KR102124392B1

KR102124392B1 - mTOR 경로 관련 질병 치료를 위한 화합물

Info

Publication number: KR102124392B1
Application number: KR1020157003924A
Authority: KR
Inventors: 모하마드 호세인 푸어그호라미; 데이비드 엘. 모리스; 로저 아스톤
Original assignee: 피트니 파마슈티컬스 피티와이 리미티드
Priority date: 2012-08-06
Filing date: 2013-08-05
Publication date: 2020-06-19
Also published as: AU2016234924B2; EP3202397A1; ZA201501390B; PL2880014T3; JP2015524446A; WO2014022879A1; CA2881325C; AU2016234924A1; JP6441219B2; CA2881325A1; CN104837812B; US9790176B2; US20150166477A1; EP2880014A1; ES2627099T3; CN104837812A; KR20150081422A; NZ631523A; JP6509386B2; NZ729555A

Abstract

본 발명은 mTOR(라파마이신의 포유류 타겟) 경로 관련 질병의 치료를 위한 화합물에 관한 것이다. 상세하게는, 본 발명은 mTOR 경로 관련 질병의 치료에 있어서 아미노아세토니트릴 유도체(AADs)의 용도에 관한 것이다.

Description

mTOR 경로 관련 질병 치료를 위한 화합물{COMPOUNDS FOR THE TREATMENT OF MTOR PATHWAY RELATED DISEASES}

본 발명은 대체적으로 mTOR(라파마이신의 포유류 타겟) 경로 관련 질병 치료를 위한 화합물에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 mTOR 경로 관련 질병 치료에 있어서 아미노아세토니트릴 유도체들(AADS)의 용도에 관한 것이다.

아미노아세토니트릴 유도체들(Aminoacetonitrile derivatives: AADs)은 약물-저항 선충류(nematodes)에 대항한 구충제 클래스에 속한다. 상기 선충류 혹은 회충(roundworm)은 남성 및 가축의 다수의 병원체를 포함한다. 염전위충(haemonchus contortus)과 같은 위장 선충류는 전세계적으로 가축 생산의 실질적인 경제적 손실을 야기하는 반추동물(ruminants)의 주요 기생충이다.

모네판텔(monepantel: MPL) (N-[(1S)-1-시아노-2-(5-시아노-2-트리플루오로메틸-페녹시)-1-메틸-에틸]-4-트리플루오로메틸설파닐-벤즈아미드)는 상기 AAD의 예이며, 양 위장 기생충의 치료를 위한 살선충제로 입증되었다.

(MPL)

MPL은 다양한 가축-병원성 선충류 종들에 대해 효과가 있는 것으로 밝혀져왔다.

살선충제로서, MPL의 동작 메커니즘은 신경근육 시냅스에서의 신호전달 방해를 야기하는 리간드-개폐형 이온 채널을 통해 이루어진다. 이에 영향받은 기생충은 근육 수축, 마비, 괴사 및 탈피(moulting) 결함에서의 조절장애를 경험할 수 있다. 3개의 니코틴성 아세틸콜린 수용체(nicotinic acetylcholine receptor: nAChR)연관 유전자들이 MPL의 1차 타겟으로 확인되었으며, 이들 3개의 유전자들은 모두 선충 내에서만 존재하는 nAChR 서브유닛들의 DEG-3 서브패밀리를 나타내는 단백질에 대해 인코딩한다. DEG-3 유전자는 이차 트랜스멤브레인 도메인내에서 α7 서브유닛의 것과 유사성을 보유한 nAChRα-서브유닛을 인코딩한다.

현재 놀랍게도 AAD들은 또한 포유류 세포들에서 mTOR 경로 타겟(수용체)에 결합하며, 이에 따라 mTOR 경로 관련 질병들의 치료에 효과적임이 밝혀졌다.

본 발명은 mTOR 경로 관련 질병 치료를 위한 화합물을 제공한다.

본 발명의 제1 측면에 따르면, 일 이상의 mTOR 경로 관련 질병의 치료를 위한 화학식(I)의 화합물, 또는 이의 대사물질(metabolite), 약학적으로 허용가능한 염, 용매화물 혹은 전구약물이 제공된다:

R¹, R², R³ 및 R⁵ 는 각각 독립적으로 H, 알킬, 할로겐, -CF³ 또는 -CN으로부터 선택된다;

R⁴ 및 R⁶ 는 각각 독립적으로 H, 알킬, 할로겐, 알콕시, -CF₃, -OCF₃, -SO₂CF₃, -SOCF₃ 또는 -SCF₃으로부터 선택된다;

X는 헤테로원자, N(알킬) 또는 NH이다; 그리고

n은 1 내지 20이다.

본 발명의 제2 측면에 따르면, 일 이상의 mTOR 경로 관련 질병의 치료를 위한 방법이 제공된다. 상기 방법은 본 발명의 제1 측면에 따른 화학식(I)의 화합물, 또는 이의 대사물질, 약학적으로 허용가능한 염, 용매화물 혹은 전구약물의 치료적으로 유효량을 이를 필요로하는 환자에게 투여하는 것을 포함한다.

본 발명의 제3 측면에 따르면, 본 발명의 제1 측면에 따른 화학식(I)의 화합물, 또는 이의 대사물질, 약학적으로 허용가능한 염, 용매화물 혹은 전구약물의 일 이상의 mTOR 경로 관련 질병들의 치료를 위한 약물 제조를 위한 용도를 제공한다.

본 발명의 제4 측면에 따르면, 일 이상의 mTOR 경로 관련 질병들의 치료 용도의 본 발명의 제1 측면에 따른 화학식(I)의 화합물이 제공되며, 상기 질병은 암(cancer)이 아니다.

본 발명의 제5 측면에 따르면, 일 이상의 mTOR 경로 관련 질병 치료를 위한 방법이 제공되며, 상기 질명은 암이 아니다. 상기 방법은 본 발명의 제1 측면에 따른 화학식(I)의 화합물, 또는 이의 대사물질, 약학적으로 허용가능한 염, 용매화물 혹은 전구약물의 치료적으로 유효량을 이를 필요로 하는 환자에 투여하는 것을 포함한다.

본 발명의 제6 측면에 따르면, 일 이상의 mTOR 연관 질병의 치료를 위한 약물 제조를 위한 본 발명의 제1 측면에 따른 화학식(I)의 화합물, 또는 이의 대사물질, 약학적으로 허용가능한 염, 용매화물 혹은 전구약물이 제공되며, 상기 질병은 암이 아니다,

바람직하게는, R¹은 -CN, H 또는 할로겐이다. 보다 바람직하게는, R¹은 -CN이다. 바람직하게는, R²는 H 혹은 할로겐이며, 보다 바람직하게는 H이다. 바람직하게는, R³은 -CF₃ 또는 할로겐이며, 보다 바람직하게는 -CF₃이다. 바람직하게는, R⁴는 -SCF₃, -SOCF₃, -SO₂CF₃, -OCF₃또는 -CF₃이다. 보다 바람직하게는, R⁴는 -SCF₃ 또는 -SO₂CF₃이다. 바람직하게는,R⁵ 는 H이다. 바람직하게는, R⁶은 알킬이며, 보다 바람직하게는 CH₃이다. 바람직하게는, X는 O이다. 바람직하게는, n은 1 내지 15, 1 내지 10, 1 내지 5, 1 내지 2, 또는 1이다. 가장 바람직하게는, n은 1이다. 바람직하게는, R⁴는 아미드기의 파라(para)위치에 배열된다.

화학식(I)의 화합물은 (R) 혹은 (S)-광학이성질체 또는 라세미체일 수 있다. 바람직하게는 화학식(I)의 화합물은 (S)-광학이성질체이다.

화학식(I)의 화합물은 하기의 화합물들 중에서 선택되는 어느 하나일 수 있다:

;

;

;

또는

상기의 화합물들 각각은 (R)- 또는 (S)-광학이성질체, 혹은 라세미체, 혹은 이의 대사물질, 약학적으로 허용가능한 염, 용매화물 혹은 전구약물이다.

바람직하게는, 화학식(I)의 화합물은 하기의 화합물들 중에서 선택되는 어느 하나일 수 있다.

AAD 2224 (MPL-(R));

AAD 907;

AAD 1336; 또는

AAD 1470.

상기 화합물들 각각은 (R)- 또는 (S)-광학이성질체, 또는 라세미체(특별히 언급되지 않는 한), 혹은 이의 대사물질, 약학적으로 허용가능한 염, 용매화물 혹은 전구약물이다.

보다 바람직하게는, 화학식(I)의 화합물은 MPL(N-[(1S)-1-시아노-2-(5-시아노-2-트리플루오로메틸-페녹시)-1-메틸-에틸]-4-트리플루오로메틸설파닐-벤즈아미드) 또는 이의 대사물질, 약학적으로 허용가능한 염, 용매화물 혹은 전구약물이다.

추가적으로, 본 발명의 화합물은 MPL의 대사물질인 모네판텔 설폰(MPL-SO₂) 또는 이의 대사물질, 약학적으로 허용가능한 염, 용매화물 혹은 전구약물일 수 있다.

바람직하게는, 상기 일 이상의 mTOR 경로 관련 질병은 알츠하이머 병, 헌팅턴 병, 연령-연관(age-related) 질병, 이식 거부 관련 질병, 만성 염증성 질병, 글리코겐축적 관련 질병, 암, 전이(metastasis), 전신 홍반 루푸스, 염증 및 면역 활성화 관련 질병, 빈혈, 백혈구 감소증, 혈소판 감소증, 스텐트 코팅(stent coating) 관련 질병, 신부전, 비만, 당뇨/인슐린 저항, 비-알코올성 지방간 관련 질병, 다낭포성 신장질환, 파킨슨 병 및 섬유증 중에서 선택된다. 바람직하게는. 상기 mTOR 경로 관련 질명은 만성 염증성 질병이며, 이는 류마티스 관절염일 수 있다. 바람직하게는, 상기 섬유증(fibrosis)은 간 섬유증, 심장 섬유증 혹은 폐 섬유증이다. 가장 바람직하게는, 치료 대상 질병은 암 및 전이이다. 바람직하게는, 암은 키나아제(kinase)와 연관된다. 바람직하게는, 상기 키나아제는 사이클린-의존성 키나아제이며, 보다 바람직하게는 cdk2 혹은 cdk4이다.

바람직하게는, 상기 암은 하기의 종류로부터 선택된다: 방광, 유방, 대장, 중피종, 신장, 간, 소세포 폐암, 비-소세포 폐암을 포함하는 폐, 머리 및 목, 식도, 담즙 방광, 난소, 췌장, 위, 자궁 경부, 갑상선, 전립선, 및 편평상피암을 포함하는 피부 암종; 백혈병, 급성 림프구성 백혈병, 급성 림프모구 백혈병, B-세포 림프종, T-세포 림프종, 호지킨 림프종, 비-호지킨 림프종, 모발 세포 림프종, 맨틀 세포 림프종, 골수종, 및 버켓 림프종을 포함하는 림프 계통의 조혈 종양; 급성 및 만성 골수성 백혈병, 골수형성 이상 증후군 및 전골수구 백혈병을 포함하는 골수 계통 조혈 종양; 섬유육종 및 횡문근 육종을 포함하는 중간엽성 종양; 성상 세포종, 신경 모세포종, 신경 교종 및 신경초종을 포함하는 중추 및 말초 신경계의 종양; 및 흑색종, 정상피종, 기형암종, 골육종, 색소성 건피증, 각질가시세포종, 갑상선 여포암, 및 카포시 육종을 포함하는 다른 종양들.

바람직하게는, 치료 대상암은 난소, 유방암, 전립선 또는 중피종의 암으로부터 선택되며, 가장 바람직하게는 상기 치료 대상 암은 난소암이다.

본 발명의 추가적인 측면에 있어서, 화학식(I)의 화합물은 일 이상의 mTOR 경로 관련 질병들의 치료에 사용될 수 있으며, 상기 질병은 암이 아니다.

바람직하게는, 상기 일 이상의 mTOR 경로 관련 질병은 알츠하이머 병, 헌팅턴 병, 연령-연관 질병, 이식 거부 관련 질병, 만성 염증성 질병, 글리코겐축적 관련 질병, 전이(metastasis), 전신 홍반 루푸스, 염증 및 면역 활성화 관련 질병, 빈혈, 백혈구 감소증, 혈소판 감소증, 스텐트 코팅(stent coating) 관련 질병, 신부전, 비만, 당뇨/인슐린 저항, 비-알코올성 지방간 관련 질병, 다낭포성 신장질환, 파킨슨 병 및 섬유증 중에서 선택된다.

바람직하게는, 상기 mTOR 경로 관련 질병은 만성 염증성 질병이며, 이는 류마티스 관절염 혹은 이식 후 기관 거부일 수 있다.

