CN115820572A - 一种表达双拷贝拉沙热病毒gp基因的重组病毒株及其构建方法和应用 - Google Patents
一种表达双拷贝拉沙热病毒gp基因的重组病毒株及其构建方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种表达双拷贝拉沙热病毒GP基因的重组病毒株及其构建方法和应用，属于病毒基因工程技术领域。本发明提供了表达双拷贝拉沙热病毒GP基因的重组病毒株，以弹状病毒科病毒为骨架含有两个拉沙热病毒的GP基因，并且定向敲除了狂犬病病毒基因组中原有的GP基因。本发明以构建的重组狂犬病病毒制备疫苗，不仅具有良好的安全性，具有良好的免疫原性，对拉沙热的预防和治疗具有重要意义。
Description
技术领域
本发明属于病毒技术领域，具体涉及一种表达双拷贝拉沙热病毒GP基因的重组病毒株及其构建方法和应用。
背景技术
拉沙热(Lassa Fever,LF)是由拉沙热病毒(Lassa fever virus,LASV)引起的一种病毒性出血热。拉沙热病毒的天然宿主是多乳鼠，多分布在西非地区，其活动不受国界限制。人类可通过直接或间接接触带毒动物或其分泌物而发生感染，同时病毒也可在人与人之间传播，每年造成大量感染和死亡病例[1]。LF自1969年在尼日利亚被首次发现以来，每年均有暴发且暴发频率呈逐年递增趋势。LASV感染者的高死亡率和多国出现输入性病例引起国际社会的高度重视，LASV再次成为医学界研究的热点。
由于该病的高死亡率、易于在人与人之间接触传播的能力以及气溶胶传播的潜力，LASV被列为生物安全四级(Biosafety level 4,BSL-4)病原微生物，且被美国国家过敏和传染病研究所(National Institute of Allergy and Infectious Diseases,NIAID)列为生物防御A类制剂。非人灵长动物(Non-human primates,NHPs)模型的高昂成本和研究所需的BSL-4实验室等因素，阻碍了疫苗的研发进程。目前尚无获批可用于LF的治疗性药物和预防用疫苗，唯一可用的药物是早期通过静脉注射途径注射抗病毒药物利巴韦林。鉴于以上因素，LF已被WHO和流行病预防创新联盟(Coalition for Epidemic PreparednessInnovations,CEPI)列为对全球健康构成重大威胁的疾病之一，应重点关注该病毒的传播机制、疫苗研发和治疗药物筛选。
目前，我国对LF的研究相对较少，缺乏LF预防性疫苗和治疗性药物，因此，积极开展有效的预防控制研究工作，尤其是研发安全有效的LF疫苗，是防止外来疫病输入我国，维护我国生物安全的重要举措。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种表达双拷贝拉沙热病毒GP基因的重组病毒株及其构建方法和应用，使制备的重组病毒不仅具有良好的安全性，作为拉沙热疫苗候选株具有良好的免疫原性，为拉沙热病毒的治疗和免疫防控提供新手段。
本发明提供了一种表达双拷贝拉沙热病毒GP基因的重组病毒株，在弹状病毒科病毒的基础上，用两个拉沙热病毒GP基因插入到弹状病毒科病毒全长基因组中。
优选的，所述拉沙热病毒GP基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
优选的，两个拉沙热病毒GP基因中的一个插在P基因和M基因之间，另外一个插在M基因和L基因之间。
优选的，所述弹状病毒科病毒包括狂犬病病毒和水泡性口炎病毒。
优选的，所述狂犬病病毒的毒株为SRV9毒株。
本发明提供了一种所述表达双拷贝拉沙热病毒GP基因的重组病毒株的构建方法，包括以下步骤：
1)分别将两个拉沙热病毒GP基因克隆至含有SRV9全长基因组的重组全长质粒中，并替换SRV9 GP基因，得到表达LASV GP的重组全长质粒；
2)将步骤1)中所述表达SRV9-LASV GP的重组全长质粒与辅助质粒共转染细胞进行病毒拯救，得到重组病毒rSRV9-2LASV-GP。
优选的，步骤1)中扩增所述两个拉沙热病毒GP基因的引物包括LASV/GP-F1/LASV/GP-R1引物对和LASV/GP-F2/LASV/GP-R2引物对；
所述LASV/GP-F1的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；
所述LASV/GP-R1的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；
所述LASV/GP-F2的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示；
所述LASV/GP-R2的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示。
优选的，步骤1)中所述辅助质粒包括表达狂犬病病毒的核蛋白的辅助质粒、表达狂犬病病毒的磷蛋白的辅助质粒、表达狂犬病病毒的RNA聚合酶的辅助质粒、表达狂犬病病毒的糖蛋白的辅助质粒；
所述表达LASV GP的重组全长质粒、表达狂犬病病毒的核蛋白的辅助质粒、表达狂犬病病毒的磷蛋白的辅助质粒、表达狂犬病病毒的RNA聚合酶的辅助质粒和表达狂犬病病毒的糖蛋白的辅助质粒的质量比为2～3:0.1～0.2:0.6～0.7:0.25～0.3:3～4。
优选的，所述细胞包括Vero E6细胞。
本发明提供了所述表达双拷贝拉沙热病毒GP基因的重组病毒株或所述构建方法得到的重组病毒株在制备预防和/或治疗拉沙热的疫苗中的应用。
本发明提供的表达双拷贝拉沙热病毒GP基因的重组病毒株，在弹状病毒科病毒的基础上，用两个拉沙热病毒GP基因替换弹状病毒科病毒中GP基因。本发明通过将拉沙热病毒GP蛋白的全部编码基因整合至弹状病毒科病毒的基因组序列中，在弹状病毒科病毒中高效表达拉沙热病毒的GP蛋白，得到的重组狂犬病病毒不仅具有良好的安全性，作为拉沙热疫苗具有良好的免疫原性，这在拉沙热病毒的治疗和免疫领域，具有重要意义。
附图说明
图1为本发明实施例中重组狂犬病病毒感染性克隆的构建示意图；
图2为拉沙热病毒GP基因的PCR电泳结果和酶切结果，其中A为LASV GP基因的PCR结果；B为LASV GP经Pst I/Kpn I双酶切(泳道2)及BsiW I/Pme I双酶切(泳道3)结果；
图3为本发明构建的重组全长质粒的酶切鉴定结果，其中泳道1为Marker，泳道2为重组全长质粒pSRV9-2LASV-GP BsiWI/Pme I双酶切鉴定(见泳道)，泳道3为Pst I/Kpn I双酶切鉴定；
图4为利用直接免疫荧光抗体鉴定重组病毒rSRV9-2LASV-GP结果图；
图5为重组病毒的间接免疫荧光鉴定重组病毒rSRV9-2LASV-GP结果图，其中A为LASV/Josiah GP鼠单克隆抗体鉴定重组病毒rSRV9-2LASV-GP表面糖蛋白结果，B为RABV/SRV9 GP鼠单克隆抗体鉴定重组病毒rSRV9-2LASV-GP表面糖蛋白的结果，C为A图与B图的合成图(Merge图)；
图6为利用SDS-PAGE和Western blot鉴定重组病毒rSRV9-2LASV-GP的结果，其中A为SDS-PAGE鉴定重组病毒rSRV9-2LASV-GP结果，B为Western blot鉴定重组病毒rSRV9-2LASV-GP表面糖蛋白结果；
