BRPI1015567A2

BRPI1015567A2 - Composições imunogênicas de antígenos de staphylococcus aureus

Info

Publication number: BRPI1015567A2
Application number: BRPI1015567-8A
Authority: BR
Inventors: Annaliesa Anderson; Ellen Murphy; Bruce Arthur Green; Mark Edward Ruppen; Yekaterina Timofeyeva; Viliam Pavliak; Kathrin Ute Jansen; Ingrid Lea Dodge; Steven Morris Baker; Jasdeep Singh Nanra
Original assignee: Wyeth Llc
Priority date: 2009-06-22
Filing date: 2010-06-22
Publication date: 2021-08-31
Also published as: KR20120046189A; EP2445522A1; PE20142188A1; AU2010264538B2; JP6067806B2; US20120107327A1; SI2445522T1; PL2445522T3; JP2016034956A; RU2536981C9; SG10201707084SA; US8568735B2; MY169837A; US8889145B2; AR119682A2; NZ597154A; US9114105B2; RU2536981C2; CO6480925A2; CN102481352A

Abstract

composições imunogênicas de antígenos de staphylococcus aureus. a presente invenção refere-se a composições imunogênicas compreendendo polipeptideos e polissacarideos de staphylococcus aureus.a presente invenção refere-se também a composições imunogênicas compreendendo polissacarideos capsulares de staphylococcus aureus conjuga-dos a uma proteina veiculo. além disso, a invenção refere-se a métodos deindução de uma resposta imune em individuos contra staphylococcus aureus usando composições imunogênicas dos polipeptideos e polissacarideoscapsulares de staphylococcus aureus.

Description

MENTA ' xa PI101586, —- é . Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "COMPOSI- ÇÕES IMUNOGÊNICAS DE ANTÍGENOS DE STAPHYLOCOCCUS AU- REUS”.

REFERÊNCIA REMISSIVA A PEDIDO RELACIONADO O presente pedido reivindica o benefício de prioridade do Pedido de Patente Provisório U.S. No; 61/219.124, depositado em 22 de Junho de 2009, a totalidade do qual é aqui incorporada por referência.

CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se a composições imunogênicas compreendendo polipeptídeos e polissacarídeos capsulares isolados de Staphylococcus aureus. Além disso, a invenção refere-se a métodos de in- * dução de uma resposta imune em indivíduos contra Staphylococcus aureus usando composições imunogênicas dos polipeptídeos e polissacarideos capsulares de Staphylococcus aureus. Os anticorpos resultantes podem 15 . também ser usados para tratar ou prevenir infecção por Staphylococcus au- reus via imunoterapia passiva.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO Seres humanos os reservatórios naturais para Staphylococcus aureus (S. aureus). Indivíduos saudáveis podem ser colonizados por S&S aureus sobre a pele, nas narinas e garganta persistentemente (10-35%), intermitentemente (20-75%) ou estar em um estado de não transmissor (5- 70%) sem doença associada. Vide Vandenbergh et al., J. Clin. Micro. 37: 3133-3140 (1999). A doença ocorre subsequentemente quando os indivi- duos se tornam imunocomprometidos em virtude de brechas nas barreiras Í 25 imunes, tal como durante cirurgia, colocação de cateteres de intumescimen- & to ou outros dispositivos, traumas ou ferimentos. A infecção resultante por S. aureus pode causar uma ampla faixa de diferentes doenças que oscilam de infecções brandas na pele a endocardite, osteomielite, bacteremia, sepsia e outras formas de doença com altas taxas de mortalidade associadas. O grande reservatório humano intensífica a oportunidade para evolução e dis- seminação de tipos clonais patogênicos adaptados. Infecções estafilocócicas invasivas pelos cocos Gram positivos í S. aureus e S. epidermidis são de preocupação particular porque eles são um problema de saúde pública crescente no mundo todo. Especificamente, i S. aureus é responsável pela maioria das infecções adquiridas em hospital (nosocomiais) e sua prevalência em infecções com início em comunidade está aumentando. Por exemplo, a incidência de S. aureus resistente à meti- cilina (Methicillin-Resistant S. aureus - MRSA) foi estimada em 31,8 por

100.000 pessoas, incluindo 18.650 mortes nos Estados Unidos em 2005. -” Vide Klevens R.M. et al., JAMA, 298: 1763-71 (2007).

Divulgas estafilocócicas têm mostrado um aumento dramático e “10 nos últimos 20 anos, esse aumento em paralelo com o uso de dispositivos intravasculares e procedimentos invasivos. Essa elevação na incidência da doença se toma mais problemático em virtude da paralela elevação de resis- tência a antibiótico, portanto, há uma necessidade urgente por composições imunogênicas para uso em vacinas ou estimular anticorpos policlonais ou - monocionais para conferir imunidade passiva como um meio para prevenir ou tratar infecção estafilocócica e doenças associadas.

Ú SUMÁRIO DA INVENÇÃO . A presente invenção é dirigida a uma composição imunogênica com múltiplos antígenos ou múltiplos componentes compreendendo pelo —menostrês antígenos isolados de uma bactéria estafilocócica. Os antígenos, o os quais são polipeptideos e polissacarídeos, podem ser obtidos, inter alia, diretamente da bactéria usando procedimentos de isolamento bem conheci- dos por aqueles versados no campo ou eles podem ser produzidos usando protocolos sintéticos ou eles podem ser recombinantemente produzidos u- —sando procedimentos de engenharia genética também conhecidos por aque- les versados no campo ou através de uma combinação de qualquer um dos precedentes. Em determinadas modalidades, uma composição imunogênica . da invenção compreende três ou mais antígenos selecionados de um poli- peptídeo de fator A de aglutinação (CIfA) isolado de S. aureus, um polipepti- . 30 deodefatorB de aglutinação (CIfB) isolado de S. aureus, um polissacarídeo capsular do tipo 5 (CP5) isolado de S. aureus conjugado a uma proteína veí- i culo, um polissacarideo capsular do tipo 8 (CP8) isolado de S. aureus e uma

| 3/134 . proteina MntC isolada de S. aureus.

Além disso, a presente invenção pro- porciona métodos para indução de uma resposta imune contra uma bactéria Ú estafilocócica, métodos para prevenção, redução de gravidade ou retardo de início de uma doença causada por uma bactéria estafilocócica e métodos para prevenção, redução de gravidade ou retardo de início de pelo menos um sintoma de uma doença causada por uma bactéria estafilocócica.

Consequentemente, em uma modalidade, à invenção proporcio- . na uma composição imunogênica compreendendo; um polipeptídeo de fator A de aglutinação (CITA) isolado de S. aureus, um polissacarideo capsular do e - 10 tipo 5 (CP5) isolado de S. aureus conjugado a uma proteína veículo e um polissacarideo capsular do tipo 8 (CP8) isolado de S. aureus conjugado a uma proteina veículo, ' Em uma modalidade, a invenção proporciona uma composição imunogênica compreendendo: um polipeptídeo de fator A de aglutinação - (CIfA) isolado de S. aureus, um fator B de aglutinação (CIfB) isolado de S, aureus, um polissacarídeo capsular do tipo 5 (CP5) isolado de S. aureus ” conjugado à uma proteina veículo e um polissacarídeo capsular do tipo 8 (CP8) isolado de S. aureus conjugado a uma proteína veículo. : Em uma modalidade, a invenção proporciona uma composição imunogênica compreendendo: um polipeptideo de fator A de aglutinação eo (CIfA) isolado de S. aureus, um polipeptídeo de fator B de aglutinação (CIfB) isolado de S. aureus, uma proteína MntC isolada de S. aureus, um polissa- carídeo capsular do tipo 5 (CP5) isolado de S. aureus conjugado a uma pro- teína veículo e um polissacarideo capsular do tipo 8 (CP8) isolado de S. au- reus conjugado a uma proteina veículo.

Em uma modalidade, a invenção proporciona uma composição imunogênica compreendendo: um polipeptideo de fator À de aglutinação . (CIfA) isolado de S. aureus, uma proteína MntC isolada de S. aureus, um polissacarideo capsular do tipo 5 (CP5) isolado de S. aureus conjugado a ' 30 uma proteina veículo e um polissacarídeo capsular do tipo 8 (CP8) isolado de S. aureus conjugado a uma proteína veículo. ' Em uma modalidade, à invenção proporciona uma composição

.: 4/134 ' imunogênica compreendendo: um polipeptídeo de fator B de aglutinação BR (CIfB) isolado de S. aureus, um polissacarideo capsular do tipo 5 (CP5) iso- lado de S. aureus conjugado a uma proteina veiculo e um polissacarídeo capsular do tipo 8 (CP8) isolado de S. aureus conjugado a uma proteína vei- culo Em uma modalidade, a invenção proporciona uma composição imunogênica compreendendo: um polipeptídeo de fator B de aglutinação ' (CIfB) isolado de S. aureus, uma proteína MntC isolada de S. aureus, um polissacarídeo capsular do tipo 5 (CP5) isolado de S. aureus conjugado a e 10 uma proteina veículo e um polissacarídeo capsular do tipo 8 (CP8) isolado de S. aureus conjugado a uma proteina veículo.

Em uma modalidade, a invenção proporciona uma composição í imunogênica compreendendo: um polipeptídeo de fator A de aglutinação (CIfA) isolado de S. aureus, um polipeptídeo de fator B de aglutinação (CIfB) - isolado de S. aureus e uma proteina MntC isolada de S. aureus. Em uma modalidade, a invenção proporciona uma composição ] imunogênica compreendendo: uma proteina MntC isolada de S. aureus, um . polissacarídeo capsular do tipo 5 (CP5) isolado de S. aureus conjugado a uma proteína veículo e um polissacarideo capsular do tipo 8 (CP8) isolado deS. aureus conjugado a uma proteína veículo.

e Em uma modalidade, a composição imunogênica compreende um fragmento de polipeptideo de CIfA isolado, em que o fragmento de poli- peptídeo de CIfA compreende o domínio de ligação a fibrinogênio de CIfA. Em uma modalidade, o fragmento de polipeptídeo de CIfA compreende um domínio de ligação à fibrinogênio compreendendo os domínios N1, N2 e N3 de CIA. Em uma modalidade, o fragmento de polipeptídeo de CIfA compre- ende um domínio de ligação a fibrinogênio compreendendo os domínios N2 . e N3 de CITA. Em uma modalidade, as composições contendo o domínio de ligação a fibrinogênio de CIfA mostram ligação reduzida ao fibrinogênio. Em ' 30 uma modalidade, o domínio de ligação a fibrinogênio de CIfA se liga ao fibri- . nogênio em um nível reduzido comparado com a ligação ao fibrinogênio ob- servada com o domínio de CIfA de ligação ao fibrinogênio nativo. Em uma |

. modalidade, as composições contendo o domínio de ligação a fibrinogênio de CIfA mostram ligação reduzida ao fibrinogênio e têm uma substituição de Ú aminoácido em um ou mais de Tyr 338, Tyr 256, Pro 336, Lys 389, Ala 254 e lle 387 da proteina de comprimento total contendo a sequência sinalizadora. Emuma modalidade, as composições contendo o domínio de ligação a fibri- nogênio de CIfA mostram uma substituição de aminoácido em um ou mais de Tyr 338, Tyr 256, Pro 336, Lys 389, Ala 254 e lle 387, em que o aminoá- : cido em qualquer uma ou mais dessas posições é trocado para uma Ala ou Ser. Em uma modalidade, a composição compreende um domínio de ligação e “10 afibrinogênio de CIfA em que a Tyr na posição 338 é trocada para uma Ala.

Em uma modalidade, a composição imunogênica compreende um fragmento de polipeptídeo de CIfB isolado, em que o fragmento de poli- , Peptideo de CIfB compreende o domínio de ligação a fibrinogênio de CIÍB. Em uma modalidade, o fragmento de polipeptídeo de CIfB compreende um - domínio de ligação a fibrinogênio compreendendo os domínios N1, N2 e N3 de CIfB. Em uma modalidade, o fragmento de polipeptídeo de CIfB compre- 7 ende um domínio de ligação a fibrinogênio compreendendo os domínios N2 e N3 de CIfB. Em uma modalidade, as composições contendo o domínio de ligação a fibrinogênio de CIfB mostram ligação reduzida ao fibrinogênio. Em uma modalidade, o domínio de ligação a fibrinogênio de CIfB se liga ao fibri- eo nogênio em um nível reduzido comparado com a ligação ao fibrinogênio ob- servada com o domínio de ligação a fibrinogênio de CIfB nativo. Em uma modalidade, a composição imunogênica compreende polissacarideo capsular do tipo 5 de S. aureus (CP5) o qual é um polissaca- rideode alto peso molecular de entre 20 e 1000 kDa. Em uma modalidade, o polissacarideo do tipo 5 de alto peso molecular tem um peso molecular de entre 50 e 300 kDa. Em uma modalidade, o polissacarideo do tipo 5 de alto peso molecular tem um peso molecular de entre 70 e 150 kDa.

Em uma modalidade, a composição imunogênica compreende um polissacaríideo capsular do tipo 5 de S. aureus, o qual é entre 10% e 100% O-acetilado. Em uma modalidade, a composição imunogênica com- ' preende um polissacarideo capsular do tipo 5 de S. aureus, o qual é entre

50% e 100% O-acetilado. Em uma modalidade, a composição imunogênica - compreende um polissacarideo capsular do tipo 5 de S. aureus, o qual é en- tre 75% e 100% O-acetilado. Em uma modalidade, a composição imunogênica compreende polissacarídeo capsular do tipo 8 de S. aureus o qual é um polissacarideo de alto peso molecular de entre 20 e 1000 kDa. Em uma modalidade, o polissa- carídeo do tipo 8 de alto peso molecular tem um peso molecular de entre 50 e 300 kDa. Em uma modalidade, o polissacarídeo do tipo 8 de alto peso mo- . lecular tem um peso molecular de entre 70 e 150 kDa. e 10 Em uma modalidade, a composição imunogênica compreende um polissacarídeo capsular do tipo 8 de S. aureus, o qual é entre 10% e 100% O-acetilado. Em uma modalidade, a composição imunogênica com- preende um polissacarídeo capsular do tipo 8 de S. aureus, o qual é entre 50% e 100% O-acetilado. Em uma modalidade, a composição imunogênica - compreende um polissacarídeo capsular do tipo 8 de S. aureus, o qual é en- : tre 75% e 100% O-acetilado. Em uma modalidade, o polissacarídeo capsular 5 e/ou 8 presen- - te em uma composição imunogênica é conjugado a uma proteina veículo. Em uma modalidade, a proteina veículo é o toxóide CRM 15; de Corynebacte- rium diphtheriae (C. diphtheriae). eo Em uma modalidade, a composição imunogênica compreende a MntC de S. aureus, a qual é uma proteína lipidada. Em uma modalidade, a composição imunogênica compreende a MntC de S. aureus, a qual não é uma proteína lipidada.

Em uma modalidade, a invenção proporciona uma composição imunogênica conforme descrito aqui, ainda compreendendo pelo menos uma proteína da família de proteina com repetição de serina-aspartato (Sdr) sele- cionada do grupo consistindo de SdrC, SdrD e SdrE.

Em uma modalidade, a invenção proporciona uma composição —imunogênica conforme descrito aqui, ainda compreendendo a proteina de- - terminante na superfície de ferro B (IsdB), Em cada uma das modalidades descritas aqui nas quais uma composição imunogênica compreende três ou mais antígenos mencionados, - essa composição pode ainda compreender outras substâncias imunogênicas e/ou não imunogênicas.

Em determinadas modalidades, cada composição imunogênica pode, alternativamente, "consistir essencialmente de" ou "con- sistirde" três ou mais antígenos mencionados e ainda compreender uma ou mais substâncias não imunogênicas, conforme descrito em maiores detalhes aqui.

Em uma modalidade, a invenção proporciona uma composição . imunogênica conforme descrito aqui, ainda compreendendo qualquer um o 10 dos seguintes antígenos: Opp3a, DItD, HtsA, LtaS, IsdA, IsdC, SdrF, SdrG, SdrH, SrtA, SpA, Sbi FmtB, alfa-hemolisina (hla), beta-hemolisina, proteína A de ligação à fibronectina (fnbA), proteína B de ligação à fibronectina (fnbB), coagulase, Fig, map, leucocidina de Panton-Valentine (pvl), alfa-toxina e su- as variantes, gama-toxina (hlg) e variantes, ica, transportador ABC imuno- - dominante, transportador de Mg2*, transportador ABC de Ni, RAP, autolisi- : na, receptores de laminina, ISaA/PisA, IsaB/PisB , SPOIIIE, SsaA, EbpS, Sas A, SasF, SasH, EFB (FIB), SBI, Npase, EBP, proteína Il de sialo ligação ós- . sea, precursor de aureolisina (AUR/Sepp1, Cna e fragmentos do mesmo, tas como M55, TSST-1, mecA, exopolissacarideo de poli-n- —acetilglucosamina (PNAG/APNAG), GehD, EbhA, EbhB, SSP-1, SSP-2, o HBP, proteína de ligação à vitronectina, HarA, EsxA, EsxB, Enterotoxina A, Enterotoxina B, Enterotoxina C1 e nova autolisina.

Em determinadas modali- dades da invenção, quando a composição imunogênica compreende deter- minadas formas de CPS e/ou CP8, ela pode ainda não compreender PNAG.

Em uma modalidade, a composição imunogênica ainda compre- ende um adjuvante.

Em uma modalidade, a composição imunogênica ainda compreende um veículo farmaceuticamente aceitável.

Em uma modalidade, a composição imunogênica é usada para formular uma vacina.

Em uma modalidade, a vacina é usada para induzir a uma resposta imune em um indivíduo contra S. aureus.

Em uma modalida- - de, a composição imunogênica é usada para gerar uma formulação de anti- corpo para conferir imunidade passiva a um individuo.

| Em uma modalidade, a invenção proporciona um método de in- . dução de uma resposta imune contra S. aureus compreendendo administra- ção, ao indivíduo, de uma quantidade imunogênica de qualquer uma das composições imunogênicas conforme descrito aqui e um veículo farmaceuti- camente aceitável.

Em uma modalidade, a invenção proporciona um método de prevenção ou redução de infecção por S. aureus ou um método de preven- Ú ção ou redução da gravidade de pelo menos um sintoma associado a uma . infecção causada por S. aureus, os métodos compreendendo administração, e 10 ao indivíduo, de uma quantidade imunogênica de qualquer uma das compo- sições imunogênicas conforme descrito aqui e um veículo farmaceuticamen- te aceitável.

Em uma modalidade, os métodos para indução de uma resposta imune contra S. aureus compreendem distribuição das composições imuno- - gênicas com um adjuvante.

Em uma modalidade, os métodos para indução de uma resposta imune contra S. aureus constituem de distribuição das composições imunogênicas com um veículo farmaceuticamente aceitável. : Em uma modalidade, a resposta imune induzida pela composi- ção imunogênica conforme descrito aqui previne ou reduz uma doença ou condição associada a um organismo estafilocócico em um indivíduo ou pre- oe vine ou reduz um ou mais sintomas associados a um organismo estafilocóci- co em um indivíduo.

Em uma modalidade, a doença é selecionada do grupo consistindo de doença invasiva por S. aureus, sepsia e transmissão.

Em uma modalidade, a resposta imune induzida compreende a geração de anticorpos tendo atividade opsonofagocítica (Opsonophagocytic Activity - OPA) contra S. aureus.

Em uma modalidade, a resposta imune in- duzida compreende a geração de maiores titulações de anticorpos opsono- fagocíticos específicos para S. aureus comparado com aquelas observadas em indivíduos não imunizados.

Em uma modalidade, a titulação opsonofa- —gocíticaé de pelo menos 1:20. . Em uma modalidade, a S. aureus contra a qual a resposta imune é induzida é MRSA.

Em uma modalidade, a S. aureus contra a qual a res-

posta imune é induzida é MSSA. Em uma modalidade, a S. aureus contra a . qual a resposta imune é induzida é VRSA. Em uma modalidade, a S. aureus contra a qual a resposta imune é induzida é VISA. Em uma modalidade, a invenção proporciona um método para prevenção de uma infecção estafilocócica em um indivíduo que sofreu um procedimento cirúrgico, o método compreendendo administração de uma quantidade imunologicamente eficaz de qualquer uma das composições i- i munogênicas as conforme descrito aqui ao individuo prior to o procedimento . cirúrgico. O procedimento cirúrgico pode ser um procedimento cirúrgico ele- e 10 tivo ou um procedimento cirúrgico não eletivo. Em uma modalidade, o pro- cedimento cirúrgico é um procedimento cirúrgico cardio-torácico. Em uma modalidade, o individuo é um ser humano, animal de estimação ou um ani- mal de criação, | Em uma modalidade, a invenção proporciona um método para - conferir imunidade passiva a um indivíduo compreendendo as etapas de (1) . geração de um preparado de anticorpo usando uma das composições imu- nogênicas da invenção; e (2) administração do preparado de anticorpo ao ' indivíduo para conferir imunidade passiva.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A Figura 1 representa as várias formas de CIfA recombinante e oe divulga SEQ ID NOs: 125 e 127-129, respectivamente, em ordem de apare- cimento. A Figura 2 representa as etapas de clonagem usadas para construção de pl.P1179 para expressão de CITA. A Figura 3 representa o vetor de expressão de T7CIfA123)Y338A, pLP1179. A Figura 4 representa a estrutura de repetição dos polissacari- deos CP5 e CP8. As Figuras 5A e 5B representam perfis de peso molecular de CP5(A)eCP8(B)produzidos em diferentes pHs do caldo. - As Figuras 6A e 6B representam perfis de peso molecular de CP5 (A) e CP8 (B) produzidos em diferentes temperaturas. | i A Figura 7 demonstra a correlação do peso molecular de CP5 e . CP8 purificados com o tempo de tratamento para hidrólise ácida suave. As Figura 8A-BE representam o alinhamento de CIfA entre vá- rias cepas de S. aureus (SEQ ID NOs: 62, 64, 68, 84, 70, 104, 66, 78, 86, 88,90,72,74,76, 80, 94,82, 92,96, 98, 100, 102, 106 e 108, respectiva- mente, em ordem de aparecimento). A Figura 9 representa à árvore filogenética de CIfA, Ú As Figura 10A-10E representam o alinhamento de CIfB entre várias cepas de S. aureus (SEQ ID NOs: 26, 28, 32, 18, 54, 34, 36, 30, 16, e 10 20,22,24,38,40,42,44,46,48, 50, 52, 56, 58 e 60, respectivamente, em ordem de aparecimento). A Figura 11 representa a árvore filogenética de CIfB. A Figura 12 representa o alinhamento de MntC entre várias ce- pas de S. aureus (SEQ ID NOs: 2, 8, 10, 4, 6, 14 e 12, respectivamente, em 15 . ordem de aparecimento).

A Figura 13 demonstra que anticorpos policlonais anti-CIfA de ] coelho reduzem as contagens de colônia de S. aureus 659-018 em um mo- . delo de sepsia em murino, A Figura 14 demonstra que imunização ativa com CIA reduz a colonização do coração por S. aureus PEESA0OO03 no modelo de endocardi- oe te infectiva em coelho, As Figuras 15A e 15B demonstram que imunização com MntC reduz a S, aureus no sangue. A; cepa S. aureus PFESA0237; B: cepa S. aureus PFESA0266, A Figura 16 demonstra que a formulação imunogênica de con- jugado de CP5 de S. aureus-CRM;;97; exibe consistentemente proteção em um modelo de pielonefrite em murino.

A Figura 17 demonstra que vacinação com a formulação imuno- gênica de conjugado CP8-CRM3 9; reduz a morte em um modelo de sepsia.

A Figura 18 mostra unidades de formação de colônia (Colony . Forming Units - CFU) recuperadas em rins após estímulo com S. aureus PFESAV0266 em camundongos vacinados com CPS5-CRM de alto peso mole-

' cular (HMW), CPS-CRM de baixo peso molecular (LMW) ou controle PP5- . CRM.

A Figura 19 mostra uma comparação das titulações de OPA (geomédia) de soro obtido de camundongos vacinados com diferentes for- mulações de conjugado polissacarídico (CPS-CRM de alto peso molecular (HMW), CPS-CRM de baixo peso molecular (LMW)). Os grupos consistiam de 5 a 9 camundongos. ' A Figura 20 demonstra a titulação de OPA para o soro de prima- ta não humano antes (wk0O, símbolos abertos) e 2 semanas após (wk2, sim- e “10 bolos fechados) vacinação com diferentes combinações de antígenos de S, aureus. A vacina com 3-antígenos (3Ag) era composta de três antígenos e a vacina com 4-antígenos (4Ag) era composta de quatro antígenos. Cada for- mulação tem dois conjugados de CP e 1 ou 2 peptídeos.

i DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO Antes que os presentes métodos e metodologia de tratamento sejam descritos, deve ser entendido que a presente invenção não está limi- ' tada aos métodos e condições experimentais descritos em particular, uma ' vez que tais métodos e condições podem variar. Deve também ser entendi- do que a terminologia usada aqui é para fins de descrição de modalidades particulares apenas e não se destina a ser limitativa.

o Embora quaisquer métodos e materiais similares ou equivalen- tes àqueles descritos aqui possam ser usados na prática ou testagem da invenção, os métodos e materiais preferidos são agora descritos. Todas as publicações mencionadas aqui são incorporadas por referência na íntegra.

Os termos usados aqui têm os significados reconhecidos e co- nhecidos por aqueles versados no campo, contudo, por conveniência e a- brangência, termos particulares e seus significados são apresentados abai- xo.

Conforme usado no presente relatório descritivo e nas reivindi- cações em anexo, as formas no singular "um", "uma, "o" e "a" incluem as : referências no plural, a menos que o contexto oriente claramente de outro modo. Assim, por exemplo, referências a "o método" incluem um ou mais métodos e/ou etapas do tipo descrito aqui e/ou as quais serão evidentes pa- ra aqueles versados no campo quando de leitura da presente divulgação e assim por diante.

O termo "cerca de" ou "aproximadamente" significa dentro de uma faixa estatisticamente significativa de um valor. Tal faixa pode estar dentro de uma ordem de magnitude, tipicamente dentro de 20%, mais tipi- . camente dentro de 10% e, ainda mais tipicamente, dentro de 5% de um de- terminado valor ou faixa. A variação permissível abrangida pelo termo "cerca - de" ou "aproximadamente" depende do sistema sob estudo em particular e e 10 pode ser prontamente apreciada por aqueles versados no campo. Sempre que uma faixa é mencionada dentro do presente pedido, cada número inteiro dentro da faixa também é considerado como uma modalidade da invenção. Um "anticorpo" é uma molécula de imunoglobulina capaz de |i- | gação específica a um alvo, tal como um carboidrato, polinucleotídeo, lipidio, 15 . polipeptídeo, etc., através de pelo menos um sítio de reconhecimento de . antígeno, localizado na região variável da molécula de imunoglobulina. Con- forme usado aqui, a menos que de outro modo indicado pelo contexto, o " termo se destina a abranger não apenas anticorpos policlonais ou monocio- nais intactos, mas também anticorpos manipulados (por exemplo, quiméri- cos, humanizados e/ou derivatizados para alterar funções efetuadoras, esta- o bilidade e outras atividades biológicas) e fragmentos dos mesmos (tais como Fab, Fab', F(ab')2, Fv), anticorpos com cadeia única (ScFv) e domínio, inclu- indo anticorpos de tubarão e camelideo) e proteinas de fusão compreenden- do uma porção de anticorpo, anticorpos multivalentes, anticorpos multiespe- cíficos (por exemplo, anticorpos biespecíficos, contanto que eles exibam a atividade biológica desejada) e fragmentos de anticorpo conforme descrito aqui e qualquer outra configuração modificada da molécula de imunoglobuli- na que compreende um sítio de reconhecimento de antígeno. Um anticorpo inclui um anticorpo de qualquer classe, tal como IgG, IgA ou IgM (ou sub- classedas mesmas) e o anticorpo não precisa ser de qualquer classe em . particular. Dependendo da sequência de aminoácido do domínio constante de anticorpo de suas cadeias pesadas, imunoglobulinas podem ser atribuí-

das à diferentes classes. Existem cinco principais classes de imunoglobuli- ' nas: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM e várias dessas podem ser ainda divididas em subclasses (isotipos), por exemplo, I9G1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2 em seres humanos. Os domínios de cadeia pesada que correspondem às dife- rentes classes de imunoglobulinas são denominados alfa, delta, epsilon, gama e mu, respectivamente. As estruturas de subunidade e configurações . tridimensionais de diferentes classes de imunoglobulinas são bem conheci- das.

: "Fragmentos de anticorpo" compreendem apenas uma porção o 10 deum anticorpo intacto, em que a porção retém, de preferência, pelo menos uma, mais preferivelmente a maioria ou todas as funções normalmente as- sociadas a essa porção quando presente em um anticorpo intacto, O termo “antígeno” refere-se, em geral, a uma molécula biológi- ca, usualmente uma proteína, peptídeo, polissacarídeo, lipídio ou conjugado - o qual contém pelo menos um epítopo ao qual um anticorpo cognato pode . se ligar seletivamente; ou, em alguns casos, a uma substância imunogênica . —que pode estimular a produção de anticorpos ou respostas de células T ou ' ambos, em um animal, incluíndo composições que são injetadas ou absorvi- das por um animal. A resposta imune pode ser gerada à molécula inteira ou aumaoumais de vários porções da molécula (por exemplo, um epítopo ou o hapteno). O termo pode ser usados para referir-se a uma molécula individual Ou a uma população homogênea ou heterogênea de moléculas antigênicas. Um antígeno é reconhecido por anticorpos, receptores de células T ou ou- tros elementos de imunidade humoral e/ou celular específicos. O termo "an- tígeno" inclui todos os epítopos antigênicos relacionados. Epítopos de um determinado antígeno podem ser identificados usando qualquer número de técnicas de mapeamento de epítopo bem conhecidos no campo. Vide, por exemplo, Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66 (Glenn E. Morris, Ed., 1996) Humana Press, Totowa, N. J. Por exemplo, epítopos lineares podem ser determinados, por exemplo, sintetizando con- ' correntemente grandes números de peptídeos sobre suportes sólidos, os peptídeos correspondendo à porções da molécula de proteina e reagindo os peptídeos com anticorpos enquanto os peptídeos ainda estão presos aos ' suportes, Tais técnicas são conhecidas no campo e descritas, por exemplo, na Pat.

U.S.

No. 4.708.871; Geysen et al. (1984) Proc.

Natl.

Acad.

Sci.

USA 81: 3998-4002; Geysen et al. (1986) Molec.

Iimmunol. 23: 709-715, todos incorporados aqui por referência na íntegra.

Similarmente, epitopos confor- macionais podem ser identificados determinando-se a conformação espacial ' de aminoácidos tal como, por exemplo, por meio de cristalografia de raios x e ressonância magnética nuclear bidimensional.

Vide, por exemplo, Epitope , Mapping Protocols, supra.

Além disso, para fins da presente invenção, um o 10 "“antigeno" pode também ser usado para referir-se a uma proteina que incluí modificações, tais como deleções, adições e substituições (geralmente de natureza conservativa, mas podem ser não conservativas) na sequência na- tiva, contanto que a proteina mantenha a capacidade de estimular uma res- posta imunológica.

Essas modificações podem ser deliberadas, conforme - por meio de mutagênese sítio-dirigida ou através de procedimentos sintéti- . cos particulares ou uma abordagem de engenharia genética ou podem ser . — acidentais, tal como através de mutações de hospedeiros os quais produzem : os antígenos.

Além disso, o antigeno pode ser derivado, obtido ou isolado de um micróbio, por exemplo, uma bactéria ou pode ser um organismo inteiro.

Similarmente, um oligonucleotídeo ou polinucleotídeo o qual expressa um o antígeno, tal como em aplicações de imunização com ácido nucleico, tam- bém é incluído na definição.

Antígenos sintéticos são também incluídos, por exemplo, poli-epítopos, epítopos de flanqueamento e outros antígenos re- combinantes ou sinteticamente derivados (Bergmann et al. (1993) Eur.

J.

Immunol. 23: 2777 2781; Bergmann et al, (1996) J.

Ímmunol. 157: 3242 3249; Suhrbier, A. (1997) Immunol. and Cell Biol. 75; 402 408; Gardner et al. (1998) 12º World AIDS Conference, Geneva, Suiça, 28 de Junho - 3 de Ju-

lho, 1998). O termo "adjuvante" refere-se a um composto ou mistura que in- tensífica a resposta imune a um antígeno, conforme ainda descrito e exem-

" plificado aqui. "Bacteremia" é a presença transitória de bactérias no sangue.

À | bacteremia pode progredir para septicemia ou sepsia, a qual seria conside- Ú rada uma infecção e é a presença persistente de bactérias no sangue com sinais/sintomas clínicos associados. Nem todas as bactérias são capazes de sobreviver no sangue. Aquelas que não têm traços genéticos especiais não possuem essa capacidade. Também, os fatores do hospedeiro exercem um papel importante.

. "Polissacarídeo capsular" ou "polissacarideo capsular" refere-se à cápsula polissacarídica que é externa à parede celular da maioria dos iso- . lados de Estafilococos. Por exemplo, S. aureus inclui um componente da %" 10 parede celular composto de um complexo de peptidoglicana, o qual permite que o organismo sobreviva sob condições osmóticas desfavoráveis e tam- bém inclui um ácido teicoico único ligado à peptidoglicana. Externa à parede celular, uma cápsula polissacarídica fina reveste a maioria dos isolados de S. aureus. Essa cápsula sorologicamente distinta pode ser usada para soro- 15 . tipificação de vários isolados de S. aureus. Foi mostrado que muitos dos iso- . lados clinicamente relevantes incluem dois tipos de cápsula: sorotipo 5 . (CP5)e sorotipo 8 (CP8). As estruturas de CP5 e CP8 são mostradas es- quematicamente na Figura 4. Conforme usado aqui, "conjugados" compreendem um polissa- caríideo capsular usualmente de uma faixa de peso molecular desejada e se uma proteina veículo, em que o polissacarídeo capsular é conjugado à pro- teina veículo. Conjugados podem ou não conter alguma quantidade de po- lissacarídeo capsular livre. Conforme usado aqui, "polissacarídeo capsular livre" refere-se a um polissacarídeo capsular que é não covalentemente as- sociado (isto é, não covalentemente ligado a, adsorvido a ou encerrado em ou com) o polissacarideo capsular-proteíina veículo conjugados. Os termos "polissacarideo capsular livre", “polissacarideo livre" e "sacarídeo livre" po- dem ser usados permutavelmente e se destinam a trazer o mesmo signífica- do. A despeito da natureza da molécula veículo, ela pode ser conjugada ao polissacarídeo capsular, quer diretamente ou através de um ligante. Confor- : me usado aqui, "conjugar", "conjugado" e "conjugação" referem-se a um . processo pelo qual um polissacarideo capsular bacteriano é covalentemente preso à molécula veículo. Conjugação intensifica a imunogenicidade dos , polissacarídeos capsulares bacterianos. A conjugação pode ser realizada de acordo com os métodos descritos abaixo ou através de processos conheci- dos no campo. Conforme descrito acima, a presente invenção refere-se a con- jugados compreendendo polissacarideos capsulares do sorotipo 5 (CP5) de S. aureus conjugados à proteinas veículo e conjugados compreendendo po- lissacarídeos capsulares do sorotipo 8 (CP8) de S, aureus conjugados à pro- - teíinas veículo. Uma modalidade da invenção proporciona conjugados com- eo 10 preendendo um polissacarideo capsular de sorotipo 5 de S. aureus conjuga- do a uma proteina veículo e um conjugado de polissacarídeo capsular de sorotipo 8 de S. aureus conjugado a uma proteina veículo em que: o polis- sacarideo capsular do tipo 5 tem um peso molecular de entre 50 kDa e 800 kDa; o polissacarídeo capsular do tipo 8 tem um peso molecular de entre 50 15 . e 700 kDa; os conjugados imunogênicos têm pesos moleculares de entre . cerca de 1000 kDa e cerca de 5000 kDa; e os conjugados compreendem menos de cerca de 30% de polissacarideo livre com relação ao polissacari- ' deo total. Em uma modalidade, os conjugados compreendem menos de cer- ca de 25%, cerca de 20%, cerca de 15%, cerca de 10% ou cerca de 5% de polissacarídeo livre com relação ao polissacarídeo total. Em uma modalida- e de, o polissacarideo do tipo 5 ou 8 tem um peso molecular entre 20 kDa e 1000 kDa.

Em uma modalidade, o conjugado tem um peso molecular de entre cerca de 50 kDa e cerca de 5000 kDa. Em uma modalidade, o conju- gadotem um peso molecular de entre cerca de 200 kDa e cerca de 5000 kDa. Em uma modalidade, o conjugado imunogênico tem um peso molecular de entre cerca de 400 kDa e cerca de 2500 kDa. Em uma modalidade, o conjugado imunogênico tem um peso molecular de entre cerca de 500 kDa e cerca de 2500 kDa. Em uma modalidade, o conjugado imunogênico tem um peso molecular de entre cerca de 600 kDa e cerca de 2800 kDa. Em uma - modalidade, o conjugado imunogênico tem um peso molecular de entre cer- ca de 700 kDa e cerca de 2700 kDa. Em uma modalidade, o conjugado imu-

nogênico tem um peso molecular de entre cerca de 1000 kDa e cerca de . 2000 kDa; entre cerca de 1800 kDa e cerca de 2500 kDa; entre cerca de 1100 kDa e cerca de 2200 kDa; entre cerca de 1900 kDa e cerca de 2700 kDa; entre cerca de 1200 kDa e cerca de 2400 kDa; entre cerca de 1700 kDaecercade 2600 kDa; entre cerca de 1300 kDa e cerca de 2600 kDa;

entre cerca de 1600 kDa e cerca de 3000 kDa.

Consequentemente, em uma modalidade, a proteina veículo i dentro do conjugado imunogênico da invenção é CRM 5; e a CRM:197 é cova- - lentemente ligada ao polissacarideo capsular via uma ligação de carbamato, e 10 uma ligaçãode amida ou ambas.

O número de resíduos de lisina em uma proteína veículo que se torna conjugada a um polissacarideo capsular pode ser caracterizado como uma faixa de lisinas conjugadas.

Por exemplo, em uma determinada composição imunogênica, a CRM; pode compreender 5 a 15 lisinas de 39 covalentemente ligadas ao polissacarideo capsular.

