CN113577086B - 异戊酰螺旋霉素类化合物或其组合物在制备治疗免疫失调的药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于药物应用领域，具体地说，本发明提供了异戊酰螺旋霉素类化合物或其组合物在制备治疗免疫失调相关疾病的药物中的应用。异戊酰螺旋霉素化合物选自异戊酰螺旋霉素Ⅰ或其衍生物、异戊酰螺旋霉素Ⅱ或其衍生物、异戊酰螺旋霉素Ⅲ或其衍生物；异戊酰螺旋霉素组合物选自异戊酰螺旋霉素Ⅰ或其衍生物、异戊酰螺旋霉素Ⅱ或其衍生物、异戊酰螺旋霉素Ⅲ或其衍生物中两种或两种以上的组合，或者可利霉素。本发明的异戊酰螺旋霉素化合物或其组合物可以作为免疫调节剂，改善机体的免疫能力，对多种免疫失调相关的疾病、哮喘、炎症具有疗效，具有社会意义。

Description

异戊酰螺旋霉素类化合物或其组合物在制备治疗免疫失调的药物中的应用

技术领域

本发明属于药物领域，具体地说，涉及异戊酰螺旋霉素类化合物或其组合物在制备治疗免疫失调的药物中的应用。

背景技术

免疫调节是指机体识别和排除抗原性异物，维持自身生理动态平衡与相对稳定的生理功能。免疫调节是指免疫系统中的免疫细胞和免疫分子之间，以及与其它系统如神经内分泌系统之间的相互作用，使得免疫应答以最恰当的形式使机体维持在最适当的水平。免疫调节是依靠免疫系统(Immunesystem)来实现的。

免疫是机体的一种排斥反应，受到很多基因、蛋白质以及细胞的作用。免疫失调会引起许多疾病，包括变态反应(过敏、免疫复合物型、迟发型免疫病、细胞毒型免疫病)、免疫缺陷(AIDS等)以及免疫系统受损等。

肿瘤患者由于均存在免疫缺陷，肿瘤的化学疗法和放射疗法又常进一步加重这种免疫缺陷，降低了患者的抗肿瘤和抗感染免疫能力。应用免疫调节剂的肿瘤免疫疗法应能提高患者的免疫功能，防止化疗和放疗对免疫系统的损仿，增强化疗，放疗和手术疗法的疗效。随着免疫调节剂和肿瘤免疫疗珐的不断发展，并用免疫疗法的免疫化疗，免疫放疗等将成为肿瘤治疗的标准形式。

可利霉素(Carrimycin)，又称必特螺旋霉素(Bitespiramycin)、生技霉素(Shengjimycin)是由中国医科院生物技术研究所与本申请人合作，通过转基因技术将碳霉素产生菌的4”异戊酰基转移酶基团(4”-o-acyl-transferase)克隆至螺旋霉素产生菌中，定向酰化螺旋霉素4”-OH，在4”位加入异戊酰基侧链所形成的以4”位异戊酰基螺旋霉素为主要组分的新型抗生素。

可利霉素是由多种螺旋霉素衍生物组成，主要活性成分异戊酰螺旋霉素(I+II+III)总含量不低于60％，酰化螺旋霉素的总含量不低于80％，于药学上是一种可接受的药物组合物。中心结构为16元内酯环，与一分子福洛胺糖、一分子碳霉胺糖和一分子碳霉糖连接而成，其主要成分异戊酰螺旋霉素I、II、III与螺旋霉素结构不同之处在于碳霉糖4”位上连接的基团为异戊酰基而不是羟基。可利霉素主成分的结构示意图如式(1)所示，不代表构象；共包含十余种组分。目前可利霉素成品组成标准为异戊酰螺旋霉素III≥30％，异戊酰螺旋霉素I、II、III的比例总和≥60％，总酰化螺旋霉素的比例≥80％，其它未知组分的总和≤5％。

其中，当R＝H，R′＝COCH₂CH(CH₃)₂时为异戊酰螺旋霉素Ⅰ；当R＝COCH₃，R′＝COCH₂CH(CH₃)₂时为异戊酰螺旋霉素Ⅱ；当R＝COCH₂CH₃，R′＝COCH₂CH(CH₃)₂时为异戊酰螺旋霉素Ⅲ。

可利霉素属于16元大环内酯类抗生素，具有活性基团羧基、烷氧基、环氧基、酮基和醛基以及一对共轭的C＝C，分子量约为884～982。可利霉素易溶于酯类、丙酮、氯仿、醇类等大多数有机溶剂，微溶于石油醚，难溶于水；分子结构中含有两个二甲胺基而呈弱碱性，易溶于酸性水溶液；具有溶解度随温度的升高而降低的“负溶解度”质。

初步体内外药效学试验表明，该药不仅对多数G⁺菌有较好抗菌活性，对部分G^-菌也有一定作用，各项技术指标明显优于阿奇霉素、红霉素、乙酰螺旋霉素、麦迪霉素，尤其对肺炎支原体的抗菌活性最强，对红霉素耐药菌、淋球菌、肺炎球菌、金葡菌、绿脓假单胞菌、流感杆菌、流感嗜血杆菌、脆弱拟杆菌、军团菌、多行杆菌和产气荚膜梭菌也有一定抗菌活性，对临床耐红霉素的金葡球菌仅有极少交叉耐药性。可利霉素将主要用于治疗革兰氏阳性菌感染性疾病，尤其是上呼吸道感染，并可能用于泌尿系统感染等。

目前还没有可利霉素用于调节免疫的具体报道，也没有可利霉素在抗感染和肿瘤方面通过免疫调节机制产生作用的报道。

有鉴于此特提出本发明。

发明内容

本发明要解决的技术问题在于克服现有技术的不足，提供异戊酰螺旋霉素化合物或其组合物在制备治疗免疫失调相关疾病的药物中的应用，能够改善机体的免疫能力，具有重要的经济效益和社会效益。

为解决上述技术问题，本发明采用技术方案的基本构思是：

本发明的第一目的是提供异戊酰螺旋霉素化合物或其组合物在制备治疗免疫失调相关疾病的药物中的应用。

本发明中异戊酰螺旋霉素类化合物选自异戊酰螺旋霉素Ⅰ或其衍生物、异戊酰螺旋霉素Ⅱ或其衍生物、异戊酰螺旋霉素Ⅲ或其衍生物；异戊酰螺旋霉素组合物选自异戊酰螺旋霉素Ⅰ或其衍生物、异戊酰螺旋霉素Ⅱ或其衍生物、异戊酰螺旋霉素Ⅲ或其衍生物中两种或两种以上的组合，或者可利霉素。

进一步的方案，异戊酰螺旋霉素类化合物或其组合物使至少一种免疫细胞对抗病原体、癌细胞、异常或突变细胞的活性增强；和/或促进免疫活性成分的产生。

免疫细胞是指参与免疫应答或与免疫应答相关的细胞，包括淋巴细胞、树突状细胞、单核/巨噬细胞、粒细胞、肥大细胞等。免疫细胞可以分为多种，在人体中各种免疫细胞担任着重要的角色。免疫细胞(immunecell)俗称白细胞，包括先天性淋巴细胞、各种吞噬细胞和能识别抗原、产生特异性免疫应答的淋巴细胞等。淋巴细胞是免疫反应的核心。根据淋巴细胞的发生来源、形态结构、表面标志和免疫功能等方面的不同，可分为T细胞、B细胞和NK细胞三类。T淋巴细胞随血循环到胸腺，在胸腺激素等的作用下成熟，而B细胞在骨髓中分化成熟。当受抗原刺激后，T淋巴细胞即转化为淋巴母细胞，再分化为致敏T淋巴细胞，参与细胞免疫，其免疫功能主要是抗胞内感染、瘤细胞与异体细胞等；而B淋巴细胞是先转化为浆母细胞，再分化为浆细胞，产生并分泌免疫球蛋白(抗体)，参与体液免疫，其功能是产生抗体，提呈抗原，以及分泌细胞内因子参与免疫调节；NK细胞不依赖抗原刺激而自发地发挥细胞毒效应，具有杀伤靶细胞的作用。

