CN105496999A

CN105496999A - 治疗mTOR通路相关的疾病的化合物

Info

Publication number: CN105496999A
Application number: CN201510883323.4A
Authority: CN
Inventors: M·H·波霍艾米; D·L·莫里斯; 罗杰·阿斯顿
Original assignee: Pitney Pharmaceuticals Pty Ltd
Current assignee: Pitney Pharmaceuticals Pty Ltd
Priority date: 2012-08-06
Filing date: 2013-08-05
Publication date: 2016-04-20
Also published as: US20150166477A1; US9790176B2; US20170369435A1; CA2881325C; AU2013302209B2; CN104837812B; PL2880014T3; CA2881325A1; WO2014022879A1; ES2627099T3; JP6441219B2; JP2018062526A; ES2757598T3; EP2880014A1; EP3202397B1; JP6509386B2; AU2016234924B2; KR20150081422A; JP2015524446A; NZ631523A

Abstract

本发明涉及用于治疗mTOR(雷帕霉素的哺乳动物靶标)通路相关的疾病的化合物。具体地，本发明涉及氨基乙腈衍生物(AAD)在治疗mTOR通路相关的疾病中的用途。

Description

治疗mTOR通路相关的疾病的化合物

技术领域

通常，本发明涉及治疗mTOR(雷帕霉素的哺乳动物靶标)通路相关的疾病的化合物。具体地，本发明涉及氨基乙腈衍生物(AAD)在治疗mTOR通路相关的疾病中的用途。

背景

氨基乙腈衍生物(AAD)是一类对耐药性线虫有效的驱虫药。线虫或蛔虫包括大量的人类和家畜的病原体。诸如捻转血矛线虫(Haemonchuscontortus)的胃肠道线虫是导致全球畜牧生产的重大经济损失的反刍动物的主要寄生虫。

莫奈太尔(Monepantel)(MPL)(N-[(1S)-1-氰基-2-(5-氰基-2-三氟甲基-苯氧基)-1-甲基-乙基]-4-三氟甲基巯基-苯甲酰胺)是这类AAD的实例并且被批准为用于治疗羊胃肠道寄生虫的杀线虫剂。

MPL已被证实对许多种类的家畜致病线虫有效。

作为杀线虫剂，MPL的作用机制是通过配体门控离子通道，其导致干扰在神经肌突触处的信号转导。然后，受影响的寄生虫经历肌肉收缩的调节异常、麻痹、坏死和蜕皮缺陷。三种烟碱样乙酰胆碱受体(nAChR)相关的基因被确认为MPL的主要靶标并且所有三种基因编码代表仅存在于线虫中的nAChR亚基的DEG-3亚科的蛋白质。DEG-3基因编码保持与在第二跨膜结构域中的α7亚基相似的nAChRα-亚基。

现在，出人意料地发现AAD还结合哺乳动物细胞中的mTOR通路靶标(受体)，因此对治疗mTOR通路相关的疾病有效。

发明概述

根据本发明的第一方面，提供了治疗一种或多种mTOR通路相关的疾病的式(I)的化合物或其代谢物、药物可接受的盐、溶剂化物或前药：

其中，

R¹、R²和R³和R⁵各自独立地选自H、烷基、卤素、-CF₃或-CN；

R⁴和R⁶各自独立地选自H、烷基、卤素、烷氧基、-CF₃、-OCF₃、-SO₂CF₃、-SOCF₃或-SCF₃；

X为杂原子、N(烷基)或NH；且

n为1至20。

根据本发明的第二方面，提供了治疗一种或多种mTOR通路相关的疾病的方法，所述方法包括将治疗有效量的本发明第一方面所述的式(I)的化合物或其代谢物、药物可接受的盐、溶剂化物或前药给予需要其的患者。

根据本发明的第三方面，提供了本发明第一方面所述的式(I)的化合物，或其代谢物、药物可接受的盐、溶剂化物或前药在制备用于治疗一种或多种mTOR通路相关的疾病的药物中的用途。

根据本发明的第四方面，提供了本发明第一方面所述的式(I)的化合物用于治疗一种或多种mTOR通路相关的疾病的用途，其中所述疾病不是癌症。

根据本发明的第五方面，提供了治疗一种或多种mTOR通路相关的疾病的方法，其中所述疾病不是癌症，所述方法包括将治疗有效量的本发明第一方面所述的式(I)的化合物或其代谢物、药物可接受的盐、溶剂化物或前药给予需要其的患者。

根据本发明的第六方面，提供了本发明第一方面所述的式(I)的化合物，或其代谢物、药物可接受的盐、溶剂化物或前药在制备用于治疗一种或多种mTOR通路相关的疾病的药物中的用途，其中所述疾病不是癌症。

优选地，R¹为–CN、H或卤素。更优选地，R¹为–CN。优选地，R²为H或卤素，且更优选地为H。优选地，R³为–CF₃或卤素且更优选地为–CF₃。优选地，R⁴为–SCF₃、-SOCF₃、-SO₂CF₃、-OCF₃或–CF₃。更优选地，R⁴为–SCF₃或-SO₂CF₃。优选地，R⁵为H。优选地，R⁶为烷基且更优选地为CH₃。优选地，X为O。优选地，n为1至15，1至10，1至5，1至2，或1。最优选地，n为1。优选地，R⁴排列在酰胺部分的对位。

式(I)的化合物可为(R)-或(S)-对映异构体或外消旋体。优选地，式(I)的化合物为(S)-对映异构体。

式(I)的化合物可选自下列化合物中的任一个：

其中各个上述化合物为(R)-或(S)-对映异构体，或外消旋体，或其代谢物、药物可接受的盐、溶剂化物或前药。

优选地，式(I)的化合物可选自下列化合物中的任一个：

其中各个上述化合物为(R)-或(S)-对映异构体，或外消旋体，(除非规定)或其代谢物、药物可接受的盐、溶剂化物或前药。

更优选地，式(I)的化合物为MPL(N-[(1S)-1-氰基-2-(5-氰基-2-三氟甲基-苯氧基)-1-甲基-乙基]-4-三氟甲基巯基-苯甲酰胺)或其代谢物、药物可接受的盐、溶剂化物或前药：

此外，本发明的化合物可为MPL的代谢物，其为莫奈太尔砜(MPL-SO₂)或其代谢物、药物可接受的盐、溶剂化物或前药：

优选地，一种或多种mTOR通路相关的疾病选自阿尔茨海默氏病、亨廷顿舞蹈病、与年龄相关的疾病、与移植排斥相关的疾病、慢性炎性疾病、与糖原贮积相关的疾病、肿瘤转移、系统性红斑狼疮、与炎症和免疫激活相关的疾病、贫血症、白细胞减少症、血小板减少症、与支架涂层相关的疾病、肾功能不全、肥胖症、糖尿病/胰岛素耐受性、与非酒精性脂肪肝相关的疾病、多囊肾、帕金森氏病和纤维化。优选地，mTOR通路相关的疾病为慢性炎性疾病，其可为类风湿性关节炎。优选地，纤维化为肝纤维化、心肌纤维化或肺纤维化。最优选地，被治疗的疾病为癌症和肿瘤转移，优选地，癌症与激酶有关。优选地，激酶为细胞周期素依赖性激酶，且更优选地，cdk2或cdk4。

优选地，癌症选自下列：癌，包括膀胱癌、乳腺癌、结肠癌、间皮瘤、肾癌、肝癌、肺癌包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌、头颈癌、食道癌、胆囊癌、卵巢癌、胰腺癌、胃癌、子宫颈癌、甲状腺癌、前列腺癌和皮肤癌包括鳞状细胞癌；淋巴系统的造血肿瘤包括白血病、急性淋巴性白血病、急性淋巴母细胞性白血病、B-细胞淋巴瘤、T-细胞淋巴瘤、霍奇金氏淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、毛细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、骨髓瘤和伯基特(Burkett)氏淋巴瘤；髓系造血肿瘤包括急性和慢性髓细胞性白血病、骨髓增生异常综合症和早幼粒细胞白血病；间叶细胞源肿瘤包括纤维肉瘤和横纹肌肉瘤；中枢和外周神经系统的肿瘤包括星形细胞瘤、成神经细胞瘤、神经胶质瘤和神经鞘瘤；和其他肿瘤包括黑素瘤、精原细胞瘤、畸胎癌、骨肉瘤、着色性干皮病、角化棘皮瘤(keratoctanthoma)、甲状腺滤泡癌症和卡波西氏肉瘤。

优选地，被治疗的癌症选自卵巢癌、乳腺癌、前列腺癌或间皮瘤，且最优选地，被治疗的癌症为卵巢癌。

在本发明的其他方面中，式(I)的化合物可用于治疗一种或多种mTOR通路相关的疾病，其中所述疾病不是癌症。

优选地，一种或多种mTOR通路相关的疾病选自阿尔茨海默氏病、亨廷顿舞蹈病、与年龄相关的疾病、与移植排斥相关的疾病、慢性炎性疾病、与糖原贮积相关的疾病、肿瘤转移、系统性红斑狼疮、与炎症和免疫激活相关的疾病、贫血症、白细胞减少症、血小板减少症、与支架涂层相关的疾病、肾功能不全、肥胖症、糖尿病/胰岛素耐受性、与非酒精性脂肪肝相关的疾病、多囊肾、帕金森氏病和纤维化。

优选地，mTOR通路相关的疾病为慢性炎性疾病，其可为类风湿性关节炎或移植后器官排斥。

附图简述

图1表示通过MPL抑制细胞增殖。卵巢癌细胞系OVCAR-3、A2780和SKOV-3和正常HUVEC(对照)都在MPL(0、1、5、10、25、50和100μmol/L)的存在下培养72小时。使用SRB检验评价MPL对细胞增殖的影响。采用对照(载体处理的)细胞以提供100％增殖并将MPL处理组表示为对照的百分比。一式四份测试各个药物浓度并将各个实验重复至少两次。将数据(平均±SEM)表示为对照的百分比。为了统计学比较，使用Studentt检验将各个药物处理组与对照组比较。

图2表示MPL对OVCAR-3细胞的菌落形成活动的影响。在使用MPL(0、5、10和25μmol/L)孵育细胞72小时后，将细胞洗涤，转移至琼脂板，使用它们的常规生长培养基培养并在标准条件下孵育2周。然后，使用100％甲醇将细胞固定并使用1％结晶紫染色。在显微镜(放大×5)下将菌落(大于50的一群细胞)计数。将针对不同实验组计算的菌落数表示为对照的百分比。

图3表示MPL如何干扰卵巢癌细胞系的细胞周期分布。使用MPL(0、5、10和25μmol/L)将OVCAR-3(图3a)或A2780(图3b)细胞处理48小时。使用流式细胞仪分析进行分析碘化丙啶(propodiumiodide)染色细胞的DNA含量。结果(参见表格)表示为细胞在G1、S和G2/M阶段中的百分比。各个值代表2次独立实验的平均±SEM。

图4表示MPL干扰细胞周期调节蛋白cdk2、cdk4和细胞周期素E和A的表达。使用MPL(0、5、10和25μmol/L)将细胞处理48小时。通过电泳法获得和分离全蛋白提取物并使用指定的抗体探测免疫印迹。使用相关抗体分析表示这些蛋白质在各个提取物中的水平的免疫印迹分析。图像代表扫描的曝光放射线胶片。看家基因(GAPDH)用于确认类似的蛋白质负载和印迹转移。

图5表示MPL处理的细胞中PARP和断裂的PARP的免疫印迹分析。使用各个浓度的MPL[0、5、10、25μM]将在细胞培养条件下生长的OVCAR-3和A2780细胞孵育24、48或72小时。然后，制备细胞裂解液并通过免疫印迹分析用于测定PARP和断裂的PARP。

图6表示使用MPL处理A2780卵巢癌细胞或使用MPL-SO₂处理U87神经胶质瘤细胞导致液泡的形成，表明MPL和MPL-SO₂诱导这些细胞中的自噬。自噬是mTOR抑制的特征。

图7与图6所示的一致，表示MPL处理降低ADP/ATP的细胞比例，其为细胞自噬的另一指示。

图8表示MPL对人卵巢癌OVCAR-3细胞系中ATP和ADP/ATP比例的影响。在标准细胞培养条件下细胞暴露于MPL导致ATP水平的降低，因此ADP/ATP比例增加。使用来自Abcam的商业比色/荧光检验试剂盒连同来自Lonza的ApoGlow检验试剂盒(Sydney,Australiasubsidary)检测培养基中的ADP和ATP水平。各个值代表至少两次测定的平均+s.e.m.。

