CN114796114B - 一种抗肿瘤药物胶束及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种抗肿瘤药物胶束及其制备方法和应用，包括药物、载体材料、助溶剂、溶剂。所述药物为

Description

一种抗肿瘤药物胶束及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，特别涉及一种抗肿瘤药物胶束及其制备方法和应用。

背景技术

癌症已经成为全球女性健康威胁的重要因素之一，近年来，乳腺癌已经成为女性易患癌症中病死率最高的恶性肿瘤，每年被确诊为乳腺癌患者的女性人数高达30余万，攻克这一难题，已经成为医药工作者近年来研究的热点。

目前临床用于治疗乳腺癌的手段主要有手术、放疗、化疗等，这些手段虽然可以为乳腺癌患者带去生存的希望，但是长期用药也会对患者造成其它附加性的伤害，开发靶向抗癌药物一直是我们公司的研究方向，乳腺癌也是我们的重点研究对象。

信号转导与转录激活因子 3 (Signal transducer and activator oftranscription 3，STAT3) 是一种在细胞中参与大量细胞因子及生长因子应答的信号转导蛋白, 负责调控细胞的生长、增殖、分化以及凋亡等一系列重要的生理过程。研究发现STAT3 家族中某些蛋白的过度表达与乳腺癌的生长、转移有密切联系。抑制 STAT3 信号通路的异常活化已成为抗乳腺癌药物研发的热门靶点之一，本公司自主研发的RDp002化合物在抑制 STAT3 信号通路方面取得了显著成效。

胶束是由同时具有亲水性基团和疏水性基团的嵌段共聚物或接枝共聚物，在水中溶解后自发形成高分子胶束(polymericmicelles)，可以对难溶性药物实现增溶和包裹，因其具有亲水性外壳及疏水性内核，适合于携带不同性质的药物，广东众生药业研发的注射用多西他赛聚合物胶束已获得FDA审批，采用mPEG-PDLLA对多西他赛进行物理包裹，成功制备了具有核-壳结构的注射用多西他赛聚合物胶束。与多西他赛注射液相比，该胶束具有组织被动靶向性及增效减毒作用，同时还可避免多西他赛注射液中助溶剂吐温、乙醇等造成的体液潴留和过敏反应，具有更好的临床使用安全性。印度太阳制药Cequa采用了纳米胶束配方技术，研制了环孢素眼用溶液0.09%，由于胶束是两亲性（疏水性和亲水性）分子，可以在特定的浓度下形成胶状团聚体，此外，纳米胶束的小尺寸有利于进入角膜和结膜细胞，从而能够递送高浓度的环孢素。

聚乙二醇单甲醚属于醚类，相比于聚乙二醇，其性质更加稳定，毒性也明显降低，对人体伤害较小。且其在化学合成中容易进行化学修饰，因此被广泛应用于材料合成以及制剂当中，乙酰化鹅去氧胆酸为疏水部分，河南大学药学院蒲晓辉教授团队，以聚乙二醇单甲醚为亲水部分，设计、合成了生物相容性好、生物可降解的两亲性高分子聚合物材料(mPEG-DCA)，该聚合物作为胶束载药系统的载体具有很大的潜力及应用前景。

发明内容

本发明的目的在于提供一种抗肿瘤药物胶束及其制备方法和应用，利用本公司自主研发的具有良好的STAT3蛋白表达抑制功能的化合物剂RDp002，解决治疗三阴性乳腺癌时STAT3蛋白过表达导致的乳腺癌细胞的浸润和转移，同时克服活性药物溶解性差的问题，以低毒性的mPEG-DCA为载体材料，包裹活性药物成分，形成胶束制剂，进行体内外试验，评价活性药物在治疗三阴性乳腺癌的疗效。

本发明要解决的问题是通过以下技术方案进行的：

一种抗肿瘤药物胶束，以药物、载体材料、助溶剂和溶剂为原料，所述药物为化合物，所述载体材料为聚乙二醇-脱氧胆酸（mPEG-DCA），所述助溶剂为吐温-80，所述溶剂为无水乙醇和生理盐水。