图7为重组病毒rSRV9-2LASV-GP在电镜观察下观察形态图；
图8为重组病毒的生长动力学检测结果，其中A为重组病毒rSRV9-2LASV-GP在不用细胞上的生长动力学比较结果，B为重组病毒rSRV9-2LASV-GP与母本病毒的生长动力学比较图；
图9为重组病毒rSRV9-2LASV-GP及母本毒株对2日龄BALB/c乳鼠的致病力评价结果；
图10为重组病毒rSRV9-2LASV-GP在成年BALB/c小鼠的致病力评价结果，其中A为重组病毒rSRV9-2LASV-GP及母本毒株对成年BALB/c小鼠的存活率结果，B为重组病毒rSRV9-2LASV-GP及母本毒株对成年BALB/c小鼠的体重方面的影响；
图11为重组病毒rSRV9-2LASV-GP以及母本毒株在STAT1 KO免疫缺陷小鼠的致病力评价结果，其中A为肌肉注射途径感染重组病毒rSRV9-2LASV-GP的免疫缺陷小鼠的生存率，B为腹腔注射感染重组病毒rSRV9-2LASV-GP的免疫缺陷小鼠小鼠的生存率；
图12为Hartly豚鼠免疫及攻毒示意图；
图13为疫苗免疫组及对照组Hartly豚鼠攻毒后生存率结果；
图14为疫苗免疫组及对照组Hartly豚鼠攻毒后体重变化结果，其中A为疫苗免疫组及对照组豚鼠平均体重变化，B为免疫三针剂rSRV9-2LASV-GP组豚鼠体重变化，C为免疫两针剂rSRV9-2LASV-GP组豚鼠体重变化；D为对照组豚鼠体重变化；
图15为疫苗免疫组及对照组Hartly豚鼠攻毒后体温变化结果，其中A为疫苗免疫组及对照组豚鼠平均体温变化，B为免疫三针剂rSRV9-2LASV-GP组豚鼠体温变化，C为免疫两针剂rSRV9-2LASV-GP组豚鼠体温变化；D为对照组豚鼠体温变化；
图16为Hartly豚鼠LASV攻毒后临床评分，其中A为免疫三针剂灭活疫苗rSRV9-2LASV-GP组豚鼠临床得分，B为免疫两针剂灭活疫苗rSRV9-2LASV-GP组豚鼠临床得分，C为空白对照组豚鼠临床得分；
图17为病毒血症检测结果。
具体实施方式
本发明提供了一种表达双拷贝拉沙热病毒GP基因的重组病毒株，在弹状病毒科病毒的基础上，用两个拉沙热病毒GP基因插入到弹状病毒科病毒全长基因组中。
在本发明中，所述弹状病毒科病毒优选包括狂犬病病毒和水泡性口炎病毒。在本发明实施例中，所述狂犬病病毒的毒株优选为SRV9毒株。本发明实验结果表明，不同种类的骨架病毒对重组病毒株的复制增殖性能有一定影响，本发明采用弹状病毒科病毒作为骨架病毒有利于保持重组病毒株的复制增殖性能，而采用麻疹病毒或黄病毒等作为骨架病毒，因为不能进行外源糖蛋白与基因组中糖蛋白基因的置换，只能通过嵌合表达的策略进行重组病毒的构建，如若完全置换重组病毒难以获得拯救。
在本发明中，所述拉沙热病毒GP基因的核苷酸序列优选如SEQ ID NO:1(atgggacaaatagtgacattcttccaggaagtgcctcatgtaatagaagaggtgatgaacattgttctcattgcactgtctgtactagcagtgctgaaaggtctgtacaattttgcaacgtgtggccttgttggtttggtcactttcctcctgttgtgtggtaggtcttgcacaaccagtctttataaaggggtttatgagcttcagactctggaactaaacatggagacactcaatatgaccatgcctctctcctgcacaaagaacaacagtcatcattatataatggtgggcaatgagacaggactagaactgaccttgaccaacacgagcattattaatcacaaattttgcaatctgtctgatgcccacaaaaagaacctctatgaccacgctcttatgagcataatctcaactttccacttgtccatccccaacttcaatcagtatgaggcaatgagctgcgattttaatgggggaaagattagtgtgcagtacaacctgagtcacagctatgctggggatgcagccaaccattgtggtactgttgcaaatggtgtgttacagacttttatgaggatggcttggggtgggagctacattgctcttgactcaggccgtggcaactgggactgtattatgactagttatcaatatctgataatccaaaatacaacctgggaagatcactgccaattctcgagaccatctcccatcggttatctcgggctcctctcacaaaggactagagatatttatattagtagaagattgctaggcacattcacatggacactgtcagattctgaaggtaaagacacaccagggggatattgtctgaccaggtggatgctaattgaggctgaactaaaatgcttcgggaacacagctgtggcaaaatgtaatgagaagcatgatgaggaattttgtgacatgctgaggctgtttgacttcaacaaacaagccattcaaaggttgaaagctgaagcacaaatgagcattcagttgatcaacaaagcagtaaatgctttgataaatgaccaacttataatgaagaaccatctacgggacatcatgggaattccatactgtaattacagcaagtattggtacctcaaccacacaactactgggagaacatcactgcccaaatgttggcttgtatcaaatggttcatacttgaacgagacccacttttctgatgatattgaacaacaagctgacaatatgatcactgagatgttacagaaggagtatatggagaggcaggggaagacaccattgggtctagttgacctctttgtgttcagtacaagtttctatcttattagcatcttccttcacctagtcaaaataccaactcataggcatattgtaggcaagtcgtgtcccaaacctcacagattgaatcatatgggcatttgttcctgtggactctacaaacagcctggtgtgcctgtgaaatggaagagatga)所示。两个拉沙热病毒GP基因中的一个优选插在P基因和M基因之间，另外一个优选插在M基因和L基因之间(见图1)。导入两个GP的目的是在重组病毒复制过程中，提高拉沙病毒GP的转录水平，从而提高GP蛋白的表达量，使得更多的囊膜糖蛋白GP转运至细胞膜表明，促使子代病毒在出芽过程中获得的囊膜上会含有更多的GP蛋白，从而提高了该重组病毒作为免疫原的免疫原性，相比表达单个GP的重组病毒免疫效果更好，诱导机体产生更高水平GP蛋白特异性抗体，使得疫苗的保护效果更加。导入两个GP的作用是在重组病毒复制过程中，提高拉沙病毒GP的转录水平，从而提高GP蛋白的表达量，使得更多的囊膜糖蛋白GP转运至细胞膜表明，促使子代病毒在出芽过程中获得的囊膜上会含有更多的GP蛋白，从而提高了该重组病毒作为免疫原的免疫原性，相比表达单个GP的重组病毒免疫效果更好，诱导机体产生更高水平GP蛋白特异性抗体，使得疫苗的保护效果更加。
