CN116685347A

CN116685347A - 编码嵌合冠状病毒刺突蛋白的重组载体及其用途

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Publication number: CN116685347A
Application number: CN202180076316.7A
Authority: CN
Inventors: M·A·朗格雷斯; A·德格罗夫; P·维尔梅吉; B·J·博世
Original assignee: Intervet International BV
Current assignee: Intervet International BV
Priority date: 2020-11-12
Filing date: 2021-11-11
Publication date: 2023-09-01

Abstract

本发明提供了编码嵌合冠状病毒刺突蛋白的重组载体。本发明进一步提供了包含这些重组载体的新的免疫原性组合物和疫苗。还包括将这些免疫原性组合物和疫苗施用于动物受试者(包括人、猫科动物和禽类)来保护它们对抗冠状病毒的方法。也提供了单独或与其他保护剂组合制备免疫原性组合物和疫苗的方法。

Description

编码嵌合冠状病毒刺突蛋白的重组载体及其用途

技术领域

本发明涉及编码嵌合冠状病毒刺突蛋白的重组载体。本发明进一步涉及包含这些重组载体的新的免疫原性组合物和疫苗。本发明进一步涉及将这些免疫原性组合物和疫苗施用于动物受试者(包括人类)来保护它们对抗冠状病毒侵害的方法。此外，本发明涉及单独或与其他保护剂组合制备免疫原性组合物和疫苗的方法。

背景技术

冠状病毒是有包膜的单链非节段性正义RNA病毒，其编码16种非结构性蛋白、几种辅助蛋白和4种主要结构蛋白：(i)刺突表面蛋白(刺突蛋白或S蛋白)，其为从病毒表面突出的大糖蛋白；(ii)整合膜(或基质)蛋白(M)；(iii)小膜包膜蛋白(E)；和(iv)核衣壳蛋白(N)。冠状病毒的刺突蛋白通过与跨越受感染动物宿主细胞膜的宿主靶蛋白的特定胞外结构域结合来确定冠状病毒的向性。靶蛋白被称为受体。

所有冠状病毒S糖蛋白由四个结构域组成；在合成过程中被切除的信号序列、存在于病毒体颗粒外部的胞外结构域、负责将S蛋白锚定到病毒体颗粒的脂质双层中的跨膜区，以及可能与其他冠状病毒蛋白(如膜蛋白(E)和整合膜蛋白(M))相互作用的胞质尾区。冠状病毒刺突蛋白是通过电子显微镜可观察到的作为冠状病毒病毒体刺突的I型糖蛋白。S蛋白可能通过与M蛋白的非共价相互作用组装到病毒体膜中，但不需要形成冠状病毒病毒样颗粒。在纳入冠状病毒颗粒后，由羧基末端结构域决定，S糖蛋白负责结合靶细胞受体和病毒与细胞膜的融合，在易感细胞的感染中发挥主要作用。

冠状病毒是一个庞大的病毒科，包括禽冠状病毒、牛冠状病毒、犬冠状病毒、猫冠状病毒、猪冠状病毒、蝙蝠冠状病毒和人冠状病毒。传染性支气管炎病毒(IBV)是一种禽冠状病毒，引起传染性支气管炎，这是家禽(鸡)的一种急性、高度传染性的呼吸道疾病。传染性支气管炎的临床症状包括打喷嚏/咳嗽、气管啰音、鼻分泌物和喘息，雏鸡比成鸡更明显。禽也可能表现出抑郁和消耗较少的食物。肉型禽体重增加减少，而产蛋禽产蛋较少。呼吸道感染使雏鸡易患继发性细菌感染，这在雏鸡中可能是致命的。该病毒还可引起输卵管的永久性损伤(特别是在雏鸡中，导致蛋产量和质量降低)，以及肾的永久性损伤，有时导致肾病，这可能是致命的。

2019-2020年全世界人类大流行病(普遍被称为2019冠状病毒病(COVID-19))的病原体，是被称为严重急性呼吸综合征冠状病2(SARS-CoV-2)的呼吸道(可能也是肠道)冠状病毒。尽管在过去的一个世纪中已经报道了人的冠状病毒感染，但是它们通常与普通感冒样症状有关，而SARS-CoV-2继2003年SARS流行(SARS-CoV)和2012年中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)之后作为本千年爆发的第三个主要的Β冠状病毒。

SARS-CoV和SARS-CoV-2的宿主受体都是血管紧张素转化酶2(ACE2)，这是一种I型整合膜蛋白，是一种锌金属酶，它起着单羧肽酶的作用并在血管健康中起重要作用。ACE2的主要功能是平衡血管紧张素转化酶(ACE)的作用。ACE将血管紧张素I激素裂解成血管收缩肽血管紧张素II，而ACE2裂解血管紧张素II的C-末端氨基酸，最终导致形成起反作用的血管舒张肽。SARS-CoV-2的刺突蛋白与ACE2的结合导致内吞作用和病毒易位到位于细胞内的内体中。

SARS-CoV-2被认为具有人畜共患的起源，SARS-CoV-2直接或通过中间动物从蝙蝠冠状病毒(蝙蝠CoV)进化而来[Wu等,Cell Host&Microbe 27:1-4(2020)]。实际上，SARS-CoV和SARS-CoV-2都被认为是从不同的SARS样蝙蝠CoV进化而来，他们进入人类，可能涉及中间宿主。有人提出，SARS-CoV通过圈养的喜马拉雅棕榈果子狸(Paguma larvata)从蝙蝠进入人类[Wu等,同上；Guan等,Science 302:276-278(2003)]。值得注意的是，喜马拉雅棕榈果子狸也已显示极易感染SARS-CoV[Kan等,J.of Virol.79(18):11892-11900(2005)；Guan等,同上]。一致地，比较它们整个基因组的核苷酸序列表明，SARS-CoV-2在遗传上与SARS样蝙蝠CoV的关系比与SARS-CoV的关系更密切[Wu等,同上]。

与SARS-CoV一样，大众媒体上也已经有一些关于动物园中的狮子和老虎以及家猫的SARS-CoV-2检测呈阳性的报道。其中一些猫科动物(包括家猫)，已经表现出感染的临床症状和显著的尸检肺损伤。最近的报道还表明SARS-CoV-2可感染雪貂、仓鼠和水貂。

尽管到目前为止，还没有人类从家猫身上感染COVID-19的报告，但是这种传播可能发生的巨大担忧仍然存在。这种担忧的一个依据来自于研究报告，受感染的家猫可通过气溶胶脱落足够的SARS-CoV-2从而感染其他已经保持物理距离的猫。此外，基于它们的血清转换率，研究表明SARS-CoV-2的猫与猫之间的传播可以在自然环境中发生。而且，最近的研究已经表明，感染的水貂已经将SARS-CoV-2传播给人类[Oreshkova等,Eurosurveillance 25(23)(2020):pii＝2001005；doi:10.2807/1560-7917.ES.2020.25.23.2001005]。

有点令人鼓舞的是，在初步研究中，SARS-CoV-2显示出相对较少的遗传多样性，表明抗SARS-CoV-2的正确的猫科动物疫苗可能是成功的。理想地，这种疫苗将防止病毒传播到猫，防止猫成为病毒库，和/或减少受感染的猫的SARS-CoV-2的脱落。目前，有超过200种的潜在的SARS-CoV-2疫苗正被开发用于人类，研究人员采用了许多不同的疫苗策略。然而，即使付出了前所未有的努力，这些疫苗策略中的任何一种是否会导致疫苗在对抗SARS-CoV-2的传播或COVID-19的作用方面迈出重要一步，仍然存在不确定性。

甚至在最近对SARS-CoV-2的兴奋之前，修饰人冠状病毒刺突蛋白以增加其免疫原性和/或对宿主免疫系统的可利用性已经引起了一些兴趣。依赖于先前关于来自HIV-1和呼吸道合胞病毒(RSV)的融合蛋白的发现，其显示，由于在残基V1060和L1061处引入两个连续的脯氨酸替代(被称为2P)，在第一个七肽重复区(HR1)和中央螺旋之间的环中的脯氨酸替代限制了融合蛋白的过早触发并且导致外胚层产量的大于50倍的改善，证明来自SARS-CoV和HCoV-HKU1的刺突蛋白中的同源替代也增加了胞外结构域的表达水平并改善了构象均一性[Pallesen等,Proceedings of the National Academy of Sciences of the UnitedStates of America 114:E7348–e7357,https://doi.org/10.1073/pnas.1707304114(2017)]。此外，在中央螺旋开始处引入两个连续的脯氨酸残基(2P)被认为是将Β冠状病毒S蛋白保留在原型的融合前构象中的一般策略[Pallesen等,同上]。最近，Amanat等，[doi:https://doi.org/10.1101/2020.09.16.300970,(2020)]已经报道了两个脯氨酸的引入和多元切割位点的去除导致基于重组刺突的SARS-CoV-2疫苗在小鼠模型中的最佳功效。还讨论了人冠状病毒刺突蛋白的其他修饰[参见,Sternberg and Naujokat,Life Sciences,257:118056(2020)；Li,Ann.Rev.Viol.,3(1):237-261(2016)；和Wickramasinghe等,VirusResearch 194:37-48(2014)]。

猪中致命的猪急性腹泻综合征(SADS)的病原体是新的冠状病毒，其基因组序列与蝙蝠冠状病毒HKU2有98.48％是相同的。2016年在猪场附近洞穴中的蝙蝠中检测到了HKU2相关冠状病毒。该新的冠状病毒，即猪急性腹泻综合征冠状病毒(SADS-CoV)，源自与SARS-CoV相同属的马蹄蝠(Rhinolophus)[Zhou等,Nature,556:255-258(2018)；doi.org/10.1038/s41586-018-0010-9]。

水疱性口炎病毒(VSV)是非节段的负链RNA病毒，属于弹状病毒科(Rhabdoviridae)，该科包括狂犬病病毒。VSV优先从极化上皮细胞的基底外侧表面出芽。这种出芽偏好与其糖蛋白的基底外侧定位相关[参见，例如，Drokhlyansky等,J.Virol.,89(22):11718-11722(2015)]。这样的质膜出芽使得病毒能够离开宿主细胞并且主要被包膜病毒使用，其必须获得富含病毒蛋白的宿主来源的膜以形成其外包膜。组装的或在构建过程中的核衣壳诱导在宿主细胞膜中形成膜弯曲并包裹在形成的芽中，其最终通过膜断裂被夹断以释放包膜颗粒。

多年来，使用甲病毒来源的RNA复制子颗粒(RP)是疫苗中用于保护免受特定动物病原体侵害的大量载体策略之一[Vander Veen等，Anim Health Res Rev.13(1):1-9.(2012)doi:10.1017/S1466252312000011；Kamrud等，J Gen Virol.91(Pt 7):1723-1727(2010)]。甲病毒来源的RP已被开发用于几种不同的甲病毒，包括委内瑞拉马脑炎病毒(VEEV)[Pushko等,Virology 239:389-401(1997)]，辛德毕斯(SIN)[Bredenbeek等,Journal of Virology 67:6439-6446(1993)]和塞姆利基森林病毒(SFV)[Liljestrom和Garoff,Biotechnology(NY)9:1356-1361(1991)]。甲病毒RP疫苗将增殖缺陷型甲病毒RNA复制子递送到宿主细胞中并导致所需免疫原性转基因在体内表达[Pushko等,同上]。已经报道了体外表达可检测的刺突蛋白的编码SARS-CoV刺突蛋白的杂合VEEV/SIN复制颗粒的构建[U.S.9,730,997]。当与一些传统的疫苗制剂相比时，RP还具有吸引人的安全性和功效特征[Vander Veen等，Anim Health Res Rev.13(1):1-9(2012)]。此外，VEEV RP平台已用于编码来自犬科动物和猫科动物的致病抗原[参见，例如，WO2019/086645、WO2019/086646和WO2019/115090]，并且是用于猪和家禽的几种USDA许可的疫苗的基础。

本文中任何参考文献的引用不应被解释为承认此类参考文献可作为本申请的“现有技术”获得。

发明内容

因此，本发明提供了编码修饰的冠状病毒刺突蛋白的重组载体。在具体的实施方式中，修饰的冠状病毒刺突蛋白是嵌合冠状病毒刺突蛋白。编码修饰的冠状病毒刺突蛋白(例如，嵌合冠状病毒刺突蛋白)的载体可用于免疫原性组合物和/或疫苗中。在特定的实施方式中，重组载体是重组表达载体。在其他实施方式中，重组载体是合成的信使RNA(合成的mRNA)。

本发明的一个方面提供了编码嵌合冠状病毒刺突蛋白的重组载体，该刺突蛋白包含源自冠状病毒的刺突蛋白，以及替代冠状病毒刺突蛋白的跨膜结构域(TMD)和C末端结构域(CTD)的，源自从宿主细胞的质膜出芽(BV_pm)的出芽病毒的表面糖蛋白的TMD和CTD，替代冠状病毒刺突蛋白的TMD和CTD。在这种类型的特定实施方式中，重组载体是重组BV_pm，并且表面糖蛋白的TMD和CTD源自不同于重组BV_pm的病毒种。

在重组载体的某些实施方式中，源自BV_pm的表面糖蛋白是来自VSV的糖蛋白(G蛋白)。在重组载体的其他实施方式中，源自BV_pm的表面糖蛋白是流感病毒的血凝素。在重组载体的其他实施方式中，源自BV_pm的表面糖蛋白是流感病毒的神经氨酸酶。在重组载体的其他实施方式中，源自BV_pm的表面糖蛋白是新城疫病毒(NDV)的血凝素-神经氨酸酶(HN)蛋白。在重组载体的其他实施方式中，源自BV_pm的表面糖蛋白是NDV的融合(F)蛋白。在重组载体的其他实施方式中，源自BV_pm的表面糖蛋白是人免疫缺陷病毒(HIV)的糖蛋白120(gp120)。在重组载体的其他实施方式中，源自BV_pm的表面糖蛋白是拉沙病毒的糖蛋白(GP)。在重组载体的其他实施方式中，源自BV_pm的表面糖蛋白是埃博拉病毒的GP。在重组载体的其他实施方式中，源自BV_pm的表面糖蛋白是麻疹病毒(MV)的F蛋白。在重组载体的其他实施方式中，源自BV_pm的表面糖蛋白是MV的HN蛋白。

在一个相关方面，本发明提供了编码嵌合冠状病毒刺突蛋白的重组载体，其中嵌合冠状病毒刺突蛋白的弗林蛋白酶切割位点被失活。在其他实施方式中，重组载体编码嵌合冠状病毒刺突蛋白，由于在嵌合冠状病毒刺突蛋白的中央螺旋开始处的两个连续氨基酸残基被一对脯氨酸残基(2P)替代，该嵌合冠状病毒刺突蛋白进一步稳定在融合前状态。

在相关的实施方式中，重组载体编码嵌合冠状病毒刺突蛋白，其中两个嵌合冠状病毒刺突蛋白的弗林蛋白酶切割位点都被失活，由于在嵌合冠状病毒刺突蛋白的中央螺旋开始处的两个连续氨基酸残基被一对脯氨酸残基(2P)替代，该嵌合冠状病毒刺突蛋白进一步稳定在融合前状态。

在具体的实施方式中，重组载体包含嵌合冠状病毒刺突蛋白，其中嵌合冠状病毒刺突蛋白的冠状病毒刺突蛋白部分源自哺乳动物冠状病毒。在重组载体的某些实施方式中，嵌合冠状病毒刺突蛋白的冠状病毒刺突蛋白部分源自牛冠状病毒。在重组载体的其他实施方式中，嵌合冠状病毒刺突蛋白的冠状病毒刺突蛋白部分源自犬冠状病毒。在重组载体的其他实施方式中，嵌合冠状病毒刺突蛋白的冠状病毒刺突蛋白部分源自猫冠状病毒。在重组载体的其他实施方式中，嵌合冠状病毒刺突蛋白的冠状病毒刺突蛋白部分源自猪冠状病毒。在这种类型的重组载体的具体实施方式中，猪冠状病毒是SADS-CoV。在该类型重组载体的其他具体实施方式中，猪冠状病毒是猪流行性腹泻病毒(PEDV)。在重组载体的其他实施方式中，嵌合冠状病毒刺突蛋白的冠状病毒刺突蛋白部分源自蝙蝠冠状病毒。

在重组载体的更具体的实施方式中，嵌合冠状病毒刺突蛋白的冠状病毒刺突蛋白部分源自人冠状病毒。在这种类型的重组载体的特定的实施方式中，嵌合冠状病毒刺突蛋白的冠状病毒刺突蛋白部分源自SARS-CoV。在这种类型的重组载体的其他实施方式中，嵌合冠状病毒刺突蛋白的冠状病毒刺突蛋白部分源自MERS。在这种类型的重组载体的甚至更具体的实施方式中，嵌合冠状病毒刺突蛋白的冠状病毒刺突蛋白部分源自SARS-CoV-2。

在重组载体的特定实施方式中，嵌合冠状病毒刺突蛋白在相同的氨基酸残基范围内包含与SEQ ID NO：10的氨基酸序列的氨基酸残基14至1211的80％、85％、90％、95％、97％、99％、99.5％或更高的同一性，并且嵌合冠状病毒刺突蛋白包含失活的弗林蛋白酶切割位点。在这类重组载体的更特定的实施方式中，嵌合冠状病毒刺突蛋白在相同的氨基酸残基范围内进一步包含与SEQ ID NO：10的氨基酸序列的氨基酸残基1212至1260的80％、85％、90％、95％、97％或更高的同一性。在重组载体的甚至更特定的实施方式中，嵌合冠状病毒刺突蛋白包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列。

在重组载体的其他特定实施方式中，嵌合冠状病毒刺突蛋白在相同的氨基酸残基范围内包含与SEQ ID NO：12的氨基酸序列的氨基酸残基14至1211的80％、85％、90％、95％，97％，99％、99.5％或更高的同一性，并且嵌合冠状病毒刺突蛋白两者都包含失活的弗林蛋白酶切割位点，并且SEQ ID NO：12的986位的赖氨酸(K)残基和987位的缬氨酸(V)残基被一对脯氨酸残基(2P)替代。在这类重组载体的更特定的实施方式中，嵌合冠状病毒刺突蛋白在相同的氨基酸残基范围内进一步包含与SEQ ID NO：12的氨基酸序列的氨基酸残基1212至1260的80％、85％、90％、95％、97％或更高的同一性。在重组载体的甚至更特定的实施方式中，嵌合冠状病毒刺突蛋白包含SEQ ID NO：12的氨基酸序列。

在重组载体的其他实施方式中，嵌合冠状病毒刺突蛋白的冠状病毒刺突蛋白部分源自禽冠状病毒。在这种类型的重组载体的具体实施方式中，禽冠状病毒是IBV。在重组载体的更特定的实施方式中，IBV是马萨诸塞血清型。在这类重组载体的甚至更具体的实施方式中，嵌合冠状病毒刺突蛋白的冠状病毒刺突蛋白部分源自IBV-Ma5。在重组载体的其他实施方式中，嵌合冠状病毒刺突蛋白的冠状病毒刺突蛋白部分源自血清型4/91IBV。在重组载体的其他相关实施方式中，嵌合冠状病毒刺突蛋白的冠状病毒刺突蛋白部分源自血清型QXIBV。

在这些重组载体的特定实施方式中，嵌合冠状病毒刺突蛋白在相同的氨基酸残基范围内包含与SEQ ID NO：4的氨基酸序列的氨基酸残基19至1091的80％、85％、90％、95％、97％、99％、99.5％或更高的同一性，并且嵌合冠状病毒刺突蛋白包含失活的弗林蛋白酶切割位点。在这类重组载体的更特定的实施方式中，嵌合冠状病毒刺突蛋白在相同的氨基酸残基范围内进一步包含与SEQ ID NO：4的氨基酸序列的氨基酸残基1092至1140的80％、85％、90％、95％、97％或更高的同一性。在重组载体的甚至更特定的实施方式中，嵌合冠状病毒刺突蛋白包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列。

在重组载体的其他特定实施方式中，嵌合冠状病毒刺突蛋白在相同的氨基酸残基范围内包含与SEQ ID NO：6的氨基酸序列的氨基酸残基19至1091的80％、85％、90％、95％、97％、99％、99.5％或更高的同一性，并且嵌合冠状病毒刺突蛋白包含失活的弗林蛋白酶切割位点，并且SEQ ID NO：6的859位的丙氨酸(A)残基和860位的异亮氨酸(I)残基被一对脯氨酸残基(2P)替代。在这类重组载体的更特定的实施方式中，嵌合冠状病毒刺突蛋白在相同的氨基酸残基范围内进一步包含与SEQ ID NO：6的氨基酸序列的氨基酸残基1092至1140的80％、85％、90％、95％、97％或更高的同一性。在重组载体的甚至更特定的实施方式中，嵌合冠状病毒刺突蛋白包含SEQ ID NO：6的氨基酸序列。

在本发明的一个方面，本发明的重组载体是重组表达载体。在这种类型的具体的实施方式中，重组表达载体是重组病毒载体。在其他实施方式中，重组表达载体是DNA表达质粒。

在具体的实施方式中，重组病毒载体是重组禽病毒载体。在这种类型的更具体的实施方式中，重组病毒载体是重组火鸡疱疹病毒(HVT)。在其他实施方式中，重组病毒载体是重组减毒马立克氏病病毒1(MDV1)。在其他实施方式中，重组病毒载体是重组减毒马立克氏病病毒2(MDV2)。在其他实施方式中，重组病毒载体是重组减毒NDV。

在其他实施方式中，重组病毒载体是重组减毒MV。在其他实施方式中，重组病毒载体是甲病毒RNA复制子颗粒(RP)。在这种类型的特定实施方式中，甲病毒RNA复制子颗粒是VEEV RNA复制子颗粒。在甚至更具体的实施方式中，甲病毒RNA RP包含VEEV的无毒TC-83毒株的衣壳蛋白和糖蛋白。

在特定的实施方式中，重组病毒载体是编码本发明的嵌合冠状病毒刺突蛋白的VEEV RNA复制子颗粒。在更特定的实施方式中，嵌合冠状病毒刺突蛋白是SARS-CoV-2-VSV刺突蛋白。

在其他特定实施方式中，重组病毒载体是编码本发明的嵌合冠状病毒刺突蛋白的重组HVT载体。在更特定的实施方式中，嵌合冠状病毒刺突蛋白是本发明的嵌合IBV-VSV刺突蛋白。

在其他实施方式中，重组表达载体是DNA表达质粒。在这种类型的具体实施方式中，DNA表达质粒编码RNA复制子。在甚至更具体的实施方式中，RNA复制子是VEEV RNA复制子。

