CN105497053B - 可利霉素在抗结核分枝杆菌感染中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及可利霉素在抗结核杆菌感染中的应用，其主要步骤是，以临床一线抗结核药异烟肼和利福霉素作为对照，采用绝对浓度法进行可利霉素抗结核分枝杆菌活性测定，结果表明，可利霉素对临床分离的结核分枝杆菌包括耐药菌的活性，明显优于临床一线对照药异烟肼和利福霉素，有望发掘出可利霉素在治疗结核菌感染疾病中的新用途。

Description

可利霉素在抗结核分枝杆菌感染中的应用

技术领域：

本发明涉及大环内酯类抗生素在治疗结核杆菌感染中的应用。

技术背景：

结核病是由结核分枝杆菌(MTB)感染引起的慢性传染病，主要累及肺，是传染病中单一导致死亡人数最多的疾病。结核病多见于免疫功能低下人群，也是最常见的与艾滋病相关的一种机会感染性疾病。据世界卫生组织(WHO)报告，全世界每年有800万-1000万肺结核新发病例，有300万～400万人死于结核病，且以发展中国家患者为甚。另据预测，2000-2020年将有约10亿人被感染，3500万人死于结核病。与此同时，MTB耐药性逐年增加，将成为全球控制结核病的一大威胁。我国是全球结核病高发的22个国家之一，活动性结核病患者数居世界第二位，且流行的特点呈现高感染率、高患病率、高耐药率和高死亡率，全国200万MTB阳性患者中，有1/4以上为结核菌耐药患者。

目前，临床常用治疗结核病的一线药物(具有明确的抗结核分枝杆菌活性)有：利福平、异烟肼、链霉素、乙胺丁醇和吡嗪酰胺等5种。然而这些药物不良反应多，杀菌作用有限，疗程较长，通常使用6个月以上，患者依从性差。二线抗结核药物(对结核分枝杆菌具抑菌作用)有：卷曲霉素、乙硫异烟胺、对氨基水杨酸、环丝氨酸、环丙沙星、阿米卡星和卡那霉素等，而这些药物不良反应较大，治疗时间更长(18～24个月)，花费昂贵，治愈率也更低。值得关注的是，临床研究表明，一线抗结核药物均可对肝脏造成损害，如异烟肼的不良反应为周围神经炎、肝毒性、中枢神经系统障碍及过敏反应；利福平的不良反应有肝毒性、消化道不适、神经系统症状和过敏反应；乙胺丁醇的不良反应主要为视神经毒性；吡嗪酰胺的不良反应为出现皮肤黄染和血尿酸增高；链霉素毒性及细菌耐药性问题严重限制了其应用，因与其它药物联用可减少细菌耐药性的发生率，尽管临床应用不多，但仍用作抗结核病的一线药物。[朱珊梅海峡药学2010，22(2)：123-125]。另据报道，2010年，对518株临床分离结核分枝杆菌的研究表明，在一线药物中，对异烟肼的耐药率最高达到53.67％，对链霉素耐药率为45.95％；在二线药物中，对氧氟沙星耐药率达39.77％，对阿米卡星耐药率为15.83％，对卷曲霉素耐药率为21.81％；在321株对一种及以上一线药物的耐药菌株中，对氧氟沙星耐药高达57.01％，对阿米卡星和卷曲霉素耐药率分别为25.55％和33.02％；在217株多重耐药株中，对氧氟沙星耐药率达72.35％[刘一典等2010中国防痨协会临床基础专业学术大会汇编274-275页]。这对我国结核病控制工作，特别是耐多药结核病控制工作的实施带来严峻的挑战。因此，尽快寻找抗结核分支杆菌特别是抗多重耐药菌株的替代产品已经刻不容缓了。

