MX2012000044A

MX2012000044A - Composiciones inmunogenicas de antigenos de staphylococcus aureus.

Info

Publication number: MX2012000044A
Application number: MX2012000044A
Authority: MX
Inventors: Viliam Pavliak; Ellen Murphy; Kathrin Ute Jansen; Ingrid Lea Dodge; Annaliesa Anderson; Steven Morris Baker; Jasdeep Singh Nanra; Bruce Arthur Green; Mark Edward Ruppen; Yekaterina Timofeyeva
Original assignee: Wyeth Llc
Priority date: 2009-06-22
Filing date: 2010-06-22
Publication date: 2012-01-30
Also published as: RU2011151781A; JP2013151501A; CN107096020A; SG10201707084SA; HUE036372T2; SG176837A1; KR20120046189A; US8889145B2; MY169837A; JP6067806B2; CA2766629A1; PE20142188A1; ZA201200501B; RU2536981C2; PE20110023A1; CO6480925A2; US20150132336A1; JP5395264B2; KR101486122B1; SA110310528B1

Abstract

La presente invención se refiere a composiciones inmunogénicas, que comprenden polipéptidos y polisacáridos a partir de Staphylococcus aureus; la presente invención también se refiere a composiciones ¡inmunogénicas, que comprenden polisacáridos de cápsula de Staphylococcus aureus conjugados con una proteína de portador; además, la invención se refiere a unos procedimientos de inducción de una respuesta inmunitaria en sujetos frente a Staphylococcus aureus usando composiciones inmunogénicas de los polisacáridos de cápsula y polipéptidos de Staphylococcus aureus.

Description

COMPOSICIONES INMUNOGÉNICAS DE ANTÍGENOS DE STAPHYLOCOCCUS AUREUS REFERENCIA CRUZADA A LAS SOLICITUDES RELACIONADAS La presente solicitud reivindica el beneficio de la prioridad de la solicitud de patente provisional de los Estados Unidos con n.° 61/219.134, presentada el 22 de junio de 2009, la totalidad de la cual se incorpora por la presente por referencia en el presente documento.

CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a composiciones inmunogénicas, que comprenden polipéptidos y polisacáridos capsulares aislados a partir de Staphylococcus aureus. Además, la invención se refiere a unos procedimientos de inducción de una respuesta inmunitaria en sujetos frente a Staphylococcus aureus usando composiciones inmunogénicas de los polisacáridos y polipéptidos capsulares de Staphylococcus aureus. Los anticuerpos resultantes pueden usarse también para tratar o evitar una infección por Staphylococcus aureus a través de inmunoterapia pasiva.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Los seres humanos son los depósitos naturales para Staphylococcus aureus (S. aureus). Los individuos sanos pueden ser colonizados mediante S. aureus en la piel, en las fosas nasales y la garganta o bien de forma persistente (de un 10 a un 35 %), intermitente (de un 20 a un 75 %) o bien estar en un estado de no portador (de un 5 a un 70 %) sin enfermedad asociada alguna. Véase Vandenbergh y col., J. Clin. Micro. 37:3133 a 3140 (1999). Posteriormente tiene lugar la enfermedad cuando los individuos están inmunocomprometidos debido a brechas en las barreras inmunitarias, tal como durante la cirugía, colocación de catéteres permanentes u otros dispositivos, traumatismo, o heridas. La infección resultante por S. aureus puede dar lugar a una amplia gama de enfermedades diferentes que varían entre infecciones de la piel leves y endocarditis, osteomielitis, bacteriemia, septicemia, y otras formas de enfermedad con unas altas tasas de mortalidad asociadas. El gran depósito humano aumenta la oportunidad de evolución y propagación de tipos de clonación patogénicos adaptados.

Las infecciones estafilocócicas invasivas a partir de cocos Gram positivos S. aureus y S. epidermidis son de particular interés debido a que éstas se están convirtiendo en un creciente problema de salud pública a nivel mundial. Específicamente, S. aureus es responsable de la mayoría de infecciones adquiridas en hospital (nosocomiales) y su prevalencia en infecciones de aparición en la comunidad va en aumento. Por ejemplo, la incidencia de S. aureus (MRSA) resistente a meticilina invasivo se estimó en 31.8 por 100.000 personas, incluyendo 18.650 muertes en los Estados Unidos en 2005. Véase Klevens R.M. y col., JAMA, 298:1763 a 71 (2007).

Las enfermedades estafilocócicas han experimentado un aumento drástico en los últimos 20 años, este aumento corre parejo con el uso de dispositivos intravasculares y de procedimientos invasivos. Este aumento en incidencia de enfermedad se hace más preocupante debido al aumento paralelo de resistencia a antibióticos, por lo tanto, hay una necesidad urgente de composiciones inmunogénicas para su uso en vacunas o para provocar que anticuerpos policlonales o monoclonales confieran inmunidad pasiva como un medio de evitar o de tratar una infección por estafilococos y enfermedades asociadas.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención se dirige hacia una composición inmunogénica multiantígeno o multicomponente que comprende al menos tres antígenos aislados a partir de una bacteria estafilocócica. Los antígenos, que son polipéptidos y polisacáridos, pueden obtenerse, entre otros, directamente a partir de la bacteria usando unos procedimientos de aislamiento conocidos por los expertos en la técnica, o éstos pueden producirse usando protocolos de síntesis, o éstos pueden producirse de forma recombinante usando unos procedimientos de ingeniería genética también conocidos por los expertos en la técnica, o a través de una combinación de cualquiera de los anteriores. En ciertas realizaciones, una composición inmunogénica de la invención comprende tres o más antigenos que se seleccionan de un polipéptido de factor de aglutinación A (CIfA) de S. aureus aislado, un polipéptido de factor de aglutinación B (CIfB) de S. aureus aislado, un polisacárido capsular de S. aureus aislado de tipo 5 (CP5) conjugado con una proteína de portador, un polisacárido capsular de S. aureus aislado de tipo 8 (CP8) conjugado con una proteína de portador y una proteína MntC de S. aureus aislada. Además, la presente invención proporciona procedimientos para inducir una respuesta inmunitaria frente a una bacteria estafilocócica, procedimientos para prevenir, para reducir la gravedad, o para retardar la aparición de una enfermedad causada por una bacteria estafilocócica, y procedimientos para prevenir, para reducir la gravedad, o para retardar la aparición de al menos un síntoma de una enfermedad causada por infección con una bacteria estafilocócica.

Por consiguiente, en una modalidad, la invención proporciona una composición inmunogénica que comprende: un polipéptido de factor de aglutinación A (CIfA) de S. aureus aislado, un polisacárido capsular de S. aureus aislado de tipo 5 (CP5) conjugado con una proteína de portador, y un polisacárido capsular de S. aureus aislado de tipo 8 (CP8) conjugado con una proteina de portador.

En una modalidad, la invención proporciona una composición inmunogénica que comprende: un polipéptido de factor de aglutinación A (CIfA) de S. aureus aislado, un factor de aglutinación B (CIfB) de S. aureus aislado, un polisacárido capsular de S. aureus aislado de tipo 5 (CP5) conjugado con una proteína de portador, y un polisacárido capsular de S. aureus aislado de tipo 8 (CP8) conjugado con una proteína de portador.

En una modalidad, la invención proporciona una composición inmunogénica que comprende: un polipéptido de factor de aglutinación A (ClfA) de S. aureus aislado, un polipéptido de factor de aglutinación B (CIfB) de S. aureus aislado, una proteína MntC de S. aureus aislada, un polisacárido capsular de S. aureus aislado de tipo 5 (CP5) conjugado con una proteína de portador, y un polisacárido capsular de S. aureus aislado de tipo 8 (CP8) conjugado con una proteína de portador.

En una modalidad, la invención proporciona una composición inmunogénica que comprende: un polipéptido de factor de aglutinación A (ClfA) de S. aureus aislado, una proteína MntC de S. aureus aislada, un polisacárido capsular de S. aureus aislado de tipo 5 (CP5) conjugado con una proteína de portador, y un polisacárido capsular de S. aureus aislado de tipo 8 (CP8) conjugado con una proteína de portador.

En una modalidad, la invención proporciona una composición inmunogénica que comprende: un polipéptido de factor de aglutinación B (CIfB) de S. aureus aislado, un polisacárido capsular de S. aureus aislado de tipo 5 (CP5) conjugado con una proteína de portador, y un polisacárido capsular de S. aureus aislado de tipo 8 (CP8) conjugado con una proteína de portador.

En una modalidad, la invención proporciona una composición inmunogénica que comprende: un polipéptido de factor de aglutinación B (ClfB) de S. aureus aislado, una proteína MntC de S. aureus aislada, un polisacárido capsular de S. aureus aislado de tipo 5 (CP5) conjugado con una proteína de portador, y un polisacárido capsular de S. aureus aislado de tipo 8 (CP8) conjugado con una proteína de portador.

En una modalidad, la invención proporciona una composición inmunogénica que comprende: un polipéptido de factor de aglutinación A (CIfA) de S. aureus aislado, un polipéptido de factor de aglutinación B (ClfB) de S. aureus aislado, y una proteína MntC de S. aureus aislada.

En una modalidad, la invención proporciona una composición inmunogénica que comprende: una proteína MntC de S. aureus aislada, un polisacárido capsular de S. aureus aislado de tipo 5 (CP5) conjugado con una proteína de portador, y un polisacárido capsular de S. aureus aislado de tipo 8 (CP8) conjugado con una proteína de portador.

En una modalidad, la composición inmunogénica comprende un fragmento de polipéptido de CIfA aislado, en la que el fragmento de polipéptido de CIfA comprende el dominio de unión a fibrinógeno de CIfA. En una modalidad, el fragmento de polipéptido de CIfA comprende un dominio de unión a fibrinógeno que comprende los dominios de CIfA N1 , N2 y N3. En una modalidad, el fragmento de polipéptido de CIfA comprende un dominio de unión a fibrinógeno que comprende los dominios de CIfA N2 y N3. En una modalidad, las composiciones con contenido en el dominio de unión a fibrinógeno de CIfA muestran una unión reducida a fibrinógeno. En una modalidad, el dominio de unión a fibrinógeno de ClfA se une a fibrinógeno a un nivel reducido en comparación con la unión que se observa a fibrinógeno con el dominio de unión a fibrinógeno nativo de ClfA. En una modalidad, las composiciones con contenido en el dominio de unión a fibrinógeno de ClfA muestran una unión reducida a fibrinógeno y tienen una sustitución de aminoácidos en uno o más de Tyr 338, Tyr 256, Pro 336, Lys 389, Ala 254 y He 387 de la longitud total de la proteína con contenido en la secuencia señal. En una modalidad, las composiciones con contenido en el dominio de unión a fibrinógeno de ClfA muestran una sustitución de aminoácidos en uno o más de Tyr 338, Tyr 256, Pro 336, Lys 389, Ala 254 y lie 387, en la que el aminoácido en una o más cualesquiera de éstas posiciones se cambia a una Ala o Ser. En una modalidad, la composición comprende un dominio de unión a fibrinógeno de ClfA en el que la Tyr en la posición 338 se cambia a una Ala.

En una modalidad, la composición inmunogénica comprende un fragmento de polipéptido de ClfB aislado, en la que el fragmento de polipéptido de ClfB comprende el dominio de unión a fibrinógeno de ClfB. En una modalidad, el fragmento de polipéptido de ClfB comprende un dominio de unión a fibrinógeno que comprende los dominios de ClfB N1 , N2 y N3. En una modalidad, el fragmento de polipéptido de ClfB comprende un dominio de unión a fibrinógeno que comprende los dominios de ClfB N2 y N3. En una modalidad, las composiciones con contenido en el dominio de unión a fibrinógeno de ClfB muestran una unión reducida a fibrinógeno. En una modalidad, el dominio de unión a fibrinógeno de ClfB se une a fibrinógeno a un nivel reducido en comparación con la unión que se observa a fibrinógeno con el dominio de unión a fibrinógeno nativo de ClfB.

En una modalidad, la composición inmunogénica comprende polisacárido capsular de tipo 5 (CP5) de S. aureus que es un polisacárido de alto peso molecular de entre 20 y 1.000 kDa. En una modalidad, el polisacárido de alto peso molecular de tipo 5 tiene un peso molecular de entre 50 y 300 kDa. En una modalidad, el polisacárido de alto peso molecular de tipo 5 tiene un peso molecular de entre 70 y 150 kDa.

En una modalidad, la composición inmunogénica comprende un polisacárido capsular de tipo 5 de S. aureus, que está entre un 10 % y un 100 % O-acetilado. En una modalidad, la composición inmunogénica comprende un polisacárido capsular de tipo 5 de S. aureus, que está entre un 50 % y un 100 % O-acetilado. En una modalidad, la composición inmunogénica comprende un polisacárido capsular de tipo 5 de S. aureus, que está entre un 75 % y un 100 % O-acetilado.

En una modalidad, la composición inmunogénica comprende polisacárido capsular de tipo 8 de S. aureus que es un polisacárido de alto peso molecular de entre 20 y 1.000 kDa. En una modalidad, el polisacárido de alto peso molecular de tipo 8 tiene un peso molecular de entre 50 y 300 kDa. En una modalidad, el polisacárido de alto peso molecular de tipo 8 tiene un peso molecular de entre 70 y 150 kDa.

En una modalidad, la composición inmunogénica comprende un polisacárido capsular de tipo 8 de S. aureus, que está entre un 10 % y un 00 % O-acetilado. En una modalidad, la composición inmunogénica comprende un polisacárido capsular de tipo 8 de S. aureus, que está entre un 50 % y un 100 % O-acetilado. En una modalidad, la composición inmunogénica comprende un polisacárido capsular de tipo 8 de S. aureus, que está entre un 75 % y un 100 % O-acetilado.

En una modalidad, el polisacárido capsular 5 y/o 8 presente en una composición inmunogénica está conjugado con una proteína de portador. En una modalidad, la proteína de portador es el toxoide CRM-ig7 de Corynebacterium diphtheriae (C. diphtheriae).

En una modalidad, la composición inmunogénica comprende la MntC de S. aureus, que es una proteína lipidada. En una modalidad, la composición inmunogénica comprende la MntC de S. aureus, que no es una proteína lipidada.

En una modalidad, la invención proporciona una composición inmunogénica tal como se describe en el presente documento, que además comprende al menos una proteína a partir de la familia de proteínas de repetición de serina-aspartato (Sdr) que se selecciona del grupo que consiste en SdrC, SdrD y SdrE.

En una modalidad, la invención proporciona una composición inmunogénica tal como se describe en el presente documento, que además comprende la proteína de determinante de superficie de hierro B (IsdB).

En cada una de las realizaciones que se describen en el presente documento en las que una composición inmunogénica comprende tres o más antígenos enumerados, esa composición puede comprender además otras sustancias inmunogénicas y/o no inmunogénicas. En ciertas realizaciones, cada composición inmunogénica puede, alternativamente, "consistir esencialmente en" o "consistir en" los tres o más antígenos enumerados y comprender además una o más sustancias no inmunogénicas, tal como se describe con más detalle en el presente documento.

En una modalidad, la invención proporciona una composición inmunogénica tal como se describe en el presente documento, que además comprende uno cualquiera de los siguientes antígenos: Opp3a, DltD, HtsA, LtaS, IsdA, IsdC, SdrF, SdrG, SdrH, SrtA, SpA, Sbi FmtB, alfa-hemolisina (hla), beta-hemolisina, proteína A de unión a fibronectina (fnbA), proteína B de unión a fibronectina (fnbB), coagulasa, Fig, map, leucocidina Panton-Valentine (pvl), alfa-toxina y sus variantes, gamma-toxina (hlg) y variantes, ica, transportador ABC inmunodominante, transportador Mg2+, transportador ABC de Ni, RAP, autolisina, receptores de laminina, IsaA/PisA, IsaB/PisB, SPOIIIE, SsaA, EbpS, Sas A, SasF, SasH, EFB (FIB), SBI, Npase, EBP, sialoproteína II de unión a hueso, precursor de aureolisina (AUR)/Sepp , Cna, y fragmentos de los mismos tal como M55, TSST-1 , mecA, poli-N-acetilglucosamina (PNAG/dPNAG) exopolisacárido, GehD, EbhA, EbhB, SSP-1 , SSP-2, HBP, proteína de unión a vitronectina, HarA, EsxA, EsxB, Enterotoxina A, Enterotoxina B, Enterotoxina C1 , y autolisina novedosa. En ciertas realizaciones de la invención, cuando la composición inmunogénica comprende ciertas formas de CP5 y/o CP8, puede no comprender además PNAG.

