EA027142B1

EA027142B1 - Улучшенные способы получения сквалена

Info

Publication number: EA027142B1
Application number: EA201291225A
Authority: EA
Inventors: Мэниндер Хора
Original assignee: Новартис Аг
Priority date: 2010-05-12
Filing date: 2011-05-12
Publication date: 2017-06-30
Also published as: CA2798924A1; US9867877B2; US9199897B2; US20160051670A1; EP3103784B1; CA2798924C; CN102892734B; PT3103784T; MX352758B; PL2569267T5; JP5946188B2; PL2620423T5; AU2011251706B2; IL222855A0; KR20130103668A; PT3489211T; ES2817446T3; EP2620423A1; SG185419A1; ZA201208381B

Abstract

Улучшенный способ получения сквалена из скваленсодержащей композиции; причем указанный способ включает стадии (а) очищающей дистилляции, осуществляемой при температуре T; (b) денатурирующей дистилляции, осуществляемой при температуре Т; в котором стадии (а) и (b) можно осуществлять в любом порядке; Tи Тявляются достаточными, чтобы вызвать кипение сквалена; T>T; и Т≥200°С.

Description

Изобретение относится к области получения сквалена, имеющего чистоту, соответствующую фармацевтическому использованию.

Уровень техники

Масло печени акулы содержит разветвленный ненасыщенный терпеноид, называемый скваленом, (С₃₀Н₅₀); [(СН₃)₂С[=СНСН₂СН₂С(СН₃)]₂=СНСН₂-]₂; 2,6,10,15,19,23-гексаметил-2,6,10,14,18,22-тетракозагексаен; СА8 ΚΝ 7683-64-9). Известно применение сквалена в эмульсиях типа масло в воде для человеческих вакцин, например в эмульсии МР59, которую используют в качестве адъюванта в вакцинах против гриппа. Сквален также используют в других фармацевтических продуктах (например, мазях, суппозиториях) и в косметике.

Современными источниками сквалена являются, прежде всего, рыбьи жиры и, в частности, масла печени акулы. Могут иметь место проблемы, связанные с использованием сквалена, экстрагированного из масла печени акулы, особенно, если строгие стандарты производства (такие как стандарты, используемые при производстве МР59 компанией ΝοναΠίδ). не соблюдаются. Например, акулы могут быть инфицированы патогенами, которые также являются заразными для людей или которые продуцируют вещества, вредные для людей; а также могут существовать Т8Е или ΤδΕ-подобные агенты [например, ссылки 1-3]. Помимо этого, акулы могут содержать человеческие токсины, такие как кархатоксин (сагсйа1охш). Кроме того, акулы могут содержать белки, аллергенные для человека. Распространенным белком, аллергенным для человека, является парвальбумин, который находят у акул. Таким образом, дешевые низкосортные источники сквалена не подходят для фармацевтического использования для людей. Риск нанести вред реципиенту-человеку может повышаться в ситуациях, когда сквален является частью иммунологического адъюванта, поскольку, по определению, адъювант может индуцировать сильный нежелательный иммунный ответ против примеси.

Было бы полезно найти дополнительные способы и улучшенные способы получения сквалена, которые являются подходящими для фармацевтического применения, т.е. продукта, который удовлетворяет регулятивным стандартам и не содержит контаминантов, патогенов, вирусов, токсинов или белков, которые могли бы нанести вред человеку. Способ по настоящему изобретению является особенно пригодным для очистки сквалена, полученного из масла печени акулы.

Описание изобретения

Изобретение относится к способу получения сквалена из композиции, включающей сквален животного происхождения; причем указанный способ включает стадии: (а) очищающей дистилляции, осуществляемой при температуре Τι; (Ь) денатурирующей дистилляции, осуществляемой при температуре Т₂; причем стадии (а) и (Ь) можно осуществлять в любом порядке; Τι и Т₂ являются достаточными, чтобы вызвать кипение сквалена; Т₂>Т₁; и Т₂>200°С. Источником животного происхождения обычно является рыбный источник, такой как масло печени акулы (или экстракт из него), т.е. изобретение относится к способу получения сквалена из масла печени акулы или из экстракта из масла печени акулы.

Настоящее изобретение относится также к способу получения сквалена из композиции, содержащей сквален, включающему стадии:

(a) очищающей дистилляции, осуществляемой при температуре Т₁;

(b) денатурирующей дистилляции, осуществляемой при температуре Т₂; причем стадии (а) и (Ь) можно осуществлять в любом порядке; Т₁ и Т₂ являются достаточными, чтобы вызвать кипение сквалена; Т₁<140 и Т₂>200°С. Композицией, содержащей сквален, обычно может являться масло печени акулы или экстракт из него.

Настоящее изобретение относится также к способу редистилляции композиции, включающей по меньшей мере 99% сквалена; причем указанная редистилляция представляет собой денатурирующую редистилляцию, осуществляемую при температуре Т₂; в котором Т₂>200°С. Указанная редистилляция может уменьшать содержание влаги в композиции, например, до <0,01%.

Способ по настоящему изобретению можно использовать для получения продукта, который подходит для фармацевтического использования. В частности, способ по настоящему изобретению можно использовать для получения очищенного сквалена, который не содержит контаминантов, патогенов, вирусов, токсинов или белков, в частности белка парвальбумина, которые могли бы нанести вред человеку.

Настоящее изобретение относится также к способу получения эмульсии типа масло в воде, включающему получение эмульсии с использованием сквалена, полученного в соответствии со способами, описанными выше.

Настоящее изобретение относится также к способу получения вакцинной композиции, включающему получение эмульсии, как описано выше, и объединение эмульсии с антигеном.

Настоящее изобретение относится также к способу получения вакцинного набора, включающему получение эмульсии, описанной выше, и упаковку эмульсии в набор, в качестве компонента набора, вместе с антигенным компонентом.

- 1 027142

Настоящее изобретение относится также к сквалену, полученному согласно способам по настоящему изобретению.

Настоящее изобретение относится также к эмульсии типа масло в воде, включающей сквален, полученный согласно способам по настоящему изобретению.

Настоящее изобретение относится также к вакцине, включающей сквален, полученный согласно способам по настоящему изобретению.

Настоящее изобретение относится также к применению сквалена, полученного согласно способам по настоящему изобретению, в вакцине.

Очищающая дистилляция.

Композиция, включающая сквален, может быть получена из любого подходящего источника, например снятой пены из мыла черного щелока, мыла таллового масла, необработанного таллового масла, смолы таллового масла, масла сахарного тростника, остатков после экстракции, дегуммирования и рафинирования масел и жиров, остатков после перегонки жирных кислот и сложных эфиров, дистиллятов после дезодорирования растительных масел, оливкового масла, соевого масла, масла рисовых отрубей, масла печени акулы, говяжьего жира, кофейного масла, рыбьего жира, масла печени трески, масла зародышей пшеницы, масла зародышей кукурузы, пальмовых масел, масла андиробы и масло из томатных остатков. В частности, композицию, включающую сквален, можно получить из масла печени акулы.

Очищающая дистилляция удаляет примеси из композиции, включающей сквален, в результате чего получают очищенную композицию. Композиция, включающая сквален, обычно представляет собой жидкость. До осуществления очищающей дистилляции композиция, включающая сквален, может содержать такие примеси как скваламин, алкилглицеролы, жирные кислоты (например, омега-3 жирные кислоты), витамины А и Ό, пристин, триглицериды, эфиры глицерина и жирные спирты.

Очищающую дистилляцию осуществляют при температуре Τι, где Т может быть достаточной, чтобы вызвать кипение сквалена, т.е. Т может превышать или равняться температуре кипения сквалена. Температура кипения сквалена составляет 429-430°С при 760 мм рт.ст. (т.е. при давлении в 1 атмосферу).