Outra 15 . forma de expressar esse parâmetro é que 12% a 40% das lisinas de CRM 97 . são covalentemente ligadas ao polissacaríideo capsular.

Em algumas moda- lidades, a porção CRM; do polissacarideo covalentemente ligado ao ' CRM:s57 compreende 5 a 22 lisinas covalentemente ligadas ao polissacari- deo.

Em algumas modalidades, a porção CRM; do polissacarídeo covalen- temente ligado ao CRM;is; compreende 5 a 23 lisinas covalentemente liga- e das ao polissacarideo.

Em algumas modalidades, a porção CRM 57 do polís- sacarideo covalentemente ligado à proteina veículo compreende 8 a 15 lisi- nas covalentemente ligadas ao polissacarídeo, Em algumas modalidades, a porção CRM: 57 do polissacarideo covalentemente ligado à proteina veículo compreende 8 a 12 lisinas covalentemente ligadas ao polissacarideo.

Por exemplo, em uma determinada composição imunogênica, a CRM;57 pode compreender 18 a 22 lisinas de 39 covalentemente ligadas ao polissacarideo capsular.

Outra forma de expressar esse parâmetro é que 40% a 60% das lisinas de CRM:57 são covalentemente ligadas ao polissacarideo capsular.

Emalgumas modalidades, a CRM,s; compreende 5 a 15 lisinas de 39 cova- * lentemente ligadas ao CP8. Outra forma de expressar esse parâmetro é que 12% a 40% das lisinas de CRM;57 são covalentemente ligadas ao CP8. Em algumas modalidades, a CRM;19; compreende 18 a 22 lisinas de 39 covalen- temente ligadas ao CP5. Outra forma de expressar esse parâmetro é que

40% a 60% das lisinas de CRM; 197 são covalentemente ligadas ao CP5. Conforme discutido acima, o número de resíduos de lisina em uma proteina veículo conjugada ao polissacarideo capsular pode ser carac- terizado como uma faixa de lisinas conjugadas, a qual pode ser expressa como uma proporção molar.

Por exemplo, a proporção molar de lisinas con- i jugadas ao CRM 57 no conjugado imunogênico de CP8 pode estar entre cer- : ca de 18:1 a cerca de 22:1. Em uma modalidade, a faixa de proporção molar o 10 de lisinas conjugadas ao CRM157 no conjugado imunogênico de CP8 pode estar entre cerca de 15:1 a cerca de 25:1. Em algumas modalidades, a faixa de proporção molar de lisinas conjugadas ao CRM:5; no conjugado imuno- gênico de CP8 pode estar entre cerca de 14:1 a cerca de 20:1; cerca de 12:1 a cerca de 18:1; cerca de 10:1 a cerca de 16:1; cerca de 8:1 a cerca de 14:1; 15 . cerca de 6:1 a cerca de 12:1; cerca de 4:1 a cerca de 10:1; cerca de 20:1 a : cerca de 26:1; cerca de 22:1 a cerca de 28:1; cerca de 24:1 a cerca de 30:1; cerca de 26:1 a cerca de 32:1; cerca de 28:1 a cerca de 34:1; cerca de 30:1 : a cerca de 36:1; cerca de 5:1 a cerca de 10:1; cerca de 5:1 a cerca de 20:1; cerca de 10:1 a cerca de 20:1; ou cerca de 10:1 a cerca de 30:1. Também, a proporção molar de lisinas conjugadas ao CRM157 no conjugado imunogêni- o co de CP5 pode estar entre cerca de 3:1 e 251. Em uma modalidade, a fai- xa de proporção molar de lisinas conjugadas ao CRM 157 no conjugado imu- nogênico de CP5 pode estar entre cerca de 5:1 a cerca de 201. Em uma modalidade, a faixa de proporção molar de lisinas conjugadas ao CRM.5; no conjugado imunogênico de CP5 pode estar entre cerca de 4:1 à cerca de 20:1; cerca de 6:1 a cerca de 20:1; cerca de 7:1 a cerca de 20:1; cerca de 8:1 a cerca de 20:1; cerca de 10:1 a cerca de 20:1; cerca de 11:1 à cerca de 20:1; cerca de 12:1 a cerca de 20:1; cerca de 13:1 a cerca de 20:1; cerca de 14:1 a cerca de 20:1; cerca de 15:1 a cerca de 20:1; cerca de 16:1 a cerca de20:1;cercade 17:1acerca de 20:1; cerca de 18:1 a cerca de 20:1; cerca . de 5:1 a cerca de 18:1; cerca de 7:1 a cerca de 16:1; ou cerca de 9:1 a cerca de 14:1.

Outra forma de expressar o número de resíduos de lisina uma ' proteína veículo conjugada ao polissacarídeo capsular pode ser como uma faixa de lisinas conjugadas.

Por exemplo, em um determinado conjugado imunogênico de CP8, a CRM; pode compreender 5 a 15 lisinas de 39 co- valentemente ligadas ao polissacarídeo capsular.

Alternativamente, esse parâmetro pode ser expresso como um percentual.

Por exemplo, em um de- . terminado conjugado imunogênico de CP8, o percentual de lisinas conjuga- das pode estar entre 10% a 50%, Em algumas modalidades, 20% a 50% de . lisinas podem ser covalentemente ligadas ao CP8. Ainda alternativamente, oe 10 30% a50% de lisinas de CRM 5; podem ser covalentemente ligadas ao CP8; 10% a 40% de lisinas de CRM197; 10% à 30% de lisinas de CRM197; 20% a 40% de lisinas de CRM 697; 25% a 40% de lisinas de CRM197; 30% a 40% de lisinas de CRM197; 10% a 30% de lisinas de CRM197; 15% a 30% de lisinas de CRM157; 20% à 30% de lisinas de CRM:57; 25% a 30% de lisinas de - CRMi157; 10% à 15% de lisinas de CRM:97; ou 10% a 12% de lisinas de - CRM:167 são covalentemente ligadas ao CP8, Também, em um determinado conjugado imunogênico de CP5, a CRM:s5; pode compreender 18 a 22 lisi- ' nas de 39 covalentemente ligadas ao polissacarideo capsular.

Alternativa- mente, esse parâmetro pode ser expresso como um percentual.

Por exem- plo em um determinado conjugado imunogênico de CP5, o percentual de oe lisinas conjugadas pode estar entre 40% a 60%. Em algumas modalidades, 40% a 60% de lisinas podem ser covalentemente ligados ao CP5. Ainda al- ternativamente, 30% a 50% de lisíinas de CRM;9; podem ser covalentemente ligados ao CP5; 20% a 40% de lisinas de CRM197; 10% a 30% de lisinas de CRMi97; 50% a 70% de lisinas de CRM197; 35% a 65% de lisinas de CRM197; 30% a 60% de lisinas de CRM 197; 25% a 55% de lisinas de CRM;197; 20% à 50% de lisinas de CRM197; 15% a 45% de lisinas de CRM197; 10% a 40% de lisinas de CRM157; 40% a 70% de lisinas de CRM697; ou 45% a 75% de lisi-

nas de CRM; 57 são covalentemente ligados ao CP5. A frequência de fixação da cadeia do polissacarideo capsular a 7 uma lisina sobre a molécula veículo é outro parâmetro que caracteriza con- jugados de polissacarideos capsulares.

Por exemplo, em uma modalidade,

pelo menos uma ligação covalente entre a CRM57 e polissacarideo ocorre a . pelo menos cada 5 a 10 unidades de repetição sacarídica do polissacarídeo capsular. Em outra modalidade, há pelo menos uma ligação covalente entre a CRM; 9; e o polissacarideo capsular para cada 5 a 10 unidades sacarídicas repetidas; cada 2 a 7 unidades sacarídicas repetidas, cada 3 a 8 unidades sacarídicas repetidas; cada 4 a 9 unidades sacarídicas repetidas; cada 6 a 11 unidades sacarídicas repetidas; cada 7 a 12 unidades sacarídicas repeti- das; cada 8 a 13 unidades sacarídicas repetidas; cada 9 a 14 unidades sa- . caridicas repetidas; cada 10 a 15 unidades sacarídicas repetidas; cada 2a 6 o 10 unidades sacarídicas repetidas, cada 3 a 7 unidades sacarídicas repetidas; cada 4 a 8 unidades sacarídicas repetidas; cada 6 a 10 unidades sacarídicas repetidas; cada 7 a 11 unidades sacarídicas repetidas; cada 8 a 12 unidades sacarídicas repetidas; cada 9 a 13 unidades sacarídicas repetidas; cada 10 a 14 unidades sacarídicas repetidas; cada 10 a 20 unidades sacarídicas repe- tidas; cada 5 a 10 unidades sacarídicas repetidas do polissacarídeo capsu- : lar. Em outra modalidade, pelo menos uma ligação entre a CRM 47 e o polis- sacarídeo capsular ocorre para cada 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10,11, 12, 13, 14, . 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 unidades sacarídicas repetidas do polissacarideo capsular.

A ativação química dos polissacarideos e subsequente conjuga- o ção à proteína veículo pode ser obtida através de meios convencionais. Vi- de, por exemplo, Pats. U.S. Nos. 4.673.574 e 4.902.506. Outros métodos de ativação e conjugação podem ser altenativamente usados. "Proteína veiculo" ou "proteína carreadora", conforme usado a- qui, refere-se à qualquer molécula de proteína que pode ser conjugada a um antígeno (tais como polissacarideos capsulares) contra o qual uma resposta imune é desejada. Conjugação de um antígeno, tal como um polissacarídeo, a uma proteína veículo pode tornar o antígeno imunogênico. Proteínas vei- culo são, de preferência, proteinas que são não tóxicas e não reatogênicas e obteníveis em quantidade e pureza suficientes. Exemplos de proteínas vei- . culo são toxinas, toxóides ou qualquer material de reação cruzada mutante (CRM197) da toxina de tétano, difteria, pertussis, espécies Pseudomonas,

E. coli, espécies Staphylococcus e espécies Streptococcus. Proteinas veicu- . lo deverão ser passíveis de procedimentos padrões de conjugação. Em uma modalidade particular da presente invenção, CRM57 é usada como a protei- na veículo. CRM+157 (WyettPfizer, Sanford, NC) é uma variante não tóxica (isto é, toxóide) de toxina de difteria isolada de cultures da cepa C7 de Cory- nebacterium diphtheria (B.97) crescida em casaminoácidos e meio baseado em extrato de levedura, CRM197 é purificada através de ultra-filtração, preci- . pitação com sulfato de amônio e cromatografia de troca de íons. Uma cultura o 10 da cepaC7 de Corynebacterium diphtheriae (197), a qual produz a proteina CRMi697, foi depositada na American Type Culture Collection, Rockville, Mar- yland e foi atribuído número de acesso ATCC 53281. Outros toxóides de , difteria são também adequados para uso como proteinas veículo.

Outras proteínas veículo adequadas incluem toxinas bacterianas 15 . inativadas, tais como toxóide do tétano, toxóide de pertussis, toxóide do có- ' lera (por exemplo, conforme descrito no Pedido de Patente Internacional WO?2004/083251), LT de E. coli, ST de E. coli e exotoxina A de Pseudomo- . nas aeruginosa. Proteínas da membrana externa bacteriana, tais como com- plexo de proteina c da membrana externa bacteriana (OMPC), porinas, pro- teínas de ligação à transferrina, pneumolisina, proteína A na superfície oe pneumocócica (PspA), proteina adesina pneumocócica (PsaA), enterotoxina de C. difficile (toxina A) e citotoxina (toxina B) ou proteina D de Haemophilus influenzae, podem também ser usadas, Outras proteínas, tais como ovalbu- mina, hemocianina do caramujo Megathura crenulata (Keyhole Limpet He- mocyanin- KLH), albumina de soro bovino (Bovine Serum Albumin - BSA) ou derivados purificados de proteina tuberculina (PPD) podem também ser usadas como proteína veículos. Após conjugação do polissacarídeo capsular à proteína veículo, os conjugados de polissacarideo-proteína são purificados (enriquecidos com relação à quantidade de conjugado de polissacarideo-proteina) através de - uma variedade de técnicas. Essas técnicas incluem, por exemplo, operações de concentraçâáo/diafiltração, precipitação/eluição, cromatografia em coluna e filtração profunda. Vide exemplos abaixo.

- Após os conjugados individuais serem purificados, eles podem ser combinados para formular uma composição imunogênica da presente invenção, a qual pode ser usada, por exemplo, em uma vacina. Formulação da composição imunogênica da presente invenção pode ser realizada usan- do métodos reconhecidos na técnica. Deve ser entendido que, na presente divulgação, termos tais como "compreende", "compreendida", "compreendendo", "contém", "conten- . do" e semelhantes têm o significado atribuído aos mesmos na lei de Paten- oe 10 tes Norte Americana; por exemplo, eles podem significar "incluem", "incluí- do", "incluindo" e semelhantes, Tais termos referem-se à inclusão de um in- grediente ou conjunto de ingredientes em particular sem excluir quaisquer outros ingredientes. Termos tais como "consistindo essencialmente de" e "consiste essencialmente de" têm o significado atribuído aos mesmos na leí 15 . de Patentes Norte Americana, por exemplo, eles permitem a inclusão de in- ' gredientes ou etapas adicionais que não se desviam as características no- vas ou básicas da invenção, isto é, eles excluem ingredientes ou etapas não . mencionadas adicionais que se desviam das características novas ou bási- cas da invenção e eles excluem ingredientes ou etapas da técnica anterior, tais como documentos da técnica que são citados aqui ou são incorporados o aqui por referência, especialmente uma vez que é um objetivo do presente documento definir modalidades que são passíveis de patente, por exemplo, novas, não óbvias, inventivas, com relação à técnica anterior, por exemplo, com relação aos documentos citados aqui ou incorporados aqui por referên- cia E ostermos "consiste de" e "consistindo de" têm o significado atribuído aos mesmos na lei de Patentes Norte Americana; isto é, esses termos são de sentido limitado. Consequentemente, esses termos referem-se à inclusão de um ingrediente ou conjunto de ingredientes em particular e à exclusão de todos os outros ingredientes. Uma "substituição de aminoácido conservativa" refere-se à subs- - tituição de um ou mais dos residuos de aminoácido de uma proteína por ou- tros resíduos de aminoácido tendo propriedades físicas e/ou químicas simila-

res.

Substitutos para um aminoácido dentro da sequência podem ser sele- S cionados de outros membros da classe à qual o aminoácido pertence.

Por exemplo, aminoácidos não polares (hidrofóbicos) incluem alanina, leucina, isoleucina, valina, prolina, fenilalanina, triptofano e metionina.

Aminoácidos contendo estruturas de anel aromático são fenilalanina, triptofano e tirosina.

Os aminoácidos polares neutros incluem glicina, serina, treonina, cisteína, : tirosina, asparagina e glutamina.

Os aminoácidos positivamente carregados (básicos) incluem arginina, lisina e histidina.

Os aminoácidos negativamente ' carregados (ácidos) incluem ácido aspártico e ácido glutâmico.

Espera-se e 10 que tais alterações não afetem o peso molecular aparente, conforme deter- minado por meio de eletroforese em gel de poliacrilamida ou o ponto isoelé- trico.

Substituições particularmente preferidas são: Lys por Arg e vice versa, de modo que uma carga positiva possa ser mantida; Glu por Asp e vice ver- sa, de modo que uma carga negativa possa ser mantida; Ser por Thr, de — modo que um --OH livre possa ser mantido; e Gln por Asn, de modo que um

7 NH; livre possa ser mantido. "Fragmento" refere-se à proteinas onde apenas domínios espe- cíficos de uma proteina maior são incluídos.

Por exemplo, proteínas CIfA e CIfB contêm tanto quanto 8 domínios cada se uma sequência sinalizadora é incluída.

Um polipeptídeo correspondendo aos domínios NIN2N3, N2N3, o N1IN2, N1, N2 ou N3 é, cada um, considerado como sendo fragmentos de CIfA ou CIfB. "Fragmento" refere-se também a uma proteína ou polipeptideo compreendendo uma sequência de aminoácido de pelo menos 4 resíduos de aminoácido (de preferência, pelo menos 10 resíduos de aminoácido, pelo menos 15 resíduos de aminoácido, pelo menos 20 resíduos de aminoácido, pelo menos 25 residuos de aminoácido, pelo menos 40 resíduos de aminoá- cido, pelo menos 50 resíduos de aminoácido, pelo menos 60 resíduos de aminoácido, pelo menos 70 resíduos de aminoácido, pelo menos 80 resi- duos de aminoácido, pelo menos 90 residuos de aminoácido, pelo menos 100 resíduos de aminoácido, pelo menos 125 residuos de aminoácido ou ' pelo menos 150 resíduos de aminoácido) da sequência de aminoácido de . uma proteina ou polipeptídeo original ou um ácido nucleico compreendendo uma sequência de nucleotídeo de pelo menos 10 pares de base (de prefe- i rência pelo menos 20 pares de base, pelo menos 30 pares de base, pelo menos 40 pares de base, pelo menos 50 pares de base, pelo menos 50 pa- res de base, pelo menos 100 pares de base, pelo menos 200 pares de base) dasequência de nucleotídeo do ácido nucleico parental.

"Atividade funcional" de um anticorpo ou "anticorpo funcional", . conforme usado aqui, refere-se a um anticorpo que, no mínimo, pode se ligar especificamente a um antígeno. Funções adicionais são conhecidas na téc- ' nica podem incluir componentes adicionais do sistema imune que realizam o 10 eliminação ou morte do patógeno, tal como através de opsonização, ADCC ou citotoxicidade complemento-mediada. Após ligação ao antigeno, quais- quer subsequentes funções do anticorpo podem ser mediadas pela região Fc do anticorpo. O ensaio opsonofagocítico de anticorpo (Antibody Opsono- phagocytic Assay - OPA) é um ensaio in vitro projetado para medir a morte 15 . complemento de Ig-assistida in vitro de bactérias com células efetuadoras " (células sanguíneas brancas), assim, imitando um processo biológico. Liga- ção de anticorpo pode também inibir diretamente a função biológica do antí- geno ao qual ele se liga, por exemplo, anticorpos que se ligam ao CIfA po- dem neutralizar sua função enzimática. Em algumas modalidades, um "anti- corpo funcional" refere-se a um anticorpo que é funcional, conforme medido e pela morte de bactérias em um modelo de eficácia com animais ou um en- saio de morte opsonofagocítica que demonstra que a morte de bactérias por anticorpos. O peso molecular de um polissacarideo capsular de S. aureus é uma consideração quando de uso em composições imunogênicas. Por e- xemplo, polissacarídeos capsulares de alto peso molecular capsulares po- dem ser capazes de induzir à determinadas respostas imunes de anticorpo em virtude de uma maior valência dos epítopos presentes sobre a superfície antigênica. O isolamento de "polissacarídeos capsulares de alto peso mole- cular é considerado para uso nas composições e métodos da presente in- ' venção. Por exemplo, em uma modalidade da invenção, o isolamento de ' polissacarídeos do tipo 5 de alto peso molecular oscilando, quanto ao tama-

nho, de cerca de 50 a cerca de 800 kDa quanto ao peso molecular é consi- . derado.

Em uma modalidade da invenção, o isolamento de polissacarídeos do tipo 5 de alto peso molecular oscilando, quanto ao tamanho, de cerca de 20 a cerca de 1000 kDa quanto ao peso molecular é considerado.

Em uma modalidade da invenção, o isolamento e purificação de polissacarideos cap- sulares de tipo 5 de alto peso molecular oscilando, quanto ao tamanho, de cerca de 50 a cerca de 300 kDa quanto ao peso molecular são considera- ' dos.

Em uma modalidade, o isolamento e purificação de polissacarídeos . capsulares de tipo 5 de alto peso molecular oscilando de 70 kDa a 300 kDa o 10 quanto ao peso molecular são considerados.

Em uma modalidade, o isola- mento e purificação de polissacarideos capsulares de tipo 5 de alto peso molecular oscilando de 90 kDa a 250 kDa quanto ao peso molecular são considerados.

Em uma modalidade, o isolamento e purificação de polissaca- rídeos capsulares de tipo 5 de alto peso molecular oscilando de 90 kDa a -. 150 kDa quanto ao peso molecular são considerados.

Em uma modalidade, o isolamento e purificação de polissacarídeos capsulares de tipo 5 de alto ] . —peso molecular oscilando de 90 kDa a 140 kDa quanto ao peso molecular . são considerados.

Em uma modalidade, o isolamento e purificação de polis- sacarídeos capsulares de tipo 5 de alto peso molecular oscilando de 80 kDa a120kKkDa quanto ao peso molecular são considerados.

Outras faixas de o polissacarídeos capsulares de sorotipo 5 de alto peso molecular que podem ser isolados e purificados através dos métodos da presente invenção inclu- em faixas de tamanho de cerca de 70 kDa à cerca de 100 kDa quanto ao peso molecular; 70 kDa a 110 kDa quanto ao peso molecular; 70 kDa a 120 kDa quanto ao peso molecular; 70 kDa a 130 kDa quanto ao peso molecular; 70 kDa a 140 kDa quanto ao peso molecular; 70 kDa a 150 kDa quanto ao peso molecular; 70 kDa a 160 kDa quanto ao peso molecular; 80 kDa a 110 kDa quanto ao peso molecular; 80 kDa a 120 kDa quanto ao peso molecular; 80 kDa a 130 kDa quanto ao peso molecular; 80 kDa a 140 kDa quanto ao peso molecular; 80 kDa a 150 kDa quanto ao peso molecular; 80 kDa a 160 - kDa quanto ao peso molecular; 90 kDa a 110 kDa quanto ao peso molecular; 90 kDa a 120 kDa quanto ao peso molecular; 90 kDa a 130 kDa quanto ao peso molecular; 90 kDa a 140 kDa quanto ao peso molecular; 90 kDa a 150 - kDa quanto ao peso molecular; 90 kDa a 160 kDa quanto ao peso molecular; 100 KkDa a 120 kDa quanto ào peso molecular; 100 kDa a 130 kDa quanto ao peso molecular; 100 kDa a 140 kDa quanto ao peso molecular; 100 kDa a 150 kDa quanto ao peso molecular; 100 kDa a 160 kDa quanto ao peso mo-

lecular; e faixas de peso molecular similares desejadas.

Conforme discutido acima, o peso molecular de polissacarideos i capsulares de S. aureus é uma consideração quando de uso em composi- . ções imunogênicas.

Por exemplo, polissacarídeos capsulares de alto peso oe 10 molecular podem ser capazes de induzir à determinadas respostas imunes de anticorpo em virtude de uma maior valência dos epitopos presentes sobre a superfície antigênica.

Em uma modalidade da invenção, o isolamento e purificação de polissacarídeos capsulares do tipo 8 de alto peso molecular oscilando de cerca de 20 kDa a cerca de 1000 kDa quanto ao peso molecu- 15 . lar são considerados.

Em uma modalidade da invenção, o isolamento e puri- ficação de polissacarideos capsulares do tipo 8 de alto peso molecular osci- ' lando de cerca de 50 kDa a cerca de 700 kDa quanto ao peso molecular são ; considerados.

Em uma modalidade da invenção, o isolamento e purificação de polissacarídeos capsulares do tipo 8 de alto peso molecular oscilando de 50 kDa a 300 kDa quanto ao peso molecular são considerados.

Em uma eo modalidade, o isolamento e purificação de polissacarídeos capsulares do tipo 8 de alto peso molecular oscilando de 70 kDa a 300 kDa quanto ao peso molecular são considerados.

Em uma modalidade, o isolamento e purífica- ção de polissacaríideos capsulares do tipo 8 de alto peso molecular oscilan- dode 90kDaa250 kDa quanto ao peso molecular são considerados.

Em uma modalidade, o isolamento e purificação de polissacarideos capsulares do tipo 8 de alto peso molecular oscilando de 90 kDa a 150 kDa quanto ao peso molecular são considerados.

Em uma modalidade, o isolamento e puri- ficação de polissacarídeos capsulares do tipo 8 de alto peso molecular osci- landode 90 kDa a 120 kDa quanto ao peso molecular são considerados.

Em : uma modalidade, o isolamento e purificação de polissacarídeos capsulares do tipo 8 de alto peso molecular oscilando de 80 kDa a 120 kDa quanto ao

| 27/134 peso molecular são considerados.

Outras faixas de polissacarídeos capsula- res de sorotipo 8 de alto peso molecular que podem ser isolados e purifica- dos através dos métodos da presente invenção incluem faixas de tamanho de cerca de 70 kDa a cerca de 100 kDa quanto ao peso molecular; 70 kDa a 110kDa quanto ao peso molecular; 70 kDa a 120 kDa quanto ao peso mole- cular; 70 kKDa a 130 kDa quanto ao peso molecular; 70 kDa a 140 kDa quan- : to ao peso molecular; 70 kDa a 150 kDa quanto ao peso molecular; 70 kDa a 160 kDa quanto ao peso molecular; 80 kDa a 110 kDa quanto ao peso mole- ' cular; 80 kDa a 120 kDa quanto ao peso molecular; 80 kDa a 130 kDa quan- o 10 toaopeso molecular; 80 kDa a 140 kDa quanto ao peso molecular; 80 kDa a 150 kDa quanto ao peso molecular; 80 kDa a 160 kDa quanto ao peso mole- cular; 90 kDa a 110 kDa quanto ao peso molecular; 90 kDa a 120 kDa quan- to ao peso molecular; 90 kDa a 130 kDa quanto ao peso molecular; 90 kDa a 140 kDa quanto ao peso molecular; 90 kDa a 150 kDa quanto ao peso mole- 15 . cular; 90 kDa a 160 kDa quanto ao peso molecular; 100 kDa a 120 kDa : quanto ao peso molecular; 100 kDa a 130 kDa quanto ao peso molecular; : 100 kDa a 140 kDa quanto ao peso molecular; 100 kDa a 150 kDa quanto ao peso molecular; 100 kDa a 160 kDa quanto ao peso molecular; e faixas de peso molecular similares desejadas.

Uma "resposta imune" a uma composição imunogênica é o de- o senvolvimento, em um indivíduo, de uma resposta imune humoral e/ou célu- la-mediada à moléculas presentes em uma composição de interesse (por exemplo, um antígeno, tal como uma proteína ou polissacarídeo). Para fins da presente invenção, uma "resposta imune humoral" é uma resposta imune anticorpo-mediada e envolve a geração de anticorpos com afinidade pelos antigenos presentes nas composições imunogênicas da invenção, enquanto que uma "resposta imune célula-mediada" é uma mediada por linfócitos T e/ou outras células sanguíneas brancas.

Uma "resposta imune célula- mediada" é estimulada pela apresentação de epítopos antigênicos em asso- ciaçãocommolêculas da Classe | ou Classe Il do principal complexo de his- : tocompatibilidade (Major Histocompatibility Complex - MHC). Isso ativa célu- . las T auxiliares CD4* antigeno-especiíficas ou linfócitos T citotóxicos CD8* às

' células ("CTLs"). CTLs têm especificidade por antígenos peptídicos ou lipidi- , cos que são apresentados em associação com proteinas codificadas pelo principal complexo de histocompatibilidade (Major Histocompatibility Com- plex - MHC) ou CD1 e expressas sobre a superfície de células. CTLs ajudam ainduzire promove a destruição intracelular de micróbios intracelulares ou a lise das células infectadas com tais micróbios. Outro aspecto de imunidade celular envolve uma resposta antigeno-específica por células T auxiliares. ' Células T auxiliares atuam para ajudar à estimular a função e foco da ativi- dade de células efetuadoras não específicas contra células que mostram o 10 antígenos peptídicos em associação com moléculas do MHC clássicas ou não clássicas sobre sua superfície. Uma "resposta imune célula-mediada" refere-se também à produção de citocinas, quimiocinas e outras de tais mo- , léculas produzidas por células T ativadas e/ou outras células sanguíneas brancas, incluindo aquelas derivadas de células T CD4* e CD8”. A capaci- — dade de um antígeno ou componente em particular de estimular uma respos- ta imunológica célula-mediada pode ser determinada através de uma série Ú de ensaios, tal como através de ensaios de linfoproliferação (ativação de ' linfócito), ensaios de célula citotóxica CTL, ensaio de linfócitos T específicos para o antigeno em um individuo sensibilizado ou medição da produção de citocina por células T em resposta à re-estimulação com antígeno. Tais en- o saios são bem conhecidos na técnica. Vide, por exemplo, Erickson et al., J. Immunol. (1993) 151: 4189-4199; Doe etal., Eur. J. Immunol. (1994) 24: 2369-2376.

O termo "imunogênico" refere-se à capacidade de um antigeno ou uma vacina de estimular uma resposta imune, quer humoral ou célula- mediada ou ambos.

Uma "quantidade imunogênica" ou uma "quantidade imunologi- camente eficaz” ou "dose", cada um dos quais é usado permutavelmente aqui refere-se, em geral, à quantidade de antígeno ou composição imunogê- nica suficiente para estimular uma resposta imune, quer uma resposta celu- . lar (célula T) ou humoral (célula B ou anticorpo) ou ambas, conforme medido por meio de ensaios padrões conhecidos por aqueles versados no campo.

À 29/134 A quantidade de um conjugado em particular em uma composi- - ção é geralmente calculada baseado no polissacarídeo total, conjugado e não conjugado para esse conjugado. Por exemplo, um conjugado de CP5 com 20% de polissacarídeo livre terá cerca de 80 meg de polissacarideo —CP5 conjugado e cerca de 20 mcg de polissacarideo CP5 não conjugado em uma dose de 100 mcg de polissacarídeo CP5. A contribuição da proteina para o conjugado usualmente não é considerada quando de cálculo da dose de um conjugado. A quantidade de conjugado pode variar, dependendo do , sorotipo do estafilococo. Em geral, cada cose compreenderá 0,01 a 100 mcg " 10 de polissacarideo, particularmente 0,1 a 10 mcg e, mais particularmente, 1 a meg. A "quantidade imunogênica”" dos diferentes componentes polissaca- rídicos em uma composição imunogênica pode divergir e cada um pode compreender 0,01 mcg, 0,1 meg, 0,25 mcg, 0,5 meg, 1 mcg, 2 mcg, 3 meg, 4 i meg, 5 meg, 6 mcg, 7 meg, 8 mcg, 9 meg, 10 meg, 15 mcg, 20 meg, 30 meg, 15 . 40 mcg,50 mcg, 60 meg, 70 mcg, 80 meg, 90 meg ou cerca de 100 meg de . qualquer antígeno polissacarídico em particular.

Em outra modalidade, a "quantidade imunogênica"” dos compo- . nentes de proteína em uma composição imunogênica pode oscilar de cerca de 10 mcg a cerca de 300 mcg de cada antígeno de proteina. Em uma mo- dalidade particular, a "quantidade imunogênica" dos componentes de proteí- +: na em uma composição imunogênica pode oscilar de cerca de 20 meg à cerca de 200 mcg de cada antígeno de proteina. A "quantidade imunogêni- ça" dos diferentes componentes de proteina em uma composição imunogê- nica pode divergir e cada um compreende 10 mcg, 20 meg, 30 meg, 40 mcg, 50mcg,60meg,70 meg, 80 mcg, 90 meg, 100 meg, 125 meg, 150 meg, 175 meg ou cerca de 200 meg de qualquer antígeno de proteína em particular.

A eficácia de um antígeno como um imunogênio pode ser medi- da avaliando-se os níveis de atividade de célula B ao medir os níveis de an- ticorpos em circulação específicos para o antígeno no soro usando imuno- ensaios, ensaios de imunoprecipitação, ensaios de anticorpo funcional, tal : como o ensaio opsônico in vitro e muitos outros ensaios conhecidos no campo. Outra medida de eficácia de um antígeno como um imunogênio de i célula T pode ser medida através de ensaios de proliferação, ensaios citolíti- . cos, tais como ensaios de liberação de cromo, para medir a capacidade de uma célula T de submeter à lise sua célula alvo específica.

Além disso, na presente invenção, uma "quantidade imunogênica" pode também ser defini- da medindo-se os níveis de anticorpo antigeno-específico no soro induzido após administração do antígeno ou medindo-se a capacidade dos anticorpos assim induzidos de intensificar a capacidade opsonofagocítica de células sanguíneas brancas em particular, conforme descrito aqui.

O nível de prote- . ção da resposta imune pode ser medido estimulando o hospedeiro imuniza- o 10 docomo antígeno que foi injetado.

Por exemplo, se o antígeno ao qual uma resposta imune é desejada é uma bactéria, o nível de proteção induzida pela "quantidade imunogênica" do antígeno pode ser medido detectando-se a sobrevivência percentual ou a mortalidade percentual após estímulo dos a- Ú nimais com as células bacterianas.

Em uma modalidade, a quantidade de 15 . proteção pode ser medida ao avaliar pelo menos um sintoma associado à . infecção bacteriana, por exemplo, uma febre associada à infecção.

A quanti- dade de cada um dos antígenos nas vacinas ou composições imunogênicas . com múltiplos antígenos ou múltiplos componentes variará com relação a cada um dos outros componentes e pode ser determinada por meio de mé- todos conhecidos por aqueles versados no campo.

Tais métodos incluiriam, eo por exemplo, procedimentos para medição de imunogenicidade e/ou eficácia in vivo.

O termo "composição imunogênica" refere-se à qualquer com- posição farmacêutica contendo um antígeno, por exemplo, um microorga- nismo ou um componente do mesmo, composição à qual pode ser usada para estimular uma resposta imune em um indivíduo.

As composições imu- nogênicas da presente invenção podem ser usadas para tratar um ser hu- mano suscetível à infecção por S. aureus por meio de administração das composições imunogênicas através de uma via transdérmica sistêmica ou —mucosal.

Essas administrações podem incluir injeção através das vias intra- . muscular (i.m.), intraperitoneal (i.p.), intradérmica (1,d.) ou subcutânea; apli- cação através de um emplastro ou outro dispositivo de distribuição trans-

dérmica; ou via administração mucosal aos tratos oral/alimentar, respiratório . ou genitourinário. Em uma modalidade, administração intranasal é usada para o tratamento ou prevenção de transmissão nasofaringeal de S. aureus, assim, atenuando a infecção em seu estágio mais inicial. Em uma modalida- de, a composição imunogênica pode ser usada na produção de uma vacina ou na estimulação de anticorpos policionais ou monoclonais que poderiam ser usados para proteger passivamente ou tratar animal, Quantidades ótimas de componentes para uma composição i- . munogênica em particular podem ser determinadas através de estudos pa- oe 10 drões envolvendo observação das respostas imunes em individuos. Após uma vacinação inicial, os indivíduos podem receber uma ou várias imuniza- ções de reforço adequadamente espaçadas.

Em uma modalidade da presente invenção, a composição imu- nogênica de S. aureus compreende um fragmento de fator A de aglutinação — (CIfA) recombinante de S. aureus (N1N2N3 ou combinações do mesmo), um ' polissacarideo capsular do tipo 5 isolado conjugado ao CRM;57 e um polis- sacarídeo capsular do tipo 8 isolado conjugado ao CRM::57. Em outra moda- ' lidade, a composição imunogênica de S. aureus é uma formulação estéril (líquida, liofilizada, vacina de DNA, preparado intradérmico) de fragmento de fator Ade aglutinação (CIfA) recombinante de S. aureus (N1IN2N3 ou combi- eo nações do mesmo), fragmento de fator B de aglutinação (CIfB) recombinante de S. aureus (N1N2N3 ou combinações do mesmo), um polissacarideo cap- sular do tipo 5 isolado conjugado ao CRM; e um polissacarídeo capsular do tipo 8 isolado conjugado ao CRM;57. Em uma modalidade da presente invenção, a composição imunogênica de S. aureus compreende um frag- mento de fator A de aglutinação (CIfA) recombinante de S. aureus (NIN2N3 ou combinações do mesmo), proteina MntC de ligação ao ferro de S. aureus, um polissacarídeo capsular do tipo 5 isolado conjugado ao CRM;9; e um po- lissacarideo capsular do tipo 8 isolado conjugado ao CRM 57. Em uma mo- dalidade, a composição imunogênica de S. aureus é uma formulação estéril 7 (líquida, liofilizada, vacina de DNA, preparado intradérmico) de fragmento de fator A de aglutinação (CIfA) recombinante de S. aureus (N1IN2N3 ou combi-

nações do mesmo), fragmento de fator B de aglutinação (CIfB) recombinante ' de S. aureus (N1IN2N3 ou combinações do mesmo), proteina MntC de liga- ção ao ferro de S. aureus, um polissacarideo capsular do tipo 5 isolado con- jugado ao CRM; e um polissacarídeo capsular do tipo 8 isolado conjugado aoCRMi7. Em uma modalidade da presente invenção, a composição imu- nogênica de S. aureus compreende a fragmento de fator B de aglutinação . (CIfB) recombinante de S. aureus (N1N2N3 ou combinações do mesmo), um polissacarídeo capsular do tipo 5 isolado conjugado ao CRM157 e um polis- . sacarideo capsular do tipo 8 isolado conjugado ao CRM197. Em uma modali- oe 10 dade da presente invenção, a composição imunogênica de S. aureus com- preende a fragmento de fator B de aglutinação (CIfB) recombinante de S. aureus (N1N2N3 ou combinações do mesmo), proteína MntC de ligação ao ferro de S. aureus, um polissacaríideo capsular do tipo 5 isolado conjugado ao CRM; e um polissacarídeo capsular do tipo 8 isolado conjugado ao CRMi67 Em uma modalidade da presente invenção, à composição imuno- . gênica de S. aureus compreende a proteína MntC de ligação ao ferro de S. . aureus, um polissacarideo capsular do tipo 5 isolado conjugado ao CRM:97 e

' um polissacarídeo capsular do tipo 8 isolado conjugado ao CRM 67. As composições imunogênicas da presente invenção podem a- inda compreender um ou mais "imunomoduladores" adicionais, os quais são o agentes que alteram ou modificam o sistema imune, de modo que super- regulação ou sub-regulação de imunidade humoral e/ou célula-mediada seja observada.

Em uma modalidade particular, super-regulação dos ramos hu- moral e/ou célula-mediada do sistema imune é preferida.

Exemplos de de- terminados imunomoduladores incluem, por exemplo, um adjuvante ou cito- cina ou ISCOMATRIX (CSL Limited, Parkville, Austrália), descritos na Paten- te U.S.

No. 5.254.339, dentre outros.