图9表示MPL干扰细胞存活。A)暴露于MPL(0、5、10、25μM)72h的OVCAR-3细胞的显微图像。在MPL(0、5、10、25μmol/L)的存在下将人卵巢癌细胞系OVCAR-3、A2780、SKOV-3、IGROV-1培养72h。使用标准台盼蓝检验评价MPL对细胞存活的影响。采用对照(媒介处理的)细胞以提供100％可存活且MPL处理组表示为对照的百分比。一式四份测试各个药物浓度并将各个实验重复至少两次。数据(平均±SEM)表示为％对照。为了统计学比较，使用Studentt检验将各个药物处理组与对照组比较并且认为0.5或更少的p值表示显著变化(p<0..5)，*＝<0.05，**<0.01，***＝p<0.001。

图10表示MPL对正常细胞的存活率的影响并且表示MPL的抗增殖作用为癌细胞定向的。在MPL(0、5、10、25μmol/L)的存在下将正常细胞HOSE、CHO、HEK和HUVEC培养72h。使用标准台盼蓝检验评价MPL对细胞存活的影响。与对照(100％)相比，结果表示为平均±SEM。

图11表示MPL如何抑制细胞增殖。在MPL(0、5、10、25、50和100μmol/L)的存在下，将人卵巢癌细胞系OVCAR-3、A2780和SKOV-3和IGROV-1全部培养72h。使用SRB检验评价MPL对细胞增殖的影响。采用对照(载体处理的)细胞以提供100％增殖并将MPL处理组表示为对照的百分比。一式四份测试各个药物浓度并将各个实验重复至少两次。数据(平均±SEM)表示为％对照。为了统计学比较，使用Studentt检验将各个药物处理组与对照组比较。(A)：阿托品：毒蕈碱Ach.受体拮抗剂，筒箭毒碱(Tobucorarine)：烟碱Ach.受体拮抗剂，美卡拉明：非选择性、非竞争性烟碱受体拮抗剂；(B)：卡巴胆碱：毒蕈碱烟碱ach.受体激动剂，烟碱：烟碱ach.受体激动剂，α-银环蛇毒素：选择性α7、烟碱ach受体激动剂。

图12表示MPL抗增殖作用独立于烟碱受体。使用增加浓度的烟碱、卡巴胆碱或受体拮抗剂、阿托品、美卡拉明、筒箭毒碱和α-银环蛇毒素将细胞预处理(30min)。加入MPL(5μM)并在细胞培养孵育器中放置72h。一式四份测试各个药物浓度并将各个实验重复两次。结合值(平均±SEM)表示为％对照。

图13表示MPL如何抑制神经胶质瘤细胞的增殖。比较在正常细胞培养条件下MPL处理(0、5、10、25、50μM；72h)对U87-MG、U251神经胶质瘤细胞系与正常星形胶质细胞的增殖的影响并使用SRB增殖检验。数据表示为％对照。

图14表示MPL如何诱导自噬。使用MPL处理化疗抗性U87神经胶质瘤细胞导致自噬，其被以浓度依赖方式的LC3-II增加的表达确认。使用MPL处理的U87-MG和U251神经胶质瘤细胞证实自噬的浓度依赖性形成(以液泡形式示出)。LC3-I向LC3-II的浓度依赖性的转化确认了这些细胞中增加的自噬现象。

图15表示MPL对OVCAR-3和A2780细胞的菌落形成活动的影响。在使用MPL(0、5、10、25μM)孵育细胞72h后，将细胞洗涤，然后转移至琼脂板，使用它们的常规生长培养基培养并在标准条件下孵育2周。然后，使用100％甲醇将细胞固定并使用1％结晶紫染色。在显微镜(放大×5)下计数菌落(细胞大于50的细胞簇)。将针对不同实验组计数的菌落数表示为对照的％。

图16表示MPL如何干扰卵巢癌细胞系的细胞周期进程。使用MPL(0、5、10、25μM)将OVCAR-3或A2780细胞处理48小时并在使用PI染色细胞后通过流式细胞仪分析(FACS)检验。图和数据表示细胞周期的各个阶段中细胞分布的MPL诱导的变化，此处表示为在G1、S和G2/M阶段中细胞的百分比。各个值代表2次独立实验的平均±SEM。

图17表示MPL如何干扰细胞周期调节蛋白cdk2、cdk4和细胞周期素E和A的表达。使用MPL(0、5、10、25μmol/L)将细胞处理24h、48h或72h。通过电泳法获得和分离全蛋白提取物，并使用指定的抗体探测免疫印迹。使用相关抗体分析表示这些蛋白质在各个提取物中的水平的免疫印迹分析。图像代表扫描的曝光放射线胶片。看家基因(GAPDH)用于确认类似的蛋白质负载和印迹转移。

图18表示MPL如何断裂PARP。OVCAR-3或A2780细胞暴露于MPL(0、5、10、25μM)24、48或72h引起PARP的断裂，其导致细胞分解并且充当死亡细胞的标记。

图19A和19B表示MPL如何降低ATP水平。OVCAR-3或A2780细胞暴露于MPL(0、5、10、25μM)24、48或72h引起PARP的断裂，其导致细胞分解并且充当死亡细胞的标记。

图20表示i.p.(腹膜内)给予的莫奈太尔对裸鼠中的s.c.(皮下)肿瘤生长的影响。将250万对数生长期的OVCAR-3细胞s.c.注射至各个小鼠的左肋。通过卡尺测量监测肿瘤生长并通过检测正交直径测定肿瘤体积。基于公式1/2(长度×宽度2)计算估计的肿瘤体积，其中宽度为两次正交测量的较短的。在肿瘤细胞注射之后7天开始治疗，在这之前，将小鼠随机化并分配为治疗组或对照组(6只每组)。在2.5mg/kg或25mg/kg下i.p.给予悬浮在0.5％HPMC中的莫奈太尔每周三次。仅使用载体处理对照组。

图21表示i.p.给予的莫奈太尔对裸鼠中的s.c.肿瘤生长的影响。将对数生长期的OVCAR-3细胞s.c.注射至各个小鼠的左肋。通过卡尺测量监测肿瘤生长并通过检测正交直径测定肿瘤体积。基于公式1/2(长度×宽度2)计算估计的肿瘤体积，其中宽度为两次正交测量的较短的。在肿瘤细胞注射之后7天开始治疗，在这之前，将小鼠随机化并分配为治疗组或对照组(6只每组)。在25mg/kg或50mg/kg下i.p.给予悬浮在0.5％HPMC中的莫奈太尔每周三次。仅使用载体处理对照组。

图22表示口服莫奈太尔对裸鼠中肿瘤生长的影响。将OVCAR-3细胞s.c.注射至各个小鼠的左肋。通过卡尺测量监测肿瘤生长并通过检测正交直径测定肿瘤体积，并基于公式1/2(长度×宽度2)计算估计的肿瘤体积，其中宽度为两次正交测量的较短的。在肿瘤细胞注射之后7天开始治疗，在这之前，将小鼠随机化并分配为治疗组或对照组(6只每组)。在50mg/kg或100mg/kg下口服给予(100μL)悬浮在0.5％HPMC中的莫奈太尔每周三次。仅使用载体口服处理对照组。

图20-22大体上表示MPL对雌性裸鼠中的s.c.异种移植物的影响。将小鼠在左肋中接种250万对数生长期的人OVCAR-3细胞。通过卡尺测量监测肿瘤生长并通过检测正交直径测定肿瘤体积。基于公式1/2(长度×宽度2)计算估计的肿瘤体积，其中宽度为两次正交测量的较短的。在肿瘤细胞注射之后7天开始治疗，在这之前，将小鼠随机化并分配为治疗组或对照组(5-6只每组)。在2.5mg/kg或25mg/kg(图19)、25mg/kg和50mg/kg(图20)下i.p.给予或在50mg/kg和100mg/kg下口服给予悬浮在0.5％HPMC中的莫奈太尔，所有每周给予三次。对照组小鼠以完全相似的方式和时间接受相似体积的0.5％HPMC。

图23表示MPL如何诱导肿瘤组织中的坏死。隔天在50或100mg/kg/天下使用口服给予的MPL处理裸鼠中来自皮下异种移植物的肿瘤组织。示出在苏木精和伊红染色(H&E；顶行)中的肿瘤的组织学图像，表明深刻的药物诱导的坏死(黑色箭头；放大×10)。来自从MPL处理的小鼠切除的肿瘤的肿瘤组织学的代表性图像表明在100mg/kg的较高剂量(s.c.肿瘤、口服治疗，每周×3，2周时间)下的广泛坏死。

图24表示在细胞培养条件下使用10μMMPL处理OVCAR-3细胞规定时间点。在细胞培养条件下，使用10μMMPL处理从OVCAR-3细胞制备的细胞裂解液的免疫印迹分析1、4或24小时。结果证实两种mTOR和它的下游信号通路p70S6K的磷酸化[激活]的抑制。

图25表示在细胞培养条件下，使用0、5、10、15和25μMMPL处理使用从OVCAR-3细胞制备的细胞裂解液的MPL免疫印迹分析体外处理的人卵巢OVCAR-3细胞中的蛋白质表达48小时。结果证实c-Myc和cyclinD1表达的下调。

图26表示MPL对MPL处理的OVCAR-3肿瘤中mTOR相关的信号的肿瘤表达的抑制作用。从雌性裸鼠中s.c.生长的OVCAR-3肿瘤制备肿瘤裂解液的免疫印迹分析。使用MPL(i.p.给予的25mg/kg、50mg/kg悬浮在0.5％HPMC中)或载体(0.5％HPMC)从i.p.细胞接种后第8天将小鼠处理3周。在最后给药24小时后，将肿瘤切除并在-80℃下冷冻。肿瘤的免疫印迹分析证实mTOR信号的抑制。在从MPL处理的小鼠中切除的肿瘤中，mTOR连同c-Myc、细胞周期素D1和E2以及CDKs2和4的蛋白质表达被抑制。

图27A和27B表示MPL对NF-кBp65磷酸化的抑制作用。

图28表示MPL对IкB-α磷酸化的抑制作用。

图29表示MPL对IKK磷酸化的抑制作用。

图30表示MPL引起IL-6表达的下调。

图31表示MPL引起TGF-β表达的下调。

图32表示MPL废止NO表达。

定义

“卤素”是指氟、氯、溴或碘，优选地氟或氯。

“烷基”是指可为直链或支链并且在链中包含约1至约20个碳原子的脂肪族烃基团。优选的烷基基团在链中包含约1至约12个碳原子。更优选的烷基基团在链中包含约1至约6个碳原子。支链是指将诸如甲基、乙基或丙基的一个或多个低级烷基基团与线性烷基链连接。“低级烷基”是指可为直链或支链的在链中具有约1至约6个碳原子的基团。“烷基”可为未取代的或任选被一个或多个可相同或不同的取代基取代，各个取代基独立地选自卤素、烷基、芳基、环烷基、氰基、羟基、烷氧基、烷基硫代、氨基、-NH(烷基)、-NH(环烷基)、-N(烷基)₂、羧基和-C(O)O-烷基。合适的烷基基团的非限制性实例包括甲基、乙基、正丙基、异丙基和叔丁基。

“芳基”，单独地或作为另一取代基的一部分，是指芳香族环烃基团。优选的芳基基团具有六至十个碳原子。术语“芳基”包括多环体系以及单环体系。用于本发明的优选的芳基基团包括苯基和萘基。术语“芳基”还包括稠环烃环，其为部分芳香族(即，一个稠环为芳香族的且另一个为非芳香族的)。部分芳香族的示例性芳基基团为茚满基。

单独地或作为另一取代基的一部分的“杂芳基”是指具有五至十二个选自C、N、O和S的环原子的环或多环基团，其中至少一个环杂原子为O、N或S，且其中至少一个组成环为芳香族的。用于本发明的示例性杂芳基基团包括咔唑基、咔啉基、色满基(chromenyl)、噌啉基、呋喃基、苯并呋喃基、苯并呋咕基、异苯并呋喃基、咪唑基、苯并咪唑基、苯并咪唑啉酮基、吲唑基、吲哚基、异吲哚基、吲哚啉基、吲嗪基、茚基(indynyl)、噁二唑基、噁唑基、苯并噁唑基、异噁唑基、吡喃基、吡嗪基、吡唑基、苯并吡唑基、哒嗪基、吡啶基、嘧啶基、吡咯基、喹啉基、异喹啉基、四唑基、噻唑基、异噻唑基、噻二唑基、噻吩基、苯并噻吩基、苯并噻唑基、喹喔啉基、三嗪基和三唑基及其N-氧化物。