도 1은 MPL에 의한 세포 증식 억제(inhibition)을 나타낸다. 난소 암 세포주 OVCAR-3, A2780 및 SKOV-3 및 일반 HUVEC(통제) 들이 72시간 동안 MPL의 존재 하에(0, 1, 5, 10, 25, 50 and 100 μmol/L)에 배양되었다. 세포 증식에 대한 MPL의 효과는 SRB 분석을 사용하여 평가되었다, 통제(비히클 처리) 세포들이 수집되어 100% 증식을 보였으며, MPL 처리된 그룹들은 통제그룹의 퍼센트로 표시된다. 각각의 약물 농도가 4배로 시험되었으며, 각 실험은 적어도 2번 반복되었다. 데이터(평균±SEM)는 통제그룹의 퍼센트로 제공된다. 통계적 비교를 위해, 각 약물 처리된 그룹은 스튜던트 t 테스트를 사용하여 통제그룹과 비교되었다.
도 2는 OVCAR-3 세포들의 군집 형성 활성에 대한 MPL 효과를 나타낸다. 72 시간 동안 MPL(0, 5, 10 and 25 μmol/L)로 세포들을 배양한 후, 세포들은 세척되고, 한천 플레이트로 이송되고, 통상의 성장 배지로 배향되고, 2주 동안 표준 조건에서 인큐베이션되었다. 이어서, 세포들은 100% 메탄올로 고정되고 1% 크리스탈 바이올렛으로 염색되었다. 집단들(50 이상의 세포 클러스터)이 현미경(배율×5)으로 계수되었다. 서로 다른 실험그룹에 대해 계수된 집단들의 수는 통제 그룹의 퍼센트로 표시된다.
도 3은 MPL이 어떻게 난소암 세포주들의 세포 사이클 분포를 방해하는지를 보여준다. OVCAR-3(도 3a) 또는 A2780(도 3b) 세포들은 48 시간 동안 MPL(0, 5, 10 및 25 μmol/L)로 처리되었다. 프로포듐 요오드화물(propodium iodide) 염색된 세포들이 유동 세포(flow cytometric) 분석을 사용하여 DNA 함량에 대해 분석되었다. 결과들(표 참조)이 G1, S 및 G2/M 페이즈에서 세포들의 퍼센트로 나타난다. 각 값들은 2회의 독립된 실험들의 평균±SEM을 나타낸다.
도 4는 MPL이 세포 사이클 조절 단백질 cdk2, cdk4 및 사이클린 E 및 A의 발현을 방해함을 보여준다. 세포들은 48 시간 동안 MPL(0, 5, 10 and 25 μmol/L)로 처리되었다. 전체 단백질 추출물이 수득되어 전기영동을 통해 분리되었고, 면역블롯(immunoblot)이 지시된 항체를 이용해 검사되었다. 각 추출물 내의 이러한 단백질의 레벨을 보여주는 웨스턴 블롯 분석이 연관 항체들을 사용하여 수행되었다. 이미지는 노광된 방사선투과 필름 스캔을 나타낸다. 항존유전자(house-keeping gene)(GAPDH)가 사용되어 유사한 단백질 로딩 및 블롯 전달이 확인되었다.
도 5는 MPL 처리된 세포들 내의 PARP 및 분리된(cleaved) PARP의 면역블롯 분석을 나타낸다. 세포 배양 조건하에서 성장된 OVCAR-3 및 A2780 세포들이 24, 48 혹은 72 시간 동안 MPL(0, 5, 10, 25 μM)의 다양한 농도들에서 인큐베이션되었다. 세포 용해물들이 이어서 준비되고, PARP 및 cleaved PARP의 결정을 위해 웨스턴 블롯에 의해 분석되었다.
도 6은 A2780 난소암 세포들의 MPL 치료 혹은 U87 신경교종 세포들의 MPL-SO₂ 치료가 액포 형성을 유도하며, 이는 MPL 및 MPL-SO₂이 상기의 세포들 내에서 자가소화(autophagy)를 유도함을 제시한다. 자가소화는 mTOR 억제의 특성이다.
도 7은, 도 6에 도시된 바와 정합성을 가지며, MPL 치료가 ADP/ATP의 세포 비율을 감소시키며, 이는 세포 자가소화의 또 다른 표시이다.
도 8은 인간 난소암 OVCAR-3 세포주 내에서 ATP 및 ADP/ATP 비율에 대한 MPL의 효과를 보여준다. 표준 세포 배양 조건에서 세포들의 MPL에의 노출은 ATP 레벨의 감소 및 결과적으로 ADP/ATP 비율의 증가를 유도한다. 배지 내의 ADP 및 ATP 레벨은 Lonza(Sydney, Australia subsidary)로부터의 ApoGlow 분석 키트와 함께 상용 Abcam의 비색/형광(colorimetric/fluorometric) 분석 키트를 사용하여 측정되었다. 각 수치는 적어도 두 결정 값의 평균 + s.e.m을 나타낸다.
도 9는 세포 생존에 있어서 MPL 방해를 보여준다. A) MPL(0, 5, 10, 25 μM)에 72 시간 동안 노출된 OVCAR-3 세포들의 현미경 이미지. 인간 난소암 세포주 OVCAR-3, A2780, SKOV-3, IGROV-1는 MPL(0, 5, 10, 25, μmol/L)의 존재 하에 72 시간 동안 배양되었다. 세포 생존에 대한 MPL의 효과는 표준 트리판 블루(Trypan blue) 분석을 사용하여 평가되었다. 통제(비히클 처리) 세포들이 수집되어 100% 생존을 나타냈으며, MPL 처리된 그룹은 통제 그룹의 퍼센트로 표현된다. 각 약물 농도는 4배로 시험되었고, 각 실험은 적어도 2회 반복되었다. 데이터(평균±SEM)는 % 통제로 제공된다. 통계적 비교를 위해. 각 약물 처리 그룹은 스튜던트 t 테스트를 사용하여 통제 그룹과 비교되었고, 0.5 이하의 p 값이 유의한 변화를 제공하는 것으로 간주되었다(p<0..5).^* = <0.05, ^** < 0.01, ^*** = p< 0.001.
도 10은 정상 세포들의 생존에 대한 MPL의 효과를 보여주며, MPL의 항-증식성 효과는 암 세포에 대한 것임을 보여준다. 정상 세포들 HOSE, CHO, HEK 및 HUVEC이 72 시간 동안 MPL(0, 5, 10, 25, μmol/L)의 존재 하에서 배양되었다. MPL의 세포 생존에 대한 효과는 표준 트리판 블루 분석을 사용하여 평가되었다. 결과들은 통제군(100%) 대비 평균±SEM 으로 제공된다.
도 11은 MPL이 어떻게 세포 증식을 억제하는지 보여준다. 인간 난소암 세포주들인 OVCAR-3 , A2780 및 SKOV-3 및 IGROV-1이 72 시간 동안 MPL(0, 5, 10, 25, 50 and 100 μmol/L)의 존재 하에서 배양되었다. 세포 증식에 대한 MPL의 효과는 SRB 분석을 사용하여 평가되었다. 통제(비히클 처리) 세포들이 수집되어 100% 세포 증식을 제공하고, MPL 처리된 그룹들은 통제 그룹에 대한 퍼센트로 표현된다. 각 약물 농도는 4배로 시험되었고, 각 실험은 최소한 2뢰 반복되었다. 결과(평균±SEM)는 % 통제군으로 제공된다. 통계적 비교를 위해, 각 약물 처리된 그룹은 스튜던트 t 테스트를 사용하여 통제 그룹과 비교되었다. (A): 아트로핀: 무스카리닉(muscarinic) Ach. 수용체 길항자(receptor antagonist), 토부코라린(Tobucorarine): 니코르티닉(nicortinic) Ach. 수용체 길항자, 메카밀아민(Mecamylamine): 비선택적, 비경쟁적 니코틴성 수용체 길항자; (B): 카르바콜(Carbachol): 무스카린성 니코틴성 ach. 수용체 길항자, 니코틴: 니코틴성 ach. 수용체 길항자, 알파-분가로톡식(bungarotoxin): 선택적 α7, 니코틴성 ach 수용체 길항자.
도 12는 MPL 항증식 효과가 니코틴성 수용체에 독립적임을 보여준다. 세포들은 니코틴, 카르바콜 또는 수용체 길항자, 아트로핀, 메카밀아민(mecamylamine), 투보쿠라린(tubocurarine), 및 α-분가로톡식의 증가된 농도로 예비-처리(30 분)되었다. MPL(5 μM)이 첨가되고, 72 시간 동안 세포 배양 인큐베이터 내에 방치되었다. 각 약물 농도가 4배로 테스트되고, 각 실험은 2회 반복되었다. 결합 수치들(평균±SEM)은 % 통제로 제공된다.
도 13은 MPL이 신경교종(glioma) 세포들의 증식을 어떻게 억제하는지를 보여준다. 정상 세포 배양 조건 및 SRB 증식 분석을 사용하여 U87-MG, U251 신경교종 세포들 대 정상 성상교세포(astrocytes)의 증식에 대한 MPL 처리(0, 5, 10, 25, 50 μM; 72 시간)의 효과가 비교되었다. 데이터는 % 통제로 제공된다.
도 14는 MPL이 어떻게 자가소화를 유도하는지 보여준다. 항암제 저항성(chemo-resistant) U87 신경교종 세포들의 MPL로의 처리는 자가소화를 유도하며, 이는 농도-의존선 방식으로 LC3-II의 증가된 발현에 의해 확인된다. MPL로 처리된 U87-MG 및 U251 신경교종 세포들은 자가소화의 농도-의존성 형성을 나타냈다(액포로 나타남). LC3-I에서 LC3-II로의 농도-의존성 전환은 이러한 세포들에서 증가된 자가소화 현상을 확인해준다.
도 15는 OVCAR-3 및 A2780 세포들의 군집(colony) 형성 활성에 대한 MPL의 효과를 보여준다. 72 시간 동안 MPL(0, 5, 10, 25 μM)로 세포 인큐베이션 후에, 세포들은 세척되고 한천 플레이트로 이송되고, 이들의 적절한 성장 배치로 배양되고, 2주 동안 표준 조건 하에서 인큐베이션되었다. 세포들은 이어서 100% 메탄올로 고정되고, 1% 크리스탈 바이올렛으로 염색되었다. 군집들(50보다 큰 세포들의 클러스터)은 현미경(배율×5)으로 계수되었다. 서로 다른 실험 그룹들에 대해 계수된 군집들의 수는 % 통제로 표현된다.
도 16은 MPL이 난소암 세포주들의 세포 주기 진행을 어떻게 방해하는지 보여준다. OVCAR-3 또는 A2780 세포들은 48 시간 동안 MPL(0, 5, 10, 25 μM)로 처리되고, PI로 세포들을 염색한 후, 유동 세포 분석(flow cytometric analysis: FACS)에 의해 검사되었다. 도면 및 데이터는 세포 주기의 다양한 페이즈에서 세포 분포의 MPL-유도 변화를 제공하며, G1, S 및 G2/M 페이즈에서의 세포들의 퍼센트로 나타난다. 각 수치는 2 독립 결정의 평균±SEM을 나타낸다.
도 17은 MPL이 세포 주기 조절 단백질 cdk2, cdk4, 사이클린 E 및 A를 어떻게 방해하는지 보여준다. 세포들은 24, 48 혹은 72 시간 동안 MPL(0, 5, 10, 25 μM)로 처리되었다. 전체 단백질 추출물들이 수집되고, 전기영동에 의해 분리되고, 지시된 항체들로 면역블롯이 시행되었다. 각 추출물에 있어서 상기의 단백질들의 레벨을 나타내는 웨스턴 블롯 분석이 관련 항체를 이용하여 수행되었다. 이미지는 노광된 방사선투과 필름 스캔을 나타낸다. 항존유전자(GAPDH)가 사용되어 유사한 단백질 로딩 및 블롯 전달이 확인되었다.
도 18은 MPL이 PARP를 분리함을 보여준다. OVCAR-3 또는 A2780 세포들의 24, 48 또는 72 시간 동안 MPL(0, 5, 10, 25 μM)에의 노출은 PARP의 분리를 야기하였으며, 이는 세포 분해를 유도하며 세포 사멸의 마커로서 기능한다.
도 19a 및 도 19b는 MPL이 어떻게 ATP 레벨을 감소시키는지 보여준다. OVCAR-3 또는 A2780 세포들의 24, 48, 혹은 72시간 동안 MPL(0, 5, 10, 25 μM)에의 노출은 PARP의 분리를 야기하며, 이는 세포 분해를 유도하고, 세포 사멸의 마커로서 기능한다.
도 20은 누드 마우스에 있어서, s.c.(피하: subcutaneous) 종양 성장에 대한 i.p.(복강내: intraperitoneal) 투여된 모네판텔(monepantel)의 효과를 나타낸다. 2.5 백만 로그-페이즈 성장 OVCAR-3 세포들이 각 마우스의 좌측 옆구리 내부로 s.c. 주사되었다. 종양 성장이 캘리퍼 측정에 의해 검지되었고, 종양 부피는 수직 직경을 측정함으로써 결정되었다. 측정된 종양 부피는 1/2(길이×너비2) 식에 근거하여 계산되었으며, 직경은 두 수직 측정치 중 짧은 것이다. 처리는 종양 세포 주입 7일 후 개시되었으며, 이 전에 마우스들은 랜덤화되어 처리 혹은 통제 그룹으로 할당되었다(그룹당 6). 0.5% HPMC 내에 서스펜딩된 모네판텔은 i.p.로 주 3회 2.5 혹은 25 mg/kg으로 투여되었다. 통제 그룹은 비히클 만으로 처리되었다.
도 21은 누드 마우스 내의 s.c. 종양 성장에 대한 i.p. 투여된 모네판텔의 효과를 보여준다. 로그-페이즈 성장 OVCAR-3 세포들이 각 마우스의 좌측 옆구리 내부로 s.c. 주입되었다. 종양 성장이 캘리퍼 측정에 의해 검지되었으며, 종양 부피는 수직 직경을 측정하여 결정되었다.측정된 종양 부피는 1/2(길이×너비2) 식에 근거하여 계산되었으며, 너비는 두 수직 측정치들 중에서 짧은 것이다. 처리는 종양 세포 주입 7일 후 개시되었으며, 그 전에 마우스들은 랜덤회되고, 처리 혹은 통제 그룹으로 할당되었다(그룹당 6). 0.5% HPMC 내에 서스펜딩된 모네판텔이 주 3회 25 혹은 50 mg/kg으로 i.p. 투여되었다. 통제 그룹은 비히클만으로 처리되었다.
도 22는 누드 마우스에 있어서 종양 성장에 대한 구강 모네판텔의 효과를 보여준다. OVCAR-3 세포들이 각 마우스의 좌측 옆구리 내부로 s.c. 주입되었다. 종양 성장이 캘리퍼 측정을 통해 검지되었고, 종양 부피는 수직 직경에 의해 결정되고, 측정된 종양 부피는 1/2(길이×너비2) 식에 근거하여 계산되었으며, 너비는 두 수직 측정치들 중에서 짧은 것이다. 처리는 종양 세포 주입 7일 후에 개시되었고, 그 전에 마우스들은 랜덤화되고 처리 혹은 통제 그룹에 할당되었다(그룹 당 6). 0.5% HPMC 내에 서스펜딩된 모네판텔(100 μL)이 구강을 통해 주 3회 50 또는 100 mg/kg으로 투여되었다. 통제 그룹은 비히클만으로 구강 처리되었다.
도 20 내지 도 22는 일반적으로 여성 누드 마우스에 있어서, s.c. 이종이식에 대한 MPL의 효과를 보여준다. 마우스들은 좌측 옆구리로 2.5 백만 로그-페이즈 성장 인간 OVCAR-3 세포들로 접종되었다. 종양 성장이 캘리퍼 측정을 통해 검지되었고, 종양 부피는 수직 직경 측정을 통해 결정되었다. 측정된 종양 부피는 1/2(길이×너비2) 식에 근거하여 계산되었으며, 너비는 두 수직 측정치들 중 짧은 것이다. 처리는 종양 세포 주입 7일 후 개시되었고, 그 전에 마우스들은 랜덤화되어 처리 또는 통제 그룹으로 할당되었다(그룹 당 5-6). 0.5% HPMC 내 서스펜딩된 모네판텔이 2.5 또는 25 mg/kg(도 19), 25 및 50 mg/kg(도 20) 혹은 구강으로 50 및 100 mg/kg으로 i.p. 투여되었으며, 모두 주 3회 수여되었다. 통제 그룹 마우스는 정확히 유사한 방식 및 시간에 의해 0.5% HPMC의 유사 부피를 수여받았다.
도 23은 종양 조직에 있어서, MPL이 어떻게 괴사를 유도하는지 보여준다. 누드 마우스의 피하 이종이식으로부터의 종양 조직이 격일로 50 또는 100 mg/kg/day으로 구강 투여를 통해 MPL 처리되었다. 종양의 조직학적 이미지가 헤마톡실린(hematoxylin) 및 에오신(eosin) 염색(H&E; top row) 내에서 나타나며, 이는 상당한 약물-유도된 괴사(흑색 화살표 머리: 배율×10)를 지시한다. MPL 처리된 마우스로부터 절개된 종양으로부터의 종양 조직학적 대표 이미지는 100 mg/kg(s.c. 종양, 구강 처리, 2주간 주×3)의 높은 도오즈에서 광범위한 괴사를 보인다.
도 24는 세포 배양 조건에서 지정된 시점에서 10 μM MPL로 처리된 OVCAR-3 세포들을 보여준다. 1, 4 혹은 24시간 동안 세포 배양 조건하에서 10 μM MPL로 처리된 OVCAR-3 세포들로부터 제조된 세포 용해물의 웨스턴 블롯 분석이 수행되었다. 결과들은 mTOR 및 이의 다운-스트림 신호 경로 p70S6K 양자의 인산화(활성화)의 억제를 보여준다.
도 25는 인 비트로에서 MPL로 처리된 인간 난소 OVCAR-3 세포들의 단백질 발현을 보여준다. 48 시간 동안 세포 배양 조건 하에서 0, 5, 10, 15 및 25 μM MPL로 처리된 OVCAR-3 세포들로부터 제조된 세포 용해물의 웨스턴 블롯 분석이 수행되었다. 결과들은 c-Myc 및 사이클린 D1 발현의 하향조절(down-regulation)을 보여준다.
도 26은 MPL 처리된 OVCAR-3 종양들에서 mTOR 관련 신호전달의 종양 발현에 대한 MPL의 억제 효과를 보여준다. 여성 누드 마우스에서 s.c. 성장된 OVCAR-3 종양들로부터 제조된 종양 용해물의 웨스턴 블롯 분석이 수행되었다. 마우스들은 i.p. 세포 접종 후 8일부터 3주 동안 MPL(i.p. 투여, 0.5% HPMC 내 서스펜딩된 25, 50 mg/kg) 혹은 비히클(0.5% HPMC)로 처리되었다. 최종 도오즈 24시간 후, 종양들은 -80 ^oC에서 절단되고 냉각되었다. 종양의 웨스턴 블롯 분석은 mTOR 신호전달의 억제를 보여준다. c-Myc, 사이클린 D1 및 E2 및 CDKs 2 및 4와 함께 mTOR의 단백질 발현이 MPL 처리된 마우스로부터 절개된 종양에서 억제되었다.
도 27a 및 도 27b는 NF-кB p65 인산화에 대한 MPL의 억제 효과를 보여준다.
도 28은 IкB-α의 인산화에 대한 MPL의 억제 효과를 보여준다.
도 29는 IKK 인산화에 대한 MPL의 억제 효과를 보여준다.
도 30은 MPL이 IL-6 발현의 하향 조절을 야기함을 보여준다.
도 31은 MPL이 TGF-β 발현의 하향 조절을 야기함을 보여준다.
도 32는 MPL이 NO 발현을 제거함을 보여준다.

용어의 정의(Definition)

"할로겐(halogen)"은 불소, 염소, 브롬 혹은 요오드, 바람직하게는 불소 또는 염소를 의미한다.

"알킬(alkyl)"은 직쇄 혹은 분지형일 수 있으며, 사슬 내 약 1 내지 약 20의 탄소 원자수를 갖는 지방족 탄화수소 그룹을 의미한다. 바람직한 알킬기는 사슬 내 약 1 내지 약 12 탄소원자를 포함한다. 보다 바람직한 알킬기는 사슬 내 약 1 내지 약 6 탄소 원자를 포함한다. "분지형(branched)"은 메틸, 에틸, 프로필과 같은 일 이상의 저급 알킬이 선형 알킬 사슬이 부착된 것을 의미한다. "저급 알킬(lower alkyl)"은 직선 혹은 분지형일 수 있는 사슬 내에 약 1 내지 약 6의 탄소 원자를 갖는 그룹을 의미한다. "알킬"은 비치환 혹은 동일하거나 상이할 수 있는 일 이상의 치환기로 선택적으로 치환될 수 있으며, 각 치환기는 독립적으로 할로, 알킬, 아릴, 시클로알킬, 시아노, 히드록시, 알콕시, 알킬티오, 아미노, -NH(알킬), -NH(시클로알킬), -N(알킬)₂, 카르복시 및 -C(O)O-알킬로 구성된 그룹에서 선택된다. 적절한 알킬 그룹의 비제한적인 예들은 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필 및 t-부틸을 포함한다.

"아릴(aryl)"은 그 자체로 혹은 또 다른 치환기의 부분으로서, 방향족 시클릭 탄화수소 라디칼을 의미한다. 바람직한 아릴 그룹은 6 내지 10의 탄소 원자들을 갖는다. 용어"아릴"은 단일 고리 시스템 뿐만 아니라 다중 고리 시스템도 포함한다. 본 발명의 용도를 위한 바람직한 아릴기는 페닐 및 나프틸을 포함한다. 용어"아릴"은 또한 부분적으로 방향적인 융합(fused) 시클릴 탄화수소를 포함한다(즉, 융합 고리의 하나가 방향족이고 다른 하나는 비방향족). 부분적으로 방향족인 예시적인 아릴기는 인다닐(indanyl)이다.