Температурой кипения жидкости является температура, при которой давление пара жидкой фазы соединения равно внешнему давлению, действующему на поверхность жидкости. Таким образом, температура кипения сквалена и, следовательно, нижняя граница Т₁, будет зависеть от внешнего давления, действующего на поверхность композиции, включающей сквален. Указанное явление хорошо известно, и специалист может рассчитать наблюдающуюся температуру кипения сквалена при данном используемом давлении дистилляции. Альтернативно, специалист будет способен рассчитать требующееся давление дистилляции на основе желательной наблюдающейся температуры кипения сквалена. Указанные расчеты можно осуществлять с использованием номограммы.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения очищающую дистилляцию можно осуществлять при температуре по меньшей мере 70°С, например по меньшей мере 75°С или по меньшей мере 80°С. В другом варианте осуществления настоящего изобретения очищающую дистилляцию можно осуществлять при температуре менее 140°С, например менее 130°С, менее 120°С, менее 110°С, менее 100°С, менее 95°С, менее 90°С или менее 85°С.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения очищающую дистилляцию можно осуществлять в условиях, близких к вакууму. В частности, очищающую дистилляцию можно осуществлять при давлении по меньшей мере 0,5 мкм рт.ст., например по меньшей мере 0,75 мкм рт.ст. или по меньшей мере 1 мкм рт.ст. Очищающую дистилляцию можно осуществлять при давлении менее 5 мкм рт.ст., например, менее 2,5 мкм рт.ст. или менее 2 мкм рт.ст.

Дополнительные варианты осуществления настоящего изобретения включают комбинации минимальных и максимальных температур и минимальных и максимальных величин давления, указанных выше.

Результатом очищающей дистилляции может быть композиция, которая включает по меньшей мере 95% сквалена, например по меньшей мере 96% сквалена, по меньшей мере 97% сквалена, по меньшей мере 98% сквалена, по меньшей мере 99% сквалена, по меньшей мере 99,5% сквалена, по меньшей мере 99,8% сквалена, по меньшей мере 99,9% сквалена или даже 100% сквалена.

Все процентные доли, описанные в настоящем описании, представляют собой массовые процентные доли и могут быть измерены с использованием газовой хроматографии (ОС). ОС можно осуществлять введением образца сквалена в гексане в газовый хроматограф, оборудованный пламенноионизационным детектором (РГО). Анализ можно осуществлять на капиллярной колонке 30 м х 0,32 мм х 0,50 мм при 200°С в течение 2 мин, а затем с повышением на 12°С в минуту до температуры 310°С, которую поддерживают в течение 9 мин. Температуру порта введения и РГО поддерживают на уровне 300 и 320°С соответственно. Идентичность пика сквалена устанавливают с помощью ОС/Μδ (газовой хроматографии с использованием масс-селективного детектора). Чистота описывается как площадь пика сквалена как процент от суммы площадей всех пиков на хроматограмме.

Очищающую дистилляцию можно осуществлять перед денатурирующей дистилляцией с получением очищенной композиции. Альтернативно, очищающую дистилляцию можно осуществлять после дена- 2 027142 турирующей дистилляции, с получением денатурированной очищенной композиции.

Денатурирующая дистилляция.

Акулы и, следовательно, сквален, полученный из масла печени акулы, могут содержать белки, к которым у человека может быть аллергия. Распространенным рыбным белком, к которому у людей может быть аллергия, является парвальбумин, который находят у акул. Помимо этого, контаминантные белки или материалы могут быть введены в композицию сквалена, например, после очищающей дистилляции или в виде продуктов распада сквалена. Возможные контаминантные белки или материалы включают ацетон, ацетальдегид, формальдегид и воду. Преимущественно, стадия денатурирующей дистилляции денатурирует и/или удаляет белки, в частности парвальбумин, и любые контаминантные белки, из композиции, включающей сквален, с получением, таким образом, денатурированной композиции. Еще одним преимуществом способа по настоящему изобретению является то, что денатурирующая дистилляция может гарантировать инактивацию и/или удаление любых возможных вирусов, присутствующих в композиции, включающей сквален, из очищенной композиции. Денатурированная композиция, следовательно, является более безопасной для использования у человека, чем неденатурированная композиция.

Не ограничиваясь теорией, температура кипения сквалена будет зависеть от внешнего давления, действующего на поверхность композиции, включающей сквален. Однако температура, при которой любые белки, присутствующие в композиции, включающей сквален, будут денатурированы, обычно не зависит от внешнего давления, действующего на поверхность композиции, включающей сквален. Таким образом, денатурирующую дистилляцию можно осуществлять при особой температуре, вне зависимости от давления, при котором осуществляют дистилляцию. В частности, денатурирующую дистилляцию можно осуществлять при температуре Т₂, где Т₂ может превышать или равняться 200°С, например превышать или равняться 205°С, превышать или равняться 210°С, превышать или равняться 215°С, превышать или равняться 220°С, превышать или равняться 230°С, превышать или равняться 240°С, превышать или равняться 250°С или превышать или равняться 260°С.

Денатурирующую дистилляцию можно осуществлять при температуре менее 500°С, например менее 480°С, менее 450°С, менее 420°С, менее 400°С, менее 350°С или менее 300°С.

Денатурирующую дистилляцию можно осуществлять в условиях, близких к вакууму. В частности, денатурирующую дистилляцию можно осуществлять при давлении по меньшей мере 0,5 мм рт.ст., например по меньшей мере 0,6 мм рт.ст., по меньшей мере 0,7 мм рт.ст. или по меньшей мере 0,8 мм рт.ст. Денатурирующую дистилляцию можно осуществлять при давлении менее 5 мм рт.ст., например менее 4 мм рт.ст., менее 3 мм рт.ст., менее 2 мм рт.ст., менее 1,5 мм рт.ст., менее 1 мм рт.ст., или менее 0,9 мм рт.ст.

Для осуществления денатурирующей дистилляции при указанной высокой температуре может быть выгодным использование аппарата, в котором композицию, включающую сквален, приводят в контакт с горячей поверхностью. Температуру горячей поверхности можно поддерживать на уровне Т₂, как определено выше, а давление, действующее на горячую поверхность, может представляет собой величины, определенные выше для денатурирующей дистилляции. Давление, действующее на горячую поверхность, можно выбирать таким образом, чтобы гарантировать, что наблюдающаяся температура кипения сквалена составит Т₂ или менее. Поскольку композиция, включающая сквален, контактирует с горячей поверхностью, те компоненты композиции, включая сквален, у которых температура кипения ниже Т2 при давлении, действующем на горячую поверхность, будут улетучиваться. Нелетучие компоненты, например белки, остаются на горячей поверхности и могут быть денатурированы и отделены от сквалена.

До стадии денатурирующей дистилляции композиция, включающая сквален, может содержать от 85 до 99,9% сквалена, например от 90 до 99,5% сквалена, от 95 до 99,5% сквалена или от 97 до 99,5% сквалена.

Денатурирующая дистилляция может давать композицию сквалена, имеющую более высокую процентную долю сквалена. В частности, денатурирующая дистилляция может давать денатурированную композицию, содержащую по меньшей мере 95% сквалена, например по меньшей мере 99% сквалена, по меньшей мере 99,5% сквалена, по меньшей мере 99,9% сквалена или даже 100% сквалена.

Денатурирующая дистилляция может давать денатурированную композицию, содержащую менее 0,5% белка, например менее 0,1% белка, менее 0,01% белка или 0% белка. Таким образом, настоящее изобретение относится к сквалену, содержащему менее 0,5% белка, например менее 0,1% белка, менее 0,01% белка или 0% белка.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения денатурирующую дистилляцию можно осуществлять после очищающей дистилляции, с получением очищенной денатурированной композиции.

Т₂ может быть выше Т₁. В частности, Т₂-Т₁ может составлять от 10 до 300°С, например от 30 до 250°С, от 50 до 200°С или от 80 до 150°С.

Растворители.

Для того чтобы избежать внедрения примесей в композицию, включающую сквален, что особенно

- 3 027142 важно, если композиция сквалена предназначена для использования в вакцинах, очищающую и денатурирующую дистилляцию можно осуществлять без добавления растворителей.

Сапонификация.

Композицию, включающую сквален, можно подвергать сапонификации. Сапонификация обычно будет осуществляться до стадий дистилляции (а) и (Ь), обсуждавшихся выше. Альтернативно, сапонификацию можно осуществлять между стадиями дистилляции (а) и (Ь), в каком бы порядке они не осуществлялись. Альтернативно, но необычно, сапонификацию можно осуществлять после стадий дистилляции (а) и (Ь). Сапонификация может разрушать белки, присутствующие в композиции, включающей сквален. Однако сапонификация может не удалить все присутствующие белки. Все оставшиеся после сапонификации белки в композиции, включающей сквален, могут быть удалены на стадии денатурирующей дистилляции. Комбинация сапонификации и денатурирующей дистилляции является выгодной, поскольку она повышает вероятность того, что сквален не будет содержать никаких белков.