En una modalidad, la composición inmunogénica además comprende un adyuvante. En una modalidad, la composición inmunogénica además comprende un portador farmacéuticamente aceptable.

En una modalidad, la composición inmunogénica se usa para formular una vacuna. En una modalidad, la vacuna se usa para inducir una respuesta inmunitaria en un sujeto frente a S. aureus. En una modalidad, la composición inmunogénica se usa para generar una formulación de anticuerpo para conferir inmunidad pasiva en un sujeto.

En una modalidad, la invención proporciona un procedimiento de inducción de una respuesta inmunitaria frente a S. aureus que comprende la administración a un sujeto de una cantidad inmunogénica de cualquiera de las composiciones inmunogénicas que se describen en el presente documento y un portador farmacéuticamente aceptable.

En una modalidad, la invención proporciona un procedimiento de prevención o de reducción de infección con S. aureus, o un procedimiento de prevención o de reducción de la gravedad de al menos un síntoma asociado con una infección causada por S. aureus, comprendiendo los procedimientos la administración a un sujeto de una cantidad inmunogénica de cualquiera de las composiciones inmunogénicas que se describen en el presente documento y un portador farmacéuticamente aceptable.

En una modalidad, los procedimientos para inducir una respuesta inmunitaria frente a S. aureus comprenden la administración de las composiciones inmunogénicas con un adyuvante. En una modalidad, los procedimientos para inducir una respuesta inmunitaria frente a S. aureus prevén la administración de las composiciones inmunogénicas con un portador farmacéuticamente aceptable.

En una modalidad, la respuesta inmunitaria inducida mediante las composiciones inmunogénicas que se describen en el presente documento, evita o reduce una enfermedad o afección asociada con un organismo estafilocócico en un sujeto, o evita o reduce uno o más síntomas asociados con un organismo estafilocócico en un sujeto. En una modalidad, la enfermedad se selecciona del grupo que consiste en enfermedad invasiva por S. aureus, septicemia y estado de portador.

En una modalidad, la respuesta inmunitaria inducida comprende la generación de anticuerpos que tienen una actividad opsonofagocítica (OPA) frente a S. aureus. En una modalidad, la respuesta inmunitaria inducida comprende la generación de más altos títulos de anticuerpos opsonofagocíticos específicos para S. aureus en comparación con la que se observa en sujetos no inmunizados. En una modalidad, el título opsonofagocítico es al menos 1 :20.

En una modalidad, la S. aureus frente a la que se induce la respuesta inmunitaria es MRSA. En una modalidad, la S. aureus frente a la que se induce la respuesta inmunitaria es MSSA. En una modalidad, la S. aureus frente a la que se induce la respuesta inmunitaria es VRSA. En una modalidad, la S. aureus frente a la que se induce la respuesta inmunitaria es VISA.

En una modalidad, la invención proporciona un procedimiento de prevención de una infección por estafilococos en un sujeto que se somete a un procedimiento quirúrgico, comprendiendo el procedimiento la administración de una cantidad inmunológicamente eficaz de cualquiera de las composiciones inmunogénicas tal como se describe en el presente documento al sujeto antes del procedimiento quirúrgico. El procedimiento quirúrgico puede ser un procedimiento quirúrgico opcional o un procedimiento quirúrgico no opcional. En una modalidad, el procedimiento quirúrgico es un procedimiento quirúrgico cardio-torácico. En una modalidad, el sujeto es un ser humano, un animal doméstico, o un animal de ganado.

En una modalidad, la invención proporciona un procedimiento para conferir inmunidad pasiva a un sujeto que comprende las etapas de (1 ) generar una preparación de anticuerpos usando unas composiciones inmunogénicas de la invención; y (2) administrar la preparación de anticuerpos al sujeto para conferir inmunidad pasiva.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La figura 1 muestra las varias formas de ClfA recombinante y da a conocer SEQ ID NO: 125 y 127 a 129, respectivamente, en el orden de aparición.

La figura 2 muestra las etapas de clonación que se usan para la construcción de pLP1179 para expresar el ClfA.

La figura 3 muestra el vector de expresión de T7ClfA(Ni23)Y338A, pLP1 179.

La figura 4 muestra la estructura de repetición de los polisacáridos CP5 y CP8.

Las figuras 5A y 5B muestran unos perfiles de peso molecular de CP5 (fig. 5A) y CP8 (fig. 5B) que se producen a unos pH de caldo diferentes.

Las figuras 6A y 6B muestran unos perfiles de peso molecular de CP5 (fig. 6A) y CP8 (fig. 6B) que se producen a temperaturas diferentes.

La figura 7 muestra la correlación del peso molecular de purificado CP5 y CP8 con el tiempo de tratamiento para hidrólisis ácida suave.

La figura 8A a 8E muestran el alineamiento de ClfA entre varias cepas de S. aureus (SEQ ID NO: 62, 64, 68, 84, 70, 104, 66, 78, 86, 88, 90, 72, 74, 76, 80, 94, 82, 92, 96, 98, 100, 102, 106, y 108, respectivamente, en el orden de aparición).

La figura 9 muestra el árbol filogenético de ClfA.

La figura 10A a 10E muestran el alineamiento de ClfB entre varias cepas de S. aureus (SEQ ID NO: 26, 28, 32, 18, 54, 34, 36, 30, 16, 20, 22, 24, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 56, 58, y 60, respectivamente, en el orden de aparición).

La figura 11 muestra el árbol filogenético de ClfB.

La figura 12 muestra el alineamiento de MntC entre varias cepas de S. aureus (SEQ ID NO: 2, 8, 10, 4, 6, 14 y 12, respectivamente, en el orden de aparición).

La figura 13 muestra que los anticuerpos anti-CIfA de conejo policlonales reducen los recuentos de colonia 659 a 018 de S. aureus en un modelo murino de septicemia.

La figura 14 muestra que inmunización activa con ClfA reduce la colonización del corazón mediante S. aureus PFESA0003 en el modelo de endocarditis infecciosa de conejo.

Las figuras 15A y 15B muestran que la inmunización con MntC reduce S. aureus en la sangre. Fig. 15A: cepa de S. aureus PFESA0237; fig. 15B: cepa de S. aureus PFESA0266.

La figura 16 muestra que la formulación inmunogénica de conjugado de CP5 de S. aureus-CRMi97 consistentemente exhibe protección en un modelo de pielonefritis murino.

La figura 17 muestra que la vacunación con una formulación inmunogénica de conjugado de CP8-CRM197 reduce muerte en un modelo de septicemia.

La figura 18 muestra unidades de formación de colonias (UFC) recuperadas en ríñones después de una exposición a PFESA0266 de S. aureus en ratones vacunados con CP5-CR de alto peso molecular (HMW), CP5-CRM de bajo peso molecular (LMW) o control de PP5-CRM.

La figura 19 muestra una comparación de títulos de OPA (media geométrica) a partir de suero que se obtiene a partir de ratones vacunados con diferentes formulaciones de polisacárido conjugado (CP5-CRM de alto peso molecular (HMW), CP5-CRM de bajo peso molecular (LMW)). Los grupos consistieron en de 5 a 9 ratones.

La figura 20 muestra título de OPA para suero de primate no humano antes (semO, open symbols) y 2 semanas después (sem2, closed symbols) de la vacunación con diferentes combinaciones de antígenos S. aureus. La vacuna de 3 antígenos (3Ag) estaba compuesta por tres antígenos y la vacuna de 4 antígenos (4Ag) estaba compuesta por cuatro antígenos. Cada formulación tiene dos conjugados de CP y o bien 1 o bien 2 péptidos.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Antes de que se describan los presentes procedimientos y metodología de tratamiento, ha de entenderse que la presente invención no se limita a procedimientos particulares, y condiciones experimentales que se describen, debido a que tales procedimientos y condiciones pueden variar. Ha de entenderse también que la terminología que se usa en el presente documento es sólo para los fines de descripción de las realizaciones particulares, y no se pretende que sean limitantes.

A pesar de que cualesquiera procedimientos y materiales similares o equivalentes a los que se describen en el presente documento pueden usarse en la práctica o realización de pruebas de la invención, los procedimientos y materiales preferidos se describen a continuación. Todas las publicaciones que se mencionan en el presente documento se incorporan por referencia en su totalidad.

Las expresiones que se usan en el presente documento tienen los significados que conocen y reconocen los expertos en la técnica, no obstante, por conveniencia y compleción, se exponen a continuación una expresiones particulares y sus significados.

Tal como se usa en la presente memoria descriptiva y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un", "una", y "el/la" incluyen referencias plurales a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Por lo tanto, por ejemplo, las referencias a "el procedimiento" incluyen uno o más procedimientos, y/o etapas del tipo que se describe en el presente documento y/o que se harán evidentes para los expertos en la técnica tras la lectura de la presente divulgación, etcétera.

La expresión "aproximadamente" o "de forma aproximada" quiere decir dentro de un intervalo estadísticamente significativo de un valor. Un intervalo de este tipo puede estar dentro de un orden de magnitud, habitualmente dentro de un 20 %, más habitualmente aún dentro de un 10 %, e incluso más habitualmente dentro de un 5 % de un valor o intervalo dado. La variación admisible abarcada por la expresión "aproximadamente" o "de forma aproximada" depende del sistema particular sometido a estudio, y puede apreciarse fácilmente por un experto en la técnica. Siempre que se menciona un intervalo dentro de la presente solicitud, cada número entero en su totalidad dentro del intervalo se contempla también como una modalidad de la invención.

Un "anticuerpo" es una molécula de inmunoglobulina capaz de unión específica a una diana, tal como un carbohidrato, polinucleótido, lípido, polipéptido, etc., a través de al menos un sitio de reconocimiento de antigeno, que se encuentra en la región variable de la molécula de inmunoglobulina. Tal como se usa en el presente documento, a menos que se indique de otro modo por el contexto, se pretende que la expresión abarque no sólo anticuerpos policlonales o monoclonales intactos, sino también anticuerpos diseñados por ingeniería genética (por ejemplo, quiméricos, humanizados y/o derivados para efectuar funciones de efector, estabilidad y otras actividades biológicas) y fragmentos de los mismos (tales como Fab, Fab', F(ab')2, Fv), anticuerpos de cadena única (ScFv) y de dominio, lo que incluye anticuerpos de tiburón y de camélido), y proteínas de fusión que comprenden una parte de anticuerpo, anticuerpos multivalentes, anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos a condición de que éstos exhiban la actividad biológica deseada) y fragmentos de anticuerpo tal como se describe en el presente documento, y cualquier otra configuración modificada de la molécula de inmunoglobulina que comprende un sitio de reconocimiento de antígeno. Un anticuerpo incluye un anticuerpo de cualquier clase, tal como IgG, IgA, o IgM (o subclase de los mismos), y el anticuerpo no ha de ser de ninguna clase particular. Dependiendo de la secuencia de aminoácidos de anticuerpo del dominio constante de sus cadenas pesadas, pueden asignarse inmunoglobulinas a clases diferentes. Hay cinco clases principales de inmunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG, y IgM, y varias de éstas pueden dividirse adicionalmente en subclases (isotipos), por ejemplo, lgG1 , lgG2, lgG3, lgG4, lgA1 y lgA2 en los seres humanos. Los dominios constantes de cadena pesada que se corresponden con las diferentes clases de inmunoglobulinas se denominan alfa, delta, épsilon, gamma, y mu, respectivamente. Las estructuras de subunidad y configuraciones tridimensionales de diferentes clases de inmunoglobulinas son bien conocidas.

Los "fragmentos de anticuerpo" comprenden sólo una parte de un anticuerpo intacto, en el que la parte preferentemente retiene al menos una, preferentemente la mayor parte o la totalidad, de las funciones que se asocian normalmente con esa parte cuando está presente en un anticuerpo intacto.

La expresión "antígeno" en general se refiere a una molécula biológica, normalmente una proteína, péptido, polisacárido, lípido o conjugado que contiene al menos un epítopo al que puede unirse selectivamente un anticuerpo conjugado; o en algunos casos a una sustancia inmunogénica que puede estimular la producción de anticuerpos o respuestas de células T, o ambos, en un animal, incluyendo composiciones que se inyectan o se absorben en un animal. La respuesta inmunitaria puede generarse frente a la totalidad de la molécula, o frente a una o más partes varias de la molécula (por ejemplo, un epítopo o hapteno). La expresión puede usarse para referirse a una molécula individual o a una población homogénea o heterogénea de moléculas antigénicas. Un antígeno se reconoce por anticuerpos, receptores de células T u otros elementos de inmunidad humoral y/o celular específica.

La expresión "antígeno" incluye todos los epítopos antigénicos relacionados. Los epítopos de un antígeno dado pueden identificarse usando cualquier número de técnicas de asignación de epítopos, que se conocen bien en la técnica. Véase, por ejemplo, Epitope Mapping Protocols en Methods in Molecular Biology, Vol. 66 (Glenn E. Morris, Ed., 1996) Human Press, Totowa, N. J. Por ejemplo, los epítopos lineales pueden determinarse mediante por ejemplo, sintetizando de forma concurrente un gran número de péptidos en soportes sólidos, correspondiéndose los péptidos con partes de la molécula de proteína, y hacer que reaccionen los péptidos con anticuerpos a la vez que los péptidos están aún unidos a los soportes. Tales técnicas se conocen en la técnica y se describen en, por ejemplo, la patente de los Estados Unidos con n.° 4.708.871 ; Geysen y col. (1984) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 81 :3998 a 4002; Geysen y col. (1986) Molec. Immunol. 23:709 a 715, la totalidad de las cuales se incorpora en el presente documento por referencia. De forma similar, los epítopos conformacionales pueden identificarse determinando la conformación espacial de los aminoácidos tal como mediante, por ejemplo, cristalografía de rayos X y resonancia magnética nuclear en 2 dimensiones. Véase, por ejemplo, Epitope Mapping Protocols, citado anteriormente. Además, para los fines de la presente invención, un "antígeno" puede usarse también para referirse a una proteína que incluye modificaciones, tal como deleciones, adiciones y sustituciones (en general de naturaleza conservativa, si bien éstas pueden ser no conservativas), en la secuencia nativa, a condición de que la proteína mantenga la capacidad para provocar una respuesta ¡nmunológica. Estas modificaciones pueden ser deliberadas, como a través de una mutagénesis dirigida al sitio, o a través de unos procedimientos de síntesis particulares, o a través de un enfoque de ingeniería genética, o pueden ser accidentales, tal como a través de mutaciones de huéspedes, que producen los antígenos. Además, el antígeno puede derivarse, obtenerse, o aislarse a partir de un microbio, por ejemplo, una bacteria, o puede ser la totalidad de un organismo. De forma similar, un oligonucleótido o polinucleótido, que expresa un antígeno, tal como en aplicaciones de inmunización de ácido nucleico, se incluye también en la definición. También se incluyen los antígenos de síntesis, por ejemplo, poliepítopos, epítopos flanqueantes, y otros antígenos derivados de forma sintética o recombinante (Bergmann y col. (1993) Eur. J. Immunol. 23:2777 2781 ; Bergmann y col. (1996) J. Immunol. 157:3242 3249; Suhrbier, A. (1997) Immunol. y Célula Biol. 75:402 408; Gardner y col. (1998) 12th World AIDS Conference, Ginebra, Suiza, de 28 de Junio a 3 de Julio de 1998).