"헤테로아릴(heteroaryl)"은 그 자체로 또는 또 다른 치환기의 부분으로서, C, N, O 및 S로부터 선택된 5 내지 12 고리 원자들을 갖는 시클릭 혹은 폴리시클릭 그룹을 의미하며, 여기서 적어도 하나의 고리 헤테로원자는 O, N 또는 S이고, 구성 고리 중 적어도 하나는 방향족이다. 본 발명 용도의 헤테로아릴 그룹의 예들은 카르바졸릴(carbazolyl), 카르볼리닐(carbolinlyl), 크로메닐(chromenyl), 시놀리닐(cinnolinyl), 퓨라닐(furanyl), 벤조퓨라닐(benzofuranyl), 벤조퓨라자닐(benzofurazanyl), 이소벤조퓨라닐(isobenzofuranyl), 이미다졸릴(imidazolyl), 벤즈이미다졸릴(benzimidazolyl), 벤즈이미다졸로닐(benzimidazolonyl), 인다졸릴(indazolyl), 인돌릴(indolyl), 이소인돌릴(isoindolyl), 인돌리닐(indolinyl), 인돌라지닐(indolazinyl), 인디닐(indynyl), 옥사디아졸릴(oxadiazolyl), 옥사졸릴(oxazolyl), 벤족사졸릴(benzoxazolyl), 이속사졸릴(isoxazolyl), 피라닐(pyranyl), 피라지닐(pyrazinyl), 피라졸릴(pyrazolyl), 벤조피라졸릴(benzopyrazolyl), 피리다지닐(pyridazinyl), 피리딜(pyridyl), 피리미디닐(pyrimidinyl), 피롤릴(pyrrolyl), 퀴놀릴(quinolyl), 이소퀴놀릴(isoquinolyl), 테트라졸릴(tetrazolyl), 티아졸릴(thiazolyl), 이소티아졸릴(isothiazolyl), 티아디아졸릴(thiadiazolyl), 티에닐(thienyl), 벤조티오에닐(benzothioenyl), 벤조티아졸릴(benzothiazolyl), 퀴녹살리닐(quinoxalinyl), 트리아지닐(triazinyl) 및 트리아졸릴(triazolyl), 및 이들의 N-옥사이드를 포함한다.

헤테로아릴 그룹의 일 서브그룹은 5개의 고리 원자를 갖는다. 이러한 실시예의 예시적인 헤테로아릴 그룹은 피라졸릴, 피리딜, 티아졸릴 및 이미다졸릴이다.

헤테로아릴 그룹의 또 다른 서브그룹은 6개의 고리 원자를 갖는다. 이러한 실시예의 예시적인 헤테로아릴 그룹은 피리디닐 및 피리미디닐이다.

용어"헤테로아릴"은 또한 부분적으로 방향족인 융합 시클릭 헤테로시클릭 고리(즉, 융합 고리의 하나가 방향족, 다른 하나는 비-방향족)를 포함한다. 부분적으로 방향족인 예시적인 헤테로아릴 그룹은 벤조디옥솔(benzodioxol)이다.

본 출원에 정의된 헤테로아릴 그룹이 치환될 때, 치환기는 상기 헤테로아릴 그룹의 치환이 가능한 원자가를 갖는 고리 탄소 원자에 결합되거나 고리 헤테로원자(즉, 질소, 산소 또는 황) 상에 결합될 수 있다. 바람직하게는, 상기 치환기는 고리 탄소 원자에 결합된다. 유사하게, 헤테로아릴 그룹이 본 출원에서 치환기로 정의될 때, 부착점은 부착이 허용되는 원자가를 갖는 헤테로아릴 그룹의 고리 탄소 원자, 혹은 고리 헤테로원자(즉, 질소, 산소 혹은 황)에 존재할 수 있다. 바람직하게는, 상기 부착점은 고리 탄소 원자에 있다.

"헤테로원자(heteroatom)"는 N, O, P 및 S로부터 선택되는 원자를 의미한다. 필요한 경우, 임의의 비특정 원자가가 H, OH, 카르보닐, n-알킬 또는 알콕시 로부터 독립적으로 선택된다.

"n"은 1 내지 20, 바람직하게는 1 내지 10, 보다 바람직하게는 1 내지 6, 및 가장 바람직하게는 1 내지 4이다.

"알콕시(alkoxy)"는 알킬-O- 그룹을 의미함, 알킬기는 전술한 바와 같다. 적절한 알콕시 그룹의 비제한적인 예들은 메톡시, 에톡시, n-프로폭시, 이소프로폭시 및 n-부톡시를 포함한다. 모체에의 결합은 에테르 산소를 통해 연결된다.

"약학적으로 허용가능한 염(pharmaceutically acceptable salt)"은 화학식(I)의 화합물의 생물학적 효과 및 특성을 보유하는 산-첨가 염 혹은 염기-첨가 염을 지칭하며, 적절한 비독성 유기 혹은 무기 산 또는 염기로부터 형성된다. 산-첨가 염의 예는 염산, 브롬산, 요오드산, 황산, 술팜산(sulfamic acid), 인산 및 질산과 같은 무기산으로부터 유래된 것, p-톨루엔 술폰산, 살리실산, 메탄술폰산, 옥살 산, 숙신 산, 시트르산, 말산, 락트산, 푸마르산 등과 같은 유기산으로부터 유래된 것을 포함한다. 염기-첨가 염의 예는 염기-첨가 염의 예는 암모늄, 포타슘, 소듐 및 예를 들면, 테트라메틸암모늄 히드록사이드와 같은 4차 암모늄 히드록사이드로부터 유래된 것을 포함한다. 약학적 화합물(즉, 약물)의 염으로의 화학적 변형은 약학 화학자가 공지된 기술을 통해 향상된 물리적 및 화학적 안정성, 흠습성, 유동성 및 용해성을 갖도록 달성될 수 있다(예를 들면, H. Ansel et. al., Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems (6th Ed. 1995) at pp. 196 and 1456-1457. 참조).

약학적으로 허용가능한 캐리어, 부형제 등에서의 "약학적으로 허용가능한(pharmaceutically acceptable)" 은 특정 화합물이 투여되는 개체에 있어서 약물학적으로 수용가능하며, 실질적으로 비독성인 것을 의미한다.

치환된 알킬 등에서의 "치환된(substituted)"은 다르게 지시되지 않는 한 일 이상의 위치에서 치환이 일어날 수 있으며 각 치환 사이트에서의 치환기는 독립적으로 지정된 옵션으로부터 선택됨을 의미하며, 이는 다양한 사이트에서 동시에 1보다 많은 치환기가 존재할 수 있음을 의미한다.

본 발명의 화합물들의 "전구약물(prodrug)"및 "용매화물(solvate)"은 또한 본 출원에서 고려된다. 전구약물에 대한 검토는 T. Higuchi 및 V. Stella, Pro-drugs as Novel Delivery Systems (1987) 14 of the A.C.S. Symposium Series, 및 Bioreversible Carriers in Drug Design, (1987) Edward B. Roche, ed., American Pharmaceutical Association/Pergamon Press와 같은 문헌에서 제공된다. 용어"전구약물"은 인 비보에서 변형되어 화학식(I)의 화합물 또는 화합물의 대사물질, 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물을 생성하는 화합물(예를 들면, 약물 전구체)를 의미한다. 변형은 다양한 메커니즘(예를 들면, 대사 또는 화학적 공정)에 의해 발생할 수 있다. 전구약물 용도에 관한 검토는 T. Higuchi 및 W. Stella, "Prodrugs as Novel Delivery Systems," Vol. 14 of the A.C.S. Symposium Series, 및 Bioreversible Carriers in Drug Design, ed. Edward B. Roche, American Pharmaceutical Association and Pergamon Press, 1987. 과 같은 문헌에서 제공된다.

본 발명의 화합물의 대사물질(metabolites)"은 대사과정의 중간체 및 생성물을 지칭한다.

화학식(I)의 화합물들은 비대칭 혹은 키랄 중심을 함유할 수 있으며, 그러므로 다양한 입체이성질체 형태로 존재할 수 있다. 화학식(I)의 화합물들의 모든 입체이성질체 형태뿐만 아니라 라세믹 혼합물을 포함하는 이들의 혼합물도 본 발명의 일부를 형성하는 것으로 의도된다. 추가적으로, 본 발명은 모든 기하 및 위치 이성질체를 포괄한다. 부분입체이성질체 혼합물 또한 예를 들면 크로마토그래피 및/또는 분별 결정과 같은 당해 기술분야에 통상의 지식을 가진 자에게 잘 알려진 방법을 통해 이들의 물리적 화학적 차이에 근거하여 개별 부분입체이성질체로 분리될 수 있다. 광학이성질체들은 적절히 광학적으로 활성 화합물(예를 들면, 키랄 알코올 또는 Mosher 산 염화물과 같은 키랄 보조제)과 반응에 의해 광학이성질체 혼합물을 부분입체이성질체 혼합물로 변환하고, 부분입체이성질체를 분리하고, 개별 부분입체이성질체를 대응하는 순수한 광학이성질체로 변환(예를 들면, 가수분해)함에 의해 분리될 수 있다. 광학이성질체는 또한 키랄 HPLC 칼럼 사용을 통해 분리될 수 있다. 본 발명의 키랄 중심은 IUPAC 1974에서 정의된 바와 같이 S 또는 R 배향을 가질 수 있다.

용어"염(salt)", "용매화물(solvate)", 또는 "전구약물"등의 사용은 본 발명의 화합물들의 광학이성질체, 입체이성질체, 회전이성질체, 토토머, 위치 이성질체, 라세메이트 또는 전구약물에 동일하게 적용되는 것으로 의도된다.

본 출원에 사용되는 단수 형태("a","an" 및 "the")는 문맥 상 명확하게 다르게 해석되지 않는 한 복수를 포함한다.

본 출원에 사용되는 용어"포함하는(comprising)"은 "including"을 의미하며, "comprising", "comprise"와 같은 이의 다양한 변형 역시 이에 상응하는 변형 의미를 갖는다. 따라서, 예를 들면 화학식(I)의 화합물을 "포함하는"약학적 조성물은 그 화합물로 배타적으로 구성될 수 있으며, 혹은 일 이상의 추가 성분들(예를 들면, 약학적으로 허용가능한 캐리어, 부형제 및/또는 희석제)를 포함할 수 있다.

본 출원에 사용되는 용어"복수(plurality)"는 하나 보다 많음을 의미한다, 특정한 측면 또는 실시예들에 있어서, 복수는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 또는 그 이상, 및 이로부터 유추되는 정수, 및 이로부터 유추가능한 임의의 범위를 의미할 수 있다.

"치료적으로 유효량(therapeutically effective amount)"은 실질적으로 인간 종양 세포주를 포함하는 인간 종양 세포의 증식 및/또는 분화를 실질적으로 억제, 방지하는 화학식(I)의 화합물, 이의 대사물질, 약학적으로 허용가능한 염, 용매화물 또는 전구약물의 적어도 하나의 양을 의미한다. 본 출원에 사용되는 용어"치료적으로 유효량"은 본 출원의 용도의 제제 혹은 조성물의 비독성이나 원하는 치료효과를 제공할 수 있는 충분한 양을 그 의미내에 포함한다. 요구되는 정확한 양은 치료되는 종, 개체의 연령 및 일반 조건, 치료되어야 할 증상의 심각도, 투여되는 특정 제제, 투여 방법 등과 같은 인자들에 의존하여 개체에 따라 변할 수 있다. 따라서, 모든 실시예들에 적용가능한 정확한 "유효량"은 특정할 수 없다. 그러나, 임의의 주어진 경우에 있어서, 적절한"유효량"이 당해 기술 분야에 통상의 지식을 가진자에 의해 단지 통상적인 실험을 통해 결정될 수 있다.

상세한 설명(Detailed Descriptions)

AAD(예를 들면, 화학식(I))는 유기 합성 방법의 통상적인 지식을 사용하여 합성될 수 있는 화합물 계통이다. 예를 들면, AAD는 페놀의 클로로아세톤으로의 유도체화에 의해 합성될 수 있다. Strecker 반응 및 수득되는 아민의 아로일 염화물(aroyl chlorides)로의 아실화(스킴 1에 도시된 바와 같이)가 포함된다. 필요한 경우, 특정 광학이성질체가 예를 들면, 키랄 분할에 의해 수득될 수 있다(스킴 2에 도시된 바와 같이).

스킴(Scheme) 1

스킴 2

AAD는 약물-저항성 선충을 처리하기 위해 이전부터 사용되어온 화학물질 클래스이다. 현재까지 연구는 선충내의 니코틴성 아세틸 콜린 수용체를 타겟팅하는 MPL에 집중되어왔으며, 반추 동물 내의 기생충 치료에 광범위하게 사용되어왔다.

mTOR(the mammalian Target Of Rapamycin)은 또한 라파마이신 혹은 FK506 결합 단백질 12-라파마이신 연관 단백질 1(FARP1)의 기계론적 타겟으로 알려져있으며, 인간내에서 FRAP1 유전자에 의해 인코딩되는 단백질이다. mTOR은 세포 성장, 세포 증식, 세포 운동성, 세포 생존, 단백질 합성 및 전사를 조절하는 세린/트레오닌 단백질 키나아제(및 특이적으로 포스파티딜리노시톨 3-키나아제-연관 키나제 단백질 패밀리에 속함)이다. mTOR은 mTORC1 및 mTORC2의 2 분자 복합체의 촉매적 서브유닛이다. MPL이 mTOR 경로를 방해함에 있어서, 라파마이신과 유사하다는 사실에도 불구하고, 라파마이신은 일반적으로 항기생충성이 아니며, MPL이 알려진 mTOR 억제자와 다름을 암시한다. 그러나, 라파마이신과 같이, AAD는 면역억제 성질 및 항암 활성을 갖는다.

단백질의 TOR 패밀리는 다면발현 기능을 가지며, 액틴 세포골격, 멤브레인 수송, 단백질 분해, PKC 신호전달 및 리보솜 생체내 생성의 조직에 있어서, 아미노 산 및 다른 필수적 영양분의 세포 내 농도에 반응하여 mRNA 전사 및 단백질 번역의 개시의 억제에 참여한다. 추가적으로, mTOR 경로는 많은 다른 세포 공정을 조절하며, 암, 비만, 타입 2 당뇨 및 신경퇴화를 포함하는 증가하고 있는 병리학적 증상에 관여한다.

2개의 mTOR 경로 함유 복합체들이 있다: 부 단백질 Raptor(mTOR의 조절-연관 단백질)와 상호작용에 의해 정의되는 라파마이신-민감성 복합체(mTORC1); 및 RICTOR(mTOR의 라파마이신-불감성 동반자)와의 상호작용에 의해 정의되는 라파마이신-불감성 복합체(mTORC2). mTORC1는 잘 특성화되는 mTOR 이펙터 S6 키나제 1 (S6K1, p70S6K으로도 알려짐) 및 진핵 개시 인자 4E(eIF4E)-결합 단백질 1(4EBP1, 열- 및 산-안정 단백질로 조절된 인슐린 1(PHAS1)을 인산화하는 유전자에 의해 인코딩됨)을 인산화한다. mTORC2는 AKT/PKB 뿐만 아니라 액틴 세포골격을 제어한다.

mTOR는 필수적인 신호 형질변환 경로를 조절하며, 세포 주기 진행에 성장 자극을 결합하는데 관여한다. 성장-유도 신호에 반응하여, 휴지상태의 세포들이 단백질 생성물이 세포 주기의 G1 페이즈를 통해 진행하는데 요구되는 mRNA의 서브셋의 번역을 증가시킨다. PI3K 및 AKT는 성장 인자 수용체의 mTOR의 인산화 및 활성화 상태로의 융합을 연결시키는 상류 경로의 핵심 요소이다. 암 세포의 발생 및 증식에 있어서, PI3K/ AKT/mTOR 경로의 역할에 관하여, 상기 PI3K/ AKT/mTOR 경로의 구성들은 표면 수용체의 적혈구 백혈병 바이러스 암유전자 동족체(ERB) 패밀리, 인슐린-유사 성장 인자 유사체(IGFRs), 및 발암유전자 Ras에 의해 활성화되는 것으로 밝혀져왔다. 인슐린-유사 성장-인자 1 수용체(IGF1R) 및 이의 리간드, 인슐린 성장-인자 1(IGF1)의 과발현은 공통적으로 일부 암들에서 발생한다. 추가적으로, 상기 PI3K/AKT/mTOR 경로의 일부 구성들이 악성 종양에서 구성적으로 활성화됨이 밝혀져왔다. PTEN-결핍 악성종양에서 PI3K/AKT/mTOR 신호전달 구성들의 초활성화는 암이 자주 성장 및 유지에 대해 이러한 경로에 의존함을 제시한다.

인산화에 이어, mTOR는 S6K1 및 4EBP1을 포함하는 mRNA의 특정 서브셋들의 번역을 제어하는 두 구별되는 하류 신호전달 경로를 조절한다. PI3K 및/또는 AKT의 어느 하나의 활성화, 및/또는 PTEN 억제자 기능의 손실은 mTOR를 통한 S6K1 및 4EBP1 양자의 인산화를 유도하는데 필요하며 충분하다. 따라서, 라파마이신 유도체는 활성화된 PI3K 또는 AKT를 발현하거나 PTEN이 결여된 세포들 내에서 S6K1 및 4EBP1의 인산화를 차단한다. mTOR이 신호를 전달하는 공정은 mTOR와 복합체를 형성하며, 또한 4EBP1 및 S6K1 양자와 결합하는 150 kDa의 진화적으로 보존된 단백질인 Raptor와의 상호작용에 의존한다. Raptor 자체는 키나아제가 아니나, 4EBP1 및 S6K1의 mTOR 경로 중재 인산화를 위해 요구된다.