Сапонификация представляет собой гидролиз сложного эфира при базовых условиях с образованием спирта и соли карбоновой кислоты. Во время сапонификации композиции, включающей сквален, основание (например, ΝαΟΗ или КОН) добавляют к композиции, что может вызвать превращение сложных эфиров жирных кислот (например, триглицеридов) в мыло. Сапонификация может иметь преимущества, поскольку она может увеличивать разницу между температурами кипения омыленных продуктов и температурами кипения неомыленных продуктов, что делает более эффективными очистку и/или денатурирующую дистилляцию. Альтернативно, омыленные продукты можно удалить другими средствами, например центрифугированием.

Результатом удаления сложных эфиров жирных кислот сапонификацией может быть омыленная композиция, включающая сквален, имеющая улучшенную чистоту (например, более высокий % сквалена) по сравнению с неомыленной композицией, включающей сквален.

Охарактеризовывание сквалена.

Сквален, полученный способом по настоящему изобретению, может иметь величину сапонификации менее 4 мг/мл, например менее 3 мг/мл, менее 2 мг/мл или менее 1 мг/мл. Это измерение указывает количество омыляемых видов, присутствующих в сквалене. Величину сапонификации можно определить как гидролизующие и нейтрализующие эквиваленты гидроксида натрия, как описано в Фармакопее США (И8Р) <401>. Величину сапонификации, полученную с использованием ΝαΟΗ, можно конвертировать в величины КОН путем ее умножения на соотношение молекулярных масс КОН и ΝαΟΗ (1,403).

Сквален, полученный способом по настоящему изобретению, может иметь кислотное число менее или равное 1 мг КОН/г, например менее или равное 0,8 мг КОН/г, менее или равное 0,6 мг КОН/г, менее или равное 0,5 мг КОН/г, менее или равное 0,4 мг КОН/г, менее или равное 0,2 мг КОН/г, менее или равное 0,1 мг КОН/г, менее или равное 0,05 мг КОН/г, менее или равное 0,03 мг КОН/г, менее или равное 0,02 мг КОН/г или менее или равное 0,01 мг КОН/г. Кислотное число можно определить как нейтрализующие эквиваленты гидроксида калия, потребленные скваленом, как описано в И8Р <401>.

Эмульсии типа масло в воде.

После получения композиции, включающей сквален, как описано выше, ее можно использовать для получения последующих продуктов, например лекарственных средств, адъювантов, представляющих собой эмульсии типа масло в воде, и т.п.

Для того чтобы избежать контаминации, предпочтительно, чтобы сквален оставался стерильным после обработки дистилляцией и до получения последующего продукта. Например, если последующий продукт представляет собой эмульсию, аппараты для дистилляции и получения эмульсии могут формировать закрытую систему, чтобы избежать контаминации сквалена перед формированием эмульсии. Альтернативно или помимо этого, сквален можно было бы держать под инертной атмосферой, например под азотом, перед получением последующего продукта.

Эмульсии типа масло в воде, как было установлено, являются особенно подходящими в качестве адъювантов для вакцин. Эмульсии, полученные в соответствии с настоящим изобретением, включают сквален и по меньшей мере одно поверхностно-активное вещество, помимо водного компонента. Эмульсии могут содержать дополнительные масла. В идеале, масло (масла) и поверхностно-активное вещество (поверхностно-активные вещества) являются биоразлагаемыми (метаболизируемыми) и биосовместимыми.

Можно использовать масляные комбинации сквалена и токоферолов. В случае когда композиция включает токоферол, можно использовать любой из токоферолов α, β, γ, σ, ε или ξ, но α-токоферолы являются предпочтительными. Можно использовать как Ό-α-токоферол, так и ΌΌ-α-токоферол. Предпочтительным а-токоферолом является ΌΌ-α-токоферол. Токоферол может принимать несколько форм, например различных солей и/или изомеров. Соли включают органические соли, такие как сукцинат, ацетат, никотинат и т.п. Если используется соль токоферола, предпочтительной солью является сукцинат. Масляная комбинация, включающая сквален и токоферол (например, ΌΌ-α-токоферол) является подходящей.

Содержание масла в количестве 2-20% (по объему) является типичным.

- 4 027142

Водный компонент может представлять собой простую воду (например, воду для инъекций) или может включать дополнительные компоненты, например растворенные вещества. Например, он может включать соли для формирования буфера, например цитратные или фосфатные соли, такие как соли натрия. Типичные буферы включают фосфатный буфер, Трис буфер, боратный буфер, сукцинатный буфер, гистидиновый буфер или цитратный буфер. Буферы обычно будут включены в количестве 5-20 мМ.

Поверхностно-активное вещество предпочтительно является биоразлагаемым (метаболизируемым) и биосовместимым. Поверхностно-активные вещества можно классифицировать по их ГЛБ (гидрофильно-липофильному балансу), где ГЛБ в пределах 1-10 обычно означает, что поверхностно-активное вещество лучше растворяется в масле, чем в воде, а ГЛБ в пределах 10-20 означает, что поверхностноактивное вещество лучше растворяется в воде, чем в масле. Эмульсии предпочтительно включают по меньшей мере одно поверхностно-активное вещество, которое имеет ГЛБ по меньшей мере 10, например по меньшей мере 15 или, предпочтительно, по меньшей мере 16.

Настоящее изобретение можно использовать с поверхностно-активными веществами, включающими, без ограничения, поверхностно-активные вещества с полиоксиэтиленовыми эфирами сорбитана (обычно называемые Т\уссп). особенно полисорбат 20 и полисорбат 80; сополимеры этиленоксида (ЭО), пропиленоксида (ПО) и/или бутиленоксида (БО), продающиеся под торговым наименованием ΌΘΑΡΆΧ™, такие как линейные блок-сополимеры ЭО/ПО; октоксинолы. которые могут отличаться разными количествами повторяющихся этокси (окси-1,2-этандиильных)-групп, где октоксинол-9 (Ττίΐοη Χ-100 или т-октилфеноксиполиэтоксиэтанол) представляет особый интерес; (октилфенокси)полиэтоксиэтанол (ЮЕРАЬ 0Ά-630/ΝΡ-40); фосфолипиды, такие как фосфатидилхолин (лецитин); полиоксиэтиленовые жирные эфиры, полученные из лаурилового, цетилового, стеарилового и олеилового спиртов (известные как поверхностно-активные вещества ВгЦ), такие как монолауриловый эфир триэтиленгликоля (Вту 30); полиоксиэтилен-9-лауриловый эфир и сложные эфиры сорбитана (широко известные как δΡΆΝ), такие как триолеат сорбитана (δραη 85) и монолаурат сорбитана. Предпочтительными поверхностноактивными веществами для включения в эмульсию, являются полисорбат 80 (Тгееп 80; полиоксиэтиленовый моноолеат сорбитана) δραη 85 (триолеат сорбитана), лецитин и Ττίΐοη Χ-100.

В эмульсию можно включать смеси поверхностно-активных веществ, например смеси Тгееп 80/δραη 85 или смеси Тгееп 80/Τήΐοη-Χ100. Также подходящей является комбинация полиоксиэтиленового эфира сорбитана, такого как полиоксиэтиленовый моноолеат сорбитана (Тгееп 80) и октоксинола, такого как т-октилфеноксиполиэтоксиэтанол (Ττίΐοη Х-100). Другая подходящая комбинация включает лаурет 9 плюс полиоксиэтиленовый эфир сорбитана и/или октоксинол. Подходящие смеси могут включать поверхностно-активное вещество с величиной ГЛБ в пределах 10-20 (например, Т\уееи 80, с ГЛБ 15,0) и поверхностно-активное вещество с величиной ГЛБ в пределах 1-10 (например, δραη 85 с ГЛБ 1,8).

Предпочтительными количествами поверхностно-активных веществ (мас. %) являются: для полиоксиэтиленовых эфиров сорбитана (таких как Τуееη 80) от 0,01 до 2%; для октил- или нонилфеноксиполиоксиэтанолов (таких как Ττίΐοη Χ-100 или других детергентов серии Ττίΐοη) от 0,001 до 0,1%; для полиоксиэтиленовых эфиров (таких как лаурет 9) от 0,1 до 20%.

Предпочтительными являются скваленсодержащие эмульсии типа масло в воде, содержащие полисорбат 80.