进一步地，所述药物胶束中药物和载体材料的质量比为1:10，每1mg~3mg药物需要1mL生理盐水，每1mg~3mg药物需要1.5mL~4mL无水乙醇，每1mg~3mg药物需要5μL~10μL吐温-80。

前述的抗肿瘤药物胶束的制备方法，过程如下：将载体材料和药物溶于无水乙醇中，超声使其完全溶解后备用，另将助溶剂加入生理盐水中混合均匀后备用，将药物和载体材料的无水乙醇溶液滴加至有助溶剂的生理盐水溶液中，继续超声至混合均匀；将上述溶液冷却至室温，挥干乙醇，即得胶束溶液。

优选地，所述超声时的功率为40W、温度为20~35℃。

上述抗肿瘤药物胶束在制备抗乳腺癌药物中的应用。

上述抗肿瘤药物胶束在制备抑制乳腺癌模型中小鼠肿瘤生长药物的应用。

本申请的药物胶束制剂，同时在三阴性乳腺癌细胞水平和动物水平进行胶束药物活性体内外考察，试验结果显示，此胶束制剂不仅可以解决药物溶解性差的问题，还具有良好的体内外抗乳腺癌活性。

附图说明

图1为本发明中化合物RDp002合成路线示意图；

图2 为本发明中化合物RDp002胶束粒径，透射电镜和电位图；

图3为本发明实施例3中RDp002原料药和RDp002胶束的MTT试验结果示意图；

图4为本发明实施例4中小鼠体重变化结果示意图；

图5为本发明实施例4中小鼠肿瘤情况结果示意图；

图6为本发明实施例4中小鼠肿瘤重量示意图。

具体实施方式

以下结合附图和实施例对本发明的技术方案作进一步详细说明。

实施例1：

药物胶束处方

注：RDp002的详细制备过程参考ZL2021101652981，载体材料mPEG-DCA由河南大学药学院蒲晓辉教授团队提供；参考文献如下：[1]魏志豪, 孙远梅, 李博,等. 一种新型两亲性聚乙二醇单甲醚-鹅去氧胆酸聚合物的合成与表征[J]. 河南大学学报：医学版,2017, 36(4):4.

工艺：

（1）薄膜分散法

用分析天平称取实施例1处方中RDp002、mPEG-DCA置于EP管中，加入无水乙醇，在超声功率40W条件下超声5min，使其完全溶解后备用作为①；取1mL生理盐水置于茄形瓶中，加入处方量吐温-80，转速12000r/min搅拌5min使其混合均匀作为②；在转速12000r/min条件下将①用5mL医用注射器缓慢滴加至②中，滴加完毕后搅拌30min，随后用旋转蒸发仪旋在600r/min，温度50℃的条件下将液体彻底旋干，使药物在茄形瓶内壁上形成一层均匀的薄膜，将干燥的茄形瓶在45℃，转速12000r/min的条件下加入1mL生理盐水进行水化，即得。此方法是将难溶性化合物与载体材料先溶于有机溶剂中，使其充分混合，随后将有机溶剂采用旋干的方法除去，最后加入水相进行水化，可以有效解决难溶性化合物在水中的溶解性问题。

（2）溶剂挥发法

用分析天平称取上述表格中对应处方量载体材料和药物，加入无水乙醇溶解完全，在温度30℃、功率40W的条件下超声5min，使其完全溶解备用作为①；取1mL生理盐水置于茄形瓶中，加入处方量吐温-80，超声（温度30℃、功率40W）使其混合均匀备用作为②；在30℃、超声功率为40W的条件下将①用5mL医用注射器缓慢滴加至②中，滴加完毕后继续以30℃、功率40W的超声条件超声30min，随后取出溶液，室温静置使无水乙醇自然挥发，即得胶束溶液。