La expresión "adyuvante" se refiere a un compuesto o mezcla que aumenta la respuesta inmunitaria a un antígeno tal como se describe adicionalmente y se ejemplifica en el presente documento.

La "bacteriemia" es una presencia transitoria de bacterias en la sangre. Una bacteriemia puede progresar hasta septicemia, o septicemia, que se consideraría una infección y es la presencia persistente de bacterias en la sangre con signos/síntomas clínicos asociados. No todas las bacterias son capaces de sobrevivir en la sangre. Las que pueden, tienen unos rasgos genéticos especiales que prevén esa capacidad. Asimismo, los factores de huésped juegan también un importante papel.

"Polisacárido capsular" o "polisacárido de cápsula" se refiere a la cápsula de polisacárido que es externa a la pared celular de la mayoría de aislados de estafilococos. Por ejemplo, S. aureus incluye un componente de pared celular que está compuesto por un complejo de peptidoglicano, que permite que el organismo sobreviva bajo unas condiciones osmóticas desfavorables y también incluye un único ácido teicoico unido al peptidoglicano. De forma externa a la pared celular, una cápsula de polisacárido delgada recubre la mayoría de aislados de S. aureus. Esta cápsula serológicamente diferenciada puede usarse para realizar un serotipado de varias aislados de S. aureus. Se ha mostrado que muchos de los aislados clínicamente significativaos incluyen dos tipos capsulares: serotipo 5 (CP5) y serotipo 8 (CP8). Las estructuras de CP5 y CP8 se muestran esquemáticamente en la figura 4.

Tal como se usa en el presente documento, "conjugados" comprende un polisacárido de cápsula normalmente de un intervalo deseado de peso molecular y una proteína de portador, en el que el polisacárido de cápsula está conjugado con la proteína de portador. Los conjugados pueden o pueden no contener alguna cantidad de polisacárido de cápsula libre. Tal como se usa en el presente documento, "polisacárido de cápsula libre" se refiere a un polisacárido de cápsula que está asociado no covalentemente con (es decir, está unido no covalentemente a, adsorbido a o atrapado en o con) el polisacárido capsular-proteína de portador conjugado. Las expresiones "polisacárido de cápsula libre", "polisacárido libre" y "sacárido libre" pueden usarse de forma intercambiable y se pretende que transmitan el mismo significado. Con independencia de la naturaleza de la molécula portadora, esta puede conjugarse con el polisacárido capsular o bien directamente o bien a través de un ligador. Tal como se usa en el presente documento, "(para) conjugar", "conjugado/a" y "conjugando" se refiere a un proceso mediante el cual un polisacárido capsular bacteriano se une covalentemente a la molécula portadora. La conjugación aumenta la inmunogenicidad del polisacárido capsular bacteriano. La conjugación puede realizarse de acuerdo con los procedimientos que se describen a continuación o mediante procesos que se conocen en la técnica.

Tal como se describe anteriormente, la presente invención se refiere a conjugados que comprenden polisacáridos capsulares de serotipo 5 (CP5) de S. aureus conjugado con proteínas portadoras y conjugados que comprenden polisacáridos capsulares de serotipo 8 de S. aureus (CP8) conjugado con proteínas portadoras. Una modalidad de la invención proporciona conjugados que comprenden un polisacárido capsular de serotipo 5 de S. aureus conjugado con una proteína de portador y un polisacárido capsular de serotipo 8 de S. aureus conjugado con una proteína de portador en los que: el polisacárido capsular de tipo 5 tiene un peso molecular de entre 50 kDa y 800 kDa; el polisacárido capsular de tipo 8 tiene un peso molecular de entre 50 y 700 kDa, los conjugados inmunogénicos tienen unos pesos moleculares de entre aproximadamente 1.000 kDa y aproximadamente 5.000 kDa; y los conjugados comprenden menos de aproximadamente un 30 % de polisacárido libre en relación con el polisacárido total. En una modalidad, los conjugados comprenden menos de aproximadamente un 25 %, aproximadamente un 20 %, aproximadamente un 15 %, aproximadamente un 10 %, o aproximadamente un 5 % de polisacárido libre en relación con el polisacárido total. En una modalidad, el tipo 5 u 8 polisacárido tiene un peso molecular entre 20 kDa y 1.000 kDa.

En una modalidad, el conjugado tiene un peso molecular de entre aproximadamente 50 kDa y aproximadamente 5.000 kDa. En una modalidad, el conjugado tiene un peso molecular de entre aproximadamente 200 kDa y aproximadamente 5.000 kDa. En una modalidad, el conjugado inmunogénico tiene un peso molecular de entre aproximadamente 400 kDa y aproximadamente 2.500 kDa. En una modalidad, el conjugado inmunogénico tiene un peso molecular de entre aproximadamente 500 kDa y aproximadamente 2.500 kDa. En una modalidad, el conjugado inmunogénico tiene un peso molecular de entre aproximadamente 600 kDa y aproximadamente 2.800 kDa. En una modalidad, el conjugado inmunogénico tiene un peso molecular de entre aproximadamente 700 kDa y aproximadamente 2.700 kDa. En una modalidad, el conjugado inmunogénico tiene un peso molecular de entre aproximadamente 1.000 kDa y aproximadamente 2.000 kDa; de entre aproximadamente 1.800 kDa y aproximadamente 2.500 kDa; de entre aproximadamente 1.100 kDa y aproximadamente 2.200 kDa; de entre aproximadamente 1.900 kDa y aproximadamente 2.700 kDa; de entre aproximadamente 1.200 kDa y aproximadamente 2.400 kDa; de entre aproximadamente 1.700 kDa y aproximadamente 2.600 kDa; de entre aproximadamente 1.300 kDa y aproximadamente 2.600 kDa; de entre aproximadamente 1.600 kDa y aproximadamente 3.000 kDa.

Por consiguiente, en una modalidad, la proteína de portador dentro del conjugado inmunogénico de la invención es la CRM197, y la CRM197 se une covalentemente con el polisacárido capsular a través de un enlace de carbamato, un enlace de amida, o ambos. El número de residuos de lisina en la proteína de portador que se han conjugado con un polisacárido capsular puede caracterizarse como un intervalo de lisinas conjugadas. Por ejemplo, en una composición inmunogénica dada, la CRM197 puede comprender de 5 a 15 lisinas de entre 39 con enlace covalente con el polisacárido capsular. Otra forma de expresar este parámetro es que de un 12 % a un 40 % de lisinas de CRM-197 tienen enlace covalente con el polisacárido capsular. En algunas realizaciones, la parte de CRM197 del polisacárido unido covalentemente a la CRM197 comprende de 5 a 22 lisinas con enlace covalente con el polisacárido. En algunas realizaciones, la parte de CRM197 del polisacárido unido covalentemente a la CRIv comprende de 5 a 23 lisinas con enlace covalente con el polisacárido. En algunas realizaciones, la parte de CRM-197 del polisacárido unido covalentemente a la proteína de portador de comprende de 8 a 15 lisinas con enlace covalente con el polisacárido. En algunas realizaciones, la parte de CRM197 del polisacárido unido covalentemente a la proteína de portador de comprende de 8 a 12 lisinas con enlace covalente con el polisacárido. Por ejemplo, en una composición inmunogénica dada, la CRMi9 puede comprender de 18 a 22 lisinas de entre 39 con enlace covalente con el polisacárido capsular. Otra forma de expresar este parámetro es que de un 40 % a un 60 % de lisinas de CRMi97 tienen enlace covalente con el polisacárido capsular. En algunas realizaciones, la CRMig7 comprende de 5 a 15 lisinas de entre 39 con enlace covalente con el CP8. Otra forma de expresar este parámetro es que de un 12 % a un 40 % de lisinas de CRMi9 tienen enlace covalente con el CP8. En algunas realizaciones, la CRM 97 comprende de 18 a 22 lisinas de entre 39 con enlace covalente con el CP5. Otra forma de expresar este parámetro es que de un 40 % a un 60 % de lisinas de CRMi97 tienen enlace covalente con el CP5.

Tal como se analiza anteriormente, el número de residuos de lisina en la proteína de portador conjugado con el polisacárido capsular puede caracterizarse como un intervalo de lisinas conjugadas, que puede expresarse como una razón molar. Por ejemplo, la razón molar de lisinas conjugadas con respecto a CRM-|9 en el conjugado inmunogénico de CP8 puede ser de entre aproximadamente 18:1 a aproximadamente 22:1. En una modalidad, el intervalo de razón molar de lisinas conjugadas con respecto a CRMi97 en el conjugado inmunogénico de CP8 puede ser de entre aproximadamente 15:1 a aproximadamente 25:1. En algunas realizaciones, el intervalo de razón molar de lisinas conjugadas con respecto a CRM-|97 en el conjugado inmunogénico de CP8 puede ser de entre aproximadamente 14:1 a aproximadamente 20:1; de aproximadamente 12:1 a aproximadamente 18:1; de aproximadamente 10:1 a aproximadamente 16:1; de aproximadamente 8:1 a aproximadamente 14:1; de aproximadamente 6:1 a aproximadamente 12:1; de aproximadamente 4:1 a aproximadamente 10:1; de aproximadamente 20:1 a aproximadamente 26:1; de aproximadamente 22:1 a aproximadamente 28:1; de aproximadamente 24:1 a aproximadamente 30:1; de aproximadamente 26:1 a aproximadamente 32:1; de aproximadamente 28:1 a aproximadamente 34:1; de aproximadamente 30:1 a aproximadamente 36:1; de aproximadamente 5:1 a aproximadamente 10:1; de aproximadamente 5:1 a aproximadamente 20:1; de aproximadamente 10:1 a aproximadamente 20:1; o de aproximadamente 10:1 a aproximadamente 30:1. Asimismo, la razón molar de lisinas conjugadas con respecto a CRM 97 en el conjugado inmunogénico de CP5 puede ser de entre aproximadamente 3:1 y 25:1. En una modalidad, el intervalo de razón molar de lisinas conjugadas con respecto a CRM 97 en el conjugado inmunogénico de CP5 puede ser de entre aproximadamente 5:1 a aproximadamente 20:1. En una modalidad, el intervalo de razón molar de lisinas conjugadas con respecto a CRM-ig en el conjugado inmunogénico de CP5 puede ser de entre aproximadamente 4:1 a aproximadamente 20:1; de aproximadamente 6:1 a aproximadamente 20:1; de aproximadamente 7:1 a aproximadamente 20:1; de aproximadamente 8:1 a aproximadamente 20:1; de aproximadamente 10:1 a aproximadamente 20:1; de aproximadamente 11:1 a aproximadamente 20:1; de aproximadamente 12.1 a aproximadamente 20:1; de aproximadamente 13:1 a aproximadamente 20: 1 ; de aproximadamente 14: 1 a aproximadamente 20:1 ; de aproximadamente 15:1 a aproximadamente 20:1 ; de aproximadamente 16:1 a aproximadamente 20:1 ; de aproximadamente 17:1 a aproximadamente 20: 1 ; de aproximadamente 18: 1 a aproximadamente 20:1 ; de aproximadamente 5:1 a aproximadamente 18:1 ; de aproximadamente 7:1 a aproximadamente 16:1 ; o de aproximadamente 9:1 a aproximadamente 14:1.

Otra forma de expresar el número de residuos de lisina en la proteína de portador conjugado con el polisacárido capsular puede ser como un intervalo de lisinas conjugadas. Por ejemplo, en un conjugado inmunogénico de CP8 dado, la CRM197 puede comprender de 5 a 15 lisinas de entre 39 con enlace covalente con el polisacárido capsular. Alternativamente, este parámetro puede expresarse como un porcentaje. Por ejemplo, en un conjugado inmunogénico de CP8 dado, el porcentaje de lisinas conjugadas puede ser de entre un 10 % y un 50 %. En algunas realizaciones, de un 20 % a un 50 % de lisinas puede tener enlace covalente con el CP8. Aún más alternativamente, de un 30 % a un 50 % de lisinas de CRIv puede tener enlace covalente con the CP8; de un 10 % a un 40 % de lisinas de CRM-|97; de un 10 % a un 30 % de lisinas de CRM197; de un 20 % a un 40 % de lisinas de CRM197; de un 25 % a un 40 % de lisinas de CRM197; de un 30 % a un 40 % de lisinas de CRM197; de un 10 % a un 30 % de lisinas de CRMi97; de un 15 % a un 30 % de lisinas de CRMi97; de un 20 % a un 30 % de lisinas de CRM 97; de un 25 % a un 30 % de lisinas de CRMi97; de un 10 % a un 15 % de lisinas de CRM197; o de un 10 % a un 12 % de lisinas de CRMi97 tienen enlace covalente con el CP8. Asimismo, en un conjugado inmunogénico de CP5 dado, la CRM197 puede comprender de 18 a 22 lisinas de entre 39 con enlace covalente con el polisacárido capsular. Alternativamente, este parámetro puede expresarse como un porcentaje. Por ejemplo, en un conjugado inmunogénico de CP5 dado, el porcentaje de lisinas conjugadas puede ser de entre un 40 % y un 60 %. En algunas realizaciones, de un 40 % a un 60 % de lisinas puede tener enlace covalente con el CP5. Aún más alternativamente, de un 30 % a un 50 % de lisinas de CRM197 puede tener enlace covalente con el CP5; de un 20 % a un 40 % de lisinas de CRM197¡ de un 10 % a un 30 % de lisinas de CRM197; de un 50 % a un 70 % de lisinas de CRMi97; de un 35 % a un 65 % de lisinas de CRM197; de un 30 % a un 60 % de lisinas de CRM197; de un 25 % a un 55 % de lisinas de CRM-|97; de un 20 % a un 50 % de lisinas de CRMi97¡ de un 15 % a un 45 % de lisinas de CRM197; de un 10 % a un 40 % de lisinas de CRIv ; de un 40 % a un 70 % de lisinas de CRM-i9 ; o de un 45 % a un 75 % de lisinas de CRM197 tienen enlace covalente con el CP5.

La frecuencia de unión de la cadena de polisacárido capsular a una lisina en la molécula portadora es otro parámetro para la caracterización de conjugados de polisacáridos de cápsula. Por ejemplo, en una modalidad, al menos un enlace covalente entre CRM197 y polisacárido tiene lugar para al menos cada de 5 a 10 unidades de repetición de sacárido del polisacárido capsular. En otra modalidad, hay al menos un enlace covalente entre CRM197 y polisacárido capsular para cada de 5 a 10 unidades de repetición de sacárido; cada de 2 a 7 unidades de repetición de sacárido, cada de 3 a 8 unidades de repetición de sacárido; cada de 4 a 9 unidades de repetición de sacárido; cada de 6 a 1 1 unidades de repetición de sacárido; cada de 7 a 12 unidades de repetición de sacárido; cada de 8 a 13 unidades de repetición de sacárido; cada de 9 a 14 unidades de repetición de sacárido; cada de 10 a 15 unidades de repetición de sacárido; cada de 2 a 6 unidades de repetición de sacárido, cada de 3 a 7 unidades de repetición de sacárido; cada de 4 a 8 unidades de repetición de sacárido; cada de 6 a 10 unidades de repetición de sacárido; cada de 7 a 1 1 unidades de repetición de sacárido; cada de 8 a 12 unidades de repetición de sacárido; cada de 9 a 13 unidades de repetición de sacárido; cada de 10 a 14 unidades de repetición de sacárido; cada de 10 a 20 unidades de repetición de sacárido; cada de 5 a 10 unidades de repetición de sacárido del polisacárido capsular. En otra modalidad, al menos un enlace entre CRM197 y polisacárido capsular tiene lugar para cada 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 1 1 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, o 20 unidades de repetición de sacárido del polisacárido capsular.