本发明提供了一种所述表达双拷贝拉沙热病毒GP基因的重组病毒株的构建方法，包括以下步骤：
1)分别将两个拉沙热病毒GP基因克隆至含有SRV9全长基因组的重组全长质粒中，并替换SRV9 GP基因，得到表达LASV GP的重组全长质粒；
2)将步骤1)中所述表达LASV GP的重组全长质粒与辅助质粒共转染细胞进行病毒拯救，得到重组病毒rSRV9-2LASV-GP。
本发明分别将两个拉沙热病毒GP基因克隆至含有SRV9全长基因组的重组全长质粒中，并替换SRV9 GP基因，得到表达LASV GP的重组全长质粒。
本发明对含有SRV9全长基因组的重组全长质粒中骨架载体的种类没有特殊限制，采用本领域所熟知的能够表达病毒全长基因组的载体即可，例如pcDNA3.1或pBluescriptskⅡ(+)载体。在本发明实施例中，以pcDNA3.1为骨架载体构建含有SRV9全长基因组的重组全长质粒，所述构建方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的构建方法即可。为了便于检测外源基因的表达情况，优选在含有SRV9全长基因组的重组全长质粒中插入绿色荧光蛋白报告基因eGFP。
在本发明中，扩增所述两个拉沙热病毒GP基因的引物优选包括LASV/GP-F1/LASV/GP-R1和LASV/GP-F2/LASV/GP-R2。所述LASV/GP-F1的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；所述LASV/GP-R1的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；所述LASV/GP-F2的核苷酸序列如SEQ IDNO:4所示；所述LASV/GP-R2的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示。其中LASV/GP-F1/LASV/GP-R1带有Pst I/Kpn I限制性内切酶切位点，该引物扩增产物插入P和M基因之间。所述LASV/GP-F2/LASV/GP-R2带有BsiW I/Pme I限制性内切酶切位点，插入M和L基因之间。
得到表达LASV GP的重组全长质粒后，优选对所述表达SRV9-LASV GP的重组全长质粒进行鉴定。所述鉴定方法优选采用酶切和测序进行鉴定。所述酶切鉴定的方法优选为采用Pst I/Kpn I和BsiWI/Pme I限制性内切酶分别进行限制性酶切，当得到1476bp片段后，进行测序。将测序正确的重组全长质粒进行后续操作。
得到鉴定正确的表达LASV GP的重组全长质粒后，本发明将所述表达pSRV9-2LASVGP的重组全长质粒与辅助质粒共转染细胞进行病毒拯救，得到重组病毒rSRV9-2LASV-GP。
在本发明中，所述辅助质粒优选包括表达狂犬病病毒的核蛋白的辅助质粒、表达狂犬病病毒的磷蛋白的辅助质粒、表达狂犬病病毒的RNA聚合酶的辅助质粒、表达狂犬病病毒的糖蛋白的辅助质粒。实验表明，表达LASV GP的重组全长质粒和辅助质粒在不同配比条件下对共转染结果有影响，所述表达pSRV9-2LASV GP的重组全长质粒、表达狂犬病病毒的核蛋白的辅助质粒、表达狂犬病病毒的磷蛋白的辅助质粒、表达狂犬病病毒的RNA聚合酶的辅助质粒和表达狂犬病病毒的糖蛋白的辅助质粒的质量比优选为2～3:0.1～0.2:0.6～0.7:0.25～0.3:3～4，更优选为2.5:0.125:0.625:0.25:3.78。
在本发明中，不同转染细胞对拯救重组病毒的效率有影响，通过筛选不同转染细胞(Vero、Vero E6、BHK、BSR和NA细胞)结果表明，包括Vero E6细胞适合重组病毒的繁殖。
在本发明中，将构建得到的表达双拷贝拉沙热病毒GP基因的重组病毒株进行直接免疫荧光鉴定、间接免疫荧光和蛋白水平鉴定以及电镜观察，结果均表明拉沙热病毒GP基因在重组病毒株中得到了有效表达。
在本发明中，对表达双拷贝拉沙热病毒GP基因的重组病毒株的生长动力学检测表明，重组病毒株与母本病毒没有显著显著性差异，说明拉沙热病毒GP基因的表达并未影响病毒的生长特性。
在本发明中，为了进一步评价表达双拷贝拉沙热病毒GP基因的重组病毒株的安全性，直接注射重组病毒株和母本病毒至动物幼体和成体内，结果表明，注射母本病毒的乳鼠分别在接种病毒后4～6dpi、5～8dpi和5～9dpi全部死亡，而重组病毒rSRV9-2LASV-GP组动物幼体和成体100％存活，结果表明重组病毒完全丧失对动物的致病性。同时所述重组病毒株对STAT1KO免疫缺陷小鼠有致病性，但程度弱于母本病毒株。
本发明还提供了所述表达双拷贝拉沙热病毒GP基因的重组病毒株或所述构建方法得到的重组病毒株在制备防控和/或治疗拉沙热的疫苗或药物中的应用。
在本发明中，所述疫苗优选包括表达双拷贝拉沙热病毒GP基因的重组病毒株和佐剂。所述重组病毒株和佐剂的体积比优选为1：1。在所述疫苗中，所述重组病毒株的终浓度优选为100μg/mL。所述佐剂优选为AddaVaxTM，AddaVaxTM是一种基于角鲨烯的水包油纳米乳液，可引发细胞(Th1)和体液(Th2)免疫应答。
在本发明中，所述疫苗的免疫方法，优选为3针剂和2针剂免疫。其中所述3针剂优选如下：每次免疫剂量为30μg，每两次免疫间隔7天和21天时间，免疫部位为右后肢腓肠肌。所述2针剂优选如下：每次免疫剂量为30ug，两次免疫间隔7天时间，免疫部位为右后肢腓肠肌。筛选发现，2针剂和3针剂的免疫方法均可得到100％免疫保护。
在本发明中，采用上述制备的疫苗免疫动物，可有效提高动物的生存率、有效缓解动物体重下降趋势、维持动物体温正常，消除或减轻临床反应和显著降低病毒血症。可见，所述疫苗具有良好的免疫原性，为防控拉沙热病的传播提供了有效手段。
下面结合实施例对本发明提供的一种表达双拷贝拉沙热病毒GP基因的重组病毒株及其构建方法和应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实验材料来源说明
1细胞与菌株
Vero
Vero-E6
BHK-21
NA
293T
购自ATCC；BSR/T7由中国农科院长春兽医研究所动物病毒学与特种动物疫病学实验室保存；HST08细菌感受态细胞购自Takara公司。
1.2抗体
FITC标记的RABV NP抗体购自FDI FUJIREBIO公司；鼠抗RABV GP单克隆抗体购自Merck Millipore公司；LASV GPC全人源单克隆抗体购自Zalgen Labs；FITC标记的山羊抗人抗体和Tex Red标记的山羊抗鼠抗体购自Abcam公司。
1.3主要试剂
Prime STAR Max DNA Polymerase购自Takara公司；限制性内切酶Pme I、BsiW I、Pst I、Kpn I和T4 DNA连接酶购自Thermo Fisher公司；DNA片段胶回收试剂盒、去内毒素质粒大提试剂盒和质粒小提试剂盒购自QIAGEN公司；Lipofectamine 3000转染试剂购自Invitrogen公司；FBS胎牛血清和Opti-MEM培养液均购自Giboco公司；DMEM细胞培养液购自Corning公司；DAPI购自Sigma公司；考马斯亮蓝染色液购自碧云天公司；Luminata ForteWestern HRP Substrate曝光液购自Millipore公司。