Exemplos não limitativos de adjuvantes que pode ser usados em uma vacina da presente invenção incluem o siste- ma adjuvante RIBI (Ribi Inc., Hamilton, Mont), alume, géis minerais, tal co- mo dgelde hidróxido de alumínio, emulsões óleo-em-água, emulsões água- ' em-óleo tais como, por exemplo, adjuvantes completos e incompletos de Freund, copolímero em bloco (CytRx, Atlanta Ga.), QS-21 (Cambridge Biote-

ch Inc, Cambridge Mass.), SAF-M (Chiron, Emeryville Calif.), adjuvante AMPHIGENG, saponina, Quil A ou outra fração de saponina, monofosforil lipídio A e o adjuvante de lipídio-amina Avridine. Exemplos não limitativos de emulsões óleo-em-água úteis em uma vacina da invenção incluem formula- ções modificadas de SEAM62 e SEAM 1/2. SEAM62 modificado é uma e- mulisão óleo-em-água contendo 5% (v/v) de esqualeno (Sigma), 1% (v/v) de . detergente SPANO 85 (ICI Surfactants), 0,7% (v/v) de detergente polisorbato 7 & 80 (ICI Surfactants), 2,5% (v/v) de etanol, 200 pg/ml de Quil A, 100 ug/ml ' de colesterol e 0,5% (v/v) de lecitina. SEAM 1/2 modificado é uma emulsão oe 10 óleo-em-água compreendendo 5% (v/v) de esqualeno, 1% (v/v) de detergen- te SPANGO 85, 0,7% (v/v) de detergente polisorbato 80, 2,5% (v/v) de etanol, 100 pg/ml de Quil A e 50 pyo/ml de colesterol. Outros "imunomoduladores" que podem ser incluídos em uma vacina incluem, por exemplo, uma ou mais interleucinas, interferons ou outras citocinas ou quimiocinas conhecidas. Em 15 . uma modalidade, o adjuvante pode ser um derivado de ciclodextrina ou um : polímero polianiônico, tais como aqueles descritos nas Patentes U.S. Nos.

6.165.995 e 6.610.310, respectivamente. Deve ser entendido que o imuno- modulador e/ou adjuvante a serem usados dependerão do indivíduo ao qual a vacina ou composição imunogênica será administrada, a via de injeção e o número de injeções a serem fornecidas, eo "Doença invasiva" por S. aureus é o isolamento de bactérias de um local normalmente estéril, onde há sinais/sintomas clínicos associados de doença. Locais no corpo normalmente estéreis incluem sangue, CSF, fluido pleural, fluído pericardial, fluido peritonial, fluido articular/sinovial, osso, locais internos no corpo (nódulo linfático, cérebro, coração, fígado, baço, fluido vítreo, rim, pâncreas, ovário) ou outros locais normalmente estéreis. Condições clínicas que caracterizam doenças invasivas incluem bacteremia, pneumonia, celulite, osteomielite, endocardite, choque séptico e mais. O termo "isolado" significa que o material é removido de seu ambiente original (por exemplo, o ambiente natural se ele ocorre naturalmen- te ou de seu organismo hospedeiro se ele é uma entidade recombinante ou , tomado de um ambiente para um ambiente diferente). Por exemplo, um po-

lissacaríideo capsular, proteina ou peptídeo "isolado" é substancialmente Ú isento de material celular ou outras proteinas contaminantes da fonte celular ou tecidual da qual a proteina é derivada ou substancialmente isento de pre- cursores químicos ou outros produtos químicos quando sintetizado quimica- mente ou de outro modo presente na mistura como parte de uma reação química.

Na presente invenção, as proteínas ou polissacarídeos podem ser « isolados da célula bacteriana ou de resíduos celulares, de modo que eles 7 são proporcionados em uma forma útil na fabricação de uma composição º imunogênica.

O termo "isolado" ou "isolamento" podem incluir purificação ou oe 10 purificar incluindo, por exemplo, os métodos de purificação de proteinas ou polissacarideos capsulares conforme descrito aqui.

A expressão "substanci- almente isento de material celular” inclui preparados de um polipepti- deo/proteina nos quais o polipeptídeo/proteina são separados de componen- | tes celulares das células das quais eles são isolados ou recombinantemente 15 . produzidos.

Assim, um polissacarideo capsular, proteina ou peptídeo que é , substancialmente isento de material celular inclui preparados do polissacari- deo capsular, proteína ou peptídeo tendo menos de cerca de 30%, 20%, 10%, 5%, 2,5% ou 1% (em peso seco) de proteína ou polissacarideo ou ou- tro material celular contaminante.

Quando o polipeptideo/proteina são re- combinantemente produzidos, eles também são, de preferência, substanci- e almente isentos de meio de cultura, isto é, o meio de cultura representa me- nos de cerca de 20%, 10% ou 5% do volume do preparado de proteína.

Quando o polipeptideo/proteína ou polissacarídeo são produzidos através de síntese quimica, eles são, de preferência, substancialmente isentos de pre- cursores químicos ou outros produtos químicos, isto é, eles são separados de precursores químicos ou outros produtos químicos os quais estão envol- vidos na síntese da proteína ou polissacarídeo.

Consequentemente, tais preparados de polipeptideo/proteina ou polissacarideo têm menos de cerca de 30%, 20%, 10%, 5% (em peso seco) de precursores químicos ou outros compostos que não fragmentos de polipeptídeo/proteina ou polissacarideo

] de interesse,

R Uma "substituição de aminoácido não conservativa" refere-se à

: 35/134 substituição de um ou mais dos resíduos de aminoácido de uma proteína por ' outros resíduos de aminoácido tendo propriedades físicas e/ou químicas dis- similares, usando as características definidas acima. O termo "veículo farmaceuticamente aceitável" significa um veí- culoaprovado por uma agência regulatória de um governo Federal, estadual ou outra agência regulatória ou listado na Farmacopéia Norte Americana ou . outra farmacopéia geralmente reconhecida para uso em animais, incluindo : seres humanos, bem como mamíferos não humanos. O termo "veículo" refe- ' re-se à um diluente, adjuvante, excipiente ou veículo com o qual a composi- oe 10 ção farmacêutica é administrada, Tais veículos farmacêuticos podem ser líquidos estéreis, tais como água e óleos, incluíndo aqueles originários de petróleo, animal, vegetal ou sintéticos. Água, soluções salinas e soluções aquosas de dextrose e glicerol podem ser empregados como veículos líqui- dos, particularmente para soluções injetáveis. Excipientes farmacêuticos a- dequados incluem amido, glicose, lactose, sacarose, gelatina, malte, arroz, : farinha, carvão, gel de sílica, estearato de sódio, monoestearato de glicerol, talco, cloreto de sódio, leite desnatado seco, glicerol, propileno, glicol, água, etanol e semelhantes. A composição, se desejado, pode também conter quantidades mínimas de agentes de umedecimento, espessantes, emulsifi- cação ou tamponamento de pH. Essas composições podem tomar a forma o de soluções, suspensões, emulsões, formulações com liberação sustentada e semelhantes. Exemplos de veículos farmacêuticos adequados são descri- tos em "Remington's Pharmaceutical Sciences" por E. W. Martin. A formula- ção deverá se adequar ao modo de administração.

Os termos "proteína", "polipeptídeo” e "peptídeo" referem-se a um polímero de resíduos de aminoácido e não estão limitados a um compri- mento mínimo do produto. Assim, peptídeos, oligopeptídeos, dímeros, mul- timeros e semelhantes são incluídos dentro da definição. Proteínas de com- primento total e fragmentos das mesmas são abrangidos pela definição. Os termos também incluem modificações, tais como deleções, adições e substi- ' tuições (geralmente de natureza conservativa, mas as quais podem ser não . conservativas), em uma sequência nativa, de preferência de modo que a

. proteina mantenha a capacidade de estimular uma resposta imunológica dentro de um animal ao qual a proteina é administrada. Também incluídas - são modificações, por exemplo, glicosilação, acetilação, lipidação, fosforila- ção e semelhantes.

Uma resposta imune "protetora" refere-se à capacidade de uma composição imunogênica de estimular uma resposta imune, quer humoral ou célula-mediada, a qual serve para proteger o indivíduo contra uma infecção. A proteção proporcionada não precisa ser absoluta, isto é, uma infecção não precisa ser totalmente impedida ou erradicada, se há uma melhora estatisti- o 10 camente significativa comparado com uma população de indivíduos de con- trole, por exemplo, animais infectados aos quais não foi administrada uma vacina ou composição imunogênica. Proteção pode estar limitada à alívio da gravidade ou rapidez de início de sintomas de uma infecção. Em geral, uma "resposta imune protetora" incluiria a indução de um aumento nos níveis de anticorpo específicos para um antígeno em particular em pelo menos 50% dos indivíduos, incluindo algum nivel de respostas mensuráveis de anticor- . . pos funcionais a cada antígeno. Em situações particulares, uma "resposta protetora imune" poderia incluir a indução de um aumento de duas vezes - nos níveis de anticorpo ou um aumento de quatro vezes nos níveis de anti- corpo específicos para um antígeno em particular em pelo menos 50% dos e indivíduos, incluíndo algum nível mensurável de respostas de anticorpo fun- cional a cada antígeno. Em determinadas modalidades, opsonização de an- ticorpos se correlaciona a uma resposta imune protetora. Assim, a resposta imune protetora pode ser avaliada medindo-se a diminuição percentual nas contagens bacterianas em um ensaio de opsonofagocitose, por exemplo, aqueles descritos abaixo. De preferência, há uma diminuição na contagem bacteriana de pelo menos 10%, 25%, 50%, 65%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou mais. O termo "recombinante", conforme usado aqui, refere-se sim- plesmente à qualquer proteina, polipeptídeo ou célula expressando um gene de interesse que é produzida por meio de métodos de engenharia genética. . O termo "recombinante", conforme usado com relação a uma proteína ou

EEE SN

. 37/134 . polipeptídeo, significa um polipeptídeo produzido por meio de expressão de um polinucleotideo recombinante. As proteínas usadas nas composições ' imunogênicas da invenção podem ser isoladas de uma fonte natural ou pro- duzidas por meio de métodos de engenharia genética tais como, por exem- plo, CIA recombinante, CIfB recombinante ou MntC recombinante. "Recom- binante", conforme usado aqui, descreve ainda uma molécula de ácido nu- cleico a qual, em virtude de sua origem ou manipulação, não está associada a todo ou uma parte do polinucleotíideo com o qual ele está associado na natureza. O termo "recombinante", conforme usado com relação a uma célu- o 10 la hospedeira, significa uma célula hospedeira na qual um polinucleotídeo recombinante foi introduzido.

CITA recombinante (rCIfA) e CIfB recombinante (rCIfB), conforme usado aqui, referem-se à formas de CITA ou CIfB para uso nas composições imunogênicas da invenção. Em uma modalidade, rCIfA é um fragmento de — CIfA compreendendo um ou mais dos domínio N, por exemplo, N1IN2N3, N2N3, N2 ou N3 e é referido aqui como "CIfA recombinante" ou "rCIfA”. Em . uma modalidade, rCIfB é um fragmento de CIfB compreendendo um ou mais dos domínios N de CIfB, por exemplo, N1IN2N3, N2N3, N2 ou N3 e é referido ' aqui como "CIfB recombinante" ou "rCIfB”.

O termo "indivíduo" refere-se a um mamífero, pássaro, peixe, o réptil ou qualquer outro animal. O termo "indivíduo" também inclui seres hu- manos. O termo "indivíduo" inclui animais domésticos. Exemplos não limita- tivos de animais domésticos incluem: cães, gatos, porcos, coelhos, ratos, camundongos, gerbos, hâmsters, porcos-da-índia, furões, pássaros, cobras, lagartos, peixe, tartarugas e rãs. O termo "indivíduo" também inclui animais de criação. Exemplos não limitativos de animais de criação incluem: alpaca, bisão, camelo, gado, alce, porcos, cavalos, lhamas, mulas, burros, ovelha, cabras, coelhos, veados, búfalos, galinhas, gansos e perus.

Conforme usado aqui, "tratamento" (incluindo variações do mesmo, por exemplo, "tratar ou “tratados") refere-se a qualquer um ou mais dos seguintes: (i) a prevenção de infecção ou re-infecção, conforme em uma ' vacina tradicional, (ii) uma redução na gravidade de ou na eliminação de sin-

; tomas e (il) a eliminação completa ou substancial do patógeno ou distúrbio em questão.

Consequentemente, tratamento pode ser realizado profilatica- ' mente (antes de infecção) ou terapeuticamente (após infecção). Na presente invenção, tratamentos profiláticos ou terapêuticos podem ser usados.

De acordo com uma modalidade particular da presente invenção, são propor- cionados composições e métodos os quais tratam, incluindo imunizam profi- lática e/ou terapeuticamente, um animal hospedeiro contra uma infecção microbiana (por exemplo, uma bactéria, tal como uma espécie Staphylococ- cus). Os métodos da presente invenção são úteis para conferir imunidade o 10 profilática e/ou terapêutica a um indivíduo.

Os métodos da presente inven- ção podem também ser praticados com indivíduos para aplicações de pes- quisa biomédica.

Os termos "vacina" ou "composição de vacina", os quais são u- sados permutavelmente, referem-se a composições farmacêuticas compre- — endendo pelo menos uma composição imunogênica que induz a uma res- posta imune em um animal. . Descrição Geral A presente invenção refere-se a composições imunogênicas ' compreendendo pelo menos três antígenos de um organismo estafilocócico, por exemplo, S. aureus.

Os antigenos podem ser isolados do organismo u- o sando procedimentos de isolamento bioquímico ou eles podem ser produzi- dos sinteticamente ou através de meios recombinantes.

Os antígenos po- dem ser polipeptídeos ou polissacarídeos ou uma combinação dos mesmos.

Essas composições imunogênicas podem ser usadas na fabricação de uma vacina para imunizar indivíduos contra infecções causadas por um organis- mo estafilocócico.

Os componentes adequados para uso nessas composíi- ções são descritos em maiores detalhes abaixo.

Composições imunogênicas Estafilocócicas S. aureus é o agente causador de uma ampla variedade de do- enças humanas, oscilando de infecções superficial na pele à condições que ameaçam a vida, tais como pneumonia, sepsia e endocardite.

Vide Lowy N. ' Eng.

J.

Med. 339: 580-532(1998). Em casos de doença invasiva, S, aureus

. 39/134

. pode ser isolada de locais no corpo normalmente estéreis, incluindo sangue, cérebro, fluido cérebro espinhal (Cerebral Spinal Fluid - CSF), fluido pleural, : fluido pericardial, fluido peritonial, fluido articular/sinovial, osso, locais inter- nos no corpo (nódulo linfático, cérebro, coração, figado, baço, fluido vítreo, rim, pâncreas, ovário) ou outros locais normalmente estéreis.

Isso pode levar à condições clínicas que ameaçam a vida, tais como bacteremia, pneumoni- a, celulite, osteomielite, endocardite e choque séptico.

Adultos, idosos e pa-

cientes pediátricos estão mais em risco de infecções por S. aureus.

Modalidades da presente invenção descrevem antígenos sele- oe 10 cionadosem composições imunogênicas, incluindo um polipeptídeo de fator A de aglutinação (CIfA) isolado de S. aureus, um polissacarideo capsular do tipo 5 de S. aureus isolado conjugado a uma proteína veículo, um polissaca- rideo capsular do tipo 8 de S. aureus isolado conjugado a uma proteína veí- culo, um fator B de aglutinação (CIfB) isolado de S. aureus e proteina MntC 15 . recombinante de S. aureus.

Em seguida, os antígenos foram caracterizados em composições imunogênicas como uma série de combinações, para de- . monstrar que combinações específicas conferem respostas imunes que po- dem ser superiores àquelas produzidas usando componentes individuais ' para composições imunogênicas.

Consequentemente, uma combinação proporciona uma composição imunogênica compreendendo: um polipeptídeo oe de fator A de aglutinação (CIfA) isolado de S. aureus, um polissacarídeo capsular do tipo 5 de S. aureus isolado conjugado a uma proteína veículo e um polissacarídeo capsular do tipo 8 de S. aureus isolado conjugado a uma proteína veículo.

Uma segunda combinação proporciona uma composição imunogênica compreendendo: um polipeptídeo de fator A de aglutinação (CIfA) isolado de S. aureus, um fator B de aglutinação (CIfB) isolado de S. aureus, polissacarídeo capsular do tipo 5 isolado de S. aureus conjugado a uma proteína veículo e um polissacarídeo capsular do tipo 8 de S, aureus isolado conjugado a uma proteína veículo.

Uma terceira combinação propor- cionauma composição imunogênica compreendendo: um polipeptídeo de fator A de aglutinação (CIfA) isolado de S. aureus, um polipeptídeo de fator B ' de aglutinação (CIfB) isolado de S. aureus, uma proteina MntC isolada de S.

' 40/134 . aureus, um polissacarídeo capsular do tipo 5 de S. aureus isolado conjugado - a uma proteína veículo e um polissacarideo capsular do tipo 8 de S. aureus ' isolado conjugado à uma proteína veículo.

Uma quarta combinação propor- ciona uma composição imunogênica compreendendo: um polipeptideo de fator Ade aglutinação (CITA) isolado de S. aureus, uma proteína MntC isola- da de S. aureus, um polissacaríideo capsular do tipo 5 de S, aureus isolado conjugado a uma proteína veículo e um polissacarídeo capsular do tipo 8 de S. aureus isolado conjugado a uma proteína veiculo.

Uma quinta combina- ção proporciona uma composição imunogênica compreendendo: um polipep- [ 10 tídeode fator B de aglutinação (CIfB) isolado de S. aureus, um polissacarí- deo capsular do tipo 5 de S. aureus isolado conjugado a uma proteina veícu- lo e um polissacaríideo capsular do tipo 8 de S. aureus isolado conjugado a uma proteína veículo.

Uma sexta combinação proporciona uma composição imunogênica compreendendo: um polipeptídeo de fator B de aglutinação - (CIfB) isolado de S. aureus, uma proteína MntC isolada de S. aureus, um polissacarídeo capsular do tipo 5 de S. aureus isolado conjugado a uma pro- - teina veiculo e um polissacaríideo capsular do tipo 8 de S. aureus isolado conjugado a uma proteína veículo.

Uma sétima combinação proporciona ' uma composição imunogênica compreendendo: uma proteína MntC isolada desS.aureus, um polissacaríideo capsular do tipo 5 de S. aureus isolado con- e jugado a uma proteina veículo e um polissacarideo capsular do tipo 8 de S. aureus isolado conjugado a uma proteína veículo.

Uma oitava combinação proporciona uma composição imunogênica compreendendo: um polipeptídeo de fator A de aglutinação (CIfA) isolado de S. aureus, um polipeptíideo de fator Bde aglutinação (CIfB) isolado de S. aureus e uma proteina MntC iso- lada de S. aureus.

Em algumas modalidades, as combinações acima ainda compreendem pelo menos um dos seguintes antígenos: EkeS, DsgA, KesK, KrkN, KrkN2, RkaS, RrkN, KnkA, SdrC, SdrD, SdrE, Opp3a, DIto, HtsA, LtaS, IsdA, IsdB, IsdC, SdrF, SdrG, SdrH, SrtA, SpA, Sbi alfa-hemolisina (hla), beta-hemolisina, proteina A de ligação à fibronectina (fnbA), proteina B de ligação à fibronectina (fnbB), coagulase, Fig, map, leucocidina de Panton- ' Valentine (pvl), alfa-toxina e suas variantes, gama-toxina (hlg) e variantes,

j . 41/134 1 - ica, transportador ABC imunodominante, transportador de Mg2+, transporta- dor ABC de Ni, RAP, autolisina, receptores de laminina, ISaA/PisA, IsaB/PisB ' . SPOIIE, SsaA, EbpS, Sas A, SasF, SasH, EFB (FIB), SBI, Npase, EBP, proteina || de sialo ligação óssea, precursor de aureolisina (AURY/Sepp1, Cnaefragmentos do mesmo, tais como M55, TSST-1, mecA, exopolissaca- ríideo de poli-N-acetilglucosamina (PNAG/dPNAG), GehD, EbhA, EbhB, SSP-1, SSP-2, HBP, proteína de ligação à vitronectina, HarA, EsxA, EsxB, Enterotoxina A, Enterotoxina B, Enterotoxina C1 e nova autolisina. Estudos epidemiológicos de surtos de S. aureus indicam que e 10 evoluçãode5S. aureus é de natureza clonal, onde um único clone que adqui- riu um genótipo de sucesso se disseminou rapidamente e causou muitas das infecções. Portanto, evolução é considerada como sendo clonal. Os geno- mas bacterianos é compreendido de um maior genoma central de espécies mais estáveis e um conjunto mais diversificado de genes acessórios. Vide Feiletal., Nature Reviews: Microbiology 2: 483495 (2004). Os genes cen- | trais estão abundantemente presentes em todos os clones das espécies e os . genes acessórios não estão necessariamente presentes em qualquer dado clone. Considerando S. aureus, um estudo usando um microarranjo de DNA representando mais de 90% de um genoma de S. aureus descobriu que 78% dos genesno genoma eram comuns a todas às S. aureus, assim, represen- oe tando o "núcleo da espécie" e os 22% restantes são os "genes acessórios”. Os genes acessórios compreendem material genético dispensável, a maioria do qual codifica fatores de virulência, proteínas que mediam a resistência a antibiótico e genes que codificam proteínas específicas para interação com um ambiente hospedeiro em particular. Vide Fitzgerald et al., PNAS 98: 8821-8826 (2001); Feil etal., Nature Reviews: Microbiology 2: 483-495 (2004). Em geral, os genes centrais evoluem mais lentamente e os genes acessórios são polimórficos. Vide Kuhn et al., J. Bact. 188: 169-178 (2006). Portanto, genes centrais apropriadamente selecionados conferem melhores antígenos alvo para uso em composições imunogênicas para prevenir infec- ção.

] Antígenos expressos na superfície de isolados que causam do-

' . 42/134 ' ença ou tipos clonais de S. aureus oferecem uma fonte de antígenos capa- zes de induzir à imunidade e anticorpos funcionais.

A nível macromolecular ' (quer sequência de aminoácido ou polissacarídica), formas conservadas do antígeno expresso pelos diferentes isolados que causam doença podem ser escolhidas para permitir ampla reatividade cruzada de anticorpos àquelas cepas que podem possuir variações antigênicas de um alvo de vacina.

Uma consideração importante para inclusão de um antígeno na composição imunogênica com múltiplos antigenos, conforme descrito aqui, é se o antigeno demonstrou eficácia quando administrado como uma compo- oe 10 sição imunogênica ao conferir proteção em um ou mais modelos animais de infecção bacteriana.

Existem numerosos modelos animais para várias doen- ças por S. aureus.

Cada um desses modelos tem pontos fortes e fracos.

Eliminação humana de infecções bacterianas pode ser proces- sada via morte opsônica que é mediada após captação de fagócito.

Existem — muitos exemplos convincentes disso a partir de estudos usando polissacari- deos antigênicos Gram-posiítivos, tal como polissacarídeo capsular de Strep- ' fococecus pneumoniae e polissacarideo capsular de S. aureus.

Vide Lee et al., Crit.

Rev.

Micro. 29: 333-349 (2003). Há menos evidência quanto à | atividade opsônica induzida por antígenos de proteina Gram-posiítivos.

Cap- tação por fagócitos foi observada, mas morte direta foi mais difícil de de- [ monstrar.

Foi mostrado que anticorpos monocionais à proteínas conferem proteção contra estímulo por S. aureus em modetos animais de infecção; e outros mecanismos que não morte opsonofagocítica podem responder pela proteção observada.

A indução de anticorpos tendo uma atividade funcional mensu- rável, tal como atividade opsonofagocítica (Opsonophagocytic Atividade - OPA) é um indicador se um antigeno em particular é útil para inclusão nas composições imunogênicas da presente invenção.

Outros indicadores inclu- em, mas não estão limitados a, expressão antigênica sobre a superfície celu- lardurante expressão in vivo, conforme medido usando anticorpos antígeno- específicos ou a capacidade de anticorpos de inibir/neutralizar a função do ] antígeno.

, 43/134 O tipo de qualquer cepa particular que causa doença ou hospita- % lar é útil para determinação da origem, relação clonal e monitoramento de epidemiologia de surtos. Numerosos métodos estão disponíveis para tipífica- çãodecepasdeS. aureus. A definição prática clássica para espécies bacte- rianas é um grupo de cepas que são caracterizadas por mais de 70% de hi- bridização genômica (hibridização genômica de DNA-DNA de DDH) e mais de 97% de identidade de sequência gênica ao RNA ribossômico 168. Vide Vandamme et al., Microbiol. Rev. 60: 407-438 (1996). Tipificação com bacte- oe 10 riófago (Bacteriophage Typing - BI) é um método de tipificação de cepas de S. aureus baseado em sua suscetibilidade à lise por determinados tipos de fago. Vide Blair et al., Bull. W.H.O. 24: 771-784 (1961). Esse método mais antigo sofre de uma falta de reprodutibilidade entre laboratórios e falha em ] tipificar 15-20% dos isolados.

- Composições imunogênicas com um único antígeno vs.

múltiplos antígenos . Surge a questão se a composição imunogênica ótima para pro- teger contra uma infecção das cepas de S. aureus predominantes deverá ser , compreendida de um único componente ou múltiplos componentes. Nume- rosos estudos mostraram que composições imunogênicas baseadas em o uma única proteína ou componente de carboidrato podem oferecer alguma proteção contra estímulo com a cepa de S. aureus expressando esse com- ponente em determinados modelos animais. De modo importante, foi tam- bêm demonstrado que proteção por um único antígeno pode ser dependente dacepaselecionada.

Proteinas na superfície, tais como adesinas, têm sido investiga- das como vacinas com um único componente. Por exemplo, camundongos imunizados com CIfA de S. aureus revelaram artrite menos grave do que camundongos com uma proteína de controle. Vide Josefsson et al., J. Infect.

Dis, 184: 1572-1580 (2001). Fragmentos da adesina de ligação a colágeno (cna) conferiram proteção em um modelo de sepsia com camundongos. Vide ' Nilsson, et al., J. Clin, Invest, 101: 2640-2649 (1998). Imunização de ca-

' 44/134 ' mundongos com o domínio A de CIfB pôde reduzir a colonização nasal em um modelo com camundongos. Vide Schaffer et al., Infect. Immun. 74: 2145- ' 2153 (2006).

Uma das catorze proteínas de capturam ferro de S. aureus, co- nhecida como |sdB, está sendo investigada em uma formulação imunogêni- ca monovalente para proteção contra infecção por S. aureus. Essa proteina mostrou um bom efeito protetor em camundongos e boa imunogenicidade em primatas não humanos. Vide Kuklin et al., Infect. Immun. 74: 2215-2223 (2006). oe 10 Em virtude do vasto potencial de S. aureus de evoluir ou substi- tuir diferentes proteínas para realizar as mesmas ou funções similares, a formulação imunogênica ótima para proteger a maioria das pessoas contra a maioria das doenças por S. aureus é uma formulação com múltiplos antíge- nos compreendendo 2 ou mais (por exemplo, 3, 4, 5, etc.) antígenos apro- - priadamente selecionados e apresentados em uma formulação imunogênica. Em determinadas modalidades, uma composição imunogênica da invenção Ms . compreende três ou mais antígenos selecionados de um polipeptídeo de : fator A de aglutinação (CIfA) isolado de S. aureus, um polipeptídeo de fator B de aglutinação (CIfB) isolado de S. aureus, um polissacarideo capsular do tipo5(CP5)isoladode S. aureus conjugado a uma proteína veículo, um po- oe lissacarídeo capsular do tipo 8 (CP8) isolado de S. aureus conjugado a uma proteína veículo e uma proteina MntC de S. aureus isolada. Em determina- das modalidades, uma composição imunogênica da invenção compreende quatro ou mais antígenos selecionados de um polipeptídeo de fator A de a- glutinação (CIA) isolado de S. aureus, um polipeptídeo de fator B de agluti- nação (CIfB) isolado de S. aureus, um polissacarideo capsular do tipo 5 (CP5) isolado de S. aureus conjugado a uma proteina veículo, um polissaca- rídeo capsular do tipo 8 (CP8) isolado de S. aureus conjugado a uma protei- na veiculo e uma proteina MntC de S. aureus isolada. Em determinadas mo- dalidades, uma composição imunogênica da invenção compreende um poli- peptídeo de fator A de aglutinação (CIfA) isolado de S. aureus, um polipepti- ] deo de fator B de aglutinação (CIfB) isolado de S. aureus, um polissacarideo

' 45/134 ' capsular do tipo 5 (CP5) isolado de S. aureus conjugado a uma proteína vei- culo, um polissacarídeo capsular do tipo 8 (CP8) isolado de S. aureus conju- gado a uma proteina veículo e uma proteina MntC de S, aureus isolada co- mo antígenos, Adjuvantes

Composições imunogênicas conforme descrito aqui também compreendem, em determinadas modalidades, um ou mais adjuvantes.

Um adjuvante é uma substância que intensifica a resposta imune quando admi- nistrado junto com um imunogênio ou antígeno.

Foi mostrado que uma série o 10 de citocinas ou linfocinas têm atividade de modulação imune e, assim, são úteis como adjuvantes incluindo, mas não limitado a, interleucinas 1-0, 1-B, 2,4, 5,6, 7,8, 10,12 (vide, por exemplo, Patente U.S.

No. 5.723.127), 13, 14, 15, 16, 17 e 18 (e suas formas mutantes); os interferons-a, B e y; fator de estimulação de colônia de granulócito-macrófago (GM-CSF) (vide, por e- - xemplo, Patente U.S.

No. 5.078.996 e Número de Acesso a ATCC 39900); fator de estimulação de colônia de macrófago (M-CSF); fator de estimulação . de colôniade granulócito (G-CSF); e os fatores a e B de necrose de tumor. . Ainda outros adjuvantes que são úteis com a composição imunogênica con- forme descrito aqui incluem quimiocinas incluindo, sem limitação, MCP-1, MIP-10, MIP-IB e RANTES; moléculas de adesão, tal como uma selectina, ) por exemplo, L-selectina, P-selectina e E-selectina; moléculas semelhantes à mucina, por exemplo, CD34, GIyCAM-1 e MadCAM-1; um membro da fa- mília integrina, tal como LFA-1, VLA-1, Mac-1 e p150,95; um membro da superfamília de imunoglobulina, tal como PECAM, ICAMs, por exemplo, |- CAMA, ICAM-2 e ICAM-3, CD2 e LFA-3; moléculas co-estimulatórias, tais como B7-1, B7-2,CD40 e CDA40L; fatores de crescimento, incluindo fator de crescimento vascular, fator de crescimento de nervo, fator de crescimento de fibroblasto, fator de crescimento epidérmico, PDGF, BL-1 e fator de cresci- mento endotelial vascular; moléculas receptoras, incluindo Fas, receptor de TNF, FIt, Apo-1, p55, WSL-1, DR3, TRAMP, Apo-3, AIR, LARD, NGRF, DRA,

DR5, KILLER, TRAIL-R2, TRICK2 e DR6; e Caspase (ICE). Adjuvantes adequados usados para intensificar uma resposta

S 46/134 ' imune ainda incluem, sem limitação, MPL'"" (monofosforil lipídio A 3-O- deacilado, Corixa, Hamilton, MT), o qual é descrito na Patente U.S. No.

4.912.094. Também adequados para uso como adjuvantes são análogos de lipídio A sintéticos ou compostos de aminoalquil glucosamina fosfato (AGP) ouderivados ou análogos dos mesmos, os quais estão disponíveis da Corixa (Hamilton, MT) e os quais são descritos na Patente dos Estados Unidos No.

6.113.918. Um de tais AGP é 2-[(R)-3-Tetradecanoilóxitetradecanoilamino] etil —2-Deoxi-4-O0-fosfono-3-O0-[(R)-3-tetradecanoilóxitetradecanoi!l)-2-[(R)-3- tetradecanoilóxitetradecanoil-amino]-b-D-glucopiranosídeo, o qual é também o 10 conhecido como 529 (formalmente conhecido como RC529). Esse adjuvante 529 é formulado como uma forma aquosa (Aqueous Form - AF) ou como uma emulsão estável (Stable Emulsion - SE). Ainda outros adjuvantes incluem peptideos de muramila, tais como N-acetil-muramil-L-treonil-D-isoglutamina — (thr-MDP), — N-acetil- — normuramil-L-alanina-2-(1"-2' dipalmitoil-sn-glicero-3-hidróxifosforilóxi)- l etilamina (MTP-PE); emulsões óleo em água, tais como MF59 (Patente U.S. ' No. 6.299.884) (contendo 5% de Esqualeno, 0,5% de polisorbato 80 e 0,5% . de Span 85 (opcionalmente contendo várias quantidades de MTP-PE) formu- ladas em partículas submicrônicas usando um microfluidizador, tal como o microfluidizador Modelo 110Y (Microfluídics, Newton, MA)) e SAF (contendo o 10% de Esqualeno, 0,4% de polisorbato 80, 5% de polímero L121 Pluronic- bloqueado e thr-MDP, quer microfluidizada em uma emulsão submicrônica ou submetida a turbilhonamento para gerar uma emulsão com maior tama- nho de partícula); adjuvante incompleto de Freund (IFA); saís de alumínio (alume), tais como hidróxido de aluminio, fosfato de alumínio, sulfato de a- lumínio; Amphigen; Avridine; L121/esqualeno; D-lactídeo- polilactídeo/glicosideo; polióis Pluronic; Bordetella morta; saponinas, taís como Stimulon'” QS-21 Antigenics, Framingham, MA.), descritas na Patente U,S. No. 5.057.540, ISCOMATRIX (CSL Limited, Parkville, Austrália), descri- tana Patente US. No. 5.254.339 e complexos de imunoestimulação (ISCO- MATRIX); Mycobacterium tuberculosis; lipopolissacarideos bacterianos; poli- nucleotídeos sintéticos, tais como oligonucleotídeos contendo um motivo

] 47/134 ] CpG (por exemplo, Patente U.S. No. 6.207.646); 10-31 (Intercell AG, Viena, Áustria), descrito nas Patentes Européias Nos. 1.296.713 e 1.326.634; uma toxina de pertussis (PT) ou mutante da mesma, uma toxina do cólera ou mu- tante da mesma (por exemplo, Patentes U.S. Nos. 7.285.281, 7.332.174,

7.361.355 e 7.384.640); ou uma toxina sensível ao calor (LT) de E. coli ou mutante da mesma, particularmente LT-K63, LT-R72 (por exemplo, Patentes U.S. Nos. 6.149.919, 7.115.730 e 7.291.588). Antígenos Candidatos: CIfA: Organização de Domínio o 10 Fator A de aglutinação (CIfA) é uma proteína na superfície de S. aureus associada à ligação à proteinas da matriz do hospedeiro via um sítio de ligação ao fibrinogênio. CIfA é um membro de uma família de proteí- nas contendo o motivo carboxila terminal LPXTG (SEQ ID NO: 125) que permite que a proteína se torne covalentemente ligada à superfície celular. - CIfA também pertence à outra família de proteinas (Microbial Surface Com- | ponents Recognizing Adhesive Matrix Molecule ou MSCRAMM;s) que estão ' associadas à ligação de proteínas do hospedeiro, tais como fibrinogênio (li- : gado pela CIfA), as proteínas de ligação à fibronectina (FnbA e FnbB), a pro- teina de ligação a colágeno (Cna) e outras. Essas proteínas compartilham todas a sequência sinalizadora amino terminal que media o transporte à su- eo perfície celular. As MSCRAMMs também incluem um domínio A que é a re- gião funcional contendo sítio ativo para ligação a ligante (por exemplo, fibri- nogênio, fibronectina, elastina, queratina). O domínio À é seguido por uma região composta de repetições de serina-aspartato (repetição SD), o qual acredita-se que abranja a camada de peptidoglicana. A repetição SD é se- guida por uma região abrangendo a membrana que incluí o motivo LPXTG (SEQ ID NO: 125) para ligação covalente da proteína à peptidoglicana. À CIfA é descrita na Pat. U.S. No. 6.008.341, A região de ligação a ligante de CIA compreendendo NIN2N3 do dominio A (Figura 1) abrange os aminoácidos 40-559. Os domínios N de CIfA foram atribuídos como segue: N1 abrange os resíduos 45-220; N2 a- brange os resíduos 229-369; e N3 abrange os residuos 370-559. Vide Dei-

Ú 48/134 : vanayagam etal. EMBO J. 21: 6660-6672 (2002). Para facilidade de refe- rência, os domínios NIN2N3 podem ser referidos como N123, assim como N2N3 pode ser referido como N23. Em preparados de N1N2N3 recombinan- te, descobriu-se que o domínio N1 era sensível à protease e é facilmente clivado ou hidrolisado para deixar o N2N3 como um fragmento recombinante de ligação a ligante estável. Vide Deivanayagam et al. EMBO J. 21: 6660- 6672 (2002). A estrutura de cristal do fragmento N2N3 de ligação ao fibrino- gênio do domínio A de CIfA revelou que N2 e N3 são dominados por beta fitas anti-paralelas. Além de beta fitas anti-paralelas, o domínio N2 contém o 10 uma alfa hélice com uma única volta e duas hélices 3,9 e o domínio N3 con- tém três hélices 3,9. Vide Deivanayagam etal. EMBO J. 21: 6660-6672 (2002). Alinhamento de sequência de N2 e N3 revela apenas 13% de identi- — dade de sequência e 36% de similaridade de sequência sobre seus compri- mentos. Vide Deivanayagam et al. EMBO J. 21: 6660-6672 (2002), A topolo- - gia dos domínios N2 e N3 é similar ao enovelamento clássico de IgG e foi proposto como sendo novas variantes do enovelamento de IgG. Vide Deiva- ' . nayagametal, EMBO J. 21: 6660-6672 (2002).