杂芳基基团的一个副族具有5个环原子。该实施方案中示例性杂芳基基团为吡唑基、吡啶基、噻唑基和咪唑基。

杂芳基基团的另一副族具有6个环原子。该实施方案中示例性杂芳基基团为吡啶基和嘧啶基。

术语“杂芳基”还包括稠环杂环，其为部分芳香族(即，一个稠环为芳香族且另一个为非芳香族的)。部分芳香族的示例性杂芳基基团为苯并二唑基。

当本文定义的杂芳基基团为取代的时，取代基可与杂芳基的环碳原子连接，或在环杂原子(即，氮、氧或硫)上，其具有允许取代的化合价。优选地，取代基与环碳原子连接。类似地，当在本文将杂芳基基团定义为取代基时，连接点可在杂芳基的环碳原子处，或者在环杂原子(即，氮、氧或硫)上，其具有允许连接的化合价。优选地，连接在环碳原子处。

“杂原子”是指选自N、O、P和S的原子。必要时，任何未指定的化合价独立地选自H、OH、羰基、正烷基或烷氧基。

“n”可为1至20，优选地1至10，更优选地1至6，且最优选地1至4。

“烷氧基”是指其中烷基基团如前面描述的烷基-O-基团。合适的烷氧基基团的非限制性实例包括甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基和正丁氧基。母体部分的键通过醚氧。

“药物可接受的盐”是指保留式(I)的化合物的生物学效力和性质的并且由合适的无毒有机或无机酸或有机或无机碱形成的常规酸加成盐或碱加成盐。样品酸加成盐包括衍生自无机酸的那些，所述无机酸例如盐酸、氢溴酸、氢碘酸、硫酸、氨基磺酸、磷酸和硝酸，和衍生自有机酸的那些，所述有机酸例如对甲苯磺酸、水杨酸、甲磺酸、草酸、琥珀酸、柠檬酸、苹果酸、乳酸、富马酸等。样品碱加成盐包括衍生自铵、钾、钠和季铵氢氧化物的那些，诸如例如，四甲基氢氧化铵。将药物化合物(即，药物)化学修饰为盐是药物化学家熟知的以获得化合物的改进的物理和化学稳定性、吸水性、流动性和溶解度的技术。参见例如，H.Ansel等人，PharmaceuticalDosageFormsandDrugDeliverySystems(药物剂型和药物递送系统)(第6版.1995)在pp.196和1456-1457页。

诸如药物可接受的载体、赋形剂等的“药物可接受的”是指药理学可接受的并且对被给予特定化合物的个体基本上无毒的。

如在取代的烷基中，“取代的”是指取代可在一个或多个位置发生，并且除非另外规定是指在各个取代位置的取代基独立地选自指定的选项，意思是可各个位置可同时存在多于一个取代基。

本发明的化合物的“前药”和“溶剂化物”也包括在本文中。前药的讨论在T.Higuchi和V.Stella，Pro-drugsasNovelDeliverySystems(1987)14oftheA.C.S.SymposiumSeries(作为A.C.S.研讨会系列的新递送系统(1987)14的前药)和在BioreversibleCarriersinDrugDesign(药物设计中的生物可逆性载体),(1987)EdwardB.Roche编，AmericanPharmaceuticalAssociationandPergamonPress中提供。术语“前药”是指在体内转化以产生式(I)的化合物或化合物的代谢物、药物可接受的盐或溶剂化物的化合物(例如，药物前体)。转化可通过许多机制(例如，通过代谢或化学过程)发生。前药的用途的讨论由T.Higuchi和W.Stella，“ProdrugsasNovelDeliverySystems(作为新递送系统的前药)”，Vol.14oftheA.C.S.SymposiumSeries(A.C.S.研讨会系列的第14卷)和在BioreversibleCarriersinDrugDesign(药物设计中的生物可逆性载体)，EdwardB.Roche编,AmericanPharmaceuticalAssociationandPergamonPress,1987提供。

本发明的化合物的“代谢物”是指代谢的中间体和产物。

式(I)的化合物可包含不对称或手性中心，因此，以不同立体异构体形式存在。意图式(I)的化合物的所有立体异构体形式及其混合物包括外消旋体混合物形成本发明的一部分。此外，本发明包括所有几何和位置异构体。基于它们的物理化学差异，通过本领域技术人员熟知的方法，例如通过色谱法和/或分级结晶可将非对映异构体混合物分离为它们单独的非对映异构体。对映异构体可通过将对映异构体混合物转化为非对映异构体混合物进行分离，通过与合适的光学活性化合物例如，手性助剂诸如手性醇或Mosher酰氯)反应，分离非对映异构体并且转化(例如，水解)单独的非对映异构体为相应纯的对映异构体。对映异构体还可通过使用手性HPLC柱进行分离。本发明的手性中心可具有如通过IUPAC1974定义的S或R构型。

术语“盐”、“溶剂化物”或“前药”等的使用意图同样适用于本发明化合物的对映异构体、立体异构体、旋转异构体、互变异构体、位置异构体、外消旋体或前药的盐、溶剂化物和前药。

如在本申请中使用的，单数形式“a”、“an”和“the”包括复数引用，除非上下文另外清楚规定。

如本文使用的，术语“包含(comprising)”是指“包括(including)”、诸如“包括(comprise)”和“包括(comprises)”的词语“包括(comprising)”的变型具有相应变化的含义。因此，例如，药物组合物“包括(comprising)”式(I)的化合物可仅由所述化合物组成或者可包含一种或多种另外的组分(例如，药物可接受的载体、赋形剂和/或稀释剂)。

如本文使用的，术语“多个”是指多于一个。在一些特殊的方面或实施方案中，多个可是指2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、4、45、46、47、48、49、50、51或更多，和其中可推导的任何整数以及其中可推导的任何范围。

“治疗有效量”是指至少一种显著抑制包括人肿瘤细胞系的人肿瘤细胞的增殖和/或预防人肿瘤细胞系的人肿瘤细胞的分化的式(I)的化合物，或其代谢物、药物可接受的盐、溶剂化物或前药的量。如本文使用的，术语“治疗有效量”在它的含义内包括无毒但足够量的用于本发明的试剂或组合物以提供期望的治疗效果。所需的精确量依据个体之间的不同而变化，其取决于诸如受治疗的种类、个体的年龄和身体状况、受治疗的疾病状态的严重程度、被给予的特定药剂、给药方式等的因素。因此，不能规定适用于所有实施方案的精确的“有效量”。然而，对于任何给定的情况，本领域一般技术人员可通过仅使用常规实验确定合适的“有效量”。

详细描述

AAD(例如，式(I))是可使用有机合成方法的普通知识合成的一类化合物。例如，AAD可通过苯酚与氯丙酮的衍生化、Strecker反应和生成的胺与芳酰氯的酰化合成(如在反应方案1中示出的)。必要时，然后可通过手性拆分获得特定的对映异构体(如在反应方案2中示出的)。

反应方案1：

反应方案2：

AAD是以前已经用于治疗耐药性线虫的一类化学药物。迄今，研究集中于靶向线虫中的烟碱乙酰胆碱受体的MPL，并且已经广泛用于治疗反刍动物中的寄生虫。

mTOR(雷帕霉素的哺乳动物靶标)，还称为雷帕霉素或FK506结合蛋白12-雷帕霉素缔合的蛋白1(FRAP1)的机械靶标是在人类中被FRAP1基因编码的蛋白质。mTOR为调节细胞生长、细胞增殖、细胞运动性、细胞存活、蛋白质合成和转录的丝氨酸/苏氨酸蛋白质激酶(并且专门属于磷脂酰肌醇3-激酶相关的激酶蛋白家族)。mTOR是两个分子复合物mTORC1和mTORC2的催化亚基。尽管实际上MPL在干扰mTOR通路中为拟雷帕霉素的，但雷帕霉素通常不是驱肠虫，这表明MPL很难被认为是mTOR抑制剂。然而，与雷帕霉素相同，AAD具有免疫抑制性质和抗癌活性二者。

蛋白质的TOR家族具有多效性功能，并且参与调节反应于氨基酸和其他必需营养素的细胞内浓度的mRNA转录和蛋白质转译的开始，参与激动蛋白细胞骨架、膜运输、蛋白质降解、PKC信号和核糖体生物合成的组织。此外，mTOR通路调节许多主要的细胞过程并且与包括癌症、肥胖症、2型糖尿病和神经变性的病理学疾病状态的数量增加有关。

有两种mTOR通路，其包含复合物：雷帕霉素敏感性复合物(mTORC1)，其由它与辅助蛋白Raptor(mTOR的调节相关的蛋白)的相互作用定义；和雷帕霉素-不敏感复合物(mTORC2)，其由它与RICTOR(mTOR的雷帕霉素-不敏感伙伴的相互作用定义)。mTORC1磷酸化充分表征的mTOR效应物S6激酶1(S6K1，还称为p70S6K)和真核起始因子4E(eIF4E)-结合蛋白1(4EBP1，其由磷酸化热-和酸-稳定的蛋白质调节胰岛素1(PHAS1)的基因编码)。mTORC2控制肌动蛋白细胞骨架以及AKT/PKB。

mTOR调节重要的信号转导通路并且与耦合生长刺激物与细胞周期进程有关。反应于生长诱导的信号，静止细胞提高mRNA子集的转译，需要其蛋白质产物用于通过细胞周期的G1阶段的进程。PI3K和AKT是连接生长因子受体与mTOR的磷酸化和激活态的连接的上游通路的关键元素。关于PI3K/AKT/mTOR通路在癌症细胞的发生和增殖中的作用，已经证实PI3K/AKT/mTOR通路的元素被表面受体的成红细胞白血病病毒致癌基因同系物(ERB)家族、胰岛素样生长因子受体(IGFRs)和致癌Ras激活。胰岛素样生长因子1受体(IGF1R)及其配体，胰岛素生长因子1(IGF1)的过度表达常在许多癌症中发生。此外，已经证实PI3K/AKT/mTOR通路的几种元素在恶性肿瘤中被在本质上激活。PTEN-缺陷恶性肿瘤中PI3K/AKT/mTOR信号元素的超活化表明癌症常取决于该通路用于生长和支持。

在磷酸化之后，mTOR调节两个控制包括S6K1和4EBP1的mRNAs的特定子集的转译的不同下游信号通路。PI3K和/或AKT的激活，和/或PTEN抑制剂功能的损失必须并且足以诱导通过mTOR的S6K1和4EBP1二者的磷酸化。因此，雷帕霉素衍生物阻滞表达激活的PI3K或AKT或缺乏PTEN的细胞中S6K1和4EBP1的磷酸化。mTOR传输信号的方法取决于它与Raptor的相互作用，形成与mTOR的复合物的150kDa的进化保守的蛋白质并且还结合4EBP1和S6K1二者。尽管Raptor自身不是激酶，但它需要4EBP1和S6K1的mTOR通路介导的磷酸化。

4EBP1是通过它与eIF4E的结合、eIF4F复合物的mRNA帽子结合亚基抑制蛋白质转译开始的小蛋白质。单独的eIF4E的过度表达足以诱导细胞转化。4EBP与eIF4E结合取决于4EBP1的磷酸化状态。

关于在静止细胞中并且在生长因子被剥夺的条件下，mTOR与转译蛋白的相互作用，未磷酸化的4EBP1与eIF4E紧密结合，抑制蛋白质转译的开始。反应于由激素、生长因子、有丝分裂原、细胞因子和G-蛋白偶联激动剂引发的增殖刺激，4EBP1通过mTOR和其他激酶的作用在几个丝氨酸/苏氨酸位置被磷酸化，促进eIF4E从4EBP1中解离。然后，游离的eIF4E可结合eIF4G(大支架蛋白)、eIF4A(ATP-依赖性RNA解旋酶)和eIF4B，形成多亚基eIF4F复合物并且促进帽依赖性蛋白质转译。这一连串事件诱导使用5’-未转译的末端区域(5’-UTR)中的调节元素，包括编码c-MYC、细胞周期素D1和鸟氨酸脱羧酶的mRNA转译mRNA的增加。相比之下，生长因子剥夺或使用雷帕霉素治疗导致4EBP1的去磷酸化，增加eIF4E结合和使用需要细胞周期的G1-与-S相变所需的5’-UTR转译mRNAs的开始的伴随损害。