在其他实施方式中，重组载体是合成的mRNA。

在具体的实施方式中，重组载体进一步编码一种或多种其他抗原。在这种类型的某些实施方式中，重组载体包含嵌合冠状病毒刺突蛋白并进一步编码第二种冠状病毒抗原。在这种类型的特定实施方式中，嵌合冠状病毒刺突蛋白是嵌合SARS-CoV-2刺突蛋白，第二种冠状病毒抗原是第二种SARS-CoV-2蛋白抗原。在更具体的实施方式中，第二种SARS-CoV-2蛋白抗原是整合膜(或基质)蛋白(M)。在其他实施方式中，第二种SARS-CoV-2蛋白抗原是小膜包膜蛋白(E)。在其他实施方式中，第二种SARS-CoV-2蛋白抗原是核衣壳蛋白(N)。在更具体的实施方式中，第二种SARS-CoV-2蛋白抗原是第二种嵌合SARS-CoV-2刺突蛋白，其中两种嵌合SARS-CoV-2刺突蛋白的刺突蛋白部分源自不同的SARS-CoV-2毒株。

在其他实施方式中，重组载体编码第一种嵌合SARS-CoV-2刺突蛋白，可选地与第二种嵌合SARS-CoV-2刺突蛋白和/或第二种SARS-CoV-2抗原，以及来自非SARS-CoV-2的抗原一起。在某些实施方式中，非SARS-CoV-2抗原是猫杯状病毒(FCV)衣壳蛋白。在其他实施方式中，非SARS-CoV-2抗原是狂犬病病毒糖蛋白(G)。在其他实施方式中，非SARS-CoV-2抗原是猫白血病病毒(FeLV)包膜蛋白。在其他实施方式中，非SARS-CoV-2抗原是人流感病毒蛋白。在这种类型的具体实施方式中，人流感病毒蛋白是血凝素。在另一个实施方式中，人流感病毒蛋白是神经氨酸酶。

本发明进一步提供了包含一种或多种本发明重组载体的免疫原性组合物。在具体实施方式中，免疫原性组合物包含药学上可接受的载体。重组载体可以是重组表达载体，例如重组病毒载体和DNA表达质粒；或合成的mRNA。本发明进一步提供包含一种或多种免疫原性组合物和药学上可接受的载体的疫苗。

因此，本发明的免疫原性组合物和/或疫苗可包含一种或多种本发明的任何重组载体，包括任何重组病毒载体，本发明的任何DNA表达质粒和/或本发明的任何合成的mRNA。在某些实施方式中，免疫原性组合物和/或疫苗进一步包含药学上可接受的载体。

在某些实施方式中，帮助保护哺乳动物免受SARS-CoV-2感染的疫苗包含编码嵌合SARS-CoV-2刺突蛋白的重组载体，该刺突蛋白包含源自SARS-CoV-2的刺突蛋白，以及替代SARS-CoV-2刺突蛋白的SARS-CoV-2刺突蛋白的TMD和CTD，源自从宿主细胞的质膜出芽(BV_pm)的出芽病毒的表面糖蛋白的TMD和CTD。在这种类型的具体实施方式中，重组载体是重组BV_pm，并且表面糖蛋白的TMD和CTD源自不同于重组BV_pm的病毒种。在更特定的实施方式中，BV_pm的表面糖蛋白是水疱性口炎病毒的G蛋白。在这种类型的某些实施方式中，哺乳动物是人。在其他实施方式中，疫苗有助于减少由于猫科动物或雪貂中的SARS-CoV-2感染引起的SARS-CoV-2在猫科动物或雪貂中的脱落。

因此，在某些实施方式中，本发明的疫苗在接种的哺乳动物中诱导无菌免疫。在其他实施方式中，本发明的疫苗防止冠状病毒从接种的哺乳动物传播到未接种的哺乳动物。在相关的实施方式中，本发明的疫苗在接种的哺乳动物中诱导无菌免疫并防止冠状病毒从接种的哺乳动物传播到未接种的哺乳动物。在这种类型的具体实施方式中，接种的哺乳动物是猫科动物。在这种类型的更具体的实施方式中，接种的哺乳动物是猫(例如家猫)。在其他实施方式中，未接种的哺乳动物是猫科动物。在这种类型的更具体的实施方式中，猫科动物是猫(例如家猫)。在相关实施方式中，接种的哺乳动物和未接种的哺乳动物都是猫(例如家猫)。在某些实施方式中，此类哺乳动物(例如猫科动物)疫苗包含佐剂。在其他这样的实施方式中，哺乳动物(例如猫科动物)疫苗是无佐剂疫苗。

在备选的实施方式中，疫苗有助于保护禽类免受由于感染IBV而引起的传染性支气管炎，其包含编码嵌合IBV刺突蛋白的重组载体，该刺突蛋白包含源自IBV的刺突蛋白，以及替代冠状病毒刺突蛋白的TMD和CTD，源自从宿主细胞的质膜出芽(BV_pm)的出芽病毒的表面糖蛋白的TMD和CTD。在这种类型的具体实施方式中，重组载体是重组BV_pm，并且表面糖蛋白的TMD和CTD源自不同于重组BV_pm的病毒种。在更具体的实施方式中，BV_pm的表面糖蛋白是水疱性口炎病毒的G蛋白。在相关的实施方式中，疫苗有助于保护鸡免受由于鸡中IBV感染引起的传染性支气管炎。

本发明进一步提供了免疫哺乳动物抗冠状病毒(例如SARS-CoV-2)的方法，其包括向哺乳动物施用免疫学有效量的本发明的疫苗。在某些实施方式中，施用方法是通过肌内施用(IM)进行的。在其他实施方式中，施用方法是通过皮下施用(SC)进行的。在其他实施方式中，施用方法是通过皮内施用(ID)进行的。在其他实施方式中，施用方法是通过口服施用进行的。在其他实施方式中，施用方法是通过鼻内施用进行的。本发明的疫苗可以作为单剂量施用(例如，作为单剂量疫苗)或与一次或多次随后的加强施用一起施用。

在具体实施方式中，哺乳动物是猫科动物。在更具体的实施方式中，猫科动物是家猫。在其他实施方式中，猫科动物是狮子。在其他实施方式中，猫科动物是老虎。在相关的实施方式中，哺乳动物是雪貂。在备选的实施方式中，哺乳动物是人。

本发明进一步提供了在哺乳动物中诱导针对冠状病毒的无菌免疫的方法，其包括向哺乳动物施用有效量的本发明的疫苗之一，从而提供哺乳动物疫苗。在其他实施方式中，本发明提供了防止冠状病毒从接种的哺乳动物传播到未接种的哺乳动物的方法，其包括向哺乳动物施用有效量的本发明的哺乳动物疫苗之一。在相关的实施方式中，本发明提供了在哺乳动物中诱导针对冠状病毒的无菌免疫和防止冠状病毒从接种的哺乳动物传播到未接种的哺乳动物的方法，其包括向哺乳动物施用有效量的本发明的哺乳动物疫苗之一。在这种类型的具体实施方式中，接种的哺乳动物是猫科动物。在这种类型的更具体的实施方式中，接种的哺乳动物是猫(例如家猫)。在其他实施方式中，未接种的哺乳动物是猫科动物。在这种类型的更具体的实施方式中，猫科动物是猫(例如家猫)。在相关实施方式中，接种的哺乳动物和未接种的哺乳动物都是猫(例如家猫)。在某些实施方式中，此类哺乳动物(例如猫科动物)疫苗包含佐剂。在其他这样的实施方式中，哺乳动物(例如猫)疫苗是无佐剂疫苗。

本发明进一步提供免疫禽类抗IBV的方法，包括向禽类施用免疫学有效量的本发明疫苗。相应地，本发明的疫苗可以通过肠胃外施用来施用于禽类。在具体的实施方式中，通过肌内施用(IM)将疫苗施用于禽类。在其他实施方式中，疫苗通过皮下施用(SC)施用于禽类。在其他实施方式中，通过皮内施用(ID)将疫苗施用于禽类。在其他实施方式中，疫苗通过口服施用来施用于禽类。在其他实施方式中，疫苗通过鼻内施用施用于禽类。在其他实施方式中，通过卵内施用将疫苗施用于禽类。在其他实施方式中，疫苗通过划痕法(scarification)施用于禽类。在更特定的实施方式中，禽类是鸡。本发明的疫苗可以作为单剂量施用(例如，作为单剂量疫苗)或与一次或多次随后的加强施用一起施用。

包含本发明的重组载体(例如编码嵌合SARS-CoV-2刺突蛋白的甲病毒RNA复制子颗粒或编码嵌合IBV刺突蛋白的重组HVT)的免疫原性组合物和/或疫苗(包括多价疫苗)可以在存在或不存在佐剂的情况下施用。

在具体的实施方式中，佐剂是一种油佐剂，包含多于一种的油(例如矿物油)和一种或多种非矿物油。在这种类型的某些实施方式中，油佐剂包含作为矿物油的液体石蜡油和一种或多种选自角鲨烷、角鲨烯、维生素E、维生素E-乙酸酯、油酸酯和油酸乙酯的非矿物油。在更具体的实施方式中，油佐剂包含液体石蜡油和维生素E-乙酸酯。在备选的实施方式中，疫苗不包含佐剂，是无佐剂疫苗。

在另一个方面，本发明提供了嵌合冠状病毒刺突蛋白，该刺突蛋白包含源自SARS-CoV2的刺突蛋白，以及替代SARS-CoV-2刺突蛋白的TMD和CTD的源自水疱性口炎病毒的表面糖蛋白的TMD和CTD。在特定的实施方式中，嵌合冠状病毒刺突蛋白在相同的氨基酸残基范围内包含与SEQ ID NO：10的氨基酸序列的氨基酸残基14至1211的80％、85％、90％、95％、97％、99％、99.5％或更高的同一性，并且嵌合冠状病毒刺突蛋白包含失活的弗林蛋白酶切割位点。在这种类型的更特定的实施方式中，嵌合冠状病毒刺突蛋白在相同的氨基酸残基范围内进一步包含与SEQ ID NO：10的氨基酸序列的氨基酸残基1212至1260的80％、85％、90％、95％、97％或更高的同一性。在甚至更特定的实施方式中，嵌合冠状病毒刺突蛋白包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列。

在特定的实施方式中，嵌合冠状病毒刺突蛋白在相同的氨基酸残基范围内包含与SEQ ID NO：12的氨基酸序列的氨基酸残基14至1211的80％、85％、90％、95％、97％、99％、99.5％或更高的同一性，并且嵌合冠状病毒刺突蛋白二者均包含失活的弗林蛋白酶切割位点，并且SEQ ID NO：12的986位的赖氨酸(K)残基和987位的缬氨酸(V)残基被一对脯氨酸残基(2P)替代。在这种类型的某些实施方式中，嵌合冠状病毒刺突蛋白在相同的氨基酸残基范围内进一步包含与SEQ ID NO：12的氨基酸序列的氨基酸残基1212至1260的80％、85％、90％、95％、97％或更高的同一性。在甚至更特定的实施方式中，嵌合冠状病毒刺突蛋白包含SEQ ID NO：12的氨基酸序列。

本发明进一步提供了编码一种或多种嵌合冠状病毒刺突蛋白的核酸，所述嵌合冠状病毒刺突蛋白包含源自SARS-CoV-2的刺突蛋白，和替代SARS-CoV-2刺突蛋白的TMD和CTD的源自水疱性口炎病毒的表面糖蛋白的TMD和CTD。

在另一个方面，本发明提供了嵌合冠状病毒刺突蛋白，其包含源自IBV的刺突蛋白，和替代IBV刺突蛋白的TMD和CTD的源自水疱性口炎病毒的表面糖蛋白的TMD和CTD。在特定的实施方式中，嵌合冠状病毒刺突蛋白在相同的氨基酸残基范围内包含与SEQ ID NO：4的氨基酸序列的氨基酸残基19至1091的80％、85％、90％、95％、97％、99％、99.5％或更高的同一性，并且嵌合冠状病毒刺突蛋白包含失活的弗林蛋白酶切割位点。在更特定的实施方式中，嵌合冠状病毒刺突蛋白在相同的氨基酸残基范围内进一步包含与SEQ ID NO：4的氨基酸序列的氨基酸残基1092至1140的80％、85％、90％、95％、97％或更高的同一性。在甚至更特定的实施方式中，嵌合冠状病毒刺突蛋白包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列。

在特定的实施方式中，嵌合冠状病毒刺突蛋白在相同的氨基酸残基范围内包含与SEQ ID NO：6的氨基酸序列的氨基酸残基19至1091的80％、85％、90％、95％、97％、99％、99.5％或更高的同一性，并且嵌合冠状病毒刺突蛋白二者均包含失活的弗林蛋白酶切割位点，并且SEQ ID NO：6的859位的丙氨酸(A)残基和860位的异亮氨酸(I)残基被一对脯氨酸残基(2P)替代。在这种类型的某些实施方式中，嵌合冠状病毒刺突蛋白在相同的氨基酸残基范围内进一步包含与SEQ ID NO：6的氨基酸序列的氨基酸残基1092至1140的80％、85％、90％、95％、97％或更高的同一性。在甚至更特定的实施方式中，嵌合冠状病毒刺突蛋白包含SEQ ID NO：6的氨基酸序列。

本发明进一步提供了编码一种或多种嵌合冠状病毒刺突蛋白的核酸，该刺突蛋白包含源自IBV的刺突蛋白，和替代IBV刺突蛋白的TMD和CTD的源自水疱性口炎病毒的表面糖蛋白的TMD和CTD。

通过参考以下附图说明和具体实施方式，本发明的这些和其他方面将会得到更好的理解。

附图说明

图1显示了商业化ID传染性支气管炎间接(IDVet)测试的结果。

图2显示了用编码修饰的IBV刺突蛋白的重组病毒构建体进行纤毛停滞检测(ciliostasis assay)的结果。

图3显示了SARS-CoV-2RBD替代假病毒中和试验(Surrogate Pseudo-VN test)的结果。

图4显示了初次接种的3周后加强接种后的SARS-CoV-2RBD替代假病毒中和试验的结果。

图5A-5F显示了候选疫苗在豚鼠模型中的免疫原性研究。

图5A提供了动物处理的概况：V＝接种疫苗和B＝血液采样。

图5B显示了使用来自第21天(D21)的10倍稀释的血清样品进行的替代SARS-CoV-2病毒中和(VN)试验。

图5C显示了使用来自初次接种后第35、49和63/64天(d.p.v.)的1000倍稀释的血清样品进行的替代SARS-CoV-2病毒VN试验。带圆圈的黑线显示刺突-wt抗原诱导的抗体水平，带正方形的灰线显示刺突-FCS-2P-VSV抗原诱导的抗体水平。

图5D显示了使用SARS-CoV-2刺突RBD(左)或胞外结构域(右)作为抗原的间接ELISA结果。显示了来自暴露于刺突-wt抗原(带圆圈的黑线)或刺突-FCS-2P-VSV抗原(带正方形的灰线)的猫的血清的EC50值(表示为稀释倍数)。

图5E提供了在第70/71天收集的血液的淋巴细胞刺激试验(LST)的结果。纯化的SARS-CoV-2S1抗原用于刺激分离的淋巴细胞，刺激后96小时测量增殖。

图5F提供了使用在第70/71天采集的2倍稀释的拭子样本进行的替代VN试验。

图6A-6E描述了在猫中的接种-挑战实验。

图6A提供了动物处理概况：V＝接种疫苗，B＝血液取样，O＝口咽拭子，N＝鼻洗液，(all)＝所有动物，(ch)＝仅被挑战动物，(sen)＝仅前哨动物。

图6B显示了使用SARS-CoV-2VN试验在接种后21天和45天(d.p.v.)测定的血清中和抗体滴度。带空心方块的黑线显示了对照接种动物中的抗体水平，带黑色三角形的黑线显示了未接种的前哨动物中的抗体水平，带实心正块的灰线显示由刺突-FCS-2P-VSV抗原诱导的抗体滴度。

图6C显示了在挑战当天、接种疫苗后45天(空心方块)和挑战后12天(被挑战的)或14天(前哨)(实心方块)用SARS-CoV-2VN试验测定的血清中和抗体滴度。

图6D显示了挑战后1至8天(d.p.c.)口咽拭子中SARS-CoV-2病毒的滴度，以pfu/ml表示。带空心正方形的黑线显示了被挑战的对照接种动物中的病毒滴度，带三角形的黑线显示了与对照接种动物共同饲养的未接种前哨动物中的病毒滴度，带实心正方形的灰线显示了刺突-FCS-2P-VSV抗原接种动物中的病毒滴度，带向下指向三角形的黑线显示了与刺突-FCS-2P-VSV抗原接种动物共同饲养的未接种前哨动物中的病毒滴度。

图6E显示了挑战后鼻洗液中SARS-CoV-2病毒滴度，以噬斑形成单位(pfu)/ml表示。图6E中的线和符号与图6D中的相同。

图7提供了野生型SARS-CoV-2刺突抗原(刺突-wt)和稳定的SARS-CoV-2刺突抗原(刺突-FCS-2P-VSV)的示意图。不同的刺突蛋白结构域用不同的灰色阴影表示。此外，还描述了弗林蛋白酶切割位点突变(ΔFCS，R682A/R683A)、2P替代(K986P/V987P)和TM-CTD替代。

图8和9描述了通过FACS在Vero宿主细胞上试验，对分别来自BCoV和SADS-CoV的嵌合刺突蛋白的总表达水平和表面表达水平的影响，如通过对Vero宿主细胞的FACS所测试的。细节在实施例11中给出。

具体实施方式

本发明提供免疫原性组合物和疫苗，其有助于预防或甚至在一些情况下预防哺乳动物(如人、猫科动物和雪貂)、禽(如鸡)、猪、牛和犬中由冠状病毒引起的疾病。此外，如以下实施例10所示，本发明进一步提供了在哺乳动物中诱导无菌免疫的免疫原性组合物和疫苗。

在本发明的一个方面，冠状病毒是SARS-CoV-2，疾病是在人、猫和/或雪貂中。这些疫苗不仅可以对接种的人、猫和/或雪貂有益，而且特别是在猫和雪貂的情况下，还可以防止它们成为病毒库，其中可能出现进一步的未知的和潜在有害的突变。而且，这样的疫苗可以减少或甚至消除猫和/或雪貂中SARS-CoV-2病毒的脱落。这种病毒脱落可导致SARS-CoV-2传播到其他动物，包括人。因此，本发明进一步提供了防止冠状病毒从感染的动物传播到未接种的动物的免疫原性组合物和疫苗。

在本发明的另一个方面，冠状病毒是IBV，疾病是在家禽(如鸡)中。在本发明的另一个方面，冠状病毒是IBV，疾病是在猪中。在这种类型的特定实施方式中，冠状病毒是SADS-CoV。在这种类型的特定实施方式中，冠状病毒是PEDV，疾病是在猪中。

因此，本发明提供了包含编码嵌合冠状病毒刺突蛋白的重组载体的免疫原性组合物和/或疫苗(包括多价疫苗)。在某些实施方式中，嵌合冠状病毒刺突蛋白包含：冠状病毒刺突蛋白的受体结合结构域(RBD)，冠状病毒刺突蛋白的弗林蛋白酶切割位点和冠状病毒刺突蛋白的中央螺旋，但是从宿主细胞的质膜(BV_pm)出芽的出芽病毒的表面糖蛋白的TMD和CTD，例如其中冠状病毒刺突蛋白的TMD和CTD被BV_pm的表面糖蛋白的TMD和CTD替代。在这种类型的具体实施方式中，重组载体是重组BV_pm，并且表面糖蛋白的TMD和CTD源自不同于重组BV_pm的病毒种。

为了更充分地理解本发明，提供以下定义。

为了便于描述，单数术语的使用绝不是限制性的。因此，例如，提及包含“一种多肽(a polypeptide)”的组合物包括提及一种或多种这样的多肽。此外，除非另有说明，提及一个“甲病毒RNA复制子颗粒”包括提及多个这样的甲病毒RNA复制子颗粒。

如本文所用，术语“大约(approximately)”与术语“约(about)”可互换使用，并且表示值在所示值的50％内，即每毫升含有“大约”1×10⁸甲病毒RNA复制子颗粒的组合物每毫升含有5×10⁷至1.5×10⁸甲病毒RNA复制子颗粒。

如本文所用，“重组载体”是能够将异源基因导入分离的宿主细胞或宿主生物体的宿主细胞中以产生由所述异源基因编码的蛋白质的载体。宿主细胞可以是在目标动物中。重组载体的实例包括重组表达载体和合成的信使RNA。

如本文所用，“重组表达载体”是含有合适信号以允许在合适条件下在宿主细胞或宿主生物体中表达编码的蛋白质(例如嵌合冠状病毒刺突蛋白)的重组载体。重组表达载体的实例包括DNA表达质粒和重组病毒，包括重组哺乳动物和禽病毒、RNA复制子和RNA复制子颗粒。

DNA表达质粒是一类重组表达载体，其可用于将异源基因引入宿主细胞或宿主生物体中以产生由所述异源基因编码的蛋白质。然后可以通过一些转染方法(例如使用生化物质作为载体、通过机械方法或通过电穿孔)将DNA表达质粒插入真核宿主细胞或真核宿主生物体中。典型地，异源蛋白的表达是瞬时的，因为DNA表达质粒缺乏稳定整合到宿主细胞基因组中的信号。因此，DNA表达质粒不会转化或永生化宿主细胞或宿主生物体。DNA表达质粒的实例是：pcDNA^TM、pCR3.1^TM、pCMV^TM、pFRT^TM、pVAX1^TM、pCI^TM、Nanoplasmid^TM,pFRT^TM和pCAGGS[Niwa等,Gene,108:193-199(1991)]。

如本文所用，术语“RNA复制子(RNA replicon)”可与术语“复制子RNA(repliconRNA或Replicon RNA)”互换使用，并且是指缺乏一个或多个元件(例如，结构蛋白的编码序列)的经修饰的RNA病毒基因组，如果存在所述元件，则将能够使亲本病毒在细胞培养物或动物宿主中成功增殖。在合适的细胞环境中，RNA复制子将扩增自身并可产生一种或多种亚基因组RNA种类。与RNA复制子颗粒相反，RNA复制子不与病毒结构蛋白一起包装，因此进入宿主细胞的效率较低。