Эмульсию типа масло в воде можно получать способом, включающим стадии: (ί) получения первой эмульсии, имеющей первый средний размер капель масла, известной также как предварительная эмульсия или преэмульсия; (ίί) микрофлюидизации первой эмульсии с формированием второй эмульсии, имеющей второй средний размер капель масла, который меньше, чем первый средний размер капель масла, и (ίίί) фильтрования второй эмульсии. Первую эмульсию можно получать гомогенизацией.

Капли масла в эмульсии обычно имеют диаметр менее 5 мкм и даже могут иметь субмикронный диаметр; указанные малые размеры удобно получать с использованием микрофлюидизатора, который обеспечивает стабильные эмульсии. Капли размером менее 220 нм являются предпочтительными, поскольку их можно стерилизовать фильтрованием.

Конкретные адъюванты на основе эмульсии типа масло в воде, которые можно получать с использованием сквалена, полученного в соответствии с настоящим изобретением, включают, без ограничения эмульсию сквалена, полисорбата 80 (Т\уеег1 80) и триолеата сорбитана (δραη 85). Состав эмульсии по объему может быть следующим: приблизительно 5% сквалена, приблизительно 0,5% полисорбата 80 и приблизительно 0,5% δραη 85. В массовых единицах указанные соотношения становятся: 4,3% сквалена, 0,5% полисорбата 80 и 0,48% δραη 85. Этот адъювант известен как МР59 [4-6], как описано более подробно в главе 10 ссылки 7 и главе 12 ссылки 8. Эмульсия МР59 преимущественно включает цитратные ионы, на 10 мМ буфер цитрат натрия;

эмульсию сквалена, токоферола (в идеале, ЭЬ-а-токоферола) и полисорбата 80. Указанные эмульсии могут содержать (по массе) от 2 до 10% сквалена, от 2 до 10% токоферола и от 0,3 до 3% полисорбата 80, например 4,3% сквалена, 4,7% токоферола и 1,9% полисорбата 80. Массовое соотношение сквален:токоферол составляет предпочтительно <1 (например, 0,90), поскольку это может обеспечить более

- 5 027142 стабильную эмульсию. Сквален и полисорбат 80 могут присутствовать в объемном соотношении приблизительно 5:2 или массовом соотношении приблизительно 11:5. Одну подобную эмульсию можно изготовить растворением полисорбата 80 в РВ5 с получением 2% раствора, затем смешиванием 90 мл полученного раствора со смесью (5 г ОЬ-α-токоферола и 5 мл сквалена), затем микрофлюидизацией смеси. Полученная эмульсия имеет субмикронные капли масла, например, со средним диаметром от 100 до 250 нм, предпочтительно приблизительно 180 нм. Эмульсия может также включать 3-де-О-ацилированный монофосфорильный липид А (36-МРЬ). Другая подходящая эмульсия данного типа может включать, на человеческую дозу, 0,5-10 мг сквалена, 0,5-11 мг токоферола и 0,1-4 мг полисорбата 80 [9];

эмульсию сквалена, токоферола и детергента Ттйои (например, Ттйои Х-100). Эмульсия может также включать 36-МРЬ. Эмульсия может содержать фосфатный буфер;

эмульсию, включающую сквален, полисорбат (например, полисорбат 80), детергент Ттйои (например, Ттйои Х-100) и токоферол (например, сукцинат α-токоферола). Эмульсия может включать три указанных компонента в массовом соотношении приблизительно 75:11:10 (например, 750 мкг/мл полисорбата 80, 110 мкг/мл Ттйои Х-100 и 100 мкг/мл сукцината α-токоферола, и указанные концентрации должны включать любой вклад указанных компонентов от антигенов. Эмульсия может также включать 36МРЬ. Эмульсия может также включать сапонин, такой как 0521. Водная фаза может содержать фосфатный буфер;

эмульсию, включающую сквален, водный растворитель, гидрофильное неионогенное поверхностно-активное вещество полиоксиэтиленалкиловый эфир (например, полиоксиэтилен (12) цетостеариловый эфир) и гидрофобное неионогенное поверхностно-активное вещество (например, сложный эфир сорбитана или сложный эфир маннида, такой как моноолеат сорбитана или 5рап 80). Эмульсия, предпочтительно, является термообратимой и/или имеет по меньшей мере 90% масляных капель (по объему) размером менее 200 нм [10]. Эмульсия может также включать один или боле из следующих агентов: альдитол; криопротективный агент (например, сахар, такой как додецилмальтозид и/или сахароза); и/или алкилполигликозид. Эмульсия может включать агонист ТЬК.4 [11]. Указанную эмульсию можно лиофилизировать;

эмульсию сквалена, полоксамера 105 и АЪй-Сате [12]. Конечные концентрации (массовые) указанных компонентов в адъювантированных вакцинах составляют 5% сквалена, 4% полоксамера 105 (полиол Р1итошс) и 2% АЪй-Сате 85 (В18-РЕ0/РР0-16/16 РЕ0/РР0-16/16 диметикон; каприловый/каприновый триглицерид).

Состав указанных эмульсий, выраженный выше в процентных долях, можно модифицировать разведением и концентрацией (например, на целые числа, такие как 2 или 3, или на части, такие как 2/3 или 3/4), в котором их соотношения остаются прежними. Например, сконцентрированный в 2 раза МР59 будет иметь приблизительно 10% сквалена, приблизительно 1% полисорбата 80 и приблизительно 1% триолеата сорбитана. Концентрированные формы можно разбавлять (например, раствором антигена), с получением желательной конечной концентрации эмульсии.

Эмульсии по настоящему изобретению идеально хранить при температуре от 2 до 8°С. Их не следует замораживать. В идеале их нужно беречь от прямого света. В частности, скваленсодержащие эмульсии и вакцины по настоящему изобретению следует защищать, чтобы избежать фотохимического разложения сквалена. Если эмульсии по настоящему изобретению хранятся, то, предпочтительно, хранение нужно осуществлять в инертной атмосфере, например в Ν₂ или аргоне.

Вакцины.

Хотя возможно введение адъювантов в форме эмульсии типа масло в воде пациентам самих по себе (например, для обеспечения адъювантного эффекта для антигена, который был отдельно введен пациенту), более обычным является смешивание адъюванта с антигеном до введения, с формированием иммуногенной композиции, например вакцины. Смешивание эмульсии и антигена можно осуществлять непосредственно перед использованием или во время получения вакцины, до наполнения емкостей. Способы по настоящему изобретению можно использовать в обеих ситуациях.

Таким образом, способ по настоящему изобретению может включать дополнительную стадию смешивания эмульсии, включающей сквален, полученной по настоящему изобретению, с антигенным компонентом. В качестве альтернативы, он может включать дополнительную стадию упаковки адъюванта в набор в качестве компонента набора, вместе с антигенным компонентом.

В общем и целом, таким образом, изобретение можно использовать при получении смешанных вакцин или при получении наборов, включающих антиген и адъювант, готовый для смешивания. В случае, когда смешивание имеет место во время производства, объемы массы антигена и эмульсии, которые смешивают, обычно будут превышать 1 л, например >5 л, >10 л, >20 л, >50 л и т.д. В случае, когда смешивание имеет место во время использования, объемы, которые смешивают, обычно будут менее 1 миллилитра, например <0,6 мл, <0,5 мл, <0,4 мл, <0,3 мл, <0,2 мл и т.д. В обоих случаях обычно используют практически равные объемы эмульсии и раствора антигена, которые должны быть смешаны, т.е. практически 1:1 (например, от 1,1:1 до 1:1,1, предпочтительно от 1,05:1 до 1:1,05 и, более предпочтительно, от 1,025:1 до 1:1,025). В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения, однако, можно ис- 6 027142 пользовать избыток эмульсии или избыток антигена [13]. В случаях, когда используется избыточный объем одного компонента, указанный избыток обычно составляет по меньшей мере 1,5:1, например >2:1, >2,5:1, >3:1, >4:1, >5:1 и т.д.

В случаях, когда антиген и адъювант присутствуют как отдельные компоненты в наборе, они физически отделены друг от друга в наборе, и указанное отделение может достигаться различными путями. Например, компоненты могут содержаться в отдельных контейнерах, таких как флаконы. Содержимое двух флаконов затем можно смешивать, когда это требуется, например, удалением содержимого одного флакона и добавлением его в другой флакон, или удалением содержимого обоих флаконов по отдельности и смешиванием его в третьем контейнере.