La activación química de los polisacáridos y la conjugación posterior con la proteína de portador pueden obtenerse por medios convencionales. Véanse, por ejemplo, las patentes de los Estados Unidos con n.os 4.673.574 y 4.902.506. Otros procedimientos de activación y de conjugación pueden usarse alternativamente.

"Proteína de portador" o "portador de proteína" tal como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier molécula de proteína que puede conjugarse con un antígeno (tal como los polisacáridos capsulares) frente a la que se desea una respuesta inmunitaria. La conjugación de un antígeno tal como un polisacárido con una proteína de portador puede dar lugar a que el antígeno sea inmunogénico. Las proteínas de portador son preferentemente proteínas que son no tóxicas y no reactogénicas y que pueden obtenerse en suficiente cantidad y pureza. Ejemplos de proteínas portadoras son toxinas, toxoides o cualquier material de reacción cruzada mutante (CRM197) de la toxina a partir de tétanos, difteria, tos ferina, especies Pseudomonas, E. coli, especies de Staphylococcus, y especies de Streptococcus. Las proteínas de portador deberían de poder someterse a procedimientos de conjugación convencionales. En una modalidad particular de la presente invención, se usa CRM197 como la proteína de portador.

CRM197 (Wyeth/Pfizer, Sanford, NC) es una variante no tóxica (es decir, un toxoide) de toxina diftérica aislada a partir de cultivos de la cepa C7 de Corynebacterium diphtheriae (ß197) que se hace crecer en casaminoácidos y en un medio basado en extracto de levadura. CRM-|97 se purifica a través de ultra-filtración, precipitación de sulfato de amonio, y cromatografía de intercambio iónico. Un cultivo de cepa C7 de Corynebacterium diphtheriae (197), que producen la proteína CRIv , se ha depositado con la Colección Americana de Cultivos Tipo, Rockville, Maryland y se le ha asignado el número de registro ATCC 53281 . Otros toxoides diftéricos son también adecuados para su uso como proteínas portadoras.

Otras proteínas portadoras adecuadas incluyen toxinas bacterianas inactivadas tales como toxoide tetánico, toxoide de tos ferina, toxoide del cólera (por ejemplo, tal como se describe en la solicitud de patente internacional WO2004/083251 ), E. coli LT, E. coli ST, y exotoxina A a partir de Pseudomonas aeruginosa. Pueden también usarse proteínas de la membrana exterior bacteriana tal como el complejo de proteína de la membrana exterior c (OMPC), porinas, proteínas de unión a transferrina, neumolisina, proteína de superficie neumocócica A (PspA), proteína de adhesína neumocócica (PsaA), enterotoxina de C. difficile (toxina A) y citotoxina (toxina B) o proteína de Haemophílus influenzae D. Otras proteínas, tal como ovalbúmina, hemocianina de la lapa californiana (KLH), albúmina de suero bovino (BSA) o derivado de proteína purificado de la tuberculina (PPD) pueden usarse también como proteínas portadoras.

Después de la conjugación del polisacárido capsular con la proteína de portador, los conjugados de polisacárido-proteína se purifican (se enriquecen con respecto a la cantidad de conjugado de polisacárido-proteína) mediante una variedad de técnicas. Estas técnicas incluyen, por ejemplo, operaciones de concentración/díafiltración, precipitación/elución, cromatografía en columna, y filtración profunda. Véanse los ejemplos a continuación.

Después de los conjugados individuales se purifican, éstos pueden combinarse para formular una composición inmunogénica de la presente invención, que puede usarse, por ejemplo, en una vacuna. La formulación de la composición inmunogénica de la presente invención puede llevarse a cabo usando procedimientos reconocidos en la técnica.

Se observa que en la presente divulgación, expresiones tales como "comprende", "comprendido/a", "comprendiendo/ que comprende", "contiene", "conteniendo/ que contiene" y similares pueden tener el significado que se les atribuye en la ley de patentes de los Estados Unidos; por ejemplo, éstas pueden significar "incluye", "incluído/a", "incluyendo/ que incluye" y similares. Tales expresiones se refieren a la inclusión de unos componentes particulares o conjunto de componentes sin excluir cualesquiera otros componentes. Expresiones tales como "consistiendo/ que consiste esencialmente en" y "consiste esencialmente en" tienen el significado que se les atribuye en la ley de patentes de los Estados Unidos, por ejemplo, éstas permiten la inclusión de componentes o etapas adicionales que no restan valor a las características novedosas o básicas de la invención, es decir, éstas excluyen componentes o etapas no mencionados adicionales que restan valor a las características novedosas o básicas de la invención, y éstas excluyen componentes o etapas de la técnica anterior, tal como documentos en la técnica que se indican en el presente documento o se incorporan por referencia en el presente documento, especialmente debido a que es un objetivo del presente documento definir unas realizaciones que pueden patentarse, por ejemplo, novedosas, no obvias, de la invención, sobre la técnica anterior, por ejemplo, sobre los documentos que se indican en el presente documento o que se incorporan por referencia en el presente documento. Y, las expresiones "consiste en" y "consistiendo/ que consiste en" tienen el significado que se atribuye a éstas en la ley de patentes de los Estados Unidos; a saber, que estas expresiones son cerradas. Por consiguiente, estas expresiones se refieren a la inclusión de un conjunto de componentes o un componente particular y a la exclusión de todos los otros componentes.

Una "sustitución de aminoácidos conservativas" se refiere a la sustitución de uno o más de los residuos de aminoácido de una proteína con otros residuos de aminoácido que tienen propiedades físicas y/o químicas similares. Sustitutos para un aminoácido dentro de la secuencia pueden seleccionarse de otros miembros de la clase a la que pertenece el aminoácido. Por ejemplo, los aminoácidos no polares (hidrófobos) incluyen alanina, leucina, isoleucina, valina, prolina, fenilalanina, triptófano y metionina. Aminoácidos con contenido en estructuras de anillo aromático son fenilalanina, triptófano, y tirosina. Los aminoácidos neutrales polares incluyen glicina, serina, treonina, cisteína, tirosina, asparagina, y glutamina. Los aminoácidos con carga positiva (básicos) incluyen arginina, lisinas e histidina. Los aminoácidos con carga negativa (ácidos) incluyen ácido aspártico y ácido glutámico. No se espera que tales alteraciones afecten al peso molecular aparente tal como se determina por electroforesis de gel de poliacrilamida, o punto isoeléctrico. Sustituciones preferidas particulares son: Lys para Arg y viceversa de tal modo que puede mantenerse una carga positiva; Glu para Asp y viceversa de tal modo que puede mantenerse una carga negativa; Ser para Thr de tal modo que puede mantenerse un -OH libre; y Gln para Asn de tal modo que puede mantenerse un NH2 libre.

"Fragmento" se refiere a proteínas en las que sólo se incluyen dominios específicos de una proteína más grande. Por ejemplo, proteínas de ClfA y ClfB contienen tantos como 8 dominios cada una si se incluyen las secuencias señal. Se considera que cada uno de un polipéptido que se corresponde con los dominios N1 N2N3, N2N3, N1 N2, N1 , N2, o N3 son fragmentos de ClfA o ClfB. "Fragmento" también se refiere a o bien una proteína o bien un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos de al menos 4 residuos de aminoácido (preferentemente, de al menos 10 residuos de aminoácido, de al menos 15 residuos de aminoácido, de al menos 20 residuos de aminoácido, de al menos 25 residuos de aminoácido, de al menos 40 residuos de aminoácido, de al menos 50 residuos de aminoácido, de al menos 60 residuos de aminoácido, de al menos 70 residuos de aminoácido, de al menos 80 residuos de aminoácido, de al menos 90 residuos de aminoácido, de al menos 100 residuos de aminoácido, de al menos 125 residuos de aminoácido, o al menos 150 residuos de aminoácido) de la secuencia de aminoácidos de un polipéptido o proteína original o un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos de al menos 10 pares de bases (preferentemente de al menos 20 pares de bases, de al menos 30 pares de bases, de al menos 40 pares de bases, de al menos 50 pares de bases, de al menos 50 pares de bases, de al menos 100 pares de bases, de al menos 200 pares de bases) de la secuencia de nucleótidos del ácido nucleico original.

"Actividad funcional" de un anticuerpo o "anticuerpo funcional", tal como se usa en el presente documento, se refiere a un anticuerpo que, en un mínimo, puede unirse específicamente con un antígeno. Funciones adicionales se conocen en la técnica y pueden incluir componentes adicionales del sistema inmunitario que efectúan el aclaramiento o la destrucción del patógeno tal como a través de opsonización, ADCC o citotoxicidad mediada por complemento. Después de la unión de antígeno, cualesquiera funciones de anticuerpo posteriores pueden mediarse a través de la región Fe del anticuerpo. El ensayo de anticuerpo opsonofagocítico (OPA) es un ensayo in vitro diseñado para medir la destrucción de bacterias asistida por complemento Ig in vitro con células efectoras (glóbulos blancos), que de este modo imita un proceso biológico. La unión de anticuerpos puede también inhibir directamente la función biológica del antígeno al que se une, por ejemplo, anticuerpos que se unen a ClfA pueden neutralizar su función enzimática. En algunas realizaciones, un "anticuerpo funcional" se refiere a un anticuerpo que es funcional tal como se mide por la destrucción de bacterias en un modelo de eficacia animal o un ensayo de destrucción opsonofagocítica que muestra que los anticuerpos destruyen las bacterias.

El peso molecular de los polisacáridos de cápsula de S. aureus es una consideración para su uso en composiciones inmunogénicas. Por ejemplo, los polisacáridos de cápsula de alto peso molecular pueden ser capaces de inducir ciertas respuestas inmunitarias de anticuerpo debido a una valencia más alta de los epítopos presentes en la superficie antigénica. El aislamiento de los "polisacáridos capsulares de alto peso molecular" se contempla para su uso en las composiciones y procedimientos de la presente invención. Por ejemplo, en una modalidad de la invención, se contempla el aislamiento de polisacáridos de tipo 5 de alto peso molecular que varían en tamaño de aproximadamente 50 a aproximadamente 800 kDa en peso molecular. En una modalidad de la invención, se contempla el aislamiento de polisacáridos de tipo 5 de alto peso molecular que varían en tamaño de aproximadamente 20 a aproximadamente 1.000 kDa en peso molecular. En una modalidad de la invención, se contempla el aislamiento y la purificación de tipo 5 polisacáridos capsulares de alto peso molecular que varían en tamaño de aproximadamente 50 a aproximadamente 300 kDa en peso molecular. En una modalidad, se contempla el aislamiento y la purificación de polisacárido capsular de alto peso molecular de tipo 5 que varía de 70 kDa a 300 kDa en peso molecular. En una modalidad, se contempla el aislamiento y la purificación de polisacárido capsular de alto peso molecular de tipo 5 que varía de 90 kDa a 250 kDa en peso molecular. En una modalidad, se contempla el aislamiento y la purificación de polisacárido capsular de alto peso molecular de tipo 5 que varía de 90 kDa a 150 kDa en peso molecular. En una modalidad, se contempla el aislamiento y la purificación de polisacárido capsular de alto peso molecular de tipo 5 que varía de 90 kDa a 140 kDa en peso molecular. En una modalidad, se contempla el aislamiento y la purificación de polisacárido capsular de alto peso molecular de tipo 5 que varía de 80 kDa a 120 kDa en peso molecular. Otros intervalos de alto peso molecular polisacárido capsular de serotipo 5 que puede aislarse y purificarse mediante los procedimientos de la presente invención incluyen intervalos de tamaño de aproximadamente 70 kDa a aproximadamente 100 kDa en peso molecular; de 70 kDa a 1 10 kDa en peso molecular; de 70 kDa a 120 kDa en peso molecular; de 70 kDa a 130 kDa en peso molecular; de 70 kDa a 140 kDa en peso molecular; de 70 kDa a 150 kDa en peso molecular; de 70 kDa a 160 kDa en peso molecular; de 80 kDa a 110 kDa en peso molecular; de 80 kDa a 120 kDa en peso molecular; de 80 kDa a 130 kDa en peso molecular; de 80 kDa a 140 kDa en peso molecular; de 80 kDa a 150 kDa en peso molecular; de 80 kDa a 160 kDa en peso molecular; de 90 kDa a 1 10 kDa en peso molecular; de 90 kDa a 120 kDa en peso molecular; de 90 kDa a 130 kDa en peso molecular; de 90 kDa a 140 kDa en peso molecular; de 90 kDa a 150 kDa en peso molecular; de 90 kDa a 160 kDa en peso molecular; de 100 kDa a 120 kDa en peso molecular; de 100 kDa a 130 kDa en peso molecular; de 100 kDa a 140 kDa en peso molecular; de 100 kDa a 150 kDa en peso molecular; de 100 kDa a 160 kDa en peso molecular; e intervalos deseados similares de peso molecular.

Tal como se analiza anteriormente, el peso molecular de los polisacáridos de cápsula de S. aureus es una consideración para su uso en composiciones inmunogénicas. Por ejemplo, los polisacáridos de cápsula de alto peso molecular pueden ser capaces de inducir ciertas respuestas inmunitarias de anticuerpo debido a una valencia más alta de los epítopos presentes en la superficie antigénica. En una modalidad de la invención, se contempla el aislamiento y la purificación de polisacáridos capsulares de alto peso molecular de tipo 8 que varían de aproximadamente 20 kDa a aproximadamente 1.000 kDa en peso molecular. En una modalidad de la invención, se contempla el aislamiento y la purificación de polisacáridos capsulares de alto peso molecular de tipo 8 que varían de aproximadamente 50 kDa a aproximadamente 700 kDa en peso molecular. En una modalidad de la invención, se contempla el aislamiento y la purificación de polisacáridos capsulares de alto peso molecular de tipo 8 que varían de 50 kDa a 300 kDa en peso molecular. En una modalidad, se contempla el aislamiento y la purificación de polisacárido capsular de tipo 8 de alto peso molecular variando de 70 kDa a 300 kDa en peso molecular. En una modalidad, se contempla el aislamiento y la purificación de polisacáridos capsulares de alto peso molecular de tipo 8 que varían de 90 kDa a 250 kDa en peso molecular. En una modalidad, se contempla el aislamiento y la purificación de polisacáridos capsulares de alto peso molecular de tipo 8 que varían de 90 kDa a 150 kDa en peso molecular. En una modalidad, se contempla, el aislamiento y la purificación de polisacáridos capsulares de alto peso molecular de tipo 8 que varían de 90 kDa a 120 kDa en peso molecular En una modalidad, se contempla el aislamiento y la purificación de polisacáridos capsulares de alto peso molecular de tipo 8 que varían de 80 kDa a 120 kDa en peso molecular. Otros intervalos de polisacáridos capsulares de serotipo 8 de alto peso molecular que pueden aislarse y purificarse mediante los procedimientos de la presente invención incluyen intervalos de tamaño de aproximadamente 70 kDa a aproximadamente 100 kDa en peso molecular; de 70 kDa a 1 10 kDa en peso molecular; de 70 kDa a 120 kDa en peso molecular; de 70 kDa a 130 kDa en peso molecular; de 70 kDa a 140 kDa en peso molecular; de 70 kDa a 150 kDa en peso molecular; de 70 kDa a 160 kDa en peso molecular; de 80 kDa a 110 kDa en peso molecular; de 80 kDa a 120 kDa en peso molecular; de 80 kDa a 130 kDa en peso molecular; de 80 kDa a 140 kDa en peso molecular; de 80 kDa a 150 kDa en peso molecular; de 80 kDa a 160 kDa en peso molecular; de 90 kDa a 1 10 kDa en peso molecular; de 90 kDa a 120 kDa en peso molecular; de 90 kDa a 130 kDa en peso molecular; de 90 kDa a 140 kDa en peso molecular; de 90 kDa a 150 kDa en peso molecular; de 90 kDa a 160 kDa en peso molecular; de 100 kDa a 120 kDa en peso molecular; de 100 kDa a 130 kDa en peso molecular; de 100 kDa a 140 kDa en peso molecular; de 100 kDa a 150 kDa en peso molecular; de 100 kDa a 160 kDa en peso molecular; e intervalos deseados similares de peso molecular.