如本文所用，术语“RNA复制子颗粒”，缩写为“RP”，是包装在源自病毒的结构蛋白(例如衣壳和糖蛋白)中的RNA复制子。如本文所用，术语“甲病毒RNA复制子颗粒”是包装在结构蛋白(例如衣壳和糖蛋白，其也源自甲病毒，例如，如Pushko等所描述[同上])中的源自甲病毒的RNA复制子。RNA复制子颗粒不能在细胞培养物或动物宿主中增殖(没有辅助质粒或类似成分)，因为RNA复制子不编码甲病毒结构成分(例如衣壳和糖蛋白)。

如本文所用，术语“合成的信使RNA”或“合成的mRNA”是指mRNA的重组单链分子，其被构建为包含编码所选蛋白质的mRNA的核苷酸序列，侧翼为稳定mRNA并增加蛋白质翻译的5’-和3’-非翻译区(UTR)，从而就像其在真核细胞的细胞质中自然发生那样类似于成熟mRNA分子。这些调节序列可源自病毒或真核基因。对于本发明，合成的mRNA包含编码嵌合冠状病毒刺突蛋白的核苷酸序列。在合成本发明的嵌合冠状病毒刺突蛋白的过程中，合成的信使RNA被核糖体读取。典型地，合成mRNA的5’-UTR包含“5’帽”结构，例如5’RNAm7G帽，其是修饰的鸟嘌呤核苷酸，其在自然界中在转录开始后立即添加到真核信使RNA的5’端。5’帽可由通过5’-5’-三磷酸键连接至第一转录核苷酸的末端7-甲基鸟苷残基组成。它的存在对于核糖体识别和免受RNase分解是关键的。合成的mRNA通常还具有3’poly-A尾，其是多腺苷酰基部分与信使RNA分子在3’端的共价连接。合成的mRNA可以通过转染和/或通过使用合适的载体(例如聚合物或阳离子脂质)递送至真核宿主生物体或宿主细胞。与通常对mRNA稳定性和翻译起始必不可少的帽和poly(A)尾不同，在天然存在的mRNA中发现的其他核输出信号的存在对于合成的mRNA载体不是必需的，因为它们被设计成专门存在于细胞质中。关于用于本发明的合成信使RNA分子的各种结构及其合成的细节是本领域熟知的[例如参见综述Pardi等,Nat Rev Drug Discov 17:261-279,doi:10.1038/nrd.2017.243(2018)]。类似地，将合成的mRNA直接递送到细胞质中需要其以剪接形式合成，使得天然mRNA中发现的冗余剪接信号有可能在合成mRNA中被省略。[参见Tolmachov和Tolmachova,GeneTechnology,4(1):100017(2015),U.S.9,428,535和Sclake等，NA Biol.9(11):1319-1330(2012)doi:10.4161/rna.22269。]

如上定义的合成mRNA可以是裸mRNA分子的形式或mRNA分子与协助细胞摄取合成mRNA分子的一种或多种载体分子缔合或复合的形式。为此目的已经开发了多种体内转染试剂(例如参见综述Pardi等,同上)。

本文所用的“Y1144A”表示对包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列的IBV冠状病毒刺突蛋白的氨基酸序列的修饰。相应地，CTD中SEQ ID NO：2的1144位的酪氨酸残基(Y)被丙氨酸残基(A)替代。该氨基酸替代功能性地去除IBV冠状病毒刺突蛋白的CTD中的ER-保留信号。在未修饰的IBV冠状病毒刺突蛋白中，ER-保留信号用于将刺突蛋白保留在ER或其他细胞内区室中。

如本文所用，从宿主细胞的质膜出芽的出芽病毒表示为“BV_pm”，并且是优先从质膜出芽的病毒，但其也可以不太优先地从细胞内区室(如内质网(ER)、内质网-高尔基中间区室和跨高尔基体网络)出芽。因此，BV_pm是通过从宿主细胞的质膜出芽而天然存在于宿主细胞中的病毒。这种从宿主细胞的质膜的出芽使得BV_pm能够离开宿主细胞，并且主要被包膜病毒使用，这些病毒必须获得富含病毒蛋白的宿主来源的膜以形成它们的外包膜。本发明的BV_pm优选是动物病毒，例如禽或哺乳动物病毒。BV_pm的实例是VSV、流感病毒、NDV、HIV、拉沙病毒、埃博拉病毒和MV。值得注意的是，冠状病毒不是BV_pm。冠状病毒刺突蛋白在CTD中含有ER-保留信号，其将刺突蛋白保留在ER或其他细胞内区室中[参见Welsch等,Febs Letters581:2089-2097(2007)，和Winter等,J.Virol.82(6):2765-27771(2008)]。

关于BV_pm表面糖蛋白(包括它们的TMD和CTD)的详细结构信息，可以在各种公共核酸和蛋白质序列数据库中找到，例如NCBI基因组数据库、UniProt和EMBL/GenBank。

术语“源自”(“originate from”、“originates from”和“originating from”)对于给定的蛋白质或该蛋白质的部分和天然编码该蛋白质的病原体或该病原体的毒株可互换使用，并且如本文所用，表示由该病原体或该病原体的毒株编码的该给定的蛋白质或该蛋白质的部分的未修饰和/或截短的氨基酸序列。在本发明的核酸构建体中，源自病原体的蛋白质或该蛋白质的一部分的编码序列可以进行遗传操作，从而导致相对于病原体或其来源的病原体毒株(包括天然减毒株)中该蛋白质的相应序列，所表达蛋白质的氨基酸序列的修饰和/或截短。

病毒的“表面糖蛋白”是在病毒包膜表面发现的糖蛋白，其用于识别和结合宿主膜上的受体位点。然后病毒包膜与宿主膜融合，使衣壳和病毒基因组进入并感染宿主。表面糖蛋白的实例包括冠状病毒的刺突蛋白和水疱性口炎病毒的表面糖蛋白。

VSV是属于弹状病毒科(包括狂犬病病毒)的非节段负链RNA病毒。VSV优先从极化上皮细胞的基底外侧表面出芽。这种出芽偏好与其糖蛋白的基底外侧定位相关[参见，例如，Drokhlyansky等,J.Virol.,89(22):11718-11722(2015)]。这样的质膜出芽使得病毒能够离开宿主细胞并且主要被包膜病毒使用，这些病毒必须获得富含病毒蛋白的宿主来源的膜以形成它们的外包膜。

IBV是冠状病毒，即套式病毒目(order Nidovirales)冠状病毒科(familyCoronaviridae)γ冠状病毒属(genus Gammacoronavirus)的成员。IBV S糖蛋白，即刺突蛋白，包含约1162个氨基酸残基，并被切割成两个亚基，S1(约535个氨基酸残基和约90-kDa的MW)和S2(约627个氨基酸残基和约84-kDa的MW)。C-末端S2亚基与N-末端S1亚基非共价连接，并含有跨膜和C-末端胞质尾区结构域。S1亚基包含刺突蛋白的受体结合活性。此外，当接种到鸡中时，IBV刺突蛋白参与保护性免疫应答的诱导[参见综述,Cavanagh,Vet.Res.38:281-297(2007)；也参见,EP0423869 A1；WO2004/078203A2；和WO2012/110745A2]。

SARS-CoV-2是套式病毒目冠状病毒科β冠状病毒属(genus Betacoronavirus)的成员。冠状病毒的刺突蛋白是从病毒表面突出的大糖蛋白，其通过与宿主受体的特定胞外结构域结合而决定病毒的向性。人血管紧张素转化酶2(ACE2)作为SARS-CoV-2和SARS-CoV刺突蛋白的宿主受体。冠状病毒基因组的最可变部分是冠状病毒刺突蛋白的RBD。然而，值得注意的是，在SARS-CoV-2刺突蛋白和SARS-CoV刺突蛋白之间，RBD的六个关键氨基酸残基中有五个不同。SARS-CoV-2刺突蛋白与SARS-CoV刺突蛋白的进一步区别在于SARS-CoV-2刺突蛋白在刺突蛋白的两个亚基S1和S2的连接处包含多元切割位点(RRAR，SEQ ID NO：13)，而SARS-CoV刺突蛋白则没有[参见Andersen等,Nature Medicine26:450-455(2020)]。该多元切割位点允许蛋白酶的有效切割，这在SARS-CoV-2的传染性中发挥作用。尽管多元切割位点不是SARS-CoV-2刺突蛋白独有的，因为一些其他的人β冠状病毒的刺突蛋白包含这样的结构(如SARS-CoV)，但是还没有发现最密切相关的蝙蝠冠状病毒的刺突蛋白也包含该多元切割位点。动物和人冠状病毒的刺突蛋白(包括它们的TMD和CTD)的详细结构信息，可以在各种公共核酸和蛋白质序列数据库中找到，例如NCBI基因组数据库、UniProt和EMBL/GenBank。

如本文所用，“跨膜结构域”或“TMD”是被插入到或将被插入到细胞膜中的蛋白质的疏水区。蛋白质跨膜结构域任一侧的部分位于膜的相对两侧。[参见，例如，The Senses:AComprehensive Reference,Masland等,editors；第2版(2008)]。冠状病毒刺突蛋白的跨膜结构域位于羧基末端部分附近，紧邻蛋白质羧基末端的胞质尾区。关于动物和人冠状病毒刺突蛋白的TMD的详细结构信息可以在各种公共核酸和蛋白质序列数据库中找到，例如NCBI基因组数据库、UniProt和EMBL/GenBank。

如本文所用，术语“C-末端结构域”或“CTD”与术语“胞质尾区”或“CT”可互换使用，并且是包膜病毒的表面糖蛋白(例如冠状病毒的刺突蛋白)的部分，其突出到细胞质中。I型膜糖蛋白的CTD位于表面糖蛋白的羧基末端。关于动物和人冠状病毒刺突蛋白CTD的详细结构信息可以在各种公共核酸和蛋白质序列数据库中找到，例如NCBI基因组数据库、UniProt和EMBL/GenBank。

如本文所用，缩写“2P”表示在包膜病毒的表面糖蛋白(例如冠状病毒的刺突蛋白)的中央螺旋开始处替代两个连续氨基酸残基的一对连续脯氨酸残基，以进一步稳定原型的融合前构象中的表面糖蛋白。[参见Pallesen等,同上]

“嵌合蛋白”是由两种或多种蛋白的部分组成的蛋白[参见例如McQueen等,Proc.Natl.Acad.Sci.,83:9318-9322(1986)]。

如本文所用，“嵌合冠状病毒刺突蛋白”是由冠状病毒刺突蛋白(CSP)的一部分和BV_pm的表面糖蛋白的一部分组成的蛋白质，例如包含冠状病毒刺突蛋白的两个亚基的重组蛋白：S1，其包含冠状病毒刺突蛋白的受体结合结构域；和S2，与来自BV_pm的表面糖蛋白的TMD和CTD一起替代冠状病毒刺突蛋白的TMD和CTD。在具体的实施方式中，BV_pm是水疱性口炎病毒。

如本文所用，关于进行百分比同一性确定的术语“在相同的氨基酸残基范围内”，其中已经为定义的氨基酸序列提供了特定范围的氨基酸残基，例如SEQ ID NO：12的氨基酸残基14-1211，表明在该特定氨基酸范围上进行该百分比同一性的确定。

如本文所用，冠状病毒刺突蛋白的“弗林蛋白酶切割位点”是允许蛋白酶(例如宿主细胞的弗林蛋白酶)有效切割的多元弗林蛋白酶切割位点，其在许多冠状病毒刺突蛋白(包括IBV和SARS-CoV-2的刺突蛋白)的传染性中发挥作用[参见Andersen等,NatureMedicine 26:450–455(2020)]。值得注意的是，一些其他的人β冠状病毒的刺突蛋白不包含这样的结构，例如SARS-CoV，并且还没有发现最密切相关的蝙蝠冠状病毒的刺突蛋白包含该多元切割位点。

如本文所用，冠状病毒刺突蛋白的“失活的弗林蛋白酶切割位点”或“ΔFCS”是已经被遗传修饰的冠状病毒刺突蛋白的弗林蛋白酶切割位点，以便不易于被宿主细胞弗林蛋白酶切割。在下面的实施例中，IBV刺突蛋白的弗林蛋白酶切割位点已经失活，即，将SEQ IDNO：4和6的533-537位的氨基酸残基RRFRR突变为AAFAA(SEQ ID NO：14)，并且SARS-CoV-2的刺突蛋白的弗林蛋白酶切割位点已经失活，将SEQ ID NO：8和10的682-685位的氨基酸残基RRAR突变为AAAR(SEQ ID NO：15)。

术语“非SARS-CoV-2”用于修饰诸如病原体和/或抗原或其免疫原性片段的术语，以表示相应的病原体和/或抗原既不是SARS-CoV-2也不是SARS-CoV-2蛋白抗原或其免疫原性片段，并且非SARS-CoV-2抗原不是源自SARS-CoV-2。

术语“非IBV”用于修饰诸如病原体和/或抗原或其免疫原性片段的术语，以表示相应的病原体和/或抗原既不是IBV也不是IBV蛋白抗原或其免疫原性片段，并且非IBV抗原不是源自IBV。

本文所用的术语“修饰的活的”和“减毒的”对于给定的活病毒和/或活微生物可互换使用。

如本文所用，术语“保护”，和/或“提供保护”，和/或“引起保护性免疫”，和/或“有助于预防疾病”，和/或“有助于保护”，和/或“降低病毒载量”，和/或“减少病毒血症”不需要完全保护以免于任何感染迹象。例如，“有助于保护”可指保护是足够的，使得在挑战后，潜在感染的症状至少被减少，和/或有助于减少病毒脱落，和/或导致症状的一种或多种潜在细胞性、生理性或生化性原因或机制减少和/或消除。应当理解的是，如本文中使用的“减少的”，是指相对于感染的状态，包括感染的分子状态，而不仅仅是感染的生理状态。

如本文所用，“疫苗”是适合施用于动物(例如鸡或猫科动物，在某些实施方式中，术语动物包括人，而在其他实施方式中特定地不用于人)的组合物，其包含通常与药学上可接受的载体(如含水的液体)组合的一种或多种抗原，其在施用于动物后诱导足够强的免疫应答以至少有助于提供保护以免受由野生型病毒和/或野生型微生物感染引起的疾病，即足够强有助于预防疾病和/或预防、改善或治愈疾病。

如本文所用，“无菌免疫”是防止特定致病病原体(如SARS-CoV-2(或其特定毒株))的可检测的复制并因此防止动物中建立由所述特定致病病原体引起的生产性感染的免疫类型。

如本文所用，通过疫苗接种在动物中“诱导无菌免疫”以对抗特定致病病原体(如SARS-CoV-2(或其特定毒株))的疫苗是指作为疫苗接种的结果，接种的动物获得针对该特定致病病原体的无菌免疫。诱导无菌免疫可能需要多于单次疫苗施用。

如本文所用，“预防冠状病毒的传播”的疫苗是指接种动物中针对特定致病病原体(例如SARS-CoV-2(或其特定菌株))的免疫应答将接种动物中该特定致病病原体的复制量减少至特定致病病原体的任何脱落都不足以在其他动物中引起疾病的程度。

本文所用的术语“哺乳动物”是脊椎动物，其中幼体用来自母亲特殊乳腺的乳汁喂养。哺乳动物的实例包括人、犬、猫科动物、羊、雪貂和猪。

除非另有说明，本文所用的术语“犬”包括所有家犬(Canis lupus familiaris或Canis familiaris)。

如本文所用，术语“猫科动物”是指猫科的任何成员。该科的成员包括野生的、动物园的和家养的成员，例如猫亚科的任何成员，例如猫、狮子、老虎、美洲狮、美洲豹、豹、雪豹、黑豹、北美山狮、猎豹、猞猁、美洲野猫、狞猫或其任何杂交品种。猫还包括家猫(Feliscatus)，包括纯种和/或杂种伴侣猫、表演猫、实验室猫、克隆猫和野生猫或野猫(wild orferal cats)。

如本文所用，“雪貂”是一种哺乳动物，属于貂科的哺乳动物之一。

通常，本发明的疫苗以有效的量(即“有效量”)施用，其有助于保护接种的动物免受冠状病毒侵害；例如，帮助保护人或猫科动物免于SARS-CoV-2侵害，帮助预防猫科动物或雪貂的病毒脱落，或帮助保护禽类免于IBV侵害。

本文所用的多价疫苗是包含两种或多种不同抗原的疫苗。在这种类型的具体实施方式中，多价疫苗刺激接受者的免疫系统抵抗两种或多种不同的病原体。

术语“佐剂”和“免疫刺激剂”在本文中可互换使用，并且被定义为引起免疫系统刺激的一种或多种物质。在本文中，佐剂用于增强对一种或多种疫苗抗原/分离物的免疫应答。因此，“佐剂”是非特异性地增加对具体抗原的免疫应答，从而减少任何给定疫苗中必需的抗原量和/或为了对感兴趣抗原的产生足够的免疫应答所必需的注射频率。在本文中，佐剂用于增强对一种或多种疫苗抗原/分离物的免疫应答。

本文所用的“无佐剂疫苗”是不含佐剂的疫苗或多价疫苗。

如本文所用，术语“药学上可接受的”作为形容词使用，是指修饰的名词适用于药物产品。例如，当用于描述药物疫苗中的赋形剂时，其特征在于赋形剂与组合物的其他成分相容并且对预期的受体动物(例如猫科动物)没有不利的损害。

术语“载体”是指与重组载体(例如甲病毒RNA复制子颗粒)一起施用的稀释剂、佐剂、赋形剂或媒介物。药学上可接受的载体可以是无菌液体，例如水和/或油，包括石油、动物油、植物油或合成来源的油，例如花生油、大豆油、矿物油和芝麻油等。水或水溶液盐水溶液和糖水溶液(例如葡萄糖和/或甘油溶液)可用作载体，特别是用于可注射溶液。在无佐剂疫苗的情况下，载体不能是佐剂。

“肠胃外施用”包括皮下注射、粘膜下注射、静脉内注射、肌内注射、皮内注射、口服、鼻内和输液。

如本文所用，关于特定蛋白质(例如蛋白质抗原)的术语“免疫原性片段”是免疫原性的蛋白质的片段，即，能够与免疫系统的抗原识别分子(如免疫球蛋白(抗体)或T细胞抗原受体)特异性相互作用。优选地，本发明的免疫原性片段对于抗体和/或T细胞受体识别是具有免疫优势的。在具体的实施方式中，针对给定的蛋白质抗原的免疫原性片段是保留全长蛋白SARS-CoV-2刺突蛋白或IBV刺突蛋白的抗原性的至少25％的该蛋白的片段。在优选的实施方式中，免疫原性片段保留了全长蛋白SARS-CoV-2刺突蛋白或IBV刺突蛋白的抗原性的至少50％。在更优选的实施方式中，免疫原性片段保留了全长蛋白SARS-CoV-2刺突蛋白或IBV刺突蛋白的抗原性的至少75％。免疫原性片段可以是包含全长嵌合刺突蛋白的至少一个保守区的100个或更多的氨基酸残基，或在另一个极端，是从全长蛋白缺失少至单个氨基酸的大片段。在特定的实施方式中，免疫原性片段包含全长蛋白质嵌合刺突蛋白的125至1000个氨基酸残基。在其他实施方式中，免疫原性片段包含全长嵌合刺突蛋白的250至750个氨基酸残基。

如本文所用，当两个序列的氨基酸残基相同时，一个氨基酸序列与第二个氨基酸序列是100％“相同的”或具有100％“同一性”。相应地，当两个氨基酸序列的50％的氨基酸残基相同时，一个氨基酸序列与第二个氨基酸序列是50％“相同的”。序列比较是在给定的蛋白质包含的连续氨基酸残基块上进行的，或者在嵌合蛋白质的情况下：被比较的多肽部分。

相应地，本发明的嵌合冠状病毒刺突蛋白的百分比同一性对于嵌合刺突蛋白中的每种不同蛋白单独进行。例如，在本发明的嵌合冠状病毒刺突蛋白的情况下，其由以下组成：(i)除IBV刺突蛋白的TMD和CTD外的所有IBV刺突蛋白，和(ii)仅水疱性口炎病毒的表面蛋白的TMD和CTD，IBV刺突蛋白的氨基酸序列比对是在源自IBV刺突蛋白的嵌合冠状病毒刺突蛋白的氨基酸序列(通常没有信号序列)上进行的，水疱性口炎病毒的表面蛋白的氨基酸序列比对是在源自水疱性口炎病毒蛋白的表面蛋白的嵌合冠状病毒刺突蛋白的氨基酸序列上进行的。同样，冠状病毒刺突蛋白的部分的同一性百分比的确定是在蛋白的相应部分所包含的连续的氨基酸残基块上进行的。

在一个具体的实施方式中，考虑了可改变两个氨基酸序列之间的对应关系的所选缺失或插入。重要的是，与本发明的嵌合冠状病毒刺突蛋白的确定的氨基酸序列具有确定的百分比(％)或更大同一性的嵌合冠状病毒刺突蛋白必须保留嵌合冠状病毒刺突蛋白的确定的氨基酸序列的特定功能特性。因此，与嵌合冠状病毒刺突蛋白的弗林蛋白酶切割位点被失活的本发明的嵌合冠状病毒刺突蛋白的确定的氨基酸序列具有百分比或更大同一性的嵌合冠状病毒刺突蛋白必须保留具有失活的切割位点的特性，尽管整个氨基酸序列保持可变性。类似地，由于在冠状病毒刺突蛋白的中央螺旋开始处的两个连续氨基酸残基被一对脯氨酸残基(2P)替代而进一步稳定在融合前状态的嵌合冠状病毒刺突蛋白必须保留这对脯氨酸残基，尽管整个氨基酸序列保持可变性。

如本文所用，可使用C,MacVector^TM(MacVector,Inc.Cary,NC 27519)、VectorNTI^TM(Informax,Inc.MD)、Oxford Molecular Group PLC(1996)和具有比对默认参数和用于同一性的默认参数的Clustal W算法确定核苷酸和氨基酸序列同一性百分比。这些市售的程序也可用于使用相同或相似的默认参数确定序列相似性。或者，可以使用默认过滤条件下的高级BLAST搜索，例如用默认参数使用GCG(Genetics Computer Group,ProgramManual for the GCG Package,Version 7,Madison,Wisconsin)Pileup程序。

为了本发明的目的，“灭活的”病毒或微生物是能够在动物中引发免疫应答但不能感染动物的病毒或微生物。例如，灭活的SARS-CoV-2可通过选自二乙烯亚胺、福尔马林、β-丙内酯、硫柳汞或热的试剂的试剂灭活。