优选的，异戊酰螺旋霉素类化合物或其组合物使巨噬细胞的吞噬作用增强；

优选的，异戊酰螺旋霉素类化合物或其组合物使T淋巴细胞对抗癌细胞的活性增强。

进一步的方案，异戊酰螺旋霉素类化合物或其组合物促进免疫细胞增殖分化，改变免疫细胞亚群的比例；

优选的，异戊酰螺旋霉素类化合物或其组合物诱导M2型巨噬细胞向M1型巨噬细胞转化；抑制M2型巨噬细胞，提高M1型巨噬细胞比例。

进一步的方案，异戊酰螺旋霉素类化合物或其组合物促进免疫细胞向炎症部位迁移；

优选的，异戊酰螺旋霉素类化合物或其组合物促进中性粒细胞向炎症部位迁移。

进一步的方案，免疫失调相关疾病包括免疫功能低下或缺乏导致的疾病、免疫功能异常亢进导致的疾病、免疫紊乱导致的疾病、免疫监控功能失调导致的疾病；

优选的，免疫功能低下或缺乏导致的疾病包括感冒、咳嗽、咽炎、胃炎、肠炎、肺炎、支气管炎、肺结核、鼻炎、中耳炎、肝炎、癌症、乳腺炎、皮肤感染、肾炎性功能类疾病、艾滋病、上呼吸道感染、单棱细胞缺乏症；

优选的，免疫功能异常亢进导致的疾病包括花粉过敏、过敏性皮炎、麻疹、哮喘、顽固性头痛、牙痛、红眼病、青春痘、便秘及高血压、高血脂、心脏病、中风；

优选的，免疫紊乱导致的疾病包括红斑狼疮、皮肌炎、风湿及类风湿病、恶性贫血、、再生不良性贫血、重肌无力、牛皮癣、鱼鳞病、白塞氏病及糖尿病；

优选的，免疫监控功能失调导致的疾病包括癌症和肿瘤；癌症和肿瘤包括淋巴系统的造血肿瘤、白血病、髓系造血肿瘤、间叶细胞源肿瘤、中枢和外周神经系统的肿瘤、黑素瘤、精原细胞瘤、畸胎癌、骨肉瘤、着色性干皮病、角化棘皮瘤、甲状腺滤泡癌症和卡波西氏肉瘤、膀胱癌、乳腺癌、结肠癌、间皮瘤、肾癌、肝癌、肺癌、头颈癌、食道癌、胆囊癌、卵巢癌、胰腺癌、胃癌、淋巴癌、宫颈癌、结肠癌、甲状腺癌、前列腺癌、皮肤癌、口腔癌。

本申请的第二目的是提供异戊酰螺旋霉素类化合物或其组合物在制备治疗哮喘的药物中的应用；

优选的，在制备治疗诱导性哮喘药物中的应用。

优选的，异戊酰螺旋霉素类化合物或其组合物抑制气道杯状细胞增生；

优选的，异戊酰螺旋霉素类化合物或其组合物抑制Muc5ac黏蛋白的表达。

本申请的第三目的是提供异戊酰螺旋霉素类化合物或其组合物在制备治疗炎症的药物中的应用。

优选的，异戊酰螺旋霉素类化合物或其组合物抑制炎症细胞因子IL-6的产生；

优选的，异戊酰螺旋霉素类化合物或其组合物抑制细胞中NO的产生；

优选的，异戊酰螺旋霉素类化合物或其组合物抑制细胞中IL-4因子和/或IL-1β因子的产生。

本申请的第四目的是提供一种免疫调节剂，包括异戊酰螺旋霉素Ⅰ或其衍生物、异戊酰螺旋霉素Ⅱ或其衍生物、异戊酰螺旋霉素Ⅲ或其衍生物中的至少一种，或者可利霉素。

本申请的第五目的是提供一种治疗免疫失调相关疾病的药物组合物，包括异戊酰螺旋霉素Ⅰ或其衍生物、异戊酰螺旋霉素Ⅱ或其衍生物、异戊酰螺旋霉素Ⅲ或其衍生物中的至少一种，或者可利霉素作为第一药物活性成分，以及药学上可接受的载体。

本申请的第六目的是提供一种治疗免疫失调相关疾病的药物组合物，包括异戊酰螺旋霉素Ⅰ或其衍生物、异戊酰螺旋霉素Ⅱ或其衍生物、异戊酰螺旋霉素Ⅲ或其衍生物中的至少一种，或者可利霉素作为第一药物活性成分，以及第二药物活性成分，所述的第二药物活性成分选自用于治疗免疫失调的相关药物；

优选的，第一药物活性成分和第二药物活性成分为单独制剂，或者是复配为一种制剂。

第二药物活性成分可以选自干扰素，卡介苗多糖核酸，胸腺肽、短棒杆菌、香菇多糖、茯苓多糖类、灵芝多糖粪、银耳多糖、裂褶菌多糖、酵母多糖、干扰素、白细胞介素-2、转移因子、左旋咪唑、异丙肌苷、羟壬嘌呤、：人参参皂甙、黄芪多糖、枸杞多培、淫羊藿多糖、白芍总甙及某些复方中药制剂等、二乙胺基二硫代甲酸钠、聚肌尿苷酸、聚肌胞苷酸、泰洛龙、羧胺氰丙啶、顺丁烯二酐乙烯醚等。

采用上述技术方案后，本发明与现有技术相比具有以下有益效果：

1、本发明中，戊酰螺旋霉素Ⅰ或其衍生物、异戊酰螺旋霉素Ⅱ或其衍生物、异戊酰螺旋霉素Ⅲ或其衍生物、可利霉素中的至少一种具有治疗免疫失调相关疾病的用途，使巨噬细胞的吞噬作用增强；使T淋巴细胞对抗癌细胞的活性增强；可以诱导M2型巨噬细胞向M1型巨噬细胞转化；抑制M2型巨噬细胞，提高M1型巨噬细胞比例；能够促进免疫细胞向炎症部位迁移。

2、本申请的异戊酰螺旋霉素类化合物或其组合物对肿瘤的免疫治疗具有疗效，30余名肿瘤患者试用反馈：炎症病灶减轻，疼痛减轻或消失，水肿消失，体温恢复正常，咳喘症状明显减轻等；涉及肿瘤包括脑胶质瘤，胰腺癌，结肠癌，非小细胞肺癌，乳腺癌，宫颈癌等。

3、本申请中，在经典的OVA诱导的哮喘模型中，可利霉素可以显著缓解小鼠的哮喘症状，抑制小鼠气道杯状细胞增生和Muc5ac黏蛋白的表达。结果提示可利霉素具有潜在治疗哮喘的可能；结合可利霉素杀菌优势，对细菌感染合并哮喘的病人选用可利霉素可能取得较好的临床治疗效果。

4、本申请中，戊酰螺旋霉素Ⅰ或其衍生物、异戊酰螺旋霉素Ⅱ或其衍生物、异戊酰螺旋霉素Ⅲ或其衍生物、可利霉素中的至少一种具有治疗炎症的作用，可以抑制炎症细胞因子IL-6的产生，抑制细胞中NO的产生，抑制细胞中IL-4因子和/或IL-1β因子的产生。

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的描述。

附图说明

附图作为本发明的一部分，用来提供对本发明的进一步的理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，但不构成对本发明的不当限定。显然，下面描述中的附图仅仅是一些实施例，对于本领域普通技术人员来说，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他附图。在附图中：

图1为实验例2中可利霉素对巨噬细胞吞噬鸡红细胞能力的评估中的对照组；

图2为实验例2中可利霉素对巨噬细胞吞噬鸡红细胞能力的评估中的可利霉素组；

图3为实验例2中可利霉素对巨噬细胞吞噬鸡红细胞能力的评估中的伊曲康唑组；

图4为实验例3中小鼠腹腔细胞细胞流式分群图；

图5为第一批C57BL/6鼠连续灌胃三天，50mg/kg，构建腹腔炎症模型，腹腔中性粒细胞(Gr-1和CD11b双阳细胞)检测结果；

图6为第一批C57BL/6鼠连续灌胃七天，50mg/kg，构建腹腔炎症模型，腹腔中性粒细胞(Gr-1和CD11b双阳细胞)检测结果；

图7为第二批C57BL/6鼠连续灌胃三天，50mg/kg，构建腹腔炎症模型，腹腔中性粒细胞(Gr-1和CD11b双阳细胞)检测结果；

图8为第二批C57BL/6鼠连续灌胃三天，50mg/kg，构建腹腔炎症模型，外周血中CD4+和CD8+细胞比例的检测结果；

图9是图8中外周血中CD4+/CD3+和CD8+/CD3+细胞比例的柱状图；

图10为第二批C57BL/6鼠连续灌胃三天，50mg/kg，构建腹腔炎症模型，外周血中CD3+细胞比例的检测结果；

图11是图10中外周血中CD3+细胞比例的柱状图；

图12为小鼠的皮下瘤按照分组从大到小排列采集照片；

图13为瘤重的散点图并进行统计学检验(与对照组相比)，*P<0.05。

图14为RAW细胞先加药物作用1h，再诱导其往M1型分化，检测TNF-α的水平；

图15是RAW细胞先加药物作用1h，再诱导其往M1型分化，检测iNOS的水平；

图14和15中，NC(RAW细胞，不做任何处理)；PC1(RAW细胞加LPS+INF-γ，诱导RAW细胞分化为M1型巨噬细胞)；Keli(RAW细胞先加可利霉素，再加LPS+INF-γ)；Yiqu(RAW细胞先加伊曲康唑，再加LPS+INF-γ)；并进行统计学检验，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

