパク質(S)は、感染症に必要とされる宿主細胞膜とウイルス膜との融合に関与している。SARS-CoV-2 S RNAは1273アミノ酸前駆体タンパク質に翻訳される。これは、N末端(例えば、配列番号1のアミノ酸残基1~13)に小胞体でシグナルペプチダーゼにより除去されるシグナルペプチド配列を含有する。Sタンパク質のプライミングは、コロナウイルス(SARS CoV-2を含む)のサブユニットにおけるS1サブユニットとS2サブユニットとの間(S1/S2)の境界での、及び既知の全てのコロナウイルスにおける融合ペプチド(S2’)上流の保存された部位での宿主のプロテアーゼによる切断に典型的には関与する。SARS-CoV-2については、フューリンはSARS-CoV-2 Sタンパク質の残基685と686との間のS1/S2で最初に切断し、続いてTMPRSS2は、SARS-CoV-2 Sタンパク質の残基815位と816位との間のS2’部位で、S2内にて切断する。提案される融合ペプチドであるS2’部位のC末端は、リフォールディング領域1のN末端に配置される(図1)。
SARS-CoV-2感染症に対するワクチンは、現在のところは未だ利用可能ではない。遺伝子ベース若しくはベクターベースのワクチン又は例えば精製されたSタンパク質に基づくサブユニットワクチンなど、いくつかのワクチンモダリティは可能である。クラスIタンパク質は準安定タンパク質であることから、融合タンパク質の融合前立体配座の安定性を増大させることで、タンパク質の発現レベルを増大させる。これは、ミスフォールドされるタンパク質が少なく、分泌経路を通り首尾良く輸送されるタンパク質が多いことが理由である。したがって、仮にSARS CoV-2 Sタンパク質といったクラスI融合タンパク質の融合前立体配座の安定性が増大すると、Sタンパク質の発現が更に高くなり、かつ免疫原の立体配座が可能性のある中性抗体及び保護抗体により認識される融合前立体配座と類似することからベクターベースのワクチンの免疫原特性が改善する。サブユニットベースのワクチンについては、融合前のS立体配座の安定化が更により重要である。ワクチンを首尾良く製造するために必要となる発現の高さの重要性に加えて、製造プロセス中及び経時的な保管中の融合前立体配座の維持はタンパク質ベースのワクチンにとって重要である。更には、可溶性のあるサブユニットベースのワクチンについては、SARS CoV-2 Sタンパク質は、可溶性のある分泌Sタンパク質(sS)を作製するために膜貫通(TM)領域及び細胞質領域の欠失で切断される必要がある。TM領域は膜固定を担い、安定性を増大させることから、可溶性のある固定されないSタンパク質は完全長タンパク質よりも非常に不安定であり、融合後の最終状態へと更により容易にリフォールディングする。高い発現レベル及び高い安定性を示す安定した融合前立体配座の可溶性があるSタンパク質を得るためには、融合前立体配座は安定化される必要がある。完全長(膜結合)SARS CoV-2 Sタンパク質もまた準安定であることから、融合前立体配座の安定性もまた完全長SARS CoV-2 Sタンパク質(すなわち、TMと細胞質領域を含む)にとって(例えばDNAワクチン、RNAワクチン、弱毒化生ワクチン又はベクターベースのワクチンアプローチのいずれかにとって)望ましい。
本明細書で使用される場合、核酸及び/又はアデノウイルスについての「組換え」という用語は、人間の手によって変性されていることを意味している。例えば、アデノベクターの場合には、中で能動的にクローニングされる末端を変性させ、かつ/又は異種遺伝子を含むが、これはすなわち、天然に存在する野生型アデノウイルスではないということを意味する。
本明細書のヌクレオチド配列は、当該技術分野における慣習として、5’から3’方向で提供されている。
コロナウイルスファミリーは、αコロナウイルス属、βコロナウイルス属、γコロナウイルス属及びΔコロナウイルス属を含有する。これらの属全ては、鳥類、ネコ、イヌ、ウシ、コウモリ及びヒトといった多種多様な動物に感染する可能性がある病原性ウイルスを含有する。これらのウイルスは、腸疾患及び呼吸器疾患を含む幅広い疾患を引き起こす。宿主の範囲は、ウイルスによる宿主細胞への進入を媒介するウイルススパイクタンパク質(Sタンパク質)によって主に決定される。ヒトに感染する可能性があるコロナウイルスは、αコロナウイルス属及びβコロナウイルス属の両方に見られる。ヒトの呼吸器疾患を引き起こす既知のコロナウイルスは、βコロナウイルス属の一員である。こうしたものとしては、SARS-CoV-1、SARS-CoV-2及びMERSが挙げられる。
本発明によるアミノ酸は、例えばD-アミノ酸(キラル中心を有するアミノ酸のD-鏡像異性体)といった20種の天然に存在するアミノ酸(若しくは「標準」アミノ酸)若しくはこれらのバリアント又は例えばノルロイシンといったタンパク質中に天然には存在しないいずれかのバリアントであり得る。標準アミノ酸は、それらの特性に基づき、いくつかの群に分割することができる。重要な因子としては、電荷、親水性又は疎水性、サイズ及び官能基である。これらの特性は、タンパク質構造及びタンパク質-タンパク質間の相互作用にとって重要である。他のシステイン残基への共有ジスルフィド結合(又はジスルフィド架橋)を形成することができるシステイン、ポリペプチド主鎖の変化を誘導するプロリン及び他のアミノ酸よりも可撓性が高いグリシンといったいくつかのアミノ酸は、特別な特性を有する。表1は、標準アミノ酸の略語及び特性を示す。
上記のように、SARS-CoV-2はヒトに重篤な呼吸器疾患を引き起こす可能性がある。ウイルススパイク(S)タンパク質は、SARS-CoV-2により利用される進入受容体であるアンジオテンシン変換酵素2(ACE2)に結合する。ACE2は、ACEと相同性があるI型膜貫通金属エキソペプチダーゼであるが、これはレニン・アンジオテンシン系(Renin-Angiotensin system、RAS)において重要な役割を有し、高血圧処置の標的となることで以前から知られている酵素である。これはとりわけ、血管内皮細胞、尿細管上皮細胞及び精巣内のライディッヒ細胞で発現されている。PCR分析により、肺、腎臓及び胃腸管、SARS-CoV-2を宿していると示されている組織でもACE-2を発現することが明らかになった。コロナウイルスのスパイク(S)タンパク質は主要な表面タンパク質であり、かつ感染した患者では中和抗体の標的であり(Lester et al.,Access Microbiology 2019;1)、したがってワクチン設計にとって可能性がある保護抗原と見なされている。本発明につながる研究では、SARS-CoV-2ウイルスのSタンパク質に基づくいくつかの抗原コンストラクトを設計した。驚くべきことに、本発明の核酸(すなわち配列番号13)は発現時の免疫原性に優れており、この核酸を含有する発現コンストラクトは高い収率で製造され得るということが見出された。
したがって本発明は、組換え融合前SARS CoV-2 Sタンパク質又はその断片又はそのバリアントをコードするRNAレプリコンを提供し、このSARS CoV-2タンパク質は、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号12、配列番号14又はそれらの断片から選択されるアミノ酸配列を含む。
特定の態様では、RNAレプリコンは、5’から3’末端に向かって、
(1)RNAウイルスの非構造タンパク質による媒介増幅に必要な5’非翻訳領域(5’-UTR)、
(2)RNAウイルスの非構造タンパク質のうち少なくとも1つ、好ましくは全てをコードするポリヌクレオチド配列、
(3)RNAウイルスのサブゲノムプロモータ、
(4)組換え融合前SARS CoV-2 Sタンパク質又はその断片又はそのバリアントをコードするポリヌクレオチド配列、及び
(5)RNAウイルスの非構造タンパク質による媒介増幅に必要な3’非翻訳領域(3’-UTR)を順に含む。
(1)RNAウイルスの非構造タンパク質による媒介増幅に必要な5’非翻訳領域(5’-UTR)、
(2)RNAウイルスの非構造タンパク質のうち少なくとも1つ、好ましくは全てをコードするポリヌクレオチド配列、
(3)RNAウイルスのサブゲノムプロモータ、
(4)組換え融合前SARS CoV-2 Sタンパク質又はその断片又はそのバリアントをコードするポリヌクレオチド配列、及び
(5)RNAウイルスの非構造タンパク質による媒介増幅に必要な3’非翻訳領域(3’-UTR)を順に含む。
特定の態様では、RNAレプリコンは、5’から3’末端に向かって、
(1)αウイルスの5’非翻訳領域(5’-UTR)、
(2)αウイルスの非構造遺伝子nsp1の5’複製配列、
(3)ウイルス種の下流ループ(DLP)モチーフ、
(4)自己プロテアーゼペプチドをコードするポリヌクレオチド配列、
(5)αウイルスの非構造タンパク質nsp1、nsp2、nsp3及びnsp4をコードするポリヌクレオチド配列、
(6)αウイルスのサブゲノムプロモータ、
(7)組換え融合前SARS CoV-2 Sタンパク質又はその断片又はそのバリアントをコードするポリヌクレオチド配列、
(8)αウイルス3’非翻訳領域(3’UTR)、並びに
(9)任意選択で、ポリアデノシン配列を順に含む。
(1)αウイルスの5’非翻訳領域(5’-UTR)、
(2)αウイルスの非構造遺伝子nsp1の5’複製配列、
(3)ウイルス種の下流ループ(DLP)モチーフ、
(4)自己プロテアーゼペプチドをコードするポリヌクレオチド配列、
(5)αウイルスの非構造タンパク質nsp1、nsp2、nsp3及びnsp4をコードするポリヌクレオチド配列、
(6)αウイルスのサブゲノムプロモータ、
(7)組換え融合前SARS CoV-2 Sタンパク質又はその断片又はそのバリアントをコードするポリヌクレオチド配列、
(8)αウイルス3’非翻訳領域(3’UTR)、並びに
(9)任意選択で、ポリアデノシン配列を順に含む。
特定の態様では、RNAレプリコンであって、5’から3’末端に向かって、
(1)配列番号18のポリヌクレオチド配列を有する5’-UTR、
(2)配列番号19のポリヌクレオチド配列を有する5’複製配列、
(3)配列番号20のポリヌクレオチド配列を含むDLPモチーフ、
(4)配列番号22のP2A配列をコードするポリヌクレオチド配列、
(5)配列番号24、配列番号25、配列番号26及び配列番号27の核酸配列をそれぞれ有するαウイルスの非構造タンパク質nsp1、nsp2、nsp3及びnsp4をコードするポリヌクレオチド配列、
(6)配列番号16のポリヌクレオチド配列を有するサブゲノムプロモータ、
(7)配列番号1~4、12及び14又はそれらの断片又はそれらのバリアントからなる群から選択されたアミノ酸配列を有する融合前SARS CoV-2 Sタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列、並びに
(8)配列番号28のポリヌクレオチド配列を有する3’UTRを順に含む、RNAレプリコンを本明細書で提供する。
(1)配列番号18のポリヌクレオチド配列を有する5’-UTR、
(2)配列番号19のポリヌクレオチド配列を有する5’複製配列、
(3)配列番号20のポリヌクレオチド配列を含むDLPモチーフ、
(4)配列番号22のP2A配列をコードするポリヌクレオチド配列、
(5)配列番号24、配列番号25、配列番号26及び配列番号27の核酸配列をそれぞれ有するαウイルスの非構造タンパク質nsp1、nsp2、nsp3及びnsp4をコードするポリヌクレオチド配列、
(6)配列番号16のポリヌクレオチド配列を有するサブゲノムプロモータ、
(7)配列番号1~4、12及び14又はそれらの断片又はそれらのバリアントからなる群から選択されたアミノ酸配列を有する融合前SARS CoV-2 Sタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列、並びに
(8)配列番号28のポリヌクレオチド配列を有する3’UTRを順に含む、RNAレプリコンを本明細書で提供する。
特定の態様では、(a)P2A配列をコードするポリヌクレオチド配列は配列番号21を含み、RNAレプリコンはポリアデノシン配列を更に含み、ポリアデノシン配列はレプリコンの3’末端に配列番号29を有することが好ましい。
特定の態様では、RNAレプリコンは、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号11、配列番号13又はそれらの断片又はそれらのバリアントのポリヌクレオチド配列を含む。
配列番号30又は配列番号31のポリヌクレオチド配列を含むRNAレプリコンもまた提供される。
本明細書に記載のRNAレプリコンをコードするDNA配列を含む核酸もまた提供される。核酸は、DNA配列の5’末端に動作可能に連結されたT7プロモータを更に含むことが好ましく、T7プロモータは配列番号17のヌクレオチド配列を含むことがより好ましい。
本明細書で使用される場合、「断片」という用語は、アミノ末端及び/若しくはカルボキシル末端並びに/又は内部欠失を有するものの、残りのアミノ酸配列が例えばSARS-CoV-2 Sタンパク質の完全長配列といったSARS-CoV-2 Sタンパク質の配列の対応する位置と同一であるタンパク質若しくは(ポリ)ペプチドを指す。免疫応答を誘導し、一般にはワクチン接種を目的とするため、タンパク質は完全長である必要も、野生型の機能を全て有している必要もなく、タンパク質の断片が同様に有用であるということが理解されよう。
本発明による断片は免疫学的に活性な断片であり、SARS-CoV-2 Sタンパク質のうち少なくとも15アミノ酸又は少なくとも30アミノ酸を典型的には含む。特定の実施形態では、断片はSARS-CoV-2 Sタンパク質のうち少なくとも50、75、100、150、200、250、300、350、400、450、500又は550アミノ酸を含む。
本明細書で使用される場合、「バリアント」という用語は、野生型SARS CoV-2 Sタンパク質配列(配列番号1)に由来する少なくとも1つのアミノ酸の置換又は欠失を含むSARS CoV-2 Sタンパク質を指す。バリアントは、天然に存在するもの又は天然には存在しないものであり得る。バリアントは、野生型SARS CoV-2 Sタンパク質配列(配列番号1)と比較すると少なくとも1、少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4、少なくとも5又は少なくとも10の置換又は欠失を含み得る。特定の実施形態では、バリアントは例えば、野生型SARS CoV-2 Sタンパク質配列(配列番号1)と95%を超える同一性を有し得る。野生型SARS CoV-2 Sタンパク質バリアントの例としては、2021年5月10日にアクセスしたcdc.gov/coronavirus/2019-ncov/cases-updates/variant-surveillance/variant-info.htmlに記載されているB.1.1.7、B.1.351、P.1、B.1.427及びB.1.429、B.1.526、B.1.526.1、B.1.525、B.1.617、B.1.617.1、B.1.617.2、B.1.617.3並びにP.2バリアントが挙げられ得るが、これらに限定されない。
当業者はまた、例えばごくありふれた分子生物学手順を使用し、例えばアミノ酸の置換、欠失、付加などによりタンパク質を変更可能であることを理解するであろう。一般に、保存的アミノ酸置換はポリペプチドの機能又は免疫原性を損なうことなく適用され得る。これは、当業者に周知のごくありふれた手順に従って容易に確認することができる。
非常に多くの異なる核酸が、遺伝子コードの縮重結果として同一のポリペプチド又はタンパク質をコードすることができるということが当業者によって理解される。当業者はごくありふれた技術を使用し、核酸によってコード化されたアミノ酸配列に影響しないヌクレオチド置換を行い、ポリペプチドが発現されることになるいずれかの特定の宿主生物のコドン使用を反映し得ることも理解される。したがって別途記載のない限り、「アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列」は、互いの縮重型であるヌクレオチド配列及び同一のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列全てを含む。タンパク質及びRNAをコードするヌクレオチド配列はイントロンを含んでもよい。
核酸配列は、ごくありふれた分子生物学技術を使用してクローニングされ、又はDNA合成によって新規に生成され得るが、これはDNA合成及び/又は分子クローニングの分野で事業を有するサービス会社によるごくありふれた手順(例えば、GeneArt,GenScript,Invitrogen,Eurofins)を使用して実施され得る。
本発明はまた、上記のように核酸分子を含むベクターもまた提供する。特定の実施形態ではしたがって、本発明による核酸分子はベクターの一部である。こうしたベクターは、当業者に周知の方法によって容易に操作することができ、例えば、原核細胞及び/又は真核細胞にて複製可能にするために設計することができる。更には、多くのベクターは、真核細胞を形質転換するために使用することができ、こうした細胞のゲノムにその全体又は一部が導入され、結果としてゲノムの所望の核酸を含む安定した宿主細胞がもたらされる。使用されるベクターはDNAをクローニングする上で好適などのベクターであってもよく、目的の核酸の転写にこれを使用することができる。
ベクターは自己複製RNAレプリコンであることが好ましい。
本明細書で使用される場合、「自己増幅RNA分子」又は「RNAレプリコン」又は「レプリコンRNA」又は「saRNA」と互換的に使用される「自己複製RNA分子」は、許容細胞内でそれ自体の増幅又は自己複製を指示するために必要な全ての遺伝情報を含有するプラス鎖RNAウイルスのゲノムから遺伝子操作されたRNA分子を指す。自己複製RNA分子はmRNAと類似している。これは一本鎖であり、5’キャッピングされ、かつ3’-ポリアデニル化されており、かつ正の配向のものである。それ自体の複製を指示するため、RNA分子は1)RNA増幅プロセスを触媒するためのウイルス又は宿主細胞誘導タンパク質、核酸又はリボ核タンパク質と相互作用することができるポリメラーゼ、レプリカーゼ又は他のタンパク質をコード化し、2)サブゲノムのレプリコンコード化RNAの複製及び転写に必要とされるシス作用RNA配列を含有する。したがって、送達されたRNAは複数の娘RNAの産生につながる。これらの娘RNA及び同一線上のサブゲノム転写物は、それ自体に翻訳されて目的遺伝子のインサイチュ発現を提供することができ、又は翻訳される送達されたRNAと同一のセンスを有する更なる転写物を提供するために転写され、目的遺伝子のインサイチュ発現を提供することができる。この転写の配列の全体的な結果として、導入されたレプリコンRNAの数が大きく増幅されるため、目的のコード化遺伝子は、細胞の主要なポリペプチド産物になる。
特定の実施形態では、本出願のRNAレプリコンは、5’から3’末端に向かって、(1)RNAウイルスの非構造タンパク質による媒介増幅に必要な5’非翻訳領域(5’-UTR)(2)RNAウイルスの非構造タンパク質の少なくとも1つ、好ましくは全てをコードするポリヌクレオチド配列、(3)RNAウイルスのサブゲノムプロモータ、(4)組換え融合前SARS CoV-2 Sタンパク質又はその断片又はバリアントをコードするポリヌクレオチド配列、及び(5)RNAウイルスの非構造タンパク質による媒介増幅に必要な3’非翻訳領域(3’-UTR)を順に含む。
特定の実施形態では、自己複製RNA分子は、RNA依存性RNAポリメラーゼ機能、ヘリカーゼ、キャッピング及びポリアデニル化活性を含む自己増幅(レプリカーゼポリタンパク質)の酵素複合体をコードする。サブゲノムプロモータの制御下にあるレプリカーゼ下流のウイルス構造遺伝子は、本明細書に記載の融合前SARS CoV-2 Sタンパク質又はその断片又はそのバリアントによって置き換えることができる。トランスフェクション時にレプリカーゼは直ちに翻訳され、ゲノムRNAの5’末端及び3’末端と相互作用し、相補的ゲノムRNAコピーを合成する。これらは、新規のプラス鎖キャップ化かつポリアデニル化ゲノムコピー、及びサブゲノム転写物の合成のためのテンプレートとして機能する。増幅は最終的に、細胞当たり最大2×105個のコピーという非常に多いRNAコピー数をもたらす。したがって、従来のmRNAと比較してはるかに少量のsaRNAは、有効な遺伝子導入及び保護ワクチン接種を達成する上で十分である(Beissert et al.,Hum Gene Ther.2017,28(12):1138-1146)。
「サブゲノムRNA」とは、そこから誘導されたゲノムRNAよりも小さい長さ又はサイズのRNA分子を指す。ウイルスサブゲノムRNAは、その配列がゲノムRNA又はその補体内に存在する、内部プロモータから転写され得る。サブゲノムRNAの転写は、宿主細胞コード化タンパク質、リボ核タンパク質(複数可)、又はこれらの組み合わせに会合する、ウイルスコード化ポリメラーゼ(複数可)によって媒介され得る。多数のRNAウイルスは、それらの3’近位遺伝子の発現のためにサブゲノムmRNA(sgRNA)を生成する。
本開示のいくつかの実施形態では、本明細書に記載の融合前SARS CoV-2 Sタンパク質又はその断片は、サブゲノムプロモータの制御下で発現される。特定の実施形態では、天然サブゲノムプロモータの代わりに、サブゲノムRNAは、脳性心筋炎ウイルス(encephalomyocarditis virus、EMCV)、ウシウイルス性下痢症ウイルス(Bovine Viral Diarrhea Virus、BVDV)、ポリオウイルス、口蹄疫ウイルス(Foot-and-mouth disease virus、FMD)、エンテロウイルス71、又はC型肝炎ウイルスに由来する配列内リボソーム進入部位(internal ribosome entry site、IRES)の制御下に置かれ得る。サブゲノムプロモータは、24ヌクレオチド(シンドビスウイルス)から100ヌクレオチド超(ビート壊疽性葉脈黄化ウイルス)の範囲であり、通常、転写開始の上流に見られる。
いくつかの実施形態では、RNAレプリコンは、少なくとも1つ、少なくとも2つ、少なくとも3つ又は少なくとも4つの非構造ウイルスタンパク質(例えば、nsP1、nsP2、nsP3、nsP4)のコード配列を含む。αウイルスゲノムは、非構造タンパク質nsP1、nsP2、nsP3及びnsP4をコードするが、これはP1234(又はnsP1-4若しくはnsP1234)と命名される場合がある単一のポリタンパク質前駆体として産生され、タンパク質分解処理によって成熟タンパク質に切断される。nsP1は約60kDaの大きさで、メチルトランスフェラーゼ活性を持つことがあり、ウイルスのキャッピング反応に関与し得る。nsP2は約90kDaの大きさで、ヘリカーゼ及びプロテアーゼ活性を有し得、nsP3は約60kDaで、マクロドメイン、中心(又はαウイルス固有)ドメイン、及び超可変ドメイン(hypervariable domain、HVD)の3つのドメインを含有する。nsP4は約70kDaの大きさで、コアRNA依存性RNAポリメラーゼ(RNA-dependent RNA polymerase、RdRp)触媒ドメインを含有する。感染後、αウイルスゲノムRNAを翻訳して、P1234ポリタンパク質を得る。これは、個々のタンパク質に切断される。本明細書に開示されている核酸又はポリペプチド配列では、例えば開示もされているnsP1、nsP2、nsP3、nsP4は、元の配列に基づく、又は元の配列に由来すると考えられる配列である。