重组载体

“载体”在本发明的领域中熟知为一种分子结构，其携带用于编码多肽的遗传信息(核苷酸序列)，具有合适的信号以允许其在合适的条件下(例如在宿主细胞中)表达。对于本发明，“表达”涉及通过转录和/或翻译从遗传信息表达蛋白质的公知原理。重组载体的许多类型和变体是已知的并可用于本发明，从核酸分子(如DNA或RNA)到更复杂的结构(如病毒样颗粒和复制子颗粒)，直到复制重组微生物(如重组病毒载体)。根据所用载体的类型，需要以顺式(即，在重组载体自身内提供)或反式(即，从单独的来源提供)提供或多或少的表达信号。

本发明的“重组载体”是遗传组成与其天然对应物不完全匹配的载体。这样的载体因此具有改变的分子组成，通常通过分子克隆和重组蛋白表达技术在体外操纵其遗传信息。所做的改变可用于提供、改善或适应载体和/或其表达的蛋白质的表达、操纵、纯化、稳定性和/或免疫学行为。这些和其他技术在标准教科书中有非常详尽的解释。[Sambrook和Russell,“Molecular cloning:a laboratory manual:Cold Spring Harbour LaboratoryPress(2001)；ISBN:0879695773)；Ausubel等,in:Current Protocols in MolecularBiology,(J.Wiley and Sons Inc,NY,(2003),ISBN:047150338X)；Dieffenbach和Dveksler:“PCR primers:a laboratory manual”(CSHL Press,ISBN 0879696540)；以及Bartlett和Stirling,“PCR Protocols”,(Humana press,ISBN:0896036421)]。

一种类型的重组载体是重组表达载体，其包括重组病毒载体(如重组HVT载体，其主要用于鸡疫苗[参见例如，U.S.5,853,733])和RNA复制子颗粒(其具有更宽范围的动物受试者)[参见例如，Pushko等，同上]。

重组火鸡疱疹病毒载体

通过克隆的重叠亚基因组片段的共转染产生疱疹病毒的能力首先在伪狂犬病病毒中得到证实[van Zijl等,J.Virology 62:2191-2195(1988)]。该方法随后用于构建重组HVT载体[参见，U.S.5,853,733，在此通过引用并入关于重组HVT载体的构建所公开的方法]，并且可以用于构建编码本发明的嵌合冠状病毒刺突蛋白的重组HVT载体。在该方法中，将整个HVT基因组克隆到细菌载体中，作为利用标准重组DNA技术构建的几个大的重叠亚基因组片段[Maniatis等,(1982)Molecular Cloning,Cold Spring Harbor LaboratoryPress,Cold Spring Harbor,New York(1982)；和Sambrook等,Molecular Cloning,ColdSpring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York(1989)]。HVT毒株FC126粘粒(cosmid)文库源自克隆到粘粒载体pWE15(Stratagene，现AgilentTechnologies of Santa Clara,CA)中的剪切的病毒DNA。另外，通过用酶BamHI限制性消化分离几个大的基因组DNA片段，并克隆到pWE15或质粒载体pSP64(Promega,Madison WI)中。如U.S.5,853,733中所述，将这些片段共转染到鸡胚成纤维细胞(CEF)中导致了由跨越片段重叠区域的同源重组介导的HVT基因组的再生。如果在共转染之前将插入片段直接工程化到一个或多个亚基因组片段中，则该方法产生高频率的含有插入片段的病毒。例如，需要5个重叠的亚基因组克隆来产生FC126HVT，并用作产生一系列HVT/NDV/ILTV重组病毒的基础[参见,U.S.8,932,064B2]。粘粒再生重组HVT构建体可基本上如U.S.5,853,733中所述进行[参见例如U.S.5,853,733的图8]。或者，也可以使用CRISPR/Cas9系统构建期望的重组禽疱疹病毒[参见Tang等,Vaccine,36(5):716-722(2018)].

重组RNA病毒、RNA复制子和RNA复制子颗粒

RNA病毒可以用作载体-媒介物，用于引入编码疫苗抗原的核苷酸，例如，编码本发明的嵌合冠状病毒刺突蛋白的核苷酸序列，其已经被遗传工程改造到它们的基因组中。然而，迄今为止它们的用途主要限于将病毒抗原纳入RNA病毒中，然后将病毒引入受体宿主中。结果是诱导了针对纳入的病毒抗原的保护性抗体。甲病毒RNA复制子颗粒已用于编码致病抗原。这样的甲病毒复制子平台已经从几种不同的甲病毒被开发出来，包括VEEV[Pushko等，同上]、Sindbis(SIN)[Bredenbeek等，Journal of Virology 67:6439-6446(1993)其内容通过引用整体并入本文]和塞姆利基森林病毒(SFV)[Liljestrom和Garoff,Biotechnology(NY)9:1356-1361(1991)，其内容通过引用整体并入本文]。此外，甲病毒RNA复制子颗粒是用于猪和家禽的几种USDA许可的疫苗的基础。这些疫苗包括：猪流行性腹泻疫苗、RNA颗粒(产品代码19U5.P1)、猪流感疫苗、RNA(产品代码19A5.D0)、禽流感疫苗、RNA(产品代码19O5.D0)和处方产品RNA颗粒(产品代码9PP0.00)。

本发明的甲病毒RNA复制子颗粒可以被冻干并用无菌水稀释剂复水。另一方面，当将甲病毒RNA复制子颗粒分开储存，但意欲在施用前与其他疫苗成分混合时，可将甲病毒RNA复制子颗粒储存在那些成分的稳定溶液中，例如高浓度蔗糖溶液。

相应地，在本发明的一个方面，疫苗包含甲病毒RNA RP，其包含VEEV的衣壳蛋白和糖蛋白。在甚至更特定的实施方式中，疫苗包含甲病毒RNA RP，其包含VEEV的无毒的TC-83毒株的衣壳蛋白和糖蛋白并编码嵌合冠状病毒刺突蛋白。包含编码嵌合冠状病毒刺突蛋白的甲病毒RNA复制子颗粒的免疫原性组合物和/或疫苗(包括多价疫苗)可以在存在或不存在佐剂的情况下施用。在某些实施方式中，免疫原性组合物和/或疫苗用于人。在其他实施方式中，免疫原性组合物和/或疫苗用于猫科动物。在其他实施方式中，免疫原性组合物和/或疫苗用于雪貂。在其他实施方式中，免疫原性组合物和/或疫苗用于鸡。还提供了单独或与其他保护剂组合制备和使用疫苗和/或免疫原性组合物的方法。

启动子

除了使用给定重组载体(例如重组病毒载体)的本地启动子来驱动编码本发明的重组病毒载体中的蛋白质抗原的异源基因的表达之外，许多替代启动子也可用于重组病毒载体中，例如伪狂犬病病毒(PRV)gpX启动子[参见WO87/04463]、劳斯肉瘤病毒LTR启动子、SV40早期基因启动子、人巨细胞病毒即刻早期1(hCMV IE1)基因启动子[U.S.5,830,745；U.S.5,980,906]和鸡β-肌动蛋白基因启动子[EP1298139B1]。通常需要在核苷酸编码区的下游加入聚腺苷酸化调节元件以终止编码核苷酸序列的转录。因此，许多基因在其编码序列的下游端包含聚腺苷酸化调节元件。许多这样的调节元件已被确认并可用于本发明的重组表达载体。

合成的信使RNA

本发明的编码嵌合冠状病毒刺突蛋白的合成的mRNA的生产可以在终止体外转录(例如，使用T7 RNA聚合酶和帽类似物)之前，通过使用限制酶的质粒DNA线性化开始。(该方法类似于RNA复制子生产中的用于RNA转录的方法)。应包装合成的mRNA分子以保护其免受RNA酶的影响并在真核细胞中有效递送。对于递送，可以使用不同的技术，例如阳离子聚合物、树枝状聚合物或脂质纳米颗粒(LNP)。[参见例如Pardi等，同上]用作重组载体的合成的mRNA可以多种方式递送至其靶动物或宿主细胞，包括通过机械或化学手段，通过转染，或用合适的(纳米颗粒)载体(如蛋白质、多糖、阳离子脂质或聚合物)封装。为了稳定合成的mRNA，可以将某些化学修饰应用于例如核苷酸或其主链，或通过纳入核苷酸类似物。[参见例如U.S.9，447，164。]

疫苗和多价疫苗

本发明进一步提供了包含本发明的重组载体和药学上可接受的载体的疫苗。在本发明的一个方面，疫苗有助于保护人、猫科动物或雪貂免受SARS-CoV-2感染。在这种类型的具体实施方式中，疫苗有助于减少猫科动物中SARS-CoV-2的脱落。本发明进一步提供有助于减少雪貂中SARS-CoV-2脱落的疫苗。在其他实施方式中，猫科动物疫苗有助于降低感染的猫科动物的一种或多种临床症状的严重性。在其他实施方式中，雪貂疫苗有助于降低感染的雪貂的一种或多种临床症状的严重性。在其他实施方式中，疫苗有助于保护鸡。

本发明还提供多价疫苗和免疫原性组合物。可用于哺乳动物或禽的免疫原性组合物或疫苗的任何抗原或这些抗原的组合可分别加入到本发明的任何相应的哺乳动物疫苗或免疫原性组合物或禽疫苗或免疫原性组合物中。这样的多价疫苗和/或免疫原性组合物被囊括到本发明中。在具体的实施方式中，多价疫苗包含编码嵌合SARS-CoV-2刺突蛋白和一种或多种其他SARS-CoV-2蛋白抗原，和/或一种或多种非SARS-CoV-2蛋白抗原的甲病毒RNA RP，和/或进一步包含一种或多种额外的甲病毒RNA复制子颗粒，其编码例如一种或多种其他SARS-CoV-2蛋白抗原，和/或一种或多种非SARS-CoV-2蛋白抗原。在类似的实施方式中，包含编码一种或多种嵌合冠状病毒刺突蛋白(例如嵌合IBV刺突蛋白)的甲病毒RNA RP的多价疫苗进一步包含一种或多种额外的甲病毒RNA复制子颗粒，其编码例如一种或多种其他一种或多种非IBV蛋白抗原。

相应地，包含编码本发明的嵌合IBV刺突蛋白的重组载体的本发明的禽疫苗可进一步包含至少一种非IBV抗原以引发针对非IBV病原体的保护性免疫。在这种类型的某些实施方式中，所述疫苗进一步包含重组载体，所述重组载体包含编码至少一种源自非IBV病原体的抗原或其免疫原性片段的核苷酸序列。在这种类型的具体实施方式中，重组载体是HVT。在备选的实施方式中，重组载体是VEEV RNA复制子颗粒。

相应地，在某些实施方式中，重组载体是进一步编码一种或多种其他抗原的重组病毒载体。在这种类型的具体实施方式中，重组病毒载体进一步编码第二种IBV蛋白抗原。在更具体的实施方式中，第二种IBV蛋白抗原是包含IBV刺突蛋白的第二种嵌合IBV刺突蛋白，该IBV刺突蛋白源自与第一种嵌合IBV刺突蛋白不同的IBV毒株。在其他实施方式中，重组载体可以编码第一种嵌合IBV刺突蛋白，任选地与第二种嵌合IBV刺突蛋白一起，和一种或多种来自非IBV的抗原。在某些实施方式中，非IBV抗原是NDV抗原。在该类型的某些实施方式中，NDV抗原是F蛋白。在其他实施方式中，非IBV抗原是传染性法氏囊病病毒(IBDV)抗原。在这种类型的某些实施方式中，IBDV抗原是病毒蛋白2(VP2)。在其他实施方式中，非IBV抗原是传染性喉气管炎病毒(ILTV)蛋白。在这种类型的某些实施方式中，ILTV蛋白是糖蛋白B(gB)。在其他这样的实施方式中，ILTV蛋白是糖蛋白D(gD)。在其他实施方式中，ILTV蛋白是糖蛋白I(gI)。在其他实施方式中，重组病毒载体编码ILTVgD、gI和gB中两种或多种的任意组合。在其他实施方式中，非IBV抗原是禽流感病毒(AIV)蛋白。在这种类型的某些实施方式中，AIV蛋白是AIV血凝素(HA)。在其他实施方式中，AIV蛋白是AIV神经氨酸酶(NA)。在其他实施方式中，重组病毒载体编码AIV HA和AIV NA二者。

例如，可以构建重组HVT以编码和表达单独的或在多价HVT载体(包括例如一种或多种禽流感抗原)中的嵌合IBV刺突蛋白。多价HVT载体是本领域熟知的[参见，例如，U.S.8,932,064B2]。在其他实施方式中，重组病毒载体可以是重组减毒MDV1。在其他实施方式中，重组病毒载体可以是重组减毒MDV2。在其他实施方式中，重组病毒载体可以是重组减毒NDV。

类似地，编码禽疫苗中的嵌合IBV刺突蛋白的重组载体可与一种或多种活的减毒病毒分离物一起加入，例如活的减毒NDV和/或活的减毒IBDV和/或活的减毒ILTV和/或活的减毒马立克氏病病毒(MDV)，包括天然减毒病毒HVT，和/或活的减毒禽流感病毒(AIV)。

在备选的疫苗实施方式中，非IBV抗原是灭活的非IBV病原体。

在具体的疫苗实施方式中，非IBV病原体可以是灭活的NDV。在其他疫苗实施方式中，非IBV病原体是灭活的IBDV。在其他疫苗实施方式中，非IBV病原体是灭活的ILTV。在其他疫苗实施方式中，非IBV病原体是灭活的MDV1。在其他疫苗实施方式中，非IBV病原体是HVT。在其他疫苗实施方式中，非IBV病原体是灭活的禽流感病毒。在某些疫苗实施方式中，疫苗包含来自多种非IBV病原体的非IBV抗原。

本发明包括多价哺乳动物疫苗和/或免疫原性组合物，其包含编码嵌合SARS-CoV-2刺突蛋白和非SARS-CoV-2病原体抗原二者的重组载体。在具体的疫苗实施方式中，非SARS-CoV-2病原体是猫杯状病毒(FCV)。在其他疫苗实施方式中，非SARS-CoV-2病原体是猫白血病病毒(FeLV)。在其他疫苗实施方式中，非SARS-CoV-2病原体是猫泛白细胞减少症病毒(FPLV)。在其他疫苗实施方式中，非SARS-CoV-2病原体是猫鼻气管炎病毒(FVR)。在其他疫苗实施方式中，非SARS-CoV-2病原体是猫免疫缺陷病毒(FIV)。在具体的疫苗实施方式中，非SARS-CoV-2病原体是猫嗜衣原体(Chlamydophila felis)。在其他疫苗实施方式中，非SARS-CoV-2病原体是犬流感病毒(CIV)。在其他疫苗实施方式中，非SARS-CoV-2病原体是犬细小病毒(CPV)。在其他疫苗实施方式中，非SARS-CoV-2病原体是犬瘟热病毒(CDV)。在其他疫苗实施方式中，非SARS-CoV-2病原体是狂犬病病毒。在某些疫苗实施方式中，疫苗包含来自多种非SARS-CoV-2病原体的非SARS-CoV-2抗原。

此外，编码人、猫科动物或雪貂疫苗中的一种或多种嵌合冠状病毒刺突蛋白(例如嵌合SARS-CoV-2刺突蛋白)的甲病毒RNA RP和/或相应的免疫原性组合物可以与一种或多种其他灭活病毒分离物一起加入，例如灭活的FCV毒株和/或灭活的猫疱疹病毒和/或灭活的猫细小病毒和/或灭活的猫白血病病毒和/或灭活的猫传染性腹膜炎病毒和/或灭活的猫免疫缺陷病毒和/或灭活的狂犬病病毒和/或灭活的猫流感病毒和/或灭活的犬流感病毒。另外，嗜衣原体(Chlamydophila felis)和/或支气管炎博德特氏菌(Bordetellabronchiseptica)和/或巴尔通体属(Bartonella spp.，例如，汉氏巴尔通体(例如，B.henselae))的菌苗(或菌苗的亚组分，例如菌毛亚组分)也可包括在这种多价疫苗中。

此外，编码人、猫科动物或雪貂免疫原性组合物和/或疫苗中的嵌合冠状病毒刺突蛋白的甲病毒RNA RP可与一种或多种活的减毒病毒分离物一起加入，例如活的减毒FCV病毒和/或活的减毒猫白血病病毒和/或活的减毒猫传染性腹膜炎病毒和/或活的减毒猫免疫缺陷病毒和/或活的减毒狂犬病病毒和/或活的减毒猫流感病毒和/或活的减毒犬流感病毒。另外，活的减毒的猫嗜衣原体和/或活的减毒的支气管炎博德特氏菌和/或活的减毒的巴尔通体属(例如，汉氏巴尔通体)也可包括在这种多价疫苗中。

因此，本发明提供了包含一种或多种编码第二种SARS-CoV-2蛋白抗原的VEEV RNA复制子颗粒的疫苗。在具体的实施方式中，第一种VEEV RNA复制子颗粒编码第一种嵌合SARS-CoV-2刺突蛋白，第二种VEEV RNA复制子颗粒编码第二种嵌合SARS-CoV-2刺突蛋白，所述第二种嵌合SARS-CoV-2刺突蛋白源自与第一种SARS-CoV-2刺突蛋白来源不同的SARS-CoV-2毒株。

在具体的疫苗中，重组病毒载体是甲病毒RNA复制子颗粒。在这种类型的更具体的实施方式中，甲病毒RNA复制子颗粒是VEEV RNA复制子颗粒。在甚至更具体的实施方式中，疫苗包含甲病毒RNA RP，其包含VEEV的无毒TC-83毒株的衣壳蛋白和糖蛋白并编码嵌合冠状病毒刺突蛋白。

佐剂：

在本发明的一个方面，疫苗是无佐剂化的，即不包含佐剂。另一方面，在某些实施方式中，疫苗确实含有佐剂。可用于本发明疫苗的佐剂的实例包括[例如，与聚烯基醚或二乙烯基乙二醇交联的丙烯酸聚合物、Alhydrogel+QuilA、氢氧化铝、Alhydrogel、Emulsigen+EMA31+Neocryl XK62、Carbomer、Carbomer 974P、Adjuphos、Alhydrogel+QS21(皂苷)Carbigen]。在具体的实施方式中，佐剂是一种油佐剂，包含多于一种的油(例如矿物油)和一种或多种非矿物油。在这种类型的某些实施方式中，油佐剂包含作为矿物油的液体石蜡油和一种或多种选自角鲨烷、角鲨烯、维生素E、维生素E-乙酸酯、油酸酯和油酸乙酯的非矿物油。在更具体的实施方式中，油佐剂包含液体石蜡油和维生素E-乙酸酯。在更具体的实施方式中，油佐剂是XSOLVE^TM。

施用：

本发明的疫苗可容易地通过任何标准途径施用，包括通过肠胃外施用，更具体地静脉内、肌内、皮下、口服、鼻内、皮内和/或腹膜内接种。本领域技术人员将理解，疫苗组合物优选地针对每种类型的受体动物和施用途径适当地配制。因此，本发明还提供免疫哺乳动物抗冠状病毒和/或其他动物病原体的方法。一种这样的方法包括向哺乳动物注射免疫有效量的本发明的人、猫科动物或雪貂疫苗，使得人、猫科动物或雪貂产生针对SARS-CoV-2刺突蛋白的适当抗体。另一种这样的方法包括向鸡注射免疫有效量的本发明的禽疫苗，使得鸡产生针对IBV刺突蛋白的适当抗体。在该方法中，“鸡”可以是任何年龄的鸡。在一个实施方式中，当应用所谓的卵内免疫鸡的方法时，鸡是胚胎。

以下实施例用于提供对本发明的进一步理解，但不意味着以任何方式限制本发明的有效范围。

进一步的方法和用途：

如上所述，本发明的重组载体可有利地用于根据本发明的疫苗或免疫原性组合物中，其可通过熟知的方法制备。对于不同的司法管辖区域，这些方面和实施方式也可以被不同地表述。

因此，在一个进一步的方面，本发明涉及用作疫苗的根据本发明的重组载体，其中所述疫苗有助于保护哺乳动物免受SARS-CoV-2感染，或所述疫苗有助于保护禽免受传染性支气管炎。在用作疫苗的重组载体的实施方式中，重组载体选自重组表达载体、重组病毒载体、DNA表达质粒、甲病毒RNA复制子颗粒和合成的mRNA，全部如本文所定义。

在一个进一步的方面，本发明涉及根据发明的重组载体用于制备疫苗的用途，其中所述疫苗有助于保护哺乳动物免受SARS-CoV-2感染，或者所述疫苗有助于保护禽免受传染性支气管炎。在重组载体用于制备疫苗的用途的实施方式中，重组载体选自重组表达载体、重组病毒载体、DNA表达质粒、甲病毒RNA复制子颗粒和合成的mRNA，全部如本文所定义。

在一个进一步的方面，本发明涉及制备根据本发明的疫苗的方法，该方法包括将根据本发明的重组载体与药学上可接受的载体混合。在制备疫苗的方法的实施方式中，重组载体选自重组表达载体、重组病毒载体、DNA表达质粒、甲病毒RNA复制子颗粒和合成的mRNA，全部如本文所定义。