试验结果与分析：工艺（1）薄膜分散法在水化时，制剂浑浊，以此工艺不能制备出胶束制剂；工艺（2）溶剂挥发法制剂溶液澄清。但其浓度较低，仅为1mg/mL，因此在1mg/mL浓度基础上继续增大RDp002制剂浓度。考虑到RDp001在水溶液中几乎为不溶，为提高制剂浓度，RDp001用量也会增加，与此同时，为使RDp001完全溶解，无水乙醇的用量也应该在工艺（2）对应的处方基础上增加，考虑到制剂稳定性，助溶剂吐温-80用量也需要随着RDp001用量进行增大。此外，考虑到胶束的载药量，随着RDp001用量的增加，载体材料的用量也需要增大，具体处方调整为如下实施例2。

实施例2：

药物胶束处方

工艺：

（1）溶剂挥发法

用分析天平称取上述处方中对应载体材料和药物，加入无水乙醇溶解完全，在温度30℃、功率40W的条件下超声5min，使其完全溶解备用作为①；取1mL生理盐水置于茄形瓶中，加入处方量吐温-80，超声使其混合均匀（温度30℃、功率40W）备用作为②；在30℃、超声功率为40W的条件下用5mL一次性医用注射器将①缓慢滴加至②中，滴加完毕后继续以30℃、功率40W的超声条件超声30min，随后无水乙醇被挥干，即得胶束溶液。

试验结果与分析：如图2所示，经检测制剂粒径为462.4nm，电位为-16mv，透射电镜显示为球形；制剂浓度增大为3mg/mL时，为澄清溶液，且稳定性良好。

空白胶束的制备：不含主药RDp002，其余同实施例2。

为了进一步说明本发明的有益效果，以下将实施例2所制备的制剂进行性能测试。

实施例3：体外药效学评价MTT试验

MTT试验药物浓度的配制：

（1）MDA-MB-468细胞培养

取对数生长期的MDA-MB-468细胞用于实验，将细胞培养至对数生长期，以5×10³个/孔的密度配制96孔板需要的细胞悬浮液，将悬浮液混合均匀后接种于96孔板内，将CO₂培养箱的温度设置为37℃，将孔板在培养箱内孵育24h, 取出孔板，确认细胞密度达到实验条件，倒掉板内培养基，进行加药试验。

（2）RDp002胶束制剂MTT试验样品配制

取3mg/mL的RDp002胶束制剂1 ml，RDp002分子量547.10 g/mol，配制成1 mM溶液，溶剂为生理盐水；

分别将3mg/mL的RDp002胶束制剂1 ml加入5.48ml生理盐水，可得到1 mmol/L该化合物的溶液；取99µL的生理盐水，加入1µL1 mmol/L的RDp002胶束制剂溶液，得到0.01mmol/L的RDp002胶束制剂溶液；取90µL的生理盐水，加入10µL的0.01 mmol/L的RDp002胶束制剂溶液，得到0.001 mmol/L的RDp002胶束制剂溶液；取90µL的生理盐水，加入10µL的0.001 mmol/L的RDp002胶束制剂溶液，得到0.0001 mmol/L的RDp002胶束制剂溶液。

将以上得到的0.0001，0.0010，0.0100，1.0000 mmol/L的RDp002胶束制剂溶液按剂量取1µL加入1000 µL细胞培养基，吹打混匀后即得到0.0001，0.0010，0.0100，1.0000 µmol/L浓度的RDp002胶束制剂溶液，另取1000 µL细胞培养基作为0 µmol/L浓度的空白对照。

化合物加样时，将96孔板的培养基每孔取出80 µL，加入用培养基配制不同浓度的化合物100 µL即可。

（3）RDp002原药MTT试验样品配制

取10mg的RDp002化合物，RDp002分子量547.10 g/mol，配制成1 mM溶液，溶剂为DMSO；

将10 mg的RDp002化合物加入18.29 ml的DMSO，可得到1mmol/L该化合物的溶液；取99µL的DMSO，加入1µL 1mmol/L的RDp002溶液，得到0.01mmol/L的RDp002胶束制剂溶液；取90µL的DMSO，加入10µL的0.01 mmol/L的RDp002溶液，得到0.001 mmol/L的RDp002溶液；取90µL的DMSO，加入10µL的0.001 mmol/L的RDp002溶液，得到0.0001 mmol/L的RDp002溶液。