いくつかの実施形態では、RNAレプリコンは少なくとも1つの非構造ウイルスタンパク質の一部についてのコード配列を含む。例えば、RNAレプリコンは、少なくとも1つの非構造ウイルスタンパク質についてのコード配列の約10%、約20%、約30%、約40%、約50%、約60%、約70%、約80%、約90%、約95%、約100%又はこれらの値のうちいずれか2つの間の範囲を含むことができる。いくつかの実施形態では、RNAレプリコンは、少なくとも1つの非構造ウイルスタンパク質のうち実質的な部分のコード配列を含むことができる。本明細書で使用する場合、非構造ウイルスタンパク質をコードする核酸配列の「実質的な部分」とは、当業者による配列の手動評価、又はBLASTなどのアルゴリズムを用いたコンピュータによる自動配列比較及び同定のいずれかによって、そのタンパク質の推定上の識別を可能にするのに十分な非構造ウイルスタンパク質をコードする核酸配列を含む(例えば、「Basic Local Alignment Search Tool」;Altschul S F et al.,J.Mol.Biol.215:403-410,1993を参照)。いくつかの実施形態では、RNAレプリコンは、少なくとも1つの非構造タンパク質のコード配列全体を含むことができる。いくつかの実施形態では、RNAレプリコンは天然のウイルス非構造タンパク質の実質的に全てのコード配列を含む。特定の実施形態では、1つ以上の非構造ウイルスタンパク質は、同じウイルスに由来する。他の実施形態では、1つ以上の非構造タンパク質は、異なるウイルスに由来する。
RNAレプリコンは、例えばαウイルス又はフラビウイルスといった好適なプラス鎖RNAウイルスのいずれかに由来し得る。RNAレプリコンはαウイルスに由来することが好ましい。「αウイルス」という用語は、トガウイルス科のエンベロープ一本鎖プラスセンスRNAウイルスを記載している。αウイルス属はおよそ30個のメンバーを含有するが、これらは他の動物と同様にヒトを感染させることができる。αウイルス粒子は、70nmの直径を典型的には有し、球形又はわずかに多形になる傾向があり、40nmの等尺性ヌクレオカプシドを有する。αウイルスの総ゲノム長は11,000~12,000ヌクレオチドの範囲であり、5’キャップ及び3’ポリA尾部を有する。ゲノムには、非構造的(ns)及び構造的な2つのオープンリーディングフレーム(open reading frame、ORF)が存在する。nsORFは、ウイルスRNAの転写及び複製に必要となるタンパク質(nsP1~nsP4)をコードする。構造ORFは、コアヌクレオカプシドタンパク質C、並びにヘテロ二量体として会合するエンベロープタンパク質P62及びElの3つの構造タンパク質をコードする。ウイルス膜アンカード表面糖タンパク質は、受容体認識を担い、膜融合によって標的細胞内に入る。4つのnsタンパク質遺伝子は、ゲノムの5’2/3の遺伝子によってコードされ、3つの構造タンパク質は、ゲノムの3’1/3で同一線上のサブゲノムmRNAから翻訳される。
いくつかの実施形態では、本発明に有用な自己複製RNAはαウイルスウイルス種に由来するRNAレプリコンである。いくつかの実施形態では、αウイルスRNAレプリコンは、VEEV/EEEV群又はSF群又はSIN群に属するαウイルスのものである。SF群αウイルスの非限定的な例としては、セムリキ森林ウイルス、オニョンニョンウイルス、ロスリバーウイルス、ミドルバーグウイルス、チクングニアウイルス、バーマ森林ウイルス、ゲタウイルス、マヤロウイルス、サギヤマウイルス、ベバルウイルス、及びウナウイルスが挙げられる。SIN群αウイルスの非限定的な例としては、シンドビスウイルス、ガードウッドS.A.ウイルス、南アフリカアルボウイルスNo.86、オケルボウイルス、アウラウイルス、ババンキウイルス、ワタロアウイルス、及びキジラガウイルスが挙げられる。VEEV/EEEV群αウイルスの非限定的な例としては、東部ウマ脳炎ウイルス(EEEV)、ベネズエラウマ脳炎ウイルス(VEEV)、エバーグレーズウイルス(EVEV)、ムカンボウイルス(MUCV)、ピクスナウイルス(PIXV)、ミドルバーグウイルス(MIDV)、チクングニアウイルス(CHIKV)、オニョンニョンウイルス(ONNV)、ロスリバーウイルス(RRV)、バーマ森林ウイルス(BF)、ゲタウイルス(GET)、サギヤマウイルス(SAGV)、ベバルウイルス(BEBV)、マヤロウイルス(MAYV)、及びウナウイルス(UNAV)が挙げられる。
αウイルス種の非限定的な例としては、東部ウマ脳炎ウイルス(EEEV)、ベネズエラウマ脳炎ウイルス(VEEV)、エバーグレーズウイルス(EVEV)、ムカンボウイルス(MUCV)、セムリキ森林ウイルス(SFV)、ピクスナウイルス(PIXV)、ミドルバーグウイルス(MIDV)、チクングニアウイルス(CHIKV)、オニョンニョンウイルス(ONNV)、ロスリバーウイルス(RRV)、バーマ森林ウイルス(BF)、ゲタウイルス(GET)、サギヤマウイルス(SAGV)、ベバルウイルス(BEBV)、マヤロウイルス(MAYV)、ウナウイルス(UNAV)、シンドビスウイルス(SINV)、アウラウイルス(AURAV)、ワタロアウイルス(WHAV)、ババンキウイルス(BABV)、キジラガフウイルス(KYZV)、西部ウマ脳炎ウイルス(WEEV)、ハイランドJウイルス(HJV)、フォートモーガンウイルス(FMV)、ヌドゥムウイルス(NDUV)及びバギークリークウイルスからなる群から選択されるウイルス種が挙げられる。病原性及び非病原性αウイルス株は、両方とも好適である。いくつかの実施形態では、αウイルスRNAレプリコンは、シンドビスウイルス(SIN)、セムリキ森林ウイルス(SFV)、ロスリバーウイルス(RRV)、ベネズエラウマ脳炎ウイルス(VEEV)、又は東部ウマ脳炎ウイルス(EEEV)のものである。いくつかの実施形態では、αウイルスRNAレプリコンは、ベネズエラウマ脳炎ウイルス(VEEV)のものである。
特定の実施形態では、自己複製RNA分子は、1つ以上の非構造タンパク質nsp1~4をコードするポリヌクレオチド、例えば26Sサブゲノムプロモータなどのサブゲノムプロモータ及び本明細書に記載の融合前SARS CoV-2 Sタンパク質又はその断片又はそのバリアントをコードする目的遺伝子を含む。
自己複製RNA分子は、5’キャップ(例えば、7-メチルグアノシン)を有することができる。このキャップはRNAのインビボ翻訳を増強することができる。
本発明に有用である自己複製RNA分子の5’ヌクレオチドは5’三リン酸基を有することができる。キャッピングされたRNAでは、5’から5’への架橋を介して7-メチルグアノシンにこれを結合することができる。5’三リン酸はRIG-I結合を増強することができる。
自己複製RNA分子は3’ポリA尾部を有することができる。これは、3’末端近くにポリAポリメラーゼ認識配列(例えば、AAUAAA)も含むことができる。
本開示の実施形態のいずれかでは、RNAレプリコンは、構造的ウイルスタンパク質(例えば、ヌクレオカプシドタンパク質C及びエンベロープP62、6K、及びE1)の少なくとも1つ(又は全て)のコード配列を欠損(又は含有しない)することができる。これらの実施形態では、1つ以上の構造的遺伝子をコードする配列は、例えば本明細書に記載の融合前SARS CoV-2 Sタンパク質又はその断片のコード配列など、1つ以上の異種配列と置換することができる。
特定の実施形態では、本出願の自己複製RNAベクターは、自然免疫系による翻訳阻害への抵抗性を与える、又はそれ以外の場合ではGOI(例えば、本明細書に記載の融合前SARS CoV-2 Sタンパク質又はその断片又はそのバリアント)の発現を増大させる、1つ以上の特徴を含む。
特定の実施形態では、RNA配列は翻訳効率を改善するため、コドン最適化されることができる。RNA分子は、安定性及び/又は翻訳を増強するため、例えば少なくとも30アデノシン残基のポリA尾部を加えること、及び/又は例えば7-メチルグアノシンキャップといった修飾リボヌクレオチドで5末端をキャッピングすることなどによって、本開示を考慮した当該技術分野で既知の方法のいずれかで修飾されることができる。これらは、RNA合成中に導入されることができ、又はRNA転写後に酵素的に遺伝子操作されることができる。
特定の実施形態では、本出願のRNAレプリコンは、5’から3’末端に向かって、(1)αウイルス5’非翻訳領域(5’-UTR)、(2)αウイルスの非構造遺伝子nsp1の5’複製配列、(3)ウイルス種の下流ループ(DLP)モチーフ、(4)自己プロテアーゼペプチドをコードするポリヌクレオチド配列、(5)αウイルスの非構造タンパク質nsp1、nsp2、nsp3及びnsp4をコードするポリヌクレオチド配列、(6)αウイルスのサブゲノムプロモータ、(7)組換え融合前SARS CoV-2 Sタンパク質又はその断片又はそのバリアントをコードするポリヌクレオチド配列、(8)αウイルスの3’非翻訳領域(3’UTR)、並びに(9)任意選択で、ポリアデノシン配列を順に含む。
特定の実施形態では、本出願の自己複製RNAベクターはウイルス種の下流ループ(DLP)モチーフを含む。本明細書で使用される場合、「下流ループ」又は「DLPモチーフ」は、少なくとも1つのRNAステムループを含むポリヌクレオチド配列を指すが、これはオープンリーディングフレーム(ORF)の開始コドンの下流に配置された場合、DLPモチーフなしの他の同一のコンストラクトと比較するとORFの翻訳を増大させる。一例として、αウイルス属のメンバーはウイルスの26S転写物内に存在する卓越したRNA構造によって抗ウイルス性RNA活性化プロテインキナーゼ(RNA-activated protein kinase、PKR)の活性化に抵抗することができ、これによって、これらのmRNAのeIF2非依存性翻訳を開始することが可能となる。下流ループ(DLP)と呼ばれる構造は、SINV 26SのmRNA中のAUGの下流に配置される。DLPはまた、セムリキ森林ウイルス(SFV)でも検出される。同様のDLP構造は、新世界(例えば、MAYV、UNAV、EEEV(NA)、EEEV(SA)、AURAV)及び旧世界(SV、SFV、BEBV、RRV、SAG、GETV、MIDV、CHIKV及びONNV)メンバーを含む、αウイルス属の少なくとも14個の他のメンバーに存在することが報告されている。これらのαウイルス26SのmRNAの予測構造は、SHAPE(選択的2’-ヒドロキシルアシル化及びプライマー伸長)データに基づいて構築された(Toribio et al.、Nucleic Acids Res.May19;44(9):4368-80,2016)、その内容を参照により本明細書に組み込む)。安定的ステムループ構造は、CHIKV及びONNVを除く、全ての場合で検出されたが、MAYV及びEEEVは、より低い安定性のDLPを示した(上述のToribio et al.,2016)。シンドビスウイルスの場合、DLPモチーフは、シンドビスサブゲノムRNAの最初の約150ntに見られる。ヘアピンは、シンドビスカプシドAUG開始コドンの下流に配置されている(AUGは、シンドビスサブゲノムRNAのnt50に照合される)。配列比較及び構造RNA分析に関する以前の研究は、SINVのDLPの進化的保存を明らかにし、αウイルス属の多数のメンバーにおける同等のDLP構造の存在を予測した(例えば、Ventoso,J.Virol.9484-9494,Vol.86,September2012を参照)。DLPモチーフを含む自己複製RNAベクターの例は、米国特許出願公開第2018/0171340号、及び国際公開第2018/106615号(その内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる)に記載されている。いくつかの実施形態では、本出願のレプリコンRNAは、配列番号20に記載の配列と少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%又は100%の配列同一性を示すDLPモチーフを含む。
一実施形態では、自己複製RNA分子はまた、DLPモチーフの下流及び非構造タンパク質(例えば、nsp1~4のうち1つ以上)又は目的遺伝子(例えば、本明細書に記載の融合前SARS CoV-2 Sタンパク質若しくはその断片)のコード配列の上流に操作可能に連結された自己プロテアーゼペプチドのコード配列を含有する。自己プロテアーゼペプチドの例としては、ブタテシオウイルス-1 2A(P2A)、口蹄疫ウイルス(FMDV)2A(F2A)、ウマ鼻炎Aウイルス(ERAV)2A(E2A)、Thosea asignaウイルス2A(T2A)、細胞質多角体病ウイルス2A(BmCPV2A)、軟化病ウイルス2A(BmIFV2A)及びこれらの組み合わせからなる群から選択されるペプチド配列が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、本出願のレプリコンRNAは、配列番号22のアミノ酸配列を有するP2Aのコード配列を含む。コード配列は、配列番号21に記載の配列と少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%又は100%の配列同一性を示すことが好ましい。
本発明のレプリコンのいずれも、5’非翻訳領域及び3’非翻訳領域(UTR)を含むこともできる。UTRは新世界の野生型αウイルスUTR配列又は旧世界の野生型αウイルスUTR配列又はこれらのいずれかに由来する配列であり得る。種々の実施形態では、5’UTRは約60nt又は50~70nt又は40~80ntといったいずれかの好適な長さのものであり得る。いくつかの実施形態では、5’UTRはまた、一次構造又は二次構造(例えば、1つ以上のステムループ)を保っており、αウイルスの複製又はレプリコンRNAの複製に関与することができる。いくつかの実施形態では、3’UTRは最大で数百のヌクレオチドであり得、例えば50~900又は100~900又は50~800又は100~700又は200nt~700ntであり得る。3’UTRはまた、例えばステップループといった二次構造を有することができ、この後、ポリアデニル化域(polyadenylate tract)又はポリA尾部が続き得る。本発明の実施形態のいずれかでは、5’非翻訳領域及び3’非翻訳領域は、レプリコンによりコード化された他の配列のうちいずれかに操作可能に連結することができる。UTRは、他のコード化配列の認識及び転写に必要とされる配列を提供し、かつこのための間隔をあけることで、異種タンパク質又はペプチドをコードするプロモータ及び/又は配列に操作可能に連結することができる。本開示を考慮した、当業者に既知の任意のポリアデニル化シグナルを使用することができる。例えばポリアデニル化シグナルは、SV40ポリアデニル化シグナル、LTRポリアデニル化シグナル、ウシ成長ホルモン(bovine growth hormone、bGH)ポリアデニル化シグナル、ヒト成長ホルモン(human growth hormone、hGH)ポリアデニル化シグナル又はヒトβ-グロビンポリアデニル化シグナルであり得る。
別の実施形態では、本出願の自己複製RNAレプリコンは改変5’非翻訳領域(5’-UTR)を含み、RNAレプリコンはウイルス構造タンパク質をコードする核酸配列のうち少なくとも一部を欠いていることが好ましい。例えば、改変5’-UTRは、1位、2位、4位、又はそれらの組み合わせで1つ以上のヌクレオチド置換を含み得る。改変5’-UTRは2位にヌクレオチド置換を含むことが好ましく、改変5’-UTRは2位にU->G又はU->Aを有することがより好ましい。そのような自己複製RNA分子の例は、米国特許出願公開第2018/0104359号、及び国際公開第2018/075235号(その内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる)に記載されている。いくつかの実施形態では、本出願のレプリコンRNAは、配列番号18に記載の配列と少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%又は100%の配列同一性を示す5’-UTRを含む。
いくつかの実施形態では、本出願のRNAレプリコンはシグナルペプチド配列をコードするポリヌクレオチド配列を含む。シグナルペプチド配列をコードするポリヌクレオチド配列は、融合前SARS CoV-2 Sタンパク質又はその断片をコードするポリヌクレオチド配列の上流又は5’-末端に配置されることが好ましい。シグナルペプチドは、タンパク質の局在に典型的には向いており、細胞で産生されたタンパク質の分泌を促進し、かつ/又は抗原の発現及び抗原提示細胞に対する交差提示を改善する。シグナルペプチドは、レプリコンから発現される場合には、融合前SARS CoV-2 Sタンパク質又はその断片のN末端に存在することができるが、例えば細胞からの分泌時にシグナルペプチターゼにより切断される。シグナルペプチドが切断された発現タンパク質は、多くの場合「成熟タンパク質」と呼ばれる。本開示を考慮した、当該技術分野で既知の任意のシグナルペプチドを使用することができる。例えば、シグナルペプチドはシスタチンSシグナルペプチド、Ig重鎖γシグナルペプチドであるSPIgG、Ig重鎖イプシロンシグナルペプチドSPIgEといった免疫グロブリン(Ig)分泌シグナル又はコロナウイルスの短リーダペプチド配列であり得る。シグナルペプチドをコードする例示的な核酸配列を配列番号15に示す。
種々の実施形態では、本明細書に開示されるRNAレプリコンは遺伝子操作RNAレプリコン、合成RNAレプリコン又は組換えRNAレプリコンであり得る。非限定的な例としては、RNAレプリコンは、以下:1)例えば化学的な核酸合成の使用若しくは複製、重合、エキソヌクレアーゼ消化、エンドヌクレオチド消化、ライゲーション、逆転写、転写、塩基修飾(例えばメチル化を含む)又は核酸分子の組換え(相同組換え及び部位特異的組換えを含む)のための酵素の使用といった化学的技術又は酵素的技術を例えば使用することにより、インビトロで合成又は修飾されたもの;2)天然で結合されていない結合ヌクレオチド配列;3)天然に存在するヌクレオチド配列に対して1つ以上のヌクレオチドを欠損するよう、分子クローニング技術を使用して遺伝子操作されたもの;並びに4)天然に存在するヌクレオチド配列に対して1つ以上の配列変化又は再配置を有するよう、分子クローニング技術を用いて操作されたもの、のうち1つ以上であり得る。
RNAレプリコンの成分又は配列のうちいずれかは、他の成分又は配列のうちいずれかと操作可能に連結することができる。RNAレプリコンの成分又は配列は、宿主細胞若しくは処置される生物の目的遺伝子の発現、及び/又は自己複製に対するレプリコンの能力を目的として、操作可能に連結されることができる。本明細書で使用する場合、「操作可能に連結された」という用語は、その最も広い妥当な文脈で解釈されるべきであり、機能的な関係にあるポリヌクレオチドエレメントの連結を指す。ポリヌクレオチドは、別のポリヌクレオチドと機能的関係に置かれるときに「操作可能に連結されて」いる。例えば、コード配列に操作可能に連結されたプロモータ又はUTRは、適切な酵素が存在する場合には、コード配列の転写及び発現に影響を与えることができる。プロモータは、その発現を導くように機能する限り、コード配列に隣接している必要はない。したがって、異種タンパク質又はペプチドをコードするRNA配列と制御配列(例えば、プロモータ又はUTR)との間の操作可能な結合は、目的のポリヌクレオチドの発現を可能とする機能的結合である。操作可能に連結されているとは、RdRp(例えば、nsP4)、nsP1~4、UTR、プロモータをコードする配列及びRNAレプリコンをコードする他の配列などの配列が、融合前SARS CoV-2 Sタンパク質の転写及び翻訳、並びに/又はレプリコンの複製を可能にするために連結されていることも指す。UTRは、他のコード化配列のリボソームによる認識及び翻訳に必要な配列及び間隔を提供することによって、操作可能に連結することができる。
RNAレプリコンにより発現される融合前SARS CoV-2 Sタンパク質又はその断片又はそのバリアントの免疫原性は、本開示を考慮した当業者に既知である多数のアッセイによって決定され得る。
本出願の別の一般的な態様は、本出願のRNAレプリコンをコードするDNA配列を含む核酸に関する。核酸は例えば、DNAプラスミド又は直線化DNAプラスミドの断片であり得る。核酸は、DNA配列の5’末端に操作可能に連結される、例えばT7プロモータといったプロモータを更に含むことが好ましい。T7プロモータは、配列17のヌクレオチド配列を含むことがより好ましい。核酸は、本開示を考慮した当技術分野で既知の方法を使用し、本出願のRNAレプリコン産生のために使用され得る。例えば、RNAレプリコンは核酸のインビボ又はインビトロ転写により得ることができる。
本出願のRNAレプリコン又は本出願のRNAレプリコンをコードする核酸を含む宿主細胞もまた、本発明の一部を形成している。SARS CoV-2 Sタンパク質又はその断片又はそのバリアントは、例えばチャイニーズハムスター卵巣(Chinese hamster ovary、CHO)細胞、腫瘍細胞株、BHK細胞、HEK293細胞といったヒト細胞株、PER.C6細胞、又は酵母、真菌、昆虫細胞など又は遺伝子導入動物若しくは植物といった宿主細胞での分子の発現に関与する組換えDNA技術によって産生され得る。特定の実施形態では、細胞は多細胞生物に由来するものであり、特定の実施形態では、細胞は脊椎動物又は無脊椎動物を起源とするものである。特定の実施形態では、細胞は例えばヒト細胞といった哺乳動物細胞又は昆虫細胞である。一般には、本発明のSARS CoV-2 Sタンパク質又はその断片又はそのバリアントといった組換えタンパク質の宿主細胞における産生は、発現可能な形式でタンパク質をコードする異種核酸分子の宿主細胞への導入を含むが、これによって核酸分子の発現に貢献する条件下で細胞を培養し、当該細胞におけるタンパク質又はその断片又はそのバリアントの発現を可能にすることができる。発現可能な形式でタンパク質をコードする核酸分子は、発現カセット形態であってもよく、これは通常、エンハンサ(複数可)、プロモータ、ポリアデニル化シグナルなどといった核酸の発現を引き起こすことが可能である配列を必要とする。当業者は、様々なプロモータはが宿主細胞で遺伝子の発現を得るために使用されることができるという点を認識している。プロモータは、常時発現型であるか又は調節されることができ、ウイルス、原核生物又は真核生物といった源を含む様々な源から得ることができ、又は人工的に設計することができる。