实施例1
一种表达双拷贝拉沙热病毒GP基因的重组病毒株的构建方法
(一)重组病毒的构建
1、感染性克隆的构建
(1)材料的准备
BSR-T7细胞、pcDNA3.1质粒均可通过市售途径购买获得，BALB/c乳鼠购自吉林省长春市亿斯实验动物技术有限责任公司。
以pcDNA3.1质粒为骨架，构建pcDNA3.1-SRV9-eGFP，方法如下：在pcDNA3.1空载体自带的CMV启动子下游，通过基因合成将T7启动子序列和锤头型核酶序列元件先行引入pcDNA3.1载体质粒中，并将SRV9全长基因组分段克隆至含有T7启动子和锤头型核酶序列下游，并在全长SRV9基因下游通过基因合成将丁肝病毒核酶序列元件引入序列中，得到pcDNA3.1-SRV9，全长SRV9基因组最终可通过Nhe I(895bp)和NotI(927bp)酶切鉴定，在分段连接过程中，在SRV9全长基因组2425bp位置处通过引入BsiWI和Pme I酶切位点的方法插入增强型绿色荧光蛋白报告基因(Enhanced green fluorescent protein，eGFP)，得到重组全长质粒pcDNA3.1-SRV9-eGFP。
以pcDNA3.1质粒为骨架，构建pcDNA3.1-N、pcDNA3.1-P、pcDNA3.1-L、pcDNA3.1-G，方法如下：将狂犬病病毒的N基因、P基因、L基因和G基因分别插入至pcDNA3.1质粒的Nhe I(895bp)和Sma I(2076bp)酶切位点之间位置。
2.表达双拷贝拉沙热病毒GP基因的重组全长质粒的构建
1)携带增强型绿色荧光蛋白eGFP的重组RABV/SRV9全长基因组质粒pCDNA3.1-SRV9-eGFP及辅助质粒pCDNA3.1-SRV9-NP、pCDNA3.1-SRV9-P、pCDNA3.1-SRV9-L和pCDNA3.1-SRV9-GP的构建
以pcDNA3.1质粒为骨架，构建pcDNA3.1-SRV9-eGFP，方法如下：在pcDNA3.1空载体自带的CMV启动子下游，通过基因合成将T7启动子序列和锤头型核酶序列元件先行引入pcDNA3.1载体质粒中，并将SRV9全长基因组(Wang,H.L.,Jin,H.L.,Feng,N.,Zheng,X.X.,Li,L.,Qi,Y.L.,Liang,M.,Zhao,Y.K.,Wang,T.C.,Gao,Y.W.,et al.(2015).Using rabiesvirus vaccine strain SRV9 as viral vector to express exogenous gene.VirusGenes 50,299-302.)分段克隆至含有T7启动子和锤头型核酶序列下游，并在全长SRV9基因下游通过基因合成将丁肝病毒核酶序列元件引入序列中，得到pcDNA3.1-SRV9，全长SRV9基因组最终可通过Nhe I(895bp)和NotI(927bp)酶切鉴定，在分段连接过程中，在SRV9全长基因组2425bp位置处通过引入BsiWI和Pme I酶切位点的方法插入绿色荧光蛋白报告基因eGFP，得到重组全长质粒pcDNA3.1-SRV9-eGFP。
以pcDNA3.1质粒为骨架，构建pcDNA3.1-N、pcDNA3.1-P、pcDNA3.1-L、pcDNA3.1-G，方法如下：将狂犬病病毒的N基因、P基因、L基因和G基因分别插入至pcDNA3.1质粒的Nhe I(895bp)和Sma I(2076bp)酶切位点之间位置。
2)拉沙热病毒GP基因的扩增
根据Genebank公布的LASV/Josiah GP(Genebank:HQ688672.1)基因开放阅读框(Open Reading Frame,ORF)序列，用Primer Premier 5软件设计引物，并送吉林省库美生物科技有限公司合成，引物序列信息见表1。
表1 LASV GP基因特异性扩增引物
注：表中下划直线标记处所示为限制性内切酶酶切位点序列信息，下划双直线标记处所示为RABV转录终止信号(PE，序列为TGAAAAAAA)和转录起始信号(PS，序列为AACATCCCT)。
2.2目的基因的扩增和回收
以人工合成的拉沙热病毒Josiah毒株GP基因序列(SEQ IID NO:1)为模板，采用上述引物进行PCR扩增，具体如下：
PCR反应体系为：Primer STAR Max Premix(2×)25μl，上游引物(20μM)1.25μl，下游引物(20μM)1.25μl，DNA模板200ng，灭菌蒸馏水补齐至50μl。PCR反应条件为：98℃预变性15s，98℃变性10s，55℃退火15s，72℃延伸(5s/kb，依据片段长度确定延长时间)，72℃10min，4℃保存。
PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳后，用DNA胶回收试剂盒回收PCR产物。DNA胶回收试剂盒具体步骤如下：
(1)凝胶溶解：Buffer L3溶液加入带有DNA凝胶的EP管，放入50℃水浴锅中，每3min倒转EP管一次至凝胶完全溶解；
(2)DNA与萃取柱结合：将完全溶解的凝胶溶液加入到萃取柱，以12000×g离心1min，弃去洗涤液，将萃取柱置于洗涤管；
(3)洗涤：500μL洗涤缓冲液(W1)加入柱内，在12 000×g下离心1min，弃去洗涤液，并将萃取柱放入洗涤管；
(4)除乙醇：以最大速度离心萃取柱2min，进一步除去洗涤液。
(5)洗脱：萃取柱放入新的1.5mL EP管中，加50μL洗脱缓冲液到萃取柱中心，室温静置1min；
(7)离心：12 000×g离心1min，收集管内液体。
3)重组全长质粒的构建与鉴定
基于本实验室已建立的RABV/SRV9反向遗传操作系统(INVALID CITATION)，按照图1所示构建双表达框表达LASV/Josiah GP的重组RABV感染性克隆，具体步骤如下：
(1)将载体质粒pCDNA3.1-SRV9-eGFP和项2.2中回收的LASV/Josiah GP片段用限制性内切酶BsiWI/Pme I酶切，酶切产物经1％琼脂糖凝胶电泳后回收；
目的基因的PCR和酶切结果
PCR产物经凝胶电泳后显示出特异性目的条带，其中LASV GP基因长度为1476bp(图2中A)，LASV GP经Pst I/Kpn I双酶切(图2中B中泳道2)及BsiWI/Pme I双酶切(图2中B中泳道3)条带大小均与理论值相符。
(2)用T4 DNA连接酶将目的基因LASV/Josiah GP分别连接到载体pCDNA3.1-SRV9-eGFP。酶切体系为：T4 DNA连接酶0.5μL，10×T4 Buffer 0.5μL，目的片段300ng，载体100ng，灭菌蒸馏水补齐至5μL；16℃恒温水浴锅连接过夜；
(3)将5μL连接产物加入到100μL HST08感受态中，在冰上冰浴30min，42℃恒温水浴锅中热激60s，冰浴3min，补加900μL SOC溶液，于30℃摇床上以180rpm/min速度培养1h。将培养后的菌液均匀涂布于氨苄抗性的固体LB培养基，置于30℃细菌培养箱中培养48h；