新大环内酯类药物克拉霉素、阿奇霉素、罗红霉素为十四元环红霉素的衍生物，其抗菌作用机制与上述一线、二线抗结核药物不同，是与菌体内核糖体的50S亚基可逆性结合，干扰蛋白质的合成。国内有报道称，克拉霉素对敏感结核分枝杆菌的MIC为0.25-2.0微克/毫升，对耐药菌的MIC为2.0-32微克/毫升；阿奇霉素抗结核分枝杆菌的MIC为128微克/毫升[唐神结，抗结核药物研究最新进展，中国防痨杂志，2006年28卷增刊1-3页]。据国外报道，克拉霉素对M.tuberculosis H37Rv(ATCC 27294)的MIC为6微克/毫升；阿奇霉素的MIC为95微克/毫升[KanakeshwariFalzari et al:In vitro and in vivo activities omacrolide derivatives against Mycobacterium tuberculosis.Antimicrob.Agentsand Chemother.2005,49(4):1447-1454]；罗红霉素的MIC≥64微克/毫升。此类药物并未被列入临床治疗结核分枝杆菌感染的药物，但有临床上单独或与抗结核药物合并使用治疗耐多药结核菌感染疾病的报道[许丽等深圳市住院病人抗结核相关抗菌药物应用调查中国防痨杂志2010，32(3)：151-154]。

研究证明，16元环与14元环大环内酯类抗生素具有相类似的抗菌作用机制。此类药物对结核分枝杆菌活性低，如对M.tuberculosis H37Rv(ATCC 27294)，泰洛菌素的MIC为58.6微克/毫升，螺旋霉素和麦迪霉素均>100微克/毫升[KanakeshwariFalzari et al:Invitro and in vivo activities of macrolide derivatives against Mycobacteriumtuberculosis.Antimicrob.Agents and Chemother.2005,49(4):1447-1454]。因此，迄今为止，国内外尚无此类抗生素用于临床治疗结核病的相关报道。

本实验室研制的一种新型16元环大环内酯类抗生素-可利霉素(原用名生技霉素、必特螺旋霉素)，系以异戊酰螺旋霉素为主组分的4”-酰化螺旋霉素，其作用机制是通过与细菌核糖体结合而抑制其蛋白质合成。体内外试验结果表明，可利霉素对革兰阳性菌，尤其对某些耐药菌(如耐β-内酰胺金葡菌、耐红霉素金葡菌等)有效，与同类药无明显的交叉耐药性。与此同时，它对支原体、衣原体有很好的抗菌活性，对部分革兰阴性菌也有抗菌作用，且对弓形体、军团菌等亦有良好抗菌效果[王以光等，“必特螺旋霉素及其在抗感染性疾病中的应用”，2003年12月23日，中国发明专利：ZL 200310122420.9]。可利霉素具有良好的组织渗透性，其体内抗菌活性明显优于体外，且具有潜在的免疫调节作用。通过I、II、III期临床研究，证明可利霉素是一种使用安全疗效显著的抗生素。

为了进一步发掘潜在功效，扩大可利霉素临床适应症和使用范围，近年来，本实验室以临床常用的抗结核病相关一线药物为对照，进行了可利霉素抗结核分枝杆菌活性测定的系列研究，结果表明，所述可利霉素对临床分离的结核分枝杆菌中显示活性的菌株有效数，均优于对照组，提示其有望在治疗某些耐药结核分支杆菌感染疾病中得到应用。本发明所述可利霉素在抗结核分枝杆菌感染中的应用，迄今尚未见有国内外的相关报道。

发明内容：

本发明的目的是，提供可利霉素对临床分离结核分枝杆菌活性的系列检测实验研究，以证明其可能具有治疗结核杆菌感染疾病的新用途。

本发明的主要步骤是，采用绝对浓度法对临床分离的结核杆菌，进行可利霉素抗结核分枝杆菌活性测定，并以临床使用的抗结核病一线药物异烟肼和利福霉素作为对照。实验结果表明，可利霉素对临床分离的240株结核分枝杆菌中显示活性的菌株为172株，总有效率为71.66％，其中活性优于异烟肼的有37株，占有效菌数的21.5％；活性优于利福霉素的有39株，占有效菌数的22.7％；活性比两者均优的有23株，占有效菌数的13.4％。本发明结果提示，可利霉素有望在治疗对异烟肼和利福霉素耐药的结核分枝杆菌感染疾病中发掘新的用途。