实施例

以下缩写用于标记以下实施例中使用的冠状病毒刺突蛋白和嵌合冠状病毒刺突蛋白及其各自的核苷酸和氨基酸序列：

WT或wt：野生型蛋白质

SP：信号肽

RBD：受体结合结构域

ΔFCS：弗林蛋白酶切割位点的失活

ΔCTD：CTD去除

VSV：用水疱性口炎病毒的表面糖蛋白的TMD和CTD替代刺突蛋白的TMD和CTD。

2P：加入2P修饰以稳定原型的融合前构象。

Y¹¹⁴⁴A：ER-保留信号的功能性去除

3M：加入三聚化结构域

实施例1

核苷酸和氨基酸序列

IBV-Ma5-刺突[SEQ ID NO：1]

atgctggtgaccccactgctgctggtgacactgctgtgcgcactgtgctccgccgctctgtacgatagctccagctacgtgtactactacca

gagcgcattccggccccctgatggatggcacctgcacggcggagcctacgctgtggtgaacatctccagcgagagcaacaatgctggct

ccagctccggatgcacagtggggatcattcacgggggcagagtggtgaatgcaagctccattgcaatgactgcccccagctccggaatg

gcatggagctccagccagttttgcaccgcctactgcaactttagcgataccacagtgttcgtgacacactgctacaagcacggagggtgcc

caatcactggaatgctgcagcagcacagcattagggtgtccgcaatgaaaaacgggcagctgttctacaatctgacagtgagcgtggcca

agtaccccacttttaaatccttccagtgcgtgaacaatctgaccagcgtgtacctgaacggcgatctggtgtacaccagcaatgctactacc

gacgtgacatccgcaggagtgtactttaaggccggcggacctatcacatacaaagtgatgcgggaagtgagagcactggcctacttcgtg

aatggcactgctcaggatgtgattctgtgcgatggctccccaaggggactgctggcatgccagtacaacaccggcaatttcagcgacgga

ttttaccccttcacaaactccagcctggtgaagcagaaatttatcgtgtaccgcgagaacagcgtgaatacaactttcacactgcacaacttc

acttttcacaatgaaaccggagccaaccccaatcctagcggggtgcagaacattcagacataccagacccagacagctcagagcgggta

ctacaacttcaatttttccttcctgtccagctttgtgtacaaggagagcaacttcatgtacggcagctaccacccatcctgcaattttcggctgg

aaacaatcaacaatgggctgtggttcaactccctgagcgtgtccattgcttacggccctctgcagggcggctgcaaacagagcgtgttttcc

ggaagagccacctgctgctacgcttactcctacggagggccactgctgtgcaagggggtgtacagcggcgagctggatcacaatttcga

atgcggactgctggtgtacgtgaccaaaagcggcggcagcagaatccagactgccaccgagccacccgtgatcacacagcacaactac

aacaatattacactgaacacttgcgtggactacaatatctacgggagaactggccagggattcattaccaacgtgacagatagcgctgtgtc

ctacaattacctggctgacgcaggcctggcaatcctggataccagcggcagcatcgacatttttgtggtgcagtccgagtacggcctgaac

tactacaaagtgaatccctgcgaagatgtgaaccagcagttcgttgtgagcgggggcaaactggtgggaatcctgacaagccggaatga

gactgggtcccagctgctggaaaaccagttctacatcaagatcactaacggaaccagaaggttccgccggagcatcacagagtccgtgg

aaaactgcccttacgtgtcctacgggaagttttgcattaaaccagacggcagcatcgccactattgtgcccaagcagctggagcagtttgtg

gctcctctgctgaacgtgaccgaaaatgtgctgatcccaaacagcttcaatctgacagtgactgatgagtacattcagaccaggatggaca

aagtgcagatcaactgcctgcagtacatttgcgggaacagcctggaatgccgcaatctgttccagcagtacggccctgtgtgcgataacat

cctgagcgtggtgaacagcgtgggccagaaggaggacatggaactgctgaacttttactccagcactaaacccgccggcttcaacaccc

ctgtgctgagcaatgtgtccaccggagagtttaatatctccctgttcctgaccacaccatccagccccagaaggcgcagctttattgaggat

ctgctgttcacaagcgtggaatccgtggggctgcccactgatgacgcttacaagaactgcaccgcaggccctctgggattcctgaaagac

ctggcctgcgctcgcgagtacaatggcctgctggtgctgcctccaatcattacagctgaaatgcagatcctgtacacttccagcctggtggc

tagcatggcatttggagggatcactgcagccggggcaattcccttcgccacccagctgcaggcaaggatcaaccacctgggcattacaca

gtccctgctgctgaagaaccaggagaaaatcgctgccagcttcaataaggctattgggcacatgcaggaaggcttccgcagcacttccct

ggcactgcagcagatccaggatgtggtgaacaagcagtccgccattctgaccgagacaatggctagcctgaacaaaaattttggcgccat

ctccagcgtgatccaggaaatttaccagcagctggatgctatccaggcaaacgcccaggtggacaggctgattacaggacgcctgtcca

gcctgagcgtgctggcttccgcaaagcaggcagagtacatccgggtgtcccagcagagagagctggccacacagaagatcaacgaatg

cgtgaaaagccagtccattcggtacagcttctgcgggaatggcagacacgtgctgactatccctcagaacgccccaaatggcatcgtgttt

attcacttcagctacacccccgactcctttgtgaacgtgacagctatcgtgggattctgcgtgaagccagccaatgcttcccagtacgctatt

gtgcctgcaaacggaagagggatctttattcaagtgaatggaagctactacatcactgcaagggatatgtacatgcctcgcgccatcaccg

ctggggacattgtgactctgaccagctgccaggccaactacgtgtccgtgaataaaaccgtgatcactaccttcgtggataacgatgacttt

gatttcaatgacgagctgagcaagtggtggaacgacacaaaacacgaactgcctgattttgacaagttcaattacactgtgccaatcctgga

tattgacagcgagatcgataggattcagggagtgatccaggggctgaacgatagcctgattgacctggaaaaactgtccatcctgaagac

atacattaaatggccctggtacgtgtggctggcaatcgcctttgctaccatcattttcatcctgattctgggatgggtgttctttatgacagggtg

ctgcggctgctgctgcggatgctttgggattatgcccctgatgagcaagtgcgggaagaaatccagctactacacaactttcgataacgac

gtggtgaccgagcagtaccgccctaagaaaagcgtgtga

IBV-Ma5-刺突[SEQ ID NO：2]

MLVTPLLLVTLLCALCSAALYDSSSYVYYYQSAFRPPDGWHLHGGAYAVVNISSESNN

AGSSSGCTVGIIHGGRVVNASSIAMTAPSSGMAWSSSQFCTAYCNFSDTTVFVTHCYKH

GGCPITGMLQQHSIRVSAMKNGQLFYNLTVSVAKYPTFKSFQCVNNLTSVYLNGDLVY

TSNATTDVTSAGVYFKAGGPITYKVMREVRALAYFVNGTAQDVILCDGSPRGLLACQY

NTGNFSDGFYPFTNSSLVKQKFIVYRENSVNTTFTLHNFTFHNETGANPNPSGVQNIQTY

QTQTAQSGYYNFNFSFLSSFVYKESNFMYGSYHPSCNFRLETINNGLWFNSLSVSIAYGP

LQGGCKQSVFSGRATCCYAYSYGGPLLCKGVYSGELDHNFECGLLVYVTKSGGSRIQT

ATEPPVITQHNYNNITLNTCVDYNIYGRTGQGFITNVTDSAVSYNYLADAGLAILDTSGS

IDIFVVQSEYGLNYYKVNPCEDVNQQFVVSGGKLVGILTSRNETGSQLLENQFYIKITNG

TRRFRRSITESVENCPYVSYGKFCIKPDGSIATIVPKQLEQFVAPLLNVTENVLIPNSFNLT

VTDEYIQTRMDKVQINCLQYICGNSLECRNLFQQYGPVCDNILSVVNSVGQKEDMELL

NFYSSTKPAGFNTPVLSNVSTGEFNISLFLTTPSSPRRRSFIEDLLFTSVESVGLPTDDAYK

NCTAGPLGFLKDLACAREYNGLLVLPPIITAEMQILYTSSLVASMAFGGITAAGAIPFAT

QLQARINHLGITQSLLLKNQEKIAASFNKAIGHMQEGFRSTSLALQQIQDVVNKQSAILT

ETMASLNKNFGAISSVIQEIYQQLDAIQANAQVDRLITGRLSSLSVLASAKQAEYIRVSQ

QRELATQKINECVKSQSIRYSFCGNGRHVLTIPQNAPNGIVFIHFSYTPDSFVNVTAIVGF

CVKPANASQYAIVPANGRGIFIQVNGSYYITARDMYMPRAITAGDIVTLTSCQANYVSV

NKTVITTFVDNDDFDFNDELSKWWNDTKHELPDFDKFNYTVPILDIDSEIDRIQGVIQGL

NDSLIDLEKLSILKTYIKWPWYVWLAIAFATIIFILILGWVFFMTGCCGCCCGCFGIMPLM

SKCGKKSSYYTTFDNDVVTEQYRPKKSV

1-18信号肽(SP)

19-532 S1

533-537弗林蛋白酶切割位点(FCS)

538-1162S2

1092-1140跨膜结构域(TMD)

1141-1162C末端结构域(CTD)

IBV-Ma5-刺突-ΔFCS-VSV[SEQ ID NO：3]

gactgggtcccagctgctggaaaaccagttctacatcaagatcactaacggaaccgccgccttcgccgccagcatcacagagtccgtgg

atacattaaatcctccatcgcttccttcttcttcatcatcggcctgatcatcggactgtttctggtgctgagggtgggcatctacctgtgcatcaa

gctgaagcacactaagaagaggcagatctacaccgacatcgagatgaacaggctgggcaagtga

IBV-Ma5-S-ΔFCS-VSV[SEQ ID NO：4]

1-18信号肽(SP)

19-532 S1

533-537突变的FCS RRFRR->AAFAA

538-1091 S2

1092-1116VSV跨膜结构域(TMD)

1117-1140VSV C末端结构域(CTD)

IBV-Ma5-刺突-ΔFCS-2P-VSV[SEQ ID NO：5]

ctccagcgtgatccaggaaatttaccagcagctggatcccccccaggcaaacgcccaggtggacaggctgattacaggacgcctgtcca

gctgaagcacactaagaagaggcagatctacaccgacatcgagatgaacaggctgggcaagtga

IBV-Ma5-S-ΔFCS-2P-VSV[SEQ ID NO：6]

1-18信号肽(SP)

19-532 S1

533-537突变的FCS RRFRR->AAFAA

538-1091S2

859-860A859P+I860P替代

1092-1116VSV跨膜结构域(TMD)

1117-1140VSV C末端结构域(CTD)

SARS-CoV-2-刺突[SEQ ID NO：7]

atgttcgtgttcctggtgctgctgcccctggtgtccagccagtgcgtgaacctgaccaccaggacccagctgccaccagcctacaccaaca

gcttcaccaggggcgtgtactaccccgacaaagtgttcagatcttccgtgctgcacagcacccaggacctgttcctgcccttcttctctaacg

tgacctggttccacgccatccacgtgtccggcaccaacggcaccaagaggttcgacaaccccgtgctgcccttcaacgacggcgtgtact

tcgccagcaccgagaagtctaacatcatcagaggctggatcttcggcaccaccctggactccaaaacccagagcctgctgatcgtgaaca

acgccaccaacgtggtcatcaaggtgtgcgagttccagttctgtaacgaccccttcctgggcgtgtactaccacaagaacaacaaatcttg

gatggagtccgagttcagggtgtacagctctgccaacaactgcaccttcgagtacgtgagccagcccttcctgatggacctggaaggcaa

gcagggcaacttcaaaaacctgcgggagttcgtgttcaagaacatcgacggctacttcaagatctacagcaaacacacccccatcaacct

ggtgcgcgacctgccacagggcttctctgccctggagccactggtggacctgccaatcggcatcaacatcaccaggttccagaccctgct

ggccctgcacagatcctacctgaccccaggcgactccagctctggatggaccgctggagctgccgcctactacgtgggctacctgcagc

cccggaccttcctgctgaaatacaacgagaacggaaccatcaccgacgctgtggactgcgctctggacccactgtctgaaaccaagtgta

ccctgaaatccttcaccgtggagaagggcatctaccagacctccaacttccgggtgcagcccaccgaaagcatcgtgcgcttccccaaca

tcaccaacctgtgccccttcggcgaggtgttcaacgctaccaggttcgctagcgtgtacgcttggaaccggaagcgcatcagcaactgcgt

ggccgactactctgtgctgtacaactccgccagcttctctaccttcaagtgctacggcgtgtcccccaccaaactgaacgacctgtgcttca

ccaacgtgtacgccgacagcttcgtgatcaggggcgacgaggtgcgccagatcgctccaggacagaccggcaagatcgctgactacaa

ctacaaactgcccgacgacttcaccggctgcgtgatcgcctggaactctaacaacctggactccaaagtgggcggcaactacaactacct

gtacaggctgttcagaaagtctaacctgaaacccttcgagcgggacatcagcaccgaaatctaccaggctggatctaccccatgcaacgg

agtggagggcttcaactgttacttccccctgcagtcctacggcttccagccaaccaacggagtgggataccagccatacagggtggtggt

gctgtctttcgaactgctgcacgctccagctaccgtgtgcggacccaagaaatccaccaacctggtgaagaacaaatgcgtgaacttcaac

ttcaacggactgaccggaaccggcgtgctgaccgagagcaacaagaaattcctgcccttccagcagttcggccgggacatcgctgacac

caccgacgccgtgcgcgacccccagaccctggaaatcctggacatcaccccctgcagcttcggcggcgtgtctgtgatcaccccaggaa

ccaacacctccaaccaggtggccgtgctgtaccaggacgtgaactgtaccgaggtgccagtggctatccacgctgaccagctgacccca

acctggagggtgtactctaccggctccaacgtgttccagaccagagctggatgcctgatcggagctgagcacgtgaacaactcctacgaa

tgcgacatccccatcggcgccggcatctgtgccagctaccagacccagaccaacagcccaaggagagccaggtctgtggcttcccaga

gcatcatcgcctacaccatgtccctgggcgccgaaaacagcgtggcctacagcaacaactctatcgccatccccaccaacttcaccatca

gcgtgaccaccgagatcctgcccgtgtccatgaccaagaccagcgtggactgcaccatgtacatctgtggcgacagcaccgaatgctcta

acctgctgctgcagtacggctccttctgtacccagctgaacagagccctgaccggaatcgctgtggagcaggacaaaaacacccaggaa

gtgttcgcccaggtgaagcagatctacaaaaccccccccatcaaggacttcggcggcttcaacttctcccagatcctgcccgacccctcca

agcccagcaaaaggtctttcatcgaggacctgctgttcaacaaggtgaccctggccgacgccggcttcatcaaacagtacggcgactgcc

tgggcgacatcgctgctagagacctgatctgtgcccagaagttcaacggactgaccgtgctgccaccactgctgaccgacgaaatgatcg

ctcagtacacctctgccctgctggctggaaccatcacctccggatggaccttcggcgctggagccgccctgcagatccccttcgccatgca

gatggcctacagattcaacggcatcggcgtgacccagaacgtgctgtacgagaaccagaagctgatcgccaaccagttcaacagcgcca

tcggcaaaatccaggactctctgtccagcaccgcttccgccctgggcaaactgcaggacgtggtgaaccagaacgcccaggccctgaac

accctggtgaagcagctgtcttccaacttcggcgccatcagctctgtgctgaacgacatcctgtccaggctggacaaagtggaggccgaa

gtgcagatcgacaggctgatcaccggcagactgcagagcctgcagacctacgtgacccagcagctgatcagggctgctgaaatcaggg

cttctgccaacctggctgctaccaagatgtccgagtgcgtgctgggccagagcaagagagtggacttctgtggcaaaggctaccacctga

tgtccttcccacagagcgccccacacggagtggtgttcctgcacgtgacctacgtgcccgcccaggagaagaacttcaccaccgctcca

gctatctgccacgacggcaaagctcacttcccaagggaaggcgtgttcgtgtccaacggcacccactggttcgtgacccagcgcaacttc

tacgagccccagatcatcaccaccgacaacaccttcgtgagcggcaactgtgacgtggtcatcggaatcgtgaacaacaccgtgtacgac

ccactgcagccagagctggactctttcaaggaggaactggacaagtacttcaaaaaccacacctccccagacgtggacctgggcgacat

ctctggcatcaacgcctccgtggtgaacatccagaaggagatcgacaggctgaacgaagtggccaaaaacctgaacgaaagcctgatc

gacctgcaggagctgggcaagtacgaacagtacatcaaatggccctggtacatctggctgggcttcatcgccggcctgatcgccatcgtg

atggtgaccatcatgctgtgctgtatgacctcctgctgtagctgcctgaagggctgctgttcttgtggctcctgctgtaaattcgacgaggac

gactccgaacccgtgctgaagggcgtgaaactgcactacacctga

SARS-CoV-2-刺突[SEQ ID NO：8]

1-13信号肽(SP)

14-681 S1

333-527受体结合结构域(RBD)

682-685弗林蛋白酶切割位点(FCS)

686-1211S2

1212-1255跨膜结构域(TMD)

1256-1273C末端结构域(CTD)

SARS-CoV-2-刺突-ΔFCS-VSV[SEQ ID NO：9]

atgttcgtgttcctggtgctgctgcccctggtgtccagccagtgcgtgaacctgaccaccagaacccagctgccaccagcctacaccaaca

gcttcacccggggcgtgtactaccccgacaaagtgttccgctcttccgtgctgcactctacccaggacctgttcctgcccttcttctccaacg

tcgcctctaccgagaagtccaacatcatcagaggctggatcttcggcaccaccctggacagcaaaacccagtctctgctgatcgtgaacaa

cgccaccaacgtggtcatcaaggtgtgcgagttccagttctgtaacgaccccttcctgggcgtgtactaccacaagaacaacaaatcctgg

atggagagcgagttcagggtgtacagctctgccaacaactgtaccttcgagtacgtgagccagcccttcctgatggacctggaaggcaag

cagggcaacttcaaaaacctgcgggagttcgtgttcaagaacatcgacggctacttcaagatctactctaaacacacccccatcaacctggt

gcgcgacctgccacagggcttctccgccctggagccactggtggacctgcccatcggcatcaacatcaccaggttccagaccctgctgg

ccctgcaccgctcctacctgaccccaggcgactccagctctggatggaccgctggagctgccgcctactacgtgggctacctgcagccc

aggaccttcctgctgaaatacaacgaaaacggaaccatcaccgacgctgtggactgcgctctggacccactgtccgaaaccaagtgtacc

ctgaaaagcttcaccgtggagaagggcatctaccagaccagcaacttcagggtgcagcccaccgaatctatcgtgagattccccaacatc

accaacctgtgccccttcggcgaggtgttcaacgccaccagattcgccagcgtgtacgcctggaacaggaagagaatctctaactgcgtg

gccgactactccgtgctgtacaactctgcctccttcagcaccttcaagtgctacggcgtgagccccaccaaactgaacgacctgtgcttcac

caacgtgtacgccgactctttcgtgatcaggggcgacgaggtgagacagatcgctccaggacagaccggcaagatcgctgactacaact

acaaactgcccgacgacttcaccggctgcgtgatcgcctggaactccaacaacctggacagcaaagtgggcggcaactacaactacctg

taccggctgttccgcaagagcaacctgaaacccttcgagcgggacatctctaccgaaatctaccaggctggatccaccccatgcaacgga

gtggagggcttcaactgttacttccccctgcagtcctacggcttccagccaaccaacggagtgggataccagccatacagggtggtggtg

ctgtccttcgaactgctgcacgctccagctaccgtgtgcggacccaagaaaagcaccaacctggtgaagaacaaatgcgtgaacttcaac

ttcaacggactgaccggaaccggcgtgctgaccgagagcaacaagaaattcctgcccttccagcagttcggaagggacatcgctgacac

caccgacgccgtgagagacccacagaccctggaaatcctggacatcaccccctgctctttcggcggcgtgtccgtgatcaccccaggaa

acctggagggtgtacagcaccggctctaacgtgttccagaccagagctggatgcctgatcggagctgagcacgtgaacaacagctacga

atgcgacatccccatcggcgccggcatctgtgcctcttaccagacccagaccaactctccagctgccgcccggtccgtggcttctcagtcc

atcatcgcctacaccatgagcctgggcgccgaaaactctgtggcctactccaacaacagcatcgccatccccaccaacttcaccatcagc

gtgaccaccgagatcctgcccgtgagcatgaccaagacctctgtggactgcaccatgtacatctgtggcgactctaccgaatgctccaacc

tgctgctgcagtacggctccttctgtacccagctgaaccgcgccctgaccggaatcgctgtggagcaggacaaaaacacccaggaagtg

ttcgcccaggtgaagcagatctacaaaaccccccccatcaaggacttcggcggcttcaacttctcccagatcctgcccgacccctctaagc

cctccaaaaggagcttcatcgaggacctgctgttcaacaaggtgaccctggccgacgccggcttcatcaaacagtacggcgactgcctgg

gcgacatcgctgctagagacctgatctgtgcccagaagttcaacggactgaccgtgctgccaccactgctgaccgacgaaatgatcgctc

agtacacctccgccctgctggctggaaccatcaccagcggatggaccttcggcgctggagccgccctgcagatccccttcgccatgcag

atggcctacaggttcaacggcatcggcgtgacccagaacgtgctgtacgagaaccagaagctgatcgccaaccagttcaacagcgccat

cggcaaaatccaggactccctgtccagcaccgctagcgccctgggcaaactgcaggacgtggtgaaccagaacgcccaggccctgaa

caccctggtgaagcagctgtcttccaacttcggcgccatcagctctgtgctgaacgacatcctgtcccggctggacaaagtggaggccga

agtgcagatcgacaggctgatcaccggccgcctgcagtctctgcagacctacgtgacccagcagctgatcagggccgccgaaatcaga

gcctccgccaacctggccgccaccaagatgagcgagtgcgtgctgggccagtctaagcgcgtggacttctgtggcaaaggctaccacct

gatgagcttcccacagtctgccccacacggagtggtgttcctgcacgtgacctacgtgcccgcccaggagaagaacttcaccaccgctcc

agctatctgccacgacggcaaagctcacttcccaagggaaggcgtgttcgtgagcaacggcacccactggttcgtgacccagcgcaactt

ctacgagccccagatcatcaccaccgacaacaccttcgtgtccggcaactgtgacgtggtcatcggaatcgtgaacaacaccgtgtacga

cccactgcagccagagctggactccttcaaggaggaactggacaagtacttcaaaaaccacaccagcccagacgtggacctgggcgac

atctccggcatcaacgccagcgtggtgaacatccagaaggagatcgacaggctgaacgaagtggccaaaaacctgaacgaaagcctga

tcgacctgcaggagctgggcaagtacgaacagtacatcaaatccagcatcgcctccttcttcttcatcatcggcctgatcatcggcctgttcc

tggtgctgagagtgggcatctacctgtgcatcaagctgaaacacaccaagaaacggcagatctacaccgacatcgagatgaaccgcctg

ggcaagtga

SARS-CoV-2-刺突-ΔFCS-VSV[SEQ ID NO：10]

1-13信号肽(SP)

14-681 S1

333-527受体结合结构域(RBD)

682-685突变的FCS RRAR->AAAR

686-1211S2

1212-1236VSV跨膜结构域(TMD)

1237-1260VSV C末端结构域(CTD)

SARS-CoV-2-刺突-ΔFCS-2P-VSV[SEQ ID NO：11]

accaacctgtgccccttcggcgaggtgttcaacgccaccagattcgccagcgtgtacgcctggaacaggaaaagaatctctaactgcgtg

caccctggtgaagcagctgtcttccaacttcggcgccatcagctctgtgctgaacgacatcctgtccaggctggacccaccagaggctga

ggcaagtga

SARS-CoV-2-刺突-ΔFCS-2P-VSV[SEQ ID NO：12]

1-13 信号肽(SP)

14-681 S1

333-527受体结合结构域(RBD)

682-685突变的FCS RRAR->AAAR

686-1211S2

986-987K986P+V987P替代

1212-1236VSV跨膜结构域(TMD)

1237-1260VSV C末端结构域(CTD)