4EBP1는 eIF4F 복합체의 mRNA 캡-바인딩 서브유닛인 eIF4E과의 연광을 통해 단백질 번역 개시를 억제하는 소 단백질이다. eIF4E의 단독 과발현은 세포 변형을 유도하는데 충분하다. 4EBP의 eIF4E에의 결합은 4EBP1의 인산화 상태에 의존한다.

휴지 세포들 및 성장-인자-결핍 조건에서의 mTOR의 번역 단백질과의 상호작용에 관하여, 비인산화된 4EBP1이 eIF4E에 강하게 결합하고, 단백질 번역의 개시를 억제한다. 호르몬, 성장 인자, 미토겐, 사이토킨 및 G-단백질-결합 길항자에 의해 촉발되는 증식 자극에 반응하여, 4EBP1는 mTOR 및 다른 키나아제들의 활동을 통해 일부 세린/트레오닌 사이트들에서 인산화되고, 4EBP1로부터 eIF4E의 분리를 촉진한다. 유리된 eIF4E는 이어서 eIF4G(대형 스캐폴딩(scaffolding) 단백질), eIF4A(ATP-의존성 RNA 헬리카제) 및 eIF4B에 결합하고, 다중 서브유닛 eIF4F 복합체를 형성하고, cap-의존성 단백질 번역을 촉진한다. 이러한 사건들의 단계진행은 c-MYC, 시클린 D1 및 오르니틴 디카르복실레이즈를 인코딩하는 mRNA를 포함하는 5′-미번역 말단 영역(5′-UTR) 내의 조절 요소들과의 mRNA 번역의 증가를 유도한다. 대조적으로, 성장-인자 결핍 또는 라파마이신으로 처리는 4EBP1의 탈인산화, 증가된 eIF4E 결합 및 세포 주기의 G1에서 S 페이즈 전이를 위해 요구되는 5′-UTRs에 의한 mRNA의 번역 개시의 수반되는 손상을 야기한다.

mTOR가 직접적으로 다양한 분열촉진 자극에 의해 유도되는 4EBP1 인산화 및 eIF4E의 활성화에 관여함을 제시하는 충분한 실험적 증거들이 존재한다. 예를 들면, 인슐린-처리된 세포들에서 4EBP1의 인산화는 mTOR 억제자에 의해 효과적으로 차단됨이 밝혀졌다. 실제적으로, eIF4E 대비 4EBP1의 낮은 세포 비율은 mTOR 억제자에 대한 저항을 야기할 수 있다. 더욱이, mTOR에 의해 인산화된 4EBP1 사이트들은 인슐린 처리에 의해 유도된 것들과 동일하며, mTOR 억제제에의 노출에 이어 빠르게 탈인산화된다. 일부 관찰은 mTOR이 또한 간접적으로 단백질 세린/트레오닌 포스파타아제의 억제자로서 작용할 수 있으며, G1에서 S로의 페이즈 전이를 위해 적절한 조건에서 4EBP1를 탈인산화시킴을 제시한다.

MPL이 선충 내에서 아세틸 콜린 수용체에 결합하며, 포유류 세포에서는 활성이 부족함을 제시하는 실질적 증거가 존재한다. 그러나, 상기에 언급한 것처럼, MPL이 포유류 세포 내에서 mTOR 수용체에 선택적으로 결합됨이 놀랍게도 발견되었다.

본 발명의 화합물들은 mTOR 수용체들에 결합함에 의해 포유류 세포들에서 mTOR 키나아제 억제자로서 선택적으로 작용하며, 그러므로 임의의 mTOR 경로 관련 질병의 치료에 사용될 수 있다.

라파마이신 및 이의 유사체와 같은 많은 암 약물들이 촉매 사이트로부터 분리된 도메인을 통해 mTOR와 결합하며, 이에 따라 mTOR 기능의 단지 일부만을 차단한다. 이러한 약물들은 mTOR 경로 의존성 생존 경로를 활성화할 수 있으며, 치료 실패로 이어질 수 있다.

대조적으로, 본 발명이 화합물은 ATP(아데노신 트리포스페이트)와 유사한 사이즈를 가지고, 그러므로 mTOR의 촉매 사이트에서 ATP와 경쟁할 수 있다. mTOR의 촉매 사이트에서의 본 발명의 화합물들의 이러한 상호작용은 생존 경로의 활성화 위험 없이 mTORC1 및 mTORC2의 모든 키나아제-의존성 기능들을 억제한다. 도 8에서, 난소암 세포에서 MPL이 ATP 레벨을 감소시키며, 이는 MPL이 mTOR의 촉매 사이트 결합함을 강하게 제시한다.

MPL은 구충제로 사용되는 경우 낮은 독성 및 동물들에 있어 2000mg/kg 도오즈까지 용인가능함에 기인하여 mTOR의 매우 선택적 억제를 제공하는 것으로 여겨진다. 동물 모델에서, 본 발명자들은 MPL의 항암 효과가 놀랍게도 5-50mg/kg 범위의 낮은 도오즈에서 관찰됨을 밝혀내었다.

mTOR 신호전달은 암에 있어서 자주 상향 조정된다. MPL의 포유류 mTOR 수용체와의 상호작용은 종양 성장의 억제를 야기하는 종양 세포에 대해 선택적일 수 있다(본 출원에 참조로서 병합되는 호주 임시 특허 출원 제2012901199호 및PCT/AU2013/000290 참조).

예를 들면, 본 발명자들은 MPL 및 MPL-SO₂와 같은 화학식(I)의 화합물들이 놀랍게도 항-암 활성을 가짐을 발견하였다. 보다 구체적으로, MPL 및 MPL-SO₂을 포함하는 화학식(I)의 화합물들이 암세포주의 세포 증식 및 군집 형성을 억제함이 밝혀졌다. 예를 들면, 난소암 세포주는 화학식(I)의 화합물들에 매우 민감하며, 다른 세포주들 역시 고도로 민감함이 분명하다. 이들은 유방암, 중피종 및 뇌교종 세포주를 포함한다. MPL은 항암제-내성 및 안드로겐 불감성 PC-3 및 DU 145 전립선 암 세포들에 대해 매우 효과적이다. 유사하게, 또한 항암치료에 고도의 내성을 갖는 PET 및 YOU 세포들(중피종) 및 U87 세포들(뇌교종)의 복제는 MPL에 의해 근원적으로 억제된다.

본 발명자들은 MPL 및 이의 유사체들이 하기의 mTOR 의존성 질병에의 적용성을 가짐을 밝혔다.

ㆍ 질병 진행에 기여자로 잠재적 역할을 제시하는 일부 측면에서 알츠하이머 질병(AD)과 병리학적 교차하는 mTOR 신호전달. 일반적으로, 관찰결과들은 AD 뇌에서 mTOR 신호전달의 고도활성을 보여준다. 예를 들면, 인간 AD 뇌에 대한 부검 연구들은 PTEN, Akt, S6K, 및 mTOR에서의 조절장애를 나타낸다;

ㆍ 헌팅턴 병의 마우스 모델을 사용한 연구는 라파마이신 처리가 헌팅턴 응집체의 제거를 촉진함을 보여준다. MPL은 유사하게 이러한 응집체를 제거할 수 있으며, 이러한 증상의 새로운 치료법을 제공한다;

ㆍ 연령-관련 질병

ㆍ 이식 거부(transplant rejection);

ㆍ 만성 염증성 질병(예를 들면, 류마티스 관절염);

ㆍ 글리코겐 축적 병;

ㆍ 특정 암에 대한 선택성;

ㆍ 전신 홍반성 루푸스(Systemic Lupus): mTOR 신호전달은 SLE T 세포들에서 증가되며, mTOR 신호전달의 라파마이신으로의 억제는 인간 SLE의 치료에 효과적임이 밝혀졌다. 라파마이신으로 처리된 SLE 환자들은 감소된 베이스라인 칼슘 레벨 및 TCP 자극에 따른 감소된 칼슘 인플럭스를 나타내나, 미토콘드리아 기능의 변화는 보이지 않으며, 이는 상기 질병의 이러한 징후 치료에 라파마이신의 특이성을 제시한다;

ㆍ 염증성 및 면역 활성화;

ㆍ 빈혈;

ㆍ 백혈구 감소증;

ㆍ 혈소판 감소증;

ㆍ 스텐트 코팅(stent coating);

ㆍ 신기능 부전;

ㆍ 비만;

ㆍ 당뇨/인슐린 저항;

ㆍ 비알코올성 지방간;

ㆍ 다낭성 신장질환;

ㆍ 파킨슨 병: mTORC1 억제자 라파마이신은 L-DOPA의 치료효과에 영향을 주지 않고 운동장애의 진행을 억제하였다. 따라서, mTORC1 신호전달 캐스케이드는 항-파킨슨 치료법 디자인의 타겟을 제공한다;

ㆍ 섬유증(간, 심장 및 폐 섬유증과 같은). MPL에 대한 섬유아세포의 민감성, PI3K/mTOR 및 TGFbeta 사이의 관계, 및 리실 옥시다아제(lysyl oxidase: LOX)에 대한 효과에 기인하여, MPL은 섬유증의 치료에 사용될 수 있다. 증가된 심장 LOX 발현이 심장 이상/섬유증, 유사하게는 유사하게 다수의 폐 및 신장 질병/LOX/섬유아세포 환자들에게 발견된다. 추가적으로, 섬유증은 유방 및 췌장암과 같은 일부 타입의 암에서 중요한 기여 인자이다.

이론에 구속됨이 없이, 본 발명의 화합물들의 활성은 mTOR의 촉매 사이트에 결합함으로써 작용하는 것으로 믿어진다.

조성물, 제약 및 키트(Compositions, medicaments and kits)

본 발명은 화학식(I)의 적어도 하나의 화합물, 또는 상기 화합물의 대사물질, 약학적으로 허용가능한 염, 용매화물 혹은 전구약물 및 적어도 하나의 약학적으로 허용가능한 캐리어를 포함하는 약학 조성물, 제약 및 키트들을 제공한다. 본 발명에서 설명되는 화합물들로부터 약학 조성물을 제조하기 위한 불활성, 약학적으로 허용가능한 캐리어들은 고체 또는 액체일 수 있다. 고체 형태 제제는 파우더, 태블릿, 분산성 그래뉼, 캡술, 카셰트(cachet) 및 좌약을 포함한다. 상기 파우더 및 태블릿은 약 5 내지 약 95 퍼센트의 활성 성분을 포함할 수 있다. 적절한 고체 캐리어는 당해기술 분야에 공지되어 있으며, 예를 들면 마그네슘 카르보네이트, 마그네슘 스테아레이트, 탈크, 당 또는 락토오스를 포함한다. 태블릿, 파우더, 카셰트 및 캡슐은 구강 투여에 적합한 고체 투약 형태로 사용될 수 있다. 다양한 조성물에 대한 약학적으로 허용가능한 캐리어 및 제조 방법의 예들은 A. Gennaro (ed.), Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Edition, (1990), Mack Publishing Co., Easton, Pennsylvania에서 찾을 수 있다.

액체 형태 제제들은 용액, 서스펜션 및 에멀젼, 예를 들면, 비경구 주사를 위한 물 혹은 물-프로필렌 글리콜 용액, 구강 용액, 서스펜션 및 에멀젼을 위한 감미제 및 불투명화제의 첨가물을 포함한다. 액체 형태 제제들은 또한 비강내 투여를 위한 용액을 포함할 수 있다.

흡입에 적절한 에어로졸 제제는 용액 및 파우더 형태의 고체를 포함할 수 있으며, 예를 들면 질소와 같이 불활성 압축 가스와 같은 약학적으로 허용가능한 캐리어와 조합될 수 있다. 또한, 사용 직전에 구강 혹은 비경구 투여를 위한 액체 형태 제제로 전환되는 고체 형태 제제도 포함된다. 이러한 액체 형태는 용액, 서스펜션 및 에멀젼을 포함한다.

본 발명의 화합물은 경피적으로 전달될 수도 있다. 경피 조성물은 크림, 로션, 에어로졸 및/또는 에멀젼 형태를 가질 수 있으며, 이러한 목적을 위한 종래의 기술과 같이 매트릭스 혹은 저장체 타입의 경피 패치 내에 포함될 수 있다.

본 발명의 화합물은 또한 피하로 전달될 수도 있다.

바람직하게는 화학식(I)의 화합물은 구강으로 투여된다.

본 발명의 조성물 및 제약들은 약학적으로 허용가능한 캐리어, 보조제, 부형제 및/또는 희석제를 포함할 수 있다. 상기 캐리어, 희석제, 부형제 및 보조제들은 상기 조성물 또는 제약의 다른 성분들과 양립가능한 측면에서 "허용가능"해야하며, 일반적으로 이들의 수여자에게 유해하지 않다. 약학적으로 허용가능한 캐리어 또는 희석제의 비제한적인 예들은 탈염 혹은 증류수; 생리 식염수; 땅콩유, 홍화유, 올리브유, 면실유, 옥수수 오일과 같은 야채 기반 기름; 땅콩유, 홍화유, 올리브유, 면실유, 옥수수 유, 참기름, 아라키스유, 코코넛 오일과 같은 참기름; 메틸 폴리실록산, 페닐 폴리실록산 및 메틸페닐 폴리실록산과 같은 폴리실록산을 포함하는 실리콘 오일; 휘발성 실리콘(silicone); 액상 파라핀, 소프트 파라핀 또는 스쿠알렌과 같은 미네랄 오일; 메틸 셀룰로오스, 에틸 셀룰로오스, 카르복시메틸셀룰로오스, 소듐 카르복시메틸셀룰로오스 또는 히드록시-프로필-메틸-셀룰로오스와 같은 셀룰로오스 유도체; 예를 들면 에탄올 또는 이소프로판올과 같은 저급 알칸올; 저급 아랄칸올(aralkanol); 예를 들면, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸렌 글리콜 혹은 글리세린과 같은 저급 폴리알킬렌 글리콜 혹은 저급 알킬렌 글리콜; 이소프로필 팔미테이트, 이소프로필 미리스테이트 혹은 에틸 올리에이트와 같은 지방산 에스테르; 폴리비닐피롤리돈; 아가(agar); 검 트래거캔스(gum tragacanth) 혹은 검 아카시아, 및 페트롤륨 젤리를 포함한다. 일반적으로, 캐리어 또는 캐리어들은 상기 조성물 혹은 제약의 중량에 대해 약 10% 내지 약 99.9%를 형성한다.

본 발명의 조성물 및 제약들은 주사(예를 들면, 피하, 근육 내 또는 정맥 주사를 포함하는 비경구 투여), 구강 투여(예를 들면, 캡슐, 태블릿, 당의정 및 엘릭서(elixir)), 국소 투여(예를 들면, 연고, 크림 혹은 로션, 또는 안구 액으로 전달에 적합한 형태), 또는 비강내 흡입(예를 들면, 에어로졸 형태로)에 의한 투여에 적합한 형태일 수 있다.

주사가능한 용액 또는 서스펜션으로서 투여를 위한, 비독성 비경구 허용가능한 희석제 혹은 캐리어는 링거액, 등장 염수, 포스페이트 완충 염수, 에탄올 및 1,2 프로필렌 글리콜을 포함할 수 있다. 비경구적으로 투여가능한 조성물 및 제약을 제조하는 방법은 당업자에게 공지되어 있으며, 예를 들면 Remington's Pharmaceutical Science, 15th ed., Mack Publishing Company, Easton, Pa.에 보다 상세히 설명되어있다.

구강 투여를 위한 적절한 캐리어, 희석제, 부형제 및 보조제의 일부 예들은 땅콩유, 액체 파라핀, 소듐 카르복시메틸셀룰로오스, 메틸셀룰로오스, 소듐 알기네이트, 검 아카시아, 검 트래거캔스, 덱스트로스, 수크로오스, 소르비톨, 만니톨, 젤라틴 및 레시틴을 포함한다. 추가적으로, 이러한 구강 제형은 적절한 감미제 또는 착색제를 함유할 수 있다. 캡슐 형태로 사용될 셩우, 상기 캡슐은 분해를 지연시키는 글리세릴 모노스테아레이트 혹은 글리세릴 스테아레이트와 같은 화합물로 코팅될 수 있다. 보조제는 일반적으로 연화제, 유화제, 증점제, 방부제, 살균제 및 완충제를 포함한다.