图16是RAW细胞先加药物作用1h，再诱导其往M2型分化，检测Arg-1的水平；图注：NC(RAW细胞，不做任何处理)；PC2(RAW细胞加IL-4，诱导RAW细胞分化为M2型巨噬细胞)；Keli(RAW细胞先加可利霉素，再加IL-4)；Yiqu(RAW细胞先加伊曲康唑，再加IL-4)；并进行统计学检验，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

图17先加细胞因子诱导RAW细胞分化为M1型巨噬细胞，再加相应地药物，检测TNF-α的表达；

图18先加细胞因子诱导RAW细胞分化为M1型巨噬细胞，再加相应地药物，检测iNOS的表达；

图19先加细胞因子诱导RAW细胞分化为M2型巨噬细胞，再加相应地药物，检测Arg-1的表达；

图17-19中，NC(RAW细胞，不做任何处理)；PC1(RAW细胞加LPS+INF-γ，诱导RAW细胞分化为M1型巨噬细胞)；PC2(RAW细胞加IL-4，诱导RAW细胞分化为M2型巨噬细胞)；Keli((RAW细胞先加LPS+INF-γ，诱导RAW细胞分化为M1型巨噬细胞，再加可利霉素)；Yiqu(RAW细胞先加LPS+INF-γ，诱导RAW细胞分化为M1型巨噬细胞，再加伊曲康唑)；并进行统计学检验，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

图20先加细胞因子诱导RAW细胞分化为M2型巨噬细胞，再加相应地药物，检测TNF-α的表达

图21先加细胞因子诱导RAW细胞分化为M2型巨噬细胞，再加相应地药物，检测iNOS的表达

图22先加细胞因子诱导RAW细胞分化为M2型巨噬细胞，再加相应地药物，检测Arg-1的表达

图20-22中：NC(RAW细胞，不做任何处理)；PC1(RAW细胞加IL-4，诱导RAW细胞分化为M2型巨噬细胞)；PC2(RAW细胞加IL-4，诱导RAW细胞分化为M2型巨噬细胞)；Keli((RAW细胞先加IL-4，诱导RAW细胞分化为M2型巨噬细胞，再加可利霉素)；Yiqu(RAW细胞先加IL-4，诱导RAW细胞分化为M2型巨噬细胞，再加伊曲康唑)；并进行统计学检验，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

图23-24是实验例7中安慰剂组的小鼠气道上皮杯状细胞示意图；

图25-26是实验例7中可利霉素治疗组的小鼠气道上皮杯状细胞示意图；

图27-28是实验例7中健康对照组的小鼠气道上皮杯状细胞示意图；

图29是实验例8中ISP I及LPS对BV2细胞活力的影响结果；其中A为ISP I对BV2细胞活力的作用结果，B为LPS对BV2细胞活力的作用结果；

图30是实验例8中ISP I及LPS对BV2细胞中NO产生量的影响。

图31是实验例8中ISP I及LPS对BV2细胞中IL-6的影响结果。

需要说明的是，这些附图和文字描述并不旨在以任何方式限制本发明的构思范围，而是通过参考特定实施例为本领域技术人员说明本发明的概念。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1、异戊酰螺旋霉素I或异戊酰螺旋霉素II或异戊酰螺旋霉素III或可利霉素片

规格：200mg/350mg

片芯处方：

制备工艺：

片芯的制备：主药和辅料分别过100目筛，将处方量异戊酰螺旋霉素I或异戊酰螺旋霉素II或异戊酰螺旋霉素III、微晶纤维素与1/2处方量的羧甲淀粉钠混合均匀，然后加入5％聚维酮K₃₀水溶液制软材，以18目筛制粒，湿颗粒在60℃通风条件下干燥2h；干燥后以18目筛整粒，再加入1/2处方量的处方量羧甲淀粉钠与硬脂酸镁混合均匀后，用直径11mm的浅凹冲模压片，制得片重350mg、硬度6.5kg的含药片芯。

包衣液的配制：称好所需的欧巴代II(白色)在配液容器中加入所需量的水，分次加入，待全部加入后，降低搅拌速度，使蜗旋消失，继续搅拌30min，即得。

薄膜包衣片的制备：将片芯置包衣锅内，确定包衣条件，主机速度为20r/min，进风温度40℃，出风温度30℃，喷雾压力0.02Mpa，喷浆流量为1ml/min进行包衣，恒定后持续喷包1.5h，至片粒表面光滑、色泽均匀，符合薄膜衣检验标准为合格。包衣增重5％左右。

实施例2、异戊酰螺旋霉素I或异戊酰螺旋霉素II或异戊酰螺旋霉素III素片(按10000片计算)

处方：

异戊酰螺旋霉素I或异戊酰螺旋霉素II或异戊酰螺旋霉素III原粉1000g

低取代羟丙基纤维素(5％)92.5g

羧甲基淀粉钠(3％)55.5g

硬脂酸镁(1％)18.5g

淀粉总重-其它原辅料重量

总重1850g

制备工艺：称取适量淀粉，稀释至15％浓度，加热至糊状，制成粘合剂；主料异戊酰螺旋霉素I或异戊酰螺旋霉素II或异戊酰螺旋霉素III、辅料淀粉、低取代羟丙基纤维素、羧甲基淀粉钠、硬脂酸镁分别过100目筛，按处方量，称取所需主料和辅料；异戊酰螺旋霉素I、淀粉、低取代羟丙基纤维素充分混合均匀后，用15％淀粉浓度的淀粉糊制成软材，14目筛制粒，50-60℃干燥，水份控制在3-5％，14目筛整粒，加羧甲基淀粉钠，硬脂酸镁混合，测定颗粒含量；根据颗粒含量，计算片重，压片(Φ9mm浅凹冲头)，检测片重差异；经检验合格后进行包装。

实施例3、异戊酰螺旋霉素I或异戊酰螺旋霉素II或异戊酰螺旋霉素III胶囊剂(按10000粒计算)

处方：

异戊酰螺旋霉素I或异戊酰螺旋霉素II或异戊酰螺旋霉素III原粉1000g

淀粉1080-异戊酰螺旋霉素I原粉重量

药用3号胶囊1000粒

液体石蜡50ml

制备工艺：将主料异戊酰螺旋霉素I或异戊酰螺旋霉素II或异戊酰螺旋霉素III、辅料药用淀粉按工艺配方量分别称取后，装入混合器充分混合后1.5-2小时；取样检测含量所得数据应和理论数据基本一致(每粒胶囊所装重量约为0.105g)，将经检验合格的药用3号胶囊及混合好的待装原料按全自动胶囊机操作要求，分别填入装料器进行填充，将填充好的胶囊进行差异检验(±10％以内，＜0.3g)，溶出度符合要求，将检验后符合要求的胶囊，放入打光机内加入液体石蜡进行15-20分钟的打光，然后取出进行成品包装盒检验。

实施例4、异戊酰螺旋霉素I或异戊酰螺旋霉素II或异戊酰螺旋霉素III干糖浆(按10000袋计算)