序列表

实施例2

SARS-CoV-2和IBV刺突蛋白编码序列纳入到VEEV RNA复制子颗粒中

甲病毒RNA复制子构建

制备包含甲病毒RNA复制子颗粒的疫苗，所述甲病毒RNA复制子颗粒编码密码子优化的SARSCoV2刺突蛋白(SARS-CoV-2-S-wt)，相应的SARS-CoV-2刺突嵌合刺突蛋白(SARS-CoV-2-S-ΔFCS、SARS-CoV-2-S-ΔFCS-2P、SARS-CoV-2-S-ΔFCS-ΔCTD、SARS-CoV-2-S-ΔFCS-VSV、SARS-CoV-2-S-ΔFCS-2P-VSV)和密码子优化的IBV刺突(IBV-S-wt)和相应的IBV刺突嵌合刺突蛋白(IBV-S-2P-ΔCTD、IBV-S-2P-Y1144A、IBV-S-2P-VSV)。

SARS-CoV-2刺突蛋白基因RP的产生。

用于表达SARS-CoV-2刺突基因的VEEV复制子载体如先前所述构建[参见，U.S.9,441,247B2；其内容通过引用并入本文]，并带有以下修饰。用限制酶AscI和PacI消化VEEVTC-83衍生的复制子载体“pVEK”[在U.S.9,441,247B2中公开和描述]以产生载体“pVHV”。来自SARS-CoV-2的毒株2019-nCoV/USA-WI1/2020(GenBank accession MT039887)的刺突蛋白基因序列，针对猫的密码子使用表进行密码子优化，并被合成为带侧翼AscI和PacI位点。合成的基因和pVHV载体各自用AscI和PacI酶消化并连接以产生载体“pVHV-SARS-CoV-2-刺突”。对质粒批次测序以确认正确的载体和插入物身份。

SARS-CoV-2刺突蛋白基因RNA RP的产生。

如前所述构建用于表达SARS-CoV-2刺突(SARS-CoV-2-S-wt)基因和相应的SARS-CoV-2刺突嵌合刺突蛋白(SARS-CoV-2-S-ΔFCS、SARS-CoV-2-S-ΔFCS-2P、SARS-CoV-2-S-ΔFCS-ΔCTD、SARS-CoV-2-S-ΔFCS-VSV、SARS-CoV-2-S-ΔFCS-2P-VSV)的VEEV复制子载体[参见U.S.9,441,247B2；其内容通过引用并入本文]，并带有以下修饰。用限制酶AscI和PacI消化VEEV TC-83衍生的复制子载体“pVEK”[在U.S.9,441,247B2中公开和描述]以产生载体“pVHV”。来自SARS-CoV-2的毒株2019-nCoV/USA-WI1/2020(GenBank accessionMT039887)的刺突蛋白基因序列和相应的SARS-CoV-2刺突嵌合刺突蛋白)被进行密码子优化并被合成为带侧翼AscI和PacI位点。合成的基因和pVHV载体各自用AscI和PacI酶消化并连接以产生载体“pVHV-SARS-CoV-2-刺突”。对质粒批次测序以确认正确的载体和插入物身份。

IBV刺突蛋白基因RNA RP的产生。

与来自SARS-CoV-2的刺突蛋白基因序列相似，来自IBV的毒株Ma5(GenBankaccession KY626045)的刺突蛋白基因序列被进行密码子优化并被合成为带侧翼AscI和PacI位点。用于表达IBV刺突(IBV-S-wt)基因和相应的IBV刺突嵌合刺突蛋白(IBV-S-2P-CTD、IBV-S-2P-Y1144A、IBV-S-2P-VSV、IBV-S-ΔFCS、IBV-S-ΔFCS-2P、IBV-S-ΔFCS-ΔCTD、IBV-S-ΔFCS-VSV、IBV-S-ΔFCS-2P-VSV)的VEEV复制子载体如上述SARS-CoV-2刺突蛋白所述构建。因此，与来自SARS-CoV-2的刺突蛋白基因序列相似，来自IBV的毒株Ma5(GenBank accession KY626045)的刺突蛋白基因序列被进行密码子优化并被合成为带侧翼AscI和PacI位点。合成的基因和pVHV载体各自用AscI和PacI酶消化并连接以产生载体“pVHV-IBV-Ma5-刺突”。对质粒批次测序以确认正确的载体和插入物身份。

VEEV TC-83RNA RP的生产根据先前描述的方法进行[U.S.9,441,247B2和U.S.8,460,913B2；其内容通过引用并入本文]。简言之，在使用MegaScript T7 RNA聚合酶和帽类似物进行体外转录之前，用NotI限制酶将pVHV-刺突复制子载体DNA和辅助DNA质粒线性化。重要的是，如前所述，用于生产的辅助RNA缺乏VEEV亚基因组启动子序列[Kamrud等,J GenVirol.91(Pt 7):1723-1727(2010)]。将用于复制子和辅助成分的纯化RNA组合并与Vero细胞的悬浮液混合，在4mm比色皿中电穿孔，并返回到无血清培养基中。孵育过夜后，通过使悬浮液通过深层过滤器，用含有5％蔗糖(w/v)的磷酸盐缓冲盐水洗涤，最后用400mM NaCl+5％蔗糖(w/v)缓冲液洗脱保留的RP，从细胞和培养基中纯化甲病毒RNA复制子颗粒。将洗脱的RP通过0.22微米膜过滤器，并被分装成等分试样进行储存。通过对感染的Vero细胞单层进行免疫荧光检测来确定功能性RP的滴度。然后可以将所得的编码密码子优化的SARS-CoV-2刺突蛋白的增殖缺陷型甲病毒RNA复制子颗粒置于无佐剂或有佐剂的疫苗制剂中并施用于动物受试者。

实施例3

使用IFA在培养的细胞中表达IBV刺突抗原

为了研究IBV刺突抗原在宿主细胞中的表达，使用根据本发明的多肽递送至宿主细胞的不同形式进行一系列实验。应用不同的染色技术显现这些表达的类型和位置。

来自Vero细胞中质粒DNA的IBV刺突抗原

为了确定弗林蛋白酶切割位点的失活(ΔFCS)、C末端结构域(ΔCTD)的去除或刺突蛋白TMD和CTD被VSV的表面糖蛋白TMD和CTD的替代、脯氨酸突变(2P)、三聚化结构域(3M)的加入或ER保留信号(Y¹¹⁴⁴A)的突变对IBV刺突抗原的表达水平是否有任何影响，用驱动IBV刺突抗原产生并被用于免疫荧光检测(IFA)的pCAGGS表达质粒转染Vero细胞。

材料和方法

Vero细胞在补充有10％FCS、L-谷氨酰胺和1％非必需氨基酸的DMEM中培养。将用于转染的细胞以25.000个细胞/cm²的密度接种在0.5ml培养基中的24孔簇中，并在37℃，5％CO₂下孵育。第二天，根据制造商的说明书，使用Lipofectamine3000^TM(ThermoFisher)，在每孔50μl转染混合物中，用500ng pCAGGS质粒DNA转染Vero细胞的半汇合单层。转染/感染后24小时，将细胞用每孔～1ml磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤一次并在-20℃下用每孔0.5ml96％乙醇固定30分钟。使用每孔～1ml洗涤缓冲液(PBS+0.15％聚山梨酯20)将细胞洗涤三次，并且在室温下用来自Charles River的INT-M41-01-03小鼠单克隆抗体或鸡多克隆抗体血清在0.25mlIBEIA缓冲液(PBS+0.05％聚山梨酯20+0.1％BSA)中1小时使刺突抗原可视化。在室温下，在0.25mlIBEIA缓冲液中，使用二抗山羊抗小鼠IgG Alexa488或山羊抗鸡IgG Alexa568抗体(ThermoFisher)将结合的抗体染色1小时。在染色之间和最终染色之后，用洗涤缓冲液洗涤细胞3次。使用荧光显微镜分析染色的细胞。

结果

针对IBV-Mass的小鼠单克隆抗体和鸡多克隆抗体血清都可以可视化Vero细胞中的刺突抗原表达。修饰C末端结构域或ER保留信号似乎将染色模式改变为更接近质膜。使用该分析技术不能正确评估与其他刺突变体抗原的表达水平差异。

来自HeLa细胞中质粒DNA的IBV刺突抗原

为了确定弗林蛋白酶切割位点(ΔFCS)的失活、C末端结构域(ΔCTD)的去除或刺突蛋白TMD和CTD被VSV的表面糖蛋白TMD和CTD的替代、脯氨酸突变(2P)、三聚化结构域(3M)的加入或ER保留信号(Y¹¹⁴⁴A)的突变或其组合是否对IBV刺突抗原的表达水平具有任何影响，用驱动IBV刺突抗原产生并用于免疫荧光检测(IFA)的pCAGGS表达质粒转染HeLa细胞。

材料和方法

将HELA细胞以100000个细胞/cm²的密度接种在24孔簇中的DMEM/10％FCS/PS中。第二天，使用聚乙烯亚胺(Polysciences Inc.)，用625ng pCAGGS2质粒转染细胞，DNA:PEI的比率为1：10。在OptiMEM(Lonza)中制备转染混合物，涡旋15秒，然后在室温下孵育20分钟。然后，每孔加入50μL混合物，与细胞孵育7小时后更换培养基。转染后24小时，在每个孔中加入50μL含有DAPI的培养基(终稀释度每孔1：4000)并孵育15-30分钟，然后去除培养基，用DPBS(1xDPBS，无钙和镁，Lonza)洗涤单层一次，之后用3％PFA固定。固定1小时后，将细胞再次用DPBS洗涤，在4℃下用0.5％皂苷透化(或不透化)15分钟，并在3％BSA(封闭溶液)中封闭1小时。然后将玻璃载玻片与在封闭缓冲液中以1：100稀释的抗IBV S mAb(INT-M41-01-03,MSD Animal Health)在RT下孵育1小时。然后用0.05％Tween20溶液进行3次5分钟的洗涤步骤，加入在封闭缓冲液中以1：400稀释的二抗(驴抗小鼠IgG Alexa488，Molecularprobes)。再孵育1小时后，用0.05％Tween20溶液再次洗涤细胞3次，用DPBS洗涤1次。用Olympus BX60荧光显微镜收集图像之前，使用10μL FluorProtect^TM试剂(Millipore)固定载玻片并在室温下保存过夜。除非另有说明，所有溶液均在DPBS中制备。

结果

缺失C末端结构域或将IBV TM-CTD替换为其VSV的对应物强烈地增强了细胞表面表达。此外，ER保留信号中的单个氨基酸替代似乎导致细胞表面定位的同样增加。引入2P替代或突变弗林蛋白酶切割位点提高了总体抗原表达水平，而通过引入额外的三聚化结构域(3M)稳定IBV刺突三聚体降低了刺突表达水平。值得注意的是，对弗林蛋白酶切割位点和对2P的修饰都影响表达水平，而Y¹¹⁴⁴A、CTD和VSV的修饰影响蛋白质定位(参见下表1)。这表明这些修饰的组合将是有益的。

表1

使用免疫荧光检测的体外研究

	定位	表达水平
			IBV刺突_wt	细胞内	+
IBV刺突-ΔFCS	细胞内	++
			IBV刺突-ΔFCS-Y1144A	细胞表面	++
IBV刺突-ΔFCS-ΔCTD	细胞表面	++
			IBV刺突-ΔFCS-VSV	细胞表面	++
IBV刺突-ΔFCS-3M	细胞内	-
			IBV刺突-ΔFCS-ΔCTD-2P	细胞表面	+++
模拟	-	-

来自Vero细胞中pVAX质粒DNA疫苗的IBV刺突抗原

为了确定弗林蛋白酶切割位点的失活(ΔFCS)、CTD的修饰[通过缺失IBV刺突蛋白的CTD(ΔCTD)或通过VSV表面糖蛋白的TMD和CTD替代刺突蛋白的TMD和CTD]、脯氨酸突变(2P)或ER保留信号突变(Y¹¹⁴⁴A)的组合是否对IBV刺突抗原的表达水平和/或细胞表面定位具有任何影响，用驱动IBV刺突抗原产生并用于免疫荧光检测(IFA)的pVAX质粒DNA疫苗转染Vero细胞。

材料和方法

Vero细胞在补充有10％FCS、L-谷氨酰胺和1％非必需氨基酸的DMEM中培养。将用于转染的细胞以25.000个细胞/cm²的密度接种在24孔簇中的0.5ml培养基中，并在37℃，5％CO₂下孵育。第二天，根据制造商的说明书，使用Lipofectamine3000^TM(ThermoFisher)，在每孔50μl转染混合物中，用500ng pVAX质粒DNA转染Vero细胞的半汇合单层。转染/感染后24小时，将细胞用每孔～1ml磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤一次并在-20℃下用每孔0.5ml96％乙醇固定30分钟或在室温下使用0.5ml4％PFA在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中固定15分钟。后一种类型的固定确保细胞膜仍然是完整的，因此观察到的任何信号必须在细胞表面表达。使用每孔～1ml洗涤缓冲液(PBS+0.15％聚山梨酯20)将细胞洗涤三次，并且在室温下用来自Charles River的INT-M41-01-03小鼠单克隆抗体或鸡多克隆抗体血清在0.25mlIBEIA缓冲液(PBS+0.05％聚山梨酯20+0.1％BSA)中1小时使刺突抗原可视化。在室温下，在0.25mlIBEIA缓冲液中，使用二抗山羊抗小鼠IgG Alexa488或山羊抗鸡IgGAlexa568抗体(ThermoFisher)将结合的抗体染色1小时。在染色之间和最终染色之后，用洗涤缓冲液洗涤细胞3次。使用荧光显微镜分析染色的细胞。

结果

缺失C末端结构域(ΔCTD)或ER保留信号(Y¹¹⁴⁴A)中的单个氨基酸替代与2P替代(2P)和弗林蛋白酶切割位点突变(ΔFCS)组合似乎导致最佳表达水平以及细胞表面表达。TM-CTD替代VSV的组合与ΔFCS-2P改变的组合增加了蛋白质的表达水平和定位，但程度小于其他两种组合。该最初的体外数据显示，ΔFCS-2P修饰与C末端结构域的消除、ER保留信号(Y¹¹⁴⁴A)中的氨基酸替代或VSV的CTD对IBV CTD的替代的组合，都导致细胞表面表达以及IBV刺突蛋白的总表达的增加。然而，有趣的是，在该体外数据中没有观察到在相应的体内数据(见下文)中发现的用VSV的CTD替代IBV CTD较之其他两种修饰的IBV刺突蛋白的优越性。

表2

使用免疫荧光检测的进一步体外研究

	细胞表面表达水平	总表达水平
			IBV刺突_wt	-	+
IBV刺突-ΔFCS-2P-ΔCTD	+++	+++
			IBV刺突-ΔFCS-2P-Y1144A	+++	+++
IBV刺突-ΔFCS-2P-VSV	++	++
			模拟	-	-

实施例4

IBV刺突抗原在HEK293细胞中表达的流式细胞术分析

为了确定对弗林蛋白酶切割位点(ΔFCS)的修饰、C末端结构域(ΔCTD或VSV)的修饰、脯氨酸突变(2P)、三聚化结构域(3M)的加入或ER保留信号(Y¹¹⁴⁴A)的突变是否对IBV刺突抗原的表达水平具有任何影响，将HEK293细胞用pCAGGS表达质粒转染，如流式细胞术分析，该表达质粒驱动IBV刺突抗原的产生。

材料和方法

HEK293T细胞在DMEM/10％FCS/PS中培养，并以100.000细胞/cm²的密度接种在6孔簇中。第二天，使用聚乙烯亚胺(Polysciences Inc.)，用2.5μg pCAGGS2质粒DNA转染细胞，DNA:PEI的比率为1：10。在OptiMEM(Lonza)中制备转染混合物，涡旋15秒，然后在室温下孵育20分钟。随后，每孔加入200μL混合物，与细胞温育7小时后更换培养基。在转染后24小时，用DPBS(1×DPBS，无钙和镁，Lonza)洗涤单层一次，并在室温下加入0.32mL TrypLE^TM(胰蛋白酶替代试剂，Gibco)解离细胞3-5分钟。接下来，将细胞与DMEM(至多1mL)混合并将10μL悬浮液用于计数(Invitrogen，CountessII)，同时通过离心5min/1000rpm使剩余的沉淀。除去培养基并将细胞在冰上用2％PFA固定20分钟。固定后细胞被沉淀(5min/2500rpm/4℃)，在冰上用0.5％皂苷透化(或不透化)20min，并在冰上在3％BSA(封闭溶液)中封闭1h。来自每个样品的大约4×10E5个细胞进一步用于分析，一式两份。将封闭的细胞移至圆底96孔簇中，沉淀并与在封闭缓冲液中以1：200稀释的一抗(mAbs INT-m41-01-03or INT-m41-01-08,MSD Animal Health)一起孵育。然后用0.05％Tween20溶液进行3次5分钟的洗涤步骤，以1：200的稀释度在封闭缓冲液中加入二抗(山羊抗小鼠或驴抗小鼠IgG Alexa488，Molecular probes)。孵育1小时后，用0.05％Tween20溶液再次洗涤细胞3次，并重悬于FACS缓冲液(2％BSA、5mMEDTA、0.02％NaN3)中，然后用CytoFLEX LX^TM(Beckman Coulter)分析。

结果

FACS分析证实了IFA结果：除了弗林蛋白酶切割位点突变(ΔFCS)之外，ER保留信号的突变(Y¹¹⁴⁴A)、C末端结构域的缺失(ΔCTD)和VSV的TMD-CTD的存在改善了IBV S变体的表面表达。用含有ΔFCS-2P以及VSV的TM-CT结构域的变体获得了最高的表面表达和总表达。3M变体具有最低的表面表达。

表3

使用流式细胞术分析的体外研究

	细胞表面表达水平	总表达水平
			IBV刺突_wt	+	+
IBV刺突-ΔFCS	+	+
			IBV刺突-ΔFCS-Y1144A	++	++
IBV刺突-ΔFCS-ΔCTD	++	++
			IBV刺突-ΔFCS-VSV	+++	+++
IBV刺突-ΔFCS-3M	-	+
			IBV刺突-ΔFCS-ΔCTD-2P	+++	+++
IBV刺突-ΔFCS-2P-Y1144A	+++	+++
			IBV刺突-ΔFCS-2P-VSV	+++	+++
模拟	-	-

实施例5

使用IFA在培养的细胞中的SARS-CoV-2刺突抗原的表达

为了研究SARS-CoV-2刺突抗原在宿主细胞中的表达，使用将根据本发明的多肽递送至宿主细胞的不同形式进行一系列实验。应用不同的染色技术显现这些表达的类型和位置。

在VERO细胞中使用pVAX质粒DNA和VEEV RP疫苗的SARS-CoV-2刺突抗原

为了确定失活弗林蛋白酶切割位点(ΔFCS)、C末端结构域的修饰(ΔCTD或VSV)或脯氨酸突变(2P)的组合是否对SARS-CoV-2刺突抗原的表达水平和/或细胞表面定位有任何影响，用pVAX质粒DNA疫苗转染Vero细胞或用驱动刺突抗原产生并用于免疫荧光检测(IFA)的VEEV RP感染Vero细胞。

材料和方法

Vero细胞在补充有10％FCS、L-谷氨酰胺和1％非必需氨基酸的DMEM中培养。将用于转染的细胞以25.000个细胞/cm²的密度接种在24孔簇中的0.5ml培养基中，并在37℃，5％CO₂下孵育。第二天，根据制造商的说明书，使用Lipofectamine3000(ThermoFisher)在50μl转染混合物中用500ngpVAX质粒DNA转染Vero细胞的半汇合单层，或用每孔5.0×10E5的VEEV RP感染。我们的24个转染/感染后，将细胞用每孔～1ml磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤一次并在-20℃下用每孔0.5ml96％乙醇固定30分钟。使用每孔～1ml洗涤缓冲液(PBS+0.15％聚山梨酯20)将细胞洗涤三次，并使用针对SARS-CoV-2的S1A结构域的CR3022人单克隆抗体或兔多克隆抗体在0.25mlIBEIA缓冲液(PBS+0.05％聚山梨酯20+0.1％BSA)中在室温下1小时使刺突抗原可视化。在室温下，在0.25mlIBEIA缓冲液中，使用二抗山羊抗人IgGAlexa488和山羊抗兔IgG Alexa568抗体(ThermoFisher)将结合的抗体染色1小时。在染色之间和最终染色之后，用洗涤缓冲液洗涤细胞3次。使用荧光显微镜分析染色的细胞。

结果

针对SARS-CoV-2的S1A结构域的CR3022人单克隆抗体和兔多克隆抗体都可以显现Vero细胞中的刺突抗原表达。当从pVAX质粒DNA疫苗平台以及VEEV-RP疫苗平台生产抗原时，失活的弗林蛋白酶切割位点(ΔFCS)增加抗原表达水平。使用该分析技术，在表达水平和/或定位方面没有观察到与其他刺突变体抗原的明显差异。

表4

使用免疫荧光检测的体外研究

	pVAX DNA疫苗	VEEV RP疫苗
			SARS-CoV-2刺突wt	+	++
SARS-CoV-2刺突-ΔFCS	++	+++
			SARS-CoV-2刺突-ΔFCS-2P	++	+++
SARS-CoV-2刺突-ΔFCS-ΔCTD	++	+++
			SARS-CoV-2刺突-ΔFCS-VSV	++	+++
SARS-CoV-2刺突-ΔFCS-VSV-2P	++	+++
			模拟	-

在HeLa细胞中使用pVAX质粒DNA和VEV RP疫苗的SARS-CoV-2刺突抗原

为了确定灭活的弗林蛋白酶切割位点(ΔFCS)、C末端结构域的修饰(ΔCTD或VSV)或脯氨酸突变(2P)的组合是否对SARS-CoV-2刺突抗原的表达水平和/或细胞表面定位有任何影响，用驱动刺突抗原产生并用于免疫荧光检测(IFA)的pCAGGS表达质粒转染HELA细胞。