구강 투여를 위한 고체 형태는 인간 및 수의학적 약학적 실행을 위해 허용가능한 바인더, 감미료, 분해제, 희석제, 향미제, 코팅제, 보존제, 윤활제 및/또는 시간 지연 제제를 함유할 수 있다. 적절한 바인더는 검 아카시아, 젤라틴, 옥수수 녹말, 검 트래거캔스, 소듐 알기네이트, 카르복시메틸셀룰로오스 또는 폴리에틸렌 글리콜을 포함한다. 적절한 감미제(sweetner)는 수크로오스, 락토오스, 글로코오스, 아스파르탐 혹은 사카린을 포함한다. 적절한 분해제는 옥수수 녹말, 메틸셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈, 구아 검, 잔탄 검, 벤토나이트, 알긴 산 혹은 아가를 포함한다. 적절한 희석제는 락토오스, 소르비톨, 만니톨, 덱스트로스, 카올린, 셀룰로오스, 칼슘 카르보네이트, 칼슘 실리케이트 혹은 디칼슘 포스페이트를 포함한다. 적절한 향미제(flavouring agent)는 페퍼민트 오일, 윈터그린 오일, 체리, 오렌지 혹은 라스베리 향미제를 포함한다. 적절한 코팅제는 고분자 혹은 아크릴산 및/또는 메타크릴산의 공중합체 및/또는 이들의 에스테르, 왁스, 지방알코올, 제인(zein), 쉘락 또는 글루텐을 포함한다. 적절한 보존제는 소듐 벤조에이트, 비타민 E, 알파-토코페롤, 아스코르브 산, 메틸 파라벤, 프로필 파라벤 혹은 소듐 바이설파이트를 포함한다. 적절한 윤활제는 마그네슘 스테아레이트, 스테아르산, 소듐 올리에이트, 소듐 클로라이드 또는 탈크를 포함한다. 적절한 시간 지연제제는 글리세릴 모노스테아레이트 또는 글리세릴 디스테아레이트를 포함한다.

구강 투여를 위한 액체 형태는 상기의 제제에 부가하여, 액체 캐리어를 함유할 수 있다. 적절한 액체 캐리어는 물, 올리브 유, 탕콩 유, 참기름, 해바라기 유, 홍화유, 아라키스 유, 코코넛 유와 같은 오일, 액상 파라핀, 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 에탄올, 프로판올, 이소프로판올, 글리세롤, 지방 알코올, 트리글리세리드 혹은 이들의 혼합물을 포함한다.

구강 투여를 위한 서스펜션은 분산제 및/또는 서스펜딩제를 더 포함할 수 있다. 적절한 서스펜딩제는 소듐 카르복시메틸셀룰로오스, 메틸셀룰로오스, 히드록시프로필메틸-셀룰로오스, 폴리-비닐-피롤리돈, 소듐 알기네이트 또는 아세틸 알코올을 포함한다. 적절한 분산제는 레시틴, 스테아르산과 같은 지방산의 폴리옥시에틸렌 에스테르, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 모노-또는 디-올리에이트, -스테아레이트 또는 -라우레이트, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노- 혹은 디-올리에이트, -스테아레이트 혹은 -라우레이트 등을 포함한다.

구강 투여를 위한 제형은 일 이상의 유화제(emulsifying agent)를 포함할 수 있다. 적절한 유화제는 상술한 분산제 또는 구아검, 검 아카시아 또는 검 트래거캔스와 같은 천연 검을 포함한다.

본 발명의 국부 제형은 일 이상의 허용가능한 캐리어와 함께 활성 제제를 포함하며, 선택적으로 임의의 다른 치료적 성분을 함유할 수 있다. 국부 투여에 적절한 제형은 피부를 통해 치료가 필요한 부위에 침투하는데 적절한 액체 또는 반-액체 제제를 포함하며, 예를 들면, 도포제, 로션, 크림, 연고 또는 페이스트, 및 눈, 귀 혹은 코로 투여에 적합한 액적(drop)을 포함한다.

본 발명에 따른 액적은 멸균 수용성 또는 지성 용액 혹은 서스펜션을 포함할 수 있다. 이들은 활성 성분을 살균(bactericidal 및/또는 fungicidal) 제제 및/또는 임의의 다른 적절한 보존제, 및 선택적으로 표면 활성 제제를 포함하는 수용액에 용해시텨 제조될 수 있다. 수득되는 용액은 이어엇 여과에 의해 정화되고, 적절한 용기에 이송되어 멸균될 수 있다. 멸균은 고압살균 또는 반 시간 동안 90 ^oC 내지 100 ^oC에서 유지시키거나, 무균 기술에 의해 용기 이송에 이어 여과를 통해 수행될 수 있다. 액적에 포함되기 위해 적절한 살균제의 예들은 페닐수은 나이트레이트 혹은 아세테이트(0.002%), 벤잘코늄 클로라이드(0.01%) 및 클로르헥시딘 아세테이트(0.01%)를 포함한다. 지성 용액의 제조를 위한 적절한 용매는 글리세롤, 희석 알코올 및 프로필렌 글리콜을 포함한다.

본 발명에 따른 로션은 피부 또는 안구에 적용하기에 적합한 것들을 포함한다. 안구 로션은 선택적으로 살균제(bactericide)를 함유하는 멸균 수용액을 포함할 수 있으며, 액적 제조와 관련된 상술한 설명과 유사한 방법에 의해 제조될 수 있다. 피부 적용을 위한 로션 또는 도포제는 또한 알코올 또는 아세톤과 같은 건조를 촉진하고 피부를 식히는 제제, 및/또는 글리세롤과 같은 보습제, 또는 카스토르(castor) 오일 또는 아라키스 오일과 같은 오일을 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 크림, 연고 또는 페이스트는 외부 적용을 위한 활성 성분의 반-고체 제형이다. 이들은 미세-분할 혹은 파우더 형태의 활성제제를 단독으로 또는 지성 혹은 비지성 베이스에서 수용성 혹은 비수용성 용액 또는 서스펜션 내에 혼합하여 제조될 수 있다. 상기 베이스는 경화, 연화 또는 액체 파라핀, 글리세롤, 밀랍, 금속 비누와 같은 탄화수소; 점액; 아몬드, 옥수수, 아라키스, 카스토르 혹은 올리브 유와 같은 천연 오일, 울 지방(wool fat) 또는 이의 유도체, 또는 프로필렌 알코올 혹은 마크로골(macrogol)과 같은 알코올과 조합된 스테아르 혹은 올레 산과 같은 지방산을 포함할 수 있다.

본 발명의 조성물 및 제약은 소르비탄 에스테르 또는 이들의 폴리옥시에틸렌 유도체와 같은 음이온성, 양이온성 또는 비이온성 계면활성제와 같은 임의의 적절한 계면활성제를 병합할 수 있다. 천연 검과 같은 서스펜딩제, 셀룰로오스 유도체 또는 규질 실리카와 같은 무기 물질 및 라놀린과 같은 다른 성분들 역시 포함될 수 있다.

본 발명의 조성물 및 제약들은 리포솜(liposome) 형태로 투여될 수 있다. 리포솜을 형성하는 적절한 방법은 당해 기술 분야에 공지되어 있으며, Prescott, (Ed), (1976), "Methods in Cell Biology", Volume XIV, Academic Press, New York, N.Y. p.33 et seq.과 같은 특정 참조문서과 연관되어 제조될 수 있다.

보조제 또는 생물학적 반응 조절제와 같은 보충 활성 성분 또한 본 발명의 조성물 및 제약들에 병합될 수 있다.

본 발명의 조성물 및 제약 내에 임의의 적절한 보조제가 포함될 수 있다. 예를 들면, 알루미늄 계열 보조제가 활용될 수 있다. 적절한 알루미늄 계열 보조제는, 이에 제한되는 것은 아니나, 알루미늄 히드록사이드, 알루미늄 포스페이트 및 이들의 조합을 포함한다. 활용가능한 알루미늄 게열 보조제의 다른 특정 예들은 유럽 특허 제1216053호 및 미국 특허 제6,372,223호에 설명되어 있다. 다른 적절한 보조제는 Freund 불완전 보조제 및 완전 보조제(Difco Laboratories, Detroit, Mich.); Merck Adjuvant 65 (Merck and Company, Inc., Rahway, N.J.); AS-2 (SmithKline Beecham, Philadelphia, Pa.); 알루미늄 히드록사이드 젤(alum)과 같은 알루미늄 염 또는 알루미늄 포스페이트; 칼슘, 철 또는 아연 염; 아크릴레이티드 티로신의 불용성 서스펜션; 아크릴레이티드 당; 양이온성 또는 음이온성의 유도된 폴리사카라이드; 폴리포스파젠; 생물학적 분해가능한 미이크로스피어; 모노포스포릴 지질 A 및 quil A; 유럽 특허 제0399843호, 미국 특허 제7,029,678호 및 PCT 공보 WO 2007/006939호에 설명된 것을 포함하는 물 에멀젼 내 오일; 및/또는 GM-CSF 혹은 인터루킨-2, -7, 또는 -12, 과립대식세포 집락자극인자(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF))와 같은 추가적인 사이토킨, 모노포스포릴 지질 A(MPL), 콜레라 톡신(CT) 또는 이의 구성 서브유닛, 열민감성 엔테로톡신(LT) 혹은 이의 구성 서브유닛, 리포폴리사카라이드(LPS) 및 이의 유도체(예를 들면, 모노포스포릴 지질 A 및 3-디아실레이티드 모노포스포릴 지질 A)와 같은 톨-유사(toll-like) 수용체, 무라밀 디펩티드(MDP) 및 호흡장애 바이러스(Respiratory Syncytial Virus: RSV)의 F 단백질을 포함한다.

본 발명의 또 다른 측면은 적어도 하나의 화학식(I)의 화합물, 또는 상기 화합물의 대사물질, 약학적으로 허용가능한 염, 용매화물 또는 전구약물 및 약학적으로 허용가능한 캐리어, 비히클(vehicle) 또는 희석제를 포함하는 키트를 제공한다.

본 발명의 또 다른 측면은 적어도 하나의 화학식(I)의 화합물, 또는 상기 화합물의 대사물질, 약학적으로 허용가능한 염, 용매화물 또는 전구약물의 양 및 상술한 적어도 하나의 항암 치료 및/또는 항암 제제의 양을 포함하는 키트를 제공하며, 상기 2 이상의 성분의 양은 원하는 치료 효과를 유도한다.

본 발명의 키트는 예를 들면, 투여 장치, 완충제 및/또는 희석제와 같은 본 발명의 방법 수행을 보조하기 위한 구성들을 포함할 수 있다. 상기 키트는 다양한 성분들을 하우징하기 위한 용기 및 본 발명의 방법에서의 키트 구성들의 사용을 위한 지시사항을 포함할 수 있다.

일부 실시예들에 있어서, 상기 키트는 결합된 키트이다.

일부 실시예들에 있어서, 상기 키트는 분획된 키트이다.

투여량 및 투여 경로(Dosages and routes of administration)

제제, 조성물 및 제약들은 수여자(recipient)에게, 비제한적인 예로서, 비경구(예를 들면, 정맥, 척수 내, 피하 또는 근육 내), 구강, 국부, 또는 점막 경로(예를 들면, 비강)를 포함하는 표준 경로를 통해 투여될 수 있다. 일부 실시예들에 있어서, 이들은 다른 추가 치료 제제와 분리되어 또는 조합되어 수여자에게 투여될 수 있다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 투여는 동시에 또는 순차적으로 수행될 수 있다.

일반적으로, 제제, 조성물 및 제약들은 투여 경로 및 수여자의 신체적 특성(건강 상태 포함)과 양립가능한 방법으로, 그리고 원하는 효과(즉, 치료적으로 유효, 면역성 및/또는 보호)가 유도될 수 있는 방법으로 투여된다. 예를 들면, 적절한 투여량은 비제한 적인 예로서, 개체의 신체적 특성(예를 들면, 연령, 무게, 성별), 상기 제제, 조성물 또는 제약이 단일 제제 또는 보조 치료로 사용되는지 여부, 치료되어야 할 암의 경과(즉, 병리학적 상태), 및 당업자에세 용이하게 인식되는 다른 요인들을 포함하는 다양한 인자들에 의존한다.

상기 제제, 조성물 및 제약들의 적절한 투여량 결정에 있어서, 다양한 일반적 고려사항들이 예를 들면, Gennaro et al. (Eds), (1990), "Remington's Pharmaceutical Sciences", Mack Publishing Co., Easton, Pennsylvania, USA; and Gilman et al., (Eds), (1990), "Goodman And Gilman's: The Pharmacological Bases of Therapeutics", Pergamon Press.과 같은 문헌에 설명되고 있다.

본 발명의 놀라운 이점은 화학식(I)의 화합물이 일반적으로 낮은 독성을 갖는다는 것이다. 예를 들면, MPL은 중량의 kg당 2000 mg 초과의 싱글-도오즈 독성을 갖는다. 이에 따라, 본 발명 용도의 제제, 조성물 또는 제약은 환자에게 중량 kg당 활성 성분 2000 mg 까지 포함하는 양의 싱글 도오즈로서 투여될 수 있다. 추가적으로, 암 치료에 있어서 본 발명 사용의 또 다른 놀라운 이점은 일반적으로 화학식(I) 화합물의 높은 임상적 용인성(tolerance)이다. 예를 들면, 24시간 마다 중량 kg당 MPL 1000 mg의 투여량도 포유류에게 용인될 수 있다. 이에 따라, 본 발명 용도의 제제, 조성물 또는 제약은 24시간마다 중량 kg당 활성 성분 1000 mg까지 포함하는 양으로 환자에게 투여될 수 있다.

일반적으로, 유효 투여량은 24 시간마다 중량kg당 활성성분 약 0.0001 mg 내지 약 1000 mg의 범위; 일반적으로 24 시간마다 중량kg당 활성성분 약 0.001 mg 내지 약 750 mg; 24 시간마다 중량kg당 약 0.01 mg 내지 약 500 mg; 24 시간마다 중량kg당 약 0.1 mg 내지 약 500 mg; 24 시간마다 중량kg당 약 0.1 mg 내지 약 250 mg; 또는 24 시간마다 중량kg당 약 1.0 mg 내지 약 250 mg일 수 있다. 보다 전형적으로, 유효 투여량은 24 시간마다 중량kg당 약 1.0 mg 내지 약 200 mg; 24 시간마다 중량kg당 약 1.0 mg 내지 약 100 mg; 24 시간마다 중량kg당 약 1.0 mg 내지 약 50 mg; 24 시간마다 중량kg당 약 1.0 mg 내지 약 25 mg; 24 시간마다 중량kg당 약 5.0 mg 내지 약 50 mg; 24 시간마다 중량kg당 약 5.0 mg 내지 약 20 mg; 또는 24 시간마다 중량kg당 약 5.0 mg 내지 약 15 mg일 수 있다.

예를 들면, 바람직한 투여량은 24시간 마다 중량 kg당 화학식(I) 화합물의 약 10-100 mg일 수 있다. 또한, 바람직한 투여량은 24 시간마다 중량 kg당 화학식(I) 화합물의 약 50 mg일 수 있다.

일반적으로, 치료적 적용에 있어서, 상기 치료는 암의 지속에 대한 것일 수 있다. 추가적으로, 당업자에게 최적량 및 개별 투여량의 간격은 치료되어야 할 증상 및 상태, 투여 형태, 경로 및 부위, 및 치료되는 개체의 특정 성질에 의해 결정될 수 있음이 명백하다. 최적 투여량은 종래의 기술을 사용하여 결정될 수 있다.

다수 경우에 있어서(예를 들면, 예방적 적용), 본 발명의 제제, 조성물 또는 제약을 수 회 또는 복수 회 투여하는 것이 바람직할 수 있으며, 예를 들면, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 또는 그 이상 횟수로 투여될 수 있다. 투여는 약 1 내지 약 12주 간격으로 수행될 수 있으며, 일부 실시예들에 있어서, 약 1 내지 약 4주 간격으로 투여될 수 있다. 주기적 재투여 약시 고려될 수 있다.

당업자에게 있어서, 투여의 최적 경로가 치료 결정 테스트의 종래 과정에 의해 학인될 수 있음이 명백하다.

2 이상의 물질들(예를 들면, 제제 또는 제약)이 개체에 "결합되어(in conjunction)"투여되는 경우, 이들은 단일 조성물로 동시에 투여되거나, 분리된 조성물들로 동시에 투여되거나, 분리된 조성물로 분리된 시점에 투여될 수 있다.

본 발명의 일부 실시예들은 복수의 분리된 도오즈로 상기 제제, 조성물 또는 제약을 투여하는 것을 포함한다. 이에 따라, 본 출원에 설명된 예방적 및 치료적 방법은 개체에, 예를 들면, 정의된 시간 주기에 걸쳐 복수의 분리된 도오즈의 투여를 포괄한다. 이에 따라, 일부 실시예들에 따른 방법은 프라임(prime) 도오즈 투여에 이어, 부스터(booster) 도오즈를 포함할 수 있다. 상기 부스터는 재백신을 목적으로 활용될 수 있다. 다양한 실시예들에 있어서, 상기 제제, 조성물 또는 제약은 적어도 1회, 2회 3회 혹은 그 이상 투여된다.

상기 제제, 조성물 및 제약들은 일반적으로 의도된 목적을 달성할 수 있는 유효량으로 투여될 수 있다. 보다 구체적으로, 이들은 타겟 질병 또는 증상의 진행을 억제하거나 상존하는 증상을 완화시키는데 유효한 양을 의미하는 치료적으로 요효량으로 투여될 수 있다. 유효량의 결정은 당업자의 능력 범위 내에서 용이하게 수행된다. 예를 들면, 상기 제제, 조성물 및 제약들의 치료적으로 유효량은 세포 배양 분석으로부터 초기에 평가될 수 있다. 예를 들면, 도오즈는 동물 모델 내에서 제형되어 세포 배양에서 결정되는 바와 같은 IC50을 포함하는 순환 농도 범위를 획득할 수 있다. 이러한 정보는 인간 및 다른 포유류 개체 내의 유용한 도오즈를 보다 정확히 결정하는데 사용될 수 있다.