处方：

异戊酰螺旋霉素I或异戊酰螺旋霉素II或异戊酰螺旋霉素III原粉1250g

柠檬酸(0.5％)15g

蔗糖总重-其它原辅料

总重约5000g

色素(姜黄素)约1g

制备工艺：异戊酰螺旋霉素I或异戊酰螺旋霉素II或异戊酰螺旋霉素III原粉，柠檬酸、蔗糖分别用高速气流粉碎机粉碎成颗粒85％通过300目，15％通过180目，然后将粉碎后的细粉按处方量称取后充分混合1-1.5小时，测其含量，计算装量(理论装量为每袋500mg)，然后将混合物装入袋装机中，装好铝箔纸，按分装机操作要求分装，装量差异在±5％以内，装好后进行检验合格后外包装。

实施例5、异戊酰螺旋霉素I或异戊酰螺旋霉素II或异戊酰螺旋霉素III颗粒剂(按10000袋计算)

处方：

异戊酰螺旋霉素I或异戊酰螺旋霉素II或异戊酰螺旋霉素III原粉1250g

糖粉20000g

糊精9000g

5％PVP-K₃₀适量

制备工艺：异戊酰螺旋霉素I或异戊酰螺旋霉素II或异戊酰螺旋霉素III原粉、糖粉、糊精过120目筛，按处方量称取异戊酰螺旋霉素I、糖粉、糊精混合均匀，将混合均匀的上述物料用5％PVP-K₃₀胶浆制成软材，摇摆式颗粒剂制粒70℃干燥、整粒，送检合格后分装。

实施例6、异戊酰螺旋霉素I或异戊酰螺旋霉素II或异戊酰螺旋霉素III冻干粉针剂

称取异戊酰螺旋霉素I或异戊酰螺旋霉素II或异戊酰螺旋霉素III原粉500mg与等摩尔的己二酸混合均匀后溶解于5ml水中，得到淡黄色澄明溶液，pH在4.6-5.6之间。再加入甘露醇40mg作为冻干支撑剂，低温快速冷冻9h后，冷冻干燥，获得淡黄色疏松块状物，使用前用10ml无菌水溶解。

实施例7、可利霉素冻干粉针剂

称取可利霉素500mg，与等摩尔的己二酸混合均匀后溶解于5ml水中，得到淡黄色澄明溶液，pH在4.6-5.6之间。再加入甘露醇40mg作为冻干支撑剂，低温快速冷冻9h后，冷冻干燥，获得淡黄色疏松块状物，使用前用10ml无菌水溶解。

实验例1：可利霉素治疗后的小鼠血常规检测

实验目的：评估长期使用可利霉素对小鼠的毒副作用。通过检测实验小鼠血常规参数验证长期使用可利霉素对小鼠的毒副作用。

试剂：生理盐水，吐温80，PEG400等；耗材：EDTA抗凝管，镊子等。

实验小鼠：品系:Balb/c，周龄:8-12，来源：成都达硕实验动物有限公司，数量：每组各2只小鼠。

实验步骤：(1)分组及治疗：a)生理盐水组：与实验组相同体积，p.o.；b)可利霉素组：50mg/kg，p.o.；c)伊曲康唑组：50mg/kg，p.o.；d)连续给药五天；(2)小鼠摘眼球取血，到EDTA抗凝管里，轻轻颠倒混匀，保证没有任何凝血现象，且体积大于300ul。(3)马上常温送样，即时检测，检测由高新区GLP中心完成。

实验记录：小鼠给药后，无任何明显的毒副反应，体重也未见降低。

实验结果：正常小鼠给药后血常规结果显示白细胞总数，中性粒细胞，淋巴细胞等均未见有明显的变化。如表1中所示。

表1

表注：可利霉素治疗后的小鼠血常规检测。检测指标如表中最左侧所标注，Units代表检测指标单位；Ctrl是对照组，该组数值可以作为正常参考；伊曲康唑组作为阳性参照。

结果及分析：证实可利霉素在连续用药五天的情况下，未见明显的血液系统毒副作用。

实验例2：可利霉素对巨噬细胞吞噬鸡红细胞能力的评估

实验目的：检测可利霉素是否有增强正常小鼠巨噬细胞功能，主要检测指标是巨噬细胞吞噬的作用。鉴于可利霉素在免疫学研究方面没有对标试剂，根据报道，伊曲康唑具有促进巨噬细胞极化以及增强巨噬细胞吞噬的作用，因此实验中选用伊曲康唑作为阳性对照。

试剂：生理盐水，6％鸡红细胞，甲醇，丙酮，Giemsa染液等；耗材：1ml注射器，普通载玻片，纱布，培养皿等。

实验小鼠：品系:Balb/c，周龄:8-12，来源：成都达硕实验动物有限公司，数量：每组各2只小鼠。

实验步骤：(1)分组给药：a)生理盐水组：与实验组相同体积，p.o.；b)可利霉素组：50mg/kg，p.o.；c)伊曲康唑组：50mg/kg，p.o.；连续给药五天；(2)每只小鼠注射1ml鸡红细胞，等待30min后处死小鼠。(3)腹腔注射1ml生理盐水，按摩使其分布均匀，使小鼠俯卧5min。(4)剪开小鼠腹腔，用1ml的注射器去掉针头，吸出腹腔清洗液，滴于载玻片上，每个载玻片上滴两滴，尽量保证等体积。(5)放入垫有湿纱布的培养皿中，移至37°孵箱温育30min。(6)孵毕，于生理盐水中漂洗，去除未贴壁的细胞(生理盐水提前预热)，晾干。(7)以1:1丙酮甲醛溶液固定(提前放-20°预冷)。(8)吉姆萨染色，先A液染色作用45s，再加B液4min，轻轻吹动染色成涟漪状，让二者混匀，再用蒸馏水冲洗晾干。(9)显微镜随机取视野，拍照计数，计算吞噬百分率(10)吞噬百分率计算公式正在吞噬的巨噬细胞数/巨噬细胞总数×100％

结果与分析：

小鼠腹水细胞经伊曲康唑或可利霉素刺激后，有吞噬能力的巨噬细胞吞噬鸡红细胞(有巨核细胞)或周边聚集较多的鸡红细胞。图1为对照组，图2为可利霉素组，图3为伊曲康唑组。

与安慰剂组(NC)比较，可利霉素组(Keli)和伊曲康唑组(Yiqu)在对巨噬细胞吞噬鸡红细胞能力上都有一定程度的增强；但是可利霉素组和伊曲康唑组间未见有统计学意义的差异。

整体而言，各组件差异不明显。该实验因有实验操作人员不可避免的主观介入，对微小差异不宜用出定量判断；因此改用巨噬细胞对荧光微球吞噬试验，采用流式的方法来进行检测，以减少人为主观因素参与。

实验例3：巨噬细胞体外的荧光微珠吞噬实验-流式检测

实验目的：检测可利霉素是否有增强正常小鼠巨噬细胞功能，主要检测指标是巨噬细胞吞噬的作用。鉴于可利霉素在免疫学研究方面没有对标试剂，根据报道，伊曲康唑具有促进巨噬细胞极化以及增强巨噬细胞吞噬的作用，因此实验中选用伊曲康唑作为阳性对照。

试剂：荧光微珠，无血清培养基等；耗材：5ml注射器，1.5mlEP管等；仪器：BDfortessa流式仪。

实验小鼠：品系:Balb/c，周龄:8-12，来源：南京模式动物中心，数量：每组各2只小鼠。

实验步骤：(1)分组给药：a)与实验组相同体积，p.o.；b)可利霉素组：50mg/kg，p.o.；c)伊曲康唑组：50mg/kg，p.o.；连续给药五天；(2)收腹水细胞：处死小鼠，小心剪开小鼠腹腔表层皮肤，内层不要剪破，用5ml的注射器向内注射约4ml无血清培养基，不要拔出针头，不停按摩小鼠腹部使其混匀，吸出培养基，重复3次。(3)离心获得腹腔细胞。(4)取约1×10^6个细胞用1ml培养基重悬，加入10ul荧光微珠，混合均匀，放1.5mlEP管于37°孵箱中作用40min。(5)PBS洗两遍，洗去未吞噬的微珠，流式上机检测，圈个头较大的巨噬细胞进行分析。