材料和方法

将HeLa细胞以40.000个细胞/cm²的密度接种在含有玻璃载玻片(1cm直径)的24孔簇中的DMEM/10％FCS/PS中。第二天，使用聚乙烯亚胺(Polysciences Inc.)，用625ngpCAGGS2质粒DNA转染细胞，DNA：PEI的比率为1：10。在optimem OptiMEM(Lonza)中制备转染混合物，涡旋15秒，然后在室温下孵育20分钟。然后，每孔加入50μL混合物，与细胞孵育7小时后更换培养基。转染后24小时，在每个孔中加入50μL含有DAPI的培养基(终稀释度每孔1：4000)并孵育15-30分钟，之后除去培养基，用DPBS(1xDPBS，无钙和镁，Lonza)洗涤单层一次，随后用3％PFA固定。固定1小时后，将细胞再次用DPBS洗涤并在3％BSA(封闭溶液)中封闭1小时。然后将玻璃载玻片与在封闭缓冲液中稀释至10μg/mL的抗SARS CoV2 S人mAb(靶向RBD)在RT下孵育1小时。之后用0.05％Tween20溶液进行3次5分钟的洗涤步骤，以1：400的稀释度在封闭缓冲液中加入二抗(山羊抗人IgG，Alexa488，Molecular probes)。再孵育1小时后，用0.05％Tween20溶液再次洗涤细胞3次，用DPBS洗涤1次。在用Olympus BX60荧光显微镜收集图像之前，使用10μL氟保护试剂(Millipore)固定载玻片并在室温下保存过夜。除非另有说明，所有溶液均在DPBS中制备。

结果

当从pCAGGS表达质粒生产抗原时，失活弗林蛋白酶切割位点(FCS)少量增加抗原表达水平。此外，2P替代，与或不与VSV的TM-CTD替代组合，其少量增加表达水平。VSV自身的TM-CTD替代(VSV)的CTD缺失(ΔCTD)对表达水平没有太大影响。

表5

SARS-CoV-2刺突蛋白修饰表达水平

	表达水平
		SARS-CoV-2刺突wt	+
SARS-CoV-2刺突-ΔFCS	++
		SARS-CoV-2刺突-ΔFCS-2P	++
SARS-CoV-2刺突-ΔFCS-ΔCTD	+
		SARS-CoV-2刺突-ΔFCS-VSV	+
SARS-CoV-2刺突-ΔFCS-VSV-2P	+++
		模拟	-

实施例6

HEK293细胞中的SARS-CoV刺突抗原的表达的流式细胞术分析

为了确定失活的弗林蛋白酶切割位点(ΔFCS)、C末端结构域的修饰(ΔCTD或VSV)和脯氨酸突变(2P)的组合是否对刺突抗原的表达水平和定位有任何影响，用驱动SARS-CoV-2刺突抗原产生并用于流式细胞术分析的pCAGGS表达质粒转染HEK293细胞。

材料和方法

在DMEM/10％FCS/PS中培养HEK293T细胞，并以1×10E5细胞/cm²的密度接种在6孔簇中。第二天，使用聚乙烯亚胺(Polysciences Inc.)，用2.5μgpCAGGS2质粒DNA转染细胞，DNA：PEI的比率为1：10。在OptiMEM(Lonza)中制备转染混合物，涡旋15秒，然后在室温下孵育20分钟。然后，每孔加入200μL混合物，与细胞孵育7小时后更换培养基。在转染后24小时，用DPBS(1×DPBS，无钙和镁，Lonza)洗涤单层一次，并通过加入0.32mL TrypLE(胰蛋白酶替换试剂，Gibco)在室温下解离细胞3-5分钟。接着，用移液器将细胞与DMEM混合(最多1mL)，并将10μL悬浮液用于计数(Invitrogen，CountessII)，同时其余的通过离心5分钟/1000rpm沉淀。除去培养基，细胞用3％PFA在冰上固定20分钟。固定后，将细胞沉淀(5min/2500rpm/4℃)，在冰上用0.5％皂苷透化(或不透化)20min，并在冰上在3％BSA(封闭溶液)中封闭1小时。来自每个样品的大约4×10E5个细胞进一步用于分析，一式两份。将封闭的细胞移至圆底96孔簇中，沉淀并与在封闭缓冲液中稀释至10μg/mL的一抗(人MAbs 47D11或CR3022)一起孵育。然后用0.05％Tween20溶液进行3次5分钟的洗涤步骤，以1：400的稀释度在封闭缓冲液中加入二抗(山羊抗人IgG，Alexa488，Molecular probes)。孵育1小时后，用0.05％Tween20溶液再次洗涤细胞3次，并重悬于FACS缓冲液(2％BSA、5mM EDTA，0.02％NaN3)中，然后用CytoFLEX LX(Beckman Coulter)分析。用FlowJo v.9软件分析结果。除非另有说明，所有溶液均在DPBS中制备。

结果

结果倾向于根据用于检测的hMAb和特定RBD表位的可及性而变化。当使用hMAb47D11进行检测时，具有ΔFCS的变体具有改善的表达，特别是如果存在VSV TMD时。具有ΔFCS和ΔCTD的变体具有较低的表达。用该检测获得的数据通过HeLa细胞中的免疫荧光分析被证实。

表6

使用流式细胞术分析的体外研究

	总表达水平	细胞表面表达水平
			SARS-CoV-2刺突_wt	+	+
SARS-CoV-2刺突-ΔFCS	+	+
			SARS-CoV-2刺突-ΔFCS-2P	++	++
SARS-CoV-2刺突-ΔFCS-ΔCTD	+	+
			SARS-CoV-2刺突-ΔFCS-VSV	+	++
SARS-CoV-2刺突-ΔFCS-VSV-2P	++	+++
			模拟	-	-

实施例7

鸡中IBV刺突抗原的免疫原性

上述使用修饰的IBV刺突蛋白的体外研究扩展到鸡中体内研究。如上所述，修饰的IBV Ma5刺突抗原被设计为在感染细胞的细胞表面上更有效地表达。以VEEV RNA RP疫苗平台为例，评价了编码修饰的IBVMa5抗原的病毒载体针对IBV M41挑战的保护效力。基于气管外植体的纤毛活性程度和血清学数据，疫苗的效力通过在接种后3周的挑战而被确定，然后被评价。

材料和方法

根据下表7，将六十六只(n＝66)1日龄的禽分成7组(组1-7)。在第1天，来自组2-8的鸡通过经眼鼻(OCN)施用接种商业疫苗或通过肌内(IM)施用接种表7中所列的实验疫苗。在第22天，从组2、4、5、6和7的小鸡取血以确定IBV血清学。在第23天，通过眼部(OC)接种使鸡经受IBV M41挑战。在第28、29和30天，将鸡安乐死，并将它们的气管用于纤毛停滞检测以确定疫苗功效。

表7使用修饰的IBV Ma5刺突抗原的疫苗研究

所有用于接种的材料在计划接种前即刻制备。在环境温度下制备疫苗并在制备的2小时内施用。在第1天，组3-7的小鸡通过眼鼻途径(以右眼和右鼻孔开口分组)用0.1ml疫苗接种或通过IM途径用0.25ml疫苗在腿中接种。

一旦接种，从接种当天到研究结束每天监测所有组的鸡的疾病的临床症状的发生或死亡率。出于动物福利的原因，对表现出被认为是性质上非暂时的或可能变得更严重的疼痛和不适的小鸡实施安乐死。

在第22天，从来自组2、4、5、6和7的所有鸡的翼静脉采集血样(～2ml)。在环境温度下运输血样用于评估。在室温下凝固后，通过以3000xg离心血样10分钟收集血清。将血清样品分成两组，随后在56℃下热灭活30分钟，然后在-20℃保存直至进一步使用。使用商业化的ID传染性支气管炎间接(IDVet)测试，对在第20天收集的血样进行血清学检测以确定抗IBV Ma5的抗体滴度。

在第23天，接种后3周，在计划的挑战前即刻将IBV M41挑战病毒稀释在眼鼻稀释剂中。随后，为每个隔离器制备单独的等分试样，其中装有需要接受挑战的鸡。挑战材料在生物安全运输箱中在冰上运输。在第23天，组3-7中的所有鸡通过眼部途径用挑战毒株进行挑战(4.5Log10，0.1ml/鸡)。将材料在双眼上平均分配。挑战后，通过反滴定分析剩余的挑战病毒。

在鸡安乐死后，对气管分离物进行了预定的验尸检查。预先肌内注射Zoletil^TM，通过颈椎脱位对4周龄的鸡实施安乐死。在鸡安乐死后不久，用一组无菌仪器对一组中的鸡的所有气管进行取样。切下气管，单独收集在具有预热(37℃)培养基的管中，并保存在保温箱中，直至运输以用于纤毛停滞测试。处理收集的气管并检查纤毛运动性。气管到手即对其处理。从每个气管上切下10个环，即从顶部(会厌下方)切下3个环，从中部切下4个环，从底部切下3个环。一旦切割，将环在无血清培养基中洗涤以除去任何粘液并置于24孔板中用于读数。使用低倍显微镜读取环。当至少50％的气管环显示剧烈的纤毛运动时，气管环被计为不受影响(指定为“+”)。纤毛活动低于50％的气管环被计为“受影响的”并被指定为“-”。如果90％或更多的环未受影响，则认为鸡是受保护的。

结果

用IB Ma5疫苗接种的鸡显示出强血清转换，10只动物中有6只超过了889的阈值，并且该组具有1242的平均ELISA滴度。只有一只接种了表达wt IBV Ma5刺突抗原的VEEV RP的鸡显示血清转换，并且该组具有336的平均ELISA滴度。ΔFCS+CTD+2P适应或ΔFCS+Y¹¹⁴⁴A+2P适应的组合对IBV刺突抗原的免疫原性没有影响。与之形成鲜明对比的是，ΔFCS+2P+VSV适应导致免疫原性更强的抗原，其中10只动物中有4只表现出明显的血清转换，并且该组具有617的平均ELISA滴度(参见图1)。

平均ELISA滴度与疫苗效力很好地相关，其中Nobilis IB Ma5疫苗导致100％保护，表达wt IBV刺突抗原的VEEV RP疫苗仅导致20％保护，而ΔFCS+2P+VSV适应导致55％保护(参见图2)。

实施例8

在豚鼠中使用VEEV RP疫苗的SARS-CoV-2刺突抗原的免疫原性

为了测试修饰的SARS-CoV-2刺突变体是否在体内产生改善的免疫原性，在用编码不同SARS-CoV-2刺突抗原的VEEV RP疫苗接种的豚鼠中进行实验。本研究的目的是评价编码SARS-CoV-2的刺突糖蛋白的VEEV RP在豚鼠中的血清学功效。

材料和方法

对于本研究，使用n＝35只豚鼠在研究日(SD)0、21和42进行疫苗接种。以0.3ml1.0E7pfu的剂量肌内给予疫苗。一组动物用与XSOLVE^TM100佐剂混合的疫苗接种。在SD59收集血液并用于血清学分析。

表8用修饰的SARS-CoV-2刺突抗原的疫苗研究

在接种前将冷冻的甲病毒RNA复制子颗粒在室温下解冻。所有豚鼠在大腿或臀部肌内(IM)接种约0.3mL适当的疫苗制剂。使用替代部位进行后续接种。第2组在注射前用与RNA-P疫苗混合的XSOLVE^TM100佐剂接种，最终注射体积为～0.6mL。

在研究结束时，对豚鼠进行终末放血，以获得8-10mL血清的目标最小产量。在采集血液之前，使用AVMA批准的方法麻醉动物。收集后，将血样在室温下保持不超过4小时，然后在4℃下以1257xg离心30分钟进行分离。将所有血清样品冷冻保存在-20℃或更冷的温度下直至测试。使用商业性替代假VN试验(GenScript)检测所有血清样品的SARS-CoV-2抗体。

结果

用表达野生型(wt)SARS-CoV-2刺突抗原的VEEV RP接种的豚鼠仅导致7％的抑制，显示非常差的血清转换。SARS-CoV-2刺突抗原的失活弗林蛋白酶切割位点(ΔFCS)导致平均39％的抑制，而ΔFCS+VSV和ΔFCS+2P+VSV的组合分别导致52％和54％的抑制(参见图3)。因此，如对IBV刺突抗原所观察到的，弗林蛋白酶切割位点(ΔFCS)的失活与VSV修饰(具有或不具有2P突变)组合，产生非常具有免疫原性的抗原。

初次免疫接种后3周，豚鼠接受加强免疫接种。使用取自豚鼠的血液进行的替代VN试验的结果如下图4所示。从这些数据中可以看出两点。首先，刺突-2P-VSV变体远比刺突-wt抗原更具免疫原性。在目前的条件下，刺突-2P-VSV试验显示几乎100％的抑制。VEEV RP令人惊奇地比DNA表达质粒疫苗更具免疫原性。

实例9

在豚鼠中使用VEEV RP疫苗的由SARS-Cov-2刺突抗原诱导的体液和细胞免疫应答

材料和方法

动物和饲养

从Envigo获取最小重量为350克的雌性SPF豚鼠(Dunkin Hartley)，随机分配至实验组，并使用颜色编码标签单独标记。在整个研究期间记录基线临床观察结果。在整个研究期间记录包括体温在内的基线临床观察结果。

SARS-CoV-2刺突基因RP疫苗的产生。

用于产生SARS-CoV-2刺突wt或刺突-FCS-2P-VSV基因的VEEV复制子载体如前面实施例2所述构建(也参见图7)。来自SARS-CoV-2的毒株2019-nCoV/USA-WI1/2020(GenBankaccession MT039887)的刺突_wt基因序列，和具有R⁶⁸²A/R⁶⁸³A(ΔFCS)K⁹⁸⁶P/V⁹⁸⁷P(2P)替代和SARS-CoV-2刺突残基1212-1273被VSV糖蛋白残基463-511替代的刺突-FCS-2P-VSV衍生物(GenBank accession YP_009505325)被密码子优化并被合成为带侧翼AscI和PacI位点(ATUM,Newark,CA)。如以上实施例2中所述，合成的基因和pVHV载体各自用AscI和PacI酶消化并被连接以产生载体“pVHV-SARS-CoV-2-刺突_wt”和“pVHV-SARS-CoV-2-刺突-FCS-2P-VSV”。

TC-83RNA RP的生产通过上述方法进行(参见上述实施例2)。简言之，pVHV-SARS-CoV-2-刺突_wt和pVHV-SARS-CoV-2-刺突-FCS-2P-VSV复制子载体DNA和辅助DNA质粒用NotI限制酶线性化，然后使用RiboMAX^TMExpress T7 RNA聚合酶和帽类似物(Promega,Madison,WI)进行体外转录。重要的是，用于生产的辅助RNA缺乏VEE亚基因组启动子序列。将用于复制子和辅助成分的纯化RNA组合，并与Vero细胞悬浮液混合，在4mm比色皿中电穿孔，并返回到无血清培养基中。孵育过夜后，通过使悬浮液通过深层过滤器，用含有5％蔗糖(w/v)的磷酸盐缓冲盐水洗涤，最后用400mM NaCl+5％蔗糖(w/v)缓冲液或200mM Na₂SO₄+5％蔗糖(w/v)缓冲液洗脱保留的RP，从细胞和培养基中纯化甲病毒RNA复制子颗粒。将洗脱的RP通过0.22微米膜滤器并分配成等分试样用于在检测和冻干之前保存。还制备了表达绿色荧光蛋白的对照疫苗。

在含有蔗糖、NZ胺和DMEM的稳定剂中冻干并在2-8℃下储存后，通过在感染的Vero细胞单层上的免疫荧光检测来确定功能性RP-刺突疫苗的滴度。简言之，将疫苗连续稀释并加入到96孔板中的Vero细胞单层培养物中，并在37℃下孵育18-24小时。孵育后，将细胞固定并用一抗(抗VEEV nsp2单克隆抗体)染色，然后用FITC偶联的抗鼠IgG二抗染色。通过使用Cytation^TM5成像读数器计数每个稀释度2个孔中的所有阳性荧光染色细胞来定量RNA颗粒。

豚鼠研究

将最小重量为350克的SPF豚鼠随机分为非接种对照组，RP-刺突-wt接种组和RP-刺突-FCS-2P-VSV接种组(每组n＝6)。放置一周后，动物保持未接种或接受1×10E7RP剂量的初次肌内接种(每条腿的肌肉0.1ml)。初次接种后3周，动物接受1×10E7RP剂量的加强肌内接种(每条腿的肌肉0.1ml)。加强接种6周后，动物接受第二次加强接种，7天后处死动物。取末端血液进行淋巴细胞刺激试验(LST)，仔细解剖气管而不引起出血。使用拭子从气管内部采集粘液，吸收在1ml磷酸盐缓冲盐水中并用于测定粘膜抗体滴度。在加强接种当天，以2周为间隔直到加强接种后6周，用心脏穿刺获取凝血，用血清确定全身的抗体滴度。

替代病毒中和检测豚鼠血清

根据制造商的说明书使用来自GenScript的SARS-CoV-2替代病毒中和试验试剂盒。简言之，将血清稀释在样品稀释缓冲液中，与HRP-RBD以1：1混合，并在37℃下孵育30分钟。接着，将样品置于含有涂布在表面上的ACE2受体的96孔板中并在37℃下孵育15分钟。洗去未结合的HRP-RBD，使用3，3’，5，5’-四甲基联苯胺(TMB)底物显现剩余的辣根过氧化物酶(HRP)，并在OD450下测量。

用于估计血清中抗RBD和刺突胞外结构域抗体滴度的ELISA

将纯化的SARS-CoV-2RBD和Spike胞外结构域在Dulbecco的磷酸盐缓冲盐水(DPBS)[不含Ca和Mg，Lonza，17512F]中稀释并使用10nM(10pmol/mL)包被在96孔板(MaxiSorp-ThermoFisher或High binding-Greiner Bio-one)上，并在4℃下孵育过夜。第二天早上，用ELISA板洗涤器(ImmunoWash 1575,BioRad)使用0.25mL洗涤溶液/孔(DPBS，0.05％Tween20)洗涤板三次，然后用250μL封闭溶液(在DPBS中，5％牛奶-Protifar、Nutricia、0.1％Tween20)在RT(室温)下封闭2小时。之后弃去封闭溶液。然后将血清的4倍系列稀释液(在封闭溶液中制备，一式两份或一式三份)加入到相应的孔中并在RT下孵育1小时。每个平板含有阳性对照(稀释豚鼠血清以获得～2的OD450)和阴性对照孔。将板再次洗涤3次，然后与含有HRP的抗体-山羊抗豚鼠(IgG-hrpo，Jackson lab 106-035-003，1：8000)在RT下孵育1小时。进行最后的洗涤步骤，然后在RT下用100μL/孔超灵敏TMB(Surmodics，TMBS-1000-01)孵育10分钟。通过加入100μL/孔的12.5％H₂SO₄(Millipore，1.00716.1000)终止反应。用ELx808 BioTek读板器在30分钟时测量450nm处的吸光度。

T-细胞刺激试验(LST)

根据制造商的说明书，收集血液并使用含有Histopaque 1083的Sepmate管(干细胞)分离淋巴细胞。简言之，将K3-EDTA血液在RPMI-1640培养基中以1：2稀释，并在1200xg下沉淀10分钟。收集试管顶层的细胞，置于含有RPMI-1640的干净试管中，400xg沉淀7分钟。将细胞用RPMI-1640培养基洗涤一次并以400xg沉淀7分钟。计数细胞浓度并在37℃下用羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(CFSE)染色1×10E7个细胞20分钟。用RPMI-1640洗涤细胞一次，并用培养基、Cona(10μg/ml)或纯化的SARS-CoV-2S1抗原(5、2.5、1.25、0.62、0.31或0.15μg/ml)一式两份刺激来自每只动物的5×10E5个细胞。刺激后3天，使用FACS-Verse测量细胞增殖。

结果

刺突-wt和刺突-FCS-2P-VSV抗原的免疫原性(参见图7中的示意图)在VEEV RP载体疫苗通过肌内施用(图5A)的豚鼠模型中评估。初次接种后，所有动物显示血清转换，如通过衡量干扰刺突受体结合的抗体滴度的市售替代VN试验所评估。当与刺突-wt抗原相比时，刺突-FCS-2P-VSV抗原诱导明显更高的替代VN滴度(图5B)。这些滴度在第二次接种后以更高的滴度被提升，直到实验结束。一致地，与产生刺突-wt抗原的RP疫苗相比，刺突-FCS-2P-VSV抗原诱导的滴度更高(图5C-D)。

已知VEEV RP载体平台能有效诱导体液和细胞应答。为了评价RP疫苗候选物诱导的细胞应答水平，进行第三次免疫，7天后分离淋巴细胞用于淋巴细胞刺激试验(LST)。用Cona刺激的所有分离的淋巴细胞产生>80％的增殖滴度。与刺突-wt和刺突-FCS-2P-VSV抗原之间的体液应答差异相反，在SARS-CoV-2S1特异性T细胞分化的水平上没有观察到差异(图5E)。为了确定体液应答是否也导致粘膜免疫，在实验结束时取气管拭子。有趣的是，在气管拭子中也检测到替代VN滴度，并且该水平与全身抗体水平相关，其中刺突-FCS-2P-VSV抗原的滴度高于刺突-wt抗原的滴度(图5F)。这些抗体滴度表明亲代疫苗接种可诱导保护性粘膜免疫。

实施例10

表达稳定刺突抗原的基于甲病毒复制子的疫苗诱导无菌免疫并防止SARS-Cov-2在猫之间传播

材料和方法

动物和饲养

从Marshall BioResources(Waverly，NY)处获取家养短毛雄性和雌性SPF猫，通过微芯片识别并随机分配至实验组。在整个研究期间记录包括体温在内的基线临床观察结果。

SARS-CoV-2刺突基因RP疫苗的产生。

用于产生SARS-CoV-2刺突wt或刺突-FCS-2P-VSV基因的VEEV复制子载体如前面实施例2所述构建(也参见上面实施例9和图7)。

SARS-CoV-2挑战病毒和细胞培养物

SARS-CoV-2的毒株USA-WA1/2020(GenBank accession QHO60594.1)分离自呼吸疾病患者的口咽拭子，该患者于2020年1月出现临床疾病(COVID-19)。病毒在Vero细胞上繁殖一次。为了确定病毒滴度，在Vero细胞上进行病毒的系列稀释，并通过在24小时用含有中性红的第二覆盖物复染和在孵育48小时后的显示来定量噬斑形成单位。

安慰剂对照疫苗

安慰剂疫苗由表达绿色荧光蛋白(gfp或GFP)的RNA颗粒组成，如上所述进行检测、冻干并保存在2-8℃下。使用后，滴定每种测试疫苗以确认接种剂量。

猫科动物血清学

使用体外噬斑减少中和试验(PRNT)研究对SARS-CoV-2的血清学反应。简言之，血清在56℃下灭活30分钟，制备猫血清的系列稀释液并与100pfu的SARS-CoV-2在37℃下孵育1小时。然后将病毒血清混合物接种到Vero细胞上，通过在24小时用含有中性红的第二覆盖物复染和48小时后的显示读取噬斑数。抗体滴度被确定为≥90％病毒被中和的最高稀释度的倒数。