細胞培地は様々な供給業者から入手可能であり、好適な培地は、目的のタンパク質(ここではSARS CoV-2 Sタンパク質)を発現するため、宿主細胞用に常に選択され得る。好適な培地は血清を含有してもよく、又は血清を含有しなくてもよい。
「異種核酸分子」(本明細書では「導入遺伝子」とも呼ばれる)は、宿主細胞内に天然では存在しない核酸分子である。この核酸分子は例えば、標準的な分子生物学技術によってベクターに導入される。導入遺伝子は、発現制御配列に一般的には操作可能に連結される。これは例えば、プロモータの制御下で導入遺伝子(複数可)をコードする核酸を配置することで行われ得る。更なる制御配列が加えられてもよい。多くのプロモータは、導入遺伝子(複数可)を発現するために使用されることができるが、これは当業者にとって既知であり、例えばこうしたプロモータは、ウイルスプロモータ、哺乳動物プロモータ、合成プロモータなどを含んでもよい。真核細胞で発現を得る上で好適なプロモータの非限定的な例は、CMVプロモータである(米国特許第5,385,839号)。例えば、CMV最初期プロモータは例えば、CMV最初期遺伝子エンハンサ/プロモータから-735~+95のntを含む。例えばウシ成長ホルモンポリAシグナル(米国特許第5,122,458号)といったポリアデニル化シグナルは導入遺伝子(複数可)の後ろに存在してもよい。代替的には、広範に使用されるいくつかの発現ベクターは当該技術分野で、かつ商業的供給源から入手可能であるが、これは例えば、InvitrogenのpcDNA及びpEFベクターシリーズ、BD ScienceによるpMSCV及びpTK-Hyg、StratageneによるpCMV-Scriptなどであり、これらは目的のタンパク質を組換えで発現するために、又は好適なプロモータ及び/若しくは転写終結コドン配列、ポリA配列などを得るために使用され得る。
細胞培養は、例えば培養容器の表面若しくはマイクロキャリアに付着する細胞である付着細胞培養及び懸濁培養を含むいずれかの種類の細胞培養であり得る。ほとんどの大規模な懸濁培養は、操作及びスケールアップするために最も簡潔であることからバッチプロセス又は流加プロセスとして操作される。今日では、灌流方式に基づく連続プロセスは更に一般的なものとなり、かつ好適でもある。好適な培地もまた当業者に周知であり、これは一般には大量に商業的供給源から取得することができ、又は標準的なプロトコルに従って特別注文することができる。培養は、バッチシステム、流加システム、連続システムなどを使用し、例えばディッシュ、ローラボトル又はバイオリアクタにて行うことができる。細胞を培養するための好適な条件が知られている(例えば、Tissue Culture,Academic Press,Kruse and Paterson,editors(1973)、及びR.I.Freshney,Culture of animal cells:A manual of basic technique,fourth edition(Wiley-Liss Inc.,2000,ISBN 0-471-34889-9)を参照)。
本発明は、上記のように、SARS CoV-2 Sタンパク質若しくはその断片若しくはそのバリアント及び/又は核酸分子及び/又はベクターを含む組成物を更に提供する。本発明はまた、かかるSARS CoV-2 Sタンパク質若しくはその断片若しくはそのバリアントをコードする、核酸分子及び/又はベクターを含む組成物を提供する。本発明は、上記のように、SARS CoV-2 Sタンパク質若しくはその断片若しくはそのバリアント及び/又は核酸分子及び/又はベクターを含む免疫原性組成物を更に提供する。本発明はまた、対象においてSARS CoV-2 Sタンパク質又はその断片又はそのバリアントに対する免疫応答を誘導するため、本発明に記載の安定化されたSARS CoV-2 Sタンパク質若しくはその断片若しくはそのバリアント、核酸分子及び/又はベクターの使用を提供する。本発明に記載の融合前SARS CoV-2 Sタンパク質若しくはその断片若しくはそのバリアント及び/又は核酸分子及び/又はベクターを対象に投与することを含む、対象においてSARS CoV-2 Sタンパク質又はその断片又はそのバリアントに対する免疫応答を誘導するための方法が更に提供される。対象におけるSARS CoV-2 Sタンパク質又はその断片又はそのバリアントに対する免疫応答を誘導するために使用する、本発明に記載のSARS CoV-2 Sタンパク質若しくはその断片若しくはそのバリアント、核酸分子及び/又はベクターもまた提供される。対象におけるSARS CoV-2 Sタンパク質又はその断片又はそのバリアントに対する免疫応答の誘導に使用する薬剤の製造のため、本発明に記載のSARS CoV-2 Sタンパク質若しくはその断片及び/又は核酸分子及び/又はベクターの使用が更に提供される。特定の実施形態では、核酸分子はDNA分子及び/又はRNA分子である。
本発明のSARS CoV-2 Sタンパク質若しくはその断片若しくはそのバリアント、核酸分子又はベクターは、SARS CoV-2感染症の予防(曝露後の発症予防を含む発症予防)に使用されてもよい。特定の実施形態では、予防はSARS CoV-2感染症が疑われる、及び/若しくはSARS CoV-2感染症のリスクがある、又はSARS CoV-2と診断された患者群を標的としてもよい。こうした標的群としては、高齢者(例えば、50歳以上、60歳以上及び好ましくは65歳以上)、入院患者及び抗ウイルス化合物で処置されているが、不十分な抗ウイルス応答を示している患者が挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、標的集団は月齢2ヶ月のヒト対象を含む。
本発明に記載のSARS CoV-2 Sタンパク質若しくはその断片若しくはそのバリアント、核酸分子及び/又はベクターは、例えば単独治療及び/若しくはSARS CoV-2によって引き起こされる疾患若しくは病状の発症予防で、又は他の発症予防処置及び/若しくは治療処置(例えば、(既存の、若しくは将来性のある)ワクチン、抗ウイルス剤及び/若しくはモノクローナル抗体)との併用で使用することができる。
本発明は、本発明に記載のSARS CoV-2 Sタンパク質若しくはその断片若しくはそのバリアント、核酸分子及び/又はベクターを使用する対象におけるSARS CoV-2感染症を予防及び/又は処置するための方法を更に提供する。特定の実施形態では、対象においてSARS CoV-2感染症を予防及び/又は処置するための方法は、上記のように、有効量のSARS CoV-2 Sタンパク質若しくはその断片若しくはそのバリアント、核酸分子及び/又はベクターをその必要がある対象に投与することを含む。治療有効量は、SARS CoV-2による感染症から生じた疾患又は病状を予防、寛解及び/又は処置するために効果的であるタンパク質若しくはその断片若しくはそのバリアント、核酸分子又はベクターの量を指す。予防は、SARS CoV-2の伝播を阻害若しくは低減すること、又はSARS CoV-2による感染症に関連する1つ以上の症状の発症、発生若しくは進行を阻害若しくは低減することを包含する。本明細書で使用される場合、「寛解」は目に見える若しくは知覚できる疾患症状、ウイルス血症又はSARS CoV-2感染症の測定可能な任意の他の徴候の低減を指すことができる。
例えばヒトといった対象への投与のため、本発明は、本明細書に記載のように、SARS CoV-2 Sタンパク質若しくはその断片若しくはそのバリアント、核酸分子及び/又はベクター並びに薬学的に許容される担体若しくは賦形剤を含む医薬組成物を使用することができる。この文脈では、「薬学的に許容される」という用語は、使用される投与量及び濃度での担体又は賦形剤が、投与される対象で何らかの望ましくない、又は有害な効果を引き起こさないことを意味する。こうした薬学的に許容される担体及び賦形剤は、当該技術分野で周知である(Remington’s Pharmaceutical Sciences,18th edition,A.R.Gennaro,Ed.,Mack Publishing Company[1990];Pharmaceutical Formulation Development of Peptides and Proteins,S.Frokjaer and L.Hovgaard,Eds.,Taylor & Francis[2000];及びHandbook of Pharmaceutical Excipients,3rd edition,A.Kibbe,Ed.,Pharmaceutical Press[2000]を参照)。CoV Sタンパク質又は核酸分子は滅菌溶液として製剤化及び投与されることが好ましいが、凍結乾燥製剤を使用することも可能であり得る。滅菌溶液は、滅菌ろ過によって、又は当該技術分野でそれ自体が既知の他の方法によって調製される。続いてこの溶液を凍結乾燥、又は薬学的投与容器へと充填する。この溶液のpHは、一般にはpH3.0~9.5、例えばpH5.0~7.5の範囲である。CoV Sタンパク質は、通常、薬学的に許容される好適な緩衝液を有する溶液中に存在し、組成物はまた、塩を含有することができる。任意選択で、アルブミンなどの安定化剤が存在することができる。特定の実施形態では、界面活性剤が加えられる。特定の実施形態では、CoV Sタンパク質は注射可能な製剤へと製剤化されることができる。
特定の実施形態では、本発明に記載の組成物は、更なる活性成分と組み合わせた本発明に記載のベクターを含む。こうした更なる活性成分は、例えば本発明に記載のSARS-CoV-2タンパク質若しくはその断片若しくはそのバリアントといった1つ以上のSARS-CoV-2タンパク質抗原又は他のいずれかのSARS-CoV-2タンパク質抗原又はこれらをコードする核酸を含むベクターを含んでもよい。
RNAレプリコンは、本開示を考慮した薬学的に許容されるいずれかの担体を使用して製剤化されることができる。例えば、本出願のRNAレプリコンは、1つ以上の脂質分子であって好ましくは正に帯電した脂質分子を含む免疫原性組成物に製剤化されることができる。
いくつかの実施形態では、本開示のRNAレプリコンは、1つ以上のリポソーム、リポプレックス及び/又は脂質ナノ粒子を使用して製剤化されることができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のリポソーム又は脂質ナノ粒子製剤はポリカチオン性組成物を含むことができる。いくつかの実施形態では、ポリカチオン性組成物を含む製剤はインビボ及び/又はエクスビトロでの本明細書に記載のRNAレプリコンの送達に使用することができる。
本出願の組成物及び治療配合物は、非経口投与(例えば、筋肉内注射、皮下注射、静脈内注射又は皮内注射)、経口投与、経皮投与及び経鼻投与を含むがこれらに限定されない、本開示を考慮した当該技術分野で既知のいずれかの方法によって対象に投与することができる。組成物及び治療配合物は非経口で投与(例えば、筋肉内注射又は皮内注射)されることが好ましい。送達方法は上記実施形態に限定されず、細胞内送達のためのいずれかの方法を使用することができる。
特定の実施形態では、本発明に記載の組成物は1つ以上のアジュバントを更に含む。適用される1つ以上の抗原決定基に対する免疫応答を更に増大させるアジュバントは、当該技術分野で既知である。「アジュバント」及び「免疫刺激剤」という用語は、本明細書で互換的に使用されており、免疫系の刺激を引き起こす1つ以上の物質として定義されている。この文脈では、アジュバントは本発明のSARS CoV-2 Sタンパク質に対する免疫応答を増強させるために使用される。好適なアジュバントの例としては、水酸化アルミニウム及び/又はリン酸アルミニウムといったアルミニウム塩;MF59(例えば、国際公開第90/14837号を参照)といったスクアレン-水エマルジョンを含む油エマルジョン組成物(又は水中油型組成物);例えばQS21及び免疫刺激複合体(Immunostimulating Complex、ISCOMs)といったサポニン製剤(例えば、米国特許第5,057,540号、国際公開第90/03184号、国際公開第96/11711号、国際公開第2004/004762号、国際公開第2005/002620号を参照);細菌誘導体又は微生物誘導体であって、これらの例としては、モノホスホリル脂質A(monophosphoryl lipid A、MPL)、3-O-脱アシル化MPL(3-O-deacylated MPL、3dMPL)、オリゴヌクレオチドを含有するCpG-モチーフ、例えば大腸菌液熱性エンテロトキシンLTといったADPリボシル化細菌毒素又はその変異体、コレラ毒素CTなど;真核生物タンパク質(例えば、抗体又はその断片(例えば、レシピエント細胞との相互作用時に免疫応答を刺激する、抗原それ自体若しくはCD1a、CD3、CD7、CD80に対して向けられる)及び受容体に対するリガンド(例えば、CD40L、GMCSF、GCSFなど))が挙げられる。特定の実施形態では、本発明の組成物は例えば、アジュバントとして例えば水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、リン酸アルミニウムカリウム、又はそれらの組み合わせといった形態のアルミニウムを、例えば用量あたり0.075~1.0mgのアルミニウム含有量など、0.05~5mgの濃度で含む。
SARS CoV-2 Sタンパク質又はその断片又はそのバリアントはまた、例えばポリマー、リポソーム、ウイルス様粒子といったナノ粒子と併用して、又はこれと結合した状態で投与することもできる。SARS CoV-2 Sタンパク質又はその断片又はそのバリアントは、アジュバントの有無にかかわらずナノ粒子と組み合わせられ得る、又はナノ粒子中に封入され得る、又はナノ粒子に結合され得る。リポソーム内のカプセル封入は例えば、米国特許第4,235,877号に記載されている。高分子への結合は、例えば米国特許第4,372,945号又は米国特許第4,474,757号に開示されている。
他の実施形態では、組成物はアジュバントを含まない。
特定の実施形態では、本発明は、本発明に記載の組成物を提供すること及びその組成物を薬学的に許容される組成物に製剤化することを含む、SARS CoV-2ウイルスに対するワクチンを作製するための方法を提供する。「ワクチン」という用語は、ある特定の病原体又は疾患に対して対象にある程度の免疫を誘導するために有効である活性成分を含有する薬剤又は組成物を指しており、病原体又は疾患による感染症に関連する症状の重篤度、期間又は他の徴候について最低限の減少(最大で完全な欠如)を少なくとももたらす。本発明では、ワクチンは、有効量の融合前SARS CoV-2 Sタンパク質若しくはその断片若しくはそのバリアント及び/又は融合前SARS CoV-2 Sタンパク質若しくはその断片若しくはそのバリアントをコードする核酸分子及び/又は当該核酸分子を含むベクターを含み、SARS CoV-2のSタンパク質に対する免疫応答をもたらす。ワクチンは、入院につながる深刻な下気道疾患を予防する方法及び対象におけるSARS CoV-2感染症及び複製による肺炎及び細気管支炎といった合併症の頻度の減少を提供する。本発明に記載の「ワクチン」という用語は医薬組成物であることを意味しており、したがって薬学的に許容される希釈剤、担体又は賦形剤を典型的には含む。ワクチンは更なる活性成分を含むことができる、又は含むことができない。特定の実施形態では、ワクチンは、例えばSARS CoV-2の他の抗原タンパク質に対するといった、SARS CoV-2に対する免疫応答を誘導する追加成分を更に含む、又は同一の抗原成分の異なる形態を含み得る混合ワクチンであり得る。混合製品はまた、例えばインフルエンザウイルス又はRSVを含むがこれらに限定されない他の呼吸器ウイルスなどの他の感染性病原体に対する免疫原性成分を含み得る。追加の活性成分の投与は例えば、併用投与など別個で、又はプライム・ブースト設定にて、又は本発明のワクチンと追加の活性成分との混合製品を投与することで行うことができる。
本発明はまた、本明細書に記載の組成物又はワクチンを対象に投与することを含み、対象の例えば鼻腔及び肺のSARS-CoV-2の感染症及び/又は複製を低減するための方法を提供する。これは、対象におけるSARS-CoV-2感染症から生じる有害作用を低減し、これによってこうした有害作用に対しての対象の保護に寄与する。特定の実施形態では、SARS-CoV-2感染症の有害作用を基本的に予防することができる。これはすなわち、臨床的に関連しない非常に低いレベルまで低減され得る。ベクターは、上記実施形態を含む、本発明に記載のワクチンの形態であってもよい。更なる活性成分の投与は例えば、個別投与によって、又は本発明のワクチン混合製品の投与によって行われてもよい。
組成物は例えばヒト対象といった対象に投与され得る。単回投与のための組成物中のSARS CoV-2 Sタンパク質の総用量は、例えば約0.01μg~約10mg、例えば1μg~約1mg、例えば10μg~約100μgであり得る。推奨用量の決定は試験によって実施することができ、当業者にとってはごくありふれている。
本発明に記載の組成物の投与は、標準的な投与経路を使用して実施されることができる。非限定的な実施形態としては、皮内投与、筋肉内投与、皮下投与、経皮投与又は粘膜投与(例えば経鼻内、経口など)といった非経口投与が挙げられる。一実施形態では、組成物は筋肉内注射により投与される。当業者は、ワクチンの抗原(複数可)に対する免疫応答を誘導するために、例えばワクチンといった組成物を投与する様々な可能性を理解している。
本明細書で使用される場合、対象は哺乳動物であり、例えばげっ歯類、例えばマウス、コットンラット又は非ヒト霊長類又はヒトであることが好ましい。対象はヒト対象であることが好ましい。対象は、例えば約1ヶ月から100歳、例えば2ヶ月から約80歳、例えば約1ヶ月から約3歳、約3歳~約50歳、約50歳~約75歳などのいずれかの年齢であり得る。特定の実施形態では、対象は2歳のヒトである。
SARS CoV-2 Sタンパク質若しくはその断片若しくはそのバリアント、核酸分子、ベクター(例えばRNAレプリコン)又は本出願の実施形態に記載の組成物は、SARS CoV-2ウイルスに対して哺乳動物の免疫応答を誘導するために使用することができる。免疫応答は、ヒト対象のSARS CoV-2に対する体液性(抗体)応答及び/又はT細胞反応などの細胞性反応を含み得る。
タンパク質、核酸分子、ベクター及び/又は組成物はまた、同種又は異種プライム・ブーストレジメンではプライム又はブーストのいずれかで投与することができる。ブーストワクチン接種が実施される場合、通常はこうしたブーストワクチン接種は、初回に対象に組成物を投与した後(このような場合には「プライムワクチン接種」と呼ばれる)、1週間~1年の期間、好ましくは2週間~4ヶ月で同一の対象に投与される。特定の実施形態では、ブースト組成物又はワクチンは、プライム組成物又はワクチンの少なくとも2週間後に投与される。特定の実施形態では、ブースト組成物又はワクチンは、プライム組成物又はワクチンの約2週間~約12週間後に投与される。特定の実施形態では、ブースト組成物又はワクチンは、プライム組成物又はワクチンの約4週間後に投与される。特定の実施形態では、投与は少なくとも1回のプライム投与(初回刺激投与)及び少なくとも1回のブースト投与(追加抗原投与)を含む。
プライム・ブースト投与は例えば、同種プライム・ブーストであり得る。1回目の投与及び2回目の投与は、同一ベクター(例えば、RNAレプリコン)から発現される同一の抗原(例えば、SARS-CoV-2スパイクタンパク質)を含む。プライム・ブースト投与は例えば、異種プライム・ブーストであり得る。1回目の投与及び2回目の投与は、同一又は異なるベクター(例えば、RNAレプリコン、アデノウイルス、RNA又はプラスミド)から発現される同一の抗原又はそのバリアント(例えば、SARS-CoV-2スパイクタンパク質)を含む。異種プライム・ブースト投与のいくつかの実施形態では、1回目の投与は、SARS-CoV-2スパイクタンパク質又はそのバリアントを含むアデノウイルスベクターを含み、2回目の投与は、SARS-CoV-2スパイクタンパク質又はそのバリアントを含むRNAレプリコンベクターを含む。異種プライム・ブースト投与のいくつかの実施形態では、1回目の投与は、SARS-CoV-2スパイクタンパク質又はそのバリアントを含むRNAレプリコンベクターを含み、2回目の投与は、SARS-CoV-2スパイクタンパク質又はそのバリアントを含むアデノウイルスベクターを含む。
特定の態様では、同種プライム・ブースト投与又は異種プライム・ブースト投与に使用されるRNAレプリコンワクチンは、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号11、配列番号13のポリヌクレオチド配列又はこれらの断片を含む。特定の実施形態では、第1の投与は配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号11、配列番号13のポリヌクレオチド配列又はその断片又はそのバリアントを含むアデノウイルスベクターを含み、第2の投与は配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号11、配列番号13のポリヌクレオチド配列又はその断片又はそのバリアントを含むRNAレプリコンベクターを含む。特定の実施形態では、第1の投与は配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号11、配列番号13のポリヌクレオチド配列又はその断片又はそのバリアントを含むRNAレプリコンベクターを含み、第2の投与は配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号11、配列番号13のポリヌクレオチド配列又はその断片又はそのバリアントを含むアデノウイルスベクターを含む。
SARS CoV-2 Sタンパク質はまた、免疫化動物又は感染したヒトから取得された生体試料(例えば、血液、血症又は細胞といった生体試料)からモノクローナル抗体を単離するために使用することができる。したがって、本発明はまた、モノクローナル抗体を単離するためのベイトとしてSARS CoV-2タンパク質の使用に関する。
SARS CoV-2に対する抗体を含むがこれに限定されない、候補となるSARS CoV-2抗ウイルス剤をスクリーニングする方法での本発明の融合前SARS CoV-2 Sタンパク質の使用もまた提供される。
更には、本発明のタンパク質は、例えば本発明のタンパク質に結合可能である個体の血清中に抗体が存在するかどうかを証明することでこうした個体の免疫状態を試験するための診断ツールとして使用され得る。本発明はしたがって、対象の進行中又は過去のCoV感染症の存在を検出するためのインビトロ診断方法にも関し、当該方法は、a)当該対象から取得された生体試料と本発明に記載のタンパク質とを接触する工程及びb)抗体タンパク質複合体の存在を検出する工程を含む。