有大量的实验证据表明mTOR直接负责4EBP1磷酸化和通过各种促有丝分裂刺激诱导的eIF4E的激活。例如，已经证实胰岛素处理的细胞中4EBP1的磷酸化被mTOR抑制剂有效阻滞。事实上，低细胞比的4EBP1与eIF4E可导致mTOR抑制剂抗性。此外，通过mTOR磷酸化的4EBP1的位点与通过胰岛素处理诱导的那些相同，并且在暴露于mTOR抑制剂之后迅速去磷酸化。一些观察结果表明mTOR还可间接充当蛋白质丝氨酸/苏氨酸磷酸酶的抑制剂，当条件适于G1-与-S相变时其起作用以去磷酸化4EBP1。

有大量证据表明MPL结合线虫中的乙酰胆碱受体并且在哺乳动物细胞中没有活性。然而，如上所述，现在出人意料地发现MPL在哺乳动物细胞中选择性结合mTOR受体。

本发明的化合物通过结合mTOR受体在哺乳动物细胞中充当选择性mTOR激酶抑制剂，因此可用于治疗任何mTOR通路相关的疾病。

诸如雷帕霉素及其类似物的许多癌症药物通过从催化位点分离的结构域结合mTOR，因此仅阻滞mTOR功能的子集。这类药物可激活导致治疗失败的mTOR通路依赖性存活通路。

相比之下，本发明的化合物具有与ATP(三磷酸腺苷)相似的尺寸，因此能够在mTOR的催化位点与ATP竞争。本发明化合物在mTOR的催化位点的这种相互作用应抑制mTORC1和mTORC2的所有激酶依赖性功能，并且没有激活存活通路的风险。在图8中，表示MPL降低卵巢癌细胞中的ATP水平，其强烈表明MPL结合mTOR的催化位点。

MPL由于它的低毒性似乎提供mTOR的高选择性抑制，并且当用作驱虫剂时，动物对它的剂量耐受性高达2000mg/kg。在动物模型中，本发明人证实观察到在5-50mg/kg的出人意料低的剂量下的MPL的抗癌作用。

在癌症中mTOR信号常上调。对于肿瘤细胞，MPL与哺乳动物mTOR受体的相互作用可为选择性的，导致肿瘤生长的抑制(参见第2012901199号澳大利亚临时专利申请和PCT/AU2013/000290，其通过引用并入本文)。

例如，本发明人出人意料地发现诸如MPL和MPL-SO₂的式(I)的化合物具有抗癌活性。更具体地，已经证实式(I)的化合物，包括MPL和MPL-SO₂，抑制癌症细胞系的细胞增殖和菌落形成。例如，已经证实卵巢癌细胞系对式(I)的化合物非常敏感，并且明显地其他细胞系也是高度敏感的。这些包括乳腺癌、间皮瘤、前列腺癌和胶质母细胞瘤细胞系。MPL对化学耐药性，雄激素不敏感的PC-3和DU145前列腺癌癌细胞非常有效。类似地，也对化学疗法高度耐受的PET和YOU细胞(间皮瘤)以及U87细胞(胶质母细胞瘤)的复制被MPL深度抑制。

本发明人证实MPL及其类似物适用于下列mTOR依赖性疾病：

mTOR信号在许多方面与阿尔茨海默氏病(AD)病理学交叉，表明它作为疾病发展的贡献者的潜在作用。通常，发现证实mTOR信号在AD大脑中过度活动。例如，人AD大脑的死后研究表示PTEN、Akt、S6K和mTOR的调节异常；

使用亨廷顿舞蹈病的小鼠模型的研究证实使用雷帕霉素治疗促进亨廷顿聚集体的清除。MPL可类似地去除这种聚集体，提供该疾病状态的新治疗；

与年龄相关的疾病；

移植排斥；

慢性炎性疾病(例如，类风湿性关节炎)；

糖原贮积疾病；

对一些癌症可选择；

系统性红斑狼疮：mTOR信号在SLET细胞中增加，并且已经证实使用雷帕霉素抑制mTOR信号在人SLE的治疗中有效。使用雷帕霉素治疗的SLE患者表示降低的基线钙水平和在TCR刺激后减少的钙流入，但不表示线粒体功能的改变，表明雷帕霉素治疗对该疾病的表现的特异性；

炎症和免疫激活；

贫血症；

白细胞减少症；

血小板减少症；

支架涂层；

肾功能不全；

肥胖症；

糖尿病/胰岛素耐受性；

非酒精性脂肪肝；

多囊肾；

帕金森氏病：mTORC1抑制剂雷帕霉素防止运动障碍的发展而不影响L-DOPA的治疗功效。因此，mTORC1信号级联代表用于设计抗帕金森氏病疗法的靶标；

纤维化(例如肝、心肌和肺纤维化)。由于成纤维细胞对MPL的敏感性，PI3K/mTOR和TGFβ之间的关系，和对赖氨酰氧化酶(LOX)表达/活性的作用，MPL可用于治疗纤维化。增加的心肌LOX表达在具有心力衰竭/纤维化的患者中，和类似地许多肺和肾疾病/LOX/成纤维细胞中发现。此外，纤维化在诸如乳腺和胰腺癌的几种类型的癌症中是重要的促成因素。

不受理论束缚，认为本发明化合物的活性通过结合mTOR的催化位点起作用。

组合物、药物和试剂盒

本发明提供了包含至少一种式(I)的化合物，或所述化合物的代谢物、药物可接受的盐、溶剂化物或前药和至少一种药物可接受的载体的药物组合物、药物和试剂盒。为了从本发明描述的化合物制备药物组合物，惰性药物可接受的载体可为固体或液体。固体形式制剂包括粉末剂、片剂、分散颗粒剂、胶囊剂、扁囊剂和栓剂。粉末剂和片剂可包含约5％至约95％的活性成分。合适的固体载体是本领域已知的，例如碳酸镁、硬脂酸镁、滑石、糖或乳糖。片剂、粉末剂、扁囊剂和胶囊剂可用作适于口服给药的固体剂型。药物可接受的载体和各个组合物的制备方法的实例可在A.Gennaro(编)，Remington'sPharmaceuticalSciences(雷明顿药物科学)，第18版，(1990)，MackPublishingCo.，Easton,Pennsylvania中获悉。

液体形式制剂包括溶液剂、悬浮剂和乳液剂，例如用于肠胃外注射的水或水-丙二醇溶液剂或用于口服溶液剂的添加的甜味剂和遮光剂、悬浮剂和乳液剂。液体形式制剂还可包括用于鼻内给药的溶液。

适于吸入的气雾剂制剂可包括粉末形式的溶液剂和固体，可将其结合药物可接受的载体，例如惰性压缩气体，例如，氮气。还包括的是意图在使用前立即转化为用于口服或肠胃外给药的液体形式制剂的固体形式制剂。这种液体剂型包括溶液剂、悬浮剂和乳液剂。

本发明的化合物还可透皮递送。透皮组合物可采取乳膏剂、洗剂、气雾剂和/或乳剂的形式并且可包含在本领域为了该目的常见的基质的透皮膏药或储存类型中。

本发明的化合物还可皮下递送。

优选地，口服给予式(I)的化合物。

本发明的组合物和药物可包含药物可接受的载体、佐剂、赋形剂和/或稀释剂。根据与组合物或药物的其他成分相容，载体、稀释剂、赋形剂和佐剂必须是“可接受的”，并且通常对其受体无害。药物可接受的载体或稀释剂的非限制性实例为脱矿质水或蒸馏水；盐水溶液；诸如花生油、红花油、橄榄油、棉籽油、玉米油的植物基油类；诸如花生油、红花油、橄榄油、棉籽油、玉米油、芝麻油、花生油或椰子油的芝麻油；硅油，包括诸如甲基聚硅氧烷、苯基聚硅氧烷和甲基苯基聚硅氧烷的聚硅氧烷；挥发性硅酮；矿物油诸如液体石蜡、软石蜡或角鲨烷；诸如甲基纤维素、乙基纤维素、羧甲基纤维素、羧甲基纤维素钠或羟基丙基甲基纤维素的纤维素衍生物；低级烷醇，例如乙醇或异丙醇；低级芳烷醇；低级聚亚烷基二醇或低级亚烷基二醇，例如聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇、丙二醇、1,3-丁二醇或丙三醇；脂肪酸酯诸如棕榈酸异丙酯、肉豆蔻酸异丙酯或油酸乙酯；聚乙烯基吡咯烷酮；琼脂；黄芪胶或阿拉伯树胶和凡士林。通常，载体或载体类形成约10％至约99.9％重量比的组合物或药物。

本发明的组合物和药物可为适于通过注射给药(例如，用于肠胃外给药包括皮下注射、肌内注射或静脉内注射)、通过口服给药(例如胶囊剂、片剂、囊片剂和酏剂)、通过局部给药(例如，为软膏剂、乳膏剂或洗剂形式，或者适于以滴眼液形式递送的形式)或通过鼻内吸入(例如，气雾剂形式)的形式。

为了以可注射溶液或悬浮液形式给药，无毒肠胃外可接受的稀释剂或载体可包括林格氏溶液、等渗盐水、磷酸盐缓冲盐水、乙醇和1,2丙二醇。制备肠胃外给药的组合物和药物的方法对于本领域技术人员是明显的，并且在例如，Remington’sPharmaceuticalScience(雷明顿药物科学)，第15版，MackPublishingCompany,Easton,Pa中更详细地描述。

为了口服给药，合适的载体、稀释剂、赋形剂和佐剂的一些实例包括花生油、液体石蜡、羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、海藻酸钠、阿拉伯树胶、黄芪胶、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、明胶和卵磷脂。此外，这些口服制剂可包含合适的调味剂和着色剂。当用于胶囊形式时，可使用延迟崩解的诸如单硬脂酸甘油酯或硬脂酸甘油酯的化合物将胶囊剂包衣。佐剂通常包括软化剂、乳化剂、增稠剂、防腐剂、杀菌剂和缓冲剂。

用于口服给药的固体形式可包含在人和兽医药物实践中可接受的粘合剂、甜味剂、崩解剂、稀释剂、调味剂、包衣剂、防腐剂、润滑剂和/或时间延迟剂。合适的粘合剂包括阿拉伯树胶、明胶、玉米淀粉、黄芪胶、海藻酸钠、羧甲基纤维素或聚乙二醇。合适的甜味剂包括蔗糖、乳糖、葡萄糖、阿斯巴甜或糖精。合适的崩解剂包括玉米淀粉、甲基纤维素、聚乙烯基吡咯烷酮、瓜尔胶、黄原胶、膨润土、海藻酸或琼脂。合适的稀释剂包括乳糖、山梨醇、甘露醇、葡萄糖、高岭土、纤维素、碳酸钙、硅酸钙或磷酸氢钙。合适的调味剂包括薄荷油、冬青油、樱桃油、橙子油或树莓调味剂。合适的包衣剂包括丙烯酸和/或甲基丙烯酸的聚合物或共聚物和/或它们的酯、蜡、脂肪醇、玉米蛋白、虫胶或面筋。合适的防腐剂包括苯甲酸钠、维生素E、α-生育酚、抗坏血酸、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯或亚硫酸氢钠。合适的润滑剂包括硬脂酸镁、硬脂酸、油酸钠、氯化钠或滑石。合适的时间延迟剂包括单硬脂酸甘油酯或双硬脂酸甘油酯。

用于口服给药的液体形式可包含除了上述制剂之外的液体载体。合适的液体载体包括水，诸如橄榄油、花生油、芝麻油、葵花油、红花油、花生油、椰子油的油，液体石蜡、乙二醇、丙二醇、聚乙二醇、乙醇、丙醇、异丙醇、丙三醇、脂肪醇、三酸甘油酯或其混合物。

用于口服给药的悬浮剂还可包含分散剂和/或悬浮剂。合适的悬浮剂包括羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟基丙基甲基-纤维素、聚乙烯基吡咯烷酮、海藻酸钠或乙酰基醇。合适的分散剂包括卵磷脂、诸如硬脂酸、聚氧乙烯山梨醇单-或二-油酸酯、-硬脂酸酯或-月桂酸酯、聚氧乙烯脱水山梨糖醇单-或二-油酸酯、-硬脂酸酯或-月桂酸酯等的脂肪酸的聚氧乙烯酯。