功效测试

形成两组10只11周龄的SPF猫，并分别圈养；一组接种通过皮下途径施用的5×10E7 RP-刺突-FCS-2P-VSV(0.5ml每剂量)，另一组接受相同剂量的RP-gfp。三周后，每组接受相同的治疗。第二次接种后25天，在轻度镇静下，通过鼻内和口服途径，猫受到3.1×10E5pfu的SARS-CoV-2的挑战。另外两组5只SPF猫(其既未接种也未被挑战)通过在挑战后1天与每组共同饲养而用作前哨。挑战后10天每天观察所有动物的指示SARS-CoV-2感染的临床症状。检查的临床症状包括抑郁、呼吸困难、鼻分泌物、眼分泌物、咳嗽、结膜炎和/或打喷嚏。在挑战后/混合后研究日1-11的记录体温。

口咽拭子

在挑战后的研究日1-7从受挑战的猫收集用于病毒分离的口咽拭子，拭子被放置在含有1％牛血清白蛋白的Tris缓冲MEM中，其中含有庆大霉素、青霉素、链霉素和两性霉素B(BA-1培养基)。在挑战后的研究日2-8天，还将拭子从接触前哨收集到运输介质中，以评估接触传播。将样品在-50℃下冷冻直至测试。

鼻洗液

在挑战后第1、2、3、5和7天，通过将1mlBA-1培养基滴入猫的鼻孔中并在培养皿中收集鼻分泌物来收集用于病毒分离的鼻洗液样品。还在挑战后第2、3、4、6和8天从接触前哨收集鼻洗液以评估接触。将样品在-50℃下冷冻直至测试。

血液样本

在初次接种前和初次接种后3周采集血样以获取血清。此外，在挑战前和挑战后14天采集血样。

病毒再分离

所有口咽拭子和鼻洗液都进行了病毒再分离测试。将6孔板中Vero E6细胞的汇合单层用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤一次，并用100μl连续10倍稀释的拭子/洗液样品接种，在37℃下孵育1小时，然后用含有0.5％琼脂糖、2％FBS的MEM覆盖。24小时后加入含有中性红染料的第二覆盖层，在48小时计数斑块。以Log10pfu/ml记录病毒滴度。

结果

为了确定疫苗效力，将猫接种作为对照的产生增强的绿色荧光蛋白(EGFP)的RP疫苗、优化的SARS-CoV-2刺突抗原(刺突-FCS-2P-VSV)，或保持未接种(前哨)。加强接种后3周，如图6A所示，猫暴露于粘膜SARS-CoV-2挑战并取样。

接种后，在任何时间点，在任何猫中均未检测到不良反应。产生刺突-FCS-2P-VSV抗原的RP疫苗能够在单次接种后在所有猫中诱导病毒中和抗体滴度，其在第二次接种后加强并维持水平直到3.5周后的挑战(图6B)。未接种的前哨动物在直至挑战的所有时间保持阴性。受到挑战的猫和前哨猫在挑战后都没有表现出任何临床症状。然而，10只未接种的受到挑战的猫中的9只在挑战后一天并在观察期间至少3天，经口(图6D)和经鼻(图6E)脱落病毒。这些数据显示粘膜SARS-CoV-2挑战导致呼吸道中有效的病毒复制。从鼻洗液中检测到更高和更一致的病毒脱落，而口咽拭子显示出较不一致的模式。有趣的是，在挑战后1天，在与未接种对照一起放置的2只未接种前哨中也从鼻洗液中检测到脱落的病毒。此外，所有5只前哨动物至少2天经口脱落病毒，这证明病毒从未接种的受到挑战的动物有效传播至前哨动物(图6D)。

接种的猫没有一只在挑战后的任何时间点经口(图6D)或鼻(图6E)脱落任何可检测的病毒。结果表明疫苗预防了感染。而且，正如所预期的，考虑到接种的猫中缺乏挑战病毒复制，在与接种的猫一起饲养的未接种的前哨中没有检测到病毒。挑战后的病毒中和抗体滴度的分析证实未接种的受到挑战的动物和前哨动物都被有效感染(图6C)。与之直接相反，在与接种的猫一起饲养的前哨动物中没有观察到血清转换。因此，产生刺突-FCS-2P-VSV抗原的VEEV RP疫苗(i)诱导无菌免疫和(ii)防止病毒从感染的猫传播到未接种的猫。

这些结果同时公布为：Langereis等,2021,npj Vaccines，第6卷，第122期，https://doi.org/10.1038/s41541-021-00390-9。

本发明不限于本文所述的具体实施方式的范围。实际上，除了在此描述的那些之外，根据前面的描述，本发明的各种修改对于本领域技术人员将变得显而易见。这些修改旨在落入所附权利要求的范围内。

进一步被理解的是，对于核酸或多肽，给出的所有碱基大小或氨基酸大小，以及所有分子量或分子量值是近似的，并且被提供用于描述。

实施例11

进一步的冠状病毒刺突抗原的突变

为了研究来自进一步的冠状病毒的嵌合刺突蛋白的表达，进行了更多的实验。其中，编码牛冠状病毒(BCoV)和引起SADS的猪冠状病毒的刺突蛋白的基因被突变以提高它们的稳定性和(表面)表达。

材料和方法

通过FACS显示表达的实验基本上如上所述进行：扩增Vero细胞并铺板。使用Lipofectamine将含有待测试的(突变的)刺突基因的质粒转染到Vero细胞中，并培养。接着收获细胞并固定。用或不用去污剂透化细胞，以便能够分别区分总表达/内部表达或表面表达。使用的抗体是，对于BCoV：小鼠单克隆抗BCoV刺突和山羊抗小鼠IgG-A488偶联的抗体；对于SADS-CoV：多克隆兔抗SADS-CoVS1抗体和山羊抗兔IgG-A488偶联抗体。

所使用的BCoV刺突蛋白基因(参见SEQ ID NO：16，翻译在SEQ ID NO：17中)是共有序列，其由可在公共数据库中获得的2016-2021年的130个BCoV刺突序列组装而成。

SADS-CoV刺突基因(参见SEQ ID NO：18，翻译在SEQ ID NO：19中)，衍生自猪肠道α冠状病毒的GDS04毒株，其基因组可从GenBank acc.nr.:MF167434获得。

测试BCoV(共有)刺突的刺突蛋白突变类似于上述测试IBV和SARS-CoV-2刺突蛋白的突变：FCS、2P和VSV-TM/CT。此外，BCoV共有TMD-CTD区被来自流感病毒HA蛋白，毒株A/Puerto Rico/8/1934(H1N1)的TMD-CTD区替代，HA基因序列可从GenBank acc.nr.:V01088获得。

通过用来自VSV G蛋白的TMD-CTD区替代SADS-CoV刺突的TMD-CTD区域来突变SADS-CoV刺突。

对BCoV刺突进行的特定突变：

-“FCS”突变的BCoV共有刺突蛋白基因具有突变的(失活的)弗林蛋白酶切割位点，并示于SEQ ID NO：20中，在其核苷酸2290-2295和2299-2304处纳入突变。

-“FCS-2P”突变的BCoV共有刺突蛋白基因在失活的弗林蛋白酶切割位点旁还纳入两个稳定的脯氨酸。序列如SEQ ID NO：21所示，在其核苷酸3238-3243处具有2P突变。

-“FCS-IAV-TM/CT”突变的BCoV共有刺突基因在失活的弗林蛋白酶切割位点附近纳入了来自流感病毒HA蛋白的BCoV共有TMD-CTD区的替代，如SEQ ID NO：22所示，在其核苷酸3922-4029处具有流感HA TM/CT区。

-“FCS-VSV-TM/CT”突变的BCoV共有刺突蛋白基因在失活的弗林蛋白酶切割位点旁还纳入了来自VSV G蛋白的BCoV刺突蛋白共有TMD-CTD区的替代，参见SEQ ID NO：23，在其核苷酸3922-4068处具有VSV G蛋白TM/CT区域。

-构建体“FCS-2P-VSV-TM/CT”组合了上述突变。

对SADS-CoV刺突进行的特定突变：

-“VSV-TM/CT”突变的SADS-CoV刺突基因纳入了来自VSV G蛋白的SADS-CoV TMD-CTD区的替代，参见SEQ ID NO：24，在其核苷酸3205-3351处具有VSV TM/CT区。

结果

将不同突变对来自BCoV和SADS-CoV刺突蛋白表达的影响与其各自未突变刺突蛋白(“wt”)的表达水平(设定为100％)进行比较。来自BCoV的嵌合刺突蛋白的结果示于图8，来自SADS-CoV的结果示于图9。

从图8和9可以清楚地看出，BCoV和SADS-CoV刺突蛋白的结果与上述IBV和SARS-CoV2刺突蛋白的结果一致。对于所有刺突蛋白，用来自出芽病毒的表面糖蛋白(例如VSV G蛋白)的TMD-CTD区替代TMD-CTD区对总表达水平是有益的，但对宿主细胞表面上的表达水平是特别有利的。这也在使用来自流感病毒HA蛋白的TMD-CTD区后观察到。其他修饰，如除去弗林蛋白酶切割信号(“FCS”)和稳定融合前构象(“2P”)，具有类似的作用：总刺突蛋白表达水平有一定程度的增加，在细胞表面上刺突蛋白表达有强至极强的增加。

因此，BCoV和SADS-CoV刺突蛋白的这些结果证实并扩展了本文所述的本发明的有益效果。

Claims

1.编码嵌合冠状病毒刺突蛋白的重组载体，该刺突蛋白包含源自冠状病毒的刺突蛋白，以及替代所述冠状病毒刺突蛋白的跨膜结构域(TMD)和C末端结构域(CTD)的，源自从宿主细胞的质膜出芽的出芽病毒(BV_pm)的表面糖蛋白的TMD和CTD；其中当所述重组载体是重组BV_pm时，所述表面糖蛋白的TMD和CTD源自不同于所述重组BV_pm的病毒种。

2.根据权利要求1所述的重组载体，其选自重组表达载体和合成的信使RNA(合成的mRNA)。

3.根据权利要求1或权利要求2所述的重组载体，其中所述表面糖蛋白源自选自以下的BV_pm种：水疱性口炎病毒(VSV)的糖蛋白(G蛋白)、流感病毒的血凝素、流感病毒的神经氨酸酶、新城疫病毒(NDV)的血凝素-神经氨酸酶(HN)蛋白、NDV的融合(F)蛋白、人免疫缺陷病毒的糖蛋白120(gp120)、拉沙病毒的糖蛋白(GP)、埃博拉病毒的GP、麻疹病毒(MV)的F蛋白和MV的HN蛋白。

4.根据权利要求3所述的重组载体，其中所述表面糖蛋白是VSV的G蛋白。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的重组载体，其中所述嵌合冠状病毒刺突蛋白包含失活的弗林蛋白酶切割位点。

6.根据权利要求1-5中任一项所述的重组载体，其中所述嵌合冠状病毒刺突蛋白包含中央螺旋，所述中央螺旋由于所述中央螺旋开始处的两个连续氨基酸残基被一对脯氨酸残基(2P)替代而进一步稳定在融合前状态。

7.根据权利要求1-6中任一项所述的重组载体，其中所述冠状病毒刺突蛋白源自选自人冠状病毒、传染性支气管炎病毒(IBV)、牛冠状病毒、犬冠状病毒、猫冠状病毒、猪冠状病毒、和蝙蝠冠状病毒的冠状病毒。

8.根据权利要求7所述的重组载体，其中所述冠状病毒刺突蛋白源自人冠状病毒。

9.根据权利要求8所述的重组载体，其中所述人冠状病毒选自SARS-CoV2、SARS-CoV、和MERS。

10.根据权利要求9所述的重组载体，其中所述人冠状病毒是SARS-CoV-2。

11.根据权利要求10所述的重组载体，其中所述嵌合冠状病毒刺突蛋白在相同的氨基酸残基范围内包含与SEQ ID NO：10的氨基酸序列的氨基酸残基14至1211的90％或更高的同一性；并且其中所述嵌合冠状病毒刺突蛋白包含失活的弗林蛋白酶切割位点。

12.根据权利要求10所述的重组载体，其中所述嵌合冠状病毒刺突蛋白在相同的氨基酸残基范围内包含与SEQ ID NO：12的氨基酸序列的氨基酸残基14至1211的90％或更高的同一性；其中所述嵌合冠状病毒刺突蛋白包含失活的弗林蛋白酶切割位点；并且其中SEQID NO：12的986位的赖氨酸(K)残基和987位的缬氨酸(V)残基被一对脯氨酸残基(2P)替代。

13.根据权利要求11或权利要求12所述的重组载体，其中所述嵌合冠状病毒刺突蛋白在相同的氨基酸残基范围内进一步包含与SEQ ID NO：10或12的氨基酸序列的氨基酸残基1212至1260的90％或更高的同一性。

14.根据权利要求7所述的重组载体，其中所述冠状病毒刺突蛋白源自IBV。

15.根据权利要求14所述的重组载体，其中所述IBV是选自马萨诸塞血清型、4/91血清型和QX血清型的血清型的成员。

16.根据权利要求14所述的重组载体，其中所述IBV是IBV-Ma5毒株。

17.根据权利要求16所述的重组载体，其中所述嵌合冠状病毒刺突蛋白在相同的氨基酸残基范围内包含与SEQ ID NO：4的氨基酸序列的氨基酸残基19至1091的90％或更高的同一性；并且其中所述嵌合冠状病毒刺突蛋白包含失活的弗林蛋白酶切割位点。

18.根据权利要求16所述的重组载体，其中所述嵌合冠状病毒刺突蛋白在相同的氨基酸残基范围内包含与SEQ ID NO：6的氨基酸序列的氨基酸残基19至1091的90％或更高的同一性；其中所述嵌合冠状病毒刺突蛋白包含失活的弗林蛋白酶切割位点；并且其中SEQ IDNO：6的859位的丙氨酸(A)残基和860位的异亮氨酸(I)残基被一对脯氨酸残基(2P)替代。

19.根据权利要求17或权利要求18所述的重组载体，其中所述嵌合冠状病毒刺突蛋白在相同的氨基酸残基范围内进一步包含与SEQ ID NO：4或6的氨基酸序列的氨基酸残基1092至1140的90％或更高的同一性。

20.根据权利要求1-19中任一项所述的重组载体，其是选自重组病毒载体和DNA表达质粒的重组表达载体。

21.根据权利要求20所述的重组表达载体，其是选自重组火鸡疱疹病毒(HVT)、重组减毒马立克氏病病毒1(MDV1)、重组马立克氏病病毒2(MDV2)、重组MV、重组NDV、和甲病毒RNA复制子颗粒(RP)的重组病毒载体。

22.根据权利要求21所述的重组病毒载体，其是HVT。

23.根据权利要求21所述的重组病毒载体，其中所述甲病毒RNA复制子颗粒是委内瑞拉马脑炎病毒(VEEV)复制子颗粒。

24.根据权利要求20所述的重组表达载体，其是DNA表达质粒。

25.根据权利要求24所述的重组表达载体，其编码RNA复制子。

26.根据权利要求25所述的重组表达载体，其中所述RNA复制子是VEEV RNA复制子。

27.根据权利要求1-19中任一项所述的重组载体，其是合成的mRNA。

28.一种免疫原性组合物，其包含根据权利要求1-20中任一项所述的重组载体，根据权利要求21-23中任一项所述的重组病毒载体，根据权利要求24-26中任一项所述的DNA表达质粒，或根据权利要求27所述的合成的mRNA，和药学上可接受的载体。

29.一种有助于保护哺乳动物免受SARS-CoV-2感染的疫苗，其包含根据权利要求1-13或20中任一项所述的重组载体，根据权利要求23所述的重组病毒载体，根据权利要求24-26中任一项所述的DNA表达质粒，或根据权利要求27所述的合成的mRNA，和药学上可接受的载体。

30.根据权利要求29所述的疫苗，其中所述疫苗在接种的哺乳动物中诱导无菌免疫，防止冠状病毒从所述接种的哺乳动物传播到未接种的哺乳动物，或在所述接种的哺乳动物中诱导无菌免疫并防止冠状病毒从所述接种的哺乳动物传播到未接种的哺乳动物。

31.根据权利要求30所述的疫苗，其中所述接种的哺乳动物是猫，所述未接种的哺乳动物是猫，或所述接种的哺乳动物和所述未接种的哺乳动物都是猫。

32.根据权利要求29-31中任一项所述的疫苗，其包含佐剂。

33.根据权利要求29-31中任一项所述的疫苗，其是无佐剂疫苗。

34.一种有助于保护禽类免于由禽类中的IBV感染引起的传染性支气管炎的疫苗，其包含根据权利要求1-7或14-20中任一项所述的重组载体，根据权利要求21-23中任一项所述的重组病毒载体，根据权利要求24-26中任一项所述的DNA表达质粒，或根据权利要求27所述的合成的mRNA，和药学上可接受的载体。

35.根据权利要求34所述的疫苗，其进一步包含至少一种非IBV抗原，用于引发针对非IBV禽病原体的保护性免疫。

36.根据权利要求34或权利要求35所述的疫苗，其包含佐剂。

37.根据权利要求34或权利要求35所述的疫苗，其是无佐剂疫苗。

38.一种在哺乳动物或禽类中诱导针对冠状病毒的免疫应答的方法，其包括向所述哺乳动物或所述禽类施用有效量的根据权利要求29-37中任一项所述的疫苗。

39.一种在哺乳动物中诱导针对冠状病毒的无菌免疫，防止冠状病毒从接种的哺乳动物传播到未接种的哺乳动物，或在所述哺乳动物中诱导针对所述冠状病毒的无菌免疫并防止所述冠状病毒从所述接种的哺乳动物传播到所述未接种的哺乳动物的方法，其包括向哺乳动物施用有效量的根据权利要求30-33中任一项所述的疫苗。

40.根据权利要求39所述的方法，其中所述接种的哺乳动物是猫，所述未接种的哺乳动物是猫，或所述接种的哺乳动物和所述未接种的哺乳动物都是猫。

41.根据权利要求38-40中任一项所述的方法，其中所述施用通过选自肌内施用(IM)、皮下施用(SC)、皮内施用(ID)、口服、鼻内或卵内施用的施用方式进行。

42.根据权利要求38-41中任一项所述的方法，其中施用至少一次加强给药。

43.一种嵌合冠状病毒刺突蛋白，其包含源自SARS-CoV-2的刺突蛋白，和替代所述SARS-CoV2刺突蛋白的TMD和CTD的源自水疱性口炎病毒的表面糖蛋白的TMD和CTD。

44.根据权利要求43所述的嵌合冠状病毒刺突蛋白，其在相同的氨基酸残基范围内包含与SEQ ID NO：10的氨基酸序列的氨基酸残基14至1211的90％或更高的同一性；其中所述嵌合冠状病毒刺突蛋白包含失活的弗林蛋白酶切割位点。

45.根据权利要求43所述的嵌合冠状病毒刺突蛋白，其在相同的氨基酸残基范围内包含与SEQ ID NO：12的氨基酸序列的氨基酸残基14至1211的90％或更高的同一性；其中所述嵌合冠状病毒刺突蛋白包含失活的弗林蛋白酶切割位点；并且其中SEQ ID NO：12的986位的赖氨酸(K)残基和987位的缬氨酸(V)残基被一对脯氨酸残基(2P)替代。

46.根据权利要求44或权利要求45所述的嵌合冠状病毒刺突蛋白，其中所述嵌合冠状病毒刺突蛋白在相同的氨基酸残基范围内进一步包含与SEQ ID NO：10或12的氨基酸序列的氨基酸残基1212至1260的90％或更高的同一性。

47.一种嵌合冠状病毒刺突蛋白，其包含源自IBV的刺突蛋白，和替代IBV刺突蛋白的TMD和CTD的源自水疱性口炎病毒的表面糖蛋白的TMD和CTD。

48.根据权利要求47所述的嵌合冠状病毒刺突蛋白，其中所述嵌合冠状病毒刺突蛋白在相同的氨基酸残基范围内包含与SEQ ID NO：4的氨基酸序列的氨基酸残基19至1091的90％或更高的同一性；并且其中所述嵌合冠状病毒刺突蛋白包含失活的弗林蛋白酶切割位点。

49.根据权利要求48所述的嵌合冠状病毒刺突蛋白，其中所述嵌合冠状病毒刺突蛋白在相同的氨基酸残基范围内包含与SEQ ID NO：6的氨基酸序列的氨基酸残基19至1091的90％或更高的同一性；其中所述嵌合冠状病毒刺突蛋白包含失活的弗林蛋白酶切割位点；并且其中SEQ ID NO：6的859位的丙氨酸(A)残基和860位的异亮氨酸(I)残基被一对脯氨酸残基(2P)替代。

50.根据权利要求48或权利要求49所述的嵌合冠状病毒刺突蛋白，其中所述嵌合冠状病毒刺突蛋白在相同的氨基酸范围内进一步包含与SEQ ID NO：4或6的氨基酸序列的氨基酸残基1092至1140的90％或更高的同一性。

51.一种编码根据权利要求43-50中任一项所述的嵌合冠状病毒刺突蛋白的核酸。

52.根据权利要求1-20中任一项所述的重组载体，其用作疫苗，其中所述疫苗有助于保护哺乳动物免受SARS-CoV-2感染，或所述疫苗有助于保护禽类免受传染性支气管炎。

53.根据权利要求52所述的用作疫苗的重组载体，其中所述重组载体选自根据权利要求21和24-26中任一项所述的重组表达载体、根据权利要求22和权利要求23所述的重组病毒载体、DNA表达质粒、甲病毒RNA复制子颗粒、和合成的mRNA。

54.根据权利要求1-20中任一项所述的重组载体在制备疫苗中的用途，其中所述疫苗有助于保护哺乳动物免受SARS-CoV-2感染，或所述疫苗有助于保护禽类免受传染性支气管炎。

55.重组载体用于制备根据权利要求54所述的疫苗的用途，其中所述重组载体选自根据权利要求21和24-26中任一项所述的重组表达载体、根据权利要求22和权利要求23所述的重组病毒载体、DNA表达质粒、甲病毒RNA复制子颗粒、和合成的mRNA。

56.一种制备根据权利要求29-37中任一项所述的疫苗的方法，所述方法包括将根据权利要求1-20中任一项所述的重组载体与药学上可接受的载体混合的步骤。

57.根据权利要求56所述的制备方法，其中所述重组载体选自根据权利要求21和24-26中任一项所述的重组表达载体、根据权利要求22和权利要求23所述的重组病毒载体、DNA表达质粒、甲病毒RNA复制子颗粒、和合成的mRNA。