(4)挑取培养平板上的单克隆菌落，置于5mL氨苄抗性的LB液体培养基中，在30℃条件下，以200rpm/min培养20h，并保存菌液；
(5)按照QIAGEN质粒小量提取试剂盒的操作步骤提取重组全长质粒，用限制性内切酶进行酶切鉴定，酶切鉴定正确的重组全长质粒送至吉林省库美生物科技有限公司进行测序，测序正确的阳性质粒命名为pCDNA3.1-SRV9-LASV-GP；
(6)将LASV/Josiah GP基因片段和重组载体pCDNA3.1-SRV9-LASV-GP以限制性内切酶Pst I/Kpn I进行双酶切，利用T4 DNA连接酶将目的基因LASV/Josiah GP插入到重组载体pCDNA3.1-SRV9-LASV-GP的RABV GP处，按照上述操作步骤连接、转化和质粒提取，得到重组载体，酶切鉴定正确后送公司进行测序，测序正确的阳性质粒命名为pCDNA3.1-SRV9-2LASV-GP；
重组全长质粒的鉴定结果
重组全长质粒pCDNA3.1-SRV9-2LASV-GP分别通过限制性核酸内切酶BsiWI/Pme I和Pst I/Kpn I进行酶切鉴定，凝胶电泳结果显示重组全长质粒经BsiWI/Pme I和Pst I/Kpn I酶切后均可以得到1476bp的LASV/Josiah GP片段(图3)。结果表明重组全长质粒pCDNA3.1-SRV9-2LASV-GP，构建成功。
3.重组全长质粒及辅助质粒的大量制备
将鉴定正确的重组全长质粒pCDNA3.1-SRV9-2LASV-GP保存的相应菌种以及含有辅助质粒pCDNA3.1-SRV9-NP、pCDNA3.1-SRV9-P、pCDNA3.1-SRV9-L和pCDNA3.1-SRV9-GP的菌种按照1:1000的体积比接种于氨苄抗性的500mL LB中扩大培养，30℃恒温摇床以180rpm速度培养20h。其中狂犬病病毒N基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示，狂犬病病毒P基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示,狂犬病病毒L基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示，狂犬病病毒G基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示。用QIAGEN去内毒素质粒大提试剂盒提取质粒，步骤如下：
(1)培养过夜的细菌液，经6000×g，4℃条件下离心15min，弃上清，留沉淀；
(2)沉淀中加入10mL Buffer P1溶液，重悬细菌；
(3)加10mL Buffer P2溶液，剧烈晃动离心管4～6次使其混匀，室温放置5min，溶液变成蓝色；
(4)加入10mL冰浴的Buffer P3溶液到溶菌产物中，剧烈晃动离心管4～6次使其充分混匀，直到溶液蓝色颜色消失；
(5)将溶液倒入密封的过滤器，室温静置10min。打开针型密封盖，轻轻挤压活塞将溶液过滤到新的50ml离心管中；
(6)加入2.5mL Buffer ER溶液到过滤的溶液中，充分混匀10次后冰上孵育30min；
(7)将QIAGEN-tip500的柱子挂在另一离心管上，加入10mL Buffer QBT溶液，使管中溶液通过重力滴下；
(8)将步骤7冰上孵育的溶液加入QIAGEN-tip柱子中让其透过树脂慢慢滴下；
(9)用2×30mL Buffer QC溶液洗QIAGEN-tip柱；
(10)用15mLBuffer QN洗脱DNA，用新的离心管收集DNA洗脱液；
(12)加入10.5mL异丙醇到洗脱液中沉淀DNA，混匀。以大于16000×g，4℃离心30min，离心后弃去上清液；
(13)用5mL无内毒素的70％乙醇洗DNA，经15000×g，4℃离心10min，弃去上清，留沉淀；
(14)晾干质粒。用适当体积的无内毒素的BufferE溶液重新溶解DNA，检测质粒浓度并记录。
4.病毒拯救
将生长状态良好的BSR/T7细胞传代于6孔细胞培养板，细胞密度为2×105～3×105个/孔，待细胞密度长至90％汇合度时进行转染，转染体系如表2所示，具体步骤如下：
(1)在无菌1.5mL EP管A和B中分别加入250μL Opti-MEM溶液，从A管Opti-MEM液面底部缓慢加入10μL Lipofectamine 3000脂质体，室温静置15min；
(2)B管Opti-MEM液面底部按顺序分别加入辅助质粒pCDNA3.1-SRV9-N、pCDNA3.1-SRV9-P、pCDNA3.1-SRV9-L和pCDNA3.1-SRV9-G，再加入重组全长质粒pCDNA3.1-SRV9-2LASV-GP，最后加入16μL P3000转染增强剂，用枪头轻轻混匀，室温静置5min；各质粒的用量具体见表2。
(3)将B管的液体加至A管中，用枪头轻轻混匀，室温孵育30min；
(4)室温孵育期间，用Opti-MEM清洗BSR/T7细胞三次，然后每孔加入1.5mL Opti-MEM溶液；
(5)将孵育好的质粒-脂质体复合物逐滴加入6孔板每孔中，置于37℃，5％CO2细胞培养箱培养5h；
(6)作用5h后弃去6孔板中液体，每孔加入2mL含5％FBS的DMEM细胞培养基，继续培养120h～148h，将6孔板至于-80℃冰箱中冻融2次后，收取冻融后混合物并分装，记重组病毒P1代，冻存于-80℃冰箱备用。拯救的重组病毒分别命名为rSRV9-2LASV-GP。
表2 RABV重组LASV拯救体系质粒配比
实施例2
实施例1制备的重组病毒的鉴定
1.重组病毒的直接免疫荧光鉴定
将生长状态良好的BSR/T7细胞传代于24孔细胞培养板，细胞密度为2～3×105个/孔，待细胞密度长到90％汇合度时进行接毒，将实施例1制备的重组病毒P1代分别取100μL接种于24孔板，同时设置未接毒的细胞作为对照，将培养板置于37℃细胞培养箱(5％CO2)培养48h，直接免疫荧光的步骤如下：
(1)将24孔细胞培养板中培养液弃去，每孔加入200μL-20℃预冷的80％丙酮，细胞室温固定30min。
(2)弃去丙酮固定液，在水平摇床上用PBST清洗细胞3次，5min/次。
(3)用PBST 1:200倍稀释FITC标记的鼠抗RABV N蛋白单克隆抗体，每孔加入100μL抗体稀释液，置于37℃细胞温箱中作用1h。
(4)弃去抗体稀释液，在水平摇床上用PBST清洗细胞3次后置于荧光显微镜下观察。
重组病毒的直接免疫荧光鉴定
将拯救的P2代重组病毒rSRV9-2LASV-GP(图4)接种于BSR/T7细胞，FITC标记的RABV N蛋白免疫荧光抗体来检测重组病毒，荧光显微镜下接毒的细胞均显示出清晰的特异性绿色荧光，而未接毒的细胞对照未检测到特异性绿色荧光，结果表明三种重组病毒均拯救成功。
2.重组病毒的传代培养
取500μL P1代重组病毒接种细胞后置于37℃细胞温箱中感作1h，补加含5mL 5％FBS的DMEM细胞培养基继续于37℃温箱中培养120h，收取培养物置于-80℃冰箱中进行冻融2次后，进行分装，记作P2代，按照上述方法将病毒培养至P5代。
3.重组病毒的滴定
使用BSR/T7细胞进行病毒滴度的测定，病毒TCID50测定方法如下：