. Sequência de CIfA O gene para proteína de fator A de aglutinação, designada CITA, foiclonado, sequenciado e analisado em detalhes a nível molecular (McDe- o vitt et al., Mol. Microbiol. 11: 237-248 (1994); McDevitt et al., Mol. Microbiol. 16: 895-907 (1995)). Os identificadores de sequência para as sequências de aminoácido de CIfA de 111 isolados de S. aureus que causam doença são mostrados na Tabela 10. A sequência de aminoácido da CITA do tipo silves- trede comprimento total (incluindo a sequência sinalizadora) da cepa PFE- SA0237 de S. aureus é mostrada em SEQ ID NO: 130. Essa sequência mos- tra uma tirosina na posição 338, a qual é trocada por uma alanina na forma com mutação de CIfA. O gene de comprimento total que codifica a CIfA do tipo silvestre da cepa PFESA0O237 de S. aureus, compreendendo a região N123,a região repetida e a região de ancoragem é mostrada em SEQ ID NO: 131. A sequência de aminoácido das formas com mutação Y338A de CIfA é mostrada em SEQ ID NO: 123. Contudo, deverá ser notado que a

' alteração de uma tirosina para uma alanina, a qual ocorre em CIfA do tipo silvestre na posição 338 de SEQ ID NO: 130 e a qual é designada como i Y338A, é mostrada na forma com mutação de CIfA, em SEQ ID NO: 123 na posição 310. Além disso, a forma com mutação de CIfA mostrada na se- quênciade aminoácido de SEQ ID NO: 123 é a forma madura de CIfA sem a sequência sinalizadora, assim, respondendo pela diferença na posição des- sa mutação entre SEQ ID NO: 130 e SEQ ID NO: 123.

CIfB: Organização de Domínio CIfB é uma proteína de S. aureus tendo atividade de ligação ao o 10 fibrinogênioelevaa S. aureus a formar grumos na presença de plasma. CIfB é uma proteina MSCRAMM e mostra a organização de domínio MSCRAMM característica, incluindo um domínio A que é a região funcional contendo o ' sítio ativo para ligação a ligante (por exemplo, fibrinogênio, fibronectina, e- lastina, queratina). O domínio A é seguido por uma região composta de re- - petições de serina-aspartato (repetição SD), a qual acredita-se que abranja a camada de peptidoglicana. A repetição SD é seguida por uma região que ' . abrangea membrana que inclui o motivo LPXTG (SEQ ID NO: 125) para . ligação covalente da proteína à peptidoglicana. CIfB é descrita no documen- to WO 99/271089 e na patente US 6.680.195.

A organização interna do domínio A N-terminal de CIÍfB é muito o similar à organização encontrada em CIfA. O domínio A é composto de três subdomínios N1, N2 e N3. A região de ligação a ligante de CIfB compreen- dendo NIN2N3 do domínio A (Figura 1) abrange os aminoácidos 44-585. Para facilidade de referência, os domínios NIN2N3 podem ser referidos co- —moN123, assim como N2N3 pode ser referido como N23. Os domínios N de CIfB foram atribuídos como segue: N1 abrange os resíduos 44-197; N2 a- brange os residuos 198-375; e N3 abrange os resíduos 375-585, Em CIA, descobriu-se que a estrutura de cristal do domínio A tem uma versão única do enovelamento de imunoglobulina e, por analogia, o mesmo pode ser es- — peculadocomo sendo o caso para CIIB, Vide Deivanayagam et al., EMBO J. : 21: 6660-6672 (2002). Mesmo embora a organização dos domínios A de CIfB e CIfA sejam similares, a identidade de sequência é de apenas 26%.

Í 50/134 ' Vide Ni Eidhin et al., Mol.

Microbiol. 30: 245-257 (2002). . Sequência de CIfB O gene que codifica CIfB é classificado como um gene de ade- são central.

Sequências de CIfB de 92 cepas de S. aureus associadas a múl- tiplos estados doentios são resumidas na Tabela 11. Sequências adicionais foram obtidas do GenBank.

Outras MSCRAMMS Outras MSCRAMMS podem ser consideradas para uso em uma composição imunogênica da presente invenção.

Por exemplo, as proteínas & 10 com repetição de serina-aspartato (Sdr), SdrC, SdrD e SdrE são relaciona- das, quanto à sequência primária e organização estrutural, às proteínas CIfA e CIfB e estão localizadas sobre a superfície celular.

As proteínas SdrC, S- drD e SdrE são proteínas associadas à parede celular, tendo uma sequência sinalizadora no N-término e um motivo LPXTG (SEQ ID NO:125), domínio | hidrofóbico e resíduos positivamente carregados no C-término.

Cada uma tem também uma repetição SD contendo uma região R de comprimento su- ] ficiente para permitir, junto com os motivos B, expressão eficiente da região : A com domínio de ligação a ligante sobre a superfície celular.

Com a região A das proteinas SdrC, SdrD e SdrE localizadas sobre a superfície celular, as proteinas podem interagir com proteinas no plasma, na matriz extracelular * ou com moléculas sobre a superfície de células hospedeiras.

As proteínas Sdr compartilham alguma similaridade de sequência de aminoácido limitada com CIfA e CIfB.

Assim como CIfA e CIfB, SdrC, SdrD e SdrE também exi- bem ligação a ligante cátion-dependente de proteínas da matriz extracelular.

Os genes sdr são intimamente relacionados e aleatoriamente configurados.

As proteínas Sdr (de SdrC, SdrD, SdrE, CIfA e CIfB) compre- endem, de modo característico, uma região A onde há uma sequência de aminoácido altamente conservada que pode ser usada para derivar um mo- tivo TYTFTDYVD (SEQ ID NO: 126) de consenso.

O motivo exibe ligeira va- riação entre as diferentes proteinas, Essa variação, junto com à sequência . de consenso do motivo, é descrita na patente US número 6.680.195. Nas proteinas CIf-Sdr, esse motivo é altamente conservado.

O motivo pode ser

' 51/134 ' usado em composições imunogênicas para conferir imunidade de amplo es- pectro contra infecções bacterianas e também pode ser usado como um an- ' tigeno na produção de anticorpos monocionais ou policlonais. Tal anticorpo pode ser usado para conferir imunidade passiva de amplo espectro.

As proteínas Sdr diferem de CIfA e CIfB por terem duas a cinco sequências repetidas de 110-113 resíduos adicionais (motivos B) localizadas entre a região A e a região R. Cada motivo B contém um loop EF-hand de ligação a Ca** normalmente encontrado em proteínas eucariotas. A integri- dade estrutural de uma proteina recombinante compreendendo as cinco re- o 10 petições B de SdrD foi mostrada por meio de análise de fluorescência bi- SANS como sendo Caº”* -dependente, sugerindo que os EF-hands são fun- cionais. Quando Ca” foi removido, a estrutura entrou em colapso para uma conformação não enovelada. A estrutura original foi restaurada pela adição de Ca?**. Os domínios R C-terminais das proteinas Sdr contêm 132-170 resí- duosSD. Esses são seguidos por regiões de ancoragem em parede conser- vadas características de muitas proteínas na superfície de bactérias Gram ' positivas. Nas proteinas Sdr e CIf, esse motivo B é altamente conservado, ' enquanto que uma versão degenerada ocorre em MSCRAMMS de ligação à fibronectina, bem como na proteína Cna de ligação ao colágeno. Os motivos o B, em conjunto com as regiões R, são necessários para visualização do do- mínio de ligação a ligante em alguma distância da superfície celular. Os mo- tivos B repetidos são um denominador comum do subgrupo de proteínas com repetição SD descritas aqui. Esses motivos são encontrados em dife- rentes números nas três proteínas Sdr da cepa PFESA0237. Existem distin- ções claras entre os motivos B individuais. As unidades mais conservadas são aquelas localizadas adjacentes às regiões R (SdrC B2, SdrD B5 e SdrE B3). Elas diferem do resto em vários locais, especialmente na metade C- terminal. Um detalhe estrutural notável é que repetições B adjacentes são sempre separadas por um resíduo de prolina presente na região C-terminal, mas uma prolina nunca ocorre entre as últimas repetições B e a região R.

] Antes, esse ligante é caracterizado por um trecho ácido curto. Essas dife-

S 52/134 ] renças são evidência de que as unidades terminais têm diferentes papeis . funcionais ou estruturais comparado com os outros motivos B. Os motivos B N-terminais de SdrD e SdrE se desviaram dos outros e há numerosas alte- rações de aminoácido, incluindo pequenas inserções e deleções, enquanto que os motivos B internos restantes são mais altamente conservados. Note que cada uma das três proteínas Sdr tem pelo menos um motivo B de cada tipo. Os domínios R C-terminais de proteínas Sdr contêm 132-170 SD resíduos. Esses são seguidos por regiões de ancoragem em parede conser- e 10 vados característicos de muitas proteínas na superfície de bactérias Gram positivas. Outras moléculas SdrD candidatas podem ser derivadas de vá- rias espécies de organismos para uso em uma composição imunogênica da | invenção, algumas das quais incluem as seguintes SdrD de S. aureus: cepa

15. USA3SOO0 FPR3757 (número de acesso de proteina SAUSA300 0547); cepa NCTC8325 (número de acesso de proteina SAOUHSC 00545); cepa MW2 (número de acesso de proteina MWO517); cepa MSSA476 (número de a- . cesso de proteina SAS0520; e cepa Mu50 (número de acesso de proteina SAVOS562). Outras MSCRAMMS as quais podem ser consideradas para uso o em uma composição imunogênica da presente invenção incluem EkeS, Ds- gA, KesK, KrkN, KrkN2, RkaS, RrkN e KnkA. Essas MSCRAMMS são des- critas no documento WO 02/102829, o qual é aqui incorporado por referên- cia, MSCRAMMS adicionais, identificados pelo No. de Acesso ao GenBank, inclem NP 3732611, NP 3733711, NP 3742461, NP 3742481, NP 3748411, NP 374866.1, NP 375140,1, NP 3756141, NP 3756151, NP 375707.1, NP 375765.1 e NP 3757731. Polissacarídeos Capsulares Tipo 5 e Tipo 8 Microorganismos estafilocócicos capazes de causar doença in- vasivasão,em geral, também capazes de produzir um polissacarideo cap- . sular (CP) que encapsula a bactéria e intensifica sua resistência à elimina- ção pelo sistema imune inato do hospedeiro. O CP serve para envolver a

' célula bacteriana em uma cápsula protetora que torna as bactérias resisten- . tes à fagocitose e morte intracelular. As bactérias carecendo da cápsula são mais suscetíveis à fagocitose. Polissacarídeos capsulares são frequente- mente um fator de virulência importante para muitos patógenos bacterianos, incluindo Haemophilus influenzae, Streptococcus pneumoniae e estreptoco- cos do Grupo B.

O polissacarídeo capsular pode ser usado para sorotipificação de espécies bacterianas em particular. Tipificação é usualmente realizada por meio de reação com um anti-soro específico ou anticorpo monocional e 10 gerado a uma estrutura específica ou epítopo único característico do polis- sacarídeo capsular. Bactérias encapsuladas tendem a crescem em colônias lisas, enquanto que colônias de bactérias que perderam suas cápsulas pare- cem rugosas. Colônias que produzem uma aparência mucoide são conheci- das como Pesadamente Encapsuladas. Tipos 1 e 2 de S. aureus são pesa- 15 . damente encapsulados e raramente são associados a uma doença, A maioria dos isolados clínicos de S. aureus são encapsulados S . com :sorotipos5 ou 8. Os polissacarideos capsulares do tipo 5 (CP5) e tipo 8 . (CP8) têm unidades de repetição trissacarídicas similares compreendidas de ácido N-acetil manosaminurônico, N-acetil L-fucosamina e N-acetil D- fucosamina. Vide Fournier, J.M. et al., Infect. Immun. 45: 97-93 (1984) e Mo- o reau, M,, et al., Carbohydrate Res. 201: 285-297 (1990). Os dois CPs, os quais têm os mesmos açúcares, mas diferem quanto às ligações de açúcar e locais de O acetilação, produzem padrões de imuno-reatividade sorologica- mente distintos.

Em algumas modalidades, os polissacarideos capsulares de so- rotipo 5 e/ou 8 da invenção são O-acetilados. Em algumas modalidades, o grau de O-acetilação de polissacarídeo ou oligossacarídeo capsular do tipo 5 é 10-100%, 20-100%, 30-100%, 40-100%, 50-100%, 60-100%, 70-100%, 80- 100%, 90-100%, 50- 90%, 60-90%, 70-90% ou 80-90%. Em algumas moda- lidades,o graude O-acetilação de polissacarideo ou oligossacarideo capsu- . lar do tipo 8 é 10-100%, 20-100%, 30-100%, 40-100%, 50-100%, 60-100%, 70-100%, 80-100%, 90-100%, 50-90%, 860-90%, 70-90% ou 80-90%. Em i 54/134 ' algumas modalidades, o grau de O-acetilação de polissacarídeos ou oligos- . sacarídeos capsulares do tipo 5 e tipo 8 é 10-100%, 20-100%, 30-100%, 40- 100%, 50-100%, 60-100%, 70-100%, 80-100%, 90-100%, 50-90%, 60-90%, 70-90% ou 80-90%.

O grau de O-acetilação do polissacarídeo ou oligossacarídeo pode ser determinado por meio de qualquer método conhecido no campo, por exemplo, através de NRM de próton (Lemercinier e Jones 1996, Car- bohydrate Research 296; 83-96, Jones e Lemercinier 2002, J Pharmaceuti- cal and Biomedical Analysis 30; 1233-1247, documentos WO 05/033148 ou o 10 WO 00/56357). Outro método comumente usado é descrito por Hestrin (1949) J. Biol. Chem. 180; 249-261.

Em algumas modalidades, os polissacarideos capsulares de so- rotipo 5 e/ou 8 da invenção são usados para gerar anticorpos que são fun- cionais, conforme medido pela morte de bactérias em um modelo de eficácia - com animais ou um ensaio de morte opsonofagocítica que demonstra que a morte de bactérias por anticorpos. Tal funcionalidade pode não ser observa- . da usando um ensaio que monitora a geração de anticorpos isoladamente, o . qual não é indicativo da importância de O-acetilação sobre a eficácia.

Epidemiologia de Cápsula A associação de sorotipos capsulares em particular a uma doen- oe ça é possível através de monitoramento de isolado clínicos. Dos oito diferen- tes sorotipos de S. aureus identificados (Karakawa e Vann (1982) apenas os sorotipos 1 e 2 são pesadamente encapsulados e esses raramente são iso- lados. Vide Capsular Polysaccharide of Staphylococcus aureus, páginas 285-293, em JB. Robbins, J.C. Hill e J.C. Sadoff (ed.), Seminars in infecti- ous disease, vol. 4, Bacterial Vaccines. Thieme Stratton, Inc. New York). E- xames mostraram que aproximadamente 85-90% dos isolados clínicos de S. aureus expressam CP5 ou CP8 (Arbeit RD, et al., Diagn. Microbiol. Infect.

Dis. (Abril de 1984); 2(2): 85-91; Karakawa WW, et al., J. Clin. Microbiol. (Se- tembro de 1985); 22(3): 445-7; Essawi T, et al., Trop. Med. Int. Health, (Julho R de 1998); 3(7): 576-83; Na'was T, et al., J. Clin. Microbiol. (1998) 36(2): 414-

20. A maioria das cepas CP5 e CP8 não passíveis de tipificação são, em

. 55/134 : geral, tipo 5 ou tipo 8 contendo mutações no focus cap5/8 (Cocchiaro, Go- mez et al., (2006), Mol, Microbiol.

Fev. 59(3): 948-960). Capsulação para . algumas cepas é perdida rapidamente dentro de umas poucas passagens in vitro, o qual é em virtude de um efeito repressivo da alta concentração de fosfato em meios usados em diagnóstico clínico sobre produção de cápsula.

Foi também reportado que isolados não encapsulados recuperam expressão da cápsula após passagem através de vacas.

Vide Opdebeck, J.P. et al.

J.

Med, Microbiol. 19: 275-278 (1985). Algumas cepas não passíveis de tipi- ficação se tornam cápsula positivas sob condições de crescimento apropria- oe 10 das, Estrutura de CP5 e CP8 A unidade de repetição de CP5 e CP8 é compreendida de ácido 2-acetamido-2-deoxi-D-manurônico, 2-acetamido-2-deoxi-L-fucose e 2- acetamido-2-deoxi-D-fucose.

Vide C.

Jones etal.,, Carbohydr.

Res. 340: - 1097-1106 (2005). Embora CP5 e CP8 tenham a mesma composição de açúcar, foi demonstrado que eles são imunologicamente distintos.

Eles dife- . . rem quanto às ligações glicosídicas e local de O-acetilação de ácido urônico.

N-acetilação incompleta cepa-dependente de um dos resíduos FucNAc foi 1 observada.

Vide Tzianabos et al., PNAS V98: 9365(2001). O peso molecular de um polissacarideo capsular de S. aureus é e uma consideração importante para uso em composições imunogênicas.

Po- lissacarídeos capsulares de alto peso molecular são capazes de induzir à determinadas respostas de anticorpo em virtude de uma valência maior dos epitopos presentes sobre a superfície antigênica.

Os métodos descritos aqui constituem de isolamento e purificação de polissacarídeo capsular do tipo 5 e tipo 8 de peso molecular muito maior do que estava anteriormente disponí- vel.

MntC/SitC /Proteíina de Ligação Salivar MntC/SitC /Proteina de Ligação Salivar é uma proteína transpor- tadora ABC e tem homólogos em S. epidermidis e S, aureus.

Ela é referida na presente invenção como MntC.

Essa proteina é uma lipoproteina de 32 , kDa e está localizada na parede de células bacterianas.

Vide Sellman et al. e | |

. 56/134 ' Cockayne et al., Infect.

Immun. 66: 3767(1998). Em S. epidermídis, ela é um componente de um óperon ferro-regulado.

Ela mostra homologia considerá- ' vel à adesinas, incluindo FimA de S, parasanguis e com lipoproteínas da família de transportadores ABC, com funções de transporte de ferro metálico provadas ou putativas. (Vide Tabela 12 para cepas de S. aureus e sequên- cias.) Proteina MntC de S. aureus Um homólogo de MntC de S. aureus é conhecido como proteína de ligação salivar e foi divulgado na Pat.

U.S.

No. 5.801.234 e pode ser in- o 10 cluídoem uma composição imunogênica da invenção.

À sequência de prote- ina para um homólogo de MntC/SitC/Proteína de Ligação Salivar de S. aureus é encontrado no número de acesso ao GenBank NP 371155 for cepa Mu50 (também conhecido como SAVO631). O identificador de sequên- cia é SEQ ID NO: 119. O número de acesso para a sequência de nucleotí- 15 . deo para o genoma completo da cepa Mu50 é NC 002758.2 (coordenadas 704988-705917). . Proteína SitC de S. epidermidis O homólogo de MntC/SitC/Proteína de Ligação Salivar de S. e- ' pidermidis é conhecido como SitC e foi divulgado em Sellman et al., (Sell- manetal, Infect.

Inmun.

Outubro de 2005; 73(10): 6591-6600). A sequên- o cia de proteina para o homólogo de MntC/SitC/Proteina de Ligação Salivar de S. epidermidis é encontrado no número de acesso ao GenBank YP 187886.1 (também conhecido como SERP0290). O identificador de se- quência é SEQ ID NO: 121. O número de acesso para a sequência de nucleotídeo para o genoma completo da cepa RP62A é NC 002976 (coordenadas 293030- 293959). Outras moléculas SitC candidatas podem ser derivadas de várias espécies de organismos para uso em uma composição imunogênica da in- venção, algumas das quais são listadas na Tabela 1 abaixo.

' 57/1834 ' ' Tabela 1 site S. epidermidis | ATCC 12228 S. saprophyti- [se | ja PERA |arccasaos — | 15305 mae1G2334 | Proteinas de Ligação ao Ferro de S. aureus Outro antígeno candidato potencial a ser considerado para uso nas composições imunogênicas da invenção incluem um determinante B na º 5 superfície de ferro de proteina na superfície de S, aureus (IsdB). Essa MS- CRAMM foi descrita por Mazmanian et al. (Mazmanian, SK et a/., Proc.

Natl.

Acad.

Sci., USA 99: 2293-2298 (2002)) e foi subsequentemente testado e mostrado como sendo um candidato de vacina em um modelo de infecção em murino e um estudo de imunogenicidade com macaco Rhesus por Ku- Klin,etal. (Kuklin) NA, etal.

Infection and Immunity, Vol. 74, No. 4, 2215- ' 2223, (2006)). Essa molécula de IsdB está presente em várias cepas de S. aureus, incluindo cepa MRSA252 (número de acesso de proteína CAGA40104.1); cepa Newman (número de acesso de proteína BAF67312.1); cepa MSSA476 (número de acesso de proteina CAG42837.1); cepa Mu3 e 15 (número de acesso de proteína BAF78003.1); cepa RF122 (número de a- cesso de proteína CAI8O0681.1). Antígenos Candidatos A composições imunogênicas da presente invenção podem tam- bém incluir um ou mais dos seguintes antígenos: Opp3a, DItD, HtsA, LtaS, IsdA, IsdC, SdrF, SdrG, SdrH, SrtA, SpA, Sbi alfa-hemolisina (hla), beta- hemolisina, proteína A de ligação à fibronectina (fnbA), proteína B de ligação à fibronectina (fnbB), coagulase, Fig, map, leucocidina de Panton-Valentine (pvl), alfa-toxina e suas variantes, gama-toxina (hlg) e variantes, ica, trans- portador ABC imunodominante, transportador de Mg2+, transportador ABC deNi RAP, autolisina, receptores de laminina, ISaA/PisA, IsaB/PisB , SPOII- ' IE, SsaA, EbpS, Sas A, SasF, SasH, EFB (FIB), SBI, Npase, EBP, proteína ||

' 58/134 v ' de sialo ligação óssea, precursor de aureolisina (AUR)/Sepp1, Cna e frag- mentos do mesmo, tais como M55, TSST-1, mecA, exopolissacarideo de poli-N-acetilglucosamina (PNAG/dPNAG), GehD, EbhA, EbhB, SSP-1, SSP- 2, HBP, proteina de ligação à vitronectina, HarA, EsxA, EsxB, Enterotoxina A, Enterotoxina B, Enterotoxina C1 e nova autolisina, Em determinadas mo- dalidades da invenção, quando a composição imunogênica compreende de- terminadas formas de CP5 e/ou CP8, ela pode ainda não compreender PNAG.

Formulações de Composição imunogênica e 10 Em uma modalidade, a composições imunogênicas da invenção ainda compreendem pelo menos um de um adjuvante, um tampão, um crio- protetor, um sal, um cátion divalente, um detergente não iônico, um inibidor de oxidação de radical livre, um diluente ou um veículo.

As composições imunogênicas da invenção podem ainda com- 15 . preender um ou mais conservantes, além de uma pluralidade de antígenos de proteína estafilocócica e conjugados de polissacarideo capsular-proteína. ' O FDA requer que produtos biológicos em frascos com múltiplas doses (múl- . tiplas doses) contêm um conservante, com apenas umas poucas exceções, Produtos de vacina contendo conservantes incluem vacinas contendo cloreto de benzalcônio (antraz), 2-fenoxietanol (DTaP, HepA, Lyme, Polio (parente- oe ral)), fenol (Pneumo, Tifóide (parenteral), Varíola) e timerosal (DTaP, DT, Td, HepB, Hib, Influenza, JE, Mening, Pneumo, Raiva). Conservantes aprovados para uso em fármacos injetáveis incluem, por exemplo, clorobutanol, m-cresol, metilparabeno, propilparabeno, 2-fenoxietanol, cloreto de benzetô- nio, ácido benzóico, álcool benzílico, fenol, timerosal e nitrato fenilmercúrico, Formulações da invenção podem ainda compreender um ou mais de um tampão, um sal, um cátion divalente, um detergente não iônico, um crioprotetor, tal como açúcar e um antioxidante, tal como um removedor de radical livre ou agente de quelação ou qualquer múltipla combinação dos mesmos.

A escolha de qualquer componente, por exemplo, um quelador, pode determinar se outro componente (por exemplo, um removedor) é dese- ' Jável ou não.

A composição final formulada para administração deverá ser

. ' estéril e/ou isenta de pirogênio. Aqueles versados no campo podem deter- minar empiricamente quais combinações desses e outros componentes se- rão ótimas para inclusão nas composições imunogênicas contendo conser- vante da invenção, dependendo de uma variedade de fatores, tais como as condiçõesde armazenamento e administração requeridas em particular. Em determinadas modalidades, a formulação da invenção a qual é compatível com administração parenteral compreende um ou mais tam- pões fisiologicamente aceitáveis selecionados de, mas não limitado a, Tris (trimetamina), fosfato, acetato, borato, citrato, glicina, histidina e succinato. o 10 Em determinadas modalidades, a formulação é tamponada para dentro de uma faixa de pH de cerca de 6,0 à cerca de 9,0, de preferência de cerca de 6,4 a cerca de 74.

Em determinadas modalidades, pode ser desejável ajustar o pH “da composição imunogênica ou formulação da invenção. O pH da formula-

15. ção da invenção pode ser ajustado usando técnicas padrões no campo. O PH da formulação pode ser ajustado para estar entre 3,0 e 8,0. Em determi- ] nadas modalidades, o pH da formulação pode ser ou pode ser ajustado para . estar entre 3,0 e 6.0,4,0 e 6.0 ou 5.0 e 8.0, Em outras modalidades, o pH da formulação pode ser ou pode ser ajustado para ser cerca de 3,0, cerca de 3,5,cercade 4,0, cerca de 4,5, cerca de 5,0, cerca de 5,5, cerca de 5,8, cer- oe ca de 6,0, cerca de 6,5, cerca de 7,0, cerca de 7,5 ou cerca de 8,0. Em de- terminadas modalidades, o pH pode ser ou pode ser ajustado para estar em uma faixa de 4,5 a 7,5 ou de 4,5 a 6,5, de 5,0 a 54, de 54 a 5,5, de 5,5 a 5,6, de 5,6 a 5,7, de 5,7 a 5,8, de 5,8 a 5,9, de 5,9 a 6,0, de 6,0 a 8,1, de 6,1 a6,2,de6,2a6,3,de6,3a6,5, de 6,5 a 7,0, de 7,0a 7,5 ou de 7,5a8,0.

Em uma modalidade específica, o pH da formulação é cerca de 5,8. Em determinadas modalidades, a formulação da invenção a qual é compatível com administração parenteral compreende um ou mais cátions divalentes incluindo, mas não limitado a, MgCl;, CaCl; e MnCl,, em uma concentração oscilando de cerca de 0,1 MM a cerca de 10 mM, com até cer- . ca de 5 mM sendo preferido.

Em determinadas modalidades, a formulação da invenção a qual

: 60/134 «

' é compatível com administração parenteral compreende um ou mais sais incluindo, mas não limitado a, cloreto de sódio, cloreto de potássio, sulfato de sódio e sulfato de potássio, presentes em uma resistência iônica a qual é fisiologicamente aceitável para o indivíduo quando de administração paren- terale incluído em uma concentração final para produzir a resistência iônica ou osmolaridade selecionada na formulação final.

A resistência iônica ou osmolalidade final da formulação será determinada por múltiplos componen- tes (por exemplo, íons de composto(s) de tamponamento e outros sais de não tamponamento). Um sal preferido, NaCl, está presente de uma faixa de o 10 até cerca de 250 mM, com as concentrações de sal sendo selecionadas pa- ra complementar outros componentes (por exemplo, açúcares), de modo que a osmolaridade final da formulação seja compatível com administração parenteral (por exemplo, injeção intramuscular ou subcutânea) e promoverá a estabilidade a longo prazo dos componentes imunogênicos da formulação 15 . de composição imunogênica sobre várias faixas de temperatura.

Formula- ções sem sal tolerarão faixas aumentadas de um ou mais dos crioprotetores

' selecionados para manter os níveis finais desejados de osmolaridade, . Em determinadas modalidades, a formulação da invenção a qual é compatível com administração parenteral compreende um ou mais criopro- tetores selecionados de, mas não limitado a, dissacarideos (por exemplo, o lactose, maltose, sacarose ou trealose) e polihidróxi hidrocarbonetos (por exemplo, dulcitol, glicerol, manitol e sorbitol),

Em determinadas modalidades, a osmolaridade da formulação está em uma faixa de cerca de 200 mOs/L a cerca de 800 mOs/L, com uma faixa preferida de cerca de 250 mOs/L a cerca de 500 mOs/L ou cerca de 300 mOs/L - cerca de 400 mOs/L.

Uma formulação sem sal pode conter, por exemplo, de cerca de 5% a cerca de 25% de sacarose e, de preferência, de cerca de 7% a cerca de 15% ou cerca de 10% a cerca de 12% de sacarose.

Alternativamente, uma formulação sem sal pode conter, por exemplo, de cercade 3% a cerca de 12% de sorbitol e, de preferência, de cerca de 4% a . 7% ou cerca de 5% a cerca de 6% de sorbitol.

Se um sal, tal como cloreto de sódio, é adicionado, então, a faixa eficaz de sacarose ou sorbitol é relativa-

' 61/134 « ' mente diminuída.

Essas e outras considerações sobre osmolalidade e osmo- laridade estão dentro da capacidade daqueles versados no campo.

Em determinadas modalidades, a formulação da invenção a qual é compatível com administração parenteral compreende um ou mais inibido- resde oxidação de radical livre e/ou agentes de quelação.

Uma variedade de removedores e queladores de radical livre é conhecida na técnica e se aplicam às formulações e métodos de uso descritos aqui.

Exemplos incluem, mas não estão limitados a, etanol, EDTA, uma combinação de EDTA/etanol, trietanolamina, manitol, histidina, glicerol, citrato de sódio, hexafosfato de e 10 inositol, tripolifosfato, ácido ascórbico/ascorbato, ácido succínico/succinato, ácido málico/maleato, desferal, EDDHA e DTPA e várias combinações de dois ou mais dos acima.

Em determinadas modalidades, pelo menos um re- movedor de radical livre de não redução pode ser adicionado em uma con- centração que intensífica eficazmente a estabilidade da formulação a longo 15 . prazo.

Um ou mais inibidores de oxidação de radical livre/queladores podem também ser adicionados em várias combinações, tais como um removedor e ' um cátion divalente.

A escolha do quelador determinará se a adição de um : removedor é ou não necessária.

Em determinadas modalidades, a formulação da invenção a qual é compatível com administração parenteral compreende um ou mais tensoa- o tivos não iônicos incluindo, mas não limitado a, polioxietileno sorbitan éste- res de ácido graxo, Polisorbato-80 (Tween 80), Polisorbato-8S0 (Tween 60), Polisorbato-40 (Tween 40) e Polisorbato-20 (Tween 20), polioxietileno alquil éteres incluindo, mas não limitado a, Brij 58, Bri) 35, bem como outros, tais como Triton X-100; Triton X-114, NP40, Span 85 e a série Pluronic de ten- soativos não iônicos (por exemplo, Pluronic 121), com o componente prefe- rido sendo Polisorbato-80 em uma concentração de cerca de 0,001% a cer- ca de 2% (com até cerca de 0,25% sendo preferido) ou Polisorbato-40 em uma concentração de cerca de 0,001% a 1% (com até cerca de 0,5% sendo preferido). . Em determinadas modalidades, a formulação da invenção com- preende um ou mais agentes de estabilização adicionais adequados para

' administração parenteral, por exemplo, um agente de redução compreen- ' dendo pelo menos um grupo tiol (-SH) (por exemplo, cisteína, N-acetil cistei- na, glutationa reduzida, tioglicolato de sódio, tiossulfato, monotioglicerol ou misturas dos mesmos). Alternativa ou opcionalmente, as formulações de composição imunogênica contendo conservante da invenção podem ainda ser estabilizadas mediante remoção de oxigênio dos recipientes de armaze- namento, protegendo a formulação contra à luz (por exemplo, usando recipi- entes de vidro âmbar).

Formulações de composição imunogênica contendo conservante o 10 da invenção podem compreender um ou mais veículos ou excipientes far- maceuticamente aceitáveis, os quais incluem qualquer excipiente que, em si, não induz a uma resposta imune. Excipientes adequados incluem, mas não estão limitados a, macromoléculas, tais como proteinas, sacarídeos, ácidos polilácticos, ácidos poliglicólicos, aminoácidos poliméricos, copolimeros de 15 . aminoácido, sacarose (Paoletti et al, 2001, Vacecine, 19: 2118), trealose, lac- - — tosee agregados lipídicos (tais como gotículas de óleo ou lipossomas). Tais veículos são bem conhecidos por aqueles versados no campo. Excipientes : farmaceuticamente aceitáveis são discutidos, por exemplo, em Gennaro, 2000, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20º edição, ISBN:0683306472.

o As composições da invenção podem ser liofiizadas ou estar na forma aquosa, isto é, soluções ou suspensões. Formulações líquidas podem, vantajosamente, ser administradas diretamente de sua forma embalada e, assim, são ideais para injeção sem a necessidade de reconstituição em um meio aquoso, conforme de outro modo requerido para composições liofiliza- das da invenção, Distribuição direta de composições imunogênicas da presente invenção a um indivíduo pode ser realizada através de administração paren- teral (intramuscular, intraperitoneal, intradérmica, subcutânea, intravenosa- mente ou ao espaço intersticial de um tecido); ou através de administração ' retal, oral, vaginal, tópica, transdérmica, intranasal, ocular, aural, pulmonar ou outra mucosal. Em uma modalidade preferida, administração parenteral é

' 63/134 ' através de injeção intramuscular, por exemplo, à coxa ou parte superior do braço do indivíduo. Injeção pode ser via uma agulha (por exemplo, uma agu- ' lha hipodérmica), mas injeção sem agulha pode, alternativamente, ser usa- da. Uma dose intramuscular típica é 0,5 mL. As composições da invenção podem ser preparadas em várias formas, por exemplo, para injeção, quer como soluções ou suspensões líquidas. Em determinadas modalidades, a composição pode ser preparada como um pó ou pulverização para adminis- tração pulmonar, por exemplo, em um inalador. Em outras modalidades, a composição pode ser preparada como um supositório ou pessário para ad- o 10 ministração nasal, aural ou ocular, por exemplo, como um spray, gotas, gel ou pó.

Quantidades ótimas de componentes para uma composição i- munogênica particular podem ser determinadas por meio de estudos pa- drões envolvendo observação de respostas imunes apropriadas em indivi- 15 . duos. Após uma vacinação inicial, os indivíduos podem receber uma ou vá- rias imunizações de reforço adequadamente espaçadas. . Embalagem e Formas de Dosagem Composições imunogênicas da invenção podem ser embaladas na forma de dose unitária ou múltiplas doses (por exemplo, 2 doses, 4 doses oumais) Para formas com múltiplas doses, frascos são, tipicamente, mas o não necessariamente, preferidos com relação à seringas pré-enchidas. For- matos com múltiplas doses adequados incluem, mas não estão limitados a: 2 a 10 doses por recipiente a 0,1 a 2 mL por dose. Em determinadas modali- dades, a dose é uma dose de 0,5 mL. Vide, por exemplo, Pedido de Patente Internacional WO2007/127668, o qual é incorporado aqui por referência.

Às composições podem ser apresentadas em frascos ou outros recipientes de armazenamento adequados ou podem ser apresentadas em dispositivos de distribuição pré-enchidos, por exemplo, seringas com um ú- nico ou múltiplos componentes, as quais podem ser fornecidas com ou sem agulhas, Uma seringa pode, tipicamente, mas não necessariamente, conter uma única dose da composição imunogênica contendo conservante da in- ' venção, embora seringas pré-enchidas com múltiplas doses também sejam i 65/134 ] lidades, a solução aquosa compreende um ou mais conservantes e pode, . opcionalmente, compreender pelo menos um adjuvante (vide, por exemplo, documento WOZ2009/109550 (incorporado aqui por referência)). Em ainda outra modalidade, um recipiente de múltiplos formatos dedoseé selecionado de um ou mais do grupo consistindo de, mas não limi- tado a, utensílio de vidro geral para laboratório, frascos, béqueres, cilindros graduados, fermentadores, biorreatores, tubulações, tubos, sacos, jarros, frascos, vedações de frascos (por exemplo, uma rolha de borracha, uma tampa de rosca), ampolas, seríngas, seringas com câmara dupla ou múlti- o 10 plas câmaras, rolhas para seringa, êmbolos de seringa, vedações de borra- cha, vedações plásticas, vedações de vidro, cartuchos e canetas descartá- veis e semelhantes. O recipiente da presente invenção não está límitado pe- lo material de fabricação e inclui materiais tais como vidro, metais (por e- xemplo, aço, aço inoxidável, alumínio, etc.) e polimeros (por exemplo, ter-

15. moplásticos, elastômeros, elastômeros termoplásticos), Em uma modalidade particular, o recipiente do formato é um frasco de vidro Schott do Tipo 1 de 5 mL com uma rolha de butila. Aqueles versados no campo apreciarão que o . formato apresentado acima não se destina a ser uma lista exaustiva, mas serve meramente como uma orientação para o técnico com relação à varie- dadede formatos disponíveis para a presente invenção. Formatos adicionais [ considerados para uso na presente invenção podem ser encontrados em catálogos publicados de vendedores e fabricantes de equipamento para la- boratório, tal como United States Plastic Corp. (Lima, OH), VWR. Avaliação de Composições imunogênicas Em uma modalidade, a presente invenção proporciona composi- ções imunogênicas compreendendo pelo menos três antigenos de um orga- nismo S. aureus. Vários testes in vitro são usados para avaliar a imunogenicidade das composições imunogênicas da invenção. Por exemplo, um ensaio opsô- nicoin vitroé conduzido através de incubação de uma mistura de células - estafilocócicas, soro termicamente inativado contendo anticorpos específicos aos antígenos em questão e uma fonte de complemento exógeno. Opsono-

' 66/134 ' fagocitose se processo durante incubação de células polimorfonucleares (PMN's) recentemente isoladas ou células efetuadoras diferenciadas, tais ' como HL60, e a mistura de célula estafilocócica/complemento/anticorpo.

Cé- lulas bacterianas que são revestidas com anticorpo e complemento são mor- tas quando de opsonofagocitose, Unidades de formação de colônia (Colony Forming Units - CFU) de bactérias que sobrevivem que são recuperadas de opsonofagocitose são determinadas colocando a mistura de ensaio em lâmi- na.

As titulações são reportadas como a recíproca da maior diluição que proporciona morte bacteriana de 50%, conforme determinado comparando oe 10 com controles de ensaio.

Um ensaio ELISA de célula inteiro é também usado para avaliar a imunogenicidade in vitro e exposição do antigeno na superfície, em que as cepas bacterianas de interesse (S. aureus) são revestidas sobre uma lâmi- na, tal como uma lâmina com 96 cavidades e o soro testado de um animal 15 . imunizado é reagido com as células bacterianas.

Se qualquer anticorpo, es- pecífico para o antígeno de teste, é reativo com o epitopo do antígeno ex- ' posto na superfície, ele pode ser detectado através de métodos padrões co- nhecidos por aqueles versados no campo. i Qualquer antigeno que demonstra a atividade desejada in vitro é, então, testado em um modelo de estimulo animal in vivo.