用于口服给药的制剂可包含一种或多种乳化剂。合适的乳化剂包括上述例示的分散剂或诸如瓜尔胶、阿拉伯树胶或黄芪胶的天然树胶。

本发明的局部制剂可包含活性成分连同一种或多种可接受的载体，和任选地任何其他治疗成分。适于局部给药的制剂包括适于通过皮肤渗透至其中需要治疗的位置的液体或半液体制剂，例如擦剂、洗剂、乳膏剂、软膏剂或糊剂和适于给予眼睛、耳或鼻子的滴剂。

本发明的滴剂可包含无菌水性或油性溶液或悬浮液。这些可通过将活性成分溶于杀菌剂和/或杀真菌剂和/或任何其他合适的防腐剂的水溶液制备，且任选包含表面活性剂。然后，可通过过滤使产生的溶液澄清，转移至合适的容器并杀菌。杀菌可通过高压灭菌法或保持在90℃-100℃下半小时，或通过过滤，随后通过防腐技术转移至容器实现。适于包含在滴剂中的杀菌剂和杀真菌剂的实例为硝酸苯汞或醋酸苯汞(0.002％)、苯扎氯铵(0.01％)和醋酸氯己定(0.01％)。用于制备油性溶液的合适的溶剂包括丙三醇、稀释的醇和丙二醇。

本发明的洗剂包括适于应用于皮肤或眼睛的那些。眼用洗剂可包含任选包含杀菌剂的无菌水溶液并且可通过上述关于滴剂的制备描述的那些类似的方法制备。用于应用于皮肤的洗剂或擦剂还可包含加速干燥和冷却皮肤癌的试剂，例如醇或丙酮，和/或诸如甘油，或诸如蓖麻油或花生油的油的保湿剂。

本发明的乳膏剂、软膏剂或糊剂为用于外部应用的活性成分的半固体制剂。它们可通过混合单独地或在水性或非水性液体的溶液或悬浮液中的细分散或粉末形式的活性成分与油性或非油性基质制备。基质可包含诸如硬、软或液体石蜡、甘油、蜂蜡、金属皂的烃类；粘液；诸如杏仁油、玉米油、花生油、蓖麻油或橄榄油、羊毛脂或其衍生物的天然源油类，或诸如硬脂酸或油酸的脂肪酸连同诸如丙二醇或聚乙二醇的醇。

本发明的组合物和药物可结合任何合适的诸如阴离子、阳离子的表面活性剂或诸如脱水山梨糖醇酯或其聚氧乙烯衍生物的非离子表面活性剂。还可包含诸如天然树胶、纤维素衍生物的悬浮剂或诸如硅酸(silicaceous)二氧化硅的无机材料，和诸如羊毛脂的其他成分。

可以脂质体形式给予本发明的组合物和药物。形成脂质体的合适的方法是本领域已知的，并且关于该具体参考文献参考Prescott，(编)，(1976)，“MethodsinCellBiology(细胞生物学中的方法)”，第XIV卷，AcademicPress,NewYork,N.Y.p.33etseq。

还可将诸如佐剂或生物反应调节剂的补充活性成分结合在本发明的组合物和药物中。

任何合适的佐剂可包含在本发明的组合物和药物中。例如，可使用铝基佐剂。合适的铝基佐剂包括但不限于氢氧化铝、磷酸铝及其组合。可使用的铝基佐剂的其他具体实例在第1216053号欧洲专利和第6,372,223号美国专利中描述。其他合适的佐剂包括弗氏不完全佐剂和完全佐剂(DifcoLaboratories,Detroit,Mich.)；默克佐剂65(MerckandCompany,Inc.,Rahway,N.J.)；AS-2(SmithKlineBeecham,Philadelphia,Pa.)；诸如氢氧化铝凝胶(alum)或磷酸铝的铝盐；钙、铁或锌盐；酰化酪氨酸的不溶悬浮液；酰化糖类；阳离子或阴离子衍生的多糖；聚磷腈；生物可降解微球；单磷脂酰脂质A和quilA；包括在第0399843号欧洲专利、第7,029,678号美国专利和PCT公开号WO2007/006939中描述的那些的水包油乳液；和/或诸如GM-CSF或白介素-2、-7或-12的另外的细胞因子，粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、单磷脂酰脂质A(MPL)、霍乱毒素(CT)或它的组成亚基、不耐热肠毒素(LT)或它的组成亚基、诸如脂多糖(LPS)及其衍生物的toll-样受体配体佐剂(例如，单磷脂酰脂质A和3-脱酰化单磷脂酰脂质A)、胞壁酰二肽(MDP)和呼吸道合胞体病毒(RSV)的F蛋白。

本发明的另一方面是包含治疗有效量的至少一种式(I)的化合物、或所述化合物的代谢物、药物可接受的盐、溶剂化物或前药和药物可接受的载体、载体或稀释剂的试剂盒。

本发明的另一方面是包含一定量的至少一种式(I)的化合物，或所述化合物的代谢物、药物可接受的盐、溶剂化物或前药和一定量的至少一种上述列举的抗癌疗法和/或抗癌剂的试剂盒，其中两种或多种成分的量产生期望的治疗效果。

本发明的试剂盒可包含组分以帮助进行本发明的方法，例如，给药设备、缓冲剂和/或稀释剂。试剂盒可包含存放各个组分的容器和使用本发明的方法中的试剂盒组分的指南。

在一些实施方案中，试剂盒可为组合试剂盒。

在其他实施方案中，试剂盒可为分立试剂盒。

给药剂量和途径

可通过标准途径将试剂、组合物和药物给予受体，所述标准途径包括但不限于肠胃外(例如，静脉内、椎管内、皮下或肌肉内)、口服、局部或粘膜途径(例如，鼻内)。在一些实施方案中，可单独地或结合其他另外的治疗剂将它们给予受体。在这类实施方案中，可同时或相继给药。

通常，可以与给药途径和受体的身体特征(包括健康状况)相容的方式给予试剂、组合物和药物，并且以诱导期望的效果(即，治疗有效、免疫原性和/或保护性)的方式。例如，合适的剂量可取决于许多因素，包括但不限于个体的身体特征(例如，年龄、体重、性别)、试剂、组合物或药物是否以单一试剂或佐剂疗法使用、受治疗的癌症的进展(即，病理学状态)和对于本领域技术人员显而易见的其他因素。

描述了当确定试剂、组合物和药物的合适剂量时的各种一般考虑。例如，在Gennaro等人(编)，(1990)，“Remington'sPharmaceuticalSciences(雷明顿的药物科学)”，MackPublishingCo.，Easton，Pennsylvania，USA；和Gilman等人(编)，(1990)，“Goodman和Gilman’s:ThePharmacologicalBasesofTherapeutics(治疗的药理学基础)”，PergamonPress。

本发明的出人意料的优点在于式(I)的化合物通常反映低毒性。例如，MPL在超过2000mg每千克体重时具有单剂量毒性。因此，可以多达并且包括2000mg的活性成分每千克体重的量的单剂量形式将用于本发明的试剂、组合物或药物给予患者。此外，使用本发明治疗癌症的另一出人意料的优点是式(I)的化合物的普遍高的临床耐药性。例如，1000mg的MPL每千克体重每24小时的剂量在哺乳动物中耐受良好。因此，可以多达并且包括1000mg的活性成分每千克体重每24小时的量将用于本发明的试剂、组合物或药物给予患者。

通常，期望有效剂量为约0.0001mg至约1000mg的活性成分每千克体重每24小时；通常，约0.001mg至约750mg每千克体重每24小时；约0.01mg至约500mg每千克体重每24小时；约0.1mg至约500mg每千克体重每24小时；约0.1mg至约250mg每千克体重每24小时；或约1.0mg至约250mg每千克体重每24小时。更通常地，期望有效剂量范围为约1.0mg至约200mg每千克体重每24小时；约1.0mg至约100mg每千克体重每24小时；约1.0mg至约50mg每千克体重每24小时；约1.0mg至约25mg每千克体重每24小时；约5.0mg至约50mg每千克体重每24小时；约5.0mg至约20mg每千克体重每24小时；或约5.0mg至约15mg每千克体重每24小时。

例如，优选的剂量可为约10-100mg的式(I)的化合物每千克体重每24小时。此外，优选的剂量可为约50mg的式(I)的化合物每千克体重每24小时。

通常，在治疗应用中，治疗可进行癌症的持续时间。此外，对本领域技术人员明显的是单独剂量的最佳量和间隔可由受治疗的疾病状态或疾病状态的性质和程度、给药形式、途径和位点以及受治疗的特定个体的性质决定。可使用常规技术确定最佳剂量。

在许多实例(例如，预防性应用)中，可能期望本发明的试剂、组合物或药物的几次或多次给药，其可例如，被给予1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多次。给药可为约一周至约十二周间隔，并且在一些实施方案中约一周至约四周间隔。还预期定期重新给药。

还对于本领域技术人员明显的是可使用治疗测定试验的常规过程确定最佳给药过程。

在将两个或多个实体(例如，试剂或药物)“联合”给予个体的情况下，可同时在单一组合物中，或同时在单独组合物中，或在分开的时间在单独的组合物中给予它们。

本发明的一些实施方案包括以多个分开的剂量给予试剂、组合物或药物。因此，本文描述的预防和治疗方法包括给予个体多个分开的剂量，例如，在规定的时间内。因此，在一些实施方案中，方法包括给予初次剂量，其随后可为加强剂量。加强可用于再次接种的目的。在各个实施方案中，将试剂、组合物或药物给予至少一次、两次、三次或更多次。

通常，可以实现预期目的有效的量给予试剂、组合物和药物。更具体地，可以治疗有效量给予它们，所述治疗有效量是指预防靶标疾病或疾病状态的目前症状的发展或减轻靶标疾病或疾病状态的目前症状有效的量。有效量的确定也在本领域技术人员的能力范围内。例如，可从细胞培养检验开始估算试剂、组合物和药物的治疗有效剂量。例如，可在动物模型中配制剂量以获得包括如在细胞培养基中测定的IC50的循环浓度范围。这类信息可用于更精确地确定在人类和其他哺乳动物个体中的有效剂量。

治疗有效剂量是指在治疗下预防症状的发展、减轻症状和/或延长个体的存活的试剂、组合物或药物的量。试剂、组合物和药物的毒性和治疗功效可通过在细胞培养基中的标准药物检验，和/或实验动物(例如，通过测定LD50(致死50％的群体的剂量)和ED50(在50％的群体中治疗有效的剂量))测定。毒性和治疗效果之间的剂量比为可表示为LD50与ED50的比例的疗效指数。表现出高疗效指数的试剂、组合物和药物是优选的。从这种细胞培养基检验和/或动物研究中获得的数据可用于配制用于人类或其他哺乳动物的一系列剂量。这种化合物的剂量优选地位于包括具有较小或没有毒性的ED50的循环浓度范围内。剂量可在该范围内变化，其取决于使用的剂量形式和使用的给药途径。精确制剂、给药途径和剂量可由各个医生根据个体的疾病状态容易地选择(参见例如，Fingl等人，(1975)，在“ThePharmacologicalBasisofTherapeutics(治疗的药理学基础)”，Ch.1p.1中)。可单独地调整剂量和间隔以提供足以获得和保持期望的治疗效果和/或最低有效浓度(MEC)的活性剂的血浆水平。达到MEC必需的剂量取决于给药途径和其他单独特征。生物检验和/或HPLC检验可用于测定血浆浓度。

还可使用MEC值确定剂量间隔。通常，可使用保持血浆水平高于MEC约10％-90％的时间，优选地30％-90％且更优选地约50％-90％的时间的方案给予试剂、组合物和药物。在其中使用局部给药或选择性摄取的实施方案中，药物的有效局部浓度可能并不与血浆浓度相关。