本発明は、以下の実施例で更に説明される。実施例は、いかなる方法によっても本発明を制限するものではない。これらは単に本発明を明確にする役割を果たす。
実施例1.抗原設計
完全長武漢型CoV Sタンパク質の配列に基づくいくつかの抗原を設計した。全ての配列は、SARS-CoV-2スパイク完全長タンパク質(YP_009724390.1)に基づくものであった。
完全長武漢型CoV Sタンパク質の配列に基づくいくつかの抗原を設計した。全ての配列は、SARS-CoV-2スパイク完全長タンパク質(YP_009724390.1)に基づくものであった。
異なる抗原については、例えばCOR200006及びCOR200007中の天然の野生型シグナルペプチド、tPAシグナルペプチド(COR200009及びCOR200010)又はキメラリーダー配列(COR200018)といった異なるシグナルペプチド/リーダー配列を使用した。
更には、いくつかのコンストラクトは野生型フューリン切断部位(wt)(すなわち、COR200006、COR200009及びCOR200018)を含有し、いくつかのコンストラクト(すなわち、COR200007及びCOR200010)では、フューリン部位アミノ酸配列RRAR(wt)(配列番号9)のSRAG(dFur)(配列番号10)への変更、すなわち安定性及び発現を最適化するために、R682S及びR685G変異(アミノ酸位置のナンバリングはアミノ酸配列YP_009724390のナンバリングに従う)を導入することでフューリン切断部位を除去した。
コンストラクトのうちの一部では、安定性及び発現を最適化するために986位及び987位のヒンジループに安定化(プロリン)変異を導入し、特にCOR200007及びCOR200010はK986P及びV987P変異を含む(アミノ酸位置のナンバリングはアミノ酸配列YP_009724390のナンバリングに従う)。
細胞ベースのELISA(CBE)及びFACS試験にて、COR200010及びCOR200018を含むいくつかのSARS-CoV-2免疫原設計を試験した。
CBE試験については、1日目に黒色のポリ-D-リジンコーティングされたマイクロプレート上で100%コンフルエントになるまでHEK293細胞を播種した。2日目に、リポフェクタミンを使用してプラスミドで細胞をトランスフェクトし、4日目に4℃にて細胞ベースのELISAを実施した。固定工程は使用しなかった。BM化学発光ELISA基質(Roche;Basel,Switzerland)を使用し、二次抗体を検出した。エンサイトマシンを使用し、細胞の培養密度及び発光強度を測定した。
SARS-CoV-2 Sタンパク質と交差反応するいくつかのSARS-CoV抗体を使用した。抗体CR3022(国際公開第06/051091号に開示)は、SARS-CoVの中和活性が低いことで知られている(Ter Meulen et al.(2006),PLOS Medicine)。これはSARS-CoV-2を中和しない。これは少なくとも2つの受容体結合領域(receptor binding region、RBD)が上位位置にあるときのみに結合する(Yuan et al.,Science 368 (6491):630-3(2020);Joyce et al.doi:https://doi.org/10.1101/2020.03.15.992883)。CR3015(国際公開第2005/012360号に開示)は、SARS-CoVを中和しないことで知られている。CR3023、CR3046、CR3050、CR3054及びCR3055は非中和抗体であるとも見なされる。
COR200010は、最良の中和:非中和Ab結合比を有するが、これはタンパク質が主に融合前様状態であることを示している。
更に、100μgのそれぞれのDNAコンストラクト又は対照としてリン酸緩衝生理食塩水を用いて、6~8週齢のBalb/Cマウスを筋肉内で免疫化した。組換え可溶性安定化スパイク標的抗原を使用し、血清SARS-CoV-2スパイク特異的抗体力価をELISAによる免疫化の19日後に決定した。フューリン部位ノックアウト(knock out、KO)及びプロリン変異(proline mutation、PP)は免疫原性を増大させた(フューリンKO+PP-Sタンパク質でのELISA、図5を参照)。
更には、ER保留シグナル(dERRS)の除去は、CBEのCR3022結合を減少させ、免疫原性を低減させた。
CBEのCR3022:CR3015結合比、WBでの発現レベル(データは示さず)、マウスのDNA免疫化後のELISA力価(COR200009及びCOR200010と比較した場合)(データは示さず)、COR200010 DNAで見られる中和に基づくと、COR2000010は最良の抗原コンストラクトであると思われ、ベクター構築のための抗原としてこれを選択した。
膜結合Sタンパク質について、tPAシグナルペプチド(signal peptide、ST)は、安定化されていないバージョンのwtSPと比較した場合、(CR3022結合に基づき)有益な効果を有さないと思われることから、ベクター構築のためにCOR200007も選択した。
図2は、COR200007はCOR200010よりもACE2に良好に結合することを示す。
実施例2:SARS-CoV-2 Sバリアントを発現するRNAレプリコンの構築及び特性評価
プラスミド構築
ベネズエラウマ脳炎ウイルス(VEEV)のゲノム配列は、SMARRTレプリコンを構築するために使用される塩基配列として機能した。この配列は、シンドビスウイルスからの下流LooP(DLP)を非構造タンパク質1(nsP1)の上流に配置し、ブタテスコウイルス-1から2Aリボソームスキッピングエレメントで2つを結合して改変したものである。TAGに変異させた開始コドンを除き、5’UTRの下流及びDLP上流でnsP1の最初の213ヌクレオチドを複製した。これにより、複製に必要な全ての制御構造と二次構造が維持され、この部分的なnsp1配列の翻訳が妨げられることが確認された。αウイルス構造遺伝子を除去し、目的の異種遺伝子の挿入を促進させるための複数のクローニング部位(multiple cloning site、MCS)として、サブゲノムプロモータの下流にEcoR V及びAsc I制限部位を配置した。5’及び3’末端それぞれのCoV2スパイク抗原配列にMCSに対する40bpの相同性を加え、NEB HiFi DNAアッセンブリ-マスターミックス(カタログ番号E2621S)を使用し、EcoRV及びAscIで消化したSMARRTレプリコンにクローニングした。全てのコンストラクトを配列決定して検証した。例示的なRNAレプリコンをコードするプラスミドの部分マップを図3に示す。RNAレプリコンによってコード化されたCoV2スパイクバリアントを図4に示す。
プラスミド構築
ベネズエラウマ脳炎ウイルス(VEEV)のゲノム配列は、SMARRTレプリコンを構築するために使用される塩基配列として機能した。この配列は、シンドビスウイルスからの下流LooP(DLP)を非構造タンパク質1(nsP1)の上流に配置し、ブタテスコウイルス-1から2Aリボソームスキッピングエレメントで2つを結合して改変したものである。TAGに変異させた開始コドンを除き、5’UTRの下流及びDLP上流でnsP1の最初の213ヌクレオチドを複製した。これにより、複製に必要な全ての制御構造と二次構造が維持され、この部分的なnsp1配列の翻訳が妨げられることが確認された。αウイルス構造遺伝子を除去し、目的の異種遺伝子の挿入を促進させるための複数のクローニング部位(multiple cloning site、MCS)として、サブゲノムプロモータの下流にEcoR V及びAsc I制限部位を配置した。5’及び3’末端それぞれのCoV2スパイク抗原配列にMCSに対する40bpの相同性を加え、NEB HiFi DNAアッセンブリ-マスターミックス(カタログ番号E2621S)を使用し、EcoRV及びAscIで消化したSMARRTレプリコンにクローニングした。全てのコンストラクトを配列決定して検証した。例示的なRNAレプリコンをコードするプラスミドの部分マップを図3に示す。RNAレプリコンによってコード化されたCoV2スパイクバリアントを図4に示す。
RNA転写
Nucleobond xtra EFマキシプレップキット(Machery-Nagelカタログ番号740426.10)を使用し、続いてフェノール/クロロホルム抽出及び酢酸ナトリウム/エタノール沈殿を使用してプラスミドを精製した。NEBによるHiScribe T7 ARCA mRNAキット(カタログ番号E2065S;New England Biolabs;Ipswich,MA)及びNdeIで直線化した1μgのプラスミドテンプレートを使用してRNAを生成した。続いてRNeasy精製カラム(Qiagenカタログ番号75144;Qiagen;Hilden,Germany)を用いてRNAを精製し、水中で溶出した。Nanodrop分光光度計を使用し、RNA濃度を決定した。
Nucleobond xtra EFマキシプレップキット(Machery-Nagelカタログ番号740426.10)を使用し、続いてフェノール/クロロホルム抽出及び酢酸ナトリウム/エタノール沈殿を使用してプラスミドを精製した。NEBによるHiScribe T7 ARCA mRNAキット(カタログ番号E2065S;New England Biolabs;Ipswich,MA)及びNdeIで直線化した1μgのプラスミドテンプレートを使用してRNAを生成した。続いてRNeasy精製カラム(Qiagenカタログ番号75144;Qiagen;Hilden,Germany)を用いてRNAを精製し、水中で溶出した。Nanodrop分光光度計を使用し、RNA濃度を決定した。
dsRNA及びスパイク抗原の検出
Vero細胞(ATCC,Manassas,VA,CCL-81)を10%のウシ胎児血清(Gemini#100-106)及びペニシリン/ストレプトマイシン/グルタミン(Gibco#10378016)を補充したDMEM中で培養した。SF緩衝液(Lonza;Basel,Switzerland)を使用し、106個の細胞あたり1.5μgのRNA及び4D-Nucleofectorを用いてストリップキュベットにて細胞を電気穿孔した。電気穿孔の21時間後、以下のようなフローサイトメトリー又はウェスタンブロットのいずれかによる分析のため、細胞を採取した。
Vero細胞(ATCC,Manassas,VA,CCL-81)を10%のウシ胎児血清(Gemini#100-106)及びペニシリン/ストレプトマイシン/グルタミン(Gibco#10378016)を補充したDMEM中で培養した。SF緩衝液(Lonza;Basel,Switzerland)を使用し、106個の細胞あたり1.5μgのRNA及び4D-Nucleofectorを用いてストリップキュベットにて細胞を電気穿孔した。電気穿孔の21時間後、以下のようなフローサイトメトリー又はウェスタンブロットのいずれかによる分析のため、細胞を採取した。
フローサイトメトリー:電気穿孔の21時間後、Versene溶液中で細胞を10分間インキュベートしてプレートからこれを剥離し、5%のBSAを含有するPBS中で2回洗浄した。APCに直接結合した抗体CR3022を使用し、表面発現CoV2スパイクタンパク質について細胞を染色した。細胞表面のCoV2スパイクを染色後、Lightning-Link R-PEコンジュゲーションキット(Innova Biosciences;Cambridge,United Kingdom)を使用するR-PEに結合されたJ2結合dsRNA Ab(Scicons,#10010500)を使用し、細胞内dsRNAについて細胞を洗浄してその後固定、透過及び染色した。染色後、LSRFortessaフローサイトメータ(BD)で細胞を評価し、FlowJo 10(Tree Star,Ashland,OR)を使用してデータを分析した。
ウェスタンブロット:ウェスタンブロットにより細胞を分析するため、PBSを用いて細胞を洗浄し、その後6ウェルプレートの各ウェルに150μLの1倍LDS添加液+還元剤を加えた。全細胞可溶化物を微量遠心管に移し、70℃で10分間インキュベートした。各試料から25μLの可溶化物を充填し、4~12%のビス-トリスゲルで分離した。iBlotシステムを使用し、タンパク質をニトロセルロース膜に移し、Genetex(カタログ番号GTX632604;Genetex;Irvine,CA)からの抗CoV2スパイク抗体を用いてCoV2スパイクタンパク質について膜をプローブした。続いてアクチンに対してブロットをプローブし、異なる試料間での等しい負荷を確認した。
RNAレプリコンは細胞表面に立体配座的に正確なCoV2スパイクタンパク質を発現することを示した。
実施例3:SMARRT-nCovコンストラクトの同種プライム・ブースト投与に関する用量応答試験
投与の27日後及び56日後に、SMARRT-nCovコンストラクトは体液性免疫応答を誘発可能かどうかについての調査、SMARRT-1158及びSMARRT-1159コンストラクトの同種プライム・ブースト投与に関する用量応答試験を行った。SMARRT-1158及びSMARRT-1159を0日目にプライム投与として、0.1μg,、1.0μg及び10μgの増大する用量レベルにてBalb/Cマウスに投与した。プライム投与の28日後のブースト投与で、同一のコンストラクトを同一の用量で投与した。プライム投与では100μg、ブースト投与では10μgの用量で、対照としてSMARRT-1159コンストラクトとして同一のスパイクタンパク質をコードするDNAを投与した。用量スケジュール及び実験計画を以下の表2に記載する。
投与の27日後及び56日後に、SMARRT-nCovコンストラクトは体液性免疫応答を誘発可能かどうかについての調査、SMARRT-1158及びSMARRT-1159コンストラクトの同種プライム・ブースト投与に関する用量応答試験を行った。SMARRT-1158及びSMARRT-1159を0日目にプライム投与として、0.1μg,、1.0μg及び10μgの増大する用量レベルにてBalb/Cマウスに投与した。プライム投与の28日後のブースト投与で、同一のコンストラクトを同一の用量で投与した。プライム投与では100μg、ブースト投与では10μgの用量で、対照としてSMARRT-1159コンストラクトとして同一のスパイクタンパク質をコードするDNAを投与した。用量スケジュール及び実験計画を以下の表2に記載する。
ELISAアッセイを使用し、プライム組成物及びブースト組成物の投与後に産生されたスパイクタンパク質IgG力価を測定した。プライム組成物の投与後、14日目及び27日目にスパイクタンパク質特異的IgG力価を測定し、ブースト組成物の投与後、42日目及び54日目にスパイクタンパク質特異的IgG力価を測定した。対照として、プライム組成物の投与1日前にスパイク特異的IgG力価を測定した。結果を図5B~図5Eに示す。
SMARRT-1159コンストラクトは、SMARRT-1158コンストラクトと比較すると14日目及び27日目により高い抗体力価を誘発した(図5B及び図5C)。0.1μgのSMARRT-1159は、10μgのSMARRT-1158と同様のレベルで力価を誘発した(図5B及び図5C)。SMARRT-1159によって誘発された抗体力価は14日目~27日目に増大した(図5B及び図5C)。DNA-1159コンストラクトは高い抗体力価を誘発しなかった(データは示さず)。
2回目のSMARRTコンストラクト投与は、27日目の力価と比較すると、42日目及び54日目に測定したときにはスパイクタンパク質特異的抗体力価をブーストさせた(図5C及び図5D)。
図6は、SMARRT-1159コンストラクトはプライム組成物の投与の27日後にスパイクタンパク質に対する中和抗体を産生可能であることを実証している。
図7A及び図7Bは、14日目時点での1回目の投与後2週間の免疫化動物の脾臓(図7A)及び54日目での2回目の投与後2週間の免疫化動物の脾臓(図7B)にて同様のレベルのIFNγ分泌細胞を検出したことを実証している。
材料及び方法
マウス脾細胞のELISpotアッセイ:
バイオセイフティーフードにて200μLの滅菌PBSでプレートを4回洗浄した。アルブマックスを含む200μLのAIM V(登録商標)培地(Gibco)を用いて、プレートのウェルを2時間調整した。
マウス脾細胞のELISpotアッセイ:
バイオセイフティーフードにて200μLの滅菌PBSでプレートを4回洗浄した。アルブマックスを含む200μLのAIM V(登録商標)培地(Gibco)を用いて、プレートのウェルを2時間調整した。
プレートをブロッキング緩衝液で調整しつつ、4μLのPMA原液(1mg/mL)を1.996mLの培地に加えて1:500希釈物を作製し、PMA/イオノマイシン溶液を調製した。200μLの1:500希釈物を9.780mLの培地に加え、1:50希釈物を作製した。20μLのイオノマイシンを培地に加え、1:500希釈物を作製した。
PMA/イオノマイシン溶液を調製した後、ブロッキング緩衝液をプレートから除去し、プレートをペーパータオル上で軽く叩いて乾燥させた。100μLのPMA/イオノマイシン溶液、刺激及びDMSOをプレートのウェルに加えた。AIM V(登録商標)で希釈した100μLの細胞を、2.5×105個の細胞/ウェルの総濃度で各ウェルに加えた。プレートを37℃、5%のCO2で22時間インキュベートした。
PBSでプレートを5回洗浄した。0.5%のFBSを含有するPBS中で1mg/mLの検出抗体(すなわち、R4-6A2ビオチン)を1μg/mLに希釈した。100μLの希釈した検出抗体を各ウェルに加え、プレートを室温で2時間インキュベートした。PBSでプレートを5回洗浄した。PBS-0.5%のPBS中で二次抗体(すなわち、ストレプトアビジン-HRP)を1:1000に希釈した。100μLの二次抗体を各ウェルに加え、プレートを暗所にて室温で1時間インキュベートした。プレートを5回洗浄した。既製のTMB基質をろ過し、100μLのTMB基質を各ウェルに加え、明確なスポットが発現するまで発育させた(約10分間)。プレートをスキャン及び計測サービスに送った。
マウス脾細胞の細胞内染色:
100mLのAIM V(登録商標)組織培地を取り、0.5μg/mLの最終濃度で100μlLの抗CD49d及び抗CD28精製抗体を加えることで同時刺激分子を含むAIM V(登録商標)+培地を調製した。AIM V(登録商標)+培地を氷上で保持した。
100mLのAIM V(登録商標)組織培地を取り、0.5μg/mLの最終濃度で100μlLの抗CD49d及び抗CD28精製抗体を加えることで同時刺激分子を含むAIM V(登録商標)+培地を調製した。AIM V(登録商標)+培地を氷上で保持した。
DMSA中で40.5μMの濃度のPMAと669.3μMの濃度のイオノマイシンの500倍細胞活性カクテルを調製することで、1:250の比のPMA/イオノマイシンポジティブコントロール培地の細胞活性化カクテル(プレフェルジンAなし)を作製した。0.1mL/群でn=15群のプールを作製する場合、12μLの500倍の細胞活性カクテルとともに2.988mLのAIM V組織培地を加えて1:250希釈物を作成し、3mLの希釈した細胞活性カクテルを調製する。96ウェルプレートの適切なウェルに100μLの希釈した細胞活性化カクテルを加えた。
1:250希釈のDMSO「モック(mock)」条件培地を、50匹のマウスについては100μL/ウェルで調製した。5mLの総量のモック条件培地を必要とした。5mLのAIM V(登録商標)+培地(同時刺激分子を含む)を20μLのDMSOに加え、十分混合する。100μLのモック培地を96ウェルプレートの適切なウェルに加える。
SARS-CoV-2スパイク特異的重複ペプチドプールを調製し、標識した。150試料×100μL/ウェルについては、200試料に十分なSAR-CoV-2スパイク特異的重複ペプチドプールを調製する。
マウスに由来する単一の細胞懸濁液を10×106細胞/mLの濃度で調製した。1条件につきマウスあたり200μLの再懸濁細胞を丸底の96ウェルプレートに播種し、2×106細胞/ウェルの最終濃度の細胞を提供した。プレートを500g、4℃で5分間遠心分離し、培地を細胞ペレットからデカントした。100μLのAIM V(登録商標)組織培地中で細胞ペレットを再懸濁し、刺激条件培地が加えられるまで4℃で保管した。
適切な成分を用いて再懸濁細胞を処理すると、96ウェルプレートをホイルで覆い、刺激インキュベーションの間37℃で1時間インキュベートした。
インキュベーション中、各96ウェルプレートについて、0.25μL/ウェルでは100ウェルに十分なゴルジプラグ希釈を行うことに留意した上で、以下のようにゴルジプラグ希釈を調製した。19.82mLのAIM V+培地(同時刺激分子を含む)を別個の管に加え、180μLのゴルジプラグを管に加え、氷上で十分に混合した。
刺激インキュベーションの1時間後、25μL/ウェルの希釈したゴルジプラグを各ウェルに加え、プレートを37℃で更に5時間、合計で6時間のインキュベーション時間でインキュベートした。6時間のインキュベーション後、プレートを500g、4℃で5分間遠心分離した。上清を除去し、200μLのAIM V(登録商標)+細胞培地を各ウェルに加え、細胞を再懸濁した。細胞のプレートを4℃で一晩置き、翌日に細胞内シグナル伝達について細胞を分析した。
細胞外及び細胞内シグナル伝達:
細胞のプレートを500g、4℃で5分間遠心分離した。上清を除去し、150μLの1倍PBSを再懸濁することで細胞を洗浄した。続いて細胞を500gで5分間遠心分離した。PBSの除去後、細胞を50μLのFVD506カクテル中で再懸濁し、暗所で(すなわち、プレートをホイルで包んで)室温にて15分間インキュベートした。15分後、500xgで5分間遠心分離し、150μLの細胞染色緩衝液で洗浄することで細胞を2回洗浄した。最終の遠心分離後に上清を除去し、細胞を25μLのFcブロック中で再懸濁し、暗所で室温にて15分間インキュベートした。次に、25μLの細胞外表面染色(CD8 FITC、CD3-APC-ef780、CD4-BV421)を各ウェルに加えた。細胞を混合し、暗所で4℃にて30分間インキュベートした。
細胞のプレートを500g、4℃で5分間遠心分離した。上清を除去し、150μLの1倍PBSを再懸濁することで細胞を洗浄した。続いて細胞を500gで5分間遠心分離した。PBSの除去後、細胞を50μLのFVD506カクテル中で再懸濁し、暗所で(すなわち、プレートをホイルで包んで)室温にて15分間インキュベートした。15分後、500xgで5分間遠心分離し、150μLの細胞染色緩衝液で洗浄することで細胞を2回洗浄した。最終の遠心分離後に上清を除去し、細胞を25μLのFcブロック中で再懸濁し、暗所で室温にて15分間インキュベートした。次に、25μLの細胞外表面染色(CD8 FITC、CD3-APC-ef780、CD4-BV421)を各ウェルに加えた。細胞を混合し、暗所で4℃にて30分間インキュベートした。