Em determina- eo das modalidades, composições imunogênicas são usadas na imunização de um animal (por exemplo, um camundongo) através de métodos e vias de imunização conhecidas por aqueles versados no campo (por exemplo, intra- nasal, parenteral, oral, retal, vaginal, transdérmica, intraperitoneal, intrave- —nosa, subcutânea, etc.). Após imunização do animal com uma composição imunogênica de Staphylococcus sp. em particular, o animal é estimulado com um Staphylococcus sp. e ensaiado com relação à resistência à infecção estafilocócica.

Em uma modalidade, camundongos sem patógeno são imuniza- dose estimulados com S. aureus.

Por exemplo, camundongos são imuniza- dos com uma ou mais doses do antígeno desejado em uma composição i- munogênica.

Subsequentemente, os camundongos são estimulados com

' 67/134 ' S. aureus e a sobrevivência é monitorada com o tempo pós-estimulo. Métodos de Imunização São proporcionados também métodos para imunização de um hospedeiro para prevenir infecção estafilocócica, Em uma modalidade prefe- rida,o hospedeiro é um ser humano. Assim, a um hospedeiro ou indivíduo é administrada uma quantidade imunogênica de uma composição imunogêni- ca conforme descrito aqui. Uma quantidade imunogênica de uma composi- ção imunogênica pode ser determinada fazendo um estudo de dose- resposta no qual indivíduos são imunizados com quantidades gradualmente oe 10 crescentes da composição imunogênica e a resposta imune analisada para determinar a dosagem ótima. Pontos iniciais para o estudo podem ser inferi- dos a partir de dados de imunização em modelos animais. A quantidade de dosagem pode variar, dependendo de condições específicas do indivíduo. À quantidade pode ser determinada em ensaios de rotina através de meios 15 . conhecidos por aqueles versados no campo. Em algumas modalidades, o método de imunização de um hospedeiro para prevenir infecção, doença ou Ú condição estafilocócica compreende um tratamento para ser humano, veteri- . nário, animal ou agricola. Outra modalidade proporciona um método de imu- nização de um hospedeiro para prevenir infecção, doença ou condição esta- fillocócica associada a um Staphylococcus sp. em um indivíduo, o método o compreendendo geração de um preparado de anticorpo policlonal ou mono- clonal a partir de uma composição imunogênica descrita aqui e uso do refe- rido preparado de anticorpo para conferir imunidade passiva ao indivíduo. Uma quantidade imunologicamente eficaz da composição imu- nogênicaem um número apropriado de doses é administrada ao indivíduo para estimular uma resposta imune. O indivíduo tratado não exibirá as mani- festações clínicas mais graves da infecção estafilocócica. A quantidade de dosagem pode variar, dependendo das condições específicas do indivíduo, tais como idade e peso. Essa quantidade pode ser determinada em ensaios de rotina através de meios conhecidos por aqueles versados no campo.

. Em uma modalidade, pacientes aos quais foram administradas composições imunogênicas da invenção mostram uma redução nas taxas de transmissão de S. aureus.

Tal redução na transmissão ou intervalo de tempo . prolongado levado como um não portador após administração de uma com- posição imunogênica é significativo de um ponto de vista de necessidade médica.

Por exemplo, redução na transmissão geral de S. aureus em porta- dores pode ser avaliada após uma dose de uma vacina com múltiplos anti- genos de S. aureus.

Por exemplo, 1 dia antes de administração de uma composição imunogênica, um grupo de adultos com idade de 18-50 anos pode sofrer triagem quanto à transmissão através de esfregaços nasal e da garganta, seguido por cultura para determinar seu estado de transmissão. e 10 Em seguida, ao grupo pode ser administrada uma composição imunogênica da invenção com um grupo que recebeu controle.

Esfregaços nasal e da garganta realizados semanalmente durante um período de 12 semanas e mensalmente até 6 meses pós-administração da composição imunogênica " são realizados e comparados com placebo.

Um endpoint primário é compa- 15 . rar as taxas de transmissão em pacientes após administração de uma com- posição imunogênica versus placebo em intervalos de 3 meses pós- i . imunização, - Modelos Animais de Infecção Estafilocócica Vários modelos animais são descritos abaixo para uso em avali- açãoda eficácia de qualquer uma das composições imunogênicas, conforme oe descrito aqui.

Modelo de Sepsia em Murino (Passiva ou Ativa) Modelo de Imunização Passiva

Camundongos são passivamente imunizados intraperitoneal- mente (ip) com IgG imune ou anticorpo monoclonal.

Os camundongos são subsequentemente estimulados 24 horas depois com uma dose letal de S. aureus.

O estímulo bacteriano é administrado intravenosamente (i.v.) ou i.p., assegurando que qualquer sobrevivência pudesse ser atribuída à intera- ção específica in vivo do anticorpo com as bactérias.

A dose de estímulo bacteriano é determinada como sendo a dose requerida para obter sepsia . letal de aproximadamente 20% dos camundongos de controle não imuniza- dos.

Avaliação estatística de estudos de sobrevivência pode ser realizada através de análise de Kaplan-Meier. - Modelo de Imunização Ativa Nesse modelo, camundongos (por exemplo, Camundongos Swiss Webster) são ativamente imunizados intraperitonealmente (i.p.) ou subcutaneamente (s.c.) com um antígeno alvo a 0,3 e 6 semanas (ou outro esquema de vacinação similar apropriadamente espaçado) e subsequente- mente estimulados com S. aureus na semana 8 através da via intravenosa. A dose de estimula bacteriana é calibrada para obter uma sobrevivência de aproximadamente 20% no grupo de controle durante um período de 10-14 o 10 dias. Avaliação estatística de estudos de sobrevivência pode ser realizada através de análise de Kaplan-Meier. Modelo de Endocardite Infecciosa (Passiva ou Ativa) Um modelo de imunização passiva para endocardite infecciosa i (IE) causada por S. aureus foi usado anteriormente para mostrar que CIfA

15. pode induzir à imunidade protetora. Vide Vernachio et al., Antmicro. Agents & Chemo. 50: 511-518 (2006). Nesse modelo de IE, coelhos ou ratos são . usados para simular infecções clinicas que incluem um cateter venoso cen- . tral, bacteremia e disseminação hematogênea para os órgãos distais. A coe- lhos ou ratos com cateter com vegetações estéreis na válvula aórtica é ad- ministrada uma única ou múltiplas injeções intravenosas de um anticorpo e monoclional ou policlonal específico para o antígeno alvo. Subsequentemen- te, os animais são estimulados i.v. com uma cepa de S. aureus ou S. epi- dermidis. Então, após estimulo, tecidos de coração, vegetações cardíacas e adicionais, incluindo rins e sangue, são coletados e cultivados. A frequência de infecção estafilocócica em tecido cardiaco, rins e sangue é então, medi- da. Em um estudo, quando os animais foram estimulados com MRSE ATCC 35984 ou MRSA 67-0, reduções significativas na taxa de infecção foram mostradas usando o preparado de anticorpo policlonal ou anticorpo mono- clonal ao CIfA. Vide Vernachio et al., Antmicro, Agents & Chemo. 50: 511- 518(2006). . O modelo de endocardite infecciosa foi também adaptado para estudos de imunização ativa em coelhos e ratos. Coelhos ou ratos são imu-

| 70/134 nizados intramuscular ou subcutaneamente com antígeno alvo e estimulados . com S. aureus duas semanas depois através da via intravenosa.

Modelo de Pielonefrite No modelo de pielonefrite, camundongos são imunizados nas semanas0O,3es6 (ou outro esquema de imunização apropriadamente espa- çado) com os antígenos alvo.

Subsequentemente, os animais são estimula- dos i.p. ou 1.v. com S. aureus PFESA0266. Após 48 horas, os rins são colhi- dos e a CFU bacteriana é contada.

Anticorpos e Composições de Anticorpo o 10 A invenção ainda proporciona anticorpos e composições de anti- corpo as quais se ligam específica e seletivamente a um ou mais antígenos de uma composição imunogênica da presente invenção.

Em algumas moda- lidades, anticorpos são gerados quando de administração, a um indivíduo, de uma composição imunogênica da presente invenção.

Em algumas moda- 15 . lidades, a invenção proporciona anticorpos purificados ou isolados dirigidos contra um ou mais dos antígenos de uma composição imunogênica da pre- sente invenção.

Em algumas modalidades, os anticorpos da presente inven- . ção são funcionais, conforme medido pela morte bactérias em um modelo de eficácia com animais ou via um ensaio de morte opsonofagocítica.

Em algu- mas modalidades, os anticorpos da invenção conferem imunidade passiva a oe um indivíduo.

A presente invenção ainda proporciona moléculas de polinu- cleotídeo que codificam um anticorpo ou fragmento de anticorpo da invenção e uma célula ou linhagem de célula (tal como células de hibridoma ou outras linhagens de célula manipuladas para produção de anticorpos recombinan- tes)e um animal transgênico que produz um anticorpo ou composição de anticorpo da invenção, usando técnicas bem conhecidas por aqueles versa- dos no campo.

Anticorpos ou composições de anticorpo da invenção podem ser usadas em um método de tratamento ou prevenção de uma infecção estafi- locócica, doença ou condição associada a um Staphylococcus sp. em um . indivíduo, o método compreendendo geração de um preparado de anticorpo policlonal ou monocional e uso do referido anticorpo ou composição de anti-

i 71/134 corpo para conferir imunidade passiva ao indivíduo. Anticorpos da invenção . podem também ser úteis para métodos diagnósticos, por exemplo, detecção da presença de ou quantificação dos níveis de um ou mais antígenos das composições imunogênicas da presente invenção.

EXEMPLOS Os exemplos a seguir demonstram algumas modalidades da presente invenção. Contudo, deve ser entendido que esses exemplos são para ilustração apenas e não se destinam serem definitivos quanto às condi- ções e escopo da presente invenção. Será apreciado que, quando condições o 10 de reação típicas (por exemplo, temperatura, tempos de reação, etc.) são fornecidas, condições acima e abaixo das faixas especificadas podem tam- bêm ser usadas, embora em geral de modo menos conveniente. Todas as partes e percentuais mencionados aqui são em uma base por peso e todas as temperaturas são expressas em graus centigrados, a menos que de outro 15 . modo especificado. Além disso, os exemplos a seguir foram realizados usando téc- i nicas padrões, as quais são bem conhecidas e rotina para aqueles versados . no campo, exceto onde de outro modo descrito em detalhes. Conforme no- tado acima, os exemplos a seguir são apresentados para fins ilustrativos e não deverão ser construídos de qualquer forma que limite o escopo da pre- o sente invenção. Exemplo 1: Produção de Antigenos CIfA e CIfB Fator A de aglutinação (CITA) e B (CIfB) são proteínas na super- fície de S. aureus responsáveis pela ligação à proteínas hospedeiras, inclu- indo fibrinogênio (CIfA, CIfB) e citoqueratina 10 (CIfB). CIfA e CIfB são mem- bros de uma família de proteinas contendo o motivo carboxila terminal LPXTG (SEQ ID NO: 125) que permite que a proteina se torne covalente- mente ligada à superfície celular. CIfA e CIfB pertencem à família de proteí- nas (Microbial Surface Components Recognizing Adhesive Matrix Molecule ouMSCRAMMs) que reconhecem e se ligam à proteinas na matriz extrace- . lular do hospedeiro, tais como fibrinogênio (CIfA e CIfB), fibronectina (FnNbA e FnbB), colágeno (Cna) e outras. Essas proteínas compartilham toda a se-

i 72/134 quência sinalizadora amino terminal que media o transporte à superfície ce- - lular.

As MSCRAMMs também incluem um domínio A que é a região funcio- nal contendo sítio de ligação a ligante para fibrinogênio, fibronectina, elastina e queratina.

O domínio A pode ser seguido por uma região composta de re- petiçõesde serina-aspartato (repetição SD), o qual acredita-se que abranja a camada de peptidoglicana.

A repetição SD é seguida por uma região abran- gendo a membrana que inclui o motivo LPXTG (SEQ ID NO: 125) para liga- ção covalente da proteina à peptidoglicana.

As regiões de ligação a ligante de CIfA e CIfB compreendendo o 10 NIN2N3 do domínio A abrange os aminoácidos 40-559. Os dominios N de CIfA / CIfB foram atribuídos como segue: N1 abrange os residuos 45-220; N2 abrange os resíduos 229-369; e N3 abrange os resíduos 370-559, Vide Deivanayagam et al.

EMBO J. 21: 6660-6672 (2002). Em preparados de CIfA recombinante N1N2N3, descobriu-se que o domínio N1 era sensível à prote- aseeé facilmente clivado ou hidrolisado para deixar N23 como o fragmento recombinante de ligação a ligante estável.

Vide Deivanayagam et al.

EMBO J. 21: 8650-6672 (2002). Similarmente, foi demonstrado que o domínio N1 . de CIfB é também sensivel à protease e poderia ser facilmente clivado pela metaloprotease de S. aureus (McAleese, F.

M. etal.

J.

Biol.

Chem. 2001, 276, páginas 29969-29978). A estrutura de cristal do fragmento N23 que se e liga ao fibrinogênio do dominio A de CIfA revelou que N2 e N3 são domina- dos por beta fitas anti-paralelas.

Além das beta fitas anti-paralelas, o domínio N2 contém uma única alfa hélice e duas hélices 3,97 e o domínio N3 contém três hélices 3,9. Vide Deivanayagam et al.

EMBO J. 21: 6660-6672 (2002). Alinhamento de sequência de N2 e N3 revela apenas 13% de identidade de sequência e 36% de similaridade de sequência sobre seus comprimentos.

Vide Deivanayagam et al.

EMBO J. 21: 6660-6672 (2002). À topologia dos domínios N2 e N3 é similar ao enovelamento clássico de IgG e esses foram propostos como sendo novas variantes do enovelamento de IgG Vide Deivanayagam et al.

EMBO J. 21: 6660-6672 (2002). - Formas recombinantes de CIfA usadas em uma composição i- munogênica conforme descrito aqui são fragmentos de CIfA compreendendo um ou mais dos domínios N, por exemplo, NIN2N3, N2N3 e são referidas . aqui como "CIfA recombinante" ou "rCIfA”, Além disso, qualquer rCIfA deverá ser uma que mantém a estrutura nativa dos domínios N individuais e epíto- pos críticos, mas não interfere com processos normais dos indivíduos imuni- zados após administração (isto é, sem ligação a fibrinogênio). Estudos de mutação mostraram que a mutação Y338A (N2) eliminou completamente a ligação do fragmento N23 ao fibrinogênio. (Essa posição Y338A refere-se a uma alteração de uma tirosina para uma alanina na posição 338 na forma imatura da sequência polipeptídica com a sequência líder ainda presa.

Essa o 10 alteração pode ser observada na posição 310 na forma madura do polipepti- deo de CIfA com mutação de SEQ ID NO: 123 que demonstra uma falta de ligação ao fibrinogênio). Vide Deivanayagam et al.

EMBO J. 21: 6660-6672 (2002). Portanto, a mutação Y338A foi adotada para todos os fragmentos de

CIfA nos estudos a seguir.

Similarmente, formas recombinantes de CHKfB usadas em uma . composição imunogênica conforme descrito aqui são fragmentos de CIfB compreendendo um ou mais dos domínios N, por exemplo, NIN2N3, N2N3 ' e são referidas aqui como "CIfB recombinante" ou "rCIfB". Além disso, qual- quer rCIfB deverá ser uma que mantém a estrutura nativa dos domínios N individuais e epítopos críticos, mas não interfere com processos normais dos o indivíduos imunizados após administração (isto é, sem ligação a fibrinogê- nio) (vide, por exemplo, Walsh, E.J. et al.

Microbiology (2008), 154, 550-

558). CIfA e CIfB: Visão Geral de Estratégia de Clonagem

As diferentes formas de proteina rCIfA usada para gerar dados de eficácia pré-clínica incluem HisCIfAi23; T7CIfAiasy; TTCIAN 23); Y338A; CIfAnza) E CIfAN23Y338A.

Vide Figura 1. O gene de CIfA contém a sequên- cia de codificação de região A de S. aureus PFESA0237, correspondendo aos resíduos 40-559. O quadro de leitura clonado de S. aureus foi fundido à HisTag N-terminal e sequências ligante do vetor (MRGSHHHHHHGS SEQ . ID NO: 127) junto com três sequências de codificação adicionais (KLN) in- troduzidas no C-término (vide abaixo para procedimento detalhado). A prote-

ina expressa a partir desse vetor foi usada para todos os experimentos, on- . de ela é referida como HisCIfAmi123)- As diferentes formas de rC!fA foram derivadas da região A (resi- duos 40-559 de CIfA expressos por S. aureus PFESA0237 (fileira superior)). A HIisCIfAmiaa) é expressa usando o promotor T5 contido em pQE30 e todas as outras formas são expressas usando o sistema de expressão pET basea- do em T7. Duas formas de CIfB (T7CIfB N1IN2N3 e CIfB N23) foram utiliza- das para estudos pré-clínicos com animais, * 10 Procedimento de Clonagem de CIfA A sequência de codificação de CIfA correspondendo aos resi- duos de aminoácido 40-559 da cepa PFESA0237 de S, aureus foi clonada e a mutação, Y338A, foi introduzida para eliminar a ligação ao fibrinogênio. O gene de CIlfA com mutação foi introduzido em um vetor de expressão de

15. RNA polimerase T7, pET9a (Novagen) para proporcionar o plasmídeo . PLP1179, A sequência de DNA da região compreendendo o promotor T7 e à região de codificação em pLP1179 é SEQ I1D:124. O vetor de expressão foi . transformado em E. coli BLR(DES) (Novagen) para a produção de CIfA re- combinante. A construção de T7CIfAn123)Y338A envolveu várias etapas, Um o sumário das etapas de clonagem usadas para construir o plasmídeo de ex- pressão final, pLP1179, é mostrado na Figura 2. A sequência de DNA de cifA presente em pQECIf40 corresponde aos residuos de aminoácido 40-559 de CIfA que foi originalmente clonada no sítio de clonagem BamHI/Hindlll de pOE30. Isso cria uma fusão HisTag na extremidade N-terminal de CIfA e a adição de três residuos no C-término. A região de codificação de CIfA presente em (AmpR) pQECIf40 foi subclonada no vetor KanR pET 27b (Novagen) para criar o pl P1137. Além disso, a se- quência de DNA de cifA correspondendo aos residuos de aminoácido 221- 559 foi clonada no sitio de clonagem Ndel-Hindlll do pET27b para criar o . PLP1134. A HisTag N-terminal de CIfA foi substituída pela T7 N-terminal por meio de subclonagem do fragmento de DNA BamHI-Blpl do pQECI40 em i pET9a (Novagen) para criar o pLP1153. A sequência de codificação de . T7CIfAmni23, presente em pl.P1153 contém 11 resíduos de aminoácido N- terminais da tag T7 de pET9a, seguido por três resíduos de aminoácido de sequências ligante mais os três resíduos derivados de ligante C-terminais originalmente presentes em pQE3SOCIM40. A mutação Y338A foi primeiro in- troduzida na sequência de codificação CIfAmn23, de plLP1134 para criar o PLP1168. Depois, um fragmento de DNA Pstl-SnaBIl contendo a mutação Y338A de CIfAmas, de pLP1168 foi substituída pelo Pstl-SnaBI da sequência de codificação de T7CIfAmi23y de pl P 1153 para criar o pLP1171. Um sítio de o 10 ligação ribossômica interna presente na sequência de codificação de T7CIfAws23)Y338A de plLP1171 foi alterado por meio de mutações silencio- sas em posições de DNA 339 e 342 do ORF de T7 rCIfA Y338A, trocando de G para T e G para A, respectivamente.

O plasmídeo resultante, pL.P1176, foi, então, usada para remover os três resíduos estranhos, originalmente derivados de pQESOCIF40 entre a tag T7 e o início da região de codificação . de CITA.

Os três resíduos C-terminais derivados de ligante foram também removidos nesse momento. ' A rCIfA expressa pelo plasmídeo resultante, pLP1179 (Figuras 2 e 3), contém apenas os 11 aminoácidos N-terminais fundidos aos resíduos 40-559 de CIfAni23Y338A.

A sequência de DNA da região compreendendo o o promotor 17 e a sequência de codificação de T7 rCIfAi23Y338A de PLP1179 é SEQ ID NO 124. Cepas Bacterianas e Plasmídeos A parte principal do plasmídeo pET9a (obtido da Novagen) foi usada para construção de plLP1179, o qual expressa T7CIfAn123)Y338A a partir de um promotor T7. O plasmídeo contém o gene de resistência à ca- namícina (KanR) para seleção positiva.

A cepa hospedeira de E. coli BL21(DE3) [F- ompT hsdSg (re mg) gal dem (DE3)] (Novagen) foi original- mente usada para obter expressão de T7 CIfAmi23,Y338A.

A designação DE3 denota o lisógeno lambda contendo o gene de RNA polimerase T7 sob o . controle do promotor lacUV5 (IPTG induzível) que é usado para induzir à expressão de RNA polimerase T7 e subsequente transcrição do promotor T7 proximal à sequência de codificação CIfAw123)Y338A presente em pLP1179. . Quando de recebimento de informação de que a cepa hospedeira BL21(DE3) lisogênica é capaz de indução de fago litico quando de fermen- tações em larga escala, a cepa hospedeira foi trocada para a cepa hospedei- ra reci BLR(DE3S) [F- ompT hsdSs (rems) gal dom A(sri recA)3SO6::Tn10(TcR) (DE3)] (Novagen). Produção e Purificação de CIfA Para a produção de CIfA, E. coli BLR(DE3)/pLP1179 foi crescida em meio definido no modo descontínuo em biorreatores com glicose.

Quan- o 10 doa cultura atingiu uma densidade óptica (ODço9) entre 30-50, a expressão de CIA foi induzida mediante a adição de IPTG.

A cultura foi colhida entre 3- 16 horas pós-indução.

As células foram rompidas e a fração solúvel clarificada foi cole- — tada.

Após a adição de sulfato de amônio, o material foi aplicado a uma co- luna contendo resina Fenil-Sepharose e eluído.

Frações contendo CIfA fo- ram identificadas, submetidas à diálise e carregadas sobre uma coluna de troca de ânions (Q-Sepharose). Após eluição com um gradiente de sal, fra- . ções contendo CIfA foram identificadas, concentradas por meio de ultrafiltra- ção e carregadas sobre uma coluna de exclusão de tamanho (Superdex-75). Frações contendo CIfA foram identificadas e agrupadas.

A pureza da CIfA o nesse ponto era cerca de 98%, conforme medido por SDS-PAGE.

Clonagem e Purificação de CIfB NIN2N3 A sequência de codificação de CIfB correspondendo aos resi- duos de aminoácido 44-542 foi clonada em um vetor de expressão de RNA polimeraseT7, pET28a (Novagen) para proporcionar o plasmideo pPX1189. O vetor de expressão foi transformado em E. coli BLR(DE3) (Novagen) para a produção de CIfB recombinante (Vide Walsh, et al., Microbiology 154: 550- 558 (2008).) Para a produção de CIfB, E. coli BLR(DE3)/pLP1179 foi crescida em meio definido no modo descontínuo em biorreatores com glicose.

Quan- - do a cultura atingiu uma densidade óptica (ODgso5) entre 30-50, a expressão de CIfB foi induzida mediante a adição de IPTG.

A cultura foi colhida entre 3- |

16 horas pós-indução.

' As células foram rompidas e a fração solúvel clarificada foi cole- tada. O pH da fração solúvel foi ajustado para um pH de cerca de 3,2e as impurezas precipitadas foram removidas. O pH da fração solúvel contendo CIfBfoireajustado para um pH de cerca de 8,0 e submetida à diálise para remover os sais. Após a adição de sulfato de amônio, o material foi aplicado a uma coluna contendo resina Fenil-Sepharose e eluído. Frações contendo CIfB foram identificadas, submetidas à diálise e carregadas sobre uma colu- na de troca de ânions (Q-Sepharose). Após eluição com um gradiente de e 10 sal, frações contendo CIfB foram identificadas, concentradas por meio de ultrafiltração e carregadas sobre uma coluna de exclusão de tamanho (Su- perdex-75). Frações contendo CIfB foram identificadas e agrupadas. A pure- za do CIfB nesse ponto era cerca de 94%, conforme medido por SDS-PAGE.

Exemplo 2: Produções de Antigenos: MntC de Staph Aureus Clonagem de MntC Lipidada de S. aureus - MntC recombinante foi originalmente clonada da cepa Mu50 de S. aureus. A sequência de codificação de rMntC foi amplificada através de PCR do DNA genômico de S. aureus Mu50. Dois pares de primers agrupa- dos foram usados para a amplificação (Tabela 2). O primeiro par de primers, &SSA926-MntC "ups" e 3'SA926-MntC "down", se alinhou à sequência a mon- o tante e a jusante do quadro de leitura abertura da rMntC. O segundo conjun- to de primers se alinha à sequência de codificação de rMntC, permitindo amplificar a sequência correspondendo aos resíduos de aminoácido 19-309. Sitios de enzima de restrição foram incorporados nas extremidades 5' des- ses primers para facilitar a clonagem direcional. PCR foi realizada em um Peltier Thermal Cycler (MJ Research Inc, Walthan, MA) com TaKaRa Pri- meSTAR HS DNA Polymerase Premix (Takara Bio EUA, Madison, WI). O produto de PCR foi purificado pelo QIAEX II (Qiagen, Valencia, CA), clivado com as endonucleases de restrição apropriadas (New England BioLabs, Ipswich, MA) e subclonado no vetor de expressão acionado por promotor ' araBAD, pBAD18Cm. Esse vetor também contém o peptídeo sinalizador da : lipoproteina P4 de H. influenza. O produto de POR MntC foi subclonado in-

frame a jusante do peptídeo sinalizador P4 para criar pLP1194. A sequência ' de DNA da região de codificação de MntC do plLP1194 é mostrada em SEQ ID NO: 120. A MntC expressa a partir do pLP1194 é uma lipoproteina.

O DNA de plasmídeo recombinante foi sequenciado pela ABI PRISM BigDye'"M Terminator V3.1 (Applied Biosystems, Foster City, CA) e a proteina recom- binante foi expressa em E. coli BLR (NOVAGEN) para a produção de rMntC lipidada.

Produção e Purificação de MntC Lipidada Para a produção de MntC lipidada, E. coli BLR/pLP1194 foi oe 10 crescida em meio definido no modo descontínuo em biorreatores com glico- se.

Quando a cultura atingiu uma densidade óptica (ODgsoo) de cerca de 60, a expressão de rMntC foi induzida trocando a alimentação para uma mistura de glicose e arabinose.

A cultura foi colhida cerca de 24 horas pós-indução.

As células foram rompidas e a fração insolúvel foi coletada.

MntC lipidada foi encontrada associada às membranas celulares em virtude . da modificação lipídica.

MntC foi extraída da fração de membrana com um detergente (Zwittergent ZW-312). Após remoção dos resíduos insolúveis, a MntC lipidada foi encontrada na fração solúvel.

A fração solúvel foi aplicada a uma coluna contendo uma resina no modo misturado e eluída com um gradiente linear de sal e pH.

Frações contendo MntC foram identificadas e o agrupadas.

Sulfato de amônio foi adicionado à reserva e o material foi apli- cado a uma coluna contendo Butil-Sepharose e eluída.

Frações contendo MntC foram identificadas, dessalinizadas e carregadas sobre uma coluna de troca de cátions (SP-Sepharose). Após eluição com um gradiente de sal, frações contendo rMntC foram identificadas e agrupadas.

Clonagem de MntC Não Lipidada de S. aureus A sequência de DNA empregada para expressar rMntC não lipi- dada foi isolada através de amplificação por PCR do plasmídeo pl P1194. À sequência resultante corresponde aos residuos de aminoácido 19-309 e não contém a sequência sinalizadora que dirige à secreção e lipidação, A se- ' quência de DNA da região de codificação de rMntC do pLP1215 é encontra- da em DNA SEQ ID NO: 120.

Para criar pLP1215, MntC foi amplificada através de PCR a par- ' tir de pLP1194. A sequência de DNA de MntC presente em pl P1215 corres- ponde aos resíduos de aminoácido 19-309 e o primeiro códon para esse construto foi introduzido no primer "forward" usado na amplificação do gene.

S Os primers usados para PCR também contêm sítios de enzima de restrição nas extremidades 5' para facilitar clonagem direcional (Tabela 2). PCR e pu- rificação do gene amplificado foram realizadas conforme descrito acima. O produto de PCR purificado foi clivado com endonucleases de restrição apro- priadas (New England BioLabs, Ipswich, MA) e subclonado no vetor de ex- o 10 pressão acionado por promotor T7, pET28a (Novagen, Madison, WI). O DNA de plasmídeo recombinante plP1215 foi sequenciado pelo ABI! PRISM BigDye"" Terminator V.3.1 (Applied Biosystems, Foster City, CA) e a protei- na recombinante foi expressa em E. coli BLR(DES). DNA de plasmídeo para PLP1215 foi purificado e usado para transformar E. coli HMS174(DE3) para 15 . avaliar a expressão de proteína, . Tabela 2: Primers para MntC Construtos de expressão|Nome do primer — Sequência (5'-3') ' MntC lipidada (pl.P1194)/5'SA926-MntCups /CAC AAA ATT TAC GAA TAG; AAA GAA ACG AG (SEQ |D NO: 109) 13'SAG26-MntCdownAAA ATA TTG GAG ATA CCA o ATA TTT TAG GTT G (SEQ ID NO: 110) 5'BamHISA926 Mn CTT GGA TCC GGT AC Cc GGT GGT AAA CAA AGC AGT G (SEQ ID NO: 111) I3'SphISA926 MntC CTT GCA TGC TTA

CAT GCT TCC GTG TAC AG C (SEQ ID NO: 112) Mntc não lipidadaS'NcolMnto CTT CCA TGG GTA CTG (PpLP1215) GTG GTA AAC AAA GCA G (SEQ ID NO: 113) . 3'BIpIMntC CTT GCT CAG CAT TA

C ATG CTT CCG TGT ACA G - (SEQ ID NO: 114)

* 80/134 Oligonucleotideos sintéticos usados para gerar construtos de ' IMAC.

Sítios de endonuclease de restrição são sublinhados.

Os nucleotí- deos em negrito indicam o primeiro códon para o construto de rMntC não lipidada.

Produção e Purificação de rMntC Não Lipidada Para a produção de rMntC não lipidada, E. coli HMS174(DE3)/ PLP1215 foi crescida em meio definido no modo descontínuo em biorreato- res com glicose.

Quando a cultura atingiu uma densidade óptica (ODgsoo) de cerca de 60 a 80, a expressão de rMntC foi induzida pela adição de IPTG.

À o 10 —culturafoi colhida cerca de 24 horas pós-indução.

As células foram rompidas e a fração solúvel clarificada foi coletada.

O lisato foi aplicado a uma coluna contendo uma resina de troca de cátions (SP-Sepharose) e eluído com um gradiente de sal linear.

Frações contendo MntC foram identificadas.

Após a | adição de sulfato de amônio, o material foi aplicado a uma coluna contendo resina Fenil-Sepharose e eluído, Após eluição, frações contendo rMntC fo- - — ram identificadas, agrupadas e dessalinizadas.

A pureza da rMntC nesse ponto era >95%, conforme medido por SDS-PAGE.

Exemplo 3: Produção de Polissacarideos Capsulares CP5 e CP8 Nesse exemplo, a produção de vários tamanhos de polissacari- deos capsulares tipo 5 e 8 de S. aureus é descrita.

As estruturas dos polis- o sacarídeos CP5 e CP8 são mostradas na Figura 4. Os métodos descritos aqui são eficazes na produção de CP5 e CP8 com pesos moleculares osci- lando de cerca de 50 kDa a 800 kDa.

Baseado nas características de cres- cimento e quantidade de cápsula produzida, a cepa PFESA0266 foi escolhi- da para produção de CP5, enquanto que as cepas PFESAO0O0O5 ou PFE- SA0286 foram usadas para a produção de CP8. Foi mostrado que as cápsu- las isoladas das cepas PFESAOOOS5 e PFESAD0286 eram idênticas.

Para produção de polissacarídeo capsular, as cepas foram cres- cidas em um meio complexo consistindo primariamente uma fonte de carbo- no (lactose ou sacarose), farinha de soja hidrolisada como a fonte de nitro- ' gênio e metais residuais.

As cepas foram crescidas em biorreatores durante 2a5dias.

* 81/134 Purificação de CP5 e CP8 usados para o preparo de conjugados ' foi realizada através de dois métodos diferentes que contam com temperatu- ra elevada e baixo pH para realizar a liberação de cápsula da célula e redu- zir o peso molecular do polissacarídeo. O peso molecular resultante é de- pendentedo tempo, temperatura e pH da etapa de hidrólise.

Caracterização de CPS e CP8 foi realizada usando as técnicas especificadas na Tabela 3. Polissacarídeos capsulares produzidos através desse procedimento resultam em polissacarideos puros com baixos níveis de contaminantes de proteína, NA, peptidoglicana e TA. Vide Tabelas 4e 5.

o 10 Tabela3: Caracterização de CP5 e CP8 de S. aureus Purificados Especificidade Ensaio Proteína residual Ensaio colorimétrico de Lowry Ácidos nucleicos residuais Varredura a 260 nm Ácido teicóico residual Ensaio colorimétrico de fosfato Peptidoglicana residual HPAEC-PAD . Tamanho SEC-MALLS Composição HPAEC-PAD ! Identidade 1H-RMN ou reação com mAb específico O-acetilação 1H-RMN Concentração MALLS-RI ou HPAEC-PAD o No primeiro método, após liberação da cápsula da célula e redu- ção de peso molecular, o preparado de cápsula é tratado com um coquetel de enzimas (ribonuclease, deoxiribonuclease, lisozima e protease) para di- gerir as impurezas. Após incubação, impurezas residuais são precipitadas mediante a adição de etanol (concentração final de cerca de 25%). Após remoção do etanol residual, solução contendo cápsula foi carregada sobre uma coluna de troca de ânions (Q-Sepharose) e eluída com um gradiente de sal linear. Frações contendo cápsula foram agrupadas e tratadas com meta- periodato de sódio. Esse tratamento resultou na hidrólise oxidativa de con- taminante ácido teicoico residual, mas não afeta o CP5 ou CP8. A reação foi ' resfriada mediante a adição de etileno glicol. O material foi concentrada e . diafitrada contra dH;O para remover quaisquer reagentes e subprodutos

' 821134 residuais, : O segundo método que foi usado para produzir cápsulas não envolve o uso de enzimas para digerir as várias impurezas derivadas de cé- lula. Nesse método, após liberação da cápsula da célula e redução de peso molecular, o caldo de fermentação hidrolisado foi clarificado através de mi- crofiltração, seguido por ultrafiltração e diafiltração. A solução foi tratada com carvão ativado para remover impurezas. Após tratamento com carvão, o ma- terial foi tratado com meta-periodato de sódio para oxidar o ácido teicócico residual, seguido por resfriamento com propileno glicol. O material foi con- e 10 centrado e diafiltrado contra dH2O para remover quaisquer reagentes e sub- produtos residuais, Cápsulas produzidas usando qualquer método resultam em po- lissacarideos puros com baixos níveis de contaminantes de proteina, ácido nucleico e ácido teicoico, Os métodos descritos podem ser usados para pro- duzir faixas específicas dos polissacarideos de alto peso molecular sim- plesmente variando as condições de hidrólise. Uma faixa particularmente vantajosa de polissacarídeos de alto peso molecular, oscilando de 70 a 150 ' kDa, é útil na produção de composições imunogênicas através de conjuga- ção de polissacarídeo a uma proteína veículo. Exemplos de polissacarídeo capsular de alto peso molecular ob- o teníveis por meio dos métodos descritos aqui são mostrados na Tabela 4 abaixo. Lotes de CP5 de alto MW purificados também tinham alta pureza, conforme indicado por nenhum TA, peptidoglicana e baixo teor de proteína residual. Vide Tabela 4. A faixa de pesos moleculares nesses exemplos a- brangia132,7kDa a 800 kDa e os polissacarideos puríficados eram altamen- te O-acetilados, oscilando de 90-100% e 100% para N-Acetilação. Vide Ta- bela 4.

Exemplos de polissacarídeo capsular de baixo peso molecular obteníveis por meio dos métodos descritos aqui são mostrados na Tabela 5 abaixo. Lotesde CP8 de baixo MW purificados tinham alta pureza, conforme . indicado por nenhum ácido teicoico (TA), peptidoglicana e baixo teor de pro- teina residual. Vide Tabela 5. A faixa de menores pesos moleculares abran-

S 83/134 gia 20,4 kDa a 65,1 kDa e os polissacarídeos purificados eram altamente O- . acetilados, oscilando de 75-96%. Os níveis de contaminação por ácido nu- cleico eram baixos, oscilando de 0,5-%-2 45%, Vide Tabela 5, Tabela 4: Caracterização de Preparados de CP5 (kDa) (mg/ml) | (%) RMN RMN (%) RMN [8001 [3164 100 —— [Passou — [100 a 2 js Passos — 100 3 [0675 aa passar 1108 [8 ass fosse a rasa No oe 5 Tabela5S: Caracterização de Preparados de CP8 rificado mg — (g/mol) (Lowry) —%/260 nm) % (pe-RMN % (peso/pe-so) /so/peso) Bb bo fr be o 6 se ao Ra Ro ia RE er N:) ot ss Bs detec-l0,5 94 ção EMEA RAM mo ' 1 bro bs Bo” 5 Seleção de Peso Molecular de Polissacarídeos Capsulares Essa análise cinética demonstra que uma ampla faixa de pesos oe moleculares de polissacarídeos capsulares pode ser gerada através dos mê- todos descritos aqui.

Inicialmente, polissacarideos maiores foram produzidos pelas células bacterianas e, subsequentemente, uma faixa de peso molecu- lar desejada pode ser selecionada e, então, purificada através de manipula- ção das condições de pH e calor e etapas de hidrólise, Tratamento térmico do caldo de fermentação de S. aureus foi uma etapa de processo entre a fermentação e recuperação de CP.

Essa e- tapa de processo usa calor para tratar caldo com pH ajustado durante um período especificado.

Os objetivos do tratamento térmico em baixo pH eram matar células, inativar enterotoxinas, liberar o polissacarídeo ligado à célula ' e reduzir o peso molecular durante um período especificado.