(1)取50μL待测病毒原液加入到450μL DMEM细胞培养液中，充分混匀，取50μL稀释病毒液加入到450μL DMEM细胞培养液中，以此类推，用相同的方法进行10倍连续梯度稀释，从10-1～10-8；
(2)用0.25％胰酶消化NA细胞，用含2％FBS的DMEM细胞培养液重悬细胞，调整细胞悬液密度为4×105个/mL，将细胞悬液加入96孔细胞培养板，100μL/孔；
(3)同步接种稀释好的病毒液，将病毒液从高稀释度到低稀释度加入96孔板中，50μL/孔，每个稀释度重复4个孔，同时设置正常细胞对照孔；
(4)将96孔细胞培养板置于37℃、5％CO2的温箱中培养48h；
(5)弃去孔内液体，用80％的预冷丙酮固定细胞，200μL/孔，将96孔板室温固定30min；
(6)弃去每孔液体，用PBST清洗，3min/次，共3次；
(7)用PBST 1:200倍稀释FITC标记的鼠抗RABV N蛋白单克隆抗体，1:300倍稀释伊文思蓝，30μL/孔，37℃孵育1h；
(8)弃去每孔液体，用PBST清洗，3min/次，共3次；
(9)倒置96孔板弃净每孔液体，置于荧光显微镜下观察，荧光灶阳性孔记为“+”，阴性孔记为“-”，根据Reed-Muench法计算病毒滴度。
4.间接免疫荧光鉴定LASV GP表达
BSR/T7细胞接种于24孔细胞培养板，细胞密度为2～3×105个/孔，将重组病毒rSRV9-2LASV-GP以MOI＝0.01进行接毒，间接免疫荧光步骤如下：
(1)固定细胞。接毒培养48h后弃去培养液，参照上述方法固定细胞。
(2)孵育一抗。将鼠抗RABV GP单克隆抗体用1％BSA进行1:1,000稀释，100μL/孔，LASV GP全人源单克隆抗体用1％BSA进行1:500稀释，100μL/孔，37℃孵育1h。
(3)弃去一抗孵育液，PBST洗3次，5min/次。
(4)孵育二抗。将Tex Red标记的山羊抗鼠抗体用PBST进行1:5,000稀释，100μL/孔，FITC标记的山羊抗人抗体用PBST进行1:1,000稀释，DAPI用PBST进行1:1,000稀释，100μL/孔，37℃孵育1h。
(5)弃去二抗孵育液，PBST清洗3次，5min/次，于荧光显微镜下观察。
间接免疫荧光鉴定LASV GP的表达结果
通过间接免疫荧光检测重组病毒rSRV9-2LASV-GP表面囊膜糖蛋白的表达情况，针对LASV/Josiah GP全人源单克隆抗体作为一抗，FITC标记的山羊抗人抗体为二抗，图5结果显示，荧光显微镜下可检测到特异性绿色荧光，同时以针对RABV GP的鼠源单克隆抗体为一抗，Tex Red标记的山羊抗鼠抗体为二抗检测RABV GP的表达情况，结果显示未检测到特异性红色荧光。结果表明重组病毒rSRV9-2LASV-GP表面只有LASV GP，符合实验预期。
5.重组病毒的SDS-PAGE和Western blot鉴定
为鉴定LAFV GP是否成功组装在重组病毒rSRV9-2LASV-GP表面，进行了SDS-PAGE和Western-Blot鉴定，实验步骤如下：
(1)将纯化的病毒粒子放入尿素缓冲液使其变性(125mM Tris-HCl[pH 6.8]，8M尿素，4％SDS，5％β-巯基乙醇，0.02％溴酚蓝)，95℃放置5min。
(2)然后将3μg蛋白质溶解在10％SDS-聚丙烯酰胺凝胶上，然后转移至Towbin缓冲液(192mM甘氨酸，25mM Tris，20％甲醇)中的硝酸纤维素膜上进行Western blot分析。
(3)然后将硝酸纤维素膜放在含有5％(wt/vol)脱脂奶粉的TBST缓冲液(100mMTris-HCl，150mM NaCl，0.01％Tween 20)中封闭1h。
(4)封闭后，将膜与RABV GP的单克隆抗体4C12或针对LASV GP的单克隆抗体的混合物以1:1,000的稀释度在含有5％BSA的PBS中孵育过夜。
(5)洗涤后，将膜与1:20,000稀释的二抗在室温孵育1h。使用SuperSignal WestDura化学发光底物进行显色。使用FluorChem M电荷耦合器件成像系统捕获图像。
重组病毒的SDS-PAGE和Western-Blot鉴定结果
分别收获重组病毒rSRV9-2LASV-GP，完全灭活后纯化病毒颗粒，以分析其各蛋白质组分。病毒液经浓缩后通过蔗糖梯度密度离心进行纯化分离，并在十二烷基硫酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶上进行分离，可检测到重组病毒的多个蛋白条带，这些条带的大小分别对应RABV NP、P、M和L蛋白以及LASV GP蛋白(图6中A)。SDS-PAGE检测出的条带不足以验证目的蛋白的表达，为了验证LASV GP蛋白的存在，进行了Western blot分析。使用针对LASV GP的单克隆抗体，在rSRV9-2LASV-GP病毒体中检测到70kDa GPC及44kDa GP1(图6中B)。总的来说，LASV GPC在重组病毒中得到了有效表达。
6.重组病毒的透射电镜观察
将β-丙内酯灭活的病毒液滴于封口膜上，使之形成一个球形小液滴，用眼科镊夹取透射电镜专用铜网悬于小液滴上方与重组病毒充分吸附，室温作用15min后用1％磷钨酸染色3min，染色后用吸水纸除去铜网表面残余的磷钨酸，在透射电镜下观察病毒粒子。
重组病毒的透射电镜观察结果
取P5代三种重组病毒培养液的上清于透射电镜下观察，电镜下观察到重组病毒rSRV9-2LASV-GP典型的子弹状(图7)，孵育一抗和胶体金颗粒标记的二抗后，病毒粒子表与胶体金颗粒结合，结果表明LASV GP蛋白成功组装在病毒粒子表面。
7.重组病毒的生长动力学检测
选用Vero细胞、Vero-E6细胞、BSR/T7细胞、BHK-21和NA细胞对重组病毒rSRV9-2LASV-GP在不同细胞上的生长动力学进行探索，将以上五种细胞分别接种于T25细胞培养瓶，细胞达到80％～90％汇合度时，以MOI＝5将病毒接种细胞，37℃细胞温箱中感作1h，弃去瓶内液体，用无血清培养基洗涤细胞3次，向细胞培养瓶内加入5ml含2％FBS的DMEM培养液。每隔24h从细胞上清液中收集200μL样品，并在BSR/T7细胞上测定每个时间所收获的病毒的滴度，病毒滴度测定方法同上，绘制生长动力学曲线。
为探索重组病毒rSRV9-2LASV-GP与母本病毒SRV9的生长动力学差异以，以MOI＝5将病毒接种于细胞达到80％～90％汇合度的BSR/T7细胞或NA细胞，每隔24h从细胞上清液中收集200μL样品，并在测定每个时间所收获样品的病毒滴度，病毒滴度测定方法同上，绘制生长动力学曲线。
重组病毒的生长动力学检测结果
鉴于重组病毒rSRV9-2LASV-GP中LASV GP完全取代了RABV GP，使用Vero-E6、Vero、BHK-21、BSR/T7和NA细胞上进行重组病毒rSRV9-2LASV-GP生长动力学检测，结果表明重组病毒rSRV9-2LASV-GP在Vero-E6和Vero上生长趋势较好，尤其Vero-E6细胞上显示出优于其他细胞上的生长趋势，在接毒后的第5天病毒生长达到峰值，病毒滴度可达2.58×108.75TCID50/mL，结果表明，重组病毒rSRV9-2LASV-GP的最佳培养细胞为Vero-E6(图8中A)；为检测病毒重组之后是否会影响病毒的生长动力学，在BSR/T7细胞上进行了重组病毒rSRV9-2LASV-GP与母本病毒RABV/SRV9株的生长动力学比较，结果表明三种重组病毒都在接毒后的第5天达到生长峰值，与母本病毒没有显著性差异，进一步表明病毒重组之后并未影响到病毒的生长动力学(图8中B)。