实验结果：流式结果显示与安慰剂组(NC)比较，可利霉素组(Keli)和伊曲康唑组(Yiqu)中各有一只小鼠的巨噬细胞吞噬能力被显著增强。

图4为腹腔巨噬细胞荧光强度的histogram，小鼠腹腔细胞细胞流式分群图，可以看到明显的细胞分群，由于巨噬细胞个头较其它细胞大。结果提示，小鼠在某种“未知”状态下，可利霉素组和伊曲康唑可以增强小鼠巨噬细胞的吞噬能力。需要扩大样本量进行验证和排除该结果是否为偶然因素造成。

实验例4：可利霉素对中性粒细胞功能影响检测

实验目的：检测可利霉素是否可增强小鼠中性粒细胞的炎性趋化迁移能力，主要是通过构建小鼠腹腔炎症模型，流式检测腹腔中性粒细胞比例，检测指标为CD11b和Gr-1。本实验以伊曲康唑作为阳性对照。

试剂：无菌PBS，fMLP,无菌HBSS，Gr-1-APC流式抗体，CD11b-FITC流式抗体等；耗材：吸管，皮筋，剪刀，镊子，1ml注射器，15ml离心管，流式管等。

实验小鼠：品系：C57BL/6小鼠，周龄：8-12，来源：成都达硕实验动物有限公司，数量：第一批给药三天每组各3只鼠，给药7天每组各4只鼠。第二批重复实验给药三天每组各7只鼠。

实验步骤：

(1)分组给药：d)生理盐水组：与实验组相同体积，p.o.；e)可利霉素组：50mg/kg，p.o.；f)伊曲康唑组：50mg/kg，p.o.；连续给药三天、七天；(2)配制fMLP:配制100nMfMLP，PBS稀释，现配现用，配制后置于冰上。(3)腹腔注射：每只小鼠腹腔注射100uL100nM预冷的fMLP。(4)收腹水细胞：注射4小时后，将小鼠处死，四肢固定，剪开腹部皮肤，剖开腹膜一个小口，用橡皮筋与回形针固定腹膜，用吸管吸取预冷的HBSS反复冲洗腹腔，动作轻柔，收集腹水大约8～10ml，将其置于冰上。(5)1000rpm离心5min,小心弃上清。(6)若有红细胞，用1ml红细胞裂解液重悬，冰上裂解3-5min。(7)1000rpm离心5min，弃上清，再加3mlPBS洗一次。(8)加500uLPBS重悬。(9)取10^6个细胞，室温避光孵育流式抗体：CD11b-FITC和Gr-1-APC。(10)PBS洗细胞一次，重悬，置于冰上，避光，上机检测。

实验结果：可利霉素对小鼠腹腔炎症模型中性粒细胞迁移能力评估结果如图5-7所示。图5-7为不同给药时间、不同批次小鼠腹腔炎症模型，流式检测中性粒细胞(Gr-1和CD11b双阳细胞)比例。图5为第一批C57BL/6鼠连续灌胃三天，50mg/kg，构建腹腔炎症模型，腹腔中性粒细胞(Gr-1和CD11b双阳细胞)检测结果；图6为第一批C57BL/6鼠连续灌胃七天，50mg/kg，构建腹腔炎症模型，腹腔中性粒细胞(Gr-1和CD11b双阳细胞)检测结果；图7为第二批C57BL/6鼠连续灌胃三天，50mg/kg，构建腹腔炎症模型，腹腔中性粒细胞(Gr-1和CD11b双阳细胞)检测结果。

图8-11为给药三天后构建小鼠腹腔炎症模型后外周血中T淋巴细胞检测，采用流式细胞术检测CD3+、CD4+和CD8+细胞比例。

可利霉素和伊曲康唑在小鼠体内能够显著促进中性粒细胞向炎症部位迁移，在个别小鼠体内的结果尤其明显；三天同七天的结果比较，没有发现连续用药七日能够使效果进一步加强。可利霉素和伊曲康唑在小鼠体内能够显著促进总T细胞(CD3阳性细胞)增加，其中CD4和CD8阳性细胞都增加，但是伊曲康唑表现更好。

实验例5：可利霉素在肿瘤条件下的免疫调节试验

实验目的：探讨可利霉素在肿瘤条件下是否具有免疫调节功能。随着人们对于免疫的研究发现恶性黑色素瘤是一种免疫原性较好的肿瘤，通过研究T细胞活化的分子机制及如何调动免疫系统对抗肿瘤，从而研制出抗细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(CTLA-4)抗体及抗PD-1抗体。因此，我们试图通过建立B16F10小鼠恶性黑色素瘤皮下瘤模型来探讨可利霉素在肿瘤条件下是否具有免疫调节功能。

实验试剂耗材：

试剂：B16F10黑色素瘤细胞，1640培养基，FBS；耗材：细胞培养相关耗材

实验小鼠：品系:C57BL/6，周龄:8-12，来源：南京模式动物中心，数量：每组各6只小鼠

实验步骤：(1)体外培养B16F10黑色素瘤细胞，大概长至10cm的皿5皿的时候于对数期收细胞；(2)用PBS清洗细胞3遍，并调整细胞浓度到1×10⁷个/ml；(3)在小鼠的右肩部位皮下接种，每只小鼠接种100ul，即1×10⁶个细胞；(4)每天观察小鼠并测量肿瘤的大小，大概在5天的时候，小鼠的肿瘤平均大小达到100左右，开始分组给药并记录第一次数据。分组方案如下：a)生理盐水组：与实验组相同体积，p.o.；b)可利霉素组：50mg/kg，p.o.；c)伊曲康唑组：50mg/kg，p.o.；d)RJ-5组：30mg/kg，p.o(RJ-5为实验室自行合成的一个免疫调节药物，在此处作为区别于伊曲康唑的阳性对照)；(5)小鼠每天给药，并每隔一天记录一次肿瘤的大小以及小鼠体重，肿瘤体积计算公式为：V(mm3)＝0.5×长(mm)×宽(mm)2；(6)最后一天处死小鼠，剥离肿瘤进行称重，拍照，并保留小鼠的心肝脾肺肾泡4％多聚甲醛，留做病理用。(7)由于可利霉素组小鼠状态比其它组差，最后一天均接近死亡，因此没有收到相关的免疫数据，只有皮下瘤的数据。

实验记录：

给药第4天可利霉素组死亡一只，给药第6天对照组死亡一只，给药第9天可利霉素组死亡2只(小鼠刚刚死亡后保留了小鼠的皮下瘤)，剩下3只的状态也很不好(接近濒死状态)。(伊曲康唑组有一只瘤子很小，怀疑跟药物无关是瘤子本来没有长起来，统计的时候剔除。RJ-5组肿瘤大小整体来说比较均匀，统计的时候随机剔除一只。)

实验结果：

可以认为可利霉素，伊曲康唑，RJ-5都具有抑制B16皮下瘤生长的作用。在肿瘤大小，瘤重和抑瘤率等指标上，可利霉素优于伊曲康唑，RJ-5。结果如表2和表3所示。

表2

瘤重(g)	对照	可利霉素	伊曲康唑	RJ-5
					1	3.03	3.29	1.8	2.49
2	4.66	1.73	3.17	2.27
					3	2.32	2.24	2.71	3.75
4	3.8	1.05	1.17	1.9
					5	3.65	1.88	2.37	3.22
平均值	3.49	2.04	2.25	2.73
					抑瘤率(％)	0	41.6	35.7	21.9

表注：小鼠瘤重比较。最后一天处死小鼠剥离皮下瘤，称取重量，并计算平均值。

抑瘤率计算公式为：给药组瘤重平均值(g)/给药组瘤重平均值(g)×100％

表3

体重(g)	对照	可利霉素	伊曲康唑	RJ-5
					1	25.7	18	19.2	21
2	25.8	17.3	20.3	20.6
					3	19	20.7	18.6	18.4
4	24.7	16.3	14.9	20.1
					5	22	18.4	22.1	25.2
			20.5	23.2
					平均值	23.4	18.1	19.3	21.4