Dentre esses objetivos, a redução de peso molecular foi a mais lenta em termos de tempo

, 84/134 de processamento requerido nessa etapa.

Portanto, os outros objetivos fo- ' ram inevitavelmente obtidos dentro do tempo de tratamento considerado.

Tratamento Térmico Condições de temperatura e pH para seleção de várias faixas de peso molecular de polissacarideos capsulares foram determinadas.

O pH do caldo foi ajustado com ácido sulfúrico concentrado.

Então, a temperatura do caldo foi elevada para o valor configurado.

O tempo de tratamento térmico começou tão logo a temperatura atingisse o ponto de ajuste.

Quando o tem- po de tratamento desejado foi atingido, o caldo foi esfriado para a temperatu- e 10 ra ambiente.

Amostras do processo foram tomadas para determinar a con- centração e peso molecular do polissacarideo por meio de sistemas de H- PLC e SEC-MALLS, respectivamente.

Os dados de MW foram usados na análise cinética.

Os perfis de MW foram determinados com o tempo de CP5 em um pH de 4,0, 4,5 e 5,0 e CP8 em um pH de 3,5, 4,0 e 5,0. Vide Figuras SAeSB.

A cinética de hidrólise ácido suave de polissacarídeos foi condu- zida usando CP-5 e CP-8 purificados obtidos do processo.

A solução de po- ' lissacarídeo purificado foi ajustada para o pH desejado para o experimento com ácido sulfúrico.

As amostras foram colocadas em um banho de óleo equipado com um sistema de controle de temperatura de precisão.

Cada o amostra foi tomada em um intervalo de tempo predeterminado e foi esfriada em um balde de gelo.

Ao final do experimento, uma alíquota de tampão de Tris a 1M (pH de 7,5) foi adicionada à amostra para ajustar o pH de volta para cerca de 7. As amostras foram analisadas por um sistema SEC- MALLS.

Os dados de MW foram usados na análise cinética.

O efeito da temperatura sobre os perfis de MW de CP5 em um pH de 4,5 e CP8 em um PH de 3,5 foi determinado com o tempo.

Vide Figuras 6A e 6B.

Esse proce- dimento de hidrólise ácida pode ser implementado usando a cultura de fer- mentador ou em um estágio intermediário de purificação ou, conforme mos- trado aqui, usando o polissacarideo purificado.

Outras etapas de redução de , peso molecular, tais como ultrassom ou cisalhamento, podem ser similar- mente implementadas.

Ú 85/134 Resultados - O efeito do pH sobre a redução de MW em tratamento térmico é mostrado nas Figuras SA e 5B para CP-5 e CP-8, respectivamente. Pode ser observado que um menor pH foi mais eficaz na redução de tamanho do po- lissacarídeo. Os dados também sugerem que CP-5 foi mais difícil hidrolisar do que o CP-8 no mesmo pH. Considerando os perfis de CP8, faixas de pe- sos moleculares entre 300 kDa e 600 kDa podem ser geradas usando um pH de 5 a 95 “C durante entre 15 minutos e 120 minutos. Da mesma forma, escolha de um pH de 4 a 95 “ºC durante entre 15 minutos e 120 minutos po- oe 10 de proporcionar polissacarideos CP8 com faixas de peso molecular entre 250 kDa e 450 kDa. Além disso, escolha de um pH de 3,5 a 95 “C durante entre 15 minutos e 120 minutos pode proporcionar polissacarídeos CP8 com faixas de peso molecular entre 120 kDa e 450 kDa, O efeito da temperatura sobre a redução de MW foi conduzido usando os polissacarídeos purificados recuperados d processo de recupera- ção. Os resultados são mostrados nas Figuras 6A e 68B. Conforme mostrado, quanto maior a temperatura, mais rápida a taxa de hidrólise e mais ampla as faixas de peso molecular dos polissacarídeos produzidos com o tempo. Uso de uma menor temperatura, 55"C versus 95ºC no mesmo pH, produz uma faixamais limitada de pesos moleculares do polissacarídeo.

o Além disso, a Figura 7 demonstra a correlação entre o peso mo- lecular de CP5 e CP8 purificados com o tempo de tratamento para hidrólise ácida suave. O polissacarideo purificado é o produto final obtido do processo de recuperação detalhado anteriormente. Conforme mostrado na Figura 7, o aumento no tempo de tratamento térmico da cepa PFESA0266 de S. aureus em um pH de 4,5 resulta na geração de polissacarideos CP5 de menor peso molecular, enquanto que tempos de tratamento mais curtos em um pH de 4,5 resultam na geração de polissacarideos CP5 de maior peso molecular. O tamanho dos polissacarideos CP5 oscilava de cerca de 90 kDa a cerca de 220 kDa, dependendo da extensão de tempo de tratamento térmico em bai- ' xo pH (4,5). Da mesma forma, o aumento no tempo de tratamento térmico da cepa PFESAOOOS de S. aureus em um pH de 3,5 resulta na geração de

" 86/134 polissacarideos CP8 de menor peso molecular, enquanto que tempos de . tratamento térmico mais curtos em um pH de 3,5 resultam na geração de polissacaríideos CP8 de maior peso molecular.

O tamanho dos polissacari- deos CP8 oscilava de cerca de 80 kDa a cerca de 220 kDa, dependendo da extensão de tempo de tratamento térmico em baixo pH (3,5). A correlação entre o tempo de tratamento térmico em baixo pH e o tamanho dos polissa- carideos CP5 e CP8 purificados, conforme mostrado nesse estudo, permite uma estimativa do tempo de tratamento requerido para produzir polissacari-

deos purificados com uma faixa especificada de peso molecular. e 10 É importante notar que, conforme demonstrado acima, a faixa completa de pesos moleculares de polissacarideos capsulares para CP5 e CP8 de 20 kDa a mais de 800 kDa pode ser produzida, liberada e purificada.

Os métodos descritos podem ser usados para produzir faixas específicas de polissacarideos capsulares de alto peso molecular desejados.

Uma faixa particularmente vantajosa de polissacarídeos capsulares tipo 5 e tipo 8 de alto peso molecular pode ser gerada a partir desses métodos, tendo pesos moleculares oscilando de 70 a 150 kDa.

Vide Tabela 6. Essa faixa de pesos moleculares de polissacarídeo capsular é útil na produção de composições imunogênicas através de conjugação do polissacarídeo a uma proteína vei- culo.

Altermativamente, essa faixa vantajosa de polissacarideo capsular CP5 oe e CP8 de alto peso molecular oscila de 80 a 140 kDa.

Vide Tabela 6, Outra faixa vantajosa de polissacarideo capsular CP5 e CP8 de alto peso molecu- lar é de CP5 e CP8 de 90 a 130 kDa ou de 90 a 120 kDa.

Vide Tabela 6. As condições usadas para gerar o polissacaríideo capsular CP5 tendo uma faixa de peso molecular de cerca de 100 a 140 kDa são como segue: 95ºC, pH de 4,5 durante 135 minutos.

As condições usadas para gerar o polissacarideo capsular CP8 tendo uma faixa de peso molecular de cerca de 80 a 120 kDa são como segue: 95ºC, pH de 3,5 durante 300 minutos. »

NE. 87/134 ' Tabela 6: Produção de CP5 e CP8 com uma Faixa Específica de Alto Peso ; Molecular 1 98 142 3 12 ; 6 oa COM Pa 63 74 vo mo e ar BND | ND = não feito Exemplo 4: Conjugação de Polissacarídeos Capsulares CP5 e CP8 ao CRM, i Esse exemplo descreve processos e ensaios de caracterização usados na produção de conjugados CPS-CRM:s; e CP8-CRM1s; de S. aureus.

Várias químicas de conjugação foram avaliadas para conjugação de polissacarideos capsulares CP5 e CP8 de S. aureus a uma proteina veí- e 10 culo.

Conjugação usando PDPH (3,2-piridilditio)-propionil hidrazida) resulta em uma ligação covalente de tivéter e CDICDT (1,1-carbonildiimidazola/1,1- carbonil-di-1,2,4-triazola) resulta em um ligante com um carbono ou nenhum carbono entre o CP e a proteína veículo.

Conjugação de CP ao CRM:«7 através de Quimica de Conjuga- çãoPDPH À química de conjugação com PDPH é um processo com múlti- plas etapas que envolve ativação do polissacarídeo, remoção do grupo de proteção tiol, purificação do intermediário polissacarídico ativado, ativação e purificação da proteina CRM;s7; e conjugação dos componentes ativados, “ 20 seguido por purificação.

Após introdução de um grupo tiol contendo ligante : ao polissacarideo e um grupo haloacetila na proteina veículo CRM:67, polis-

: 88/134 | sacarideos CP5 e CP8 de S. aureus foram ligados à proteína veiculo através , de uma ligação de tioéter. Os grupos bromoacetila foram introduzidos na proteina CRM157 através de reação de grupos amina com o N-hidróxi- succimida éster de ácido bromoacético. Para gerar CP tiolado, os grupos carboxilato ativados com carbodiimida de ácido N-acetilmanosaminourônico no CP foram acoplados ao grupo hidrazida do ligante heterobifuncional de hidrazida sulfidrila-reativo, 3-(2-piridilditio)-propionil hidrazida (PDPH). Tióis de CP PDPH-tiolado, gerados por meio de redução com DTT e purificado através de SEC sobre uma coluna Sephadex G25, reagiram com grupos e 10 —bromoacetila da proteina ativada, resultando em ligação de tioéter covalente formada por meio de deslocamento de bromo entre o CP e a proteína. Gru- pos bromoacetila não reagidos foram "revestidos" com hidrocloreto de ciste- amina (hidrocloreto de 2-aminoetanotiol). A mistura de reação foi, então, concentrada e diafiltrada. Os grupos bromoacetila não conjugados restantes foram revestidos com hidrocloreto de cisteamina para assegurar que ne- nhum grupo bromoacetila reativo era deixado após conjugação. Isso formou uma ligação covalente entre a extremidade tiol da cisteamina e o grupo ace- tila sobre o resíduo de lisina após deslocamento de bromo.

Tiolação de Polissacarideo Capsular de S. aureus com PDPH O polissacarideo foi primeiro ativado por meio de tiolação com e PDPH. O polissacarídeo foi misturado com uma solução de estoque de PD- PH recentemente preparada (250 mg/ml. em DMSO), uma solução de esto- que de EDAC (90 ma/mL em diH2O) e solução de estoque de tampão MES (0,5 M, pH de 4,85) para fazer uma solução final de MES a 0,IM e 2e 4 mg de CP/mMl enquanto se mantinha uma proporção em peso de CP:PDPH:EDAC de 1:5:3 para CP5 e 1:0,6:1,25 para CP8. Essa mistura foi incubada durante 1 hora em temperatura ambiente e, então, submetida à diálise contra um volume de 1000X de H,O destilada quatro vezes usando um dispositivo de diálise com MWCO de 3500 em entre 4º e 8ºC para remo- veroPDPH não reagido. O polissacarideo PDPH-ligado foi feito em DTT a . 0,2 M e incubado em temperatura ambiente durante 3 horas ou durante a noite em entre 4 e 8ºC. DTT em excesso, bem como os subprodutos da rea-

S 89/134 ' ção, foram separados do sacarídeo ativado através de SEC usando resina . Sephadex G25 e água destilada como a fase móvel. Frações foram ensaia- das através do ensaio DTDP para grupos tiol e frações tiol-positivas que elu- iram próximo do volume vazio da coluna foram agrupadas. O grupo de fra- çõesfoiensaiado por meio dos ensaios de PAHBAH e O-acetila para deter- minar o grau de ativação, o qual é expresso como um percentual molar das unidades de repetição contendo um grupo tiol (concentração molar de ti- óis/concentração molar de unidades de repetição). O polissacarídeo ativado foi liofilizado e armazenado a -25ºC até necessário para conjugação.

o 10 Ativação de Proteína Veículo Separadamente, a proteina veículo foi ativada por meio de bro- moacetilação. CRM;57 foi diluído para 5 mg/ml com NaCl a 0,9% tamponado com fosfato a 10 mM, pH de 7 (PBS) e, então, com NaHCO; a 0,1 M, pH de 7,0, usando solução de estoque a 1 M. O N-hidróxi-succinimida éster de áci- do bromoacético (BAANS) foi adicionado em uma proporção de CRM157:BAANS de 1:0,25 (peso:peso) usando uma solução de estoque de BAANS em 20 mg/mL de DMSO. Essa mistura de reação foi incubada a en- tre 4 e 8ºC durante 1 hora, então, purificada usando SEC sobre Sephadex G-25. O CRM; ativado purificado foi avaliado por meio do ensaio de Lowry para determinar a concentração de proteína e, então, diluído com PBS para ) 5 mga/mL. Sacarose foi adicionada a 5% peso/vol como um crioprotetor e a proteína ativada foi congelada e armazenada a -25ºC até necessária para conjugação. Reação de Acoplamento Uma vez que o polissacarideo capsular ativado de proteína vei- culo ativada foram preparados, os dois foram combinados em uma reação de conjugação. O polissacarideo liofilizado e tiolado foi dissolvido em borato a 0,16 M, pH de 8,95, misturado com CRM; bromoacetilado descongelado e água destilada para fazer uma solução final de borato a 0,1 M, proporção em pesode 1:1de CRM's;:CP e 1 mg/mL de polissacarideo para CP8 e 2 , mg/mL de polissacarideo para CP5. Essa mistura foi incubada em tempera- , tura ambiente durante entre 16 e 24 horas. Grupos bromoacetila não reagi-

Ú 90/134 dos sobre a proteina foram revestidos mediante a adição de hidrocloreto de . cisteamina em uma proporção de CRM157;:cisteamina de 1:2 (peso/peso) u- sando uma solução de estoque a 135 mg/mL de cisteamina dissolvida em borato a 0,1 M, pH de 8,95 e incubada durante 4 horas em temperatura am- biente.

O conjugado de polissacarídeo capsular-CRM157 (conjugado) foi puri- ficado por meio de diafiltração 50 vezes contra NaCl a 0,9% usando um ul- trafiltro de poliéter sulfona de 100K.

Os resultados da reprodutibilidade de estudos de tiolação de CP5 e CP8 com PDPH demonstraram que o grau de ativação de CP5 estava o 10 nafaixade11a19%, o qual corresponde a aproximadamente uma molécula ligante presa por dez unidades de repetição do CP a uma molécula ligante por cinco unidades de repetição.

A ativação estava na faixa de 12 a 16%, o qual era muito similar à ativação de CP5. Bromoacetilação de residuos de lisina de CRM; 97 foi muito con- sistente, resultando na ativação de 19 a 25 lisinas de 39 lisinas disponíveis. . A reação produziu altos rendimentos de proteína ativada.

Conjugação de CP ao CRM;57 através de Química de Conjuga- ção CDVCDT CDI e CDT proporcionam um processo de conjugação em uma etapa onde o polissacarideo é ativado em um ambiente anidro (DMSO) para e formar porções de carbamato de imidazola ou triazola com hidroxilas dispo- níveis e porções acilimidazola ou aciltriazola com ácidos carboxílicos.

A adi- ção de uma proteina veículo (em DMSO) leva ao deslocamento nucleofílico da imidazola ou triazola pela lisina e formação de uma ligação de carbamato (para hidroxilas ativadas) e uma ligação de amida (para ácidos carboxílicos ativados). À solução de reação é diluída 10 vezes em uma solução aquosa para remover os grupos de ativação não reagidos e, então, purificada por meio de diafiltração.

Ambas as conjugações químicas produziram CPs covalentemen- teligadosà proteina veículo, o qual foi indicado pela presença do sacarídeo . e proteína nas frações de cromatografia por exclusão de tamanho e análise de aminoácido do conjugado terminado em glicolaldeido ou hidrocloreto de

S 91/134 ' cisteamina, . Um sumário dos resultados do preparo de vários lotes de conju- gados preparados através de químicas PDPH e CDI/CDT para ambos os sorotipos capsulares com um tamanho de polissacarideo na faixa de 20 a 40 kDaé mostrado na Tabela 7 abaixo, Não havia diferença significativa no po- lissacarideo capsular livre, proporção de CP':proteína e rendimentos de con- jugados gerados através desses dois métodos de conjugação, A antigeníci- dade do CP conjugado não foi alterada pela conjugação, conforme mostrado pela linha de identidade de precipitina entre os conjugados e o CP nativo. o o

.. 92/134

DX " xs => &S o - : o , = Oo Ex Rx | mn E. [E NS o Oo |) oO 283) Nr lo O e o ESTES & Fr 8 |sES|) =P) SS 2 SE es) =x) xo & [8.3 8 8/8): ã& ES) a nn) 8 E

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] Conforme mostrado acima, os métodos descritos aqui podem . ser usados para produzir faixas específicas de polissacarideos capsulares de alto peso molecular desejados. O objetivo desse estudo foi preparar con- jugados a partir de uma faixa pré-selecionada de altos pesos moleculares que poderiam ser CPs filtrados e purificados para uso em composições imu- nogênicas. Nesse exemplo, oito lotes, onde o peso molecular do polissacari- deo capsular CP5 oscilava de cerca de 90 kDa a cerca de 120 kDa, foram selecionados e conjugação foi realizada usando ativação com triazola (CDT). Vide Tabela 8. Os pesos moleculares dos conjugados resultantes oscilavam % 10 de1533kDaa 2656 kDa. O número de lisinas conjugadas por CRM 697 osci- lava de um máximo de 22 a um mínimo de 15. O polissacarídeo capsular livre oscilava de um máximo de 18% a um mínimo de 11 %. Vide Tabela 8.

Tabela 8. Conjugados de CP5 com Faixa de MW Pré-selecionada Operação |Poli “MWi|Rendimento |[Sacarideo |MW através de Lisinas mo- (kDa) de Sac. livre SEC-MALLS dificadas US TERÇO ES Tem o n e ese e ms a e im is A Tabela 9 resume a análise de conjugados de CP8 onde o peso molecular do polissacarideo capsular CP8 oscilava de cerca de 87 kKDa à o 113 kDa e a química de conjugação por imidazola foi utilizada. Os pesos moleculares dos conjugados resultantes oscilavam de 595 kDa a 943 kDa. O número de lisinas conjugadas por CRMy57 oscilava de um máximo de 9 a um mínimo de 3. O polissacarideo capsular livre oscilava de um máximo de 6% aummínimode 2%. Vide Tabela 9. Tabela 9 Conjugados de CP8 com Faixa de MW Pré-selecionada Operação |Poli MW |Rendimento de Sacarídeo |MW através|Lisinas mo- ERTric= MALLS (kDa) 1a as e less Be Re E es 3 ' Bros ra a o o e E e e ' EB 8 je

Ú Ambas as conjugações químicas produzem CP covalentemente . ligado à proteina veículo. Não havia diferença significativa no polissacarideo capsular livre, proporção de CP: proteina e rendimentos de conjugados ge- rados através desses dois métodos.

Exemplo 5: Diversidade de Sequência de Fragmentos Polipeptídicos N1, N2 e N3 de CIfA Nesse exemplo, a heterogeneidade de sequência de proteina de fragmentos polipeptídicos N1, N2 e N3 de CIfA de isolados que causam do- ença obtidos de vários fontes foi avaliada. Genes de CIfA foram sequencia- e 10 dosapartirde cepas de S. aureus associadas a múltiplos estados doentios. Informação de sequência sobre cepas adicionais foi obtida do GenBank para : gerar sequências a partir de cepas relevantes. A Tabela 10 lista diferentes sequências de CIfA. ' O alinhamento de sequência de proteínas CIfA de diferentes ce- pasde S. aureus que causam doença é mostrado nas Figuras 8A-SE. As sequências de proteina foram alinhadas usando MUSCLE. Vide Edgar, R.C. Nucleic Acids Research 32 (5): 1792-1797 (2004). Os alinhamentos foram visualizados usando SHOWNALIGN. Vide Rice, P. et al., "EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite" Trends in Genetics, 16 (6) 276-277 (2000). Muitas das sequências recorriam múltiplas vezes sem e variação. Por clareza, cada sequência única foi colocada no alinhamento apenas uma vez. Vide Figuras 8A-BE. Apenas sequências únicas foram in- cluídas na listagem de sequência. Por exemplo, a sequência de proteína de CIfA 001 foi obtida de múltiplas cepas diferentes sem qualquer variação. Vide Figuras 8A-BE. O número de listagem de sequência para qualquer se- quência pode também ser obtido da Tabela 10: Cepas de CIfA e Listagens de Sequência. A Tabela 10 lista uma cepa exemplificativa que continha essa mesma sequência de proteina CIfA 001. Essa sequência é mostrada na primeira fileira do alinhamento nas Figuras 8A-8E. Esse alinhamento de se- quência únicas do antígeno CfIA indica que polimorfismos estavam distribuí- Í dos por toda a região A (N1I-N2-N3) de CIfA. Em alguns casos, para qual- . quer dada sequência de proteína única de CIfA, mais de uma sequência de c . . nucleotídeo, que codifica a mesma proteína, foi descoberta. Apenas a se- * "” —quênciade DNA que ocorre mais frequentemente foi incluida na listagem de - sequência e na Tabela 10. Para CIfA, as sequências a seguir são divulgadas aqui e não são encontradas no GenBank: CIfA 003, CIfA 005, CIfA 008, CIfA 009, CIfA 013, CIfA 014, CIfA 015, CIfA 016, CIfA 017, CIfA 018, CIfA 019, CIfA 020,CIfA 021, CIfA 022, CIfA 023 e CIfA 024. Tabela 10: Cepas de CIfA e Listagens de Sequência Cepa Exem- NT SEQ ID|Proteina- JAA SEQ|ldentidade % IprESADIST Jara ota fot — lema oo jaz =— jon => e restore lar centos — lama det fe IPrESADO72 feia oos1 js — — Jeraoos as — | 68 ss

EST ROMS CER A 1 lPreSADOSS fama ostra lema oos [72 for | IPrESA026O feita 0071173 =— fera oo 7a IPFESADOS1 Jara 0081 PFESAOOOS |cifa 009-1 |77 leia 009 f7g fas "| ESTIENNE OO oa PrESADIS7 Jara 0121183 — —lanaota fes — joe — PFESADO6S acres amor fo PFESADOO2 feia o1a-1l8r — — Janaora Joe — Jos — O ES Ra aa o IPrESADOSA fera ote-tjar — feras Jor — dog PreESAOIAS fofa 0171/93 — fera oiz oa — jar — | PESADAS fer tentos emote e e PrESANIZA ama otat jar — —feraots Jos — jar |PrESADIAS jon 0201/00 — — erao2o [100 Jet IPrESADIAO Ja 0at1 [107 — leraoat j1o2 —jo8 |PFESA0152 |cifa 022-1 103 cifa 022 104 ag Presanto fat nee|tor —emnea fios fe A filogenia das sequências de proteína CIfA foi examinada e uma árvore filogenética foi construída. Sequências foram alinhadas usando o ClustalW. Vide Chenna R, Sugawara H, Koike T, et al. Nucleic Acids Rese-

] ” - arch. 31(13): 3497-3500 (2003). Árvores de união vizinha sofreram "boots- " trap" 1000 vezes e foram visualizadas com o MEGA 4.0. Vide Tamura K, 7 et al., Molecular Biology & Evolution. 24(8): 1596-1599 (2007). Valores de "bootstrap”", indicados sobre as ramificações, são o número de vezes em que uma ramificação foi reproduzida em 1.000 experimentos.

Valores de menos de 500 (reprodutibilidade de 50%) são considerados como sendo pobremen- te sustentados.

As sequências de CIfA formam uma árvore com 2 ramificações principais.

Vide Figura 9. A separação desses dois grupos é muito bem sus- oe 10 tentada em filogenia.

Uma ramíificação (superior) inclui 9 sequências que são intimamente relacionadas de modo razoável umas às outras (96-99% de i- dentidade), mas mais distantemente relacionadas à sequência candidata | clfA 011, à qual elas são 91-92% idênticas.

O segundo grupo, o qual inclui - clfA 011, é mais diverso e a filogenia nesse grupo não é bem sustentado.

Essas sequências de proteína oscilam de 93-99% idênticas umas às outras.

Exemplo 6: Diversidade de Sequência de Fragmentos Polipeptídicos N1, N2 e N3 de CIfB Nesse exemplo, a heterogeneidade de sequência de proteina de fragmentos polipeptídicos N1, N2 e N3 de CIfB de 92 isolados que causam doença obtidos de várias fontes foi avaliada.

Genes de CIfB foram sequenci- oe ados a partir de cepas de S. aureus associadas a múltiplos estados doenti- os.

Vide Tabela 11. Informação sobre cepas adicionais foi obtida do Gen- Bank para gerar sequências adicionais.

O alinhamento de sequência de proteínas CIfB de diferentes ce- pasdeS. aureus que causam doença é mostrado nas Figuras 10A4-10E.

As sequências de proteina foram alinhadas usando MUSCLE.

Vide Edgar, R.C.

Nucleic Acids Research 32 (5): 1792-1797 (2004). Os alinhamentos foram visualizados usando SHOWNALIGN.

Vide Rice, P. et al., "EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite" Trends in Genetics, 16 (6): 276-277 (2000). Vide Figuras 10A-10E, alinhamento de CIfB.

Conforme com CIfA, muitas das sequências recorriam múltiplas vezes sem variação, Por clareza, cada sequência única foi colocada no alinhamento apenas uma

- vez. Vide Figuras 10A-10E. Apenas sequências únicas de CIfB foram incluí- “ dasna listagem de sequência. Por exemplo, a sequência de CIfB 006 foi 7 obtida de múltiplas cepas diferentes sem qualquer variação. Essa sequência é mostrada na primeira fileira do alinhamento nas Figuras 10A-10E. O núme- rodelistagem de sequência para qualquer sequência pode também ser ob- tido da Tabela 11. Esse alinhamento de sequências únicas representativas do antígeno CIfB indica que polimorfismos estavam distribuídos por toda a região A (N1-N2-N3) de CIfB. Similar ao CIfA, para qualquer dada sequência de proteina única de CIfB, mais de uma sequência de nucleotídeo que codi- o 10 ficaa mesma proteina foi descoberta, Apenas a sequência de DNA que o- corre mais frequentemente foi incluída na listagem de sequência e na Tabela ; 11. Para CIÍfB, as sequências a seguir são divulgadas aqui e não são encon- tradas no GenBank: CIfB 001, CIfB 004, CIfB 005, CIfB 010,CIfB 011, ' CIfB 013, CIfB 014, CIfB 015, CIfB 016, CIfB 017, CIfB 018, CIfB 019, CIfB 020,CIfB 021, CIfB 022, CIfB 023 e CIfB 024, A árvore filogenética é mostrada na Figura 11. Tabela 11: Cepas de CIfB e Listagens de Sequência Cepa Exempli- Proteina- | SEQ Identidade % ficativa | pace | Ro ema Ro. ao Antigeno PFESA0286 15 JerBoo |16 PFESA0159 cIfB 002-1 95 o RF122 EXERCE CON CN PFESADATT omBoo4T [21 oro [22 —jo8 — 24 os 2 |100 PFESAO270 | chB 0071 28 99 2 jo 34 os

ECA oNB 0131 38 6 o

EXTTERNE CCAGENECCOS CMC ao o

- ficativa DNA-CIfB | 1IDNO: | CIfB ID NO: | ao Antígeno (PrESADIAT fomolet az —fomote fas fo =) | [PrESAIAS fonBotst [as — forsots [50 jo ea Jane Sana a est Jansar e ana da e PFESADI63 Ieaozt [or Tamos To Te PFESA0211 60 jo Exemplo 7: Diversidade de Sequência de MntC em Clones de S. aureus que Causam Doença o Nesse exemplo, a heterogeneidade de sequência de proteína dos genes de MntC de 104 isolados que causam doença obtidos de várias “5 fontes foi avaliada.

Genes de MntC foram sequenciados de cepas de S. aureus associadas a múltiplos estados doentios.

Vide Tabela 12. Informa- tion sobre cepas adicionais foi obtida do GenBank para gerar sequências de cepa.

O alinhamento de sequência de proteinas MntC de diferentes cepasde S. aureus que causam doença é mostrado na Figura 12A-12B.

As sequências de proteina foram alinhadas MUSCLE.

Vide Edgar, R.C.

Nucleic Acids Research 32 (5): 1792-1797 (2004). Os alinhamentos foram visualiza- e dos usando SHOWNALIGN.

Vide Rice, P. et al, "EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite" Trends in Genetics, 16 (6): 276-277 (2000). Vide Figura 12. Conforme com CITA, muitas das sequências recorri- am múltiplas vezes sem variação.

Para clareza, cada sequência única foi colocada no alinhamento apenas uma vez.

Vide Figura 12. Apenas sequên- cias de MntC únicas foram incluídas na listagem de sequência.

Por exemplo, a sequência de MntC 001 foi obtida de diferentes cepas sem qualquer vari- ação.

Vide Figura 12. Essa sequência é mostrada na primeira fileira do ali- nhamento na Figura 12. O número de listagem de sequência para qualquer sequência pode também ser obtido da Tabela 12. Apenas a sequência de DNA correspondente mais frequente foi incluída na listagem de sequência.

Para MntC, as sequências a seguir são divulgadas não são encontradas no GenBank: MntC 002, MntC 006, MnNtC 007, MntC 008 eMntC 009.

r Tabela 12: Cepas de MntC e Listagens de Sequência NO: MntC NO: ao Antigeno i PFESA0129 |Mntc 001-1 |1 IMnte oo1/2 == = prESADIA fume one 5 ME A PFESAO0286 |MntC 006-1 |7 MntC 0068 99 PFESAO0136 |Mntc 007-1 |g NE Mntc 008/12 — oo PFESAOIS3 Exemplo 8: Expressão na Superfície de CIFA, CP5, CP8 e MntC in Vivo e Durante Infecção S. aureus é responsável por causar uma diversa série de infec- “5 ções humanas. Consequentemente, as bactérias devem se adaptar a dife- rentes nichos ambientais por meio de expressão diferencial de fatores de virulência requeridos para infecção. A expressão de antígenos alvo foi estu- dada em três ensaios in vivo com roedor para avaliar sua expressão durante infecção: um modelo de ferimento para medir a expressão do antigeno no local primário de infecção, um modelo de bacteremia que monitora a expres- são antigênica no sangue e um modelo de câmara individual que monitora expressão antigênica durante condições limitadas de nutriente/oxigênio, Pa- eo ra todos esses modelos, os roedores foram estimulados com bactérias no local de estudo. Após infecção, bactérias foram coletadas em vários pontos detempoe expressão antigênica (CIfA, CP5, CP8, MntC) foi avaliada usan- do microscopia imunofluorescente (ferimento e bacteremia) ou citometria de fluxo (câmara).

MATERIAIS E MÉTODOS Expressão no Modelo de Ferimento Experimentos de infecção por ferimento consistem de 5 ani- mais/grupo e até 5 grupos para um máximo de 25 animais/experimento. Camundongos machos C57BL/6 de seis a oito semanas (wk) de idade sofre- ram cirurgia para embutir um laço de suture em uma incisão no músculo da coxa. Isso proporciona um substrato estranho no corpo para fixação bacteri- anae reduz significativamente a dose infecciosa minima necessária para

' 100/134 i produzir uma infecção estafilocócica por ferimento. Cinco yuL de S. aureus ou - solução salina estéril foram introduzidos na incisão sob a sutura tecidual pro- funda de 4-0 silk. A pele foi fechada com suturas de Proleno 4-0 ou adesivo i cirúrgico (por exemplo, cianoacrilato). Os animais foram sacrificados em pontosde tempo entre 30 min e 10 dias após infecção e o músculo da coxa excisado, homogeneizado e as bactérias contadas. As bactérias no local de infecção foram analisadas quanto à expressão antigênica através de micros- copia confocal imunofluorescente (IF). Expressão no Modelo de Bacteremia o 10 Grupos de 10 camundongos CD-1 ou Balb/C de quatro semanas de idade foram imunizados com 1 ug de proteína ou conjugado de CP atra- vés de injeção subcutânea nas semanas 0,3 e 6. O sanque dos animais foi colhido nas semanas O e 8, seguido por um estímulo intraperitoneal com S. aureus crescida até a fase log tardia em TSB. Três horas após estímulo, os animais foram sacrificados e sangue coletado para microscopia confocal IF. Expressão no Modelo de Tubulação de Diálise Individual Isolados de S. aureus foram crescidos durante a noite sobre lâ- minas TSA a 37ºC, As bactérias foram raspadas das lâminas e resuspensas em PBS estérilea ODsoo ajustado para 1, aproximadamente 10º unidades o de formação de colônia (Colony Forming Units - CFU) /mL. As bactérias fo- ram diluídas para uma concentração de 10º cfu/mL e inoculada em tubula- ção de diálise. Uma alíquota da suspensão foi colocada em lâminas para determinar o número real de cfu. Tubulação de diálise com MWCO de 3,5 kDa foi preparada para implante através de esterilização em etanol a 70% durante 30 minutos, seguido por enxague extensivo em água estéril e, então, solução salina estéril. Uma alíquota de 2 mL da suspensão bacteriana foi transferida para a tubulação de diálise, o saco fechado com um nó e, então, extensivamente enxaguada com solução salina estéril. Ratos machos Spra- gue Dawley(6 semanas de idade) foram anestesiados e uma incisão de 2-3 cm feita ao longo de linha mediana dorsal. Bolsas foram criadas no local da incisão separando gentilmente a pele do tecido subjacente. A tubulação foi

Ú implantada nas bolsas e a pele foi fechada usando grampos cirúrgicos.

Após | * —24h,ratosforam sacrificados, a tubulação removida e as bactérias recupe- - radas para análise citométrica de fluxo.

Microscopia Imunofluorescente (IF)

O sangue de 5 camundongos foi agrupado em citrato de sódio gelado, pH de 7,0 (concentração final, 0,4%), As células eucariotas foram submetidas à lise com NP-40 à 1% (Pierce Biotechnology). As bactérias fo- ram lavadas com PBS e incubadas durante a noite a 4ºC com soro imune ou pré-imune de coelho (1:100) e detectados com anticorpo de cabra-a-coelho o 10 conjugado ALEXA4B8 (1:250, Invitrogen). As bactérias rotuladas foram se- cas sobre uma lâmina de microscópio e uma laminula foi montada com meio Vectashield HardSet (Vector Laboratories, Inc.). Imagens foram obtidas com | um microscópio confocal espectral Leica TCS SL (Leica Microsystems). Análise Citométrica de Fluxo | Isolados de S. aureus foram crescidos conforme descrito no pro- cedimento do modelo de tubulação de diálise em rato.

Aproximadamente 107 células bacterianas foram bloqueadas em tampão de coloração (solução sa- lina equilibrada de Hank com soros de cabra a 10%) durante 1 hora sobre gelo.

Células bacterianas foram centrifugadas durante 5 minutos a 10.000 rpm,o sobrenadante removido e as células incubadas com anticorpo de ca- s mundongo ou anticorpo de controle de isotipo durante 30 minutos sobre ge- lo.

As células foram, então, lavadas e coradas com IgG de cabra anti- camundongo conjugada a FITC (Jackson ImmunoResearch) sobre gelo du- rante 30 minutos.

As bactérias foram lavadas com tampão de coloração, fi- xadas com paraformaldeído a 2% e dados adquiridos e analisados usando um citômetro de fluxo FACS Caliber e o software Cell Quest (Becton, Dickin- son e Co.). Um total de 30.000 eventos foram coletados para cada amostra. |

7. 102/134 | O 8 : | e Ela) nl Z + — HZ + vv 2 & = do =) 4) Z do alo +) O Ebal dal Ela ala a! al o Z| + +H Z + +) +) +

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1 . Tabela 13c. Expressão de antígenos de S. aureus na tubulação de diálise individual ] Frequência de células positivas (% do total Ss. aureus | Tempo (noras) o |3 Teo [eo [130 [180/3060] PFESA0266 Ao E AT LIA RARE Rm 1º 118 61 |71 |52 [96 | se e ju faueiaio mm Pp | Ss aves remetem 217160 180 1a 06) 240 oe PFESADOOS | CIA [686 |630 | 697 [243 [361 |966 090] LE TA AE EE 1 08 aa ae, : lMie = se |77 125126 |29 los los Resultados Uma combinação de dezenove isolados de S. aureus foi testada quanto à expressão de CIfA, CP5, CP8 ou MntC sobre a superficie de uma célula de S. aureus durante infecção (Tabelas 13a, 13b e 13c). Esses isola- dos incluíam cepas clinicamente relevantes recentes e eram diversas, con- forme monitorado por MLST. Expressão antigênica era dependente da cepa, ponto de tempo e modelo de infecção. A variação na expressão antigênica entre isolados em diferentes ambiente in vivo (corrente sanguínea vs. feri- o mento) sustenta o uso de uma composição imunogênica com múltiplos antí- genos para induzir a uma ampla cobertura de isolados estafilocócicos em uma variedade de diferentes infecções. Os antígenos eram expressos na superfície dentro das primeiras 24 horas de infecção e, assim, são compo- nentes válidos para uma composição imunogênica antiestafilocócica. Antí- genos proteináceos CIfA e MntC foram acessíveis à coloração na presença de expressão capsular, indicando que a presença de cápsula não esconde as proteínas de anticorpos dirigidos contra as mesmas.

A maioria dos isolados do tipo 8 testados não expressa CP no sangue até pontos de tempo posteriores pós-estiímulo (> 4 horas) (Vide Ta- bela 13a-c). Esses resultados demonstram que, em S. aureus, o CP é dife- rencialmente regulado dependendo do microambiente in vivo, isto é, local de

| 106/134 ' . infecção.

Esses resultados podem explicar os resultados de ineficácia con- sistentes reportados para conjugados de CP8 em modelos animais. ' Resultados de expressão in vivo sugerem que nenhuma formu- lação imunogênica com um único antígeno proporcionará ampla cobertura contraamaioria das infecções por S. aureus.

Há muita diversidade de fenó- tipos de expressão por cepas individuais dentro de microambientes in vivo.

Portanto, uma composição imunogênica consistindo de mais de um antígeno é requerida para prevenir doença por S. aureus.

Exemplo 9: Imunogenicidade de Múltiplas Formulações Antigênicas o 10 Contendo Conjugados de CIfA, CP5- e CP8-CRM197 Nesse exemplo, nós avaliamos a imunogenicidade de combina- ções de CIfA, CPS5-CRM 97 e CP8-CRM 97. i A.