实施例3
拉沙热病毒重组狂病病毒载体双G株的安全性评价
1.材料
1.1实验动物
BALB/c孕鼠和4～6周龄健康雌性BALB/c小鼠购自长春市亿斯实验动物技术有限责任公司；4～6周龄健康雌性STAT1缺陷鼠由军事兽医研究所提供。
2方法
2.1重组病毒的BALB/c乳鼠安全性评价
为检测重组病毒的致病力是否与母本病毒RABV/SRV9存在差异，分别使用2日龄BALB/c乳鼠、4～6周龄BALB/c成年鼠和4～6周龄STAT1 KO免疫缺陷鼠进行致病力评价。
BALB/c乳鼠安全性实验：8周龄的BALB/c孕鼠9只分笼饲养并分别标号A1、A2、A3、B1、B2和B3，待孕鼠产下乳鼠，用微量注射器分别通过颅内注射途径对A1、A2、A3组2日龄乳鼠注射102、104和106TCID50/50μL重组病毒rSRV9-2LASV-GP，分别对B1、B2和B3组2日龄乳鼠颅内注射102、104或106TCID50/50μL母本病毒RABV/SRV9。
2.2重组病毒的BALB/c成年鼠安全性评价
BALB/c成年鼠安全性实验：6周龄的雌性BALB/c小鼠每组5只，分别标号A1～A3和B1～B3，共计6组，重组病毒rSRV9-2LASV-GP、和母本病毒RABV/SRV9以不同的剂量(102、104或106TCID50/50μL)通过颅内注射的方式对每组小鼠进行感染。对攻毒小鼠每天进行体重和临床症状监测，观察至感染后第18天。对体重减轻超过20％或表现出严重神经系统症状(包括震颤、癫痫发作、虚脱和瘫痪)时，对小鼠实施安乐死。
2.3重组病毒的免疫缺陷鼠安全性评价
免疫缺陷鼠安全性实验：8周龄的雌性STAT1 KO小鼠每组5只，分别标号A1～A3和B1～B3，共计6组，用微量注射器分别对A1、A2和A3组小鼠分别通过肌肉或腹膜内感染102、104和106TCID50/50μL重组病毒rSRV9-2LASV-GP，B1、B2和B3组小鼠感染母本病毒RABV/SRV9。每天监测小鼠体重变化并观察疾病迹象，直到18dpi。对体重减轻超过20％或表现出严重神经系统症状(包括震颤、癫痫发作、虚脱和瘫痪)的STAT1 KO小鼠实施安乐死。
重组病毒的安全性评价
为探索病毒重组后是否对2日龄BALB/c乳鼠存在神经毒性，分别以102、104和106TCID50/50μL剂量的重组病毒rSRV9-2LASV-GP和母本病毒RABV SRV9株通过颅内注射感染2日龄乳鼠，注射母本病毒的乳鼠分别在接种病毒后4～6dpi、5～8dpi和5～9dpi全部死亡，而重组病毒rSRV9-2LASV-GP组乳鼠100％存活，结果表明重组病毒rSRV9-2LASV-GP完全丧失对乳鼠的致病性(见图9)。
为探索病毒重组后是否对4～6周龄成年BALB/c小鼠存在神经毒性，分别以102、104或106TCID50/50μL剂量的三种重组病毒及母本病毒RABV SRV9株通过颅内注射感染成年BALB/c小鼠，结果显示接种重组病毒rSRV9-2LASV-GP的小鼠100％存活(图10中A)，体重呈持续上升趋势(图10中B)，以上结果表明重组病毒及母本病毒对成年BALB/c小鼠没有致病性。
以102、104或106TCID50/50μL剂量将重组病毒rSRV9-2LASV-GP或母本毒RABV SRV9株通过肌肉(图11中A)和腹腔(图11中B)注射感染STAT1 KO小鼠，结果表明重组病毒rSRV9-2LASV-GP和母本病毒RABV SRV9株均对STAT1 KO免疫缺陷小鼠有致病性，但重组病毒rSRV9-2LASV-GP对小鼠致病性要弱于母本毒。
实施例4
拉沙热病毒重组狂犬病病毒灭活疫苗对豚鼠的免疫原性研究
1.材料
1.1毒株
RABV疫苗株SRV9和强毒株HuNPB3由中国农科院长春兽医研究所动物病毒学与特种动物疫病学实验室保存。LASV/Josiah豚鼠适应株LASV/Josiah由加拿大国家微生物实验室(National Microbiology Laboratory,NML)生物安全四级实验室保存。
1.2实验动物
32只6～8周龄周龄远交系Hartly豚鼠由加拿大国家微生物实验室国家微生物实验室(National Microbiology laboratory)提供。
2方法
2.1灭活疫苗的制备
以MOI为0.01在Vero-E6细胞上大规模培养重组病毒rSRV9-2LASV-GP和BSR/T7细胞上大规模培养重组病毒rSRV9-L-R-GP。每4d收集上清液，共收获6次。使用RABV噬斑形成测定法确定病毒的效价。将收获物收集在一起，并在300ml超滤池中浓缩9次。然后使用SW32Ti转子通过20％蔗糖将浓缩的上清液在25,000rpm下离心2h，以沉淀病毒颗粒。将病毒粒子沉淀重悬于PBS中，并使用BCA试剂盒测定总蛋白浓度。向病毒粒子中加入1:2,000倍稀释的β-丙内酯，4℃下化学灭活过夜。第2d通在37℃恒温水浴锅水解30min使病毒灭活剂中的β-丙内酯完全失活。通过在T25细胞培养瓶中用10gβ-丙内酯灭活病毒接种Vero细胞或BSR/T7细胞，连续盲传2代来验证是否存在感染性病毒粒子。80％丙酮固定细胞，并孵育FITC标记的抗RABV N MAb，通过荧光显微镜观察荧光灶。
2.2 Hartly豚鼠免疫及攻毒保护
Hartly豚鼠免疫：将50只Hartly豚鼠，平均分成A、B和C三组，10只/组，包括5只雌性和5只雄性，A组豚鼠通过肌肉注射途径免疫30μg的灭活rSRV9-2LASV-GP，在免疫后第7d和第14d分别加强免疫一次，总计免疫三针剂；B组豚鼠免疫30μg的灭活疫苗rSRV9-2LASV-GP，在免疫后第7d加强免疫疫苗一次，总计免疫两针剂；C组豚鼠免疫30μg灭活的母本毒RABV/SRV9，在免疫后第7d和第14d分别加强免疫一次，总计免疫三针剂。在免疫前，免疫后第21d，第49d进行采血并收集血清，免疫流程如图12所示。
Hartly豚鼠免疫攻毒保护：在免疫后的第47d，以104PFU剂量的豚鼠适应株LASV/Josiah通过腹腔注射途径对免疫后C组豚鼠进行攻毒，在12dpi分别对5组豚鼠进行采血并收集血清，同时进行全血细胞计数和血浆生化指标检测，观察豚鼠至45dpi，对幸存豚鼠进行采血后安乐死，攻毒保护流程如图12所示。
1.Hartly豚鼠生存率结果
结果说明3组攻毒组豚鼠的生存率总体情况，免疫三针剂灭活疫苗rSRV9-2LASV-GP可以100％保护远交系Hartly豚鼠免受豚鼠适应株LASV/Josiah的致死性攻击(图13)；为探索疫苗起保护效果的最低剂量，对免疫剂量进行了探索，结果表明免疫两针剂灭活疫苗rSRV9-2LASV-GP也可以100％保护豚鼠免受豚鼠适应株LASV/Josiah的致死性攻击(图13)。
2.Hartly豚鼠体重监测结果