表注：小鼠最后一天的体重记录。在处死小鼠后剥离肿瘤前称取每一只小鼠的体重，该体重为包含小鼠的肿瘤的总体重。

结果与分析：可利霉素在肿瘤大小，瘤重和抑瘤率等指标上，优于伊曲康唑，RJ-5；其体内抑瘤机制需要进一步研究。

实验例6：可利霉素对巨噬细胞分化的影响

实验背景及目的：巨噬细胞可分为两大类：经典活化的巨噬细胞(Classicallyactivatedmacrophage，M1)，其特点是主要组织相容性复合体MHCⅡ类表达增加，一氧化氮(Nitricoxide,NO)增多，活性氧和促炎细胞因子，如肿瘤坏死因子(Tumornecrosisfactor,TNF)、白细胞介素-1(IL-1)和白细胞介素-6(IL-6)等升高。另一类是替代性活化的巨噬细胞(Alternativelyactivatedmacrophage，M2)，也称选择性活化的巨噬细胞，是一类具有免疫抑制活性的巨噬细胞，在多种刺激下，白细胞介素-4(IL-4)水平升高，白细胞介素-10(IL-10)和精氨酸酶(Arginase，Arg)的表达增加，导致细胞增殖和胶原生成增强。在遇到感染和癌症时，M1细胞的极化对人类健康有保护效应。因此，本实验的目的是检测可利霉素是否影响巨噬细胞分化，进而探讨可利霉素的潜在免疫调节作用。

实验试剂耗材：试剂：RAW246.7细胞系，1640培养基，FBS，RNA提取试剂盒，反转录试剂盒，SYBR荧光定量试剂盒。细胞因子：IL-4，INF-γ，LPS；耗材：细胞培养相关耗材。

实验步骤：

方案一：探讨药物是否会促进或抑制RAW246.7细胞的极化过程。

(1)可利霉素和伊曲康唑用DMSO配成10mM浓度母液储存。(2)体外培养RAW246.7细胞系，收集对数期生长的细胞按每孔1×10^6个细胞的密度铺6孔板，细胞分别做不加药，加可利霉素20uM，伊曲康唑20uM三种处理。(3)作用1h后，每种处理再分为2组，一组加入LPS(200ng/ml)和IFN-γ(20ng/ml)，另外一组加入IL-4(20ng/ml)，培养12h后收细胞。(4)提取细胞总RNA，反转录成为cDNA，检测相应指标的RNA水平。

方案二：探讨药物对已经极化的细胞是否有作用。

(1)可利霉素和伊曲康唑用DMSO配成10mM浓度母液储存。(2)体外培养RAW246.7细胞系，采用同样的方法铺板，将细胞分别加入对应的细胞因子(LPS+IFN-γ或者IL-4)作用12h。(3)12h后，向已经极化为M1型或M2型的细胞加入可利霉素(20uM)或者伊曲康唑(20uM)，再次作用12h。(4)收细胞，提取细胞总RNA，反转录成为cDNA，检测相应指标的RNA水平。

实验结果：

方案一：探讨可利霉素是否会促进或抑制RAW246.7细胞的分化

图14RAW细胞先加药物作用1h，再诱导其往M1型分化，检测TNF-α的水平。图注：NC(RAW细胞，不做任何处理)；PC1(RAW细胞加LPS+INF-γ，诱导RAW细胞分化为M1型巨噬细胞)；Keli(RAW细胞先加可利霉素，再加LPS+INF-γ)；Yiqu(RAW细胞先加伊曲康唑，再加LPS+INF-γ)；并进行统计学检验，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

图15是RAW细胞先加药物作用1h，再诱导其往M1型分化，检测iNOS的水平；

图16是RAW细胞先加药物作用1h，再诱导其往M2型分化，检测Arg-1的水平；图注：NC(RAW细胞，不做任何处理)；PC2(RAW细胞加IL-4，诱导RAW细胞分化为M2型巨噬细胞)；Keli(RAW细胞先加可利霉素，再加IL-4)；Yiqu(RAW细胞先加伊曲康唑，再加IL-4)；并进行统计学检验，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

方案一结果分析：

可利霉素可以升高TNF-α和iNos的表达，抑制Arg-1的表达。提示可利霉素可能促进M1型巨噬细胞的分化和功能。

方案二：A、探讨可利霉素是否对分化巨噬细胞是否有转分化作用

图17先加细胞因子诱导RAW细胞分化为M1型巨噬细胞，再加相应地药物，检测TNF-α的表达

图18先加细胞因子诱导RAW细胞分化为M1型巨噬细胞，再加相应地药物，检测iNOS的表达

图19先加细胞因子诱导RAW细胞分化为M2型巨噬细胞，再加相应地药物，检测Arg-1的表达

图17-19中，NC(RAW细胞，不做任何处理)；PC1(RAW细胞加LPS+INF-γ，诱导RAW细胞分化为M1型巨噬细胞)；PC2(RAW细胞加IL-4，诱导RAW细胞分化为M2型巨噬细胞)；Keli((RAW细胞先加LPS+INF-γ，诱导RAW细胞分化为M1型巨噬细胞，再加可利霉素)；Yiqu(RAW细胞先加LPS+INF-γ，诱导RAW细胞分化为M1型巨噬细胞，再加伊曲康唑)；并进行统计学检验，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

实验结果：与在RAW246.7细胞系上获得的结果一致，可利霉素不进一步增强LPS+INF-γ诱导的TNF-α和iNOS的表达，但是能够抑制M1型巨噬细胞中Arg-1的表达水平，提示可利霉素有潜在增强M1型巨噬细胞功能的作用。

方案二：B探讨可利霉素是否对分化巨噬细胞是否有转分化作用

图20先加细胞因子诱导RAW细胞分化为M2型巨噬细胞，再加相应地药物，检测TNF-α的表达

图21先加细胞因子诱导RAW细胞分化为M2型巨噬细胞，再加相应地药物，检测iNOS的表达

图22先加细胞因子诱导RAW细胞分化为M2型巨噬细胞，再加相应地药物，检测Arg-1的表达

图注20-22中：NC(RAW细胞，不做任何处理)；PC1(RAW细胞加IL-4，诱导RAW细胞分化为M2型巨噬细胞)；PC2(RAW细胞加IL-4，诱导RAW细胞分化为M2型巨噬细胞)；Keli((RAW细胞先加IL-4，诱导RAW细胞分化为M2型巨噬细胞，再加可利霉素)；Yiqu(RAW细胞先加IL-4，诱导RAW细胞分化为M2型巨噬细胞，再加伊曲康唑)；并进行统计学检验，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

实验结果：可利霉素可以显著提高TNF-α和iNos在M2型巨噬细胞中的表达水平，并且显著强于LPS+INF-γ诱导的TNF-α和iNos表达水平，更优于伊曲康唑，并能显著抑制Arg-1在M2型巨噬细胞中的表达水平。

RAW细胞实验结果初步结论：

综合以上结果，提示：1)可利霉素有潜在的抑制M2型巨噬细胞，提高M1型巨噬细胞的功能；2)可利霉素有极强的诱导M2型巨噬细胞向M1型巨噬细胞转化的功能。已有的研究表明，M2型巨噬细胞促进炎症和肿瘤发生，肿瘤免疫逃逸正相关，尤其是多发性骨髓瘤。因此，可利霉素在有M2型巨噬细胞参与的肿瘤治疗中作用意义值得进一步研究和探索。

实验例7探索可利霉素对OVA诱导的小鼠哮喘疾病作用

小鼠：本实验购买达硕SPF级Balb/c小鼠，年龄6-8周，20-28g的雌性小鼠15只，用其中10只小鼠诱导哮喘：5只做安慰剂组,5只用可利霉素治疗，5只作为健康对照。每组5只小鼠。

试剂：配制致敏腹腔注射液(15-20g/小鼠)：100g/100ul的卵清蛋白溶液加上100ul注射用Alum佐剂。哮喘诱发雾化液：5％的卵清蛋白的生理盐水溶液。