В другом варианте один из компонентов набора содержится в шприце, а другой - в контейнере, таком как флакон. Шприц можно использовать (например, с иглой) для введения его содержимого во флакон для смешивания, а смесь затем можно набрать в шприц. Смешанное содержимое шприца затем можно вводить пациенту, обычно с использованием новой стерильной иглы. Упаковка одного компонента в шприц устраняет необходимость использования отдельного шприца для введения пациенту.

В другом предпочтительном варианте два компонента набора содержатся вместе, но по отдельности в одном и том же шприце, например двухкамерном шприце, таком, который описан в ссылках 14-21, и т.п. Когда шприц приводят в действие (например, во время введения пациенту), содержимое двух камер смешивается. При использовании указанного устройства отпадает необходимость отдельной стадии смешивания во время применения.

Содержимое различных компонентов набора обычно имеет жидкую форму. В некоторых вариантах компонент (обычно скорее антигенный компонент, чем эмульсионный компонент) находится в сухой форме (например, в лиофилизированной форме), а другой компонент - в жидкой форме. Два компонента можно смешивать, чтобы реактивировать сухой компонент и получить жидкую композицию для введения пациенту. Лиофилизированный компонент обычно находится во флаконе, а не в шприце. Высушенные компоненты могут включать стабилизаторы, такие как лактоза, сахароза или маннит, а также их смеси, например, смеси лактозы и сахарозы, смеси сахарозы и маннита и т.п. В одном возможном варианте используется жидкий эмульсионный компонент в заранее наполненном шприце и лиофилизированный антигенный компонент во флаконе.

Если вакцины содержат другие компоненты, помимо эмульсии и антигена, то указанные дополнительные компоненты могут быть включены в один из двух указанных компонентов набора или могут быть частью третьего компонента набора.

Подходящие контейнеры для смешанных вакцин по настоящему изобретению или для отдельных компонентов набора включают флаконы и одноразовые шприцы. Указанные контейнеры должны быть стерильными.

В случае, когда композиция/компонент помещен во флакон, флакон предпочтительно изготавливается из стекла или пластика. Флакон предпочтительно стерилизуют до помещения в него композиции. Для того чтобы избежать проблем с чувствительными к латексу пациентами, флаконы предпочтительно запечатывают не содержащими латекса пробками, и предпочтительно также отсутствие латекса во всем упаковочном материале. В одном варианте осуществления настоящего изобретения флакон имеет пробку из бутилкаучука. Флакон может содержать одну дозу вакцины/компонента, или он может содержать более одной дозы (многодозовый флакон), например 10 доз. В одном варианте осуществления настоящего изобретения флакон содержит 10x0,25 мл доз эмульсии. Предпочтительные флаконы изготовлены из бесцветного стекла.

Флакон может иметь крышку (например, наконечник Люэра), адаптированный таким образом, что заранее наполненный шприц можно вставлять в крышку, содержимое шприца можно выталкивать во флакон (например, для повторного растворения содержащегося в нем лиофилизированного материала), а содержимое флакона можно повторно набирать в шприц. После удаления шприца из флакона можно присоединить иглу и композицию можно ввести пациенту. Крышка, предпочтительно, располагается под запечатывающей полоской или колпачком, таким образом, что запечатывающую полоску или колпачок необходимо удалить, чтобы достичь крышки.

В случае, когда композиция/компонент помещен в шприц, шприц обычно будет иметь присоединенную к нему иглу, хотя шприц может быть снабжен отдельной иглой для сборки и использования. Предпочтительными являются безопасные иглы. Типичными являются 1-дюймовые иглы калибра 23, 1дюймовые иглы калибра 25 и 5/8-дюймовые иглы калибра 25. Шприцы могут быть снабжены отрываемыми этикетками, на которых могут быть напечатаны номер серии, сезон гриппа и срок годности содержимого, для облегчения ведения записей. Плунжер шприца, предпочтительно, имеет пробку, чтобы предотвратить случайное удаление плунжера во время набора препарата. Шприцы могут иметь крышку и/или плунжер из латексного каучука. Одноразовые шприцы содержат одну дозу вакцины. Шприц обычно будет иметь крышку-наконечник для запечатывания наконечника до присоединения иглы, и крышкунаконечник предпочтительно изготавливают из бутилкаучука. Если шприц и игла упакованы по отдельности, то игла предпочтительно снабжается защитой из бутилкаучука.

- 7 027142

Эмульсию можно разводить буфером до упаковки во флакон или шприц. Обычные буферы включают фосфатный буфер, Трис буфер, боратный буфер, сукцинатный буфер, гистидиновый буфер или цитратный буфер. Разведение может уменьшать концентрацию компонентов адъюванта, сохраняя в то же время их относительные пропорции, например, для получения адъюванта половинной силы.

Контейнеры могут быть маркированы с указанием объема половины дозы, например, чтобы облегчить введение детям. Например, шприц, содержащий 0,5 мл дозу, может иметь отметку, показывающую объем 0,25 мл.

В случае, когда используется стеклянный контейнер (например, шприц или флакон), предпочтительно использовать контейнер, изготовленный из боросиликатного стекла, а не из натриево-кальциевого силикатного стекла.

Различные антигены можно использовать с эмульсиями типа масло в воде, включая, без ограничения: вирусные антигены, такие как вирусные поверхностные белки; бактериальные антигены, такие как белковые и/или сахаридные антигены; грибковые антигены; паразитарные антигены и опухолевые антигены. Изобретение является особенно пригодным для вакцин против вируса гриппа, ВИЧ, анкилостомы, вируса гепатита В, вируса простого герпеса, бешенства, респираторно-синцитиального вируса, цитомегаловируса, 81арйу1ососси5 аигеиз, хламидии, коронавируса атипичной пневмонии, вируса уапсе11а /оЧег. §1гер1ососси8 рпеитошае, №188ег1а тетпдШШз, МусоЪас1егшт 1иЬегси1оч5. ВасШик апШгатз, вируса Эпштейна-Барра, человеческого папилломавируса и т.п. Например антигены вируса гриппа. Последние могут принимать форму живого вируса или инактивированного вируса. В случае, когда используется инактивированный вирус, вакцина может включать вирион целиком, расщепленный вирион или очищенные поверхностные антигены (включая гемагглютинин и, обычно также включая нейраминидазу). Гриппозные антигены также могут презентироваться в форме виросом. Антигены могут иметь любой подтип гемагглютинина, выбранный из Η1, Н2, Н3, Н4, Н5, Н6, Н7, Н8, Н9, Н10, Н11, Н12, Н13, Н14, Н15 и/или Н16. Вакцина может включать антиген (антигены) из одного или более (например, 1, 2, 3, 4 или более) штаммов вируса гриппа, включая вирус гриппа А и/или вирус гриппа В, например, моновалентная вакцина Α/Η5Ν1 или Α/Η1Ν1, или трехвалентная вакцина Α/Η1Ν1+Α/Η3Ν2+Β. Вирус гриппа может представлять собой реассортантный штамм, и может быть получен с использованием реверсивных генетических методик [например, 22-26]. Таким образом, вирус может включать один или более сегментов РНК из вируса Α/ΡΡ/8/34 (обычно 6 сегментов из Α/ΡΡ/8/34, с сегментами НА и N из вакцинного штамма, т.е. реассортант 6:2). Вирусы, используемые в качестве источника антигенов, можно выращивать на яйцах (например, куриных яйцах с эмбрионами) или на клеточной культуре. В случае, когда используется клеточная культура, клеточным субстратом обычно будет клеточная линия млекопитающих, такая как МОСК; СНО; 293Т; ВНК; Уего; МКС-5; РЕК.С6; ΑΙ-38 и т.п. Предпочтительные клеточные линии млекопитающих для выращивания вирусов гриппа включают клетки МОСК [27-30], полученные из почки собаки МаШп ЭагЪу; клетки Уего [31-33], полученные из почки африканской зеленой мартышки, или клетки РЕК.С6 [34], полученные из человеческих эмбриональных ретинобластов. В случае, когда вирус был выращен на клеточной линии млекопитающих, композиция выгодно не будет содержать яичных белков (например, овальбумина и овомукоида) и куриной ДНК, что уменьшает аллергенность. Унифицированные дозы вакцины обычно стандартизируют по ссылке на содержание гемагглютинина (НА), обычно измеряемое с использованием §КГО. Существующие вакцины обычно содержат приблизительно 15 мкг НА на штамм, хотя можно использовать более низкие дозы, особенно, когда используется адъювант. Использовались дробные дозы, такие как 1/2 (т.е. 7,5 мкг НА на штамм) 1/4 и 1/8 [35, 36], а также более высокие дозы (например, 3х или 9х дозы [37, 38]. Таким образом, вакцины могут включать от 0,1 до 150 мкг НА на штамм вируса гриппа, предпочтительно от 0,1 до 50 мкг, например 0,1-20 мкг, 0,1-15 мкг, 0,1-10 мкг, 0,1-7,5 мкг, 0,5-5 мкг и т.д. Особые дозы включают, например, приблизительно 15, приблизительно 10, приблизительно 7,5, приблизительно 5, приблизительно 3,8, приблизительно 3,75, приблизительно 1,9, приблизительно 1,5 и т.д. на штамм;