치료적으로 유효량은 치료 하의 개체의 증상 진행 억제, 증상 완화 및/또는 생존 연장을 가져오는 상기 제제, 조성물 또는 제약의 양을 지칭한다. 상기 제제, 조성물 및 제약의 독성 및 치료효과는 세포 배양 및/또는 실험적 동물(예를 들면, LD50(개체의 50%에 치명적 도오즈) 및 ED50(개체의 50%에 치료적으로 유효한 도오즈))에 있어서 표준 약학적 분석을 통해 결정될 수 있다. 독성 및 치료 효과 사이의 도오즈 비율은 LD50 및 ED50 사이의 비율로 표현될 수 있는 치료적 인덱스이다. 높은 치료 인덱스를 보이는 제제, 조성물 및 제약들이 바람직하다. 이러한 세포 배양 분석 및/또는 동문 연구로부터 수득된 데이터는 인간 또는 다른 포유류들에 있어서 사용을 위한 도오즈의 범위를 공식화하는데 사용될 수 있다. 이러한 화합물들의 투여량은 바람직하게는 거의 독성이 없는 ED50을 포함하는 순환 농도 범위 내에 있을 수 있다. 투여량은 사용되는 투여 형태 및 투여 경로에 의존하여 이러한 범위내에서 변화될 수 있다. 정확한 제형, 투여 경로 및 투여량은 개체의 상태를 고려하여 개별 의사들에 의해 어려움 없이 선택될 수 있다(예를 들면, "The Pharmacological Basis of Therapeutics", Ch. 1 p.1의 Fingl et al., (1975) 참조). 투여량 및 간격은 개별적으로 조절되어 원하는 치료적 효과 및/또는 최소 유효 농도(MEC)를 획득 및 유지하는데 충분한 활성 제제의 플라즈마 레벨을 제공할 수 있다. MEC를 얻기 위해 필요한 투여량은 투여 경로 및 다른 개별 특성들에 의존할 것이다. 생물학적 정량 및/또는 HPLC 분석이 플라즈마 농도 결정에 사용될 수 있다.

투여 간격은 또한 MEC 값을 사용하여 결정될 수 있다. 일반적으로, 상기 제제, 조성물 및 제약들은 약 10%-90%, 바람직하게는 30%-90% 및 보다 바람직하게는 50%-90%의 시간에 대한 MEC를 넘는 플라즈마 레벨을 유지하는 식이법을 사용하여 투여될 수 있다. 국소 투여 또는 선택적 섭취가 활용되는 일부 실시예들에 있어서, 약물의 유효 국소 농노는 플라즈마 농도와 연관되지 않을 수 있다.

본 발명의 화합물들은 또한 일 이상의 방사선 치료와 같은 항암 치료, 및/또는 세포분열 억제제, 세포독성 제제(예를 들면, 이에 제한되는 것은 아니나, DNA 상호작용 제제(시스플라틴 혹은 독소루비신과 같은)와 같은); 탁산(taxanes)(예를 들면, 탁소텔, 탁솔); 토포이소머라아제 II 억제제(예를 들면, 에토포시드); 토포이소머라아제 I 억제제(이리노테칸(또는 CPT-11), 캄프토스타(camptostar) 또는 토포테칸(topotecan)); 튜불린 상호작용 제제(예를 들면, 파클리탁셀, 도세탁셀 또는 에포틸론과 같은); 호르몬 제제(타목시펜과 같은); 티미딜레이트 합성효소 억제제(5-플루오로우라실과 같은); 항-대사물질(메톡스트렉세이트와 같은); 알킬화제(테모졸로미드(TEMODAR, Schering-Plough Corporation, Kenilworth, New Jersey), 시클로포스파미드와 같은); Farnesyl 단백질 트랜스퍼라아제 억제제(SARASAR(TM)(4~ [2-[4-[(11 R)-3,10-디브로모-8-클로로-6,11-디하이드로-5H-벤조[5,6]시클로헵타[1 ,2-b]피리딘-11-일-]-1-피페리디닐]-2-옥소에틸]-1-피페리디네카르복스아미드, 또는 SCH 66336(Schering-Plough Corporation, Kenilworth, New Jersey)와 같은), tipifamib(Zamestra® 또는 R115777, Janssen Pharmaceuticals), L778.123(파메실 단백질 트랜스퍼라아제 억제제, Merck & Company, Whitehouse Station, New Jersey), BMS 214662(파메실 단백질 트랜스퍼러아제 억제제, Bristol-Myers Squibb Pharmaceuticals, Princeton, New Jersey); 신호전달 형질도입 억제제(lressa(Astra Zeneca Pharmaceuticals, England), Tarceva(EGFR 키나아제 억제제), EGFR에 대한 항체(예를 들면, C225), GLEEVEC(TM)(C-abl 키나아제 억제제, Novartis Pharmaceuticals, East Hanover, New Jersey); 예를 들면, 인트론(Schering-Plough Corporation), Peg-인트론(Schering-Plough Corporation)과 같은 인터페론; 호르몬 치료 조합; 아로마타아제 조합; ara-C, 아드리아마이신, Cytoxan, 및 젬시타빈으로 구성된 그룹에서 선택된 일 이상의 항암제제와의 조합(함께 혹은 순차적으로 투여)에 유용하다.

개체(Subjects)

본 발명의 예방 및 치료적 방법은 임의의 적절한 개체에 적용될 수 있다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 개체는 포유류 개체이다. 예를 들면, 상기 개체는, 마우스(mouse), 랫(rat), 개, 고양이, 소, 양, 말 또는 사회적, 경제적 혹은 연구적 중요성을 갖는 다른 포유류일 수 있다. 따라서, 상기 개체는 예를 들면, 인간 혹은 비인간 포유류와 같은 포유류일 수 있다.

당업자라면 전체적으로 설명된 본 발명의 사상 및 범위로부터 벗어남이 없이 특정 실시예들에 개시된 본 발명에 다양한 변형 및/또는 조절을 수행할 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로, 본 실시예들은 모든 관점에서 예시적인 것이며 제한적이 아님을 고려해야 한다.

어떤 방식으로든 제한적으로 해석되지 않는 특정 실시예들을 참조로 본 발명에 대해 설명한다.

실시예(Examples)

물질 및 방법들

세포 주(Cell lines)

인간 난소암 세포주 OVCAR-3, SKOV-3 및 A2780 및 일차 세포 인형 제대정맥 내피세포(human umbilical vein endothelial cells: HUVEC) 및 모든 다른 세포 주들이 American Type Culture Collection(ATCC)으로부터 수집되었고, 여기에 포함된 지시에 따라 유지되었다. 성상교세포 및 신경교정 세포주들은 호주 뉴 사우스웨일즈 대학의 Lowy Cancer Research Centre의 Kerry McDonald 박사로부터 수여되었다.

세포 증식 분석(Cell proliferation assay)

새포 증식이 술포로다민 B(SRB) 분석을 사용하여 평가되었다. 96-웰 플레이트 내에 씨딩된 세포들(2,000-3000 세포/웰)은 72시간 동안 MPL(0, 1, 5, 10, 25, 50 및 100 μmol/L)로 처리되었다. 세포들은 이어서 고정되고, 세척되고 1% 아세트산 내 용해된 0.4% (w/v) SRB 100 μl로 염색되었다. 미결합된 다이(dye)는 공기 건조 전에 1% 아세트산으로 5회 세척되어 제거되었다. 결합된 SRB는 10 mM Tris 염기(pH 10.5) 100 μl로 용해되고, 흡광도는 570 nm에서 측정되었다. 정확히 동일한 과정이 MPL-SO₂에 대해서도 사용되었다. 두가지 제제 모두 에탄올에 용해되고 매체 내에서 희석되어 세포 배양 분석에 요구되는 최종 농도를 수득하였다.

세포 생존 분석(Cell viability assay)

생존 실험을 위해 6 웰 플레이트에 씨딩된 세포들이 24, 48 또는 72 시간 동안 0, 1, 10, 50 및 100 μM 농도에서 모네판텔(MPL)에 노출되었다. 모네판텔(Novartis, Basel, Switzerland로부터 제공됨)은 100% 에탄올에 용해되고, 이어서 세포 배양 배지로 희석되었다. 처리 주기의 마지막에, 세포들은 PBS로 세척되고, 트립신화되고, 트리판 블루 및 헤모사이토미터(hemocytometer)를 사용하여 계수되었다. 모든 실험 지점들은 4배 셋업되었고, 각 실험음 적어도 2회 수행되었다.

군집 형성 분석(Colony formation assay)

군집 형성 분석을 위해 OVCAR-3 또는 A2780 세포들과 같은 5 x 10⁶ 세포들이 100mm 페트리 접시에 플레이트되고, 하룻밤동안 부착되도록 하였다. 배지는 배기되고, 급수적으로 성장한 세포들은 72 시간 동안 MPL의 다양한 농도로 인큐베이션되었다. 상기 지점에서 배지는 흡입되고, 접시들은 PBS로 세척되고, 약물이 제거된 배지가 각 플레이트에 추가되었다. 배지는 3주 동안 2회 교체되었다. 이어서, 플레이트들은 PBS로 약하게 세척되고, 세포들은 100% 에탄올로 고정되고, 여과된 크리스탈 바이올렛의 0.5% 용액으로 염색되었다. 50개 세포들 이상으로 구성된 군집들이 역상 현미경으로 계수되었다.

세포 주기 분석(Cell cycle analysis)

세포 주기에 대한 MPL의 효과가 표준 유동 세포분석 프로토콜 및 과정을 이용하여 결정되었다. 간단하게, 0.7×106 백만개의 세포들 25 cm3 플라스크에 씨딩되고, 하룻밤동안 부착이 허용되고, 24 혹은 48시간 동안 MPL로 처리되었다. 세포들은 트립신화를 통해 수집되고, 배지 내에 부유하는 세포들이 채집되었다. 세포 서스펜션은 원심분리되고, PBS로 세척되고 메탄올로 고정되었다. 세포들은 다시 세척되고, 상온에서 30분 동안 PBS 내의 프로포듐 요오드화물 및 리보뉴클레아제 A 내에 재서스펜딩되고, 유동 세포분석(Becton Dickinson FACSort)을 토애 분석되었다.

웨스턴 블롯 분석(Western blot analysis)

세포 내의 단백질 발현이 웨스턴 블롯 분석을 사용하여 결정되었다. MPL의 지시된 농도로 처리 후, 세포 용해물이 제조되어 cdk2, cdk4, 사이클린 A, 사이클린 E, PARP-1(1:1000 희석물; Cell Signalling Technology), 및 p53(1:200 희석물; Santa Cruz Biotechnology)에 대한 항체로 검사되었다. 젤 상에 상당한 로딩의 단백질이 GAPDH 항체(1:30000 희석액; Sigma-Aldrich)로 블롯을 재검사함으로써 확인되었다.

추가 실험에서, MPL의 지시된 농도로 처리 후에, 세포 용해물이 제조되고 c-Myc, 사이클린 D1, 사이클린 E, cdk2, cdk4, IGF-1R(Cell Signalling Technology), 및 anta (Cruz Biotechnology, Australia)에 대한 항체로 검사하였다. 젤 상에 상당한 로딩의 단백질이 GAPDH 항체(Sigma-Aldrich, Sydney, Australia)로 블롯을 재검사함으로써 확인되었다,

인비보 실험(In vivo experiments)

여성 누드 마우스들(생후 6주)을 Biological Resources (Faculty of Medicine, University of New South Wales)로부터 구입하였다. 기관 동물 윤리를 모두 만족하는 과정을 마우스들에 수행하였다. 간단하게, 2.5×106 로그-페이즈 성장한 OVCAR-3 세포들이 각 마우스의 좌측 옆구리로 s.c. 주입되었다. 동물들은 그들의 종양 부피가 주 2회 결정될 동안 주 1회 중량이 측정되었다. 종양 성장은 수직 직경의 캘리퍼 측정에 의해 검사되었으며, 측정된 종양 부피는 식 1/2(길이×W너비²)에 근거하여 계산되었으며, 너비는 두 수직 측정치들 중 짧은 것이다. 기관 윤리 승인에 근거하여, 마우스들은 종양 부피가 500 mm³에 이르기 전에 안락사되었다. 치료는 종양 세포 주입 후 8일에 개시되었으며, 마우스들은 랜덤화되어 치료 또는 통제 그룹(그룹당 6마리)에 할당되었다. 모네판텔은 멸균 0.5%(w/v) 하이드로퍼옥시메틸 셀룰로오스(HPMC) 내에 서스펜딩되었다. 약물은 25 또는 50 mg/kg으로 주 3회 i.p. 투여되었다. 통제 그룹은 멸균 비히클(0.5% HPMC)로 처리되었다. 마우스들은 3주의 주기동안 치료되었다. 최종 약물 투여의 24 시간 후에, 마우스들은 안락사되었고, 이들의 종양은 절제되어 분석까지 -80 ^oC로 냉동되었다.

대체 실험에서, 치료는 종양 주입 후 8일에 개시되었으며, 마우스들은 랜덤화되어 MPL 또는 비히클 처리된 그룹(그룹 당 5-6 마우스)으로 할당되었다. MPL은 하이드로퍼옥시 메틸셀룰로오스(0.5% w/v HPMC) 내에 서스펜딩되고 소니케이터에 의해 멸균되고, 복강내(intraperitoneally, i.p) 또는 위관으로 구강을 통해(100μL) 격일로 투여되었다. 제1 파일럿 실험에서, 약물은 2주간 주 3회 중량당 2.5 또는 25 mg/kg으로 i.p. 투여되었다. 결과에 따라, 다음 세트의 동물들에서, 도오즈는 25 및 50 mg/kg로 증가되어 주 3회 수행되었다. 마지막(제3) 파일럿 연구에서, 마우스들은 구강으로 치료되었다. 도오즈는 주 3회 50 및 100 mg/kg으로 투여되었다. 모든 상기의 실험에서, 통제 그룹의 마우스들은 작은 부피의 비히클(0.5% HPMC)을 수여받았다. 종양 조직학/면역조직화학 분석이 표준 공정에 따라 포르말린 고정 종양 슬라이스 상에 수행되었다.

통계적 분석(Statistical analysis)

모든 데이터들은 적어도 두 독립 실험들로부터의 평균±표준 오차(S.E.M.)로서 보고된다. MPL 처리 그룹 대 통제 그룹 사이의 종양 부피의 차이는 포스트 혹 Dunnett 테스트에 의한 one way ANOVA를 사용하여 분석되었다. 정량 변수들은 스튜던트 t 테스트를 사용하여 비교되었다. 유의한 통계적 차이는 P < 0.05로 정의되었다.

결과

MPL은 세포 증식을 억제함

난소암 세포주 OVCAR-3, A2780 및 SKOV-3에 대한 MPL의 효과를 시험하였다. SRB 분석을 활용하여, 세포 증식에 대한 MPL의 효과를 시험하였다. MPL은 표 1에 따르면, IC50 값 6.3, 10.0 및 29.3에서 각각 농도-의존적 방식으로 OVCAR-3, A2780 및 SKOV-3 세포들에서 증식을 억제하였다. 이러한 결과들로부터 난소암 세포주가 MPL의 항-증식성 요과에 민감함이 명백하다. SKOV-3 세포들은 최소로 민감하였다. MPL-SO₂ 또한 SRB 증식 분석을 사용하여 유사한 방법으로 시험되었다. MPL-SO₂는 MPL과 상응한 능력을 갖는 것으로 밝혀졌다. MPL-SO₂는 배양에서 암 세포주 성장의 생존성을 감소시켰으며, 세포 증식을 억제하였다. MPL-SO₂의 IC50 수치들은 표 1에 제공된다.

세포 증식에 대한 MPL의 억제 효과 또한 유방, 전립선 및 중피종 세포들과 같은 일정 범위의 세포들 상에 시험되었다. 획득된 결과들은 표 1에 제공된다. 추가 결과들은 표 2에 제공된다.

표 1: MPL 및 MPL-SO2에 대한 IC50 수치(72시간 인 비트로 처리, SRB 분석)

표 2: 다양한 암세포주 증식 억제에 있어서 MPL 및 MPL-SO ₂ 에 대한 IC50 수치

No star = 1회 결정, ** = 2회 반복, *** = 3회 반복

표 3

표 4: 표 3에 따른 아미노-아세토니트릴 유도체(AADs)

표 3에 따르면, "MPL-(R)"은 N-[(1R)-1-시아노-2-(5-시아노-2-트리플루오로메틸-페녹시)-1-메틸-에틸]-4-트리플루오로메틸설파닐-벤즈아미드를 지칭하며, "MPL-(S)"은 N-[(1S)-1-시아노-2-(5-시아노-2-트리플루오로메틸-페녹시)-1-메틸-에틸]-4-트리플루오로메틸설파닐-벤즈아미드를 지칭한다.

표 3에 나타난 결과에 따르면, AADs 907, 1336, 1470 및 2224(MPL-(R))에 대한 IC50 수치 비율(정상 세포/암 세포)은 특히 높은 활성을 보인다. 더욱이, AADs 2224(MPL-(R)) 및 AAD 1566(MPL-(S))은 동일능력을 갖는 것으로 밝혀졌다. (R)-광학이성질체 MPL-(R)은 구충 활성이 없는 것으로 이전에 밝혀졌음이 주목된다.