細胞を30分間インキュベートしながら、ポリスチレンチューブにUltraCompビーズを一滴加えることでコンペンセーションコントロールビーズを調製した。0.5μLの抗体染色(抗体あたり1コンペンセーションビーズ)を管に加え、管の底部を指で軽く弾いて内容物を混合させ、管を暗所で4℃にて15分間、インキュベートした。2mLの細胞染色緩衝液を管に加え、管を500g、4℃で5分間遠心分離した。上清を除去し、300μLの細胞染色緩衝液をビーズに加えた。ビーズを指で軽く弾いて再懸濁させ、FACSを取得するまでコンペンセーションコントロールビーズを4℃で保管した。取得前にビーズを十分にボルテックスした。
細胞外染色後、細胞を500gで5分間、遠心分離した。上清の除去後、150μLの細胞染色緩衝液で細胞を洗浄し、500gで5分間遠心分離した。上清を除去し、続いて200μLの固定及び透過処理溶液を細胞に加え、細胞を再懸濁し、暗所で4℃にて20分間インキュベートした。これらの細胞を500gで5分間遠心分離した。上清を除去し、続いて150μLの1倍perm/洗浄緩衝液を用いて細胞を2回洗浄し、細胞を再懸濁させて500gで5分間遠心分離した。(300mLの1倍BDperm/洗浄緩衝液を作製するため、30mLの10倍BDperm/洗浄緩衝液を270mLの蒸留水に加えた。溶液を十分に混合し、氷上で保持した。(試料/ウェルあたり600μLの1倍perm/洗浄緩衝液を必要とした))。
上清を除去し、50μLの以下の細胞内サイトカイン抗体カクテル(IL-2-PE、IFNg-APC、TNFa-PE-Cy7)を細胞に加え、暗所で4℃にて30分間インキュベートした。細胞を150μLの1倍perm/洗浄緩衝液を用いて洗浄した。500xgで5分間遠心分離した後、上清を除去し、続いて細胞を200μLの細胞染色緩衝液を用いて洗浄した。最終洗浄後に上清を除去し、細胞を200μLの細胞染色緩衝液を用いて再懸濁した。AcroPrep(商標)Advance Plateに試料を通してろ過し、続いて1500rpmで2分間遠心分離した。細胞を染色緩衝液中に再懸濁し、ハイスループットサンプリング(high-throughput sampling、HTS)プレートリーダーを使用し、FACSを取得するまで氷上で又は4℃で保持した。
実施例4:アデノウイルス及びSMARRT-nCovコンストラクトの異種プライム・ブーストに関する抗体応答試験
試験の主な目的は、融合前安定化スパイク抗原を発現するSMARRT及びAd26プラットフォームの2回投与異種レジメンと、Balb/Cマウスにおける2回投与同種レジメン又は単回投与レジメンとを比較することであった。指示された用量で、プライム投与としてSMARRT-1159又はAd26NCOV030を0日目にBalb/Cマウスに投与した。プライム投与後28日目に同種又は異種ブースト投与のいずれかで、同一コンストラクトを同一の用量で投与した(図8A)。ポジティブコントロール及びネガティブコントロールとしては、高用量のAd26NCOV030(1010 vp)を含む、又はAd26を含まなかった。投与スケジュール及び実験計画を以下の表3に記載し、図8Aに示す。
試験の主な目的は、融合前安定化スパイク抗原を発現するSMARRT及びAd26プラットフォームの2回投与異種レジメンと、Balb/Cマウスにおける2回投与同種レジメン又は単回投与レジメンとを比較することであった。指示された用量で、プライム投与としてSMARRT-1159又はAd26NCOV030を0日目にBalb/Cマウスに投与した。プライム投与後28日目に同種又は異種ブースト投与のいずれかで、同一コンストラクトを同一の用量で投与した(図8A)。ポジティブコントロール及びネガティブコントロールとしては、高用量のAd26NCOV030(1010 vp)を含む、又はAd26を含まなかった。投与スケジュール及び実験計画を以下の表3に記載し、図8Aに示す。
ELISAアッセイを使用し、プライム組成物及びブースト組成物の投与後に産生されたスパイクタンパク質IgG力価を測定した。プライム組成物の投与後、スパイクタンパク質特異的IgG力価を14日目及び27日目に測定した。SMARRT-1159を受けた全ての動物は、2週間という早期でスパイク特異的抗体を誘発し、これを4週目まで維持した(図8B及び図8C)。
ブーストの投与後、42日目(図8D)及び54日目(図8E)にスパイクタンパク質特異的IgG力価を測定した。2回目のSMARRT又はAd26コンストラクト投与は、27日目の力価と比較すると、42日目及び54日目に測定したときにはスパイクタンパク質特異的抗体力価をブーストさせた。SMARRT-1159-Ad26NCOV2レジメン(R-A)は、Ad26NCOV2-SMARRT-1159(A-R)レジメンに対して著しく高い抗体応答を有したが、これは56日目まで維持された。
56日目に、血清中のIgG1及びIgG2アイソタイプレベルの両方を測定するELISAを実施した。プライムにSMARRT-1159を受けた動物は、より高いレベルのスパイク特異的IgG2aアイソタイプ抗体を有した。結果として、こうした動物は、Th1非対称応答を示唆する、より高いIgG2a:IgG1比も有していた(図9A~図9B)。
ウイルス中和力価を56日目に測定した。SMARRT-1159でプライム投与された動物に、SMARRT-1159又はAd26NCOV030のいずれかでブースト投与をした場合、中和力価がブーストされる傾向が観察された(図10)。
図11A及び図11Bは、2回投与の異種又は同種レジメンが、56日目の2回目投与の4週間後に免疫化動物の脾臓中で同様のレベルのIFNγ分泌細胞を誘発したことを実証した。
配列
>COR200007_配列番号5
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>COR200009_配列番号6
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>COR200010_配列番号7
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>COR200018_配列番号8
ATGGACGCTATGAAGAGGGGCCTGTGCTGTGTGCTGCTGCTGTGCGGAGCTGTGTTTGTGTCTGCTAGCCAAGAGATCCACGCCAGATTTCGGAGATTCGTGTTTCTGGTGCTGCTGCCTCTGGTGTCCAGCCAATGCGTGAACCTGACCACAAGAACCCAGCTGCCTCCAGCCTACACCAACAGCTTTACCAGAGGCGTGTACTACCCCGACAAGGTGTTCAGATCCAGCGTGCTGCACTCTACCCAGGACCTGTTCCTGCCTTTCTTCAGCAACGTGACCTGGTTCCACGCCATCCACGTGTCCGGCACCAATGGCACCAAGAGATTCGACAACCCCGTGCTGCCCTTCAACGACGGGGTGTACTTTGCCAGCACCGAGAAGTCCAACATCATCAGAGGCTGGATCTTCGGCACCACACTGGACAGCAAGACCCAGAGCCTGCTGATCGTGAACAACGCCACCAACGTGGTCATCAAAGTGTGCGAGTTCCAGTTCTGCAACGACCCCTTCCTGGGCGTCTACTATCACAAGAACAACAAGAGCTGGATGGAAAGCGAGTTCCGGGTGTACAGCAGCGCCAACAACTGCACCTTTGAATACGTGTCCCAGCCTTTCCTGATGGACCTGGAAGGCAAGCAGGGCAACTTCAAGAACCTGCGCGAGTTCGTGTTCAAGAACATCGACGGCTACTTCAAGATCTACAGCAAGCACACCCCTATCAACCTCGTGCGGGATCTGCCTCAGGGCTTCTCTGCTCTGGAACCCCTGGTGGATCTGCCCATCGGCATCAACATCACCCGGTTTCAGACACTGCTGGCCCTGCACAGAAGCTACCTGACACCTGGCGATAGCAGCAGCGGATGGACAGCTGGTGCCGCCGCTTACTATGTGGGCTACCTGCAGCCTAGAACCTTTCTGCTGAAGTACAACGAGAACGGCACCATCACCGACGCCGTGGATTGTGCTCTGGATCCTCTGAGCGAGACAAAGTGCACCCTGAAGTCCTTCACCGTGGAAAAGGGCATCTACCAGACCAGCAACTTCCGGGTGCAGCCCACCGAATCCATCGTGCGGTTCCCCAATATCACCAATCTGTGCCCCTTCGGCGAGGTGTTCAATGCCACCAGATTCGCCTCTGTGTACGCCTGGAACCGGAAGCGGATCAGCAATTGCGTGGCCGACTACTCCGTGCTGTACAACTCCGCCAGCTTCAGCACCTTCAAGTGCTACGGCGTGTCCCCTACCAAGCTGAACGACCTGTGCTTCACAAACGTGTACGCCGACAGCTTCGTGATCCGGGGAGATGAAGTGCGGCAGATTGCCCCTGGACAGACTGGCAAGATCGCCGACTACAACTACAAGCTGCCCGACGACTTCACCGGCTGTGTGATTGCCTGGAACAGCAACAACCTGGACTCCAAAGTCGGCGGCAACTACAATTACCTGTACCGGCTGTTCCGGAAGTCCAATCTGAAGCCCTTCGAGCGGGACATCTCCACCGAGATCTATCAGGCCGGCAGCACCCCTTGTAACGGCGTGGAAGGCTTCAACTGCTACTTCCCACTGCAGTCCTACGGCTTTCAGCCCACAAATGGCGTGGGCTATCAGCCCTACAGAGTGGTGGTGCTGAGCTTCGAACTGCTGCATGCCCCTGCCACAGTGTGCGGCCCTAAGAAAAGCACCAATCTCGTGAAGAACAAATGCGTGAACTTCAACTTCAACGGCCTGACCGGCACCGGCGTGCTGACAGAGAGCAACAAGAAGTTCCTGCCATTCCAGCAGTTTGGCCGGGATATCGCCGATACCACAGACGCCGTTAGAGATCCCCAGACACTGGAAATCCTGGACATCACCCCTTGCAGCTTCGGCGGAGTGTCTGTGATCACCCCTGGCACCAACACCAGCAATCAGGTGGCAGTGCTGTACCAGGACGTGAACTGTACCGAAGTGCCCGTGGCCATTCACGCCGATCAGCTGACACCTACATGGCGGGTGTACTCCACCGGCAGCAATGTGTTTCAGACCAGAGCCGGCTGTCTGATCGGAGCCGAGCACGTGAACAATAGCTACGAGTGCGACATCCCCATCGGCGCTGGCATCTGTGCCAGCTACCAGACACAGACAAACAGCCCCAGACGGGCCAGATCTGTGGCCAGCCAGAGCATCATTGCCTACACAATGTCTCTGGGCGCCGAGAACAGCGTGGCCTACTCCAACAACTCTATCGCTATCCCCACCAACTTCACCATCAGCGTGACCACAGAGATCCTGCCTGTGTCCATGACCAAGACCAGCGTGGACTGCACCATGTACATCTGCGGCGATTCCACCGAGTGCTCCAACCTGCTGCTGCAGTACGGCAGCTTCTGCACCCAGCTGAATAGAGCCCTGACAGGGATCGCCGTGGAACAGGACAAGAACACCCAAGAGGTGTTCGCCCAAGTGAAGCAGATCTACAAGACCCCTCCTATCAAGGACTTCGGCGGCTTCAATTTCAGCCAGATTCTGCCCGATCCTAGCAAGCCCAGCAAGCGGAGCTTCATCGAGGACCTGCTGTTCAACAAAGTGACACTGGCCGACGCCGGCTTCATCAAGCAGTATGGCGATTGTCTGGGCGACATTGCCGCCAGGGATCTGATTTGCGCCCAGAAGTTTAACGGACTGACAGTGCTGCCTCCTCTGCTGACCGATGAGATGATCGCCCAGTACACATCTGCCCTGCTGGCCGGCACAATCACAAGCGGCTGGACATTTGGAGCTGGCGCCGCTCTGCAGATCCCCTTTGCTATGCAGATGGCCTACCGGTTCAACGGCATCGGAGTGACCCAGAATGTGCTGTACGAGAACCAGAAGCTGATCGCCAACCAGTTCAACAGCGCCATCGGCAAGATCCAGGACAGCCTGAGCAGCACAGCAAGCGCCCTGGGAAAGCTGCAGGACGTGGTCAACCAGAATGCCCAGGCACTGAACACCCTGGTCAAGCAGCTGTCCTCCAACTTCGGCGCCATCAGCTCTGTGCTGAACGATATCCTGAGCAGACTGGACAAGGTGGAAGCCGAGGTGCAGATCGACAGACTGATCACCGGAAGGCTGCAGTCCCTGCAGACCTACGTTACCCAGCAGCTGATCAGAGCCGCCGAGATTAGAGCCTCTGCCAATCTGGCCGCCACCAAGATGTCTGAGTGTGTGCTGGGCCAGAGCAAGAGAGTGGACTTTTGCGGCAAGGGCTACCACCTGATGAGCTTCCCTCAGTCTGCCCCTCACGGCGTGGTGTTTCTGCACGTGACATATGTGCCCGCTCAAGAGAAGAATTTCACCACCGCTCCAGCCATCTGCCACGACGGCAAAGCCCACTTTCCTAGAGAAGGCGTGTTCGTGTCCAACGGCACCCATTGGTTCGTGACACAGCGGAACTTCTACGAGCCCCAGATCATCACCACCGACAACACCTTCGTGTCTGGCAACTGCGACGTCGTGATCGGCATTGTGAACAATACCGTGTACGACCCTCTGCAGCCCGAGCTGGACAGCTTCAAAGAGGAACTGGACAAGTACTTTAAGAACCACACAAGCCCCGACGTGGACCTGGGCGATATCAGCGGAATCAATGCCAGCGTCGTGAACATCCAGAAAGAGATCGACCGGCTGAACGAGGTGGCCAAGAATCTGAACGAGAGCCTGATCGACCTGCAAGAACTGGGAAAATACGAGCAGTACATCAAGTGGCCTTGGTACATCTGGCTGGGCTTTATCGCCGGACTGATTGCCATCGTGATGGTCACAATCATGCTGTGTTGCATGACCAGCTGCTGTAGCTGCCTGAAGGGCTGTTGTAGCTGTGGCAGCTGCTGCAAGTTCGACGAGGACGATTCTGAGCCCGTGCTGAAGGGCGTGAAACTGCACTACACA
配列番号11、SMARRT-CoV2 1158にコード化された挿入のヌクレオチド配列ATGTTCGTGTTTCTGGTGCTGCTGCCTCTGGTGTCCAGCCAATGCGTGAACCTGACCACAAGAACCCAGCTGCCTCCAGCCTACACCAACAGCTTTACCAGAGGCGTGTACTACCCCGACAAGGTGTTCAGATCCAGCGTGCTGCACTCTACCCAGGACCTGTTCCTGCCTTTCTTCAGCAACGTGACCTGGTTCCACGCCATCCACGTGTCCGGCACCAATGGCACCAAGAGATTCGACAACCCCGTGCTGCCCTTCAACGACGGGGTGTACTTTGCCAGCACCGAGAAGTCCAACATCATCAGAGGCTGGATCTTCGGCACCACACTGGACAGCAAGACCCAGAGCCTGCTGATCGTGAACAACGCCACCAACGTGGTCATCAAAGTGTGCGAGTTCCAGTTCTGCAACGACCCCTTCCTGGGCGTCTACTATCACAAGAACAACAAGAGCTGGATGGAAAGCGAGTTCCGGGTGTACAGCAGCGCCAACAACTGCACCTTTGAATACGTGTCCCAGCCTTTCCTGATGGACCTGGAAGGCAAGCAGGGCAACTTCAAGAACCTGCGCGAGTTCGTGTTCAAGAACATCGACGGCTACTTCAAGATCTACAGCAAGCACACCCCTATCAACCTCGTGCGGGATCTGCCTCAGGGCTTCTCTGCTCTGGAACCCCTGGTGGATCTGCCCATCGGCATCAACATCACCCGGTTTCAGACACTGCTGGCCCTGCACAGAAGCTACCTGACACCTGGCGATAGCAGCAGCGGATGGACAGCTGGTGCCGCCGCTTACTATGTGGGCTACCTGCAGCCTAGAACCTTTCTGCTGAAGTACAACGAGAACGGCACCATCACCGACGCCGTGGATTGTGCTCTGGATCCTCTGAGCGAGACAAAGTGCACCCTGAAGTCCTTCACCGTGGAAAAGGGCATCTACCAGACCAGCAACTTCCGGGTGCAGCCCACCGAATCCATCGTGCGGTTCCCCAATATCACCAATCTGTGCCCCTTCGGCGAGGTGTTCAATGCCACCAGATTCGCCTCTGTGTACGCCTGGAACCGGAAGCGGATCAGCAATTGCGTGGCCGACTACTCCGTGCTGTACAACTCCGCCAGCTTCAGCACCTTCAAGTGCTACGGCGTGTCCCCTACCAAGCTGAACGACCTGTGCTTCACAAACGTGTACGCCGACAGCTTCGTGATCCGGGGAGATGAAGTGCGGCAGATTGCCCCTGGACAGACTGGCAAGATCGCCGACTACAACTACAAGCTGCCCGACGACTTCACCGGCTGTGTGATTGCCTGGAACAGCAACAACCTGGACTCCAAAGTCGGCGGCAACTACAATTACCTGTACCGGCTGTTCCGGAAGTCCAATCTGAAGCCCTTCGAGCGGGACATCTCCACCGAGATCTATCAGGCCGGCAGCACCCCTTGTAACGGCGTGGAAGGCTTCAACTGCTACTTCCCACTGCAGTCCTACGGCTTTCAGCCCACAAATGGCGTGGGCTATCAGCCCTACAGAGTGGTGGTGCTGAGCTTCGAACTGCTGCATGCCCCTGCCACAGTGTGCGGCCCTAAGAAAAGCACCAATCTCGTGAAGAACAAATGCGTGAACTTCAACTTCAACGGCCTGACCGGCACCGGCGTGCTGACAGAGAGCAACAAGAAGTTCCTGCCATTCCAGCAGTTTGGCCGGGATATCGCCGATACCACAGACGCCGTTAGAGATCCCCAGACACTGGAAATCCTGGACATCACCCCTTGCAGCTTCGGCGGAGTGTCTGTGATCACCCCTGGCACCAACACCAGCAATCAGGTGGCAGTGCTGTACCAGGACGTGAACTGTACCGAAGTGCCCGTGGCCATTCACGCCGATCAGCTGACACCTACATGGCGGGTGTACTCCACCGGCAGCAATGTGTTTCAGACCAGAGCCGGCTGTCTGATCGGAGCCGAGCACGTGAACAATAGCTACGAGTGCGACATCCCCATCGGCGCTGGCATCTGTGCCAGCTACCAGACACAGACAAACAGCCCCAGACGGGCCAGATCTGTGGCCAGCCAGAGCATCATTGCCTACACAATGTCTCTGGGCGCCGAGAACAGCGTGGCCTACTCCAACAACTCTATCGCTATCCCCACCAACTTCACCATCAGCGTGACCACAGAGATCCTGCCTGTGTCCATGACCAAGACCAGCGTGGACTGCACCATGTACATCTGCGGCGATTCCACCGAGTGCTCCAACCTGCTGCTGCAGTACGGCAGCTTCTGCACCCAGCTGAATAGAGCCCTGACAGGGATCGCCGTGGAACAGGACAAGAACACCCAAGAGGTGTTCGCCCAAGTGAAGCAGATCTACAAGACCCCTCCTATCAAGGACTTCGGCGGCTTCAATTTCAGCCAGATTCTGCCCGATCCTAGCAAGCCCAGCAAGCGGAGCTTCATCGAGGACCTGCTGTTCAACAAAGTGACACTGGCCGACGCCGGCTTCATCAAGCAGTATGGCGATTGTCTGGGCGACATTGCCGCCAGGGATCTGATTTGCGCCCAGAAGTTTAACGGACTGACAGTGCTGCCTCCTCTGCTGACCGATGAGATGATCGCCCAGTACACATCTGCCCTGCTGGCCGGCACAATCACAAGCGGCTGGACATTTGGAGCTGGCGCCGCTCTGCAGATCCCCTTTGCTATGCAGATGGCCTACCGGTTCAACGGCATCGGAGTGACCCAGAATGTGCTGTACGAGAACCAGAAGCTGATCGCCAACCAGTTCAACAGCGCCATCGGCAAGATCCAGGACAGCCTGAGCAGCACAGCAAGCGCCCTGGGAAAGCTGCAGGACGTGGTCAACCAGAATGCCCAGGCACTGAACACCCTGGTCAAGCAGCTGTCCTCCAACTTCGGCGCCATCAGCTCTGTGCTGAACGATATCCTGAGCAGACTGGACAAGGTGGAAGCCGAGGTGCAGATCGACAGACTGATCACCGGAAGGCTGCAGTCCCTGCAGACCTACGTTACCCAGCAGCTGATCAGAGCCGCCGAGATTAGAGCCTCTGCCAATCTGGCCGCCACCAAGATGTCTGAGTGTGTGCTGGGCCAGAGCAAGAGAGTGGACTTTTGCGGCAAGGGCTACCACCTGATGAGCTTCCCTCAGTCTGCCCCTCACGGCGTGGTGTTTCTGCACGTGACTTATGTGCCCGCTCAAGAGAAGAATTTCACCACCGCTCCAGCCATCTGCCACGACGGCAAAGCCCACTTTCCTAGAGAAGGCGTGTTCGTGTCCAACGGCACCCATTGGTTCGTGACACAGCGGAACTTCTACGAGCCCCAGATCATCACCACCGACAACACCTTCGTGTCTGGCAACTGCGACGTCGTGATCGGCATTGTGAACAATACCGTGTACGACCCTCTGCAGCCCGAGCTGGACAGCTTCAAAGAGGAACTGGACAAGTACTTTAAGAACCACACAAGCCCCGACGTGGACCTGGGCGATATCAGCGGAATCAATGCCAGCGTCGTGAACATCCAGAAAGAGATCGACCGGCTGAACGAGGTGGCCAAGAATCTGAACGAGAGCCTGATCGACCTGCAAGAACTGGGAAAATACGAGCAGTACATCAAGTGGCCTTGGTACATCTGGCTGGGCTTTATCGCCGGACTGATTGCCATCGTGATGGTCACAATCATGCTGTGTTGCATGACCAGCTGCTGTAGCTGCCTGAAGGGCTGTTGTAGCTGTGGCAGCTGCTGCAAGTTCGACGAGGACGATTCTGAGCCCGTGCTGAAGGGCGTGAAACTGCACTACACATGATAA