本发明还提供可利霉素为有效成分与药学上可接受的载体组成的组合物在制备抗结核菌感染药物中的应用。

本发明所述的应用，可以采用口服剂型，也可以采用注射剂型或其它任何适宜的剂型。

实施方案：

以下实施例仅为帮助本领域技术人员更好地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。

《实施例1》结核分枝杆菌标本的获取与处理

根据卫生部发布的国标WS288-2008《肺结核诊断标准》的规定，挑选临床表现症状、体征及胸部影像学检查确诊或高度疑似的结核患者。收集被选患者痰、胸水、脑脊液、脓汁标本约2mL，加入带有螺旋帽的50mL离心管中。加入与标本等量的N-乙酰-L-半胱氨酸氢氧化钠(NaOH-NALC)前处理液，漩涡振荡20秒。室温静置18分钟。加入PBS(pH6.8)至40mL，3000g离心20分钟，然后弃上清，留沉淀。加入2mLPBS(pH6.8)，以制备成悬浊液。处理后的标本接种培养基进行固体培养。

《实施例2》结核分枝杆菌标本的分离培养鉴定

1.培养基的配制：

培养基成分如表1所示。按其所列剂量将各成分加入蒸馏水，充分溶解；煮沸30分钟或121℃高压15分钟。

取新鲜鸡卵，经自来水清洗，肥皂水刷洗干净，待干后以75％酒精擦拭消毒。在无菌操作下将卵液倒入已灭菌的有刻度搪瓷杯内，充分搅拌混匀，灭菌纱布过滤后，取1000mL加入，充分混匀；加入2％孔雀绿20mL，充分混匀；分装试管(18mm×180mm)内加入培养基7mL，置蒸汽恒温箱内85℃50分钟凝固。按5％取管制备好的培养基，置入37℃培养48小时，进行无菌检验；无菌检验合格后，放置4℃冰箱备用，一个月内使用。

表1培养基

2.结核杆菌的接种培养：

吸取《实施例1》处理好的标本0.1mL。将其均匀接种于培养基斜面上，混悬液应布满整个斜面。放37℃孵箱内培养。第3天，第7天观察细菌生长情况，其后每周观察一次，但若发现有阳性可疑者，应及时挑出，每天观察。阳性生长须经涂片染色验证。培养至8周未见细菌生长，为结核分枝杆菌培养阴性。

3.结核杆菌的抗酸染色

取上述结核分枝杆菌培养阳性菌苔少许，均匀涂布于玻片上，火焰上固定，用石碳酸复红液染色，火焰上加热5分钟，3％盐酸酒精脱色1分钟左右，用水冲洗，再用碱性美兰溶液复染1分钟，水冲洗，吸干水分后，油镜下观察，染色为红色者为结核分枝杆菌。

《实施例3》可利霉素抗结核分支杆菌活性实验

1.绝对浓度法

1)抗结核药物

可利霉素标准品：源自中国药品生物制品检定所；对照药：异烟肼、利福平采用Sigma公司的标准品。抗结核药物按一定浓度配制成母液，然后按一定量加入培养基配制成所须剂量(表2)。

2)菌株接种

临床标本分离的菌株，涂片确认为抗酸菌的培养物，用含10％吐温80的生理盐水稀释，与McFarland标准比浊管(广东环凯微生物科技有限公司)比浊，制备10^-2mg/mL菌液，接种于含检测药物的培养基。