还可结合(同时或相继给予)一种或多种诸如放射治疗的抗癌治疗，和/或一种或多种抗癌剂使用本发明的化合物，所述抗癌剂选自细胞生长抑制剂、细胞毒性剂(例如但不限于，DNA相互作用剂(例如顺铂或阿霉素))；紫杉烷(例如，泰素帝、紫杉醇)；拓扑异构体酶II抑制剂(例如依托泊苷)；拓扑异构体酶I抑制剂(例如伊立替康(或CPT-11)、camptostar或拓扑替康)；微管蛋白相互作用剂(例如紫杉醇、多西他赛或埃博霉素)；激素剂(例如它莫西芬)；胸苷激酶合成酶抑制剂(例如5-氟尿嘧啶)；抗代谢药(例如甲氨蝶呤)；烷基化试剂(例如替莫唑胺(来自Schering-PloughCorporation,Kenilworth,NewJersey的TEMODAR(TM))、环磷酰胺)；法呢基蛋白质转移酶抑制剂(例如SARASAR(TM)(4～[2-[4-[(11R)-3,10-二溴-8-氯-6,11-二氢-5H-苯并[5,6]环七[1,2-b]吡啶-11-基-]-1-哌啶基]-2-氧基乙基]-1-哌啶甲酰胺，或来自Schering-PloughCorporation,Kenilworth,NewJersey)的SCH66336、tipifamib(来自JanssenPharmaceuticals的或R115777)、L778.123(来自Merck&Company,WhitehouseStation,NewJersey的法呢基蛋白质转移酶抑制剂)、BMS214662(来自Bristol-MyersSquibbPharmaceuticals,Princeton,NewJersey的法呢基蛋白质转移酶抑制剂)；信号转导抑制剂(例如，lressa(来自AstraZenecaPharmaceuticals,England)、特罗凯(EGFR激酶抑制剂)、EGFR的抗体(例如，C225)、格列卫(TM)(来自NovartisPharmaceuticals,EastHanover,NewJersey的C-abl激酶抑制剂)；干扰素，例如，内含子(来自Schering-PloughCorporation)、Peg-内含子(来自Schering-PloughCorporation)；激素疗法组合；芳香酶组合；阿糖胞苷(ara-C)、阿霉素、环磷酰胺和吉西他滨。

个体

可将本发明的预防和治疗方法应用于任何合适的个体。在一些实施方案中，个体为哺乳动物个体。例如，个体可为小鼠、大鼠、狗、猫、牛、羊、马或社会、经济或研究重要的任何其他哺乳动物。因此，个体可为哺乳动物，例如，人或非人哺乳动物。

本领域技术人员理解，如在具体实施方案中公开的在不背离广泛描述的本发明的主旨或范围下可对本发明进行许多改变和/或修改。因此，认为本实施方案在所有方面中为例示性的并不是限制性的。

现在，参考具体实施例描述本发明，所述实施例不应被解释为以任何方式限制。

实施例

材料和方法

细胞系

人卵巢癌细胞系OVCAR-3、SKOV-3和A2780和原代细胞人脐静脉内皮细胞(HUVEC)和所有其他细胞系从美国模式培养物保藏所(ATCC)获得并根据它们的使用说明保持。星形胶质细胞和神经胶质瘤细胞系由来自洛伊癌症研究中心，UniversityofNewSouthWales,Australia的Dr.KerryMcDonald友好地赠予。星形胶质细胞和神经胶质瘤细胞系来自洛伊癌症研究中心，UniversityofNewSouthWales,Australia的Dr.KerryMcDonald友好地赠予。

细胞增殖检验

使用磺酰罗丹明B(SRB)检验评价细胞增殖。使用MPL(0、1、5、10、25、50和100μmol/L)将在96-孔板(2,000–3,000细胞/孔)中接种的细胞处理72h。然后，将细胞固定，洗涤并使用100μl的溶于1％醋酸的0.4％(w/v)SRB染色。在空气干燥之前，通过使用1％醋酸洗涤五次去除未结合的染料。使用100μl的10mMTris碱(pH10.5)将结合的SRB溶解并在570nm下读取吸光度。精确地，相同步骤用于评价MPL-SO₂。将两种试剂溶于乙醇并使用基质稀释以提供细胞培养基检验所需的最终浓度。

细胞存活检验

对于存活实验，将在6孔板中接种的细胞暴露于0、1、10、50和100μM浓度下的莫奈太尔(MPL)24h、48h或72h。将莫奈太尔(由Novartis,Basel,Switzerland赠予)溶于100％乙醇，然后使用细胞培养基稀释。在处理时间结束时，使用PBS洗涤细胞，使用台盼蓝和血细胞计数仪胰蛋白酶化和计数。一式四份建立所有实验点并将各个实验进行至少两次。

菌落形成检验

为了菌落形成检验，在100mmPetri培养皿中将诸如OVCAR-3或A2780细胞的5×10⁶细胞制板并使其附着过夜。将培养基抽出并使用各个浓度的MPL将以指数方式生长的细胞孵育72h。此时，将培养基抽出，使用PBS洗涤培养皿，并将没有培养基的药物加入至各个板。每周改变两次培养基，时间为3周。在此之后，使用PBS轻轻洗涤板并使用100％乙醇将细胞固定，使用0.5％的过滤的结晶紫溶液染色。在倒置显微镜下计数由大于50个细胞组成的菌落。

细胞周期分析

使用标准流式细胞仪分析方案和步骤测定MPL对细胞周期的影响。简略地，使用MPL将在25cm³烧瓶中接种并使其附着过夜的0.7×106百万个细胞处理24h或48h。使用胰蛋白酶化收集细胞并与漂浮在培养基中的细胞合并。将细胞悬浮液离心，使用PBS洗涤并使用甲醇固定。然后，将细胞洗涤，在室温下重新悬浮在碘化并啶和核糖核酸酶A的PBS中30min并通过流式细胞仪(BectonDickinsonFACSort)分析。

免疫印迹分析(Westenblotanalysis)

使用免疫印迹分析测定细胞中的蛋白质表达。在使用规定浓度的MPL治疗后，制备细胞裂解液并使用cdk2、cdk4、细胞周期素A、细胞周期素E、PARP-1(1:1000稀释；CellSignallingTechnology)和p53(1:200稀释；SantaCruzBiotechnology)的抗体探测。通过使用GAPDH抗体(1:30000稀释；Sigma-Aldrich)重复探测印迹验证凝胶上的蛋白质的可比较负载量。

在其他实验中，在使用规定浓度的MPL治疗之后，制备细胞裂解液并使用c-Myc、细胞周期素D1、细胞周期素E、cdk2、cdk4、IGF-1R(CellSignallingTechnology)和(antaCruzBiotechnology,Australia)的抗体探测。通过使用GAPDH抗体(Sigma-Aldrich,Sydney,Australia)重复探测印迹验证凝胶上的蛋白质的可比较负载量。

体内实验

雌性裸鼠(6周龄)购自生物资源(FacultyofMedicine,UniversityofNewSouthWales)。实验动物伦理委员会批准包括在小鼠上进行的所有程序。简略地，将2.5×106对数生长期的OVCAR-3细胞s.c.注射至各个小鼠的左肋。将动物每周称重一次，同时每周测量两次它们的肿瘤体积。通过正交直径的卡尺测量监测肿瘤生长，并式1/2(长度×宽度²)计算估计的肿瘤体积，其中宽度为两次正交测量的较短的。基于伦理委员会批准，在肿瘤体积达到500mm³之前将小鼠安乐死。当将小鼠随机化并且分为治疗组或对照组(6只每组)时，在肿瘤细胞注射之后的第8天开始治疗。将莫奈太尔悬浮在无菌0.5％(w/v)羟丙基甲基纤维素(HPMC)中。在25mg/kg或50mg/kg下将药物每周i.p.给予3次。使用无菌载体(0.5％HPMC)处理对照组。将小鼠处理3周。24小时持续药物给予后，将小鼠安乐死并切除它们的肿瘤，在-80℃下冷冻直至分析。

在另外的实验中，当将小鼠随机化并且分配至MPL组或载体治疗组(5-6只小鼠每组)之一时，在肿瘤细胞接种之后的第8天开始治疗。将MPL悬浮在羟丙基甲基纤维素(0.5％w/vHPMC)中，通过超声处理机杀菌并以或者腹腔内(i.p)或以填喂法形式口服(100μL)每隔一天给药。在第一中试试验中，在2.5mg/kg或25mg/kg体重下i.p.给予药物，每周三次，时间为2周。基于此结果，在下一组动物中，将剂量增加至25mg/kg至50mg/kg，每周三次。在最后(第三)中试研究中，口服给药治疗小鼠。给予的剂量为50mg/kg至100mg/kg，每周三次。在所有这些试验中，对照组中的小鼠接受类似体积的载体(0.5％HPMC)。根据标准程序在福尔马林固定的肿瘤切片上进行肿瘤组织学/免疫组织化学。

统计学分析

将来自至少两个独立实验的所有数据报道为平均值±标准误差(S.E.M.)。使用单因素ANOVA与事后Dunnett检验分析治疗的MPL与对照组之间的肿瘤体积差异。使用Studentt检验比较定量变量。将显著性统计学差异限定在P<0.05。

结果

MPL抑制细胞增殖

检验MPL对OVCAR-3、A2780和SKOV-3的卵巢癌细胞系生长的影响。通过使用SRB检验，检验MPL对细胞增殖的影响。根据表1，MPL以浓度依赖性方式抑制OVCAR-3、A2780和SKOV-3细胞的增殖分别具有6.3、10.0和29.3的IC₅₀值。从这些结果可明显看出，卵巢癌细胞系对MPL的抗增殖作用敏感。SKOV-3细胞是最不敏感的。还使用SRB增殖检验以类似方式测试MPL-SO₂。发现MPL-SO₂与MPL一样有效。MPL-SO₂降低在培养基中生长的癌症细胞系的存活率并且抑制细胞增殖。MPL-SO₂的IC50值在表1中提供。

还在诸如乳腺、前列腺癌和间皮瘤细胞的一系列细胞上测试MPL对细胞增殖的抑制作用。获得的结果在表1中提供。其他结果在表2中提供。

表1：MPL和MPL-SO₂的IC50值(72h体外治疗，SRB检验)

表2：MPL和MPL-SO2在抑制各种癌症细胞系的增殖中的IC50值

没有星号＝一次测量，**＝两次重复，***＝三次重复

AAD

表4：根据表3的氨基乙腈衍生物(AAD)

AAD	R1	R2	R3	R4
					1566(MPL)	CN	H	CF₃	SCF₃
2105(MPL-SO)	CN	H	CF₃	SOCF₃
					4670(MPL-SO₂)	CN	H	CF₃	SO₂CF₃
450	H	H	Cl	CF₃
					907	H	H	CF₃	CF₃
970	H	H	CF₃	OCF₃
					1154	Cl	H	Cl	OCF₃
004	F	H	Cl	OCF₃
					2009	H	F	Cl	OCF₃
1336	F	F	Br	OCF₃
					1470	F	F	CF₃	OCF₃

根据表3，“MPL-(R)”是指N-[(1R)-1-氰基-2-(5-氰基-2-三氟甲基-苯氧基)-1-甲基-乙基]-4-三氟甲基巯基-苯甲酰胺，且“MPL-(S)”是指N-[(1S)-1-氰基-2-(5-氰基-2-三氟甲基-苯氧基)-1-甲基-乙基]-4-三氟甲基巯基-苯甲酰胺。

根据表3中示出的结果，AAD907、1336、1470和2224(MPL-(R))的IC50值(正常细胞/癌症细胞)的比例表示特别高的活性。此外，发现AAD2224(MPL-(R))和AAD1566(MPL-(S))是等位的。注意到，前面已经证实(R)-对映异构体MPL-(R)没有驱虫活性。

简言之，体外测试对抗具有广泛不同疾病特征的许多癌症细胞系的MPL和MPL-SO2。为了进一步详细研究，选择人卵巢癌细胞系OVCAR-3和A2780。此外，在MPL(0、5、10、25、50和100μM)的存在下将正常人卵巢表面上皮细胞(HOSE)培养72h。使用台盼蓝检验(图9)评价细胞存活。类似地，研究MPL对正常上皮细胞、内皮细胞、胚胎细胞和胎儿细胞的生长的影响(图10)，同时使用SRB检验评价细胞增殖(图11)。采用对照(载体处理的)细胞以提供100％增殖并将MPL处理组表示为对照±SEM的百分比。一式四份测试各个药物浓度并将各个实验重复至少两次。为了统计学比较，使用Studentt检验将各个药物处理组与对照组比较。为了检验浓度依赖性药物效果，使用方差分析(ANOVA)。P值为：*＝<0.05；**<0.01且***＝<0.001，****p<0.0001。表2中提供的结果表示MPL在癌症细胞系中发挥高的抗增殖活性，而正常细胞几乎不受影响。为了发现MPL作用是否被烟碱乙酰胆碱受体且特别地nACHR7亚型介导，使用拮抗剂将细胞预处理，然后暴露于MPL(图12)。

还提供了针对MPL-SO2获得的结果。可以看出MPL-SO2以与母体药物MPL类似的顺序起作用。IC50值的范围非常接近并且表明MPL-SO2在抑制癌症细胞增殖中与MPL一样有效(表2)。