实验记录：从2019年9月12日起连续致敏：在d1，d7，d14向模型组小鼠腹腔注射致敏注射液200ul/只，健康对照组注射等量PBS溶液。哮喘病的诱发：2019年10月4日起开始雾化诱导发病：在雾化前0.5h给小鼠口服给药可利霉素(50mg/kg)，在d21-d27连续诱导，通过雾化向实验组小鼠雾化给予诱导液，给予对照组等量雾化生理盐水，一天一次，一次30mins。2019年10月11日最后一次雾化给药。2019年10月4日小鼠物化(诱导哮喘发作)：雾化过程中，可利霉素治疗组小鼠在头面部瘙痒、竖毛、呼吸急促、点头呼吸、烦躁不安、腹肌抽搐等症状明显好于安慰剂组的小鼠。健康对照组组小鼠没有上述描述症状。2019年10月11日雾化，24h后，即2019年10月12日，颈脱臼处死老，取小鼠肺，进行肺泡灌洗：小鼠颈脱臼死亡后，用橡皮筋固定住口部，从腹部剪开，向上剪至胸骨尖处(可以把胸骨完全取出露出心脏和肺，但注意不要损伤心脏和肺)，剪断肺部下方的食道与血管，可以全部剪断，用止血钳夹住心脏与左肺连接处，剪开小鼠颈部皮肤与肌肉，露出支气管，止血钳夹住气管上部后，用1-3mlPBS注入后，等待数秒后回吸，回收率应到达50％-90％；后用止血钳夹住右肺与心脏连接部分，从气管中经由留置针注入多聚甲醛固定左肺后剪下，放入管中保存。肺石蜡切片的制作：肺泡灌洗后取出左肺，10％甲醛固定，石蜡包埋，切片后用苏木精-伊红染色观察炎性细胞侵润和粘液栓的形成，用碘酸-雪夫染色后观察杯状细胞的生成。

实验结果：雾化过程中，可利霉素治疗组小鼠在头面部瘙痒、竖毛、呼吸急促、点头呼吸、烦躁不安、腹肌抽搐等症状明显好于安慰剂组的小鼠。健康对照组组小鼠没有上述描述症状。实验小鼠肺H&E染色及碘酸-雪夫染色(观察杯状细胞，哮喘反应性细胞)的生成。安慰剂组的小鼠气道上皮杯状细胞增生和粘液高储备明显升高(图23和24)；可利霉素治疗组小鼠气道上皮杯状细胞增生不明显(图25和26)；与健康对照组小鼠没有明显差异(图27和28)。

结论：在经典的OVA诱导的哮喘模型中，可利霉素可以显著缓解小鼠的哮喘症状，抑制小鼠气道杯状细胞增生和Muc5ac黏蛋白的表达。结果提示可利霉素具有潜在治疗哮喘的可能；结合可利霉素杀菌优势，对细菌感染合并哮喘的病人选用可利霉素可能取得较好的临床治疗效果。

图注：可利霉素对OVA诱导的哮喘疾病的缓解作用。HE染色主要观察支气管和血管旁的炎症(淋巴细胞)聚集、浸润。以及血管壁增厚。PAS染色主要观察支气管内成圈增生的杯状细胞(PAS染色呈分红色)。注：杯状细胞是气管组织中的主要功能是分泌粘蛋白和粘液，哮喘发作时大量分泌粘蛋白和粘液引起气道堵塞，导致呼吸困难。图23-24为哮喘模型组；图25-26为哮喘模型可利霉素治疗组；图27-28为正常对照组、模型组的杯状细胞(箭头所指深紫色即为增生的杯状细胞)增生十分明显，而给药组和对照组杯状细胞很少甚至没有。淋巴细胞、炎症细胞的浸润(相对模型组缓解)对照组几乎没有浸润，管壁增厚并不明显。

综合以上结果，对可利霉素的免疫调剂功能总结如下：

1)可利霉素有抑制M2型巨噬细胞，提高M1型巨噬细胞的功能；

2)可利霉素有极强的诱导M2型巨噬细胞向M1型巨噬细胞转化的功能。已有的研究表明，M2型巨噬细胞促进炎症和肿瘤发生，肿瘤免疫逃逸正相关，尤其是多发性骨髓瘤。因此，可利霉素在有M2型巨噬细胞参与的肿瘤治疗中作用意义值得进一步研究和探索。

3)在经典的OVA诱导的哮喘模型中，可利霉素可以显著缓解小鼠的哮喘症状，抑制小鼠气道杯状细胞增生和Muc5ac黏蛋白的表达。结果提示可利霉素具有潜在治疗哮喘的可能；结合可利霉素杀菌优势，对细菌感染合并哮喘的病人选用可利霉素可能取得较好的临床治疗效果。

实验例8

本试验例用脂多糖(LPS)作为诱导激活剂，用BV2细胞系作为巨噬细胞的体外模型细胞，建立体外炎症模型。考察可利霉素主要活性成分异戊酰螺旋霉素I(ISP I)对IL-6产生的影响。

1、试验材料与试剂：

细胞株：小鼠小胶质细胞BV2细胞购自国家实验细胞资源共享平台(北京)

异戊酰螺旋霉素I(沈阳同联集团有限公司)，脂多糖(LPS055：B5L6529)、胰蛋白酶、青霉素、链霉素、二甲基亚砜(DMSO)、甲基噻唑蓝(MTT)均购自SigmaChemical(St.Louis，MO，USA)，DMEM培养基购自GibcoChemical(GrandIsland，NY，USA)，特级胎牛血清购自南美Lonsera，NO检测试剂盒(碧云天生物技术公司)，ELISA检测试剂盒(上海爱必信生物科技公司)。

本试验例所用仪器均可以采用现有技术中的常规仪器。

2、试验方法

2.1细胞培养

BV2细胞使用含10％FBS的DMEM培养基，置于37℃，5％CO₂的培养箱中培养。当细胞培养至密度为90％左右，可进行传代及后续实验。

2.2细胞生长抑制率测定

采用MTT法检测ISP I对BV2细胞活性的影响。MTT(四甲基偶氮唑盐)是一种能接受氢离子的黄色染料。MTT法检测细胞活性的原理的为：活细胞线粒体中存在琥珀酸脱氢酶和细胞色素c，在这两种酶的催化下MTT的四氮唑环裂开，生成蓝紫色的formazan结晶，DMSO或三联液可以溶解该结晶，在492nm/630nm波长处检测吸光值，可以以此检测细胞的活性。

将BV2细胞接种于96孔板中，密度为1.6×10⁵cell/ml，100μl/孔，每组设置六个复孔，正常培养24小时后加药。除阴性对照组外，加入不同浓度的ISP I，继续培养至规定时间。吸弃培养液，加入无菌的PBS洗涤一次，吸弃PBS，每孔加入100μl配制好的MTT，继续培养4h。向其中加入100μl三联液继续培养12h，使用微量振荡器振荡3-5min，使用酶标仪与630nm处测定星光值(A)，按如下公式计算ISP I对BV2细胞的抑制率。

Inhibitoryratio(％)＝(A₆₃₀，control-A_{630，control})/(A₆₃₀，control-A_630，blank)×100

2.3Griess法检测NO含量

BV2细胞以1×10⁵/孔接种于24孔板，采用含10％FBS的DMEM培养液培养，继续培养24h，细胞换成无血清的培养液继续培养6h。先向相应孔中加入250μl终浓度为20μM、10μM、5μM的ISP I进行预处理，1小时后，向相应孔加入终浓度为10μg/ml的LPS进行诱导处理。放置5％CO₂，37℃培养箱分别培养24h后，取上清-20℃保存用于NO的检测。

NO的测定按照说明书进行，在540nm处测定吸光值，利用标准曲线来计算相对应的NO的含量。

2.4ELISA试剂盒检测细胞炎症因子

1)准备好所有需要的试剂和标准品；2)从恢复至室温的密封袋中取出微孔板，未用的板条放回铝箔袋内，重新封口；3)分别将不同浓度标准品，实验样本或者质控品加入相应孔中，每孔100μL。用封板胶纸封住反应孔，室温孵育2h。4)将板内液体吸去，使用洗瓶洗板。每孔加洗涤液400μL，然后将板内洗涤液吸去。重复操作3次。每次洗板尽量吸去残留液体会有助于得到好的实验结果。最后一次洗板结束，请将板内所有液体吸干或将板倒置，在吸水纸拍干所有残留液体；5)在每个微孔内加入100μL检测抗体。用封板胶纸封住反应孔，室温孵育2小时；6)重复第4步洗板操作；7)在每个微孔内加入100μL稀释好的链霉亲和素-HRP，室温孵育20分钟。注意避光；8)重复第4步洗板操作；9)在每个微孔内加入100μL显色底物，室温孵育20分钟。注意避光；10)在每个微孔内加入50μL终止液，孔内溶液颜色会从蓝色变为黄色。如果溶液颜色变为绿色或者颜色变化不一致，请轻拍微孔板，使溶液混合均匀；11)加入终止液后30分钟内，使用酶标仪测量450nm的吸光度值，设定540nm作为校正波长。12)计算结果：将每个标准品和样品的校正吸光度值(OD450-OD540)、复孔读数取平均值，然后减去平均零标准品OD值。可以通过绘制标准品浓度做对数与相应OD值对数生成曲线，并通过回归分析确定最佳拟合线。