Una "respuesta inmunitana" frente a una composición inmunogénica es el desarrollo en un sujeto de una respuesta inmunitaria humoral y/o una respuesta inmunitaria mediada por células frente a moléculas presentes en la composición de interés (por ejemplo, un antígeno, tal como una proteína o polisacárido). Para los fines de la presente invención, una "respuesta inmunitaria humoral" es una respuesta inmunitaria mediada por anticuerpos e implica la generación de anticuerpos con afinidad por los antígenos presentes en las composiciones inmunogénicas de la invención, mientras que una "respuesta inmunitaria mediada por células" es una respuesta mediada por linfocitos T y/u otros glóbulos blancos. Una "respuesta inmunitaria mediada por células" se provoca mediante la presentación de epítopos antigénicos en asociación con moléculas de clase I o de clase II del complejo mayor de histocompatibilidad (CMH). Ésta activa células T CD4+ cooperadoras específicas de antígeno o linfocitos T citotóxicos CD8+ ("CTL"). Los CTL tienen espeficificidad por antígenos peptidicos o lipidíeos que se presentan en asociación con proteínas codificadas por el complejo mayor de histocompatibilidad (CMH) o CD1 y que se expresan sobre las superficies de células. Los CTL ayudan a inducir y promover la destrucción intracelular de microbios intracelulares, o la lisis de células infectadas con tales microbios. Otro aspecto de la inmunidad celular implica una respuesta específica de antígeno mediante las células T cooperadoras. Las células T cooperadoras actúan para ayudar a estimular la función, y enfocan la actividad de, células efectoras no específicas frente a células que muestran antígenos peptidicos en asociación con moléculas de CMH clásicas o no clásicas en su superficie. Una "respuesta inmunitaria mediada por células" también se refiere a la producción de citocinas, quimiocinas y otras moléculas de este tipo que se producen mediante células T activadas y/u otros glóbulos blancos, incluyendo las derivadas de células T CD4+ y CD8+. La capacidad de una composición o antígeno particular para estimular una respuesta inmunológica mediada por células puede determinarse mediante un número de ensayos, tal como mediante ensayos de linfoproliferación (activación de linfocitos), ensayos de células citotóxicas CTL, sometiendo a ensayo linfocitos T específicos para el antígeno en un sujeto sensibilizado, o mediante la medición de la producción de citocinas por células T en response to restimulation con antígeno. Tales ensayos se conocen bien en la técnica. Véase, por ejemplo, Erickson y col., J. Immunol. (1993) 151 :4189 a 4199; Doe y col., Eur. J. Immunol. (1994) 24:2369 a 2376.

La expresión "inmunogénico/a" se refiere a la capacidad de un antígeno o una vacuna para provocar una respuesta inmunitaria, o bien humoral o bien mediada por célula, o ambas.

Una "cantidad inmunogénica", o una "cantidad inmunológicamente eficaz" o "dosis", cada una de las cuales se usa de forma intercambiable en el presente documento, en general se refiere a la cantidad de antígeno o composición inmunogénica suficiente para provocar una respuesta inmunitaria, o bien una respuesta celular (célula T) o bien humoral (célula B o anticuerpo), o ambas, tal como se mide por ensayos convencionales conocidos por un experto en la técnica.

La cantidad de un conjugado particular en una composición se calcula en general en base al polisacárido total, conjugado y no conjugado para ese conjugado. Por ejemplo, un conjugado de CP5 con un 20 % de polisacárido libre tendrá aproximadamente 80 mcg de polisacárido conjugado de CP5 y aproximadamente 20 mcg de polisacárido CP5 no conjugado en una dosis de polisacárido CP5 de 100 mcg. La contribución de la proteína al conjugado no se considera normalmente cuando se calcula la dosis de un conjugado. La cantidad de conjugado puede variar dependiendo del serotipo estafilocócico. En general, cada dosis comprenderá de 0.01 a 100 mcg de polisacárido, en particular de 0.1 a 10 mcg, y más particularmente de 1 a 10 mcg. La "cantidad inmunogénica" de los componentes de polisacárido diferentes en la composición inmunogénica, puede divergir y cada uno puede comprender 0.01 mcg, 0.1 mcg, 0.25 mcg, 0.5 mcg, 1 mcg, 2 mcg, 3 mcg, 4 mcg, 5 mcg, 6 mcg, 7 mcg, 8 mcg, 9 mcg, 10 mcg, 15 mcg, 20 mcg, 30 mcg, 40 mcg, 50 mcg, 60 mcg, 70 mcg, 80 mcg, 90 mcg, o aproximadamente 100 mcg de cualquier antígeno de polisacárido particular.

En otra modalidad, la "cantidad inmunogénica" de los componentes de proteína en la composición inmunogénica, puede variar entre aproximadamente 10 mcg a aproximadamente 300 mcg de cada antígeno proteico. En una modalidad particular, la "cantidad inmunogénica" de los componentes de proteína en la composición inmunogénica, puede variar entre aproximadamente 20 mcg a aproximadamente 200 mcg de cada antígeno proteico. La "cantidad inmunogénica" de los diferentes componentes de proteína en la composición inmunogénica pueden divergir, y comprenden cada uno 10 mcg, 20 mcg, 30 mcg, 40 mcg, 50 mcg, 60 mcg, 70 mcg, 80 mcg, 90 mcg, 100 mcg, 125 mcg, 150 mcg, 175 mcg o aproximadamente 200 mcg de cualquier antígeno proteico particular.

La eficacia de un antígeno como un inmunógeno puede medirse midiendo los niveles de actividad de célula B midiendo los niveles de anticuerpos en circulación específicos para el antígeno en el suero usando inmunoensayos, ensayos de inmunoprecipitación, ensayos de anticuerpo funcional, tales como ensayo opsónico in vitro y muchos otros ensayos que se conocen en la técnicaotra medida de eficacia de un antígeno como un inmunógeno de célula T puede medirse mediante o bien mediante ensayos de proliferación, o bien mediante ensayos citolíticos, tales como ensayos de liberación de cromo para medir la capacidad de una célula T para lisar su célula diana específica. Además, en la presente invención, una "cantidad inmunogénica" puede también ser defined midiendo los niveles en suero de anticuerpo específico de antígeno que se induce a continuación de la administración del antígeno, o, midiendo la capacidad de los anticuerpos que se inducen de tal forma para aumentar la capacidad opsonofagocítica de glóbulos blancos particulares, tal como se describe en el presente documento. El nivel de protección de la respuesta ¡nmunitaria puede medirse exponiendo el huésped inmunizado al antígeno que se ha inyectado. Por ejemplo, si el antígeno con respecto al que se desea una respuesta inmunitaria es una bacteria, el nivel de protección que se induce mediante la "cantidad inmunogénica" del antígeno puede medirse detectando el porcentaje de supervivencia o el porcentaje de mortalidad después de una exposición de los animales a las células bacterianas. En una modalidad, la cantidad de protección puede medirse midiendo al menos un síntoma asociado con la infección bacteriana, por ejemplo, una fiebre asociada con la infección. La cantidad de cada uno de los antígenos en la vacuna o en las composiciones inmunogénicas multiantígeno o multicomponente variará con respecto a cada uno de los otros componentes y puede determinarse mediante procedimientos conocidos por el experto. Tales procedimientos incluirían, por ejemplo, procedimientos para medir la inmunogenicidad y/o la eficacia in vivo.

La expresión "composición inmunogénica" se refiere a cualquier composición farmacéutica con contenido en un antígeno, por ejemplo, un microorganismo, o un componente del mismo, composición que puede usarse para provocar una respuesta inmunitaria en un sujeto. Las composiciones inmunogénicas de la presente invención pueden usarse para tratar un ser humano susceptible de infección por S. aureus, por medio de administración de las composiciones inmunogénicas a través de a sistémico transdérmica o mucosal vía. Estas administraciones pueden incluir una inyección a través de las vías intramuscular (IM), intraperitoneal (i.p.), ¡ntradérmica (ID) o subcutánea; la aplicación mediante un parche u otro dispositivo de administración transdérmica; o a través de administración mucosa a los tractos oral/alimentario, respiratorio o genitourinario. En una modalidad, se usa una administración intranasal para el tratamiento o prevención de estado nasofaríngeo de portador de S. aureus, atenuando de este modo la infección en su fase más temprana. En una modalidad, la composición inmunogénica puede usarse en la fabricación de una vacuna o en la obtención de unos anticuerpos policlonales o monoclonales que podrían usarse para proteger o para tratar de forma pasiva un animal.

Pueden determinarse unas cantidades óptimas de componentes para una composición inmunogénica particular mediante unos estudios convencionales que implican la observación de unas respuestas inmunitarias apropiadas en los sujetos. Siguiendo una vacunación inicial, los sujetos pueden recibir una o varias inmunizaciones de refuerzo separadas de forma adecuada.

En una modalidad de la presente invención, la composición inmunogénica de S. aureus comprende un fragmento de factor de aglutinación A (ClfA) de S. aureus recombinante (N1 N2N3, o combinaciones de los mismos), un tipo 5 de polisacáridos capsulares aislado conjugado con CRM197 y un tipo 8 de polisacáridos capsulares aislado conjugado con CRM-197. En otra modalidad, la composición inmunogénica de S. aureus es una formulación estéril (líquida, liofilizada, vacuna de ADN, preparación intradérmica) de fragmento de factor de aglutinación A (ClfA) de S. aureus recombinante (N1 N2N3, o combinaciones de los mismos), fragmento de factor de aglutinación B (CIfB) de S. aureus recombinante (N1 N2N3, o combinaciones de los mismos), un tipo 5 de polisacáridos capsulares aislado conjugado con CRM-197 y un tipo 8 de polisacáridos capsulares aislado conjugado con CRM197. En una modalidad de la presente invención, la composición inmunogénica de S. aureus comprende un fragmento de factor de aglutinación A (ClfA) de S. aureus recombinante (N1 N2N3, o combinaciones de los mismos), una proteína MntC de unión a hierro de S. aureus, un tipo 5 de polisacáridos capsulares aislado conjugado con CRM197 y un tipo 8 de polisacáridos capsulares aislado conjugado con CRM 97. En una modalidad, la composición inmunogénica de S. aureus es una formulación estéril (líquida, liofilizada, vacuna de ADN, preparación intradérmica) de fragmento de factor de aglutinación A (ClfA) de S. aureus recombinante (N1 N2N3, o combinaciones de los mismos), fragmento de factor de aglutinación B (CIfB) de S. aureus recombinante (N1 N2N3, o combinaciones de los mismos), una proteína MntC de unión a hierro de S. aureus, un tipo 5 de polisacáridos capsulares aislado conjugado con CRMig7 y un tipo 8 de polisacáridos capsulares aislado conjugado con CRM197. En una modalidad de la presente invención, la composición inmunogénica de S. aureus comprende un fragmento de factor de aglutinación B (CIfB) de S. aureus recombinante (N1 N2N3, o combinaciones de los mismos), un tipo 5 de polisacáridos capsulares aislado conjugado con CRMi97 y un tipo 8 de polisacáridos capsulares aislado conjugado con CRM197. En una modalidad de la presente invención, la composición inmunogénica de S. aureus comprende un fragmento de factor de aglutinación B (CIfB) de S. aureus recombinante (N1 N2N3, o combinaciones de los mismos), una proteína MntC de unión a hierro de S. aureus, un tipo 5 de polisacáridos capsulares aislado conjugado con CRM197 y un tipo 8 de polisacáridos capsulares aislado conjugado con CRM197. En una modalidad de la presente invención, la composición inmunogénica de S. aureus comprende una proteína MntC de unión a hierro de S. aureus, un tipo 5 de polisacáridos capsulares aislado conjugado con CRM197 y un tipo 8 de polisacáridos capsulares aislado conjugado con CRM197.

Las composiciones inmunogénicas de la presente invención pueden comprender además uno o más "inmunomoduladores" adicionales, que son agentes que perturban o alteran el sistema inmunitario, de tal modo que se observa o bien una regulación por aumento o bien una regulación por disminución de inmunidad mediada, de forma celular y/o humoral. En una modalidad particular, se prefiere la regulación por aumento de las armas mediadas de forma celular y/o humoral del sistema inmunitario. Ejemplos de ciertos inmunomoduladores incluyen, por ejemplo, un adyuvante o citocina, o ISCOMATRIX (CSL Limited, Parkville, Australia), que se describe en la patente de los Estados Unidos con n.° 5.254.339 entre otros. Unos ejemplos no limitantes de adyuvantes que pueden usarse en la vacuna de la presente invención incluyen el sistema de adyuvante RIBI (Ribi Inc., Hamilton, Mont.), alumbre, geles minerales tales como gel de hidróxido de aluminio, emulsiones de aceite en agua, emulsiones de agua en aceite tales como, por ejemplo, adyuvantes completos e incompletos de Freund, copolímero de Block (CytRx, Atlanta Ga.), QS-21 (Cambridge Biotech Inc., Cambridge Mass.), SAF-M (Chiron, Emeryville Calif ), Adyuvante Amphigen®, saponina, Quil A u otra fracción de saponina, lípido monofosforílico A, y adyuvante lípido-amina Avridine. Unos ejemplos no limitantes de emulsiones de aceite en agua útiles en la vacuna de la invención incluyen las formulaciones SEAM62 y SEAM 1/2 modificadas. La SEAM62 modificada es una emulsión de aceite en agua con contenido en un 5 % (v/v) de escualeno (Sigma), un 1 % (v/v) de detergente SPAN® 85 (ICI Surfactants), un 0.7 % (v/v) de detergente polysorbate ® 80 (ICI Surfactants), un 2.5 % (v/v) de etanol, 200 pg/ml de Quil A, 100 pg/ml de colesterol, y un 0.5 % (v/v) de lecitina. La SEAM 1/2 modificada es una emulsión de aceite en agua que comprende un 5 % (v/v) de escualeno, un 1 % (v/v) de detergente SPAN® 85, un 0.7 % (v/v) de detergente polysorbate 80, un 2.5 % (v/v) de etanol, 100 pg/ml de Quil A, y 50 pg/ml de colesterol. Otros "inmunomoduladores" que pueden incluirse en la vacuna incluyen, por ejemplo, una o más interleucinas, interferones, u otras citocinas o quimiocinas conocidas. En una modalidad, el adyuvante puede ser un derivado de ciclodextrina o un polímero polianiónico, tal como los que se describen en las patentes de los Estados Unidos con números 6.165.995 y 6.610.310, respectivamente. Ha de entenderse que el inmunomodulador y/o adyuvante que va a usarse dependerá del sujeto al que la vacuna o composición inmunogénica se administrará, la vía de inyección y el número de inyecciones que van a darse.

"Enfermedad invasiva" por S. aureus es el aislamiento de bacterias a partir de un sitio normalmente estéril, en el que están asociados signos/síntomas clínicos de enfermedad. Los sitios del organismo normalmente estériles incluyen sangre, LCR, fluido pleural, fluido pericárdico, fluido peritoneal, fluido articular/sinovial, hueso, sitio interno del organismo (ganglio linfático, cerebro, corazón, hígado, bazo, fluido vitreo, riñon, páncreas, ovario), u otros sitios normalmente estériles. Las afecciones clínicas que caracterizan a las enfermedades invasivas incluyen bacteriemia, neumonía, celulitis, osteomielitis, endocarditis, choque septicémico y más.