MPL抑制菌落形成

为了研究MPL是否还阻滞细胞系建立菌落的生殖完整性和能力，研究暴露于MPL的细胞的克隆活动。在暴露于各个浓度的MPL72h之后，将细胞洗涤，然后在没有药物的培养基中孵育2周。发现MPL深度阻滞通过这些细胞的菌落形成。较高浓度的MPL导致克隆能力的几乎完全丧失(图2)。

为了测定MPL对细胞完整性的影响和在药物暴露和戒断之后使它自身摆脱药物影响的能力，使用MPL(0、5、10、25μM)将细胞孵育72h，使用PBS洗涤，转移至琼脂板，使用生长培养基培养并在标准条件下孵育2周。然后，使用100％甲醇将细胞固定并使用1％结晶紫染色。在显微镜(放大×5)下将菌落(大于50的细胞簇)计数。将针对不同实验组计数的菌落数表示为对照的百分比(图15)。这些结果表明通过MPL的菌落形成的浓度依赖性抑制。

MPL通过下调细胞周期素和细胞周期素依赖性激酶的表达阻滞细胞周期

为了研究MPL抑制细胞增殖和菌落形成的机制，通过流式细胞仪检验MPL对细胞周期的影响。发现MPL干扰细胞周期进程(图3)。细胞暴露于MPL的进程在G1阶段中被以浓度和时间依赖方式阻滞。在G1阶段中的细胞累积伴随在S和G2-M阶段中细胞百分比的急剧下降。为了研究与MPL-诱导的细胞周期停滞有关的分子机制，检验细胞周期调节蛋白cdk2、cdk4、细胞周期素A和E的表达。MPL处理的细胞表现较低水平的cdk2、cdk4、细胞周期素A和E(图4)。

MPL通过下调导致诱导PARP-1断裂的细胞周期素和细胞周期素依赖性激酶的表达阻滞细胞周期

为了发现MPL抑制细胞增殖和菌落形成的机制，通过流式细胞仪(FACS)检验MPL对细胞周期的影响。发现MPL干扰细胞周期进程(图22)。在暴露于MPL的细胞中，细胞周期在G1阶段中被以浓度和时间依赖性方式阻滞。在G1阶段中的细胞累积伴随在S和G2-M阶段中细胞百分比的急剧下降。为了研究与MPL-诱导的细胞周期停滞有关的分子机制，检验细胞周期调节蛋白cdk2、cdk4、细胞周期素A和E的表达。MPL处理的细胞表现较低水平的cdk2、cdk4、细胞周期素E和A(图4和16)。

MPL诱导PARP-1断裂

为了研究MPL-诱导的细胞死亡是否包括PARP的断裂，进行针对PARP-1和断裂的PARP-1的MPL-处理的细胞的裂解物的免疫印迹分析。PARP-1的断裂通过阻止DNA-修复-诱导的存活促进细胞凋亡。PARP帮助细胞保持它们的存活，因此PARP的断裂促进细胞分解并且充当经历细胞凋亡的细胞的标记。图5表示在MPL处理的细胞中PARP断裂。

MPL诱导PARP断裂

从MPL处理的OVCAR-3和A2780细胞制备的细胞裂解液的免疫印迹分析表示代表细胞死亡的PARP的高度诱导的断裂(图18)。

MPL降低细胞ATP水平

如在图19A和19B中描述的，使用MPL治疗OVCAR-3或A2780细胞导致在细胞中发现的ATP水平的降低。

MPL诱导自噬

图6表示使用MPL治疗的细胞导致液泡形成，表明MPL可诱导这些细胞中的自噬。图7表示MPL治疗降低ADP/ATP的细胞比例，其为细胞自噬的另一指示器。

MPL抑制裸鼠中生长的s.c.异种移植物的比率

图20-22表示裸鼠中MPL的体内试验。第一i.p.给药或根据最后的实验，口服给药治疗具有OVCAR-3肿瘤的小鼠。获得的结果表示给予的剂量且特别地50mg/kg剂量(i.p.和口服二者)在深刻阻滞这些动物中的肿瘤生长中的活性。肿瘤组织学表示肿瘤细胞死亡的巨大区域(图23)。

细胞增殖的抑制结合菌落形成的抑制，并且体内结果表示MPL的生长调节作用。表示MPL干扰伴随通过降低细胞周期调节蛋白A和E2连同它们的激酶cdk2和cdk4的表达的细胞周期进程。在正常细胞中，从一个阶段过渡至另一个阶段以通过各个蛋白质充分调节的有序方式发生。细胞周期素依赖性激酶(CDK)是在细胞周期的特定点激活的关键调节蛋白，因此在细胞周期进程中发挥关键作用。在周期的不同阶段这些需要不同的细胞周期素。细胞周期素A、D和E是细胞周期的G1和G1过渡至S阶段需要的。在目前识别的各个CDK中，CDK2和CDK4似乎对于进入G1和G1-S过渡是重要的。细胞周期素A和E结合CDK2，同时细胞周期素D结合CDK4和CDK6。癌症是认为是细胞周期阶段相关现象的几种疾病之一。

图20-22中提供的结果证实在抑制雌裸鼠中的s.c.肿瘤生长的MPL活性。初始试验表示i.p.MPL给药的剂量依赖性活性。25mg/kg剂量特别有效。在此基础上，在与之前相同的条件下使用25mg/kg和50mg/kg剂量进行下一试验。50mg/kg剂量在阻滞这些动物中的肿瘤生长中更有效。作为抗寄生虫试剂，证实MPL在许多动物模型中口服有效。测试50mg/kg和100mg/kg剂量的MPL的口服治疗活性。在所有三个中试试验中，在0.5％HPMC中制备MPL并以悬浮液形式给药。来自这些体内试验的肿瘤组织的检验表示具有MPL治疗的肿瘤中大量坏死的区域(图23)。

观察到的影响不局限于卵巢癌，如在表1和2中示出的，并且在代表各种癌症包括神经胶质瘤、前列腺癌、乳腺、间皮瘤、脂肪肉瘤、纤维肉瘤的许多细胞系中MPL有效抑制体外细胞增殖(参见表1和2)。

另一重要观察结构是MPL对耐化学性细胞系的活性。卵巢耐化学性细胞、神经胶质瘤替莫唑胺耐药性细胞和乳腺癌它莫西芬耐药性细胞都对MPL抗增殖作用敏感。

综上所述，结果表明在癌症细胞系中，MPL和潜在地它的代谢物和类似物(AAD)：

1-抑制细胞增殖；

2-MPL-诱导的抑制既不积极也不消极被使用烟碱激动剂或拮抗剂的预处理影响，表明作用方式不是烟碱受体介导的；

2-抑制菌落形成；

3-阻滞细胞周期[G1阶段]；

4-下调细胞-周期调节蛋白(CdK2、CdK4、细胞周期素A、细胞周期素E)；

5-阻止胸苷结合进入细胞，由此抑制DNA合成；

6-降低细胞ATP水平；

7-导致进行性自噬，如通过LC3B-I转化为LC3B-II确认的；

8-在卵巢癌和神经胶质瘤细胞系中自噬在显微镜下清楚；

9-MPL还诱导PARP-1的断裂，由此诱导细胞死亡；

10-这由体内数据确认，表示具有s.c.肿瘤的裸鼠中肿瘤的剂量依赖性抑制；

11-i.p.和口服给药途径是有效的。

此外，细胞的MPL抑制耐受一些标准化学疗法的增殖。

mTOR和自噬

本申请的另一方面是自噬在癌症中和在神经变性疾病中的作用。在具有导致神经变性的异常快速细胞凋亡的神经元细胞中，自噬充当保护神经元免受加速的细胞死亡的机制。

自噬，或细胞自我消化是与蛋白质和细胞器降解有关的细胞通路，具有惊人数量的与人疾病和生理学的联系。例如，自噬功能障碍与癌症、神经变性、微生物感染和老化有关。自相矛盾地，尽管自噬主要是细胞的保护方法，但它在癌症细胞的细胞死亡中也能发挥作用。

mTOR是自噬的主要负调节轴。mTOR和激活mTOR的那些通路的直接抑制剂随后诱导自噬。mTOR激酶反应于生长因子和营养素水平以调节细胞生长和自噬。mTOR的抑制导致自噬。自噬保护细胞免受导致神经变性的损伤。

自噬，细胞器和长寿蛋白质的主要降解通路对神经元的存活至关重要。越来越多的证据有关于在几种主要的神经变性疾病，特别是阿尔茨海默氏病(AD)的发病机理中的缺陷自噬。来自研究综述的发现表明自噬在疾病的早期阶段中改变，并且自噬的功能紊乱可在AD的病理学过程中发挥重要作用。

自噬保护细胞免受导致神经变性的损伤

神经变性疾病中的mTOR/自噬

阿尔茨海默氏病

认为Aβ和tau的积累是阿尔茨海默病的进行性认知缺陷的直接原因或促成阿尔茨海默病的进行性认知缺陷。已经证明，mTOR可能在Aβ和tau诱导的神经变性中发挥作用。

mTOR通路在控制蛋白质体内平衡中发挥重要作用，因此神经功能。确实，mTOR信号调节学习和记忆的不同形式。雷帕霉素挽救认知缺陷并且通过增加自噬改善Aβ和tau病理学。类似地，在AD的临床诊断中几种mTOR信号组分可能是认知损伤的潜在生物标记。因此，通过控制自噬-溶酶体蛋白质降解，预期mTOR-阶段相关的制剂(例如MPL)是AD的重要治疗剂。

亨廷顿舞蹈病

亨廷顿舞蹈病是由多聚谷氨酰胺束扩张引起的九种遗传性神经变性疾病之一。扩张的多聚谷氨酰胺蛋白在细胞内聚集体中异常累积。已经证明在细胞模型、转基因小鼠和人大脑中，mTOR在多聚谷氨酰胺聚集体中隔离。mTOR的隔离损害它的激酶活性并且诱导自噬，突变的亨廷顿片段的关键清除通路。这阻止多聚谷氨酰胺毒性，因为特异性mTOR抑制剂雷帕霉素减少亨廷顿蛋白累积和亨廷顿舞蹈病的细胞模型中的细胞死亡，并且自噬的抑制具有逆效应。

mTOR还与炎症、免疫抑制和神经变性疾病有关。

MPL对炎性通路NF-κB及其下游靶标的活性

转录因子NF-κB对于炎性介导的反应一直是受关注的，主要是因为几种介体和细胞因子导致该转录因子的激活。此外，NF-κB转录家族的激活通过它诱导促炎基因转录的能力在炎症中发挥核心作用。NF-κB的激活和炎症之间的联系已经在许多人疾病和疾病的动物模型中证实。此外，已经使用遗传方法或使用化学抑制剂确定NF-κB在介导炎症中的作用。

NF-κB以与抑制蛋白IκBα结合的惰性形式存在于胞液中。当被合适的细胞外信号刺激时，IκBα被IKK磷酸化，其导致IκBα的蛋白酶体-介导的降解。然后，NF-κB的活性复合物被释放并转位至细胞核以介导它的靶标基因的转录。IKK复合物通过自身磷酸化或通过被一系列反应于诸如脂多糖(LPS)、IL-1β、肿瘤坏死因子(TNF)-α和TGF-β的趋异刺激的细胞分裂素-激活的激酶(MAP3K)的磷酸化激活。

图27至32表示MPL对NF-κB信号转导通路的影响。LPS-刺激的RAW264.7细胞巨噬细胞用作炎症的体外模型系统。

观察到MPL减少这些细胞中的NF-κB激活，如通过免疫细胞化学和免疫印迹分析评价的。该影响可由磷酸化的抑制和NF-κBp65的核转位以及IKK和IкB-α的磷酸化的抑制确认。MPL的抑制作用还在IL-6、TGF-β以及一氧化氮(NO)的表达上观察到，其都是由NF-κB调节的炎性介体。

结果表示MPL抑制细胞机制，其在减少炎症中是重要的，并且表示MPL影响与癌症无关的重要病理途径。

结果清楚表示MPL抑制细胞机制，其对于反应于炎症是重要的并且表示MPL影响与癌症无关的重要病理途径。

讨论

基于前例TOR命名mTOR，即雷帕霉素的哺乳动物靶标所述前例TOR通过酿酒酵母的耐雷帕霉素的突变体的遗传和分子研究被最早发现，所述酿酒酵母识别FKBP12、Tor1和Tor2作为雷帕霉素的靶标并且提供FKBP12-雷帕霉素复合物结合并且抑制Tor1和Tor2的细胞功能的强力支持。