Formulação de composição imunogênica biantigênica (CP5- - CRM;15;/CP8-CRM; 57) - efeito da dose sobre as respostas de anticorpo anticcapsular em coelho Nesse exemplo, o efeito da dose sobre a imunogenicidade da formulação imunogênica de CPS-CRM: 27 e CP8-CRM157 combinada em coe- lhos foi avaliado, Coelhos foram imunizados nas semanas O, 3 e 6 com con- jugado bivalente mais 125 ug de AIPO, administrado através de injeção sub- cutânea As doses avaliados nesse estudo foram 0,1 ua. 1 ug ou 10 ug cada eo de CPS5-CRM 57 é CP8-CRM:147 (doses finais de CP-CRM; 97; combinados de 0, 2 ua, 2 ug e 20 pg). A dose do conjugado reflete o componente polissaca- rídico total do conjugado de polissacarídeo-proteína.

O sangue dos coelhos foi colhido nas semanas 0, 3, 6 e 8. ELISA foi realizado sobre soros agrupa- dose individuais.

As titulações de anticorpo de endpoint foram determinadas como uma diluição recíproca em uma ODaos de 0,1. Análise estatística foi realizada sobre titulações individuais da semana 8. Os resultados demons- traram que as maiores titulações de anticorpo CP5 e CP8 específicos de 5 X 10º para CP5 e 1 X 10º para CP8 foram induzidas por meio de vacinação de coelhoscom formulação imunogênica bivalente em uma dose de 1 ug de CP de cada componente (dados não mostrados).

| 107/134 - , B.

Estudo de Faixa de Dose de Formulação Triantigênica (CP5-CRM; 57 + CP8-CRM197 + rCIfA) - rCIfA com Dose Fixa (1 ug) de Cada Conjugado : em Coelhos O efeito de uma combinação de rCIfA e conjugados de CP5 e CP8 sobre a resposta imune a cada componente foi testado.

Três grupos foram imunizados com CP5-CRM197 + CP8-CRM: 57 de S. aureus bivalente (dose de 11ug de cada conjugado) combinado com T7-CIfA (N1IN2N3) em três diferentes doses de 1, 10 e 100 po.

O grupo de controle foi imunizado com CP5 e CP8 não conjugado (50 ug cada) combinado com 100 ug de T7- o 10 CIfA(NIN2N3). Cada composição imunogênica foi formulada com 500 ug de adjuvante AIPO,. As composições imunogênicas foram administradas atra- vês de injeção subcutânea no pescoço.

O sangue dos coelhos foi colhido i nas semanas 0, 6 e 8. ELISA foi realizado sobre soros agrupados e individu- . ais e titulações de anticorpo de endpoint foram determinadas como uma dilu- içãorecíproca em uma ODaos de 0,1. Os resultados mostraram que uma quantidade aumentada de r- CIfA, quando combinada com conjugado bivalente, não afeta as respostas de anticorpo capsular, Os níveis de anticorpo a ambos os sorotipos capsula- res estavam na mesma faixa conforme em coelhos imunizados com conju- gado bivalente apenas (dados não mostrados). Os níveis de anticorpo ao eo CP5 e CP8 eram 2,5 vezes menor em uma dose de 10 (103 K) e 100 ug (106 K) comparado com à dose de 1 ug de rCIfA (273 K). Houve um efeito mais reforçado as segunda e terceira injeções.

Formulação imunogênica de polissacarideo bivalente não conjugado (CP5 + CP8, 50 ug cada) combina- dacom 4100 ug de rCIfA não induz a anticorpos CP-específicos.

A resposta de anticorpo rCIfA-específico também não foi grandemente afetada pela do- se, onde as titulações estavam entre 1 X 10º e 1 X 10º após três doses para doses de 1, 10 e 100 ug (dados não mostrados). Também, os níveis de res- posta anti-CIfA atingidos quando administrada com polissacarideos CP5 e CP8 não conjugados foram similares.

Exemplo 10: Formulação triantigênica - Imunogenicidade em Coelhos com Altas Titulações de Ab anti-CP5, CP8 e CIfA Pré-Imunização

- A composição imunogênica estafilocócica é objetivada à popula- ções adultas que têm anticorpos pré-existentes a componentes na superfície ' de S. aureus.

Para estudar o efeito de anticorpos pré-existentes a compo- nentes de uma formulação imunogênica sobre a resposta à formulação imu- nogênica, nós selecionamos coelhos com altas titulações de titulações de anticorpo anti-CP5, anti-CP8 e anti-CIfA naturalmente adquiridos.

Dois gru- pos de coelhos (n = 6/7) foram imunizados nas semanas O, 3 e 6 com tri- antigeno formulação imunogênica (CPS5-CRM197 (1 ug) e CP8-CRM: 57 (1 pq) e T7-CIfA (N1IN2N3)Y338A (1049)). Um grupo foi imunizado com a composi- o 10 ção imunogênica formulada com 500 ug de AIPO, como adjuvante e o se- gundo grupo foi imunizado com formulação de composição imunogênica não contendo adjuvante.

As composições imunogênicas foram administradas i através de injeção subcutânea.

O sangue dos coelhos foi colhido nas sema- nas 0, 3,6 e 8. As titulações de anticorpo ao CP5, CP8 e rCIfA foram deter- minadas por ELISA como titulações de anticorpo de endpoínt sobre soros agrupados e individuais (determinadas como uma diluição recíproca em uma ODaos de 0,1). Os resultados mostraram que coelhos com titulações de anticor- po pré-existentes induzidas por infecção natural responderam à formulação imunogênica trivalente com um aumento nos níveis de anticorpos a todos os o componentes de uma formulação imunogênica com CP5, CP8 e rCIfA.

Um aumento nos níveis de Ab a cada antígeno de entre 5 vezes a 10 vezes foi mostrado mesmo em animais com titulações de anticorpo de 1 x 10º.

A pre- sença do adjuvante na formulação imunogênica resultou em maiores títula- ções de anticorpo comparado com o grupo imunizado sem adjuvante (dados não mostrados). Exemplo 11: Efeito do Adjuvante sobre as Respostas a Componentes de Polissacarídeo Capsular A.

Efeito de Duas Diferentes Doses de AIPO, sobre a Resposta à Composi- ção lmunogênica Bivalente de Conjugado CP5-CRM;;5;/CP8-CRM: 67 em Co- elhos O efeito da dose do adjuvante AIPO, sobre as respostas anti

- . CP5 e CP8 em coelhos foi estudado.

Coelhos foram imunizados nas sema- nas O, 3 e 6 com CP5-CRMi97 + CP8-CRM197 de S. aureus bivalente (dose S de 1 pg de cada conjugado). Um grupo (n = 5/grupo) foi imunizado com composição imunogênica formulada com 125 ug e um 2º grupo com 500 pq deaAIPO, como adjuvante.

Composições imunogênicas foram administradas através de injeção subcutânea no pescoço.

O sangue dos coelhos foi colhido nas semanas O, 6 e 8 e anticorpos anticapsulares foram determinados por ELISA como titulações de anticorpo de endpoint determinadas como uma diluição reciproca a ODs095 de 0,1. Os resultados indicaram que não houve o 10 diferença nas respostas de anticorpo CP8-específicas em coelhos imuniza- dos com 125 ug ou 500 ug de AIPO,. A formulação com 125 ug de adjuvante proporcionou maiores respostas de anticorpo anti-CP5. Também, todos os coelhos no grupo com 125 ug responderam com maiores respostas de anti- corpo anti-CP5 enquanto que, no grupo com 500 ug de adjuvante, dois coe-

lhos tiveram baixa resposta à formulação.

B.

Efeito de AIPO, sobre a Imunogenicídade da Formulação Triantigê-

nica

Coelhos (NZW, n = 6/7 coelhos por grupo) foram imunizados nas semanas 0, 3 e 6 com a formulação triantigênica compreendida de CP5- CRM; (1 pg) e CP8-CRM97 (1ug) e T7-CIfA (NIN2N3)Y338A (10 pg). Um eo grupo de coelhos foi imunizado com formulação imunogênica com 500 ug de AIPO.«, um segundo grupo foi formulado sem adjuvante, o terceiro grupo foi imunizado na semana O com formulação imunogênica com 500 ug de AIPO, e nas semanas 3 e 6 com formulação imunogênica sem adjuvante.

As for- — mulaçõesimunogênicas foram administradas através de injeção subcutânea, o sangue dos coelhos foi colhido nas semanas 0, 3, 6 e 8 e os soros avalia- dos por meio de um ELISA antigeno-específico.

Os resultados mostraram que a presença de adjuvante na formulação imunogênica não têm um efeito sobre as respostas anti-CP5 ou anti-CP8 em coelhos (dados não mostra- dos). As titulações GMT de Abs à ambas as cápsulas eram comparáveis.

Contudo, houve um efeito do adjuvante sobre a resposta de anticorpo CIfA- específica mostrada em grupos imunizados com adjuvante presente em to-

i 110/134 . , das as três vacinações.

Os segundo e terceiro reforços com formulação i- munogênica não contendo AIPO, nos coelhos que receberam a formulação ' imunogênica contendo adjuvante proporcionaram maiores respostas de CIfA comparado com o grupo sem adjuvante.

Exemplos12-29: Avaliação pré-clínica de CITA, MntC, CPS-CRM.4; e CP8-CRM9; de S.

Aureus São descritos abaixo nos Exemplos 12 a 29 os resultados da avaliação pré-clínica dos conjugados de CP5, CP8, CIfA e MntC.

Os exem- plos demonstram a eficácia desses antígenos em modelos animais pré- o 10 clínicos.

Os exemplos também demonstram que anticorpos gerados pelos CPs conjugados, CIfA e MntC têm atividade funcional em ensaios in vitro.

Duas diferentes químicas foram usadas para conjugar CP ao CRM;197, mas nenhuma diferença foi observada na eficácia para os conjuga- dos preparados através dos diferentes métodos.

Foi mostrado que O- acetilação dos polissacarídeos capsulares tem um impacto na estimulação de anticorpos funcionais.

Avaliação de uma composição imunogênica com- binada compreendendo CP5-CRM+1657, CP8-CRM 597 e CIfA não mostrou inter- ferência sobre os níveis de anticorpo específico (Ab) a cada componente da formulação imunogênica.

Materiais e Métodos o ELISA Lâminas de microtitulação para ELISA Maxisorp (Nalge Nunc In- ternational, Rochester, NY) foram revestidas 18 horas a 4ºC ou durante 90 min a 37ºC com 1 ua/mL de antígeno CfIA em PBS, pH de 7,5. As lâminas foram lavadas cinco vezes em PBST (1X PBS, poli-sorbato 20 a 0,1%) e bloqueadas com leite desnatado a 1% (peso/v) em PBS, com poli-sorbato a 0,05% durante 1 h em temperatura ambiente.

As lâminas foram lavadas com PBST e serialmente diluídas (3 vezes) e antissoros de coelho individuais das semanas 0, 3, 6 e 8 foram adicionados às lâminas e incubados durante a noitead4ºCou2ha37C.As lâminas foram lavadas e anticorpos primários ligados foram detectados com IgG de cabra anticoelho conjugada à peroxi- dase de rábano (diluição de 1:1000) em PBST.

As lâminas foram incubadas i 111134 ' . durante 1 h a 37ºC, então, lavadas e reveladas com solução de substrato ABTS-peroxidase (KPL, Inc., Gaithersburg, MD), em temperatura ambiente durante aproximadamente 20 minutos.

A reação foi cessada mediante a adi- ção de uma solução de SDS a 1% (v/v). A absorbância foi medida a 405 nm emuma Plate Reader automática (Molecular Devices Corporation, Sunnyva- le, CA). As titulações de anticorpo foram expressas como à recíproca da maior diluição de soro com um valor de absorbância de 0,1. t-teste de Stu- dent usando o software JMP (SAS Instítute, Cary, NC) foi usado para deter- minar diferenças nas titulações de anticorpo entre os diferentes grupos.

Uma o 10 probabilidade de menos de 0,05 foi considerada como indicando uma dife- rença estatisticamente significativa.

Modelos de Sepsia em Murino O modelo de sepsia em murino imita uma doença transmitida r pelo sangue.

Para imunização passiva, grupos de 15 camundongos Swiss- Webster foram tratados intraperitonealmente (i.p.) com IgG.

Vinte e quatro horas depois, os camundongos foram estimulados com S. aureus 659-018 via uma única injeção intravenosa (i.v.) (0,1 ml) através da veia caudal.

To- dos os animais foram acompanhados durante 14 a 15 dias, ponto no qual todos os camundongos restantes foram sacrificados.

Para imunização ativa, os camundongos foram imunizados com o antígeno a O, 2 e 4 semanas e estimulados na semana 6 pela via intraveno- Sa com S. aureus.

Imunização Ativa no Modelo de Endocardite em Coelho Coelhos New Zealand White adultos foram imunizados intra- muscularmente 4 vezes com 25 ug de antígeno.

Um dia pós-cirurgia, os a- nimais são estimulados |.v. com um bolo de S. aureus e o número de unida- des de formação de colônia (Colony Forming Units - CFU) em tecido cardia- co é determinado 24 horas pós-estímulo.

Bacteremia em Murino Um modelo de bacteremia de 3 horas foi usado para determinar o efeito de vacinação sobre os números bacterianos iniciais durante uma infecção.

Camundongos foram imunizados nas semanas O, 3 e 6 com antí-

i 112/1834 - geno, seguido por estímulo i.p. com S. aureus na semana 8. O sangue dos animais foi colhido 3 horas depois e diluições seriais de sangue colocadas Ú em lâminas para contagem das bactérias.

Modelo de Pielonefrite Em Murino O modelo de pieloneírite em murino imita a disseminação de S. aureus por bacteremia.

Grupos de 10 camundongos CD-1 fêmeas de qua- tro semanas de idade foram imunizados a O, 3 e 6 semanas com antígeno.

Os camundongos foram estimulados por meio de injeção i.p. de S. aureus.

Quarenta e oito horas após estimulo, os camundongos foram sacrificados e eo 10 as bactérias foram contadas no rim e sangue.

Modelo de Endocardite em Rato O modelo de endocardite em rato imita a endocardite humana, i na qual colonização ocorre após uma infecção sanguínea levar à coloniza- - ção de tecido cardíaco lesado.

Ratos Sprague-Dawley machos de 5 sema- nas de idade (Charles River, Kingston, NY) foram imunizados nas semanas O, 2 e 4 com 1 ug de conjugado CPS5-CRM; 657 formulado com 100 ug de Al- PO,. O sangue dos animais foi colhido antes de vacinação na wk O e ao final da wk 5. Setenta e duas horas depois, um cateter (tubulação PE-10) foi ci- rurgicamente colocado através da artéria carótida no ventrículo esquerdo do coração.

Colocação do cateter resulta na formação de uma vegetação estéril o à qual os estafilococos podem se fixar quando de infecção.

Para prevenir infecção resultante do procedimento cirúrgico, os animais foram tratados com o antibiótico Baytril (5 mg/kg) no momento de cirurgia e 8 horas após cirurgia.

Quarenta e oito horas após cirurgia, os ratos foram estimulados com —PFESAO0Z266 (aproximadamente 4 x 10º cfu) ou SA315 (aproximadamente 1 x 10º cfu) por meio de injeção intraperitoneal.

Quarenta e oito horas após estímulo, os ratos foram sacrificados e os corações e rins removidos e colo- cados em 3 mL de solução salina tamponada com fosfato (Phosphate Buffe- red Saline - PBS). Os órgãos foram, então, homogeneizados com um homo- geneizador tecidual (Kinematica AG, Luzernerstrasse, Alemanha) e levados para 10 mL com PBS.

Os homogenatos foram, então, serialmente diluídos e colocados em lâminas para contagem bacteriana.

. . Monitoramento de Anticorpos Funcionais Usando Ensaio de Morte Op- sonofagocítica S Células efetuadoras diferenciadas de uma linhagem de célula (por exemplo, HL60s) ou células polimorfonucleares (PolyMorphoNuclear - PMNs) isoladas de sangue de um doador humano usando solução LYM- PHOLYTEG-Poly (Cedarlane Laboratories Limited, Ontário, Canadá) con- forme o protocolo do fabricante podem ser usadas para esse ensaio.

Células efetuadoras foram resuspensas em tampão de ensaio (Meio de Eagle modi- ficado contendo albumina de soro bovino à 1%) em uma concentração de o 10 aproximadamente 2 X 10” células/ml e colocadas em uma incubadora a 37º C até prontas para uso.

A cepa PFESAV0266 de S. aureus foi crescida duran- te a noite lâminas de agar com soja tríptica.

Células bacterianas foram ras- padas, lavadas duas vezes e resuspensas em tampão de ensaio contendo . glicerol a 5% até uma ODço9 = 1, a qual é igual a uma concentração de apro- ximadamente 5 X 10º cfu/ml.

Aliquotas de um ml! da suspensão bacteriana foram congeladas e armazenadas a 40ºC até prontas para uso, A suspen- são bacteriana congelada foi descongelada e ajustada para uma concentra- ção de 10º cfu/ím! em tampão de ensaio e colocada sobre gelo.

O ensaio foi realizado usando lâminas de polipropileno de 1 m! com 96 cavidades profun- dasestêreis.

Diluições seriais duplas de amostras de anticorpo (50 ul) foram os preparadas e seguido pela adição de 300 ul de tampão de ensaio à mistura de anticorpo.

Bactérias foram adicionadas (50 ul) às lâminas e colocadas sobre um agitador giratório a 4 ºC durante 30 minutos.

A etapa de opsoniza- ção foi seguida pela adição de 50 ul de complemento humano (concentração final de 1%). Finalmente, 50 ul de células efetuadoras (concentração de 10” células/m!) foram adicionados à lâmina e a suspensão bem misturada por meio de pipeteamento repetido.

Uma alíquota de 50 pl da suspensão foi serialmente diluída 10 vezes em solução de saponina a 1%, submetida a turbilhonamento para minimizar a aglutinação bacteriana e colocada sobre agarde soja tríptica em duplicata.

A lâmina de ensaio foi incubada a 37ºC durante 1 hora com mistura contínua usando um agítador estilo "rotisserie”". Ao final da incubação, uma alíquota de 50 ul de suspensão foi serialmente

- diluída 10 vezes em solução de saponina a 1%, misturada por meio de turbi- lhonamento para minimizar a aglutinação bacteriana e colocada sobre agar ' de soja triptica em duplicata.

A morte percentual foi calculada determinando- se a proporção do número de cfu que sobrevivem a 60 minutos em cavida- des com bactérias, anticorpos, complemento e células efetuadoras para o número de cfu que sobrevivem em tubos carecendo de anticorpos mas con- tendo bactérias, complemento e células efetuadoras.

Controles contendo bactérias, complemento e soros foram incluídos para ajustar qualquer redu- ção na CFU em virtude de aglutinação. oe 10 Adsorção de Complemento Soro de doadores humanos adsorvido contra cepas PFE- SA0266, PFESA0286 e PFESAO270 de S. aureus pode ser usado como ' uma fonte de complemento no ensaio.

Cepas de S. aureus foram crescidas durante a noite sobre lâminas TSA a 37ºC.

As células foram raspadas da lâmina e resuspensas em PBS estéril.

Células bacterianas foram centrifuga- das a 10.000 rpm durante 10 minutos a 4ºC e a pelota de células foi resus- pensas em human soro para adsorção.

Soro foi incubado com bactérias so- bre um Nutator a 4ºC durante 30 minutos.

As células foram centrifugadas, o soro transferido para outro tubo contendo bactérias e a etapa de adsorção repetida novamente durante 30 minutos.

Finalmente, as células foram centri- e fugadas e o soro passado através de um filtro de 0,2 mícrons antes que ali- quotas de 0,5 ml fossem congeladas em nitrogênio liquido.

Método ll - OPA Usando Células HL-60 Células HL-60 foram diferenciadas de acordo com S.

Romero- Steiner et al, Clin Diagn Lab Immunol 4 (4) (1997), páginas 415422. Célu- las HL-60 coletadas foram resuspensas em tampão de ensaio (Meio de Ea- gle modificado contendo albumina de soro bovino a 1%) a aproximadamente 10º células/ml! e colocadas em uma incubadora a 37 ºC até prontas para u- so.

S. aureus foi crescida durante a noite lâminas de agar com soja tríptica.

Células bacterianas foram raspadas, lavadas duas vezes e resuspensas em tampão de ensaio contendo glicerol a 5% até uma ODgoo = 1, a qual é igual a aproximadamente 5 X 10ºcfu/ml.

Alíquotas de um ml da suspensão bacteria-

| 115/134

- na foram congeladas e armazenadas a -40ºC até prontas para uso.

À sus- pensão bacteriana congelada foi descongelada e ajustada para uma concen- ' tração de 10º cfu/m! em tampão de ensaio e colocada sobre gelo.

O ensaio foi realizado usando lâminas de polipropileno de 1 ml! com 96 cavidades pro- fundas estéreis.

Diluições seriais duplas de amostras de anticorpo monocio- nal (25uI) foram preparadas e seguido pela adição de 150 ul de tampão de ensaio à suspensão de anticorpo.

Bactérias foram adicionadas (254/) às là- minas e colocadas sobre um agitador giratório a 4 ºC durante 30 minutos, seguido pela adição de 25 ul de complemento humano (concentração final o 10 de1%). Finalmente, 25pl de células HL-60 (107 células/ml) foram adíiciona- dos à lâmina e a suspensão bem misturada por meio de pipeteamento repe- tido.

Uma alíquota de 25 ul da suspensão foi serialmente diluída 10 vezes em solução de saponina a 1%, misturada por meio de turbilhonamento para minimizar a aglutinação bacteriana e colocada sobre agar de soja triptica em duplicatas.

A lâmina de ensaio foi incubada a 37ºC durante 1 hora com mis- tura contínua usando um agitador estilo "rotisserie". Ao final da incubação, uma alíquota de 25 ul de suspensão foi serialmente diluída 10 vezes em so- lução de saponina a 1%, misturada por meio de turbilhonamento e colocada sobre agar de soja tríptica em duplicata.

A morte percentual foi calculada determinando-se a proporção do número de cfu que sobrevivem a 60 minu- eo tos em cavidades com bactérias, anticorpos, complemento e células HL-60 para o número de cfu que sobrevivem em tubos carecendo de anticorpos, mas contendo bactérias, complemento e células HL-60. Controles contendo bactérias, complemento e mAb fai incluído para ajustar qualquer redução na

CFUem virtude de aglutinação.

Exemplo 12: Demonstração de um Efeito Protetor pelo CIfA em Mode-

los Animais !n Vivo

Para avaliar se anticorpos policionais de coelho estimulados contra CIfA eram capazes de reduzir as contagens de colônias de S. aureus emum modelo de sepsia em murino, IgG anti-CIfA policlonal de coelho puri- ficada foi usada em duas dosagens (0, 8 mg e 1,6 mg) em um estudo de |- munização passiva (Figura 13). A cepa de estímulo de S. aureus era um iso-

i 116/134 - lado clínico recente, 8659-018. Ambas as dosagens de anticorpo resultaram i em uma redução significativa das contagens de colônias bacterianas no mo- ] delo de sepsia em murino (p = 0,0134 para a dose de 1,8 mg e p = 0,0013 para a dose de 0,8 mg). Esse experimento foi repetido com isolados adicio- naisdeS aureus com resultados similares (dados não mostrados). Exemplo 13: Imunização ativa com CIfA Reduziu a Colonização do co- ração por S.

Aureus Imunização ativa de coelhos com CITA resultou em proteção no modelo de endocardite em coelho.

Nós descobrimos uma redução de 34 o 10 lognacfude S aureus recuperada de vegetações cardiacas para animais imunizados com CIfA comparado com animais imunizados com controle ne- gativo (PBS ou AIPO,) (Figura 14). Exemplo 14: Efeito protetor de Mntc em Modelos Animais /n Vivo Imunização ativa com MntC mostrou proteção consistente de camundongos em pontos de tempo iniciais após estímulo com S. aureus.

Contagens bacterianas no sangue de camundongos que receberam estimulo com S. aureus i.p. foram reduzidas significativamente quando comparado com controles imunizados com PBS (Figuras 15A e 15B). Quatro de seis estudos individuais mostraram uma redução significativa na CFU/ml de san- gueem animais imunizados.

Proteção mediada através de imunização com oe MntC foi demonstrada usando 2 diferentes cepas de estímulo de S. aureus, PFESA0237 (Figura 15A) e PFESAO266 (Figura 156). Exemplo 15: Conjugados de CP5 Protegem no Modelo de Pielonefrite em Murino Conjugados de CP5 foram avaliados com relação à sua capaci- dade de proteger os camundongos em um modelo de imunização ativa con- tra pielonefrite, A Figura 16 mostra os resultados de vários estudos.

Conta- gens bacterianas no sangue de camundongos que receberam estimulo com S. aureus i.p. foram reduzidas significativamente quando comparado com controles imunizados com PBS (Figura 16), Seis de seis estudos individuais mostraram uma redução significativa na CFU/ml nos rins de animais imuni- zados.

Os dados mostraram redução consistente de colonização do rim após

- imunização ativa com conjugado de CP5. Exemplo 16: Conjugados de CP5 Preparados através de Diferentes ] Químicas de Conjugação Protegem Camundongos Contra Infecções Experimentais S Estudos de imunização ativa no modelo de pielonefrite em muri- no foram conduzidos usando conjugados de CP5 preparados através de química com PDPH ou CDT.

Os métodos para conjugação de CP5 ou CP8 ao CRM:97 foram descritos acima.

Os resultados mostraram que ambos os conjugados reduzem significativamente a colonização em camundongos o 10 comparado com os animais simuladamente imunizados (Tabela 14). Tabela 14: Efeito de Conjugação com PDPH vs.

CDT no Modelo de Pielone- frite Estudo f JAntigenos Dot page gue Pi E 1 pg de CP5- CRM.5; (PDPH) a EEE man povo | AIPO, 1,67 + 0,23 |p < 0,0001 e ra cr ER PN Ao Laos came, | 1 pg de CP5- CRM,.; (PDPH) RSS nom promo HAIPO, 1,87 + 0,69 |p<0,0001 o Exemplo 17: Conjugado de CP5 Protege em um Modelo de Endocardite em Rato 15 Quatro estudos foram conduzidos com conjugado CP5-CRM:157 PDPH e um conjugado não relacionado (PP5-CRM; 57) em uma dose de 1 ug.

Os conjugados de CP5 reduziram significativamente a colonização no coração e rins em 2 de 3 experimentos nos quais a cepa de estímulo do Tipo foi PPFESAO0266 (Tabela 15). No terceiro estudo, a titulação geométrica média (GMT) de anticorpo anti-CP5 foi a menor dos três experimentos, mas era apenas ligeiramente menor do que a titulação no experimento anterior (51.000 vs. 67.000).

i 118/134 - Tabela 15: Imunização com CP5-CRM;557 Reduz a cfu em um Modelo de Endocardite em Rato ' logCFU Recupe- à. cnc: rada Significância GMT Composição Estimulo : Titulação imunogênica CepaiDose Coração Rim Coração Rim de CP 1 ug de CP5- 434 + 392 + CRM; 57 PFESA0266 178 173 103.000 TugdePP5- 221 x 10º 7,94 + 6/77 + CRM 57 cfu 078 — ora PÍOOO1 proos 1 ug de CP5- 443 + 3,109 o CRM 57 PFESAD266 2.30 2,33 51.000 Solução sali- 7 5,68 + 419 + 1. na 6,5 x 10 cfu 2.48 205 Não Não “1 ugdeCP5 401 + 390% CRM 57 PFESAO0266 2 49 1.92 67.000 “Solução sali a, 752 + 652 + na 4,0 x 10º cfu 138 117 P<0,0002 p<0,0002 1 pg de CPS- 8,17 * 6,92 t CRM: 57 SA31IS 1.02 1.20 186.000 Solução sali- 9 825 &% 674 t = na 1x10º cfu 0.60 0.95 Não Não Exemplo 18: Conjugados CP5-CRM: 9; em um Modelo de Pielonefrite o Estudos iniciais que investigam a eficácia de conjugados foram realizados com CP5 com MW de 25 kDa.

Aprimoramentos no processo de fermentação resultaram em produção do polissacarídeo de alto MW, o qual foi conjugado à proteina veículo e testado lado a lado com o conjugado de CP5 de 25 kDa.

Conjugados compreendendo CP com MW de 25 kDa (Baixo MW) e 300 kDa (Alto MW) foram preparados usando química de conjugação com CDTe avaliados no modelo de pieloneírite em murino.

Três doses (0,01, 01 e 1 ug) dos conjugados de HMW foram testadas e comparadas com o controle, CPS5-CRM 57 LMW, e um conjugado não relacionado (PP5- CRM: 57) em uma dose de 1 ug.

Os resultados mostraram uma redução signi- ficativa na CFU de S, aureus PFESA0266 recuperada dos rins em uma dose de1 ug Não houve diferença estatística entre a proteção por conjugados o 119/134 preparados com CP5 de diferentes tamanhos na dose de 1 ug (Tabela 16). As menores doses (0,01 ug e 0,1 ug) do conjugado falharam em estimular uma resposta imune suficiente para reduzir significativamente a infecção.

O experimento foi repetido usando um procedimento de imunização e estimu- lação idêntico.

No experimento repetido, apenas a dose de 1 ug de CP5- CRMis7 LMW resultou em uma redução significativa na colonização (p = 0,01). A dose de 1 ug de CPS-CRM+1+57 HMW diminuiu a cfu nos rins, contu- do, a redução não foi estatisticamente significativa (p = 0,056). Tabela 16. Conjugados de CP5 Protegem em um modelo de pielonefrite em o 10 camundongo. 5 — - 0, 0048 1ug de CP5 de 25 kDa- 286 | | E sia | KDa-CRM; 67 5,59 mo kDa-CRM:67 4,70 [686 1ug de CP5 de 25 kDa- 3,25 0, 01 º KM kKkDa-CRM+657 0, 01 ug de CP5 de 300 [eos | KDa-CRM: 57 Exemplo 19: O-Acetilação de Polissacarideo é Importante para Indução de Resposta de Anticorpo Protetora à Formulação Imunogênica com Conjugado de CPS Para avaliar a importância de O-Acetilação de CP5, o CP5 nativo foi de-O-acetilado (dOAc) e conjugado ao CRM1s57 (AOAC-CRM197) usando química de conjugação com PDPH.

A eficácia de conjugado dOAcCP- CRM: 97 foi comparada lado a lado com CP5-CRM1; em um modelo de pie-

PS 120/134 Ú lonefrite em murino, Os resultados mostrou que o conjugado carecendo de grupos O-acetila (CP5 dOAc- CRM197) não é eficaz nesse modelo, conforme demonstrado por nenhuma alteração significativa na colonização bacteriana : nos rins.

Esses dados (Tabela 17) indicam que O- acetilação era importante paraestimulação de anticorpos funcionais contra CP5,. Tabela 17: Imunização com CP5 de-O-acetilado- CRM: 97 Não Protege os Camundongos Contra Colonização do Rim Estudo ft Antigenos CepalDose logCFU/Rim Significância Estudo 11 ug PP5- CRM+197 PFESA0266 3,89 + 2,24 oe 1 ug de CP5 dOAc- CRM977 x 10º 4,20 + 1,75 1 pg CP5- CRM 197 1,75+0,39 p-valor< O, 008 Estudo 2 Solução salina PFESA0266 5,08 + 1,96 1 ug de CP5 dOAc- CRM;5;2,4 x 10º — 5,89 + 1,29 " 1 ug CP5- CRM157 2,93 +2,11 p-valor<0, 02 Exemplo 20: Imunização com CP8-conjugado Reduz a Morte em um modelo de sepsia A eficácia do conjugado CP8-CRM17 foi avaliada no modelo de sepsia em murino após estímulo com S. aureus PFESA0268 (Tipo 8). Ca- mundongos Swiss Webster (n = 30) foram ativamente imunizados através de injeção subcutânea com 1ug de CP8-CRM; 7 e solução salina, ambos for- o mulados com 100 ug de AIPO,. O estudo mostrou uma redução significativa de sepsia (p= 0,0308) quando comparado com camundongos imunizados com AIPO, isoladamente.

Vide Figura 17. Exemplo 21: Avaliação do CP8 Conjugado Nativo e Tratado com Base ] no Modelo de Bacteremia em Murino i A importância de grupos O-acetila presentes sobre CP8 nativo antes conjugação para indução de respostas de anticorpo funcionais foi ava- liada para o conjugado CP8. Polissacarídeo CP8 foi de-O-Acetilado sob condições básicas suaves e RMN e Cromatografia lônica (lon Chromatogra- phy - IC) confirmaram a ausência de O-Acetilação em CP8 de-O-Ac - CRM'157. O modelo de bacteremia em murino foi usado para avaliar eficá-

NS 1211134 cia dos conjugados de CP8 ao CRM:57 nativos versus tratados com base. | * Grupos de camundongos BALB/c fêmeas (15/grupo) foram imunizados nas a semanas 0, 3 e 6 com 1 ug de CP8 de-O-Ac -CRM; 97; ou 1 ug de CP8 O-Ac - CRM157. Formulações imunogênicas foram formuladas com 22 ug de AIPO;,. Os animais foram estimulados com S. aureus PFESAO0003. Três horas pós- estímulo, os camundongos foram sacrificados e as bactérias foram contadas no sangue.

Os dados mostraram que houve uma redução estatisticamente significativa (p = 0, 0362) na cfu bacteriana recuperada do sangue de ani- mais imunizados com conjugado de CP8 nativo não tratado, conforme de- oe 10 terminado por meio do t teste de Student (Tabela 18). Em animais que foram imunizados com conjugado de CP8 tratado com base, a cfu bacteriana recu- perada do sangue foi similar ao grupo de controle com solução salina, Tabela 18: Conjugado CP8-CRM:9; Reduz a Bacteremia por S. aureus PFESAO0003 em Camundongos.

Solução salina PFESADOOS CPB de-O-Ac -CRMi67 | 1147 198 E E CP8 O-Ac -CRM 157 0, 03 Exemplo 22: Confirmação da Importância de O-Acetilação Como Epíto- po Funcional de CP5 pela OPA Usando mabs com Especificidades Co- o nhecidas CP5 monocional anticorpos com especificidades por CP5 OAc+ (CP5-7-1), CPS5 OAc+/- (CP5-5-1) e CP5 OAc- (CP5-6-1) foram avaliados ' 20 quanto à atividade de morte OP contra a cepa PFESA0266 do tipo 5 (Tabela 19). mAbs CP8-3-1 específicos para CP8 OAc+ foram usados como controle ' negativo.

Os resultados mostraram que o mAb CP5-7-1 (CP5 OAc+ especí- ficos) media a morte de ambas as cepas do tipo 5 testadas, Também, o mAb CP5-5-1, que reconhece epítopos compartilhados por CP5 OAc+ e CP5 O- Ac, mediava a morte da cepa PFESA02Z66. Os mAbs específicos para epíi- topos presentes sobre polissacaríideo CP5 OAc- não mediam a morte da cepa PFESA0O266. Esses resultados indicam que epítopos de O-acetila so- bre CP5 estão envolvidos em atividade funcional de anticorpos CP5-

S 122/1134 - específicos.

Tabela 19. mAbs Específicos ao CP5 O-Acetilado (+) e CP5 O- e de-O- ' Acetilado (+/-) são Opsônicos Contra S. aureus PEESA02686 (Tipo 5). CPS-5-1 (O-Ac +/-) | CPS-6-1 (O-Ac -) | CP5-7-1 (O0-Ac +) | CP8-3-1 (controle | fast a faso tes estares [agem pg 20 10 5 25 20 10 5 25 |20 10 5 25] 20 10 5 25 Os dados são reportados como a morte percentual e foram cal- culados determinando-se a proporção do número de cfu que sobrevivem a o 60 minutos em cavidades com bactérias, anticorpos, complemento e células HL-60 para o número de cfu que sobrevivem em cavidades carecendo de : anticorpos, mas contendo bactérias, complemento e células HL-60. Exemplo 23: Atividade opsônica de Anticorpos de camundongo Induzi- daaconjugados de CP5 de alto e baixo MW Soros de camundongos (n = 5) com altas títulações de CP5 por ELISA dos grupos com 1 ug de alto peso molecular e baixo peso molecular do Exemplo 18 foram comparados quanto à atividade opsônica usando S. aureus PEESA0266. Resultados de OPA mostraram que ambos os conju- gados estimularam anticorpos opsônicos em camundongos (Tabela 20). Houve uma tendência observada de que conjugados de alto MW estimulas- oe sem maiores titulações de anticorpos opsônicos.

Os dados são mostrados como uma morte % média + SEM para 5 soros de camundongo individuais.

Anticorpos precisam ser funcionais, conforme medido pela morte de bacté- rias em um modelo de eficácia com animais ou via um ensaio de morte op- . sonofagocítica que demonstra a morte de bactérias por anticorpos.

Morte funcional pode não ser demonstrada usando um ensaio que monitora ape- nas a geração de anticorpos isoladamente, o qual não é indicativo da impor- tância de conjugados de alto peso molecular na eficácia.

| o. 123/134 ' Tabela 20: Conjugados de CP5 LMW e HMW estimulam anticorpos opsôni- cos e Exemplo 24: Atividade Opsôónica de Soros de Camundongos Imuniza- dos com Conjugados de CP8 Nativos e Quimicamente Modificados "5 Soros de camundongo selecionados (n = 5) com altas titulações . de CP8 do estudo no Exemplo 21 foram comparados quanto à atividade op- sônica usando a cepa PFESAO0O0OS, Os resultados de OPA (Tabela 21) mos- tram que apenas conjugados preparados por meio da conjugação de CP8 nativo estimularam anticorpos opsônicos em camundongos.

Não é surpre- endente que o conjugado de CP8 de-OAc era imunogênico em camundon- gos, mas os anticorpos estimulados não eram opsônicos nesse ensaio.

As titulações de OPA são reportadas como a recíproca da diluição na qual mor- oe te de 40% foi observada.

Anticorpos precisam ser funcionais, conforme me- dido pela morte de bactérias em um modelo de eficácia com animais ou via um ensaio de morte opsonofagocítica que demonstra a morte de bactérias por anticorpos.

Morte funcional pode não ser demonstrada usando um en- ' saio que monitora apenas a geração de anticorpos isoladamente, 0 qual não : é indicativo da importância de O-acetilação na eficácia.

Tabela 21. Atividade Opsônica de CP8 Nativo vs.