图14结果说明的是3组豚鼠攻毒后的平均体重变化情况，免疫三针剂或二针剂灭活疫苗rSRV9-2LASV-GP的豚鼠平均体重呈持续增长趋势(图14中A)。从个体角度分析，免疫三针剂灭活疫苗rSRV9-2LASV-GP的10只豚鼠中有9只豚鼠体重呈持续上升趋势，1只豚鼠体重不稳定，但依旧幸存(图14中B)；免疫二针剂灭活疫苗rSRV9-2LASV-GP的10只豚鼠中有9只豚鼠体重后期都呈增长趋势，1只豚鼠体重在22dpi开始下降，但最终幸存(图14中C)，对照组豚鼠体重均呈显著下降趋势(图14中D)。
3.Hartly豚鼠体温监测结果
图15结果反应的是3组豚鼠攻毒后的平均体温度变化情况，免疫三针剂或二针剂灭活疫苗rSRV9-2LASV-GP的豚鼠平均体温在正常范围38.9℃～39.7℃内波动(图15中A)。从个体角度分析，图15中B和图15中C分别显示了免疫三针剂或二针剂灭活疫苗rSRV9-2LASV-GP的两个疫苗免疫组中豚鼠个体的体温变化情况，结果表明大部分幸存豚鼠在攻毒后期体温均正常，有个别豚鼠可能因个体差体温异常，对照组豚鼠体重均呈先升高而后下降趋势(图15中D)。
4.Hartly豚鼠临床评分结果
三针剂灭活疫苗rSRV9-2LASV-GP免疫组豚鼠均未出现任何临床症状，所有豚鼠临床评分均为0分(图16中A)；免疫二针剂灭活疫苗rSRV9-2LASV-GP免疫组豚鼠，有2只豚鼠出现轻微临床症状，后期2只豚鼠临床症状消失，所有豚鼠临床评分均为0分(图16中B)。对照豚鼠均出现典型的临床症状，且随时间推移LF临床症状越来越明显，临床评分均较高(图16中C)。
5.Hartly豚鼠毒血症检测结果
在豚鼠攻毒后的12dpi对豚鼠进行采血并检测病毒血症，如图17所示，免疫三针剂或二针剂灭活疫苗rSRV9-2LASV-GP的豚鼠的LASV基因组拷贝数都低于对照组。
实施例5
在重组病毒拯救的过程，开展了最佳质粒最佳转染比例的筛选实验
按照实施例1记载的方法进行病毒拯救，不同之处在于设置几组不同质粒配比的实验组，具体见表3。
表3 RABV重组LASV拯救体系质粒配比
按照以上病毒拯救的质粒配比方案，分别转染6个孔单层BSR/T7细胞，以每个方案病毒拯救成功的阳性孔数与总转染孔数计算重组病毒的拯救效率，方案1为重组病毒的拯救效率为50％(3/6)，方案2为33.3％(2/6)，方案1为100％(6/6)，筛选获得病毒最佳拯救质粒配比方案为方案3，筛选结果表明提高辅助质粒pCDNA3.1-SRV9-G的比率有助于提高重组病毒的拯救效率。
重组病毒拯救的过程中，拯救效率最高的质粒用量为：重组狂犬病病毒载体的用量为2～3μg，表达狂犬病病毒的核蛋白的辅助质粒的用量为0.1～0.2μg，表达狂犬病病毒的磷蛋白的辅助质粒的用量为0.6～0.7μg，表达狂犬病病毒的RNA聚合酶的辅助质粒的用量为0.25～0.3μg，表达狂犬病病毒的糖蛋白的辅助质粒的用量为3～4μg。
实施例6
培养重组病毒最佳感染和繁殖的最佳宿主细胞筛选，在Vero，Vero E6,BHK，BSR/T7和NA细胞上按照实施例2记载的方法进行了重组病毒(实施例1拯救得到)的生长动力学检测。
筛选适合病毒繁殖的最佳宿主细胞为Vero E6细胞，在该细胞上的生长滴度高于其他几种细胞，与母本病毒生长滴度无显著性差异(图8中A)。
实施例7
在重组病毒作为灭活疫苗使用时，进行了疫苗使用的剂量筛选，分别动物进行了3针剂和2针剂免疫，具有实验方案为：将50只Hartly豚鼠，平均分成A、B、C、三组，10只/组，包括5只雌性和5只雄性，A组豚鼠通过肌肉注射途径免疫30μg的灭活重组病毒rSRV9-2LASV-GP，在免疫后第7d和第14d分别加强免疫一次，总计免疫三针剂；B组豚鼠免疫30μg的灭活疫苗rSRV9-2LASV-GP，在免疫后第7d加强免疫疫苗一次，总计免疫两针剂。
筛选发现重组病毒灭活作为疫苗使用取得100％保护的最小免疫剂量为2针剂，最佳免疫剂量为3针剂(图13)。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种表达双拷贝拉沙热病毒GP基因的重组病毒株，其特征在于，在弹状病毒科病毒的基础上，用两个拉沙热病毒GP基因替代弹状病毒科病毒中GP基因。
2.根据权利要求1所述表达双拷贝拉沙热病毒GP基因的重组病毒株，其特征在于，所述拉沙热病毒GP基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
3.根据权利要求1所述表达双拷贝拉沙热病毒GP基因的重组病毒株，其特征在于，两个拉沙热病毒GP基因中的一个插在P基因和M基因之间，另外一个插在M基因和L基因之间。
4.根据权利要求1～3任意一项所述表达双拷贝拉沙热病毒GP基因的重组病毒株，其特征在于，所述弹状病毒科病毒包括狂犬病病毒和水泡性口炎病毒。
5.根据权利要求4所述表达双拷贝拉沙热病毒GP基因的重组病毒株，其特征在于，所述狂犬病病毒的毒株为SRV9毒株。
6.一种权利要求1～5任意一项所述表达双拷贝拉沙热病毒GP基因的重组病毒株的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)分别将两个拉沙热病毒GP基因克隆至含有SRV9全长基因组的重组全长质粒中，并替换SRV9 GP基因，得到表达LASV GP的重组全长质粒；
2)将步骤1)中所述表达LASV GP的重组全长质粒与辅助质粒共转染细胞进行病毒拯救，得到重组病毒rSRV9-2LASV-GP。
7.根据权利要求6所述构建方法，其特征在于，步骤1)中扩增所述两个拉沙热病毒GP基因的引物包括LASV/GP-F1/LASV/GP-R1引物对和LASV/GP-F2/LASV/GP-R2引物对；
所述LASV/GP-F1的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；
所述LASV/GP-R1的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；
所述LASV/GP-F2的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示；
所述LASV/GP-R2的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示。
8.根据权利要求6所述构建方法，其特征在于，步骤1)中所述辅助质粒包括表达狂犬病病毒的核蛋白的辅助质粒、表达狂犬病病毒的磷蛋白的辅助质粒、表达狂犬病病毒的RNA聚合酶的辅助质粒、表达狂犬病病毒的糖蛋白的辅助质粒；
所述表达LASV GP的重组全长质粒、表达狂犬病病毒的核蛋白的辅助质粒、表达狂犬病病毒的磷蛋白的辅助质粒、表达狂犬病病毒的RNA聚合酶的辅助质粒和表达狂犬病病毒的糖蛋白的辅助质粒的质量比为2～3：0.1～0.2：0.6～0.7：0.25～0.3：3～4。
9.根据权利要求6～8任意一项所述构建方法，其特征在于，所述细胞包括Vero E6细胞。
10.权利要求1～5任意一项所述表达双拷贝拉沙热病毒GP基因的重组病毒株或权利要求6～9任意一项所述构建方法得到的重组病毒株在制备预防拉沙热的疫苗和/或治疗拉沙热的药物中的应用。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20230321 |