La expresión "aislado" quiere decir que el material se retira de su entorno original (por ejemplo, el entorno natural si se produce de manera natural o a partir del organismo de su huésped si éste es una entidad recombinante, o se lleva de un entorno a un entorno diferente). Por ejemplo, una proteína, péptido o polisacárido de cápsula "aislado" está sustancialmente libre de material celular u otras proteínas contaminantes en la célula o fuente de tejido de la que se deriva la proteína, o sustancialmente libre de precursores químicos u otros productos químicos cuando se sintetiza químicamente, o de otro modo presente en una mezcla como parte de una reacción química. En la presente invención, las proteínas o polisacáridos pueden aislarse a partir de la célula bacteriana o a partir del residuo celular, de tal modo que se proporcionan en una forma útil en la fabricación de una composición inmunogénica. La expresión "aislado" o "aislar" puede incluir purificar, o purificación, incluyendo por ejemplo, los procedimientos de purificación de las proteínas o polisacáridos capsulares, tal como se describe en el presente documento. La expresión "sustancialmente libre de material celular" incluye preparaciones de un polipéptido/proteína en las que el polipéptido/proteína se separa de los componentes celulares de las células de las que se aisla o se produce de forma recombinante. Por lo tanto, un polisacárido de cápsula, proteína o péptido que está sustancialmente libre de material celular incluye preparaciones del polisacárido de cápsula, proteína o péptido que tiene menos de aproximadamente un 30 %, un 20 %, un 10 %, un 5 %, un 2.5 %, o un 1 %, (en peso seco) de proteína o polisacárido u otro material celular contaminante. Cuando el polipéptido/proteína se produce de forma recombinante, está también preferentemente sustancialmente libre de medio de cultivo, es decir, el medio de cultivo representa menos de aproximadamente un 20 %, un 10 %, o un 5 % del volumen de la preparación de proteína. Cuando el polipéptido/proteína o polisacárido se produce mediante síntesis química, está preferentemente sustancialmente libre de precursores químicos u otros productos químicos, es decir, se separa de precursores químicos u otros productos químicos que están implicados en la síntesis de la proteína o polisacárido. Por consiguiente, tales preparaciones del polipéptido/proteína o polisacárido tienen menos de aproximadamente un 30 %, un 20 %, un 10 %, un 5 % (en peso seco) de precursores químicos o compuestos distintos del fragmento de polipéptido/proteína o polisacárido de interés.

Una "sustitución de aminoácidos no conservativa" se refiere a la sustitución de uno o más de los residuos de aminoácido de una proteína con otros residuos de aminoácido que tienen propiedades físicas y/o químicas diferentes, usando las características que se definen anteriormente.

La expresión "portador farmacéuticamente aceptable" quiere decir un portador aprobado por una agencia de regulación de un gobierno estatal, uno Federal, u otra agencia de regulación, o que se enumera en la Farmacopea de los Estados Unidos o en otra farmacopea reconocida en general para su uso en animales, incluyendo seres humanos así como mamíferos no humanos. La expresión "portador" se refiere a un diluyente, adyuvante, excipiente, o vehículo con el que se administra la composición farmacéutica. Tales portadores farmacéuticos pueden ser líquidos estériles, tal como agua y aceites, incluyendo los de petróleo, animal, vegetal o de origen sintético. Pueden emplearse como portadores líquidos agua, soluciones salinas y dextrosa en solución acuosa y disoluciones de glicerol, en particular para disoluciones inyectables. Excipientes farmacéuticos adecuados incluyen almidón, glucosa, lactosa, sacarosa, gelatina, malta, arroz, harina, carbón, gel de sílice, estearato de sodio, monoestearato de glicerol, talco, cloruro de sodio, leche desnatada en polvo, glicerol, propileno, glicol, agua, etanol y similares. La composición, si se desea, puede contener también unas cantidades minoritarias de agentes de humectación, de carga, emulsionante, o agentes de tamponamiento de pH. Estas composiciones pueden adoptar la forma de disoluciones, suspensiones, emulsión, formulaciones de liberación sostenida y similares. Ejemplos de portadores farmacéuticos adecuados se describen en "Remington's Pharmaceutical Sciences" de E. W. Martin. La formulación ha de adecuarse al modo de administración.

Las expresiones "proteína", "polipéptido" y "péptido" se refieren a un polímero de residuos de aminoácido y no se imitan a una longitud mínima del producto. Por lo tanto, péptidos, oligopéptidos, dímeros, multímeros, y similares, se incluyen dentro de la definición. Tanto las proteínas de longitud total como los fragmentos de las mismas están englobados en la definición. Las expresiones también incluyen modificaciones, tal como deleciones, adiciones y sustituciones (en general de naturaleza conservativa, pero que pueden ser no conservativas), con respecto a una secuencia nativa, preferentemente de tal modo que la proteína mantenga la capacidad para provocar una respuesta inmunológica dentro de un animal al que se administra la proteína. También se incluyen modificaciones posteriores a la expresión, por ejemplo, glicosilación, acetilación, lipidación, fosforilación y similares.

Una respuesta inmunitaria "de protección" se refiere a la capacidad de una composición inmunogénica para provocar una respuesta inmunitaria, o bien mediada de forma celular o bien humoral, que sirve para proteger al sujeto frente a una infección. La protección que se prevé no ha de ser absoluta, es decir, la infección no ha de evitarse o erradicarse totalmente, si hay una mejora estadísticamente significativa en comparación con una población de control de sujetos, por ejemplo, animales infectados a los que no se administró la vacuna o composición inmunogénica. La protección puede limitarse a mitigar la gravedad o rapidez de aparición de los síntomas de la infección. En general, una "respuesta inmunitaria de protección" incluiría la inducción de un aumento en los niveles de anticuerpos específicos para un antígeno particular en al menos un 50 % de los sujetos, incluyendo un cierto nivel de respuestas de anticuerpos funcionales medibles para cada antígeno. En situaciones particulares, una "respuesta inmunitaria de protección" podría incluir la inducción de un aumento del doble en los niveles de anticuerpos o de un aumento de cuatro veces en los niveles de anticuerpos específicos para un antígeno particular en al menos un 50 % de los sujetos, incluyendo un cierto nivel de respuestas de anticuerpos funcionales medibles para cada antígeno. En ciertas realizaciones, la opsonización de anticuerpos está relacionada con una respuesta inmunitaria de protección. Por lo tanto, la respuesta inmunitaria de protección puede someterse a ensayo midiendo la disminución en porcentaje en el recuento de bacterias en un ensayo de opsonofagocitosis, por ejemplo, los que se describen a continuación. Preferentemente, hay una disminución en el recuento de bacterias de al menos un 10 %, un 25 %, un 50 %, un 65 %, un 75 %, un 80 %, un 85 %, un 90 %, un 95 % o más.

La expresión "recombinante", tal como se usa en el presente documento, se refiere simplemente a cualquier proteína, polipéptido, o célula que expresa un gen de interés que se produce mediante procedimientos de ingeniería genética. La expresión "recombinante" tal como se usa con respecto a una proteína o polipéptido, quiere decir un polipéptido que se produce mediante expresión de un polinucleótido recombinante. Las proteínas que se usa en las composiciones inmunogénicas de la invención pueden aislarse a partir de una fuente natural o producirse mediante procedimientos de ingeniería genética, tal como, por ejemplo, ClfA recombinante, ClfB recombinante o MntC recombinante. "Recombinante", tal como se usa en el presente documento, describe adicionalmente una molécula de ácido nucleico, que, en virtud de su origen o manipulación, no está asociada con la totalidad o una parte del polinucleótido con el que ésta está asociada por naturaleza. La expresión "recombinante" tal como se usa con respecto a una célula huésped quiere decir una célula huésped en el interior de la que se ha introducido un polinucleótido recombinante.

ClfA recombinante (rCIfA) y ClfB recombinante (rCIfB), tal como se usa en el presente documento, se refiere a formas de CIfA o CIfB para su uso en las composiciones inmunogénicas de la invención. En una modalidad, rCIfA es un fragmento de CIfA que comprende uno o más de los dominios N, por ejemplo, N1 N2N3, N2N3, N2 o N3 y al se hace referencia a en el presente documento como "CIfA recombinante" o "rCIfA". En una modalidad, rCIfB es un fragmento de CIfB que comprende uno o más de los dominios N de CIfB, por ejemplo, N1 N2N3, N2N3, N2 o N3 y al se hace referencia a en el presente documento como "CIfB recombinante" o "rCIfB".

La expresión "sujeto" se refiere a un mamífero, pájaro, pez, reptil, o cualquier otro animal. La expresión "sujeto" también incluye seres humanos. La expresión "sujeto" también incluye mascotas domésticas. Unos ejemplos no limitantes de mascotas domésticas incluyen: perros, gatos, cerdos, conejos, ratas, ratones, gerbos, hámsteres, cobayas, hurones, pájaros, serpientes, lagartos, peces, tortugas, y ranas. La expresión "sujeto" también incluye animales de ganado. Unos ejemplos no limitantes de animales de ganado incluyen: alpaca, bisonte, camello, ganado bovino, ciervo, cerdos, caballos, llamas, muías, burros, ovejas, cabras, conejos, reno, yak, gallinas, gansos, y pavos.

Tal como se usa en el presente documento, "tratamiento" (incluyendo variaciones del mismo, por ejemplo, "tratar" o "tratado") se refiere a uno o más cualquiera de lo siguiente: (i) la prevención de infección o reinfección, como en una vacuna tradicional, (¡i) la reducción en la gravedad de, o, en la eliminación de síntomas, y (iii) la eliminación sustancial o completa del patógeno o trastorno en cuestión. Por lo tanto, el tratamiento puede efectuarse de forma profiláctica (antes de la infección) o terapéuticamente (tras la infección). En la presente invención pueden usarse tratamientos profilácticos o terapéuticos. De acuerdo con una modalidad particular de la presente invención, se proporcionan composiciones y procedimientos que tratan, incluyendo inmunizar de forma profiláctica y/o terapéutica, un huésped animal frente a una infección microbiana (por ejemplo, una bacteria tal como especies de Staphylococcus). Los procedimientos de la presente invención son útiles para conferir inmunidad profiláctica y/o terapéutica a un sujeto. Los procedimientos de la presente invención pueden también ponerse en práctica en sujetos para aplicaciones de investigación biomédica.

Las expresiones "vacuna" o "composición de vacuna", que se usan de forma intercambiable, se refieren a composiciones farmacéuticas que comprenden al menos una composición inmunogénica que induce una respuesta inmunitaria en un animal.

Descripción general La presente invención se refiere a composiciones inmunogénicas que comprenden al menos tres antígenos a partir de un organismo estafilocócico, por ejemplo, S. aureus. Los antígenos pueden aislarse a partir del organismo usando procedimientos de aislamiento bioquímicos, o éstos pueden producirse de forma sintética o por medios recombinantes. Los antígenos pueden ser polipéptidos, o polisacáridos, o una combinación de los mismos. Estas composiciones inmunogénicas pueden usarse en la fabricación de una vacuna para inmunizar sujetos frente a infecciones causadas por un organismo estafilocócico. Los componentes adecuados para su uso en estas composiciones se describen en mayor detalle a continuación.

Composiciones inmunogénicas estafilocócicas S. aureus es el agente causante de una amplia variedad de enfermedades humanas variando de infecciones superficial de la piel a afecciones potencialmente mortales tal como neumonía, septicemia y endocarditis. Véase Lowy N. Eng. J. Med. 339:580 a 532(1998). En cases de enfermedad invasiva, S. aureus puede aislarse a partir de los sitios del organismo normalmente estériles incluyendo sangre, líquido cefalorraquídeo LCR, fluido pleural, fluido pericárdico, fluido pe toneal, fluido articular/sinovial, hueso, sitio interno del organismo (ganglio linfático, cerebro, corazón, hígado, bazo, fluido vitreo, riñon, páncreas, ovario), u otros sitios normalmente estériles. Esto puede conducir a afecciones clínicas potencialmente mortales tal como bacteriemia, neumonía, celulitis, osteomielitis, endocarditis, y choque septicémico. La mayoría de adultos, ancianos y pacientes de pediatría corre riesgo de infecciones por S. aureus.

Las realizaciones de la presente invención describen antígenos seleccionados en composiciones inmunogénicas incluyendo un polipéptido de factor de aglutinación A (CIfA) de S. aureus aislado, un polisacárido capsular de S. aureus aislado de tipo 5 conjugado con una proteína de portador, un polisacárido capsular de S. aureus aislado de tipo 8 conjugado con una proteína de portador, un factor de aglutinación B (CIfB) de S. aureus aislado, y proteína MntC de S. aureus recombinante. A continuación, los antígenos se caracterizaron en composiciones inmunogénicas como una serie de combinaciones, para mostrar que unas combinaciones específicas proporcionan respuestas inmunitarias que pueden ser superiores a las que se producen usando componentes individuales para composiciones inmunogénicas. Por consiguiente, una combinación proporciona una composición inmunogénica que comprende: un polipéptido de factor de aglutinación A (CIfA) de S. aureus aislado, un polisacárido capsular de S. aureus aislado de tipo 5 conjugado con una proteína de portador, y un polisacárido capsular de S. aureus aislado de tipo 8 conjugado con una proteína de portador. Una segunda combinación proporciona una composición inmunogénica que comprende: un polipéptido de factor de aglutinación A (CIfA) de S. aureus aislado, un factor de aglutinación B (CIfB) de S. aureus aislado, polisacárido capsular de S. aureus aislado de tipo 5 conjugado con una proteína de portador, y un polisacárido capsular de S. aureus aislado de tipo 8 conjugado con una proteína de portador. Una tercera combinación proporciona una composición inmunogénica que comprende: un polipéptido de factor de aglutinación A (CIfA) de S. aureus aislado, un polipéptido de factor de aglutinación B (CIfB) de S. aureus aislado, una proteína MntC de S. aureus aislada, un polisacárido capsular de S. aureus aislado de tipo 5 conjugado con una proteína de portador, y un polisacárido capsular de S. aureus aislado de tipo 8 conjugado con una proteína de portador. Una cuarta combinación proporciona una composición inmunogénica que comprende: un polipéptido de factor de aglutinación A (ClfA) de S. aureus aislado, una proteína MntC de S. aureus aislada, un polisacárido capsular de S. aureus aislado de tipo 5 conjugado con una proteína de portador, y un polisacárido capsular de S. aureus aislado de tipo 8 conjugado con una proteína de portador. Una quinta combinación proporciona una composición inmunogénica que comprende: un polipéptido de factor de aglutinación B (CIfB) de S. aureus aislado, un polisacárido capsular de S. aureus aislado de tipo 5 conjugado con una proteína de portador, y un polisacárido capsular de S. aureus aislado de tipo 8 conjugado con una proteína de portador. Una sexta combinación proporciona una composición inmunogénica que comprende: un polipéptido de factor de aglutinación B (CIfB) de S. aureus aislado, una proteína MntC de S. aureus aislada, un polisacárido capsular de S. aureus aislado de tipo 5 conjugado con una proteína de portador, y un polisacárido capsular de S. aureus aislado de tipo 8 conjugado con una proteína de portador. Una séptima combinación proporciona una composición inmunogénica que comprende: una proteína MntC de S. aureus aislada, un polisacárido capsular de S. aureus aislado de tipo 5 conjugado con una proteína de portador, y un polisacárido capsular de S. aureus aislado de tipo 8 conjugado con una proteína de portador. Una octava combinación proporciona una composición inmunogénica que comprende: un polipéptido de factor de aglutinación A (ClfA) de S. aureus aislado, un polipéptido de factor de aglutinación B (ClfB) de S. aureus aislado, y una proteína MntC de S. aureus aislada. En algunas realizaciones, las combinaciones anteriores comprenden además al menos uno de los siguientes antígenos: EkeS, DsqA, KesK, KrkN, KrkN2, RkaS, RrkN, KnkA, SdrC, SdrD, SdrE, Opp3a, DltD, HtsA, LtaS, IsdA, IsdB, IsdC, SdrF, SdrG, SdrH, SrtA, SpA, Sbi alfa-hemolisina (hla), beta-hemolisina, proteína A de unión a fibronectina (fnbA), proteína B de unión a fibronectina (fnbB), coagulasa, Fig, map, leucocidina Panton-Valentine (pvl), alfa-toxina y sus variantes, gamma-toxina (hlg) y variantes, ica, transportador ABC ¡nmunodominante, transportador Mg2+, transportador ABC de Ni, RAP, autolisina, receptores de laminina, IsaA/PisA, IsaB/PisB, SPOIIIE, SsaA, EbpS, Sas A, SasF, SasH, EFB (FIB), SBI, Npase, EBP, sialoproteína II de unión a hueso, precursor de aureolisina (AUR)/Sepp1 , Cna, y fragmentos de los mismas tal como M55, TSST-1 , mecA, poli-N-acetilglucosamina (PNAG/dPNAG) exopolisacárido, GehD, EbhA, EbhB, SSP-1 , SSP-2, HBP, proteína de unión a vitronectina, HarA, EsxA, EsxB, Enterotoxina A, Enterotoxina B, Enterotoxina C1 , y autolisina novedosa.