вирус иммунодефицита человека, включая ВИЧ-1 и ВИЧ-2. Антиген обычно будет представлять собой антиген оболочки;

поверхностные антигены вируса гепатита В. Указанный антиген предпочтительно получают с использованием методов рекомбинантной ДНК, например, после экспрессии в дрожжах 8ассйаготусек сегеу151ае. В отличие от нативного вирусного НЪкЛд, рекомбинантный, экспрессированный в дрожжах антиген является негликозилированным. Он может быть в форме практически сферических частиц (средний диаметр приблизительно 20 нм), включающий липидный матрикс, содержащий фосфолипиды. В отличие от нативных частиц ΗΕδΑ^, экспрессированные в дрожжах частицы могут включать фосфатидилинозит. №δΑ§ может происходить из любого из подтипов ау\у1, ау\у2, ау\у3, ау\\4, ауг, аб\\'4, абщ- и абгц+;

анкилостома, особенно семейства собачьих (Лηсу1оδΐота сатпит). Этот антиген может быть рекомбинантной Ас-МТР-1 (астацин-подобной металлопротеиназой) и/или аспарагиновой гемоглобиназой (Ас-ΑΡК-1), которые могут экспрессироваться в системе бакуловирус/клетка насекомого в качестве секретируемого белка [39, 40];

антигены вируса простого герпеса (И5У). Предпочтительным И5У антигеном для использования с

- 8 027142 настоящим изобретением является мембранный гликопротеин §Ό. Предпочтительно использовать §Ό из штамма Н8У-2 (антиген §Ώ2). В композиции можно использовать форму §Ό, в которой С-концевая мембранная якорная область была опущена [41], например усеченный §Ό, включающий аминокислоты 1306 натурального белка с добавлением аспарагина и глутамина на С-конце. Эта форма белка включает сигнальный пептид, который был расщеплен с получением зрелого белка из 283 аминокислот. Делеция якоря позволяет изготавливать белок в растворимой форме;

антигены человеческого папилломавируса (НРУ). Предпочтительными НРУ антигенами для использования с настоящим изобретением являются капсидные белки Ь1, которые могут собираться с формированием структур, известных как вирусоподобные частицы (УЬР). УЬР можно получать рекомбинантной экспрессией Ь1 в дрожжевых клетках (например, в §.сетеу151ае) или в клетках насекомых (например, в клетках 8ройор1ета, таких как §.1гид1регйа, или в клетках ЭгозорЬПа). Для дрожжевых клеток, плазмидные векторы могут нести ген (гены) Ь1; для клеток насекомых, бакуловирусные векторы могут нести ген (гены) Ь1. Более предпочтительно, композиция включает Ь1 УЬР из штаммов НРУ-16 и НРУ18. Указанная двухвалентная комбинация, как было показано, является высокоэффективной [42]. Помимо штаммов НРУ-16 и НРУ-18, также возможно включать Ь1 УЬР из штаммов НРУ-6 и НРУ-11. использование онкогенных штаммов НРУ также возможно. Вакцина может включать 20-60 мкг/мл (например, приблизительно 40 мкг/мл) Ь1 на штамм НРУ;

антигены сибирской язвы. Сибирскую язву вызывает ВасШиз апШтааз. Подходящие антигены В.апШтааз включают А-компоненты (летальный фактор (ЬР) и эдематозный фактор (ЕР)), каждый из которых имеет общий В-компонент, известный как протективный антиген (РА). Антигены могут быть, необязательно, детоксицированы. Дополнительные подробности можно найти в ссылках [43-45];

антигены З.аитеиз. Известен ряд антигенов З.аитеиз. Подходящие антигены включают капсулярные сахариды (например, из штамма типа 5 и/или типа 8) и белки (например, 1зйВ, Н1а и т.п.). Капсулярные сахаридные антигены идеально конъюгируются с белком-носителем;

антигены З.рпеитошае. Известен ряд антигенов З.рпеитошае. Подходящие антигены включают капсулярные сахариды (например, из одного или более серотипов 1, 4, 5, 6В, 7Р, 9У, 14, 18С, 19Р и/или 23Р) и белки (например, пневмолизин, детоксицированный пневмолизин, полигистидиновый триадный белок В (РНЮ) и т.п.). Капсулярные сахаридные антигены идеально конъюгируются с белком-носителем;

раковые антигены. Известен ряд опухолевоспецифичных антигенов. Изобретение можно использовать с антигенами, которые вызывают иммунотерапевтический ответ против рака легких, меланомы, рака молочной железы, рака предстательной железы и т.п.

Раствор антигена обычно будут смешивать со скваленсодержащей эмульсией, например, в объемном соотношении 1:1. Указанное смешивание может осуществлять производитель вакцины до наполнения контейнеров, или может осуществлять медицинский работник в момент применения.

Фармацевтические композиции.

Композиции, полученные с использованием способов по настоящему изобретению, являются фармацевтически приемлемыми. Они могут включать другие компоненты, помимо скваленсодержащей эмульсии и антигена выбора.

Композиция может включать консервант, такой как тиомерсал или 2-феноксиэтанол. Предпочтительно, однако, чтобы вакцина практически не содержала (т.е. менее 5 мкг/мл) ртутного материала, например, не содержала тиомерсал [46,47]. Вакцины и компоненты, не содержащие ртуть, являются более предпочтительными.

рН композиции обычно составляет от 5,0 до 8,1 и, более типично, от 6,0 до 8,0, например от 6,5 до 7,5. Способ по настоящему изобретению, таким образом, может включать стадию доводки рН вакцины перед упаковкой.

Композиция предпочтительно является стерильной. Композиция предпочтительно является апирогенной, например содержащей <1 ЕЙ (эндотоксиновая единица, стандартное измерение) на дозу, и, предпочтительно, <0,1 ЕЙ на дозу. Композиция предпочтительно не содержит глютен.

Композиция может включать материал для одной иммунизации или может включать материал для множества иммунизации (т.е. многодозовый набор). Включение в состав консерванта является предпочтительным для многодозовых вариантов.

Вакцины обычно вводят в дозовом объеме приблизительно 0,5 мл, хотя детям можно вводить половинную дозу (т.е. приблизительно 0,25 мл).

Способы лечения и введения вакцины.

Изобретение относится к наборам и композициям, полученным с использованием способов по настоящему изобретению. Композиции, полученные в соответствии со способами по настоящему изобретению, являются подходящими для введения пациентам-людям, а также изобретение относится к способу получения иммунного ответа у пациента, включающему стадию введения указанной композиции пациенту.

Изобретение относится также к указанным наборам и композициям для применения в качестве лекарственных средств.

Изобретение относится также к применению (ί) водного препарата антигена и (ίί) эмульсии типа

- 9 027142 масло в воде, включающей сквален, полученной по настоящему изобретению, для получения лекарственного средства для получения иммунного ответа у пациента.

Иммунный ответ, вызванный указанными способами и применением, обычно включает антительный ответ, предпочтительно защитный антительный ответ.

Композиции можно вводить различными путями. Наиболее предпочтительным путем иммунизации является внутримышечная инъекция (например, в руку или ногу), но другие доступные пути включают подкожную инъекцию, интраназальное [48-50], пероральное [51], внутрикожное [52,53], чрескожное, трансдермальное [54] введение и т.п.

Вакцины, полученные в соответствии с изобретением, можно применять для лечения как детей, так и взрослых. Пациент может быть в возрасте менее 1 года, 1-5 лет, 5-15 лет, 15-55 лет или по меньшей мере 55 лет. Пациентами могут быть лица старшего возраста (например, >50 лет, предпочтительно, >65 лет), молодого возраста (например, <5 лет), госпитализированные пациенты, медицинские работники, обслуживающий и военный персонал армии, беременные женщины, хронические больные, пациенты с иммунодефицитом и лица, путешествующие за границу. Вакцины, однако, подходят не только для указанных групп, и могут применяться в популяции более широко.