配列番号12、SMARRT-CoV2 1158にコード化された挿入のアミノ酸配列MFVFLVLLPLVSSQCVNLTTRTQLPPAYTNSFTRGVYYPDKVFRSSVLHSTQDLFLPFFSNVTWFHAIHVSGTNGTKRFDNPVLPFNDGVYFASTEKSNIIRGWIFGTTLDSKTQSLLIVNNATNVVIKVCEFQFCNDPFLGVYYHKNNKSWMESEFRVYSSANNCTFEYVSQPFLMDLEGKQGNFKNLREFVFKNIDGYFKIYSKHTPINLVRDLPQGFSALEPLVDLPIGINITRFQTLLALHRSYLTPGDSSSGWTAGAAAYYVGYLQPRTFLLKYNENGTITDAVDCALDPLSETKCTLKSFTVEKGIYQTSNFRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFNGLTGTGVLTESNKKFLPFQQFGRDIADTTDAVRDPQTLEILDITPCSFGGVSVITPGTNTSNQVAVLYQDVNCTEVPVAIHADQLTPTWRVYSTGSNVFQTRAGCLIGAEHVNNSYECDIPIGAGICASYQTQTNSPRRARSVASQSIIAYTMSLGAENSVAYSNNSIAIPTNFTISVTTEILPVSMTKTSVDCTMYICGDSTECSNLLLQYGSFCTQLNRALTGIAVEQDKNTQEVFAQVKQIYKTPPIKDFGGFNFSQILPDPSKPSKRSFIEDLLFNKVTLADAGFIKQYGDCLGDIAARDLICAQKFNGLTVLPPLLTDEMIAQYTSALLAGTITSGWTFGAGAALQIPFAMQMAYRFNGIGVTQNVLYENQKLIANQFNSAIGKIQDSLSSTASALGKLQDVVNQNAQALNTLVKQLSSNFGAISSVLNDILSRLDKVEAEVQIDRLITGRLQSLQTYVTQQLIRAAEIRASANLAATKMSECVLGQSKRVDFCGKGYHLMSFPQSAPHGVVFLHVTYVPAQEKNFTTAPAICHDGKAHFPREGVFVSNGTHWFVTQRNFYEPQIITTDNTFVSGNCDVVIGIVNNTVYDPLQPELDSFKEELDKYFKNHTSPDVDLGDISGINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQELGKYEQYIKWPWYIWLGFIAGLIAIVMVTIMLCCMTSCCSCLKGCCSCGSCCKFDEDDSEPVLKGVKLHYT**
配列番号13、SMARRT-CoV2 1159にコード化された挿入のヌクレオチド配列ATGTTCGTGTTTCTGGTGCTGCTGCCTCTGGTGTCCAGCCAATGCGTGAACCTGACCACAAGAACCCAGCTGCCTCCAGCCTACACCAACAGCTTTACCAGAGGCGTGTACTACCCCGACAAGGTGTTCAGATCCAGCGTGCTGCACTCTACCCAGGACCTGTTCCTGCCTTTCTTCAGCAACGTGACCTGGTTCCACGCCATCCACGTGTCCGGCACCAATGGCACCAAGAGATTCGACAACCCCGTGCTGCCCTTCAACGACGGGGTGTACTTTGCCAGCACCGAGAAGTCCAACATCATCAGAGGCTGGATCTTCGGCACCACACTGGACAGCAAGACCCAGAGCCTGCTGATCGTGAACAACGCCACCAACGTGGTCATCAAAGTGTGCGAGTTCCAGTTCTGCAACGACCCCTTCCTGGGCGTCTACTATCACAAGAACAACAAGAGCTGGATGGAAAGCGAGTTCCGGGTGTACAGCAGCGCCAACAACTGCACCTTTGAATACGTGTCCCAGCCTTTCCTGATGGACCTGGAAGGCAAGCAGGGCAACTTCAAGAACCTGCGCGAGTTCGTGTTCAAGAACATCGACGGCTACTTCAAGATCTACAGCAAGCACACCCCTATCAACCTCGTGCGGGATCTGCCTCAGGGCTTCTCTGCTCTGGAACCCCTGGTGGATCTGCCCATCGGCATCAACATCACCCGGTTTCAGACACTGCTGGCCCTGCACAGAAGCTACCTGACACCTGGCGATAGCAGCAGCGGATGGACAGCTGGTGCCGCCGCTTACTATGTGGGCTACCTGCAGCCTAGAACCTTTCTGCTGAAGTACAACGAGAACGGCACCATCACCGACGCCGTGGATTGTGCTCTGGATCCTCTGAGCGAGACAAAGTGCACCCTGAAGTCCTTCACCGTGGAAAAGGGCATCTACCAGACCAGCAACTTCCGGGTGCAGCCCACCGAATCCATCGTGCGGTTCCCCAATATCACCAATCTGTGCCCCTTCGGCGAGGTGTTCAATGCCACCAGATTCGCCTCTGTGTACGCCTGGAACCGGAAGCGGATCAGCAATTGCGTGGCCGACTACTCCGTGCTGTACAACTCCGCCAGCTTCAGCACCTTCAAGTGCTACGGCGTGTCCCCTACCAAGCTGAACGACCTGTGCTTCACAAACGTGTACGCCGACAGCTTCGTGATCCGGGGAGATGAAGTGCGGCAGATTGCCCCTGGACAGACTGGCAAGATCGCCGACTACAACTACAAGCTGCCCGACGACTTCACCGGCTGTGTGATTGCCTGGAACAGCAACAACCTGGACTCCAAAGTCGGCGGCAACTACAATTACCTGTACCGGCTGTTCCGGAAGTCCAATCTGAAGCCCTTCGAGCGGGACATCTCCACCGAGATCTATCAGGCCGGCAGCACCCCTTGTAACGGCGTGGAAGGCTTCAACTGCTACTTCCCACTGCAGTCCTACGGCTTTCAGCCCACAAATGGCGTGGGCTATCAGCCCTACAGAGTGGTGGTGCTGAGCTTCGAACTGCTGCATGCCCCTGCCACAGTGTGCGGCCCTAAGAAAAGCACCAATCTCGTGAAGAACAAATGCGTGAACTTCAACTTCAACGGCCTGACCGGCACCGGCGTGCTGACAGAGAGCAACAAGAAGTTCCTGCCATTCCAGCAGTTTGGCCGGGATATCGCCGATACCACAGACGCCGTTAGAGATCCCCAGACACTGGAAATCCTGGACATCACCCCTTGCAGCTTCGGCGGAGTGTCTGTGATCACCCCTGGCACCAACACCAGCAATCAGGTGGCAGTGCTGTACCAGGACGTGAACTGTACCGAAGTGCCCGTGGCCATTCACGCCGATCAGCTGACACCTACATGGCGGGTGTACTCCACCGGCAGCAATGTGTTTCAGACCAGAGCCGGCTGTCTGATCGGAGCCGAGCACGTGAACAATAGCTACGAGTGCGACATCCCCATCGGCGCTGGCATCTGTGCCAGCTACCAGACACAGACAAACAGCCCCAGCAGAGCCGGATCTGTGGCCAGCCAGAGCATCATTGCCTACACAATGTCTCTGGGCGCCGAGAACAGCGTGGCCTACTCCAACAACTCTATCGCTATCCCCACCAACTTCACCATCAGCGTGACCACAGAGATCCTGCCTGTGTCCATGACCAAGACCAGCGTGGACTGCACCATGTACATCTGCGGCGATTCCACCGAGTGCTCCAACCTGCTGCTGCAGTACGGCAGCTTCTGCACCCAGCTGAATAGAGCCCTGACAGGGATCGCCGTGGAACAGGACAAGAACACCCAAGAGGTGTTCGCCCAAGTGAAGCAGATCTACAAGACCCCTCCTATCAAGGACTTCGGCGGCTTCAATTTCAGCCAGATTCTGCCCGATCCTAGCAAGCCCAGCAAGCGGAGCTTCATCGAGGACCTGCTGTTCAACAAAGTGACACTGGCCGACGCCGGCTTCATCAAGCAGTATGGCGATTGTCTGGGCGACATTGCCGCCAGGGATCTGATTTGCGCCCAGAAGTTTAACGGACTGACAGTGCTGCCTCCTCTGCTGACCGATGAGATGATCGCCCAGTACACATCTGCCCTGCTGGCCGGCACAATCACAAGCGGCTGGACATTTGGAGCTGGCGCCGCTCTGCAGATCCCCTTTGCTATGCAGATGGCCTACCGGTTCAACGGCATCGGAGTGACCCAGAATGTGCTGTACGAGAACCAGAAGCTGATCGCCAACCAGTTCAACAGCGCCATCGGCAAGATCCAGGACAGCCTGAGCAGCACAGCAAGCGCCCTGGGAAAGCTGCAGGACGTGGTCAACCAGAATGCCCAGGCACTGAACACCCTGGTCAAGCAGCTGTCCTCCAACTTCGGCGCCATCAGCTCTGTGCTGAACGATATCCTGAGCAGACTGGACCCTCCTGAGGCCGAGGTGCAGATCGACAGACTGATCACCGGAAGGCTGCAGTCCCTGCAGACCTACGTTACCCAGCAGCTGATCAGAGCCGCCGAGATTAGAGCCTCTGCCAATCTGGCCGCCACCAAGATGTCTGAGTGTGTGCTGGGCCAGAGCAAGAGAGTGGACTTTTGCGGCAAGGGCTACCACCTGATGAGCTTCCCTCAGTCTGCCCCTCACGGCGTGGTGTTTCTGCACGTGACTTATGTGCCCGCTCAAGAGAAGAATTTCACCACCGCTCCAGCCATCTGCCACGACGGCAAAGCCCACTTTCCTAGAGAAGGCGTGTTCGTGTCCAACGGCACCCATTGGTTCGTGACACAGCGGAACTTCTACGAGCCCCAGATCATCACCACCGACAACACCTTCGTGTCTGGCAACTGCGACGTCGTGATCGGCATTGTGAACAATACCGTGTACGACCCTCTGCAGCCCGAGCTGGACAGCTTCAAAGAGGAACTGGACAAGTACTTTAAGAACCACACAAGCCCCGACGTGGACCTGGGCGATATCAGCGGAATCAATGCCAGCGTCGTGAACATCCAGAAAGAGATCGACCGGCTGAACGAGGTGGCCAAGAATCTGAACGAGAGCCTGATCGACCTGCAAGAACTGGGAAAATACGAGCAGTACATCAAGTGGCCTTGGTACATCTGGCTGGGCTTTATCGCCGGACTGATTGCCATCGTGATGGTCACAATCATGCTGTGTTGCATGACCAGCTGCTGTAGCTGCCTGAAGGGCTGTTGTAGCTGTGGCAGCTGCTGCAAGTTCGACGAGGACGATTCTGAGCCCGTGCTGAAGGGCGTGAAACTGCACTACACATGATAA
配列番号14、SMARRT-CoV2 1159にコード化された挿入のアミノ酸配列MFVFLVLLPLVSSQCVNLTTRTQLPPAYTNSFTRGVYYPDKVFRSSVLHSTQDLFLPFFSNVTWFHAIHVSGTNGTKRFDNPVLPFNDGVYFASTEKSNIIRGWIFGTTLDSKTQSLLIVNNATNVVIKVCEFQFCNDPFLGVYYHKNNKSWMESEFRVYSSANNCTFEYVSQPFLMDLEGKQGNFKNLREFVFKNIDGYFKIYSKHTPINLVRDLPQGFSALEPLVDLPIGINITRFQTLLALHRSYLTPGDSSSGWTAGAAAYYVGYLQPRTFLLKYNENGTITDAVDCALDPLSETKCTLKSFTVEKGIYQTSNFRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFNGLTGTGVLTESNKKFLPFQQFGRDIADTTDAVRDPQTLEILDITPCSFGGVSVITPGTNTSNQVAVLYQDVNCTEVPVAIHADQLTPTWRVYSTGSNVFQTRAGCLIGAEHVNNSYECDIPIGAGICASYQTQTNSPSRAGSVASQSIIAYTMSLGAENSVAYSNNSIAIPTNFTISVTTEILPVSMTKTSVDCTMYICGDSTECSNLLLQYGSFCTQLNRALTGIAVEQDKNTQEVFAQVKQIYKTPPIKDFGGFNFSQILPDPSKPSKRSFIEDLLFNKVTLADAGFIKQYGDCLGDIAARDLICAQKFNGLTVLPPLLTDEMIAQYTSALLAGTITSGWTFGAGAALQIPFAMQMAYRFNGIGVTQNVLYENQKLIANQFNSAIGKIQDSLSSTASALGKLQDVVNQNAQALNTLVKQLSSNFGAISSVLNDILSRLDPPEAEVQIDRLITGRLQSLQTYVTQQLIRAAEIRASANLAATKMSECVLGQSKRVDFCGKGYHLMSFPQSAPHGVVFLHVTYVPAQEKNFTTAPAICHDGKAHFPREGVFVSNGTHWFVTQRNFYEPQIITTDNTFVSGNCDVVIGIVNNTVYDPLQPELDSFKEELDKYFKNHTSPDVDLGDISGINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQELGKYEQYIKWPWYIWLGFIAGLIAIVMVTIMLCCMTSCCSCLKGCCSCGSCCKFDEDDSEPVLKGVKLHYT**
配列番号15、コロナウイルスに由来する短シグナルペプチドのコード配列
ATGTTCGTGTTTCTGGTGCTGCTGCCTCTGGTGTCCAGC
配列番号16、26S最小プロモータ
CTCTCTACGGCTAACCTGAATGGA
配列番号17、T7プロモータ
TAATACGACTCACTATAG
配列番号18、5-UTR
ATAGGCGGCGCATGAGAGAAGCCCAGACCAATTACCTACCCAAA
配列番号19、nsP1由来のα5’複製配列
TAGGAGAAAGTTCACGTTGACATCGAGGAAGACAGCCCATTCCTCAGAGCTTTGCAGCGGAGCTTCCCGCAGTTTGAGGTAGAAGCCAAGCAGGTCACTGATAATGACCATGCTAATGCCAGAGCGTTTTCGCATCTGGCTTCAAAACTGATCGAAACGGAGGTGGACCCATCCGACACGATCCTTGACATTGGA
配列番号20、gDLP
ATAGTCAGCATAGTACATTTCATCTGACTAATACTACAACACCACCACCATGAATAGAGGATTCTTTAACATGCTCGGCCGCCGCCCCTTCCCGGCCCCCACTGCCATGTGGAGGCCGCGGAGAAGGAGGCAGGCGGCCCCG
配列番号21、P2A
GGAAGCGGAGCTACTAACTTCAGCCTGCTGAAGCAGGCTGGAGACGTGGAGGAGAACCCTGGACCT
配列番号22、P2A
GSGATNFSLLKQAGDVEENPGP
配列番号23、gDLP、P2A及びnsp1~3の3’部分をコードするDLP nsp ORF
ATGAATAGAGGATTCTTTAACATGCTCGGCCGCCGCCCCTTCCCGGCCCCCACTGCCATGTGGAGGCCGCGGAGAAGGAGGCAGGCGGCCCCGGGAAGCGGAGCTACTAACTTCAGCCTGCTGAAGCAGGCTGGAGACGTGGAGGAGAACCCTGGACCTGAGAAAGTTCACGTTGACATCGAGGAAGACAGCCCATTCCTCAGAGCTTTGCAGCGGAGCTTCCCGCAGTTTGAGGTAGAAGCCAAGCAGGTCACTGATAATGACCATGCTAATGCCAGAGCGTTTTCGCATCTGGCTTCAAAACTGATCGAAACGGAGGTGGACCCATCCGACACGATCCTTGACATTGGAAGTGCGCCCGCCCGCAGAATGTATTCTAAGCACAAGTATCATTGTATCTGTCCGATGAGATGTGCGGAAGATCCGGACAGATTGTATAAGTATGCAACTAAGCTGAAGAAAAACTGTAAGGAAATAACTGATAAGGAATTGGACAAGAAAATGAAGGAGCTCGCCGCCGTCATGAGCGACCCTGACCTGGAAACTGAGACTATGTGCCTCCACGACGACGAGTCGTGTCGCTACGAAGGGCAAGTCGCTGTTTACCAGGATGTATACGCGGTTGACGGACCGACAAGTCTCTATCACCAAGCCAATAAGGGAGTTAGAGTCGCCTACTGGATAGGCTTTGACACCACCCCTTTTATGTTTAAGAACTTGGCTGGAGCATATCCATCATACTCTACCAACTGGGCCGACGAAACCGTGTTAACGGCTCGTAACATAGGCCTATGCAGCTCTGACGTTATGGAGCGGTCACGTAGAGGGATGTCCATTCTTAGAAAGAAGTATTTGAAACCATCCAACAATGTTCTATTCTCTGTTGGCTCGACCATCTACCACGAGAAGAGGGACTTACTGAGGAGCTGGCACCTGCCGTCTGTATTTCACTTACGTGGCAAGCAAAATTACACATGTCGGTGTGAGACTATAGTTAGTTGCGACGGGTACGTCGTTAAAAGAATAGCTATCAGTCCAGGCCTGTATGGGAAGCCTTCAGGCTATGCTGCTACGATGCACCGCGAGGGATTCTTGTGCTGCAAAGTGACAGACACATTGAACGGGGAGAGGGTCTCTTTTCCCGTGTGCACGTATGTGCCAGCTACATTGTGTGACCAAATGACTGGCATACTGGCAACAGATGTCAGTGCGGACGACGCGCAAAAACTGCTGGTTGGGCTCAACCAGCGTATAGTCGTCAACGGTCGCACCCAGAGAAACACCAATACCATGAAAAATTACCTTTTGCCCGTAGTGGCCCAGGCATTTGCTAGGTGGGCAAAGGAATATAAGGAAGATCAAGAAGATGAAAGGCCACTAGGACTACGAGATAGACAGTTAGTCATGGGGTGTTGTTGGGCTTTTAGAAGGCACAAGATAACATCTATTTATAAGCGCCCGGATACCCAAACCATCATCAAAGTGAACAGCGATTTCCACTCATTCGTGCTGCCCAGGATAGGCAGTAACACATTGGAGATCGGGCTGAGAACAAGAATCAGGAAAATGTTAGAGGAGCACAAGGAGCCGTCACCTCTCATTACCGCCGAGGACGTACAAGAAGCTAAGTGCGCAGCCGATGAGGCTAAGGAGGTGCGTGAAGCCGAGGAGTTGCGCGCAGCTCTACCACCTTTGGCAGCTGATGTTGAGGAGCCCACTCTGGAAGCCGATGTCGACTTGATGTTACAAGAGGCTGGGGCCGGCTCAGTGGAGACACCTCGTGGCTTGATAAAGGTTACCAGCTACGATGGCGAGGACAAGATCGGCTCTTACGCTGTGCTTTCTCCGCAGGCTGTACTCAAGAGTGAAAAATTATCTTGCATCCACCCTCTCGCTGAACAAGTCATAGTGATAACACACTCTGGCCGAAAAGGGCGTTATGCCGTGGAACCATACCATGGTAAAGTAGTGGTGCCAGAGGGACATGCAATACCCGTCCAGGACTTTCAAGCTCTGAGTGAAAGTGCCACCATTGTGTACAACGAACGTGAGTTCGTAAACAGGTACCTGCACCATATTGCCACACATGGAGGAGCGCTGAACACTGATGAAGAATATTACAAAACTGTCAAGCCCAGCGAGCACGACGGCGAATACCTGTACGACATCGACAGGAAACAGTGCGTCAAGAAAGAACTAGTCACTGGGCTAGGGCTCACAGGCGAGCTGGTGGATCCTCCCTTCCATGAATTCGCCTACGAGAGTCTGAGAACACGACCAGCCGCTCCTTACCAAGTACCAACCATAGGGGTGTATGGCGTGCCAGGATCAGGCAAGTCTGGCATCATTAAAAGCGCAGTCACCAAAAAAGATCTAGTGGTGAGCGCCAAGAAAGAAAACTGTGCAGAAATTATAAGGGACGTCAAGAAAATGAAAGGGCTGGACGTCAATGCCAGAACTGTGGACTCAGTGCTCTTGAATGGATGCAAACACCCCGTAGAGACCCTGTATATTGACGAAGCTTTTGCTTGTCATGCAGGTACTCTCAGAGCGCTCATAGCCATTATAAGACCTAAAAAGGCAGTGCTCTGCGGGGATCCCAAACAGTGCGGTTTTTTTAACATGATGTGCCTGAAAGTGCATTTTAACCACGAGATTTGCACACAAGTCTTCCACAAAAGCATCTCTCGCCGTTGCACTAAATCTGTGACTTCGGTCGTCTCAACCTTGTTTTACGACAAAAAAATGAGAACGACGAATCCGAAAGAGACTAAGATTGTGATTGACACTACCGGCAGTACCAAACCTAAGCAGGACGATCTCATTCTCACTTGTTTCAGAGGGTGGGTGAAGCAGTTGCAAATAGATTACAAAGGCAACGAAATAATGACGGCAGCTGCCTCTCAAGGGCTGACCCGTAAAGGTGTGTATGCCGTTCGGTACAAGGTGAATGAAAATCCTCTGTACGCACCCACCTCTGAACATGTGAACGTCCTACTGACCCGCACGGAGGACCGCATCGTGTGGAAAACACTAGCCGGCGACCCATGGATAAAAACACTGACTGCCAAGTACCCTGGGAATTTCACTGCCACGATAGAGGAGTGGCAAGCAGAGCATGATGCCATCATGAGGCACATCTTGGAGAGACCGGACCCTACCGACGTCTTCCAGAATAAGGCAAACGTGTGTTGGGCCAAGGCTTTAGTGCCGGTGCTGAAGACCGCTGGCATAGACATGACCACTGAACAATGGAACACTGTGGATTATTTTGAAACGGACAAAGCTCACTCAGCAGAGATAGTATTGAACCAACTATGCGTGAGGTTCTTTGGACTCGATCTGGACTCCGGTCTATTTTCTGCACCCACTGTTCCGTTATCCATTAGGAATAATCACTGGGATAACTCCCCGTCGCCTAACATGTACGGGCTGAATAAAGAAGTGGTCCGTCAGCTCTCTCGCAGGTACCCACAACTGCCTCGGGCAGTTGCCACTGGAAGAGTCTATGACATGAACACTGGTACACTGCGCAATTATGATCCGCGCATAAACCTAGTACCTGTAAACAGAAGACTGCCTCATGCTTTAGTCCTCCACCATAATGAACACCCACAGAGTGACTTTTCTTCATTCGTCAGCAAATTGAAGGGCAGAACTGTCCTGGTGGTCGGGGAAAAGTTGTCCGTCCCAGGCAAAATGGTTGACTGGTTGTCAGACCGGCCTGAGGCTACCTTCAGAGCTCGGCTGGATTTAGGCATCCCAGGTGATGTGCCCAAATATGACATAATATTTGTTAATGTGAGGACCCCATATAAATACCATCACTATCAGCAGTGTGAAGACCATGCCATTAAGCTTAGCATGTTGACCAAGAAAGCTTGTCTGCATCTGAATCCCGGCGGAACCTGTGTCAGCATAGGTTATGGTTACGCTGACAGGGCCAGCGAAAGCATCATTGGTGCTATAGCGCGGCAGTTCAAGTTTTCCCGGGTATGCAAACCGAAATCCTCACTTGAAGAGACGGAAGTTCTGTTTGTATTCATTGGGTACGATCGCAAGGCCCGTACGCACAATCCTTACAAGCTTTCATCAACCTTGACCAACATTTATACAGGTTCCAGACTCCACGAAGCCGGATGTGCACCCTCATATCATGTGGTGCGAGGGGATATTGCCACGGCCACCGAAGGAGTGATTATAAATGCTGCTAACAGCAAAGGACAACCTGGCGGAGGGGTGTGCGGAGCGCTGTATAAGAAATTCCCGGAAAGCTTCGATTTACAGCCGATCGAAGTAGGAAAAGCGCGACTGGTCAAAGGTGCAGCTAAACATATCATTCATGCCGTAGGACCAAACTTCAACAAAGTTTCGGAGGTTGAAGGTGACAAACAGTTGGCAGAGGCTTATGAGTCCATCGCTAAGATTGTCAACGATAACAATTACAAGTCAGTAGCGATTCCACTGTTGTCCACCGGCATCTTTTCCGGGAACAAAGATCGACTAACCCAATCATTGAACCATTTGCTGACAGCTTTAGACACCACTGATGCAGATGTAGCCATATACTGCAGGGACAAGAAATGGGAAATGACTCTCAAGGAAGCAGTGGCTAGGAGAGAAGCAGTGGAGGAGATATGCATATCCGACGACTCTTCAGTGACAGAACCTGATGCAGAGCTGGTGAGGGTGCATCCGAAGAGTTCTTTGGCTGGAAGGAAGGGCTACAGCACAAGCGATGGCAAAACTTTCTCATATTTGGAAGGGACCAAGTTTCACCAGGCGGCCAAGGATATAGCAGAAATTAATGCCATGTGGCCCGTTGCAACGGAGGCCAATGAGCAGGTATGCATGTATATCCTCGGAGAAAGCATGAGCAGTATTAGGTCGAAATGCCCCGTCGAAGAGTCGGAAGCCTCCACACCACCTAGCACGCTGCCTTGCTTGTGCATCCATGCCATGACTCCAGAAAGAGTACAGCGCCTAAAAGCCTCACGTCCAGAACAAATTACTGTGTGCTCATCCTTTCCATTGCCGAAGTATAGAATCACTGGTGTGCAGAAGATCCAATGCTCCCAGCCTATATTGTTCTCACCGAAAGTGCCTGCGTATATTCATCC
AAGGAAGTATCTCGTGGAAACACCACCGGTAGACGAGACTCCGGAGCCATCGGCAGAGAACCAATCCACAGAGGGGACACCTGAACAACCACCACTTATAACCGAGGATGAGACCAGGACTAGAACGCCTGAGCCGATCATCATCGAAGAGGAAGAAGAGGATAGCATAAGTTTGCTGTCAGATGGCCCGACCCACCAGGTGCTGCAAGTCGAGGCAGACATTCACGGGCCGCCCTCTGTATCTAGCTCATCCTGGTCCATTCCTCATGCATCCGACTTTGATGTGGACAGTTTATCCATACTTGACACCCTGGAGGGAGCTAGCGTGACCAGCGGGGCAACGTCAGCCGAGACTAACTCTTACTTCGCAAAGAGTATGGAGTTTCTGGCGCGACCGGTGCCTGCGCCTCGAACAGTATTCAGGAACCCTCCACATCCCGCTCCGCGCACAAGAACACCGTCACTTGCACCCAGCAGGGCCTGCTCGAGAACCAGCCTAGTTTCCACCCCGCCAGGCGTGAATAGGGTGATCACTAGAGAGGAGCTCGAGGCGCTTACCCCGTCACGCACTCCTAGCAGGTCGGTCTCGAGAACCAGCCTGGTCTCCAACCCGCCAGGCGTAAATAGGGTGATTACAAGAGAGGAGTTTGAGGCGTTCGTAGCACAACAACAATGA
配列番号24、nsp1コード配列
GAGAAAGTTCACGTTGACATCGAGGAAGACAGCCCATTCCTCAGAGCTTTGCAGCGGAGCTTCCCGCAGTTTGAGGTAGAAGCCAAGCAGGTCACTGATAATGACCATGCTAATGCCAGAGCGTTTTCGCATCTGGCTTCAAAACTGATCGAAACGGAGGTGGACCCATCCGACACGATCCTTGACATTGGAAGTGCGCCCGCCCGCAGAATGTATTCTAAGCACAAGTATCATTGTATCTGTCCGATGAGATGTGCGGAAGATCCGGACAGATTGTATAAGTATGCAACTAAGCTGAAGAAAAACTGTAAGGAAATAACTGATAAGGAATTGGACAAGAAAATGAAGGAGCTCGCCGCCGTCATGAGCGACCCTGACCTGGAAACTGAGACTATGTGCCTCCACGACGACGAGTCGTGTCGCTACGAAGGGCAAGTCGCTGTTTACCAGGATGTATACGCGGTTGACGGACCGACAAGTCTCTATCACCAAGCCAATAAGGGAGTTAGAGTCGCCTACTGGATAGGCTTTGACACCACCCCTTTTATGTTTAAGAACTTGGCTGGAGCATATCCATCATACTCTACCAACTGGGCCGACGAAACCGTGTTAACGGCTCGTAACATAGGCCTATGCAGCTCTGACGTTATGGAGCGGTCACGTAGAGGGATGTCCATTCTTAGAAAGAAGTATTTGAAACCATCCAACAATGTTCTATTCTCTGTTGGCTCGACCATCTACCACGAGAAGAGGGACTTACTGAGGAGCTGGCACCTGCCGTCTGTATTTCACTTACGTGGCAAGCAAAATTACACATGTCGGTGTGAGACTATAGTTAGTTGCGACGGGTACGTCGTTAAAAGAATAGCTATCAGTCCAGGCCTGTATGGGAAGCCTTCAGGCTATGCTGCTACGATGCACCGCGAGGGATTCTTGTGCTGCAAAGTGACAGACACATTGAACGGGGAGAGGGTCTCTTTTCCCGTGTGCACGTATGTGCCAGCTACATTGTGTGACCAAATGACTGGCATACTGGCAACAGATGTCAGTGCGGACGACGCGCAAAAACTGCTGGTTGGGCTCAACCAGCGTATAGTCGTCAACGGTCGCACCCAGAGAAACACCAATACCATGAAAAATTACCTTTTGCCCGTAGTGGCCCAGGCATTTGCTAGGTGGGCAAAGGAATATAAGGAAGATCAAGAAGATGAAAGGCCACTAGGACTACGAGATAGACAGTTAGTCATGGGGTGTTGTTGGGCTTTTAGAAGGCACAAGATAACATCTATTTATAAGCGCCCGGATACCCAAACCATCATCAAAGTGAACAGCGATTTCCACTCATTCGTGCTGCCCAGGATAGGCAGTAACACATTGGAGATCGGGCTGAGAACAAGAATCAGGAAAATGTTAGAGGAGCACAAGGAGCCGTCACCTCTCATTACCGCCGAGGACGTACAAGAAGCTAAGTGCGCAGCCGATGAGGCTAAGGAGGTGCGTGAAGCCGAGGAGTTGCGCGCAGCTCTACCACCTTTGGCAGCTGATGTTGAGGAGCCCACTCTGGAAGCCGATGTCGACTTGATGTTACAAGAGGCTGGGGCC
配列番号25、nsp2コード配列
GGCTCAGTGGAGACACCTCGTGGCTTGATAAAGGTTACCAGCTACGATGGCGAGGACAAGATCGGCTCTTACGCTGTGCTTTCTCCGCAGGCTGTACTCAAGAGTGAAAAATTATCTTGCATCCACCCTCTCGCTGAACAAGTCATAGTGATAACACACTCTGGCCGAAAAGGGCGTTATGCCGTGGAACCATACCATGGTAAAGTAGTGGTGCCAGAGGGACATGCAATACCCGTCCAGGACTTTCAAGCTCTGAGTGAAAGTGCCACCATTGTGTACAACGAACGTGAGTTCGTAAACAGGTACCTGCACCATATTGCCACACATGGAGGAGCGCTGAACACTGATGAAGAATATTACAAAACTGTCAAGCCCAGCGAGCACGACGGCGAATACCTGTACGACATCGACAGGAAACAGTGCGTCAAGAAAGAACTAGTCACTGGGCTAGGGCTCACAGGCGAGCTGGTGGATCCTCCCTTCCATGAATTCGCCTACGAGAGTCTGAGAACACGACCAGCCGCTCCTTACCAAGTACCAACCATAGGGGTGTATGGCGTGCCAGGATCAGGCAAGTCTGGCATCATTAAAAGCGCAGTCACCAAAAAAGATCTAGTGGTGAGCGCCAAGAAAGAAAACTGTGCAGAAATTATAAGGGACGTCAAGAAAATGAAAGGGCTGGACGTCAATGCCAGAACTGTGGACTCAGTGCTCTTGAATGGATGCAAACACCCCGTAGAGACCCTGTATATTGACGAAGCTTTTGCTTGTCATGCAGGTACTCTCAGAGCGCTCATAGCCATTATAAGACCTAAAAAGGCAGTGCTCTGCGGGGATCCCAAACAGTGCGGTTTTTTTAACATGATGTGCCTGAAAGTGCATTTTAACCACGAGATTTGCACACAAGTCTTCCACAAAAGCATCTCTCGCCGTTGCACTAAATCTGTGACTTCGGTCGTCTCAACCTTGTTTTACGACAAAAAAATGAGAACGACGAATCCGAAAGAGACTAAGATTGTGATTGACACTACCGGCAGTACCAAACCTAAGCAGGACGATCTCATTCTCACTTGTTTCAGAGGGTGGGTGAAGCAGTTGCAAATAGATTACAAAGGCAACGAAATAATGACGGCAGCTGCCTCTCAAGGGCTGACCCGTAAAGGTGTGTATGCCGTTCGGTACAAGGTGAATGAAAATCCTCTGTACGCACCCACCTCTGAACATGTGAACGTCCTACTGACCCGCACGGAGGACCGCATCGTGTGGAAAACACTAGCCGGCGACCCATGGATAAAAACACTGACTGCCAAGTACCCTGGGAATTTCACTGCCACGATAGAGGAGTGGCAAGCAGAGCATGATGCCATCATGAGGCACATCTTGGAGAGACCGGACCCTACCGACGTCTTCCAGAATAAGGCAAACGTGTGTTGGGCCAAGGCTTTAGTGCCGGTGCTGAAGACCGCTGGCATAGACATGACCACTGAACAATGGAACACTGTGGATTATTTTGAAACGGACAAAGCTCACTCAGCAGAGATAGTATTGAACCAACTATGCGTGAGGTTCTTTGGACTCGATCTGGACTCCGGTCTATTTTCTGCACCCACTGTTCCGTTATCCATTAGGAATAATCACTGGGATAACTCCCCGTCGCCTAACATGTACGGGCTGAATAAAGAAGTGGTCCGTCAGCTCTCTCGCAGGTACCCACAACTGCCTCGGGCAGTTGCCACTGGAAGAGTCTATGACATGAACACTGGTACACTGCGCAATTATGATCCGCGCATAAACCTAGTACCTGTAAACAGAAGACTGCCTCATGCTTTAGTCCTCCACCATAATGAACACCCACAGAGTGACTTTTCTTCATTCGTCAGCAAATTGAAGGGCAGAACTGTCCTGGTGGTCGGGGAAAAGTTGTCCGTCCCAGGCAAAATGGTTGACTGGTTGTCAGACCGGCCTGAGGCTACCTTCAGAGCTCGGCTGGATTTAGGCATCCCAGGTGATGTGCCCAAATATGACATAATATTTGTTAATGTGAGGACCCCATATAAATACCATCACTATCAGCAGTGTGAAGACCATGCCATTAAGCTTAGCATGTTGACCAAGAAAGCTTGTCTGCATCTGAATCCCGGCGGAACCTGTGTCAGCATAGGTTATGGTTACGCTGACAGGGCCAGCGAAAGCATCATTGGTGCTATAGCGCGGCAGTTCAAGTTTTCCCGGGTATGCAAACCGAAATCCTCACTTGAAGAGACGGAAGTTCTGTTTGTATTCATTGGGTACGATCGCAAGGCCCGTACGCACAATCCTTACAAGCTTTCATCAACCTTGACCAACATTTATACAGGTTCCAGACTCCACGAAGCCGGATGT
配列番号26、nsp3コード配列
GCACCCTCATATCATGTGGTGCGAGGGGATATTGCCACGGCCACCGAAGGAGTGATTATAAATGCTGCTAACAGCAAAGGACAACCTGGCGGAGGGGTGTGCGGAGCGCTGTATAAGAAATTCCCGGAAAGCTTCGATTTACAGCCGATCGAAGTAGGAAAAGCGCGACTGGTCAAAGGTGCAGCTAAACATATCATTCATGCCGTAGGACCAAACTTCAACAAAGTTTCGGAGGTTGAAGGTGACAAACAGTTGGCAGAGGCTTATGAGTCCATCGCTAAGATTGTCAACGATAACAATTACAAGTCAGTAGCGATTCCACTGTTGTCCACCGGCATCTTTTCCGGGAACAAAGATCGACTAACCCAATCATTGAACCATTTGCTGACAGCTTTAGACACCACTGATGCAGATGTAGCCATATACTGCAGGGACAAGAAATGGGAAATGACTCTCAAGGAAGCAGTGGCTAGGAGAGAAGCAGTGGAGGAGATATGCATATCCGACGACTCTTCAGTGACAGAACCTGATGCAGAGCTGGTGAGGGTGCATCCGAAGAGTTCTTTGGCTGGAAGGAAGGGCTACAGCACAAGCGATGGCAAAACTTTCTCATATTTGGAAGGGACCAAGTTTCACCAGGCGGCCAAGGATATAGCAGAAATTAATGCCATGTGGCCCGTTGCAACGGAGGCCAATGAGCAGGTATGCATGTATATCCTCGGAGAAAGCATGAGCAGTATTAGGTCGAAATGCCCCGTCGAAGAGTCGGAAGCCTCCACACCACCTAGCACGCTGCCTTGCTTGTGCATCCATGCCATGACTCCAGAAAGAGTACAGCGCCTAAAAGCCTCACGTCCAGAACAAATTACTGTGTGCTCATCCTTTCCATTGCCGAAGTATAGAATCACTGGTGTGCAGAAGATCCAATGCTCCCAGCCTATATTGTTCTCACCGAAAGTGCCTGCGTATATTCATCCAAGGAAGTATCTCGTGGAAACACCACCGGTAGACGAGACTCCGGAGCCATCGGCAGAGAACCAATCCACAGAGGGGACACCTGAACAACCACCACTTATAACCGAGGATGAGACCAGGACTAGAACGCCTGAGCCGATCATCATCGAAGAGGAAGAAGAGGATAGCATAAGTTTGCTGTCAGATGGCCCGACCCACCAGGTGCTGCAAGTCGAGGCAGACATTCACGGGCCGCCCTCTGTATCTAGCTCATCCTGGTCCATTCCTCATGCATCCGACTTTGATGTGGACAGTTTATCCATACTTGACACCCTGGAGGGAGCTAGCGTGACCAGCGGGGCAACGTCAGCCGAGACTAACTCTTACTTCGCAAAGAGTATGGAGTTTCTGGCGCGACCGGTGCCTGCGCCTCGAACAGTATTCAGGAACCCTCCACATCCCGCTCCGCGCACAAGAACACCGTCACTTGCACCCAGCAGGGCCTGCTCGAGAACCAGCCTAGTTTCCACCCCGCCAGGCGTGAATAGGGTGATCACTAGAGAGGAGCTCGAGGCGCTTACCCCGTCACGCACTCCTAGCAGGTCGGTCTCGAGAACCAGCCTGGTCTCCAACCCGCCAGGCGTAAATAGGGTGATTACAAGAGAGGAGTTTGAGGCGTTCGTAGCACAACAACAATGACGGTTTGATGCGGGTGCA
配列番号27、nsp4コード配列
TACATCTTTTCCTCCGACACCGGTCAAGGGCATTTACAACAAAAATCAGTAAGGCAAACGGTGCTATCCGAAGTGGTGTTGGAGAGGACCGAATTGGAGATTTCGTATGCCCCGCGCCTCGACCAAGAAAAAGAAGAATTACTACGCAAGAAATTACAGTTAAATCCCACACCTGCTAACAGAAGCAGATACCAGTCCAGGAAGGTGGAGAACATGAAAGCCATAACAGCTAGACGTATTCTGCAAGGCCTAGGGCATTATTTGAAGGCAGAAGGAAAAGTGGAGTGCTACCGAACCCTGCATCCTGTTCCTTTGTATTCATCTAGTGTGAACCGTGCCTTTTCAAGCCCCAAGGTCGCAGTGGAAGCCTGTAACGCCATGTTGAAAGAGAACTTTCCGACTGTGGCTTCTTACTGTATTATTCCAGAGTACGATGCCTATTTGGACATGGTTGACGGAGCTTCATGCTGCTTAGACACTGCCAGTTTTTGCCCTGCAAAGCTGCGCAGCTTTCCAAAGAAACACTCCTATTTGGAACCCACAATACGATCGGCAGTGCCTTCAGCGATCCAGAACACGCTCCAGAACGTCCTGGCAGCTGCCACAAAAAGAAATTGCAATGTCACGCAAATGAGAGAATTGCCCGTATTGGATTCGGCGGCCTTTAATGTGGAATGCTTCAAGAAATATGCGTGTAATAATGAATATTGGGAAACGTTTAAAGAAAACCCCATCAGGCTTACTGAAGAAAACGTGGTAAATTACATTACCAAATTAAAAGGACCAAAAGCTGCTGCTCTTTTTGCGAAGACACATAATTTGAATATGTTGCAGGACATACCAATGGACAGGTTTGTAATGGACTTAAAGAGAGACGTGAAAGTGACTCCAGGAACAAAACATACTGAAGAACGGCCCAAGGTACAGGTGATCCAGGCTGCCGATCCGCTAGCAACAGCGTATCTGTGCGGAATCCACCGAGAGCTGGTTAGGAGATTAAATGCGGTCCTGCTTCCGAACATTCATACACTGTTTGATATGTCGGCTGAAGACTTTGACGCTATTATAGCCGAGCACTTCCAGCCTGGGGATTGTGTTCTGGAAACTGACATCGCGTCGTTTGATAAAAGTGAGGACGACGCCATGGCTCTGACCGCGTTAATGATTCTGGAAGACTTAGGTGTGGACGCAGAGCTGTTGACGCTGATTGAGGCGGCTTTCGGCGAAATTTCATCAATACATTTGCCCACTAAAACTAAATTTAAATTCGGAGCCATGATGAAATCTGGAATGTTCCTCACACTGTTTGTGAACACAGTCATTAACATTGTAATCGCAAGCAGAGTGTTGAGAGAACGGCTAACCGGATCACCATGTGCAGCATTCATTGGAGATGACAATATCGTGAAAGGAGTCAAATCGGACAAATTAATGGCAGACAGGTGCGCCACCTGGTTGAATATGGAAGTCAAGATTATAGATGCTGTGGTGGGCGAGAAAGCGCCTTATTTCTGTGGAGGGTTTATTTTGTGTGACTCCGTGACCGGCACAGCGTGCCGTGTGGCAGACCCCCTAAAAAGGCTGTTTAAGCTTGGCAAACCTCTGGCAGCAGACGATGAACATGATGATGACAGGAGAAGGGCATTGCATGAAGAGTCAACACGCTGGAACCGAGTGGGTATTCTTTCAGAGCTGTGCAAGGCAGTAGAATCAAGGTATGAAACCGTAGGAACTTCCATCATAGTTATGGCCATGACTACTCTAGCTAGCAGTGTTAAATCATTCAGCTACCTGAGAGGGGCCCCTATAACTCTCTACGGC