Estudios epidemiológicos de brotes de S. aureus indican que la evolución de S. aureus es clonal por naturaleza, en la que un único clon que ha adquirido un genotipo satisfactorio se ha propagado con rapidez y ha dado lugar a muchas de las infecciones. Por lo tanto, se considera que la evolución es clonal. El genoma bacteriano está compuesto por un más grande genoma del núcleo de la especie más estable y un conjunto más diversificado de genes auxiliares. Véase Feil y col., Nature Reviews: Microbiology 2:483 a 495 (2004). Los genes del núcleo están presentes de forma ubicua en todos los clones de las especies, y los genes auxiliares no están presentes necesariamente en cualquier clon dado. Considerando S. aureus, un estudio usando una micromatriz de ADN que representa más de 90 un % del genoma de S. aureus encontró que un 78 % de los genes en el genoma era común a todos los S. aureus representando de este modo el "núcleo de la especie", y el 22 % restante son los "genes auxiliares". Los genes auxiliares comprenden un material genético prescindible, gran parte del cual codifica para factores de virulencia, resistencia a antibióticos mediada por proteínas y genes que codifican para proteínas específicas para interactuar con un entorno de huésped particular. Véase Fitzgerald y col., PNAS 98:8821 a 8826 (2001 ); Feil y col., Nature Reviews: Microbiology 2:483 a 495 (2004). En general, los genes del núcleo están evolucionando más lentamente y los genes auxiliares son polimórficos. Véase Kuhn y col., J. Bact. 188:169 a 178 (2006). Por lo tanto, unos genes del núcleo seleccionados apropiadamente proporcionan unos antígenos diana mejores para su uso en composiciones ¡nmunogénicas para evitar infecciones.

Antígenos expresados en superficie a partir de aislados causantes de enfermedades o tipos clónales de S. aureus ofrecen una fuente de antígenos capaz de inducir inmunidad y anticuerpos funcionales. En el nivel macromolecular (secuencia o bien de aminoácido o bien de polisacárido), formas conservadas del antígeno expresadas mediante los diferentes aislados de enfermedad pueden elegirse para permitir una amplia reactividad cruzada de anticuerpos a aquellas cepas que pueden presentar variaciones antigénicas de la vacuna diana.

Una consideración importante para incluir un antígeno en las composiciones inmunogénicas multiantígeno que se describen en el presente documento es si el antígeno ha mostrado eficacia cuando se administra como una composición inmunogénica proporcionando protección en uno o más modelos animales de infección bacteriana. Hay numerosos modelos animales para varias enfermedades por S. aureus. Cada uno de estos modelos tiene putos fuertes y débiles.

El aclaramiento humano de infecciones bacterianas puede proceder a través de destrucción opsónica que está mediada después de la captación por fagocitos. Hay muchos ejemplos convincentes de esto a partir de estudios que usan antígenos de polisacárido Gram positivos, tal como polisacárido capsular Streptococcus pneumoniae y polisacárido capsular de S. aureus. Véase Lee y col., Crit. Rev. Micro. 29:333 a 349 (2003). Hay menos evidencia de actividad opsónica que se induce mediante antígenos proteicos Gram positivos. La captación por fagocitos se ha observado, pero la destrucción directa ha resultado más difícil de mostrar. Se ha mostrado que los anticuerpos monoclonales frente a proteínas confieren protección frente a exposición de S. aureus en modelos animales de infección; y mecanismos diferentes de destrucción opsonofagocítica puede tener en cuenta la protección observada.

La inducción de anticuerpos que tiene una actividad funcional medible, tal como actividad opsonofagocítica (OPA) es un indicador de si un antígeno particular es útil para la inclusión en las composiciones inmunogénicas de la presente invención. Otros indicadores incluyen pero sin limitarse a expresión de antígeno en la superficie celular durante la expresión in vivo tal como se mide usando anticuerpos específicos de antígeno o la capacidad de los anticuerpos para inhibir/neutralizar función antigénica.

Especies/ cepas El tipo de cualquier particular hospital o cepa de enfermedad es útil para determinar el origen, el grado de relación clonal y la supervisión de la epidemiología de los brotes. Numerosos procedimientos están disponibles para el timado de cepas de S. aureus. La definición práctica clásica para una especie bacteriana es un grupo de cepas que se caracterizan por mas de un 70 % de hibridizacion genómica (hibridizacion genómica ADN-ADN de DDH) y más de un 97 % de identidad de secuencia de gen de ARN ribosómico 16S. Véase Vandamme y col., Microbiol. Rev. 60:407 a 438 (1996). El tipado bacteriófago (BT) es un procedimiento de tipado de cepas de S. aureus en base a su susceptibilidad a lisis por ciertos tipos de fago. Véase Blair y col., Bull. W.H.O. 24:771 a 784 (1961). Este procedimiento antiguo adolece de una falta de reproducibilidad entre laboratorios y un fallo de un 15 a un 20 % al tipar aislados.

Composiciones inmunogénicas de antígeno único frente a multiantígeno Surge la pregunta de si la composición inmunogénica óptima para proteger frente a una infección de las cepas de S. aureus predominantes debería de estar compuesta por un único componente o múltiples componentes. Numerosos estudios han mostrado que unas composiciones inmunogénicas en base a una única proteína o componente de carbohidrato puede ofrecer alguna protección frente a exposición a una cepa de S. aureus que expresa ese componente en ciertos modelos animales. Es importante destacar que, se ha mostrado también que la protección frente a un único antígeno puede depender de la cepa seleccionada.

Se han investigado proteínas de superficie, tal como adhesinas, como vacunas de único componente. Por ejemplo, ratones inmunizados con ClfA de S. aureus desarrollaron una artritis menos severa que los ratones con una proteína de control. Véase Josefsson y col., J. Infect. Dis. 184:1572 a 1580 (2001). Fragmentos de la adhesina de unión a colágeno (cna) ofrecieron protección en un modelo de septicemia de ratón. Véase Nilsson, y col., J. Clin. Invest., 101 :2640 a 2649 (1998). La inmunización de ratones con el dominio A de ClfB podría reducir la colonización nasal en un modelo de ratón. Véase Schaffer y col., Infect. Immun. 74:2145 a 2153 (2006).

Una de las catorce proteínas de secuestro de hierro de S. aureus conocidas como IsdB se está investigando en una formulación inmunogénica monovalente para protección frente a infección por S. aureus.

Esta proteína ha mostrado un buen efecto de protección en ratones y una buena inmunogenicidad en primates no humanos. Véase Kuklin y col., Infect. Immun. 74:2215 a 2223 (2006).

Debido al vasto potencial de S. aureus para evolucionar o sustituir a diferentes proteínas para realizar las msimas o similares funciones, la formulación inmunogénica óptima para proteger la mayor cantidad de personas frente a la mayor cantidad de enfermedades por S. aureus es una formulación multiantígeno que comprende 2 o más (por ejemplo, 3, 4, 5, etc.) antígenos adecuadamente seleccionados y presentados en una formulación inmunogénica. En ciertas realizaciones, una composición inmunogénica de la invención comprende tres o más antígenos que se seleccionan de un polipéptido de factor de aglutinación A (ClfA) de S. aureus aislado, un polipéptido de factor de aglutinación B (ClfB) de S. aureus aislado, un polisacárido capsular de S. aureus aislado de tipo 5 (CP5) conjugado con una proteína de portador, un polisacárido capsular de S. aureus aislado de tipo 8 (CP8) conjugado con una proteína de portador y una proteína MntC de S. aureus aislada. En ciertas realizaciones, una composición inmunogénica de la invención comprende cuatro o más antígenos que se seleccionan de un polipéptido de factor de aglutinación A (ClfA) de S. aureus aislado, un polipéptido de factor de aglutinación B (ClfB) de S. aureus aislado, un polisacárido capsular de S. aureus aislado de tipo 5 (CP5) conjugado con una proteína de portador, un polisacárido capsular de S. aureus aislado de tipo 8 (CP8) conjugado con una proteína de portador y una proteína MntC de S. aureus aislada. En ciertas realizaciones, una composición inmunogénica de la invención comprende un polipéptido de factor de aglutinación A (ClfA) de S. aureus aislado, un polipéptido de factor de aglutinación B (ClfB) de S. aureus aislado, un polisacárido capsular de S. aureus aislado de tipo 5 (CP5) conjugado con una proteína de portador, un polisacárido capsular de S. aureus aislado de tipo 8 (CP8) conjugado con una proteína de portador y una proteína MntC de S. aureus aislada como antígenos.

Adyuvantes Composiciones inmunogénicas tal como se describe en el presente documento también comprenden, en ciertas realizaciones, uno o más adyuvantes. Un adyuvante es una sustancia que aumenta la respuesta inmunitaria cuando se administra junto con un inmunógeno o antígeno. Se ha mostrado que un número de citocinas o linfocinas tienen una actividad de modulación inmunitaria, y por lo tanto son útiles como adyuvantes, incluyendo, pero sin limitarse a, las interleucinas 1-a, 1-ß, 2, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 12 (véase, por ejemplo, la patente de los Estados Unidos con n.° 5.723.127), 13, 14, 15, 16, 17 y 18 (y sus formas mutantes); los interferones-a, ß y y; factor de estimulación de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-LCR) (véase, por ejemplo, la patente de los Estados Unidos con n.° 5.078.996 y número de Registro de ATCC 39900); factor de estimulación de colonias de macrófagos (M-LCR); factor de estimulación de colonias de granulocitos (G-LCR); y los factores de necrosis tumoral a y ß. Aún otros adyuvantes que son útiles con las composiciones inmunogénicas que se describen en el presente documento incluyen quimiocinas, incluyendo sin limitación, MCP-1 , ??-1a, ???-1 ß, y RANTES; moléculas de adhesión, tal como una selectina, por ejemplo, L-selectina, P-selectina y E-selectina; moléculas de tipo mucina, por ejemplo, CD34, GlycAM-1 y MadCA -1 ; un miembro de la familia de las integrinas tal como LFA-1 , VLA-1 , Mac-1 y p150.95; un miembro de la superfamilia de las inmunoglobulinas tal como PECAM, ICAMs, por ejemplo, ICAM-1 , ICAM-2 y ICAM-3, CD2 y LFA-3; moléculas coestimuladoras tal como B7-1 , B7-2.CD40 y CD40L; factores de crecimiento incluyendo el factor de crecimiento vascular, factor de crecimiento nervioso, factor de crecimiento de fibroblastos, factor de crecimiento epidérmico, PDGF, BL-1 , y factor de crecimiento endotelial vascular; moléculas de receptor incluyendo Fas, receptor de TNF, Flt, Apo-1 , p55, WSL-1 , DR3, TRAMP, Apo-3, AIR, LARD, NGRF, DR4, DR5, KILLER, TRAIL-R2, TRICK2, y DR6; y caspasa (ICE).

Adyuvantes adecuados que se usan para aumentar una respuesta inmunitaria incluyen adicionalmente, sin limitación, MPL™ (lípido monofosforílico 3-O-desacilado A, Corixa, Hamilton, MT), que se describe en la patente de los Estados Unidos con n.° 4.912.094. También son adecuados para su uso como adyuvantes, análogos de lípido A de síntesis o compuestos de fosfato de aminoalquilglucosamina (AGP), o derivados o análogos de los mismos, que están disponibles a través de Corixa (Hamilton, MT), y que se describen en la patente de los los Estados Unidos con n.° 6.1 13.918. Un AGP de este tipo es 2-[(R)-3-tetradecanoiloxi-tetradecanoil-amino] etil 2-desoxi-4-0- fosfono-3-0-[(R)-3-tetra-decano¡oxi-tetradecanoil]-2-[(R)-3-tetradecano¡lox¡-tetradecanoil-amino]-b-D-glucopiranósido, que se conoce también como 529 (anteriormente conocido como RC529). Este adyuvante 529 se formula como una forma acuosa (AF) o como una emulsión estable (SE).

Aún otros adyuvantes incluyen péptidos de muramilo, tal como N-acetil-muramil-L-treonil-D-isoglutamina (thr-MDP), N-acetil-normuramil-L-alanina-2-(1'-2' dipalmitoil-sn-glicero-3-hidroxi-fosforil-oxi)-etilamina (MTP-PE); emulsiones de aceite en agua, tal como MF59 (patente de los Estados Unidos con n.° 6.299.884) (que contiene un 5 % de escualeno, un 0.5 % de polysorbate 80, y un 0.5 % de Span 85 (que opcionalmente contiene varias cantidades de MTP-PE) que se formulan para dar partículas submicrométricas usando un microfluidizador tal como el microfluidizador Modelo 1 10Y (Microfluidics, Newton, MA)), y SAF (que contiene un 10 % de escualeno, un 0.4 % de polysorbate 80, un 5 % de polímero L121 bloqueado con Pluronic, y thr-MDP, o bien microfluidizado para dar una emulsión submicrométrica o bien mediante agitación con vértex para generar una emulsión de tamaño de partícula más grande); adyuvante de Freund incompleto (IFA); sales de aluminio (alumbre), tal como hidróxido de aluminio, fosfato de aluminio, sulfato de aluminio; Amphigen; Avridine; L121/escualeno; D-lactida-polilactida/glicósido; polioles de Pluronic; Bordetella inactivada; saponinas, tal como Stimulon™ QS-21 (Antigenics, Framingham, MA.), que se describen en la patente de los Estados Unidos con n.° 5.057.540, ISCOMATRIX (CSL Limited, Parkville, Australia), que se describe en la patente de los Estados Unidos con n.° 5.254.339, y complejos inmunoestimulantes (ISCOMATRIX); tuberculosis por Mycobacterium; lipopolisacáridos bacterianos; polinucleótidos de síntesis tales como oligonucleótidos con contenido en un motivo de CpG (por ejemplo, la patente de los Estados Unidos con n.° 6.207.646); IC-31 (Intercell AG, Viena, Austria), que se describe en European patente n.os 1.296.713 y 1.326.634; una toxina de tos ferina (PT) o una muíante de la misma, una toxina de cólera o una muíante de la misma (por ejemplo, las patenles de los Esíados Unidos con n.os 7.285.281 , 7.332.174, 7.361.355 y 7.384.640); o an E. coli heat-labile toxina (LT) o una muíante de la misma, en particular LT-K63, LT-R72 (por ejemplo, las patenles de los Estados Unidos con n.os 6.149.919, 7.1 15.730 y 7.291.588).