Вакцины по настоящему изобретению можно вводить пациентам практически в то же время (например, во время одной и той же медицинской консультации или визита к медицинскому работнику), что и другие вакцины.

Общие положения.

Термин включающий заключает в себе содержащий, а также состоящий из, например, композиция, включающая X, может состоять исключительно из X или может содержать что-либо дополнительно, например, Χ+Υ.

Термин приблизительно по отношению к численному значению х является необязательным и означает, например, х±10%.

Термин практически не исключает полностью, например композиция, которая практически не содержит Υ, может не содержать Υ совсем. Когда это необходимо, слово практически можно исключить из определения в настоящем изобретении. Если особо не указано иное, способ, включающий стадию смешивания двух или более компонентов, не требует никакого особого порядка смешивания. Так, компоненты можно смешивать в любом порядке. В случае использования трех компонентов можно объединять два компонента, а затем комбинацию можно объединять с третьим компонентом и т.д.

Различные стадии способов можно осуществлять в одно и то же время или в разное время, в одном и том же или разном географическом местоположении, например в странах, и одними и теми же или разными людьми или предприятиями.

Способы осуществления изобретения

Пример 1.

Фиг. 1 показывает схему дистиллятора, который можно использовать для стадий очищающей и/или денатурирующей дистилляции способа по настоящему изобретению. Способ, описанный со ссылкой на фиг. 1, можно осуществлять без добавления растворителя к композиции, включающей сквален. В одном варианте, показанном на фиг. 1, композицию, включающую сквален, помещают в подающий сосуд (1), заглушенный азотом. Один конец подводящего трубопровода (3) имеет полипропиленовый фильтр предварительной очистки и помещен в подающий сосуд, в то время как другой конец подводящего трубопровода имеет иглу из нержавеющей стали (калибра 19), которая вставлена в верхушку дистиллятора (5). Дистиллятор включает камеру (7) в форме трубки с цилиндрическим горячим пальцем (9), тянущимся через центр. Этилбензоат, который имеет температуру кипения 212°С, нагревают ниже пальца для обеспечения нагревания стенки горячего пальца. Хотя в данном варианте осуществления настоящего изобретения используется этилбензоат, понятно, что растворитель, имеющий более высокую температуру кипения, можно использовать для повышения температуры горячего пальца. Во время дистилляции дистиллятор опорожняют. Композиция, включающая сквален, может всасываться в дистиллятор, например, с использованием более низкого давления в дистилляторе, через иглу из нержавеющей стали, и капать (11) на нагретую стенку горячего пальца. По мере нагревания композиции, включающей сквален, те компоненты, температура кипения которых ниже 212°С при давлении внутри дистиллятора, будет испаряться. С целью испарения сквалена с использованием системы фиг. 1 давление внутри дистиллятора следует выбирать таким образом, чтобы понизить температуру кипения сквалена до 212°С или менее (например, приблизительно 1,5 мм рт.ст. или менее). Улетучившиеся компоненты будут конденсироваться на внешней стенке камеры (7), которая будет охлаждаться окружающим воздухом, и будут стекать по стенкам в колбу для сбора (13), которая также может находиться в условиях вакуума. Нелетучие компоненты, например белки, остаются на стенке горячего пальца и стекают в колбу для остатков (15). Крайне летучие компоненты можно удалять через вакуумный трубопровод, уменьшая их уровни в скваленовом конденсате.

Сквален, который уже был подвергнут очищающей дистилляции, перегоняли с использованием данного аппарата. Независимо от источника конечный сквален постоянно имел чистоту >99,9%, кислот- 10 027142 ное число <0,03 мг КОН/г и величину сапонификации <2 мг/мл. Денатурирующая дистилляция уменьшала содержание влаги в сквалене, например, с 0,022 до 0,010%, с 0,006 до 0,005% или с 0,010 до

0,006%.

Пример 2. Измерение величины сапонификации.

Величина сапонификации представляет собой количество милиграммов гидроксида калия, которое требуется для нейтрализации свободных кислот и сапонификации сложных эфиров, содержащихся в 1,0 г вещества.

Процедура (И8Р <401>): помещают от 1,5 до 2 г вещества в 250 мл колбу с определенной массой, точно взвешивают и добавляют его в 25,0 мл 0,5Н спиртового раствора гидроксида калия. Нагревают колбу на водяной бане с использованием подходящего холодильника, чтобы поддерживать кипение с обратным холодильником в течение 30 мин, часто вращая содержимое. Затем добавляют 1 мл фенолфталеина Т§ и титруют избыток гидроксида калия 0,5Н хлористоводородной кислотой У8. Осуществляют пустое определение при тех же условиях. Разница между объемами, в мл, 0,5Н хлористоводородной кислоты, израсходованной в актуальном тесте и в пустом тесте, умноженная на 56,1 и точную нормальность 0,5Н хлористоводородной кислоты У§ и деленная на массу в г взятого образца, представляет собой величину сапонификации.

В зависимости от источника сквалена можно получить величину сапонификации <1,4 мг/г.

Пример 3. Измерение кислотного числа.

Кислотность жиров и фиксированных масел можно выразить как количество мг 0,1Н щелочи, которое требуется для нейтрализации свободных кислот в 10,0 г вещества. Кислотное число представляет собой количество мг щелочи, которое требуется для нейтрализации свободных кислот в 1,0 г вещества.

Процедура (И8Р <401>): растворяют приблизительно 10,0 г вещества, точно взвешенного, в 50 мл смеси равных объемов спирта и эфира (которая была нейтрализована по фенолфталеину 0,1Н гидроксидом натрия), содержащейся в колбе. Если тест-образец не растворяется в холодном растворителе, соединяют колбу с подходящим холодильником и медленно нагревают, при частом встряхивании, до растворения образца. Добавляют 1 мг фенолфталеина Т§ и титруют 0,1Н гидроксидом натрия У8, пока раствор не останется слегка розовым после встряхивания в течение 30 с. Рассчитывают кислотное число. Если объем 0,1 Н щелочи У8, который требовался для титрования, составляет менее 2 мл, можно использовать более разбавленный титрант или соответствующим образом подобрать размер образца. Результаты можно выразить с учетом объема титранта или с учетом эквивалентного объема 0,1Н гидроксида натрия.

В зависимости от источника сквалена можно получить кислотное число 0,03 мг КОН/г.

Пример 4. Исследование с добавлением примесей.

Ряд исследований с добавлением примесей осуществляли для демонстрации эффективности денатурирующей дистилляции.

Для определения уровней примеси, удаляемых денатурирующей дистилляцией, композицию сквалена загрязняли определенными количествами контаминантов (например, водой), а также возможными продуктами разложения сквалена (например, формальдегидом, ацетальдегидом и ацетоном). Загрязненные растворы подвергали денатурирующей дистилляции в соответствии с настоящим изобретением и анализировали на предмет видов примесей.

К 4 кг композиции сквалена примешивали, например, 0,3 мл (0,2 г) ацетальдегида (с чистотой >99,5%), 0,3 мл (0,2 г) ацетона (с чистотой >99,9%), 0,55 мл 37 мас.% водного раствора формальдегида (0,2 г) и 3,65 г воды, перед денатурирующей дистилляцией, как описано в примере 1. Дистиллят собирали тремя фракциями и анализировали на предмет видов примесей вместе с загрязненным исходным материалом. Результаты представлены в таблице ниже.

- 11 027142

Тест/метод	Исходный материал с примесями	Фракции денатурирующей дистилляции	Отходы
Первая фракция	Вторая фракция	Третья фракция	Нелетучий остаток
Содержание влаги (%)	0, 02	0, 03	0, 02	0, 02	Ν/Α
Ацетон (мг/кг или миллионные доли)	50, 9	5, 0	5, 7	1,1	Ν/Α
Ацетальдегид (мг/кг или миллионные доли)	12,4	0, 9	1,9	0, 9	Ν/Α
Формальдегид (мг/кг или миллионные доли)	2,2	0,7	0, 9	не обнаружено	Ν/Α

Результаты, представленные в таблице, показывают, что концентрации ацетона, ацетальдегида и формальдегида уменьшались после денатурирующей дистилляции.