将以上得到的0.0001，0.0010，0.0100，1.0000 mmol/L的RDp002溶液按剂量取1µL加入1000 µL细胞培养基，吹打混匀后即得到0.0001，0.0010，0.0100，1.0000 µmol/L浓度的RDp002胶束制剂溶液，另取1000 µL细胞培养基作为0 µmol/L浓度的空白对照。

化合物加样时，将96孔板的培养基每孔取出80 µL，加入用培养基配制不同浓度的化合物100 µL即可。加药后的孔板放置培养箱内孵育，到达孵育时间后，弃去板内培养基，在孔内加入10μL浓度为5 mg/mL的 MTT溶液，继续在培养箱内孵育4h，弃去孔内培养液，将孔板处理干净，加入 100 ul的DMSO，酶标仪在492nm处测量吸光度，计算IC₅₀值，结果如图3所示，RDp002原料药的IC₅₀值为0.4648，RDp002胶束的IC₅₀值为0.1533，胶束制剂相比于原料药有较小的IC₅₀值。

实施例4：体内药效学评价

通过构建MDA-MB-468细胞的裸鼠移植瘤模型和给予实施例2化合物RDp002胶束进行治疗，评价化合物RDp002胶束制剂在体内对三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-468的生长和转移的抑制作用。

一、MDA-MB-468细胞裸鼠移植瘤模型的建立：

（1）MDA-MB-468细胞按照常规传细胞培养法进行培养，其培养方法如下：

在显微镜下观察，当培养皿中的细胞覆盖率达到80%-90%时进行传代。在生物安全柜中将原有培养基弃去，加2 ml的胰蛋白酶，37℃消化2 min；待细胞变圆后加入等体积的完全培养基终止消化，用移液枪吹打细胞，使细胞全部脱落。然后把细胞悬液转入15 ml的离心管中，以900 r/min的转速室温离心5分钟。弃去上清液，以2 ml的培养基重悬细胞，吹打混匀，平均分配到2个100 mm的细胞培养皿中继续培养。

（2）MDA-MB-468细胞收集

吸掉培养皿内的旧培养液，用PBS清洗1次。

向培养皿中加入含0.25%的胰蛋白酶液和0.02%的EDTA（0.53 mM）的胰蛋白酶-EDTA消化液2 ml。

置37℃孵箱下进行消化，2min后把培养瓶放在倒置显微镜下进行观察，当发现胞质回缩或细胞间隙增大后，应立即中止消化。

加入完全培养液，终止消化。

使用吸头吸取皿中培养液反复轻轻吹打培养皿底部细胞，使之从培养皿底部脱离形成细胞悬液。

用计数板计数后，调整细胞悬液到5×10⁷个/mL，将收集好的MDA-MB-468细胞，置于冰上备用。

（3）MDA-MB-468肿瘤细胞接种

选择6周龄，18-20g的BALB/c-nude 雌性小鼠，用于MDA-MB-468肿瘤细胞接种。用酒精棉消毒接种部位的皮肤，细胞悬液混匀后用注射器吸取一定量的细胞悬液，按照100μL/只进行腋下脂肪垫接种。等待肿瘤形成约13-15毫米左右，处死荷瘤鼠，体表用75%酒精浸泡，然后用消毒剪刀镊子剖出肿瘤组织，浸于适量的生理盐水中，保证肿瘤表面的湿润，挑掉肿瘤组织表面的包膜，将瘤组织剪开，去除肿瘤中心坏死部分，保留鱼肉样的健康肿瘤组织，剪成1立方毫米小块，用镊子塞到接种针的针孔中，然后由裸鼠腋下皮下进针，针头到达预定位置后，用接种针中心的实体针将瘤组织块推出即可。将接种好的动物放回原笼饲养，保持环境清洁，避免感染。