雷帕霉素阻止细胞周期的G1阶段的真菌活性。在大鼠中，它通过阻滞T淋巴细胞中的G1至S阶段过渡抑制免疫系统。在人类中，它用作器官移植后的免疫抑制剂。mTOR结合来自上游通路的输入，包括胰岛素、生长因子(例如IGF-I和IGF-2)和氨基酸。mTOR还查觉细胞营养素、氧气和能量水平。mTOR通路在诸如糖尿病、肥胖症、抑郁症和一些癌症的人疾病中调节异常。雷帕霉素是可通过结合它的细胞内受体FKBP12抑制mTOR的细菌产物。FKBP12-雷帕霉素复合物直接结合mTOR的FKBP12-雷帕霉素结合(FRB)结构域，抑制它的活性。

尽管在包括癌症的许多疾病中mTOR通路被确定为重要元素，但迄今仅雷帕霉素处于广泛的临床使用并且尽管它在90年代投放市场，但新mTOR产品限制临床使用。类似地，尽管雷帕霉素具有干扰mTOR通路的能力，但它仅适用于器官排斥的治疗。本发明识别了一类新的mTOR抑制剂，其以至mTOR通路的不同组分于雷帕霉素为靶向，由此打开了许多重大疾病的更广泛的治疗选择。

如在表1中示出的，还在HUVEC上测试MPL。发现IC50值高于OVCAR-3中的IC50值约10倍，其反映MPL对癌症比对非-癌症细胞的更高的细胞毒效力。

在菌落形成检验中，MPL以浓度依赖性方式抑制通过在琼脂板上生长的卵巢癌细胞系的菌落形成，因此进一步证实MPL抑制癌症细胞生长的功效。

此外，已经证明不论细胞的p53状态[OVCAR-3(突变的)、SKOV-3(零)和A2780(野生型)]，MPL均表现出它的抗癌作用(虽然在不同的效能下)。这表明不论它们的肿瘤p53状态，MPL在上皮卵巢癌中有效。该发现可能至关重要，因为p53突变在许多癌症中非常常见。

应当理解，通过MPL表示的效果可延伸至除了卵巢癌之外的其他类型的癌症。

哺乳动物细胞周期受Cdks的连续激活控制。通过G1阶段的进程和进入S阶段通过与细胞周期素A和细胞周期素E复合的Cdk2调节。因此，抑制这些调节蛋白的表达破坏细胞周期进程。

在MPL上细胞增殖和菌落形成的抑制是浓度依赖性的。MPL破坏细胞周期进程的可能机制是细胞周期调节蛋白E和A以及细胞周期素依赖性激酶Cdk4和Cdk2的下调，导致G1阻滞。由于G1阻滞，细胞不进展至周期的下一个阶段，如通过S和G2-M阶段中细胞随时间的显著减少证实的。载体治疗组的G2-M阶段中细胞的百分比比使用25μMMPL治疗的组中的那些高三倍。

此外，使用MPL治疗的癌症细胞系中的自噬证据显著表明细胞通过G0阶段细胞周期阻滞不可逆地离开细胞周期。

进一步讨论

累积证据支持假设mTOR充当细胞分解代谢和合成代谢的‘总开关’、信号细胞膨胀、生长和增殖。尽管在几乎所有哺乳动物细胞中发现它，但它在侵犯性增殖和侵入的肿瘤细胞中特别重要。

靶向细胞信号通路的治疗表现出在实体瘤和血液恶性肿瘤的控制中的前景。证实mTOR为在磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)的激活的下游起作用的关键激酶。

目前，开发特异性抑制mTOR的试剂作为潜在抗肿瘤药物。

mTOR抑制剂通过诱导G1阶段阻滞本质上中断细胞周期进程。雷帕霉素是原型mTOR抑制剂。

mTOR生物学提供了mTOR在各个癌症中的作用的洞察。活性mTOR通过产生营养素转运蛋白并且还通过促进血管生成直接通过它对细胞周期调节器的影响和间接通过维持营养素供应至细胞协调细胞生长的反应。mTOR对细胞增殖发挥它的调节作用的主要方式是通过控制细胞周期素D1的产生。mTOR提供足够的营养素支持以维持异常细胞生长和增殖。主要在许多癌症中解除对mTOR通路的控制，期望mTOR抑制剂发挥显著的抗癌治疗作用。

替代(surrogate)分子标记可用于监测诸如雷帕霉素衍生物的mTOR抑制剂的生物效应和减少患者中的生物活性剂量。这些可包括细胞周期素D1、细胞周期素E的表达、P70S6K的磷酸化或半胱天冬酶3和c-Myc的表达。细胞周期素D1是原癌基因，它的基因扩增和蛋白质过度表达在肿瘤细胞中经常观察到。细胞周期素D1诱导细胞周期从G1发展至S。

已经证实，MPL阻滞G1阶段的细胞周期进程。根据本发明，数据从表示显著下调的细胞周期素D1的具有MPL治疗的肿瘤的小鼠中提供。此外，在MPL治疗的肿瘤中还抑制细胞周期素E，即mTOR信号通路和细胞周期进程的另一重要中间体的肿瘤表达。称为G1细胞周期素的细胞周期素D和E分别结合CDK4和CDK2，并且促进从G1至S阶段的过渡。卵巢癌细胞中细胞周期素D1的损失足以诱导G1细胞周期阻滞并且该策略不受细胞周期素E2的存在阻碍。甚至证实，细胞周期素D1是卵巢癌细胞中的充分治疗靶标。充分确定，c-Myc在包括结合细胞周期素D1的细胞周期素依赖性激酶4和6的多个点影响细胞周期并且降低细胞周期素E-Cdk2的激活量级。

解除控制原癌基因c-MYC表达在广泛的人癌症中发生并且常与不良预后有关，表明该致癌基因通过调节细胞增殖、生长和细胞凋亡的转录因子在肿瘤进展中的关键作用。c-Myc的调节异常的表达或功能是人恶性肿瘤中最常见的异常之一。在本发明中，研究表明MPL在这些细胞周期转运(G1至S)介体，即细胞周期素D1和c-Myc二者上起作用。

mTOR激酶通过p70核糖体S6激酶(p70S6K)的激活和eIF-4E结合蛋白质(4E-BP1)的抑制控制反应于氨基酸和生长因子的转移装置。

作为mTOR的重要下游效应器，S6K参与几种细胞过程，包括介导细胞生长和代谢的蛋白质的转录和转译。在此基础上，mTOR–S6K提供了特定信号(生长因子、营养素和激素)转译为细胞反应的关键轴。通过mTOR的p70的磷酸化对于核糖体生物合成也是关键的。

图9至11表示的结果证实mTOR激活的MPL-诱导的抑制导致p-mTOR、c-Myc[致癌基因]、细胞周期素D1、细胞周期素E2、细胞周期素依赖性激酶2和4[细胞周期进程必需的]和p-P70S6K的下调。

概括地说，本发明表明MPL通过mTOR通路产生自噬并且特别地抑制p-P70S6K(Thr389)，其为已知调节血管生成和自噬的mTOR信号通路的下游部分。

本发明还表明MPL抑制细胞周期素D1，其为细胞周期进程必需的并且在许多重度癌症中过度表达。已经证实P70S6K下调通过其他以抑制磷酸化，由此抑制细胞周期素D1活性，其适合本发明的发现。P70S6K还调节PDCD4、粘着斑激酶、E钙粘蛋白、B连环蛋白和组织转谷氨酰胺酶2，其在转移和侵入中是重要的。

本发明的MPL/自噬作用表示MPL和类似的AAD的适用于治疗其中自噬缺乏的疾病，例如中风、神经变性疾病、α1抗胰蛋白酶缺乏症、溶酶体贮积症、心肌病、免疫疾病和自身免疫疾病、细菌性和病毒性感染、寄生虫、血脂紊乱和甚至老化。其他实例包括阿尔茨海默氏病、亨廷顿舞蹈病、与年龄有关的疾病、与移植排斥有关的疾病、慢性炎性疾病、与糖原贮积有关的疾病、肿瘤转移、系统性红斑狼疮、与炎症和免疫激活有关的疾病、贫血症、白细胞减少症、血小板减少症、与支架涂层有关的疾病、肾功能不全、肥胖症、糖尿病/胰岛素耐受性、与非酒精性脂肪肝有关的疾病、多囊肾、帕金森氏病和纤维化。

本发明清楚地表明MPL产生自噬(通过mTOR通路)，因此除了用于癌症之外，其可能是有用的治疗。

Claims

1.式(I)的化合物在制备用于治疗一种或多种mTOR通路相关的疾病的药物中的用途：

其中所述式(I)的化合物选自下列化合物中的任一个：

其中各个上述化合物为(R)-或(S)-对映异构体，或其外消旋体，或药物可接受的盐、溶剂化物或前药。

2.如权利要求1所述的用途，其中所述式(I)的化合物选自以下化合物：

或其药物可接受的盐、溶剂化物或前药。

3.如权利要求1或2所述的用途，其中所述一种或多种mTOR通路相关的疾病选自阿尔茨海默氏病、亨廷顿舞蹈病、与年龄相关的疾病、与移植排斥相关的疾病、慢性炎性疾病、与糖原贮积相关的疾病、癌症、转移、系统性红斑狼疮、与炎症和免疫激活相关的疾病、贫血症、白细胞减少症、血小板减少症、与支架涂层相关的疾病、肾功能不全、肥胖症、糖尿病/胰岛素耐受性、与非酒精性脂肪肝相关的疾病、多囊肾、帕金森氏病和纤维化。

4.如权利要求3所述的用途，其中所述mTOR通路相关的疾病为慢性炎性疾病。

5.如权利要求4所述的用途，其中所述慢性炎性疾病为类风湿性关节炎或移植后器官排斥。

6.如权利要求3所述的用途，其中所述纤维化为肝纤维化、心肌纤维化或肺纤维化。

7.如权利要求3所述的用途，其中所述疾病为癌症或肿瘤转移。

8.如权利要求7所述的用途，其中所述癌症与激酶有关。

9.如权利要求8所述的用途，其中所述激酶为细胞周期素依赖性激酶。

10.如权利要求9所述的用途，其中所述细胞周期素依赖性激酶为cdk2或cdk4。

11.如权利要求10所述的用途，其中所述癌症选自下列：癌，包括膀胱癌、乳腺癌、结肠癌、间皮瘤、肾癌、肝癌、包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌的肺癌、头颈癌、食道癌、胆囊癌、卵巢癌、胰腺癌、胃癌、子宫颈癌、甲状腺癌、前列腺癌和包括鳞状细胞癌的皮肤癌；淋巴系统的造血肿瘤，包括白血病、急性淋巴性白血病、急性淋巴母细胞性白血病、B-细胞淋巴瘤、T-细胞淋巴瘤、霍奇金氏淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、毛细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、骨髓瘤和伯基特氏淋巴瘤；髓系造血肿瘤，包括急性和慢性髓细胞性白血病、骨髓增生异常综合症和早幼粒细胞白血病；间叶细胞源肿瘤包括纤维肉瘤和横纹肌肉瘤；中枢和外周神经系统的肿瘤，包括星形细胞瘤、成神经细胞瘤、神经胶质瘤和神经鞘瘤；以及其他肿瘤包括黑素瘤、精原细胞瘤、畸胎癌、骨肉瘤、着色性干皮病、角化棘皮瘤、甲状腺滤泡癌症和卡波西氏肉瘤。

12.如权利要求11所述的用途，其中所述癌症选自卵巢癌、乳腺癌、前列腺癌或间皮瘤。

13.如权利要求12所述的用途，其中所述疾病为卵巢癌。

14.如权利要求1或2所述的用途，其中所述疾病不是癌症。

15.如权利要求14所述的用途，其中所述一种或多种mTOR通路相关的疾病选自阿尔茨海默氏病、亨廷顿舞蹈病、与年龄相关的疾病、与移植排斥相关的疾病、慢性炎性疾病、与糖原贮积相关的疾病、系统性红斑狼疮、与炎症和免疫激活相关的疾病、贫血症、白细胞减少症、血小板减少症、与支架涂层相关的疾病、肾功能不全、肥胖症、糖尿病/胰岛素耐受性、与非酒精性脂肪肝相关的疾病、多囊肾、帕金森氏病和纤维化。