Следует понимать, что настоящее изобретение было описано только с помощью примеров и что могут производиться модификации при сохранении объема и идеи изобретения.

- 12 027142

Литература [1] Вогистзка & Ргазса (2002) 7 7й/г ΰίχβαχβα 25:287-98.

[2] Вейопе е( а1. (1996) 7/4л7г Мгзеазез 19:429-34.

[3] Впопез е( а1. (1998) 7 Ре/Л/е7 В 45:443-5.

[4] ШО90/14837.

[5] РосИа & Эе1 СписНсе (2003) Ехрег1 Κεν Уасстез 2:197-203.

[6] Роск1а (2001) Уассте 19: 2673-2680.

[7] Уассте Όβ3ΐξη: Тке 8иЪипИ αηά ΑφυναπΙ Арргоаск (е4з. Ροννβΐΐ & №\утап) Р1епит Ргезз 1995 (Ι8ΒΝ 0-306-44867-Х).

[8] Уассте Αάριναηΐχ: РгерагаИоп Ме(коАз апс1 Кезеагск Ргоюсо1з (Уо1ите 42 οί МеИюАз ίη Мо1еси1аг МесИсте зепез). Ι3ΒΝ: 1-59259-083-7. Εά. О’Надап.

[9] N902008/043774.

[10] 138-2007/0014805.

[11] иЗ-2007/0191314.

[12] 8иП е( а1. (2004) Уассте 22(25-26):3464-9.

[13] \νθ2007/052155.

[14] N902005/089837.

[15] υδ 6,692,468.

[16] N9000/07647.

[17] N9099/17820.

[18] υδ 5,971,953.

[19] υδ 4,060,082.

[20] ΕΡ-Α-0520618.

[21] N9098/01174.

[22] НоЛтапп е( αΐ. (2002) Уассте 20:3165-3170.

[23] ЗиЬЬагао е( αί (2003) Уто1о§у 305:192-200.

[24] Ыи е1 αί (2003) Уто1о§у 314:580-590.

[25] Огак) е1а1. (2004)7. Уток 78:1851-1857.

[26] ХУеЬЬу е1 а1. (2004) Ьапсе1363:1099-1103.

[27] N9097/37000.

[28] Вгапдз е1 а1. (1999) ΰβν ΒίοΙ δίαηά 98:93-100.

[29] На1репп εί αί. (2002) Уассте 20:1240-7.

[30] Тгее е1 αί. (2001) Уассте 19:3444-50.

[31] КЫпег е1 а1. (1998) Уассте 16:960-8.

[32] Клз1пег е/о/. (1999) Ώβν ΒίοΙ δίαηά 98:101-110.

[33] ВгиЫ είαΐ. (2000) Уассте 19:1149-58.

[34] Раи е1 αί. (2001) Уассте 19:2716-21.

[35] N9001/22992.

[36] НеЬтее/о/. (2004) Утиз Кез. 103(1-2):163-71.

[37] Тгеапоге/д/. (1996) 71п/ес( ΟΪ3 173:1467-70.

[38] Κεΐίεΐ е/ а1. (1996) СИп ϋίαρρι ЬаЬ 1ттипо13:507-10.

[39] АУППатзоп е/ а1. (2006) Ιη/ескоп апсИттипИу 74: 961-7.

[40] Ьоиказ βί а1. (2005) Ρίοδ А/е72(10): е295.

[41] ЕР-А-0139417.

[42] Нагрег е( а1. (2004) Ьапсе1364(9447):1757-65.

[43] 7 ΤοχϊεοΙ СИп ΤοχίεοΙ (2001) 39:85-100.

[44] ОеггпсЬеП е( аЬ (1998) Уассте 16:880-884.

[45] §1ерапоу е( а1. (1996)7Вю(ескпо144:155-160.

[46] ВапгЬоЛ (2000) 1ттипо1ору ЬеНегз 71:91-96.

[47] 9/002/097072.

[48] СгеепЬаит εί αί. (2004) Уассте 22:2566-77.

[49] 2игЬп§§еп е( а1. (2003) Ехрег1 Κβν Уасстез 2:295-304.

[50] Р1азс1к (2003) 7Ат Ркагт Аззос (ТУазк ЭС). 43:728-30.

[51] Мапп βία/. (2004) Уассте 22:2425-9.

[52] На1репп εί аЬ (1979) Ат 7 РиЪИс НеаЬк 69:1247-50.

[53] НегЬеПе/о/. (1979)7/и/ё<7 £>« 140:234-8.

[54] СЬепе/д/. (2003) Уассте 21:2830-6.

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Способ получения эмульсии типа масло-в-воде, включающий:

(ί) получение сквалена из композиции, включающей сквален из источника животного происхождения, с использованием способа, включающего стадии: (а) очищающей дистилляции, осуществляемой при температуре Т₁, и (Ь) денатурирующей дистилляции, осуществляемой при температуре Т₂; в котором стадии (а) и (Ь) можно осуществлять в любом порядке; Т₁ и Т₂ являются достаточными, чтобы вызвать кипение сквалена; Т₂>Т₁; и Т₂>200°С;

(и) получение эмульсии с использованием сквалена, полученного на стадии (ί).
2. Способ по п.1, в котором Т!<140°С.
3. Способ по любому из пп.1 или 2, в котором сквален, полученный на стадии (ί), поддерживают в стерильном состоянии после обработки дистилляцией и перед получением эмульсии на этапе (и).
4. Способ по п.1, в котором композиция, использующаяся на стадии (ί), включает один или более белков.
5. Способ по п.4, в котором композиция включает парвальбумин.
6. Способ по любому из пп.1-5, в котором денатурирующую дистилляцию осуществляют под давлением от 0,5 мм рт.ст. (66,7 Па) до 5,0 мм рт.ст. (666,6 Па).
7. Способ по любому из пп.1-6, в котором очищающую дистилляцию осуществляют при температуре от 70 до 100°С.
8. Способ по любому из пп.1-7, в котором очищающую дистилляцию осуществляют под давлением от 0,5 мкм рт.ст. (66,7 мПа) до 5 мкм рт.ст. (666,6 мПа).
9. Способ по любому из пп.1-8, в котором очищающую дистилляцию осуществляют перед денатурирующей дистилляцией.
10. Способ по любому из пп.1-9, в котором композицию, используемую на стадии (ί), подвергают сапонификации.
11. Способ по п.10, в котором сапонификация включает добавление ЫаОН или КОН к композиции, включающей сквален.
12. Способ по любому из пп.1-11, в котором эмульсия типа масло-в-воде представляет собой адъювант.
13. Способ получения вакцинной композиции, включающий получение эмульсии по любому из пп.1-12 и объединение эмульсии с антигеном.
14. Способ получения вакцинного набора, включающий получение эмульсии по любому из пп.1-12 и упаковку эмульсии в набор в качестве компонента набора вместе с антигенным компонентом.
15. Способ по п.14, в котором компоненты набора помещены в отдельные флаконы.
16. Способ по п.15, в котором флаконы изготовлены из боросиликатного стекла.
17. Способ по любому из пп.13-16, в котором антиген представляет собой антиген вируса гриппа.
18. Способ по п.17, в котором комбинация эмульсии и антигена образует вакцинную композицию и в котором вакцинная композиция включает 15, 10, 7,5, 5, 3,8, 3,75, 1,9 или 1,5 мкг гемагглютинина на штамм вируса гриппа.
19. Способ по п.17 или 18, в котором комбинация эмульсии и антигена образует вакцинную композицию и в котором вакцинная композиция включает в себя консервант тиомерсал или 2-феноксиэтанол.
20. Способ по любому из пп. 12-19, в котором эмульсия содержит от 2 до 10% сквалена по объему.
21. Способ по любому из пп.12-20, в котором эмульсия содержит приблизительно 5% сквалена, приблизительно 0,5% полисорбата 80 и приблизительно 0,5% сорбитан триолеата.
22. Способ получения эмульсии типа масло-в-воде, включающий получение эмульсии с использованием сквалена, который был получен из источника животного происхождения, с использованием способа, включающего стадии: (а) очищающей дистилляции, осуществляемой при температуре Т1, и (Ь) денатурирующей дистилляции, осуществляемой при температуре Т2; в котором стадии (а) и (Ь) можно осуществлять в любом порядке; Т1 и Т2 являются достаточными, чтобы вызвать кипение сквалена; Т<140 и Т₂>200°С.