간단하게, MPL 및 MPL-SO₂는 매우 상이한 질병 특성을 갖는 광범위한 암 세포주에 대해 인 비트로 테스트되었다. 추가적인 상세 연구를 위해, 인간 난소암 세포주 OVCAR-3 및 A2780가 선택되었다. 추가적으로, 정상 인간 난소 표면 상피 세포(HOSE)가 72 시간 동안 MPL(0, 5, 10, 25, 50 and 100 μM) 존재 하에 배양되었다. 트리판 블루 분석을 사용하여 세포 생존능력이 평가되었다(도 9). 유사하게, 정상 상피, 내피, 배아 및 태아 세포의 성장에 대한 MPL의 효과가 조사되었으며(도 10), 한편 세포 증식은 SRB 분석을 사용하여 평가되었다(도 11). 통제(비히클 처리) 세포들이 수집되어 100% 증식을 제공하였으며, MPL 처리된 그룹들은 통제±SEM의 퍼센트로 표현된다. 각 약물 농도는 4배로 테스트되고 각 실험을 적어도 2회 반복되었다. 통계적 비교를 위해각 약물 처리된 그룹은 스튜던트 t 테스트를 사용하여 통제 그룹과 비교되었다. 농도 의존 약물 효과를 검사히기 위해. ANOVA가 사용되었다. P 값은 다음과 같다: * = < 0.05; ** <0.01 and *** = < 0.001, **** p< 0.0001. 표 2에 제공된 결과들은 MPL 암 세포주에 있어서 강한 항증식성 활성를 가짐을 나타내며, 반면 정상 세포들은 훨씬 더 영향받는다. MPL 효과가 특히 nACHR7 서브타입 내의 니코틴성 아세틸 콜린 수용체를 통해 중재되는지 여부를 확인하기 위해, 세포들은 길항자로 에비처리되고 MPL에 노출되었다(도 12).

MPL-SO₂에 대한 결과들 역시 제공된다. MPL-SO₂는 모체 약물 MPL과 유사한 정도로 작용한다. IC50 수치 범위는 매우 유사하며, MPL-SO₂가 암세포 증식 억제에 있어서 MPL만큼 효과적임을 제시한다(표 2).

MPL은 군집 형성을 억제함

MPL이 또한 세포주의 재생 능력 및 군집을 형성 능력을 방해하는지 여부를 조사하기 위해, MPL에 노출된 세포의 복제유전성(clonogenic) 활성을 조사하였다. 72 시간 동안다양한 농도의 MPL에 노출된 후, 세포들은 세척되고 2주 간 약물 제거 배지에서 인큐베이션되었다. MPL은 이러한 세포들에 의한 군집 형성을 근원적으로 방해함이 밝혀졌다. MPL의 보다 높은 농도는 복제유전성 능력을 거의 완전한 손실을 가져왔다(도 2).

약물 노출 및 제거에 따라 약물 효과를 자체 제거하는 세포 특성 및 능력에 대한 MPL의 효과를 결정하기 위해, 세포들은 72 시간 동안 MPL(0, 5, 10, 25 μM)로 인큐베이션되고, PBS로 세척되고, 아가 플레이트에 이송되고, 성장 배지로 배양되고, 표준 조건에서 2주 간 인큐베이션되었다. 세포들은 이어서 100% 메탄올로 고정되고, 1% 크리스탈 바이올렛으로 염색되었다. 군집들(50 초과의 세포 클러스터)이 현미경(배율×5)으로 계수되었다. 상이한 실험 그룹들에서 계수된 군집들의 수는 통제에 대한 퍼센트로 표현된다(도 15). 이러한 결과들은 MPL에 의한 군집 형성의 농도-의존적 억제를 나타낸다.

MPL은 사이클린 및 사이클린-의존성 키나아제의 발현의 하향조절을 통해 세포 주기를 구속함

MPL이 세포 증식 및 군집 형성을 억제하는 메커니즘을 조사하기 위해, 유동 세포 분석을 통해 세포 주기 상의 MPL의 효과를 시험하였다. MPL이 세포 주기 진행을 방해함이 발견되었다(도 3). MPL에 노출된 세포의 진행은 농도 및 시간-의존적 방식으로 G1 페이즈에 구속되었다. G1 페이즈에서의 세포 축적은 S 및 G2-M 페이즈에서의 세포 비율의 급격한 감소를 가져왔다. MPL-유도 세포 주기 구속에 연관된 분자 메커니즘을 연구하기 위해, 세포 주기 조절 단백질 cdk2, cdk4, 사이클린 A, 및 E의 발현을 조사하였다. MPL 처리된 세포들은 낮은 레벨의 cdk2, cdk4, 사이클린 A 및 E를 발현하였다(도 4).

MPL은 사이클린 및 사이클린-의존 키나아제의 발현을 하향 조절하여 세포주기를 구속하고 PARP-1 절단을 유도함

MPL이 세포 증식 및 군집 형성을 억제하는 메커니즘을 밝히기 위해, 세포 주기에 대한 MPL의 효과를 유동 세포분석(FACS)을 통해 조사하였다. MPL은 세포 주기 진행을 방해함이 밝혀졌다(도 22). MPL에 노출된 세포들에서 세푸 주기는 농도 및 시간-의존적 방식으로 G1 페이즈에 구속되었다. G1 페이즈에서 세포 축적은 S 및 G2-M 페이즈에서의 세포 비율의 급격한 감소를 가져왔다. MPL-유도 세포 주기 구속에 연관된 분자 메커니즘을 연구하기 위해. 세포 주기 조절 단백질 cdk2, cdk4, 사이클린 A 및 E의 발현이 조사되었다. MPL 처리된 세포들은 낮은 레벨의 cdk2, cdk4, 사이클린 E, 및 사이클린 A를 발현하였다(도 4 및 도 16).

MPL은 PARP-1 절단을 유도함

MPL-유도 세포 사멸이 PARP의 절단을 포함하는지 여부를 조사하기 위해, PARP-1 및 절단된 PARP-1에 대한 MPL-처리된 세포들의 용해물의 웨스턴 블롯 분석이 수행되었다. PARP-1의 절단은 DNA-교정-유도 생존을 방지함으로써 세포자살을 촉진한다. PARP는 세포들이 이들의 생존 능력을 유지하는 것을 도와주며, 따라서 PARP의 절단은 세포 분해를 촉진하고 세포자살을 겪고 있는 세포들의 마커로서 기능한다. 도 5는 PARP가 MPL 처리된 세포들에서 절단됨을 보여준다.

MPL은 PARP 절단을 유도함

MPL 처리된 OVCAR-3 및 A2780 세포들로부터 제조된 세포 용해물의 웨스턴 블롯 분석은 세포 사멸을 나타내는 PARP의 고도로 유도된 절단을 보여준다(도 18).

MPL은 세포 ATP 레벨을 감소시킴

도 19a 및 도 19b에 나타난 바와 같이, MPL로의 OVCAR-3 또는 A2780 세포들의 처리는 세포 내에서 발견되는 ATP 레벨 감소를 초래한다.

MPL은 자가소화를 유도함

도 6은 MPL로의 세포 치료가 액포 형성을 유도하며, 이는 MPL이 이러한 세포들에서 자가소화(autophagy)를 유도할 수 있음을 제시한다. 도 7은 MPL 처리가 세포내 ADP/ATP 비율을 감소시킴을 보여주며, 이는 또 다른 세포 자가소화의 지표이다.

MPL은 누드 마우스에서 s.c. 이종이식 성장 속도를 억제함

도 20-22는 누드 마우스에서의 MPL의 인 비보 테스트를 보여준다. OVCAR-3 종양을 보유한 마우스들이 최초 i.p. 또는 마지막 실험에서 구강을 통해 처리되었다. 수득된 결과는 특히 50 mg/kg 도오즈(i.p. 및 구강 양쪽에서)의 투여된 도오즈의 활성이 이러한 동물들 내의 종양 성장을 근원적으로 지연시킴을 보여주었다. 종양 조직학 분석은 광범위한 영역의 종양 세포 사살을 나타냈다(도 23).

군집 형성 억제와 결합된 세포 증식 억제, 및 인 비보 결과는 MPL의 성장 제한 효과를 보여준다. MPL 방해는 키나아제 cdk2 및 cdk4와 함께 세포 주기 조절 단백질 A 및 E2의 발현 감소를 통한 세포 주기 진행에서 보여진다. 정상 세포에서 일 페이즈에서 다른 페이즈로의 전이는 다양한 단백질에 의해 조절되는 정돈된 방법으로 발생한다. 사이클린-의존성 키나아제(CDK)는 세포 주기의 특정 지점에서 활성화되어 세포 주기 진행에 필수적 역할을 수행하는 핵심 조절 단백질이다. 이들은 세포 주기의 서로 다른 페이즈에서 서로 다른 사이클린을 요구한다. 사이클린 A, D 및 E는 세포 주기의 G1 및, G1 에서 S 페이즈로의 전이에 요구된다. 지금까지 확인된 다양한 CDK들 중 CDK2 및 CDK4가 G1 및 G1-S 전이 진입에 필수적인 것으로 보인다. 사이클린 A 및 E는 CDK2에 결합하며, 반면 사이클린 D는 CDK4 및 CDK6에 결합한다. 암은 세포 주기 연관 현상으로 간주되는 질병들 중 하나이다.

도 20-22에 제공되는 결과들은 여성 누드 마우스에서 s.c. 종양 성장을 억제하는 MPL 활성을 나타낸다. 최초 실험은 i.p. MPL 투여의 도오즈-의존성 활성을 나타내었다. 25 mg/kg 도오즈가 특히 효과적이었다. 이에 근거하여, 후속 실험은 이전과 동일 조건 하에 25 및 50 mg/kg 도오즈를 사용하여 수행되었다. 50 mg/kg 도오즈는 이러한 동물들에 있어서 종양 성장을 지연시키는데 보다 효과적이었다. 항-기생충 제제로서, MPL은 다수의 동물 모델에서 구강을 통해 효과적인 것으로 밝혀졌다. MPL의 50 및 100 mg/kg의 구강 치료 활성이 테스트되었다. 모든 3회 파일럿 실험들에서, MPL은 0.5% HPMC 내에 제조되고, 서스펜션으로 투여되었다. 이들로부터 종양 조직의 인 비보 실험은 MPL 처리된 종양들 내에 광범위한 괴사를 갖는 영역을 나타냈다(도 23).

관찰된 효과는 표 1 및 표 2에 나타난 바와 같이 난소암에 한정되지 않으며, MPL은 효과적으로 신경교종, 전립선, 유방, 중피종, 지방육종, 섬유육종을 포함하는 다양한 암을 나타내는 다양한 세포주들 내에서 인 비트로 세포 증식을 억제한다(표 1 및 2 참조).

또 다른 중요한 관찰결과는 항암제-내성 세포주에 대한 MPL의 활성이다. 난소 항암제-내성 세포들 신경교종 테모졸리미드 저항성 세포들 및 유방암 타목시펜 저항성 세포들은 모두 MPL 항증식 작성에 민감성을 가졌다.

결론적으로, 상술한 결과들로부터 암 세포주에서 MPL 및 잠재적으로 이의 대사물질 및 유사체들(AADs)이 다음에 나열하는 효과를 가짐을 유추할 수 있다:

1. 세포 증식 억제

2. MPL-유도 억제는 양성적으로도 또는 음성적으로도 니코틴성 작용제 또는 길항제로의 예비-처리에 영향받지 않으며, 이는 작용 모드가 니코틴 수용체 중재가 아님을 제시한다;

2. 군집 형성 억제;

3. 세포 주기 구속[G1 페이즈];

4. 세포-주기 조절 단백질(CdK2, CdK4, 사이클린 A, 사이클린 E) 하향 조절;

5. 세포 내부로 티미딘 병합 차단하여, DNA 합성 억제;

6. 세포 내 ATP 레벨 감소;

7. LC3B-I의 LC3B-II로의 전환에 의해 확인되는 점진적 자가소화 유도;

8. 자가소화는 현미경을 통해 난소암 및 신경교종 세포 주 모두에서 분명히 관찰되었다;

9. MPL은 또한 PARP-1 절단을 유도하여 세포 사멸을 유도한다;

10. 이들은 s.c. 종양을 보유한 누드 마우스 내 종양의 도오즈-의존성 억제를 보여주는 인 비보 데이터에 의해 확인된다;

11. i.p. 및 구강 투여 경로 모두 효과적이었다.

더욱이, MPL은 일부 표준 항암치료에 내성을 갖는 세포들의 증식을 억제하였다.

mTOR 및 자가소화(autophagy)

본 출원의 또 다른 측면은 암 및 신경퇴화 질병에서의 자가소화의 역할에 있다. 신경퇴화를 야기하는 비정상적으로 빠른 세포자살이 진행되는 신경 세포에서, 자가소화는 가속화된 세포 사멸로부터 뉴런을 보호하는 메커니즘으로 기능한다.

자가소화, 또는 세포 내 자기-소화는 단백질 및 세포소기관 분해와 연관된 세포 경로이며, 인간 질병 및 생리학과 놀라운 다수의 연관성을 갖는다. 예를 들면, 자가소화 오작용은 암, 신경퇴화, 미생물 전염 및 노화와 연관된다. 역설적으로, 자가소화가 세포에 대한 주요 보호 과정이나, 이는 또한 암세포에서 세포 사멸에 역할을 할 수도 있다.

mTOR는 자가소화의 주요 음성 조절 축이다. mTOR의 직접적 억제제 및 mTOR를 활성화하는 경로의 억제제는 이어서 자가소화를 유도한다. mTOR 키나아제는 성장 인자 및 영양소 레벨에 반응하여 세포 성장 및 자가소화를 조절한다. mTOR의 억제는 자가소화를 유도한다. 자가소화는 세포를 신경퇴화를 유도하는 손상으로부터 보호한다.

세포 소기관 및 오래 생존한 단백질에 대한 주요 분해 경로인 자가소화는 뉴런의 생존을 위해 필수적이다. 여러 증거들은 특히 알츠하이머 병(AD)과 같은 일부 주요 신경퇴화 질병의 원인으로서 자가소화 결함을 제시하고 있다. 이러한 연구들에서의 발견들은 질병의 초기 단계에서 자가소화가 변형되며, 자가소화의 오기능이 알츠하이머 병의 병리학적 진행에 중요한 역할을 함을 제시한다.

자가소화는 세포들을 신경퇴화 야기하는 손상으로부터 보호함

신경퇴화 질병에서 mTOR/자가소화

알츠하이머 병

아베타(Abeta) 및 타우(tau)의 축적은 직접적으로 알츠하이머 병의 점진적 인식 결함을 야기 혹은 기여하는 것으로 간주된다. mTOR는 아베타 및 타우 유도 신경퇴화에 역할을 하는 것으로 밝혀졌다.

mTOR 경로는 단백질 항상성 조절 및 이에 따라 신경 기능 조절에 중심 역할을 한다. 실제로, mTOR 신호전달은 서로 다른 형태의 학습 및 기억을 조절한다. 라파마이신은 인식 결함을 치유하며, 자가소화를 증가시킴에 의해 아베타 및 타우 병리학을 완화시킨다. 유사하게, 일부 mTOR 신호전달 성분들은 알츠하이머 병의 임상적 진단에서 인식 손상의 잠재적인 바이오마커일 수 있다. 따라서, 자가소화-리소좀 단백질 퇴화의 조절을 통해, mTOR-연관 제제(MPL과 같은)는 알츠하이머 병의 중요한 치료 제제로 기대된다.

헌팅턴 병(Huntington disease)

헌팅턴 병은 폴리글루타민 영역 팽창에 의해 야기되는 9개의 유전성 신경퇴화 장애의 하나이다. 팽창된 폴리글루타민 단백질은 세포내 응집체에서 비정상적으로 축적된다. mTOR는 세포 모델, 유전자 이식 마우스 및 인간 뇌의 폴리글루타민 응집체에서 격리됨이 밝혀졌다. mTOR의 격리는 이의 키나아제 활성을 손상시키며, 자가소화를 유도하여, 돌연변이 헌팅틴 조각들에 대한 핵심 제거 경로이다. 이는 특정 mTOR 억제제 라파마이신이 헌팅턴 병의 세포 모델에서 헌팅틴 축적 및 세포 사멸을 완화하는 것처럼, 폴리글루타민 독성으로부터 보호하고, 자가소화의 억제는 반대 효과를 갖는다.

mTOR는 또한 염증, 면역억제 및 신경퇴화 질병과 연관된다.

염증성 경로 NF-κB 및 이의 하류 타겟 상의 MPL의 활성

전사 인자 NF-κB 는 주로 일부 중재자들 및 사이토킨들이 상기의 전사 인자의 활성화를 야기하므로 염증성-중재 반응에 대한 관심 대상이었다. 더욱이, NF-κB 전사 패밀리의 활성화는 염증유발 유전자의 전사를 유도하는 능력을 통해 염증에 중심 역할을 수행한다. NF-κB 활성화 및 염증사이의 연관은 다양한 인간 질병 및 질병의 동물 모델에서 밝혀졌다. 추가적으로, 염증 중재에 있어서 NF-κB 의 역할은 유전적 접근 또는 화학적 억제제를 통해 확립되었다.