2.5统计学处理

应用统计软件SPSS26.0进行数据分析，Excel2016进行数据汇总和GraphPad绘制图表，计量资料以均数±标准差(mean±SD)形式表示，组间数据比较采用单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

3.试验结果

3.1ISP I及LPS对BV2细胞活力的影响

不同浓度ISP I处理BV2细胞24h后，MTT检测结果显示：与未处理组比较，2.5μM、5μM和10μM组细胞活力均无明显差异；不同浓度LPS处理BV2细胞24h后，MTT检测结果显示：与未处理组比较，0.01μg/ml、0.1μg/ml、1μg/ml和10μg/ml组细胞活力均无明显差异。如图29所示(A为ISP I对BV2细胞活性的影响，B为LPS对BV2细胞活性的影响，)

3.2ISP I抑制LPS诱导的NO的产生

检测不同浓度LPS作用于细胞时细胞上清液中NO的水平，结果表明0.01～10μg/ml的LPS均可诱导NO生成。检测ISP I对细胞上清液中NO产生量的影响，结果表明ISP I能够浓度依赖性抑制LPS诱导的NO的产生。如图30所示，A中，当LPS浓度为0.01μg/ml，0.1μg/ml，1μg/ml，10μg/ml时，与对照组相比，NO释放量随浓度增加而增加。*p＜0.05，***p＜0.001vs0组。B中，当ISP I的浓度为2.5μM时，5μM和10μM，在ISP I中生成的NO浓度降低浓度依赖性的方式，表明ISP I可以减少由LPS诱导的NO的量。#p＜0.05，##p＜0.01vsLPS组，***p＜0.001vs空白组。

3.3ISP I抑制LPS诱导的IL-6的产生

检测不同浓度LPS作用于细胞时细胞上清液中IL-6的水平，结果表明0.01～10μg/ml的LPS均可诱导IL-6生成。ELISA法检测ISP I对细胞上清液中IL-6产生量的影响，结果表明5μM及10μMISP I可明显抑制LPS诱导的IL-6的产生。如图31所示，A中，LPS的浓度分别为0.01μg/ml，0.1μg/ml，1μg/ml和10μg/ml，细胞产生的IL-6的数量增加。*p＜0.05，**p＜0.01vs.0μg/ml组。B中，当ISP I的浓度为2.5μM，5μM和10μM时，IL-6的浓度以ISP I浓度依赖性的方式降低，表明ISP I可以减少LPS诱导的IL-6。*LPS组*p＜0.05，***p＜0.001。

4结论：可利霉素主要活性成分异戊酰螺旋霉素I(ISP I)可抑制LSP诱导的炎性细胞因子IL-6及NO的产生。

实验例9ELISA检测可利霉素对小鼠多种组织器官中炎症因子的作用

实验用昆明小鼠购于江苏大学实验动物中心，小鼠IL-1βELISA试剂盒(赛默飞(88-7013-88))，小鼠IL-4ELISA试剂盒(赛默飞(88-7044-88))，其他实验仪器及试剂均为现有的常规仪器和试剂。

1、小鼠分组以及给药

可利霉素：溶解方法，可利霉素若干加入0.48ml聚乙二醇400，再加入2.4μl的吐温80，振荡混匀，然后加入蒸馏水1.92ml(每次加入200μl振荡混匀即可)，分别配制为1.44mg/ml、2.88mg/ml、5.76mg/ml浓度。

阿奇霉素：先用少量无水乙醇溶解，然后加水使无水乙醇含量为10％，配制为1.82mg/ml浓度。

昆明小鼠，雄性，18-20g大小，144只，在实验室适应性喂养后，小鼠体重约24g，随机分为6个组：正常组，模型组，可低组(30mg/kg)，可中组(60mg/kg),可高组(120mg/kg)，阿奇霉素(37.9mg/kg)组。每个组分为8个时间点：0h，0.5h，2.5h，4.5h，12h，24h，48h和72h。每个时间点3只小鼠。正常组小鼠不给药也不注射细菌，模型组注射细菌不给药，可利霉素以及阿奇霉素均灌胃给药(500μl)，首日剂量翻倍，后续每天正常给药，模型组给相同体积的溶剂。给药后在不同的时间点分批处死小鼠。

模型建立：金葡菌的浓度测定见体外实验报告，测好浓度后，用生理盐水重悬，使得浓度为3×108CFU/ml，尾静脉注射，按照24g/100μl注射。注射一个小时后开始给药。

2、样品的制备

小鼠眼球取血后处死，取各个组织器官，用电子天平称量，每种组织称取50mg后加入1.5ml的EP管中，随后加入1ml的预冷PBS，加入磁珠后匀浆机匀浆(300Hz，30s)。冰上静置30分钟后，然后用离心机在4℃离心(10000g，10min)，取上清液作为检测样品。

3、实验方法实验方法严格按照ELISA试剂盒说明书来进行，简叙如下：

试剂准备：PH7.35的PBS，吐温20，配制含0.05％吐温20的PBS溶液作为洗涤液。(如果在缓冲液浓缩物中形成晶体，则将其轻轻加热直至完全溶解)。1.涂层缓冲液(1X)：将PBS(10倍)在去离子水中稀释1:10。2.捕获抗体：在包衣缓冲液(1x)中稀释捕获抗体(250x)1:250。3.5xELISA/ELISPOT稀释液：在去离子水中稀释浓缩稀释液(5x)1:5。4.标准品：重组小鼠il-1β标准品，用蒸馏水溶解，加入蒸馏水的体积在标准品小瓶的标签上注明。标准溶液提前10-30分钟配制，充分混合以确保完全均匀溶解(重组标准品的浓度＝1000pg/ml)。标准品在新鲜配制，立即使用，不储存。5.检测抗体：在ELISA/ELISPOT稀释液(1x)中稀释检测抗体(250x)1:250。6.酶：在ELISA/ELISPOT稀释液(1x)中稀释HRP浓缩液(100x)1:100。

实验步骤：1.在包被缓冲液中按每孔100μL的捕获抗体l量包被CorningTMCostarTM9018ELISA板(按试剂制备第1点所述进行稀释)。密封ELISA板，并在4℃下孵育过夜。2.去掉孔里面的溶液，并用大于250微升缓冲液冲洗3次，在每个冲洗步骤中留出浸泡时间(1分钟)，以提高冲洗效果，用吸水纸擦干，去掉残留液。3.每孔加200微升ELISA/ELISPOT稀释液(1X)，室温孵育1小时。4.提前30分钟准备标准品。5.用洗涤液至少抽吸和洗涤一次。6.加入100ul标准品，样品，空白孔加入ELISA/ELISPOT稀释液(1X)。7.封板室温孵育2小时。8.准备检测抗体。9.按照步骤2吸气和清洗，重复洗3-5次。10.向所有孔中加入100微升/孔稀释的检测抗体。11.封板，室温孵育1小时。12.准备HRP。13.按照步骤2吸气和清洗，重复洗3-5次。14.每孔加入100ul稀释好的HRP。15.封板室温孵育30分钟。16.按照步骤2进行抽吸和清洗，确保在抽吸前留出浸泡1到2分钟的时间，重复5-7次清洗。17.每孔加入100ul的TMB溶液。18.室温下孵育15分钟。19.每孔加50μL终止液。20.在450nm处读板。21.数据收集以及处理。

试验结果：可利霉素对小鼠多种组织器官中IL-4因子、IL-1β的作用结果分别如表4和表5所示。

表4

表5

注：*，P＜0.05；**，P＜0.01；***,P＜0.001；****,P＜0.0001.

实验结论：可利霉素在肺、肾脏、肝脏和脾脏中均有显著降低IL4因子的作用，在肝脏和脾脏中作用更为显著；可利霉素在小肠、肺、脾脏、肝脏和肾脏均有显著降低IL-1β因子的作用，在小肠和肺中作用尤为显著。

以上所述仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，虽然本发明已以较佳实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专利的技术人员在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用上述提示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明方案的范围内。

Claims (3)

1.可利霉素在制备治疗诱导性哮喘的药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，可利霉素在制备抑制气道杯状细胞增生的药物中的应用。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，可利霉素在制备抑制Muc5ac黏蛋白的表达的药物中的应用。

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