CP8- CRM 67 de-O-Ac Titulação OP em | Titulação OP em soros WkO soros WkK8 soros WkO em soros Wk8 E [50 aso

' 124/134 ' CP8- CRM:57 de-O-Ac CP8- CRM'167 ] <50 <50 <50 4050 . Exemplo 25: Morte das Cepas do Tipo 8 por AntisSoros de Primata Não : Humano com Conjugado de CP8 é Inibida Pela Adição de CP8 Nativo . Para confirmar a especificidade da atividade de morte nos soros de primatas não humanos imunizados com CP8-conjugado, um ensaio foi realizado na presença de CP8 nativo.

O método OP 1l foi usado com as se- guintes modificações.

Diluições seriais duplas de amostras de anticorpo (25 pl) foram preparadas e seguido pela adição de 150 ul (competidor Pn14) ou o 125 ul (competidor CP8) de tampão de ensaio à suspensão de anticorpo, O competidor era polissacaríideo CP8 purificado (poli CP8) e polissacarídeo pneumocócicos não relacionado (poli Pn14) foi usado como um controle.

Os polissacarídeos foram adicionadas (50 ug) à suspensão de anticorpo e a lâmina incubada a 4ºC durante 30 minutos com mistura final.

Após incuba- ção com polissacarídeos, bactérias foram adicionadas (25 ul) às lâminas e colocadas sobre um agitador giratório a 4 ºC durante 30 minutos seguido pela adição de 25 pl de complemento humano (concentração final de 1%). Os resultados (Tabela 22) mostraram que a presença de CP8 nativo na mis- tura de reação inibiu a morte opsonofagocítica de S. aureus Tipo 8. Esses e resultados confirmam que morte opsonofagocítica por soros imunes foi me- diada por Abs cápsula-específicos.

Tabela22 Adição de Polissacarídeo CP8 Inibe a Morte Opsonofagocítica de S. aureus por Soros Imunes . Macaco S 4050 oanD1SS (Wk5 +20 ugdepoliPnia Jaoso PE = Wks AsN122 WNKO + 20 ug de poli CP8

: ÍMacaco — | Amostras de soro Titulação de OPA | : WKO + 20 ug de poli Pn14 <50

ESTA : Exemplo 26: Anticorpos Naturalmente Adquiridos ao CIfA Mediam Mor- , te Opsonofagocítica de S. Aureus Seres humanos na população são naturalmente expostos à S. aureus e, assim, têm anticorpos pré-existentes a essas bactérias em sua circulação. Nós purificamos por afinidade anticorpos anti-CIfA de soro huma- no e avaliamos se os anticorpos poderiam mediar a morte opsônica. Foi o mostrado que anticorpos ao CIfA são opsônicos para polissacarideo capsu- lar de S. aureus (dados não mostrados). À cepa PFESAO0266 foi crescida durante a noite em caldo Columbia com NaCl a 2%. As bactérias foram op- sonizadas com IgG humana purificada por afinidade ao CIfA ou IgG humana purificada por afinidade a um antígeno irrelevante (controle negativo, protei- na SCP estreptocócica) e a atividade opsônica testada. Células HL-60 dife- renciadas foram usadas no ensaio opsonofagocítico em uma proporção de efetuador/alvo de 100:1. Como um controle adicional, um mAb ao CP5 foi incluído no experimento para demonstrar a presença de CP5 sobre a super- fície. Os resultados são a média de dois experimentos independentes. Anti- e corpos específicos ao CIfA e CP5 mediam a morte opsônica e anticorpos SCP específicos (controle negativo) não tiveram atividade nesse ensaio, Exemplo 27: Conjugado CP5-CRM1; Estimula Anticorpos Opsônicos . 20 em bPrimatas Não Humanos (Non Human Primate - NHP) Para comparar a funcionalidade de conjugados CPS5-CRM:+:97 de W alto vs. baixo peso molecular em NHP, grupos de cinco macacos foram imu- nizados com doses de 2 e 20 ug dos conjugados com ou sem adjuvante Al- PO. Os macacos receberam as primeira e segunda vacinações nos dias 0 e 28,respectivamente. Sangues dos dias O, 14, 28 e 42 foram testados quanto à atividade OP. Os resultados são resumidos na Tabela 23. O conjugado HMW a 20 ug teve as maiores titulações OP comparado com outros grupos. Também, a frequência de macacos OP posítivos foi maior em ambas as do- ses dos grupos com alto MW do que par aos grupos com baixo MW corres-

- pondentes. Esses resultados demonstram que há uma tendência de que o conjugado CP5-CRM;s; HMW estimule melhores respostas OP do que o " conjugado de CP5 LMW em NHP.

Ú Tabela 23. OPA de soro de NHP após imunização com conjugados de CP5. vv Ttwtação de OPA (morte de 40%) "> [eme Tess 0ao fam [nas JDas | A2NOS53 450 1350 4050 4050 dos de CP5| 1490 <100 | 4050 4050 4050 0, 5 ma/mL de AL A4LO69 <100 [450 150 <100 PO; 9 A1NO97 <100 |4050 1350 1350 A4L014 <100 |<100 <100 <100 o 02D125 <100 |150 150 <100 MO) o CP5 | a4L081 |<100 |150 150 150

0. 5 ma/mL de AL A2ZNOSS5 150 450 150 150 PO; 9 A4NO84 <100 |<100 <100 <100 A1NO85S <100 [150 450 4050 A4L084 150 150 <100 <100 2 pg de CP5|97N004 150 450 450 450 (HMW) A4LO55 <100 |<100 <100 <100 sem AIPO, 97N123 <100 |<100 150 150 225N <100 |<100 <100 <100 02D017 <100 |<100 <100 <100 AMI: de CPS/a4nIDO <100 |150 150 4050 0, 5 mg/ml de Al- 257N <100 [<100 <100 <100 PO. 9 A4LO46 <100 |<100 <100 <100 o A1NOS8 <100 |150 <100 <100 96N022 150 150 450 150 am 2º CPS | 920005 —l<100 |1350 450 1350 . O, 5mg/mL de Al 02D113 <100 |150 150 <100 PO; AZNO40 150 150 <100 <100 . A4LOS6 150 150 <100 <100 Exemplo 28:Polissacarideos Capsulares Conjugados Compreendendo Polissacarídeos de Alto Peso Molecular Mostram Imunogenicidade In- tensificada Comparado Com Conjugados Compreendendo Polissacari- deos de Baixo Peso Molecular. Estudos com primatas não humanos (Non Human Primata - NHP) foram conduzidos para avaliar a imunogenicidade de diferentes formu- lações de conjugado capsular. Duas formulações foram testadas em dois

' 127/134 níveis de dosagem diferentes (2 e 20 po), A primeira formulação era com- Ú posta de um polissacarídeo de alto peso molecular (High Molecular Weight - ' HMW) (aproximadamente 130 kDa) conjugado ao CRM: 57. A segunda formu- 7 lação continha um polissacarideo de baixo peso molecular (Low Molecular : 5 Weight-LMW) (aproximadamente 25 kDa) conjugado ao CRM157. Grupos de cinco primatas foram vacinados com uma única dose de qualquer vacina e as titulações imunes foram monitoradas antes de vacinação e duas semanas pós-vacinação. As titulações de OPA foram definidas como a diluição de so- ro requerida para matar 40% da cepa PFESA0266 de S. aureus em um en- o 10 saiode OPA. As titulações de anticorpo foram também monitoradas por E- LISA. Atividade intensificada foi observada para a vacina HMW comparado com a formulação LMW (Tabela 24), evidenciado por uma elevação de dez vezes nas titulações de anticorpo para a vacina HMW comparado com a va- cina LMW. A taxa de respondedores de OPA para os NHPs que receberam avacina HMW também foi maior (80% comparado com 40%). Tabela 24. Imunogenicidade intensificada é observada para vacinas de po- lissacarideo conjugado HMW comparado com vacinas de polissacarideo conjugado LMW. = ee Nível de dose de | Média geomé-| Taxa de respondedor CPSCRMIST O o ânen de PDT? (mcg) por animal o HMW (25/20 | 80 LMW (25KkDa) |20 40 a ' * Vezes de elevação calculada a partir da titulação de CP5 por ELISA 2 sema- nas pós-vacinação comparado com as titulações pré-vacina.

: + Taxa de respondedor calculada a partir de macacos que geraram uma eleva- ção na titulação de OPA após uma única dose de vacina 2 semanas pós- vacinação. Cada grupo continha 5 macacos Rhesus e as vacinas foram formu- ladas com AIPO, (250 mcg/dose) Exemplo 29: Respostas de Anticorpo à Formulação Bi-Antigênica (CP5- CRM; eClfA) em Primatas não humanos Para avaliar a resposta imune a uma única dose de composi- ções imunogênicas com dois antígenos (CP5-CRM; 57 e CIfA) em NHP, gru-

. pos de cinco macacos foram imunizados com diferentes doses dos dois an- tígenos sem a adição de AIPO,. Sangues dos dias 0, 14 e 28 foram testados Ú quanto à atividade opsonofagocítica (OP) e titulações por ELISA e os resul- tados são resumidos na Tabela 24. Os resultados mostraram que atividade : 5 OP foiconsistentemente observada em animais imunizados com CP5 quan- do comparado com um grupo com CP5 simulado. Em geral, o grupo com 100 ug teve as maiores titulações de ELISA e OP comparado com outros grupos, Não houve atividade de morte OP observada com soros do grupo que recebeu apenas CIfA. Nenhuma interferência foi observada nos grupos o 10 quereceberam doses crescentes de CIfA ou CP5. Vide Tabela 25. Tabela 25: Resultados de OPA do Estudo de Imunização Bi-Valente em

NHP Grupo A Número de ID fara — [10 — 150 — [<10 180ugeNa+ — | ASROS6 2019 130kDa — | AANOST CP5 No aros 180pgera+ — |97NI49 150 <100 e nem as CP NS oo ao aso [100 faso faso

RALOOS 60 ug CHA + A4R029 | <100 1350 2019 130xDa — | ASNOTS cPs Ama [150 [ao50 — Taoso <100 <100 A1NO40 <100 150 cougeras — ANOS too 1350 too Moss so 150 [o | CP oENas <1o0 A4R032 Bm eres eo eso so

- 129/134 130 kDa AINTIB <io —f150 156 cPs Aros o Ria [ro aos 1350

PARTOS 20 19 ANIS 00 150 — 150 — | 130 kDa 95N038 <100 <100 <100 <100 150 1506 o AAN11G6 450 laso — | 100 va ANOS? 130 KDa AANTOS CP Eno 10 1350 —faoso — | 97N057 A4AR112 EEE 60 ug CIfA A4L022 <100 <100 g7N100 == É E Modelos animais Demonstram o Potencial de Antígenos de Polissacaríideo Capsular CP5 e CP8 de S. aureus 8 Conjugados CP5-CRM19; e CP8-CRM157 induziram à respostas de anticorpo sorotipo capsular-específicos em camundongos, ratos, coelhos eprimatas não humanos (NHP). Os conjugados que induziram a anticorpos eram funcionais no ensaio de morte por opsonofagocitose funcional in vitro. ' Foram gerados dados para demonstrar que O-Acetilação é importante para ã estimulação de anticorpos protetores para CP5 e CP8 e que grupos O- acetila são parte de um epítopo reconhecido por mAbs OPA” contra CP5. —mAbs que reconhecem CP5 nativo, o qual é O-acetilado, são funcionais em OPA e mediam a morte das bactérias. O conjugado de CP8 induziu a anti- corpos funcionais em camundongos e coelhos que mediavam a morte da cepa do Tipo 8 em OPA. A especificidade de morte por anticorpos políclo- nais ou monoclonais foi confirmada pela eliminação da morte após adição do

| 130/134 polissacarídeo nativo homólogo ao ensaio, Os vários modelos de imunização * "foram usados para mostrar a eficácia pré-clínica de conjugados CP5- e CP8- CRM:157. O conjugado CPS5 mostrou eficácia consistente no modelo de pielo- nefrite em murino e no modelo de endocardite em rato.

A importância de O- . 5 acetilaçãode CP5 foi confirmada no modelo de pielonefrite em murino, onde CP5 de-O-acetilado conjugado ao CRM197 falhou em proteger os animais contra infecção experimentais.

A combinação dos conjugados em uma formulação biantigênica induziu a anticorpos às cápsulas CP5 e CP8 e não houve interferência com o 10 os níveis de anticorpo específicos induzidos comparado com imunizações com um único antígeno.

A combinação de conjugados e CIfA em uma formu- lação triantigênica induziu a altos níveis de CP5, CP8 e CIfA e não houve interferência com as respostas de anticorpo induzidas contra qualquer antí- geno presente na combinação.

As composições imunogênicas triantigênicas induziram à respostas de anticorpo (Ab) capazes de serem reforçadas a to- dos os três componentes em coelhos com altas titulações pré-imunes.

Esses resultados sugerem que CP5 e CP8 conjugados ao CRM197 deverão ser incluídos como componentes de uma formulação imu- nogênica de uma composição imunogênica que protege contra S. aureus.

Exemplo 30: Requisito de Diferentes Antígenos para Proteger Contra [O Múltiplas Possíveis Doenças por S. aureus S. aureus cause uma ampla série de infecções oscilando de in- fecções relativamente brandas na pele à infecções mais graves e invasivas, é tais como endocardite, fasciite necrozante, osteomiíelite, artrite séptica e pneumonia.

Cada um desses locais in vivo é único e provavelmente as bac- ' térias respondem à diferenças nos estímulos ambientais ao alterar seus per- fis de expressão antigênica para aqueles mais adequados para que a cepa individual colonize, cresça e, por fim, cause doença.

Conforme exemplificado no Exemplo 12, cepas de S. aureus mostram diversidade de expressão anti- gênicainvivo É mais provável que uma composição imunogênica com múl- tiplos componentes composta de diferentes antígenos proteja contra as di- versas manifestações doentias causadas por S. aureus.

- Foi mostrado que CIfA protege em modelos de endocardite e sepsia em roedor.

Foi reportado que CIfB é importante em colonização nasal ] de S. aureus.

MntC protegeu camundongos em um modelo de bacteremia ' em murino.

O conjugado CP5 protegeu em pielonefrite e endocardite e o conjugado CP8 protegeu em modelos de sepsia e pielonefrite em roedor.

Esses resultados demonstram que uma vacina com múltiplos componentes contendo esses antígenos protegerá contra múltiplos tipos de doença por S, aureus.

Modelos animais in vivo se aproximam do curso de uma infecção [ 10 reale ajudam a elucidar quais antígenos podem ser úteis em proteção con- tra uma doença em particular.

A Tabela 26 resume os resultados de nume- rosos experimentos realizados em vários modelos in vivo.

Os resultados são reportados em cada bloco como quatro números separados por uma barra, por exemplo, CIfA, em um modelo de sepsia, tem o números 27/1/3/31. O primeiro número representa o número de experimentos onde imunização com CflA produziu um resultado positivo estatisticamente significativo de proteção.

O segundo número representa o número de experimentos onde imunização com CfIA produziu um resultado positivo de proteção que tendia à significância, mas não foi estatisticamente significativo.

O terceiro número representa o número de experimentos onde imunização com CfIA produziu * um resultado negativo, mas não foi estatisticamente significativo.

O quarto número é o número total de experimentos realizados.

A soma dos primeiros três números deverá ser igual ao quarto número.

S Tabela 26. Sumário de Proteção em Modelos Animais Contra Antigenos de , S aureus i [feras = ces —==jcreg ==UlMec? = [sena =— rm [vom INT NT NT: Não Testado

. Exemplo 31: Testagem de Várias Composições Imunogênicas com Múl- tiplos Antígenos !n Vitro e In Vivo ' Várias formulações imunogênicas estafilocócicas com múltiplos antígenos contendo três, quatro ou cinco antígenos selecionados dos poli- peptideos e/ou polissacarideos a seguir são testados quanto à imunogenici- ' dade e eficácia em vários modelos in vivo: CIfA, CIfB, MntC, CP5- e CP8. À composições imunogênicas são como segue:

(1) uma composição imunogênica compreendendo: um polipep- tídeo de fator A de aglutinação (CIfA) isolado de S. aureus, um polissacari-

e 10 deo capsular do tipo 5 de S. aureus isolado conjugados ao CRM;57 e um po- lissacarídeo capsular do tipo 8 de S. aureus isolado conjugados ao CRM: 597;

(2) Uma segunda combinação proporciona fator A de aglutina- ção (CIfA), fator B de aglutinação (CIfB), uma MntC isolada, polissacarideo capsular estafilocócico CP5 isolado conjugado ao CRM157 e polissacarideo capsular estafilocócico CP8 isolado conjugado ao CRM:197;

(3) Uma terceira combinação proporciona uma composição imu- nogênica compreendendo: um polipeptídeo de fator A de aglutinação (CIfA) isolado de S. aureus, um polipeptídeo de fator B de aglutinação (CIfB) isola- do de S. aureus ou uma proteina MntC isolada de S. aureus, um polissacaríi-

deocapsulardo tipo 5deS. aureus isolado conjugados ao CRM157 & um po- [ lissacarideo capsular do tipo 8 de S. aureus isolado conjugados ao CRM: 97;

(4) Uma quarta combinação proporciona uma composição imu-

nogênica compreendendo: um polipeptídeo de fator B de aglutinação (CIfB)

' isolado de S. aureus, um polissacaríideo capsular do tipo 5 de S. aureus iso-

lado conjugados ao CRM; e um polissacarideo capsular do tipo 8 de S. aureus isolado conjugados ao CRM 197;

(5) Uma quinta combinação proporciona uma composição imu- nogênica compreendendo: um polipeptídeo de fator B de aglutinação (CIfB) isolado de S. aureus, uma proteína MntC isolada de S. aureus, um polissa-

—carídeo capsular do tipo 5 de S. aureus isolado conjugados ao CRM: 57 e um polissacarideo capsular do tipo 8 de S. aureus isolado conjugados ao CRM157; e

- 133/134 . . (6) Uma sexta combinação proporciona uma composição imuno- gênica compreendendo: um polipeptídeo de fator A de aglutinação (CITA) Ú isolado de S. aureus, um polipeptídeo de fator B de aglutinação (CIFB) isola- , do de S. aureus e uma proteina MntC isolada de S. aureus.

TCIfA e rCIfB são preparados e purificados conforme descrito no : Exemplo 1. MntC é preparada e purificada conforme descrito no Exemplo 2. CP5 e CP8 isolados são preparados e purificados conforme descrito no E- xemplo 3 e são conjugados ao CRM; 57 conforme descrito no Exemplo 4. Mais particularmente, os procedimentos descritos nos Exemplos oe 10 anteriores acima são usados para medir a imunogenicidade e eficácia.

Estu- dos são feitos para determinar se cada um dos três, quatro ou cinco compo- nentes, quando distribuídos isoladamente ou juntos, induzem a uma respos- ta imune.

Esses mesmos estudos são usados para determinar se a presença . de qualquer um dos quatro ou cinco componentes interferes ou não com a capacidade de qualquer um dos outros três ou quatro componentes de indu- zir a uma resposta imune.

Além disso, estudos são feitos para determinar se os quatro ou cinco componentes, quando testados isoladamente ou quando testados juntos, conferirão proteção em qualquer um ou mais dos modelos com animal descritos acima.

Os quatro ou cinco componentes são adminis- trados como uma única dose ou como múltiplas doses a um animal, por e- o xemplo, camundongos, ratos, coelhos ou primatas não humanos, conforme notado nos exemplos anteriores acima.

O sangue dos animais é colhido e o soro coletado e testado com relação à presença de anticorpos a cada dos quatro ou cinco componentes.

A presença de anticorpos antígeno- ' 25 específicos é medida por meio de qualquer imunoensaio conhecido por a- . queles versados no campo, por exemplo, um ELISA (Vide Exemplos 11-29) ou um Western blot (Vide Exemplo 1) é usado para avaliar a presença ou ausência de anticorpos antigeno-específicos.

Além disso, um ensaio opso- nofagocitico é usado para determinar se os anticorpos antigeno-específicos são eficazes ao mediar a morte dos organismos estafilocócicos por células fagocíticas (Vide Exemplos 11-29). A eficácia in vitro é também avaliada usando qualquer um ou ,

* mais dos estudos com animais descritos acima tais como, mas não limitado “” a,omodelo de tubulação in-dwelling; o modelo de bacteremia em murino; o - modelo de infecção por ferimento; o modelo de pielonefrite em murino; o ' modelo de endocardite em rato e o modelo de sepsia em murino (Vide E- xemplos 11-30). Exemplo 32: Combinações de Antígenos de S. aureus Geram Anticor- pos em Primatas Não Humanos Que Intensificam a Morte da Cepa Pfe5-1 de S.

Aureus.

Eficácia intensificada, conforme medido usando o ensaio de oe 10 OPA, foi observada usando combinações de antígenos.

Um estudo com pri- mata não humano foi conduzido onde grupos de 3-10 macacos foram imuni- zados com vacinas com múltiplos componentes, Os animais receberam uma única dose de vacina e as titulações de OPA foram monitoradas no dia 0 e duas semanas pós-vacinação.

As titulações de OPA foram definidas como a diluição de serum requerida para matar 50% da cepa Pfe5-1 de S. aureus em um ensaio de OPA.

Atividade intensificada foi observada para uma com- binação de 4 antígenos comparado com uma formulação de vacina com 3 antígenos (p = 0, 0272; Figura 18). oe

Claims

| 1/10 ' . REIVINDICAÇÕES

1. Composição imunogênica compreendendo pelo menos três ' componentes selecionados do grupo consistindo em: um polipeptídeo de fator A de aglutinação (CIfA) isolado de S. aureus, um polipeptídeo de fator B de aglutinação (CIfB) isolado de S. aureus, uma proteina MntC isolada de S. | aureus, um polissacarídeo capsular do tipo 5 de S. aureus isolado conjugado a uma proteína veículo e um polissacarideo capsular do tipo 8 de S. aureus isolado conjugado a uma proteina veículo.

2. Composição imunogênica compreendendo: um polipeptideo o 10 de fator A de aglutinação (CIfA) isolado de S. aureus, um polissacarideo capsular do tipo 5 de S. aureus isolado conjugado a uma proteína veículo e um polissacarídeo capsular do tipo 8 de S. aureus isolado conjugado a uma proteína veículo.

3. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação 2, ainda compreendendo um polipeptídeo de fator B de aglutinação (CIfB) iso- lado de S. aureus.

4. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação 2 ou 3, ainda compreendendo uma proteina MntC isolada de S. aureus.

5. Composição imunogênica de acordo com qualquer uma das reivindicações 14 , em que o polipeptídeo de CIfA ou de CIfB é um fragmen- oe to polipeptídico compreendendo o domínio de ligação a fibrinogênio de CIfA ou CIfB.

6. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação 5, em que o fragmento de polipeptídeo de CIfA ou de CIfB é um domínio de ' 25 ligação a fibrinogênio compreendendo os domínios N1, N2 e N3 de CIfA ou . CIfB.

7. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação 5, em que o fragmento de polipeptídeo de CIfA ou de CIfB é um domínio de ligação a fibrinogênio compreendendo os domínios N2 e N3 de CIfA ou CIfB.

8. Composição imunogênica de acordo com qualquer uma das reivindicações 5, 6 ou 7, em que o domínio de ligação a fibrinogênio de CIfA se liga ao fibrinogênio em um nível reduzido comparado com a ligação ao

- fibrinogênio observada com o dominio de CIfA de ligação ao fibrinogênio na- tivo. ' 9. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação 8, ' em que o domínio de ligação a fibrinogênio de CIfA se liga ao fibrinogênio emum nível reduzido comparado com a ligação ao fibrinogênio observada com o domínio de CIfA de ligação ao fibrinogênio nativo por ter uma substitu- ição de aminoácido em um ou mais de Tyr 338, Tyr 256, Pro 336, Lys 389, Ala 254 e lle 387.

10. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação 9, o 10 emque a substituição de aminoácido em um ou mais de Tyr 338, Tyr 256, Pro 336, Lys 389, Ala 254 e lle 387 é para Ala ou Ser,

11. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação 10, em que a Tyr 338 é substituída por Ala.

. 12. Composição imunogênica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-11, em que o CIfA, o CIfB ou MntC são produzidos recom- binantemente.

13. Composição imunogênica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-12, em que o polissacarideo capsular do tipo 5 é um polis- sacarideo capsular de alto peso molecular de entre 20 e 1000 kDa.

14. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação 13, eo em que o polissacarídeo capsular do tipo 5 de alto peso molecular tem um peso molecular de entre 70 e 300 kDa.

15. Composição imunogênica de acordo com qualquer uma das ' reivindicações 1-14, em que o polissacarídeo capsular do tipo 5 é entre 10% e100% O-acetilado.

16. Composição imunogênica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-14, em que o polissacaríideo capsular do tipo 5 é entre 50 e 100% O-acetilado.

17, Composição imunogênica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-14, em que o polissacarídeo capsular do tipo 5 é entre 75% € 100% O-acetilado.

18. Composição imunogênica de acordo com qualquer uma das

' reivindicações 1-17, em que o polissacarideo capsular do tipo 8 é um polis- * sacarideo capsular de alto peso molecular de entre 20 e 1000 kDa. ' 19. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação 18, em que o polissacarídeo capsular do tipo 8 de alto peso molecular tem um pesomolecular de entre 70 e 300 kDa,

20. Composição imunogênica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-19, em que o polissacarideo capsular do tipo 8 é entre 10% e 100% O-acetilado.

21. Composição imunogênica de acordo com qualquer uma das o 10 reivindicações 1-19, em que o polissacarideo capsular do tipo 8 é entre 50 e 100% O-acetilado.

22. Composição imunogênica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-19, em que o polissacarídeo capsular do tipo 8 é entre 75% - € 100% O-acetilado.

23. Composição imunogênica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-22, em que a proteína veiculo é o toxoide CRM;19; de C. diphtheriae.

24. Composição imunogênica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 4-23, em que a proteína MntC de S. aureus é uma prote- inalipidada. eo

25. Composição imunogênica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 4-23, em que a proteina MntC de S. aureus não é uma proteína lipidada. '

26. Composição imunogênica compreendendo: um polipeptídeo de fator B de aglutinação (CIfB) isolado de S. aureus, um polissacarideo capsular do tipo 5 de S. aureus isolado conjugado a uma proteína veículo, e um polissacarideo capsular do tipo 8 de S. aureus isolado conjugado a uma proteína veículo.

27. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação 23, ainda compreendendo uma proteína MntC isolada de S. aureus.

28. Composição imunogênica de acordo com as reivindicações 26 ou 27, em que o polipeptídeo de CIfB é um fragmento polipeptídico com-

. preendendo o domínio de ligação a fibrinogênio de CIfB.

29. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação 28, . em que o fragmento de polipeptídeo de CIfB é um domínio de ligação a fibri- nogênio compreendendo os domínios N1, N2 e N3 de CIfB.

30. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação 28, em que o fragmento de polipeptídeo de CIfB é um domínio de ligação a fibri- nogênio compreendendo os domínios N2 e N3 de CIfB.

31. Composição imunogênica de acordo com qualquer uma das reivindicações 28, 29 e 30, em que o domínio de ligação a fibrinogênio de o 10 CIfBse liga ao fibrinogênio em um nível reduzido comparado com a ligação ao fibrinogênio observada com o domínio de ligação a fibrinogênio de CIÍB nativo.

32. Composição de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 26-31, em que o CIfB ou a proteina MntC são produzidos recombinan- temente.

33. Composição imunogênica de acordo com qualquer uma das reivindicações 26-32, em que o polissacarideo capsular do tipo 5 é um polis- sacarideo capsular de alto peso molecular de entre 20 e 1000 kDa.

34. Composição imunogênica de acordo com qualquer uma das reivindicações 26-32, em que o polissacarídeo capsular do tipo 5 de alto pe- o so molecular tem um peso molecular de entre 70 e 300 kDa.

35. Composição imunogênica de acordo com qualquer uma das reivindicações 26-34, em que o polissacarídeo capsular do tipo 5 é entre º 10% e 100% O-acetilado.

36. Composição imunogênica de acordo com qualquer uma das reivindicações 26-34, em que o polissacarideo capsular do tipo 5 é entre 50 e 100% O-acetilado.

37. Composição imunogênica de acordo com qualquer uma das reivindicações 26-34, em que o polissacaríideo capsular do tipo 5 é entre 75%e100% O-acetilado,

38. Composição imunogênica de acordo com qualquer uma das reivindicações 26-37, em que o polissacarideo capsular do tipo 8 tem um peso molecular de entre 20 e 1000 kDa. | :

39. Composição imunogênica de acordo com qualquer uma das - reivindicações 26-37, em que o polissacarídeo capsular do tipo 8 tem um peso molecular de entre 70 e 300 kDa.

40. Composição imunogênica de acordo com qualquer uma das reivindicações 26-39, em que o polissacarideo capsular do tipo 8 é entre 10% e 100% O-acetilado.

41. Composição imunogênica de acordo com qualquer uma das reivindicações 26-39, em que o polissacarídeo capsular do tipo 8 é entre 50 o 10 e100% O-acetilado,

42. Composição imunogênica de acordo com qualquer uma das reivindicações 26-39, em que o polissacarideo capsular do tipo 8 é entre 75% e 100% O-acetilado.

43. Composição imunogênica de acordo com qualquer uma das reivindicações 2742, em que a MntC de S. aureus é uma proteína lipidada.

44. Composição imunogênica de acordo com qualquer uma das reivindicações 27-42, em que a MntC de S. aureus não é uma proteina lipi- dada.

45. Composição imunogênica de acordo com qualquer uma das reivindicações 26-44, em que a proteina veículo é o toxoide CRM 5; de o C. diphtheriae.

46. Composição imunogênica compreendendo: um polipeptideo de fator A de aglutinação (CITA) isolado de S. aureus, um polipeptídeo de . fator de aglutinação B (CIfB) isolado de S. aureus e uma proteina MntC iso- ladadeS. aureus.

47. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação 46, em que o polipeptídeo de CIfA é um fragmento polipeptídico compreendendo o domínio de ligação a fibrinogênio de CIA.

48. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação 47, emqueo fragmento de polipeptídeo de CITA é um domínio de ligação a fibri- nogênio compreendendo os domínios N1, N2 e N3 de CIfA.

49. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação 47,

em que o fragmento de polipeptideo de CIfA é um dominio de ligação a fibri- i * nogênio compreendendo os dominios N2 e N3 de CITA.

.

50. Composição imunogênica de acordo com qualquer uma das reivindicações 47, 48 e 49, em que o domínio de ligação a fibrinogênio de CIfAse liga ao fibrinogênio em um nível reduzido comparado com a ligação ao fibrinogênio observada com o domínio de CIfA de ligação ao fibrinogênio nativo.

51. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação 50, em que o domínio de ligação a fibrinogênio mostram ligação reduzida ao s 10 fibrinogênio por ter uma substituição de aminoácido em um ou mais de Tyr 338, Tyr 256, Pro 336, Lys 389, Ala 254 e lle 387.

52. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação 51, em que a substituição de aminoácido em um ou mais de Tyr 338, Tyr 256, : Pro 336, Lys 389, Ala 254 e lle 387 é to Ala ou Ser.

53. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação 52, em que a Tyr 338 é substituída por Ala.

54. Composição imunogênica de acordo com qualquer uma das reivindicações 46-53, em que o polipeptídeo de CIfB de S. aureus é um fragmento polipeptídico compreendendo o domínio de ligação a fibrinogênio decCilfB.

o 55. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação 54, em que o fragmento de polipeptídeo de CIfB de S. aureus é um domínio de ligação a fibrinogênio compreendendo os dominios N1, N2 e N3 de CIfB.

* 56. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação 54, emque o fragmento de polipeptídeo de CIfB de S. aureus é um domínio de Ú ligação a fibrinogênio compreendendo os domínios N2 e N3 de CIfB.

57. Composição imunogênica de acordo com qualquer uma das reivindicações 46-56, em que a MntC de S. aureus é uma proteína lipidada.

58. Composição imunogênica de acordo com qualquer uma das reivindicações 46-56, em que a MntC de S. aureus não é uma proteina lipi- dada.

59. Composição imunogênica compreendendo: uma proteína

' MntC isolada de S. aureus, um polissacarídeo capsular do tipo 5 de S. au- * reus isolado conjugado a uma proteina veículo e um polissacarídeo capsular . do tipo 8 de S. aureus isolado conjugado a uma proteína veículo.

60. Composição de acordo com a reivindicação 59, em que a proteina MntC é produzida recombinantemente.

61. Composição imunogênica de acordo com as reivindicações 59 ou 60, em que o polissacarídeo capsular do tipo 5 é um polissacarídeo capsular de alto peso molecular de entre 20 e 1000 kDa.

62. Composição imunogênica de acordo com qualquer uma das o 10 reivindicações 59-61, em que o polissacarideo capsular do tipo 5 de alto pe- so molecular tem um peso molecular de entre 70 e 300 kDa.

63. Composição imunogênica de acordo com qualquer uma das reivindicações 59-62, em que o polissacarídeo capsular do tipo 5 é entre . 10% e 100% O-acetilado.

64. Composição imunogênica de acordo com qualquer uma das reivindicações 59-62, em que o polissacarideo capsular do tipo 5 é entre 50 e 100% O-acetilado.

65. Composição imunogênica de acordo com qualquer uma das reivindicações 59-62, em que o polissacarideo capsular do tipo 5 é entre 75%e100% O-acetilado.

o 66. Composição imunogênica de acordo com qualquer uma das reivindicações 59-65, em que o polissacarídeo capsular do tipo 8 tem um peso molecular de entre 20 e 1000 kDa.

' 67. Composição imunogênica de acordo com qualquer uma das reivindicações 59-65, em que o polissacarídeo capsular do tipo 8 tem um i peso molecular de entre 70 e 300 kDa.

68. Composição imunogênica de acordo com qualquer uma das reivindicações 59-67, em que o polissacarídeo capsular do tipo 8 é entre 10% e 100% O-acetilado.

69. Composição imunogênica de acordo com qualquer uma das reivindicações 59-67, em que o polissacarídeo capsular do tipo 8 é entre 50% e 100% O-acetilado.

70. Composição imunogênica de acordo com qualquer uma das | reivindicações 59-67, em que o polissacarideo capsular do tipo 8 é entre . 75% e 100% O-acetilado, .

71. Composição imunogênica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-70, ainda compreendendo pelo menos uma proteina da fa- ' mília de proteina com repetição de serina-aspartato (Sdr) selecionada do grupo consistindo em SdrC, SdrD e SdrE.

72. Composição imunogênica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-71, ainda compreendendo a proteína determinante na su- oe 10 perfíciedeferroB (IsdB).

73. Composição imunogênica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1- 72, ainda compreendendo um adjuvante.

74. Composição imunogênica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-73, ainda compreendendo um veículo farmaceuticamente aceitável.

75. Composição imunogênica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-74, ainda compreendendo qualquer um dos seguintes antí- genos: Opp3a, DItD, HtsA, LtaS, IsdA, IsdC, SdrF, SdrG, SdrH, SMA, SpA, Sbi FmtB, alfa-hemolisina (hla), beta-hemolisina, proteina A de ligação à fi- bronectina (fnbA), proteina B de ligação à fibronectina (fnbB), coagulase, o Fig, map, leucocidina de Panton-Valentine (pvl), alfa-toxina e suas variantes, gama-toxina (hlg) e variantes, ica, transportador ABC imunodominante, transportador de Mg2+, transportador ABC de Ni, RAP, autolisina, recepto- . res de laminina, ISaA/PisA, IsaB/PisB , SPOIIIE, SsaA, EbpS, Sas A, SasF, SasH,EFB(FIB), SBl, Npase, EBP, proteina Il de sialo ligação óssea, pre- ' cursor de aureolisina (AUR)/Sepp1, Cna e fragmentos do mesmo, tais como M55, TSST-1, mecA, exopolissacarídeo de poli-N-acetilglucosamina (PNAG/dPNAG), GehD, EbhA, EbhB, SSP-1, SSP-2, HBP, proteína de liga- ção à vitronectina, HarA, EsxA, EsxB, Enterotoxina A, Enterotoxina B, Ente- rotoxinaC1 e nova autolisina.

76. Método de indução de uma resposta imune contra Staphylo- coccus aureus compreendendo administração ao indivíduo de uma quanti- |

- dade imunologicamente eficaz de uma composição imunogênica como defi- nida em qualquer uma das reivindicações 1-75.

77. Método de acordo com a reivindicação 76, em que a respos- ta imune previne ou reduz uma doença ou condição associada a um orga- nismo estafilocócico em um indivíduo ou previne ou reduz um ou mais sin- i tomas associados a um organismo estafilocócico em um indivíduo.

78. Método de acordo com a reivindicação 77, em que a doença é selecionada do grupo consistindo em doença invasiva por S. aureus, sep- sia e transmissão.

e 10 79. Método de acordo com a reivindicação 76, em que o indivi- duo é que sofreu um procedimento cirúrgico.

80. Método de acordo com a reivindicação 79, em que o proce- dimento cirúrgico é um procedimento cirúrgico eletivo ou um procedimento . cirúrgico não eletivo.

81. Método de acordo com a reivindicação 79, em que o proce- dimento cirúrgico é um procedimento cirúrgico cardio-torácico.

82. Método de acordo com a reivindicação 76, em que a respos- ta imune induzida compreende a geração de anticorpos tendo atividade op- sonofagocítica (Opsonophagocytic Activity - OPA) contra S. aureus.

83. Método de acordo com a reivindicação 76, em que a respos- o ta imune induzida compreende a geração de titulações significativamente maiores de anticorpos opsonofagocíticos específicos para S. aureus compa- rado com àquelas observadas em indivíduos não imunizados. '

84, Método de acordo com a reivindicação 83, em que a titula- . 25 ção opsonofagocítica é de pelo menos 1:20.

85. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 76- 84, em que a S. aureus é MSSA.

86. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 76- 84, em que a S. aureus é VRSA.

87. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 76- 84, em que a S. aureus é VISA.

88. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 76-

V

84, em que a S. aureus é MRSA. ' -

89. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 76- : 88, em que o indivíduo é um ser humano, um animal doméstico ou um ani- mail de criação.

90. Método para conferir imunidade passiva a um indivíduo compreendendo as etapas de (1) geração de um preparado de anticorpo usando uma das composições imunogênicas como definida em qualquer uma das reivindicações 1-75; e (2) administração do preparado de anticorpo ao indivíduo para conferir imunidade passiva. o r