NF-κB 는 세포 기질 내에서 억제 단백질 IκBα에 결합된 불활성 형태로 존재한다. 적절한 세포외 신호에 의해 자극될 때, IκBα는 IKK에 의해 인산화되며, 이는 IκBα의 프로테아좀-중재 퇴화를 야기한다. 이어서, NF-κB의 활성 복합체는 자유화되어 핵으로 전위되어 이의 타겟 유전자의 전사를 중재한다. IKK 복합체는 자가인산화 또는 리포폴리사카라이드(LPS), IL-1β, 종양 괴사 인자 (TNF)-α 및 TGF-β와 같은 분기된 자극에 반응한 일련의 미토겐-활성화된 키나아제(MAP3K)를 통해 활성화된다.

도 27 내지 도 32는 NF-κB 신호 형질도입 경로에 대한 MPL의 영향을 보여준다. LPS-자극 RAW 264.7 대식세포들이 염증에 대한 인 비트로 모델 시스템으로 사용되었다.

MPL은 면역세포화학 및 웨스턴 블롯 분석에 의해 평가되는 바와 같이 이러한 세포들 내에서 NF-κB 활성화를 감소시킴이 관찰되었다. 이러한 효과는 NF-κB p65의 인산화 및 핵 전위의 억제에 의해, 또한 IKK 및 IкB-α의 인산화의 억제에 의해 확인될 수 있었다. MPL의 억제 효과는 또한 IL-6, TGF-β 및 또한 질산(NO)의 발현 상에서 관찰될 수 있었으며, 이들은 모두 NF-κB에 의해 조절되는 염증 중재자이다.

결과들은 MPL이 이는 염증 감소에 중요한 세포 메커니즘을 억제하며, 암에 연관되지 않은 중요한 병리학적 경로에 영향을 미침을 보여준다.

결과들은 MPL이 염증에의 반응에 중요한 세포 메커니즘을 억제하며, MPL은 암에 연관되지 않은 중요한 병리학적 경로에 영향을 미침을 명확하게 보여준다.

토의(Discussion)

라파마이신의 포유류 타겟인 mTOR는 FKBP12, Tor1, 및 Tor2를 라파마이신의 타겟으로 확인하고, FKBP12-라파마이신 복합체가 Tor1 및 Tor2의 세포 기능에 결합되어 억제함을 강하게 지지하는 saccharomyces cerevisiae의 라파마이신-저항성 돌연변이의 유전적 및 분자적 연구를 통해 처음 발견된 TOR의 전례에 근거하여 명명되었다.

라파마이신은 세포 주기의 G1 페이즈에서 균류 활성을 구속하였다. 쥐들에 있어서, 이는 T-림프구에서 G1에서 S 페이즈 전이를 차단함으로써 면역 시스템을 억제한다. 인간들에서, 이는 기관 이식에 따른 면역억제원으로 사용된다. mTOR는 인슐린, 성장 인자(IGF-I 및 IGF-2와 같은), 및 아미노산을 포함하는 상류 경로로부터의 입력을 병합한다. mTOR는 또한 세포 영양소, 산소 및 에너지 레벨을 감지한다. mTOR 경로는 당뇨, 비만, 우울증 및 특정 암들과 같은 인간 질병에서 조절 장애가 유발된다. 라파마이신은 이의 세포내 수용체 FKBP12와 결합됨으로써 mTOR를 억제할 수 있는 박테리아 생성물이다. FKBP12-라파마이신 복합체는 mTOR의 FKBP12-라파마이신 결합(FRB) 도메인에 직접적으로 결합하여, 이의 활성을 억제한다.

mTOR 경로가 암을 포함하는 다양한 질병들에 있어서 중요한 구성으로 확인되었으나, 90년대에 도입됨에도 불구하고 현재까지 라파마이신만이 광범위한 임상적 용도를 가지고 있으며, 새로운 mTOR 생성물은 제한된 임상적 용도를 갖는다. 유사하게, 라파마이신의 mTOR 경로 방해능력에도 불구하고 여전히 기관 거부의 치료에만 유용하다. 본 발명은 mTOR 경로의 상이한 성분들을 라파마이신에 타겟팅하는 mTOR 억제제의 새로운 클래스를 확인하였으며, 이에 따라 다수의 주요 질병들을 위한 보다 넓은 치료 옵션을 개방하였다.

표 1에 나타낸 바와 같이, MPL은 또한 HUVECs 상에서 테스트되었다. IC50 수치는 OVCAR-3에서의 IC50 수치보다 약 10배 높게 나타났으며, 이는 비-암 세포들보다 암세포들 상에서 MPL의 보다 높은 세포독성 가능성을 반영한다.

군집 형성 분석에서, MPL은 농도-의존적 방식으로 아가 플레이트 상에서 성장한 난소암 세포주들에 의한 군집 형성을 억제하였으며, 그러므로 암세포 성장을 억제하는 MPL의 효과를 추가적으로 나타낸다.

추가적으로, [OVCAR-3 (mutated), SKOV-3 (null) and A2780 (wild type)] 세포들의 p53 상태와 상관 없이, MPL은 항암효과(서로 다른 능력을 가질 수 있지만)를 발휘함이 밝혀졌다. 이는 MPL이 종양의 p53 상태와 상관 없이 내피 난소암에 효과적일 수 있음을 제시한다. 이러한 발견은 p53 돌연변이가 광범위한 암에 있어서 매우 일반적이므로 중요성을 가질 수 있다.

MPL에 의한 효과는 난소암외에 다른 타입의 암들에도 확장될 수 있음을 이해해야 한다.

포유류 세포는 순차적인 Cdk들의 활성화에 지배된다. G1 페이즈에서 S페이즈로의 진입을 통한 진행은 사이클린 A 및 사이클린 E와 복합된 Cdk2에 의해 조절된다. 그러므로, 이러한 조절 단백질의 억제는 세포 주기 진행을 교란시킨다.

세포 증식 및 군집 형성의 억제는 MPL에서 농도-의존적이다. MPL이 세포 주기 진행을 교란시키는 가능한 메커니즘은 세포 주기 조절 단백질 E 및 A, 및 사이클린-의존성 키나아제 Cdk4 및 Cdk2의 하향 조절에 의한 G1 구속 발생이다. G1 구속의 결과, 세포들은 시간에 따라 S 및 G2-M 페이즈들 내의 세포들의 급격한 감소에 의해 보여지는 바와 같이, 세포 주기의 다음 사이클로 진행하지 않는다. 비히클 처리된 그룹의 G2-M 페이즈 내의 세포들의 비율은 25 μM MPL로 처리된 그룹에서 보다 3배 이상 높았다.

더욱이, MPL로 처리된 암 세포주들 내의 자가소화의 증거는 세포들이 G0 페이즈 세포 주기 구속을 통해 세포 주기를 비가역적으로 이탈함을 제시한다.

추가 토의

축적된 증거들은 mTOR가 세포 동화 및 이화작용의 '마스터 스위치'로 작용하여 세포 팽창, 성장 및 증식 신호를 전달한다는 가설을 지지한다. 이는 실제적으로 모든 포유류 세포들에서 발견되나, 특히 급속하게 증식 및 침투하는 종양 세포들에서 중요한다.

세포 신호 전달 경로에 대항하여 타겟팅된 치료들은 고체 종양 및 혈액 악성종양의 치료에 전망을 제시하고 있다. mTOR는 포스파티딜리노시톨 3 키나아제(PI3K)의 활성화의 하류로 작용하는 핵심 키나아제로 밝혀졌다.

특이적으로 mTOR를 억제하는 제제들은 현재 잠재적인 항암 약물로 개발되고 있다.

mTOR 억제제는 필수적으로 G1 페이즈 구속의 유도를 통해 세포 주기 진행을 방해한다. 라파마이신은 프로토타입 mTOR 억제제이다.

mTOR 생물학은 다양한 암들에 있어서, mTOR의 역할에 대한 관점을 제공해왔다. 활성 mTOR은 직접적으로는 세포 주기 조절자에 대한 효과를 통해, 간접적으로는 영양소 수송자의 생성 및 또한 혈관생성 촉진을 통한 세포 내부로의 영양소 공급을 유지함에 의해 세포 성장에서의 반응을 형성한다. 세포 증식에 대한 조절 효과를 발휘하는 mTOR의 주요한 방법은 사이클린 D1의 생성을 조절하는 것이다. mTOR는 적절한 영양소를 지지하여 비정상적 세포 성장 및 증식을 유지시킨다. 다수의 암들에서 mTOR 경로가 탈규제된다는 것에 의해, mTOR 억제제는 넓은 항암 치료효과를 갖는 것으로 기대된다.

대체 분자 마커가 라파마이신 유도체와 같은 mTOR 억제제의 생물학적 효과를 모니터하고, 환자에게 생물학적 활성 도오즈를 좁히는데 사용될 수 있다. 이는 사이클린 D1, 사이클린 E의 발현, P70S6K의 인산화 또는 카스파제 3 및 c-Myc의 발현을 포함할 수 있다. 사이클린 D1은 이의 유전자 증폭 및 단백질 과발현이 종양 세포에서 빈번히 관찰되는 원암유전자이다. 사이클린 D1은 G1에서 S로의 세포 주기의 진행을 유도한다.

MPL은 G1 페이즈에서 세포 주기 진행을 구속함이 밝혀졌다. 본 발명에 따르면, 데이터는 MPL 처리된 종양을 보유한 마우스가 급격한 사이클린 D1의 하향-조절을 보이는 것으로부터 제공된다. 추가적으로, mTOR 신호전달 경로의 또 다른 중요한 중간체인 사이클린 E의 종양 발현 및 세포 주기 진행이 또한 MPL 처리된 종양에서 억제된다. G1 사이클린으로 알려진 사이클린 D 및 E는 CDK4 및 CDK2에 각각 결합하며, G1에서 S 페이즈로의 전이를 촉진한다. 난소암 세포에서 사이클린 D1의 손실은 G1 세포 주기 구속을 유도하기에 충분하며, 이러한 전략은 사이클린 E2의 존재에 의해 저지되지 않는다. 사이클린 D1은 난소암 세포에서 충분한 치료 타겟으로 제안되어 왔다. c-Myc는 사이클린 D1에 결합하여 사이클린 E-Cdk2의 활성화 정도를 감소시키는 사이클린 의존성 키나아제 4 및 6을 포함하는 복수의 지점들에서 세포 주기에 영향을 미치는 것으로 잘 정립되어 있다.

원암유전자 c-MYC의 탈규제된 발현은 인간 암에서 광범위하게 발생되며, 빈번하게 안좋은 예후와 결합되고, 이는 세포 증식, 성장 및 세포자살을 조절하는 전사 인자를 통한 종양 진행에서의 상기 원암유전자의 핵심 역할을 제시한다. c-Myc의 오조절된 발현 또는 작용은 인간 악성 종양에서 가장 흔한 비정상중의 하나이다. 본 발명에 있어서, MPL은 세포 주기 전이(G1에서 S)의 이러한 두 조절자, 즉 사이클린 D1 및 c-Myc 상에 작용하는 것으로 밝혀졌다.

mTOR 키나아제는 p70 리보솜 S6 키나아제(p70S6K)의 활성화 및 eIF-4E 결합 단백질(4E-BP1)의 억제를 통해 아미노산 및 성장 인자에 반응하여 번역 체계를 조절한다.

mTOR의 중요한 하류 이펙터로서, S6K는 세포 성장 및 대사를 중재하는 단백질의 전사 및 번역을 포함하는 일부 세포 공정과 연관된다. 이에 근거하여, mTOR-S6K는 특정 신호(성장 인자, 영양소 및 호르몬)의 세포 반응으로의 번역을 위한 중요한 축을 제공한다. mTOR에 의한 p70의 인산화는 또한 리보솜 생물학적 생성에 필수적이다.

도 9 내지 도 11에 도시된 결과들은 mTOR의 MPL-유도 억제가 p-mTOR, c-Myc[원암유전자(oncogene)], 사이클린 D1, 사이클린 E2, 사이클린 의존성 키나아제 2 및 4 [세포 주기 진행에 필수적] 및 p-P70S6K의 하향-조절을 야기함을 보여준다.

요약하면, 본 발명은 MPL이 mTOR 경로를 통해 자가소화를 생성하며, 특히 혈관신생 및 자가소화를 조절하는 것으로 알려진 mTOR 신호경로의 하류 부분인 p-P70S6K (Thr 389)를 억제함을 보여준다.

본 발명은 또한 세포 주기 진행을 위해 필수적이며 많은 심각한 암들에서 과발현되는 사이클린 D1을 억제함을 보여준다. P70S6K 하향 조절은 다른 이들에 의해 인산화를 억제하고 이에 따라 본 발명의 결과와 정합되는 사이클린 D1의 활성을 억제함이 밝혀져왔다. P70S6K은 또한 PDCD4, 국소 부착 키나아제(focal adhesion kinase), E 카데린, B 카테닌 및 조직 트랜스클루토미네이트 2를 조절하며, 이들은 전이 및 침습에 중요하다.

본 발명에 따른 MPL/자가소화 효과는 MPL 및 유사한 AAD들이 발작, 신경퇴화 질병, α1 항트립신 결함, 리소좀 저장 장애, 심근증, 면역 장애 및 자가면역 질병, 박테리아 및 바이러스 전염, 기생충, 지질 장애 및 노화와 같은 자가소화 결핍 질병을 치료하는데 유용함을 보여준다. 추가적인 예들은 알츠하이머 병, 헌팅턴 병, 연령-관련 질병, 이식 거부 관련 질병, 만성 염증성 질병, 글리코겐 저장 관련 질병, 암 전이, 전신성 홍반, 염증 및 면역 활성 관련 질병, 빈혈, 백혈구 감소증, 혈소판 감소증, 스텐트 코팅 관련 질병, 신부전, 비만, 당뇨/인슐린 저항, 비알코올성 지방간 관련 질병, 다낭성 신장, 파킨슨 병 및 섬유증을 포함한다.

본 발명은 명확하게 MPL은 자가소화(mTOR 경로를 통해)를 생성함을 보여주며, 이는 암 외에도 유용한 치료법이 될 수 있다.

Claims

일 이상의 mTOR 경로 관련 질병들의 치료에의 사용을 위한 화학식(I)의 화합물, 이의 약학적으로 허용가능한 염 혹은 용매화물을 포함하는 약학 조성물로서,

상기 일 이상의 mTOR 경로 관련 질병들은 신경퇴화 질병, 연령-연관(age-related) 질병, 이식 거부 관련 질병, 만성 염증성 질병, 글리코겐 축적 관련 질병, 전신 홍반 루푸스, 염증 및 면역 활성화 관련 질병, 빈혈, 백혈구 감소증, 혈소판 감소증, 스텐트 코팅(stent coating) 관련 질병, 신부전, 비만, 당뇨/인슐린 저항, 비-알코올성 지방간 관련 질병, 다낭포성 신장 질환 그리고 섬유증 중에서 선택되며,
상기 화학식(I)에서,
R¹은 -CN이고,
R² 및 R³ 및 R⁵는 각각 독립적으로 H, 알킬, 할로겐, -CF₃ 또는 -CN으로부터 선택되며;
R⁴ 및 R⁶은 각각 독립적으로 H, 알킬, 할로겐, 알콕시, -CF₃, -OCF₃, -SO₂CF₃, -SOCF₃ 또는 -SCF₃로부터 선택되고;
X는 헤테로원자, N(알킬) 또는 NH이며;
n은 1 내지 20인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
제 1 항에 있어서,
R²는 H 또는 할로겐이고;
R³은 -CF₃ 또는 할로겐이며;
R⁴는 -SCF₃, -SOCF₃, -SO₂CF₃, -OCF₃, 또는 -CF₃이고;
R⁵는 H이며;
R⁶은 알킬이고;
X는 O이며;
n은 1 내지 5인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
제 1 항에 있어서, R⁴는 아미드 그룹에 파라위치인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 화학식(I)의 화합물은 (R)- 또는 (S)-광학이성질체이거나 라세메이트인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 화학식(I)의 화합물은 (S)-광학이성질체인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 화학식(I)의 화합물은 하기의 화합물들 중에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 약학 조성물:

또는

상기 화합물들의 각각은 (R)- 혹은 (S)-광학이성질체, 또는 라세메이트, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 혹은 용매화물이다.
제 6 항에 있어서, 상기 화학식(I)의 화합물은 하기의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 혹은 용매화물인 것을 특징으로 하는 약학 조성물:

AAD 2224 (MPL-(R)).
제 6 항에 있어서, 상기 화학식(I)의 화합물은 MPL(N-[(1S)-1-시아노-2-(5-시아노-2-트리플루오로메틸-페녹시)-1-메틸-에틸]-4-트리플루오로메틸설파닐-벤즈아미드), 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 혹은 용매화물인 것을 특징으로 하는 약학 조성물:

MPL.
제 1 항에 있어서, 상기 일 이상의 mTOR 경로 관련 질병들은 만성 염증성 질병인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
제 9 항에 있어서, 상기 만성 염증성 질병은 류마티스 관절염 또는 이식후 기관 거부인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 섬유증은 간 섬유증, 심장 섬유증 또는 폐 섬유증인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 신경퇴화 질병은 알츠하이머 병, 헌팅턴 병 또는 파킨슨 병인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
제 12 항에 있어서, 상기 신경퇴화 질병은 파킨슨 병인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
제 12 항에 있어서, 상기 신경퇴화 질병은 헌팅턴 병인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
제 12 항에 있어서, 상기 신경퇴화 질병은 알츠하이머 병인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
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