用上述方法进行肿瘤传代，至第三代裸鼠，裸鼠皮下移植瘤均出现肿瘤且肿瘤大小差异不大。分别记录每一次皮下移植瘤小鼠肿瘤生长情况及成瘤率。

二、荷瘤小鼠的的治疗

选择接种10天后，小鼠肿瘤体积达到到100立方毫米左右时开始分组，按照肿瘤体积大小均匀分为3组，每组6只。3组小鼠均自由采食和饮水。当对照组小鼠肿瘤长到1000立方毫米左右时，终止实验，取出腋下肿瘤并称重。

按照以下分组进行小鼠给药。

三、结果

（1）体重变化：每隔1天，记录小鼠体重变化，绘制生长曲线，结果如图4所示RDp002胶束组每只小鼠给70µL的3mg/mL（相当于以10 mg/kg的剂量给药）的RDp002胶束制剂，同时其它两组分别给予相同剂量的空白胶束和生理盐水，各组试验动物6只，采用原位方式进行给药，图4为RDp002胶束组，空白胶束组和生理盐水组各组的药物浓度，给药剂量，试验动物数和给药途径相同的情况下，RDp002胶束组和空白胶束组和生理盐水组相比，小鼠体重无明显差异。

（2）肿瘤生长抑制率

试验结束后剖剥离瘤块，拍照，称瘤重。计算肿瘤生长抑制率，计算公式为：肿瘤生长抑制率=（1-T/C）×100% （T：治疗组平均瘤重；C：对照组平均瘤重）根据实验结果绘制肿瘤生长抑制率曲线，结果如图5所示为将各组试验组裸鼠处死后，将各个组小鼠肿瘤剥离得到的肿瘤大小对比图，从图5发现生理盐水组和空白胶束对照组各组小鼠肿瘤体积相对较大，而RDp002胶束制剂10mg/kg试验组肿瘤较小，而且由于其中有2只裸鼠的肿瘤处于消失状态，说明RDp002胶束在MDA-MB-468移植瘤裸鼠的体内药效相对明显；并且结合图6的各组肿瘤重量大小对比可以发现，生理盐水组和空白胶束组的肿瘤平均重量分别为0.36g和0.35g，而RDp002胶束制剂10mg/kg试验组肿瘤平均重量为0.11g，RDp002胶束制剂对肿瘤抑制率达到69.4%，明显低于生理盐水组和空白胶束组，说明RDp002胶束制剂对MDA-MB-468移植瘤裸鼠的治疗效果较明显，具有治疗MDA-MB-468肿瘤的潜力。

最后应当说明的是：上述实施例仅用于说明本发明具体实施的技术方案而非对其进行限制，所属技术领域的普通技术人员应该理解，在不违背本发明宗旨的前提下，未改变其性能或用途对本发明的实施方式进行的任何等同替代或明显变型，均应涵盖在本发明请求保护的范围之内。

Claims (4)

1.一种抗肿瘤药物胶束，其特征在于：以药物、载体材料、助溶剂和溶剂为原料，所述药物为化合物 ，所述载体材料为聚乙二醇-脱氧胆酸（mPEG-DCA），所述助溶剂为吐温-80，所述溶剂为无水乙醇和生理盐水；所述药物胶束中药物和载体材料的质量比为1:10，每1mg~3mg药物需要1mL生理盐水，每1mg~3mg药物需要1.5mL~4mL无水乙醇，每1mg~3mg药物需要5μL~10μL吐温-80，上述抗肿瘤药物胶束通过下述过程获得：

将载体材料和药物溶于无水乙醇中，超声使其完全溶解后备用，另将助溶剂加入生理盐水中混合均匀后备用，将药物和载体材料的无水乙醇溶液滴加至有助溶剂的生理盐水溶液中，继续超声至混合均匀；将上述溶液冷却至室温，挥干乙醇，即得胶束溶液。

2.根据权利要求1所述抗肿瘤药物胶束，其特征在于：所述超声时的功率为40W、温度为20~35℃。

3.权利要求1所述抗肿瘤药物胶束在制备抗乳腺癌药物中的应用。

4.权利要求1所述抗肿瘤药物胶束在制备抑制乳腺癌模型中小鼠肿瘤生长药物的应用。