每批试验设阴性和阳性对照。阴性对照为未加药物培养基。阳性对照为结核分枝杆菌标准株H37Rv。每管接种量为0.1mL。接种后的培养基置37℃培养。

表2抗结核药物加入培养基内的剂量

注：本发明实验中的一线药物用量是根据临床实际用量设计的。

3)结果观察和判定

菌液接种后第3日观察一次，以后每周观察一次，4周报告结果。

培养结果按下列标准判定：

①培养8周未见菌落生长，报告分枝杆菌培养阴性(-)；

②培养基斜面菌落生长20个以下，报告分枝杆菌阳性与菌落数；

③培养基斜面菌落分散生长，菌落数20个以上，占据斜面面积1/4以下者，报告分枝杆菌阳性(1+)；

④培养基斜面菌落分散生长，占据斜面1/4以上，1/2以下者，报告分枝杆菌培养阳性(2+)；

⑤培养基斜面菌落密集生长或部分融合，占据斜面1/2以上，3/4以下者，报告分枝杆菌阳性(3+)；

⑥培养基斜面菌落密集生长，占据斜面面积3/4以上者，报告分枝杆菌阳性(4+)。

2.可利霉素抗结核分支杆菌活性

1)对可利霉素敏感的临床结核分支杆菌

240株临床分离鉴定的结核分支杆菌中，对可利霉素1或20(μg/ml)敏感的菌株有172株(表3)。由表3可见，可利霉素对临床分离的172株敏感菌株中，有92株菌的敏感度与实验室质控株H37Rv相当，占有效菌株的53.48％；其他80株的敏感度明显高于实验室质控株；有54株对1μg/ml的可利霉素敏感，占总有效菌的31.39％。说明可利霉素对临床分离的结核分支杆菌有较好的活性。

表3对可利霉素敏感的临床结核分支杆菌

质控：用结核分支杆菌实验室标准株H37Rv做为阳性对照；

对照：不加药培养基。所有分离菌株在无药培养基生长均为4+。

2)可利霉素与异烟肼对某些临床结核分支杆菌活性的比较

将可利霉素与临床一线抗结核药物异烟肼对临床结核分支杆菌活性进行比较，结果表明，可利霉素20μg/ml对37株异烟肼耐药的临床结核分支杆菌有效(表4)。

表4可利霉素与异烟肼对临床结核分支杆菌灵敏度的比较

3)可利霉素与利福霉素对某些临床结核分支杆菌活性的比较

将可利霉素与临床一线抗结核药物利福霉素对临床分离的结核分支杆菌活性进行比较，实验结果表明，可利霉素20μg/ml对39株利福霉素耐药的临床结核分支杆菌有效(表5)。

表5可利霉素与利福霉素对临床结核分支杆菌灵敏度的比较

可利霉素对某些临床结核分支杆菌活性优于250μg/ml的利福霉素。

4)可利霉素对某些耐异烟肼和耐利福霉素的临床结核分支杆菌活性比较

将可利霉素与耐异烟肼和耐利福霉素的临床结核分支杆菌活性进行比较，实验结果表明，可利霉素20μg/ml对23株临床结核分支杆菌活性优于1μg/ml异烟肼和250μg/ml利福霉素(表6)。

表6可利霉素对某些耐异烟肼和耐利福霉素的临床结核分支杆菌活性比较

本发明实验研究结果表明，可利霉素不仅对临床一线抗结核药物异烟肼和利福霉素敏感菌有活性，而且对部分异烟肼和利福霉素的耐药菌也有活性，有望在临床治疗耐药结核分枝杆菌感染疾病中得到新的应用。

Claims (3)

1.可利霉素在制备抗结核分枝杆菌感染药物中的应用。

2.以可利霉素为有效成分与药学上可接受的载体组成的组合物在制备抗结核分枝杆菌感染药物中的应用。

3.权利要求1或2所述的应用，其特征是，抗结核分枝杆菌感染治疗可以采用口服剂型、注射剂型或其它任何适宜的剂型。