配列番号28、3’-UTR
ATACAGCAGCAATTGGCAAGCTGCTTACATAGAACTCGCGGCGATTGGCATGCCGCTTTAAAATTTTTATTTTATTTTTCTTTTCTTTTCCGAATCGGATTTTGTTTTTAATATTTC
配列番号29、ポリA部位
AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA
配列番号30、SMARRT_CoV2ワクチン1158
GATAGGCGGCGCATGAGAGAAGCCCAGACCAATTACCTACCCAAATAGGAGAAAGTTCACGTTGACATCGAGGAAGACAGCCCATTCCTCAGAGCTTTGCAGCGGAGCTTCCCGCAGTTTGAGGTAGAAGCCAAGCAGGTCACTGATAATGACCATGCTAATGCCAGAGCGTTTTCGCATCTGGCTTCAAAACTGATCGAAACGGAGGTGGACCCATCCGACACGATCCTTGACATTGGAATAGTCAGCATAGTACATTTCATCTGACTAATACTACAACACCACCACCATGAATAGAGGATTCTTTAACATGCTCGGCCGCCGCCCCTTCCCGGCCCCCACTGCCATGTGGAGGCCGCGGAGAAGGAGGCAGGCGGCCCCGGGAAGCGGAGCTACTAACTTCAGCCTGCTGAAGCAGGCTGGAGACGTGGAGGAGAACCCTGGACCTGAGAAAGTTCACGTTGACATCGAGGAAGACAGCCCATTCCTCAGAGCTTTGCAGCGGAGCTTCCCGCAGTTTGAGGTAGAAGCCAAGCAGGTCACTGATAATGACCATGCTAATGCCAGAGCGTTTTCGCATCTGGCTTCAAAACTGATCGAAACGGAGGTGGACCCATCCGACACGATCCTTGACATTGGAAGTGCGCCCGCCCGCAGAATGTATTCTAAGCACAAGTATCATTGTATCTGTCCGATGAGATGTGCGGAAGATCCGGACAGATTGTATAAGTATGCAACTAAGCTGAAGAAAAACTGTAAGGAAATAACTGATAAGGAATTGGACAAGAAAATGAAGGAGCTCGCCGCCGTCATGAGCGACCCTGACCTGGAAACTGAGACTATGTGCCTCCACGACGACGAGTCGTGTCGCTACGAAGGGCAAGTCGCTGTTTACCAGGATGTATACGCGGTTGACGGACCGACAAGTCTCTATCACCAAGCCAATAAGGGAGTTAGAGTCGCCTACTGGATAGGCTTTGACACCACCCCTTTTATGTTTAAGAACTTGGCTGGAGCATATCCATCATACTCTACCAACTGGGCCGACGAAACCGTGTTAACGGCTCGTAACATAGGCCTATGCAGCTCTGACGTTATGGAGCGGTCACGTAGAGGGATGTCCATTCTTAGAAAGAAGTATTTGAAACCATCCAACAATGTTCTATTCTCTGTTGGCTCGACCATCTACCACGAGAAGAGGGACTTACTGAGGAGCTGGCACCTGCCGTCTGTATTTCACTTACGTGGCAAGCAAAATTACACATGTCGGTGTGAGACTATAGTTAGTTGCGACGGGTACGTCGTTAAAAGAATAGCTATCAGTCCAGGCCTGTATGGGAAGCCTTCAGGCTATGCTGCTACGATGCACCGCGAGGGATTCTTGTGCTGCAAAGTGACAGACACATTGAACGGGGAGAGGGTCTCTTTTCCCGTGTGCACGTATGTGCCAGCTACATTGTGTGACCAAATGACTGGCATACTGGCAACAGATGTCAGTGCGGACGACGCGCAAAAACTGCTGGTTGGGCTCAACCAGCGTATAGTCGTCAACGGTCGCACCCAGAGAAACACCAATACCATGAAAAATTACCTTTTGCCCGTAGTGGCCCAGGCATTTGCTAGGTGGGCAAAGGAATATAAGGAAGATCAAGAAGATGAAAGGCCACTAGGACTACGAGATAGACAGTTAGTCATGGGGTGTTGTTGGGCTTTTAGAAGGCACAAGATAACATCTATTTATAAGCGCCCGGATACCCAAACCATCATCAAAGTGAACAGCGATTTCCACTCATTCGTGCTGCCCAGGATAGGCAGTAACACATTGGAGATCGGGCTGAGAACAAGAATCAGGAAAATGTTAGAGGAGCACAAGGAGCCGTCACCTCTCATTACCGCCGAGGACGTACAAGAAGCTAAGTGCGCAGCCGATGAGGCTAAGGAGGTGCGTGAAGCCGAGGAGTTGCGCGCAGCTCTACCACCTTTGGCAGCTGATGTTGAGGAGCCCACTCTGGAAGCCGATGTCGACTTGATGTTACAAGAGGCTGGGGCCGGCTCAGTGGAGACACCTCGTGGCTTGATAAAGGTTACCAGCTACGATGGCGAGGACAAGATCGGCTCTTACGCTGTGCTTTCTCCGCAGGCTGTACTCAAGAGTGAAAAATTATCTTGCATCCACCCTCTCGCTGAACAAGTCATAGTGATAACACACTCTGGCCGAAAAGGGCGTTATGCCGTGGAACCATACCATGGTAAAGTAGTGGTGCCAGAGGGACATGCAATACCCGTCCAGGACTTTCAAGCTCTGAGTGAAAGTGCCACCATTGTGTACAACGAACGTGAGTTCGTAAACAGGTACCTGCACCATATTGCCACACATGGAGGAGCGCTGAACACTGATGAAGAATATTACAAAACTGTCAAGCCCAGCGAGCACGACGGCGAATACCTGTACGACATCGACAGGAAACAGTGCGTCAAGAAAGAACTAGTCACTGGGCTAGGGCTCACAGGCGAGCTGGTGGATCCTCCCTTCCATGAATTCGCCTACGAGAGTCTGAGAACACGACCAGCCGCTCCTTACCAAGTACCAACCATAGGGGTGTATGGCGTGCCAGGATCAGGCAAGTCTGGCATCATTAAAAGCGCAGTCACCAAAAAAGATCTAGTGGTGAGCGCCAAGAAAGAAAACTGTGCAGAAATTATAAGGGACGTCAAGAAAATGAAAGGGCTGGACGTCAATGCCAGAACTGTGGACTCAGTGCTCTTGAATGGATGCAAACACCCCGTAGAGACCCTGTATATTGACGAAGCTTTTGCTTGTCATGCAGGTACTCTCAGAGCGCTCATAGCCATTATAAGACCTAAAAAGGCAGTGCTCTGCGGGGATCCCAAACAGTGCGGTTTTTTTAACATGATGTGCCTGAAAGTGCATTTTAACCACGAGATTTGCACACAAGTCTTCCACAAAAGCATCTCTCGCCGTTGCACTAAATCTGTGACTTCGGTCGTCTCAACCTTGTTTTACGACAAAAAAATGAGAACGACGAATCCGAAAGAGACTAAGATTGTGATTGACACTACCGGCAGTACCAAACCTAAGCAGGACGATCTCATTCTCACTTGTTTCAGAGGGTGGGTGAAGCAGTTGCAAATAGATTACAAAGGCAACGAAATAATGACGGCAGCTGCCTCTCAAGGGCTGACCCGTAAAGGTGTGTATGCCGTTCGGTACAAGGTGAATGAAAATCCTCTGTACGCACCCACCTCTGAACATGTGAACGTCCTACTGACCCGCACGGAGGACCGCATCGTGTGGAAAACACTAGCCGGCGACCCATGGATAAAAACACTGACTGCCAAGTACCCTGGGAATTTCACTGCCACGATAGAGGAGTGGCAAGCAGAGCATGATGCCATCATGAGGCACATCTTGGAGAGACCGGACCCTACCGACGTCTTCCAGAATAAGGCAAACGTGTGTTGGGCCAAGGCTTTAGTGCCGGTGCTGAAGACCGCTGGCATAGACATGACCACTGAACAATGGAACACTGTGGATTATTTTGAAACGGACAAAGCTCACTCAGCAGAGATAGTATTGAACCAACTATGCGTGAGGTTCTTTGGACTCGATCTGGACTCCGGTCTATTTTCTGCACCCACTGTTCCGTTATCCATTAGGAATAATCACTGGGATAACTCCCCGTCGCCTAACATGTACGGGCTGAATAAAGAAGTGGTCCGTCAGCTCTCTCGCAGGTACCCACAACTGCCTCGGGCAGTTGCCACTGGAAGAGTCTATGACATGAACACTGGTACACTGCGCAATTATGATCCGCGCATAAACCTAGTACCTGTAAACAGAAGACTGCCTCATGCTTTAGTCCTCCACCATAATGAACACCCACAGAGTGACTTTTCTTCATTCGTCAGCAAATTGAAGGGCAGAACTGTCCTGGTGGTCGGGGAAAAGTTGTCCGTCCCAGGCAAAATGGTTGACTGGTTGTCAGACCGGCCTGAGGCTACCTTCAGAGCTCGGCTGGATTTAGGCATCCCAGGTGATGTGCCCAAATATGACATAATATTTGTTAATGTGAGGACCCCATATAAATACCATCACTATCAGCAGTGTGAAGACCATGCCATTAAGCTTAGCATGTTGACCAAGAAAGCTTGTCTGCATCTGAATCCCGGCGGAACCTGTGTCAGCATAGGTTATGGTTACGCTGACAGGGCCAGCGAAAGCATCATTGGTGCTATAGCGCGGCAGTTCAAGTTTTCCCGGGTATGCAAACCGAAATCCTCACTTGAAGAGACGGAAGTTCTGTTTGTATTCATTGGGTACGATCGCAAGGCCCGTACGCACAATCCTTACAAGCTTTCATCAACCTTGACCAACATTTATACAGGTTCCAGACTCCACGAAGCCGGATGTGCACCCTCATATCATGTGGTGCGAGGGGATATTGCCACGGCCACCGAAGGAGTGATTATAAATGCTGCTAACAGCAAAGGACAACCTGGCGGAGGGGTGTGCGGAGCGCTGTATAAGAAATTCCCGGAAAGCTTCGATTTACAGCCGATCGAAGTAGGAAAAGCGCGACTGGTCAAAGGTGCAGCTAAACATATCATTCATGCCGTAGGACCAAACTTCAACAAAGTTTCGGAGGTTGAAGGTGACAAACAGTTGGCAGAGGCTTATGAGTCCATCGCTAAGATTGTCAACGATAACAATTACAAGTCAGTAGCGATTCCACTGTTGTCCACCGGCATCTTTTCCGGGAACAAAGATCGACTAACCCAATCATTGAACCATTTGCTGACAGCTTTAGACACCACTGATGCAGATGTAGCCATATACTGCAGGGACAAGAAATGGGAAATGACTCTCAAGGAAGCAGTGGCTAGGAGAGAAGCAGTGGAGGAGATATGCATATCCGACGACTCTTCAGTGACAGAACCTGATGCAGAGCTGGTGAGGGTGCATCCGAAGAGTTCTTTGGCTGGAAGGAAGGGCTACAGCACAAGCGATGGCAAAACTTTCTCATATTTGGAAGGGACCAAGTTTCACCAGGCGGCCAAGGATATAGCAGAAATTAATGCCATGTGGCCCGTTGCAACGG
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配列番号31、SMARRT_CoV2ワクチン1159
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Claims (26)
- 組換え融合前SARS CoV-2 Sタンパク質又はその断片をコードするRNAレプリコンであって、前記SARS CoV-2タンパク質が、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号12、配列番号14又はそれらの断片から選択されるアミノ酸配列を含む、RNAレプリコン。
- 5’から3’末端に向かって、
(1)RNAウイルスの非構造タンパク質による媒介増幅に必要な5’非翻訳領域(5’-UTR)、
(2)前記RNAウイルスの非構造タンパク質のうち少なくとも1つ、好ましくは全てをコードするポリヌクレオチド配列、
(3)前記RNAウイルスのサブゲノムプロモータ、
(4)前記組換え融合前SARS CoV-2 Sタンパク質又はその断片をコードするポリヌクレオチド配列、及び
(5)前記RNAウイルスの非構造タンパク質による媒介増幅に必要な3’非翻訳領域(3’-UTR)
を順に含む、請求項1に記載のRNAレプリコン。 - 5’から3’末端に向かって、
(1)αウイルスの5’非翻訳領域(5’-UTR)、
(2)αウイルスの非構造遺伝子nsp1の5’複製配列、
(3)ウイルス種の下流ループ(DLP)モチーフ、
(4)自己プロテアーゼペプチドをコードするポリヌクレオチド配列、
(5)αウイルスの非構造タンパク質nsp1、nsp2、nsp3及びnsp4をコードするポリヌクレオチド配列、
(6)αウイルスのサブゲノムプロモータ、
(7)前記組換え融合前SARS CoV-2 Sタンパク質又はその断片をコードする前記ポリヌクレオチド配列、
(8)αウイルス3’非翻訳領域(3’UTR)、並びに
(9)任意選択で、ポリアデノシン配列
を順に含む、請求項2に記載のRNAレプリコン。 - 前記DLPモチーフが、東部ウマ脳炎ウイルス(Eastern equine encephalitis virus、EEEV)、ベネズエラウマ脳炎ウイルス(Venezuelan equine encephalitis virus、VEEV)、エバーグレーズウイルス(Everglades virus、EVEV)、ムカンボウイルス(Mucambo virus、MUCV)、セムリキ森林ウイルス(Semliki forest virus、SFV)、ピクスナウイルス(Pixuna virus、PIXV)、ミドルバーグウイルス(Middleburg virus、MTDV)、チクングニアウイルス(Chikungunya virus、CHIKV)、オニョンニョンウイルス(O'Nyong-Nyong virus、ONNV)、ロスリバーウイルス(Ross River virus、RRV)、バーマ森林ウイルス(Barmah Forest virus、BF)、ゲタウイルス(Getah virus、GET)、サギヤマウイルス(Sagiyama virus、SAGV)、ベバルウイルス(Bebaru virus、BEBV)、マヤロウイルス(Mayaro virus、MAYV)、ウナウイルス(Una virus、UAV)、シンドビスウイルス(Sindbis virus、SINV)、アウラウイルス(Aura virus、AURAV)、ワタロアウイルス(Whataroa virus、WHAV)、ババンキウイルス(Babanki virus、BABV)、キジラガフウイルス(Kyzylagach virus、KYZV)、西部ウマ脳炎ウイルス(Western equine encephalitis virus、WEEV)、ハイランドJウイルス(Highland J virus、HJV)、フォートモーガンウイルス(Fort Morgan virus、FMV)、ヌドゥムウイルス(Ndumu、NDUV)及びバギークリークウイルスからなる群から選択されるウイルス種に由来する、請求項3に記載のRNAレプリコン。
- 前記自己プロテアーゼペプチドが、ブタテシオウイルス-1 2A(porcine tesehovirus-1 2A、P2A)、口蹄疫ウイルス(foot-and-mouth disease virus、FMDV)2A(F2A)、ウマ鼻炎Aウイルス(Equine Rhinitis A Virus、ERAV)2A(E2A)、Thosea asignaウイルス2A(Thosea asigna virus 2A、T2A)、細胞質多角体病ウイルス2A(cytoplasmic polyhedrosis virus 2A、BmCPV2A)、軟化病ウイルス2A(Flacherie Virus 2A、BmIFV2A)及びこれらの組み合わせからなる群から選択され、前記自己プロテアーゼペプチドが前記P2Aのペプチド配列を含むことが好ましい、請求項3に記載のRNAレプリコン。
- RNAレプリコンであって、5’から3’末端に向かって、
(1)配列番号18のポリヌクレオチド配列を有する5’-UTR、
(2)配列番号19のポリヌクレオチド配列を有する5’複製配列、
(3)配列番号20のポリヌクレオチド配列を含むDLPモチーフ、
(4)配列番号22のP2A配列をコードするポリヌクレオチド配列、
(5)配列番号24、配列番号25、配列番号26及び配列番号27の核酸配列をそれぞれ有するαウイルスの非構造タンパク質nsp1、nsp2、nsp3及びnsp4をコードするポリヌクレオチド配列、
(6)配列番号16のポリヌクレオチド配列を有するサブゲノムプロモータ、
(7)配列番号1~4、12及び14又はその断片からなる群から選択されたアミノ酸配列を有する融合前SARS CoV-2 Sタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列、並びに
(8)配列番号28のポリヌクレオチド配列を有する3’UTR
を順に含む、RNAレプリコン。 - (a)前記P2A配列をコードする前記ポリヌクレオチド配列が配列番号21を含み、
(b)前記RNAレプリコンがポリアデノシン配列を更に含み、前記ポリアデノシン配列が前記レプリコンの3’末端に配列番号29を有することが好ましい、
請求項6に記載のRNAレプリコン。 - 配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号11、配列番号13のポリヌクレオチド配列又はそれらの断片を含む、請求項1~7のいずれか一項に記載のRNAレプリコン。
- 配列番号30又は配列番号31のポリヌクレオチド配列を含む、RNAレプリコン。
- 請求項1~9のいずれか一項に記載のRNAレプリコンをコードするDNA配列を含む核酸であって、前記DNA配列の5’末端に操作可能に連結されたT7プロモータを更に含むことが好ましく、前記T7プロモータが配列番号17のヌクレオチド配列を含むことがより好ましい、核酸。
- 請求項1~9のいずれか一項に記載のRNAレプリコンを含む、組成物。
- 請求項1~9のいずれか一項に記載のRNAレプリコンを含む、COVID-19に対するワクチン。
- COVID-19に対して対象にワクチン接種するための方法であって、請求項12に記載のワクチンを前記対象に投与することを含む、方法。
- 対象におけるSARS-CoV-2の感染症及び/又は複製を低減するための方法であって、請求項11に記載の組成物又は請求項12に記載のワクチンを前記対象に投与することを含む、方法。
- 前記組成物又は前記ワクチンが、プライム・ブースト投与レジメンの一部として投与される、請求項13又は14に記載の方法。
- 前記プライム・ブースト投与レジメンが同種プライム・ブースト投与レジメンである、請求項15に記載の方法。
- 前記プライム・ブースト投与レジメンが異種プライム・ブースト投与レジメンである、請求項15に記載の方法。
- 前記異種プライム・ブースト投与レジメンが、免疫応答を刺激するための請求項12に記載のワクチンのプライム投与及び前記免疫応答を増加するための組換え融合前SARS CoV-2Sタンパク質又はその断片をコードするアデノウイルスベクターを含むワクチンのブースト投与を含む、請求項17に記載の方法。
- 前記異種プライム・ブースト投与レジメンが、免疫応答を刺激するために、組換え融合前SARS CoV-2Sタンパク質又はその断片をコードするアデノウイルスベクターを含むワクチンのプライム投与及び前記免疫応答を増加するための請求項12に記載のワクチンのブースト投与を含む、請求項17に記載の方法。
- 前記RNAレプリコン及び前記アデノウイルスベクターが、同一の組換え融合前SARS CoV-2Sタンパク質又はその断片又はそのバリアントをコードする、請求項17~19のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ブースト投与が前記プライム投与の少なくとも約2週間後に投与される、請求項15~20のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ブースト投与が前記プライム投与の約2週間~約12週間後に投与される、請求項15~20のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ブースト投与が前記プライム投与の約4週間後に投与される、請求項21又は22に記載の方法。
- 請求項10に記載の核酸を含む、単離された宿主細胞。
- 請求項1~9のいずれか一項に記載のRNAレプリコンを含む、単離された宿主細胞。
- 請求項10に記載の核酸をインビボ又はインビトロで転写することを含む、RNAレプリコンを作製する方法。
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