Anííqenos candidaíos CIfA: Organización de dominio El factor de aglutinación A (CIfA) es una proteína de superficie de S. aureus asociada con la unión a proteínas de malriz de huésped a íravés de un siíio de unión a fibrinógeno. CIfA es un miembro de una familia de proteínas con contenido en el moíivo LPXTG (SEQ ID NO: 125) de carboxilo íerminal que permite que la proteína se enlace covalentemente con la superficie celular. CIfA también pertenece a otra familia de proteínas (Componentes superficiales microbianos que reconocen las moléculas adhesivas de la matriz, o MSCRAMM) que se asocian con las proíeínas de huésped de unión tal como fibrinógeno (unido mediante ClfA), las proteínas de unión a fibronectina (FnbA y FnbB), la proteína de unión a colágeno (Cna) y otras. Todas estas proteínas comparten la secuencia señal de amino terminal que media el transporte a la superficie celular. Las MSCRAMM también incluyen un dominio A que es la región funcional con contenido en el sitio activo para unión a ligandos (por ejemplo, fibrinógeno, fibronectina, elastina, queratina). El dominio A va seguido por una región que está compuesta por repeticiones de serina-aspartato (repetición de SD), que se piensa que abarca la capa de peptidoglicano. La repetición de SD va seguida por una región de extensión de membrana que incluye el motivo LPXTG (SEQ ID NO: 125) para enlace covalente de la proteína a peptidoglicano. ClfA se describe en la patente de los Estados Unidos con n.° 6.008.341.

La región de unión a ligandos de ClfA que comprende N1 N2N3 del dominio A (figura 1 ) abarca los aminoácidos 40 a 559. Los dominios N de ClfA se han asignado tal como sigue: N1 engloba los residuos 45 a 220; N2 engloba los residuos 229 a 369; y N3 engloba los residuos 370 a 559. Véase Deivanayagam y col. EMBO J. 21 :6660 a 6672 (2002). Para facilidad de referencia puede hacerse referencia a los dominios de N1 N2N3 como N123, de forma similar puede hacerse referencia a N2N3 como N23. En preparaciones de N1 N2N3 recombinante, se ha encontrado que el dominio de N1 es sensible a proteasa y se escinde o hidroliza fácilmente para dejar el N2N3 como un fragmento recombinante de unión a ligandos estable. Véase Deivanayagam y col. EMBO J. 21 :6660 a 6672 (2002). La estructura de cristal del fragmento de N2N3 de unión a fibrinógeno de dominio A de CIfA, reveló que tanto N2 como N3 están dominados mediante cadenas beta antiparalelas. Además de las cadenas beta antiparalelas, el dominio de N2 contiene una hélice alfa de vuelta única y dos hélices 310 y el dominio de N3 contiene tres hélices 310. Véase Deivanayagam y col. EMBO J. 21 :6660 a 6672 (2002). El alineamiento de secuencia de N2 y N3 revela sólo un 13 % de identidad de secuencia y un 36 % de similitud de secuencia a lo largo de sus longitudes. Véase Deivanayagam y col. EMBO J. 21 :6660 a 6672 (2002). La topología de los dominios de N2 y de N3 es similar al clásico pliegue de IgG y se ha propuesto que sean variantes novedosas del pliegue de IgG. Véase Deivanayagam y col. EMBO J. 21 :6660 a 6672 (2002).

Secuencia de CIfA El gen para la proteína de factor de aglutinación A, designada CIfA, se ha clonado, secuenciado y analizado en detalle a nivel molecular (McDevitt y col., Mol. Microbiol. 1 1 : 237 a 248 (1994); McDevitt y col., Mol. Microbiol. 16:895 a 907 (1995)). Los identificadores de secuencia para las secuencias de aminoácidos de CIfA a partir de 1 1 1 aislados causantes de enfermedades de S. aureus se muestran en el cuadro 10. La secuencia de aminoácidos de la longitud total del CIfA silvestre (incluyendo la secuencia señal) a partir de la cepa de S. aureus PFESA0237, se muestra en el SEQ ID NO: 130. Esta secuencia muestra una tirosina en la posición 338, que se cambia a una alanina en la forma mutada de CIfA. La longitud total del gen que codifica el CIfA silvestre a partir de la cepa de S. aureus PFESA0237, que comprende la región de N123, la región de repetición y la región de anclaje se muestra en el SEQ ID NO: 131. La secuencia de aminoácidos de las formas mutadas de Y338A de CIfA se muestran en el SEQ ID NO: 123. No obstante, ha de observarse que el cambio de una tirosina a una alanina, que tiene lugar en el CIfA silvestre en la posición 338 de SEQ ID NO: 130, y que se designa como Y338A, se muestra en la forma mutada de CIfA, en el SEQ ID NO: 123 en la posición 310. Además, la forma mutada de CIfA que se muestra en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 123 es la forma adulta de CIfA sin la secuencia señal, teniendo en cuenta de este modo la diferencia en cuanto a la posición de esta mutación entre el SEQ ID NO: 130 y el SEQ ID NO: 123.

ClfB: Organización de dominio ClfB es una proteína de S. aureus que tiene actividad de unión a fibrinógeno y desencadena que S. aureus forme grupos en presencia de plasma. ClfB es una proteína de MSCRAMM y muestra la organización de dominio de MSCRAMM característica incluyendo un dominio A que es la región funcional con contenido en el sitio activo para unión a ligandos (por ejemplo, fibrinógeno, fibronectina, elastina, queratina). El dominio A va seguido por una región que está compuesta por repeticiones de serina-aspartato (repetición de SD), que se piensa que abarca la capa de peptidoglicano. La repetición de SD va seguida por una región de extensión de membrana que incluye el motivo LPXTG (SEQ ID NO: 125) para enlace covalente de la proteína a peptidoglicano. CIfB se describe en el documento WO 99/27109 y en la patente de los Estados Unidos 6.680.195.

The internal organización de CIfB N-terminal dominio A es very similar organización como found en CIfA. El dominio A se compone de tres subdomains N1 , N2, y N3. La región de unión a ligandos de CIfB que comprende N1 N2N3 del dominio A (figura 1) abarca los aminoácidos 44 a 585. Para facilidad de referencia puede hacerse referencia a los dominios de N1 N2N3 como N123, de forma similar puede hacerse referencia a N2N3 como N23. Los dominios N de CIfB se han asignado tal como sigue: N1 engloba los residuos 44 a 197; N2 engloba los residuos 198 a 375; y N3 engloba los residuos 375 a 585. En CIfA, se encontró que la estructura de cristal del dominio A tiene una única versión del pliegue de inmunoglobulina y por analogía puede especularse que el caso para CIfB es el mismo. Véase Deivanayagam y col., EMBO J. 21 :6660 a 6672 (2002). Incluso a pesar de que la organización de los dominios A de CIfB y CIfA es similar, la identidad de secuencia es sólo de un 26 %. Véase Ni Eidhin y col., Mol. Microbiol. 30:245 a 257 (2002).

Secuencia de CIfB El gen que codifica CIfB se clasifica como un gen de adhesión de núcleo. Las secuencias de CIfB a partir de 92 cepas de S. aureus asociadas con múltiples estados de enfermedad se resumen en el cuadro 1 1. Secuencias adicionales se obtuvieron a partir de GenBank.

Otras MSCRAMM Otras MSCRAMM pueden considerarse para su uso en una composición inmunogénica de la presente invención. Por ejemplo, las proteínas de repetición de serina-aspartato (Sdr), SdrC, SdrD, y SdrE están relacionadas en secuencia primario y organización estructural con las proteínas de CIfA y ClfB y se encuentran en la superficie celular. Las proteínas SdrC, SdrD y SdrE son proteínas asociadas a la pared celular, que tienen una secuencia señal en el N-terminal y un motivo LPXTG (SEQ ID NO: 125), residuos con carga positiva y dominio hidrófobo en el C-terminal. Cada una también tiene una repetición de SD con contenido en región R de suficiente longitud para permitir, junto con los motivos B, una expresión eficiente de la región A de dominio de unión a ligandos en la superficie celular. Con la región A de las proteínas SdrC, SdrD y SdrE ubicadas en la superficie celular, las proteínas pueden interactuar con proteínas en plasma, la matriz extracelular o con moléculas en la superficie de las células huésped. Las proteínas Sdr comparten cierta similitud de secuencia de aminoácidos limitada con CIfA y ClfB. Como CIfA y ClfB, SdrC, SdrD y SdrE también exhiben una unión a ligandos dependiente de catión de las proteínas de matriz extracelular.

Los genes sdr están unidos muy próximamente y organizados en tándem. Las proteínas Sdr (de SdrC, SdrD, SdrE, CIfA, y ClfB) comprenden característicamente una región A en la que hay una secuencia de aminoácidos muy conservada que puede usarse para derivar un motivo TYTFTDYVD (SEQ ID NO: 126) de consenso. El motivo exhibe una ligera variación entre las diferentes proteínas. Esta variación, junto con la secuencia de consenso del motivo se describe en la patente de los Estados Unidos con número 6.680.195. En el proteínas Clf-Sdr, este motivo está muy conservado. El motivo puede usarse en composiciones inmunogénicas para impartir una inmunidad de amplio espectro frente a infecciones bacterianas, y también puede usarse como un antígeno en la producción de anticuerpos monoclonales o policlonales. Un anticuerpo de este tipo puede usarse para impartir una inmunidad pasiva de amplio espectro.

Las proteínas Sdr se diferencian de ClfA y ClfB en que tienen de dos a cinco secuencias repetidas de residuo (motivos B) adicionales 1 10 a 1 13 ubicadas entre la región A y la región R. Cada motivo B contiene un bucle de mano EF de unión de Ca2+ de consenso que se encuentra normalmente en las proteínas eucarióticas. Se mostró que La integridad estructural de una proteína recombinante que comprende las cinco repeticiones B de SdrD mediante análisis de fluorescencia bisANS dependía de Ca2+, lo que sugería que las manos EF son funcionales. Cuando se eliminó el Ca2+, la estructura se hundió a una conformación sin plegar. La estructura original se restauró mediante la adición de Ca2+. Los dominios de R de C-terminal de las proteínas Sdr contienen de 132 a 170 SD residuos. Éstos van seguidos de regiones de anclaje a pared conservadas características de muchas proteínas de superficie de bacterias Gram positivas.

En las proteínas Sdr y Clf, este motivo B está muy conservado mientras que una versión degenerada tiene lugar en MSCRAMM de unión a fibronectina, así como en la proteína de unión a colágeno Cna. Los motivos B, en conjunción con las regiones R, son necesarias para mostrar el dominio de unión a ligando a una cierta distancia con respecto a la superficie celular. Los motivos B repetidos son un denominador común del grupo secundario de las proteínas de repetición de SD que se describen en el presente documento. Estos motivos se encuentran en diferentes números en las tres proteínas Sdr a partir de la cepa PFESA0237. Hay unas distinciones claras entre los motivos B individuales. Las unidades más conservadas son las que se encuentra adyacentes a las regiones R (SdrC B2, SdrD B5 y SdrE B3). Éstas se diferencian del resto en varios sitios, especialmente en la mitad de C-terminal. Un detalle estructural digno de mención es que las repeticiones B adyacentes están siempre separados por un residuo de prolina presente en la región de C-terminal, pero una prolina nunca tiene lugar entre las últimas repeticiones B y la región R. En su lugar, este ligador se caracteriza por un tramo ácido corto. Estas diferencias son una evidencia de que las unidades de extremo tienen un papel estructural o funcional diferente en comparación con los otros motivos B. Los motivos B de N-terminal de SdrD y SdrE se han separado entre sí, y hay numerosas alteraciones de aminoácido, incluyendo pequeñas inserciones y deleciones mientras que el resto de motivos B internos están más altamente conservados. Obsérvese que cada una de las tres proteínas Sdr tiene al menos un motivo B de cada tipo.

Los dominios de R de C-terminal de las proteínas Sdr contienen de 132 a 170 SD residuos. Éstos van seguidos de regiones de anclaje a pared conservadas características de muchas proteínas de superficie de bacterias Gram positivas.

Otras moléculas de SdrD candidatas pueden derivarse a partir de varias especies de organismos para su uso en una composición inmunogénica de la invención, algunas de las cuales incluyen la siguiente SdrD a partir de S. aureus: cepa USA300 FPR3757 (número de registro de proteína SAUSA300 0547); cepa NCTC8325 (número de registro de proteína SAOUHSC 00545); cepa MW2 (número de registro de proteína MW0517); cepa MSSA476 (número de registro de proteína SAS0520; y cepa Mu50 (número de registro de proteína SAV0562).

MSCRAM adicionales que pueden considerarse para su uso en una composición inmunogénica de la presente invención incluyen EkeS, DsqA, KesK, KrkN, KrkN2, RkaS, RrkN, y KnkA. Estas MSCRAMM se describen en el documento WO 02/102829, que se incorpora por la presente por referencia. MSCRAMM adicionales, identificados mediante el n.° de Registro de GenBank, incluyen NP_373261.1 , NP_373371.1 , NP_374246.1 , NP_374248.1 , NP_374841.1 , NP_374866.1 , NP_375140.1 , NP_375614.1 , NP_375615.1 , NP_375707.1 , NP_375765.1 , y NP_375773.1.

Polisacáridos de cápsula de tipo 5 y tipo 8 Microorganismos estafilocócicos capaces de dar lugar a enfermedad invasiva en general también son capaces de producción de un polisacárido de cápsula (CP) que encapsula la bacteria y aumenta su resistencia a aclaramiento por el sistema inmunitario innato del huésped. El CP sirve para cubrir la célula bacteriana en una cápsula de protección que hace las bacterias resistentes a fagocitosis y a destrucción intracelular. Las bacterias carentes de una cápsula son más susceptibles de fagocitosis. Los polisacáridos capsulares son con frecuencia un importante factor de virulencia para muchos patógenos bacterianos, incluyendo Haemophilus influenzae, Streptococcus pneumoniae y streptococos del Grupo B.

El polisacárido de cápsula puede usarse para realizar un serotipado de una especie particular de bacterias. El tipado se lleva a cabo normalmente mediante reacción con un anticuerpo monoclonal o antisuero específico generado para una estructura específica o un único epítopo característico del polisacárido de cápsula. Las bacterias encapsuladas tienden a crecer en colonias lisas mientras que las colonias de bacterias que han perdido sus cápsulas aparecen rugosas. Las colonias que producen una aparición mucoide se conocen como Muy Encapsuladas. Tipos 1 y 2 de S. aureus son muy encapsuladas y están rara vez asociadas con enfermedad.

La mayoría de aislados clínicos de S. aureus son encapsuladas con los serotipos o bien 5 o bien 8. Los polisacáridos capsulares de tipo 5 (CP5) y de tipo 8 (CP8) tienen unidades de repetición de trisacárido similares compuestas por ácido N-acetil mannosaminurónico, N-acetil L-fucosamina, y N-acetil D-fucosamina. Véase Fournier, J.M. y col., Infect. Immun. 45:97 a 93 (1984) y Moreau, M., y col., Carbohidrate Res. 201 :285 a 297 (1990). Los dos CP, que tienen los mismos azúcares, pero que se diferencian en los enlaces de azúcar y en los sitios de O acetilación para producir unos patrones serológicamente diferentes de inmunoreactividad.

En algunas realizaciones, los polisacáridos capsulares de serotipo 5 y/o 8 de la invención son O-acetilados. En algunas realizaciones, el grado de O-acetilación de oligosacárido o polisacárido capsular de tipo 5 es de un 10 a un 100 %, de un 20 a un 100 %, de un 30 a un 100 %, de un 40 a un 100 %, de un 50 a un 100 %, de un 60 a un 100 %, de un 70 a un 100 %, de un 80 a un 100 %, de un 90 a un 100 %, 50- 90 %, de un 60 a un 90 %, de un 70 a un 90 % o de un 80 a un 90 %. En algunas realizaciones, el grado de O-acetilación de polisacárido capsular de tipo 8 u oligosacárido es de un 10 a un 100 %, de un 20 a un 100 %, de un 30 a un 100 %, de un 40 a un 100 %, de un 50 a un 100 %, de un 60 a un 100 %, de un 70 a un 100 %, de un 80 a un 100 %, de un 90 a un 100 %, de un 50 a un 90 %, de un 60 a un 90 %, de un 70 a un 90 % o de un 80 a un 90 %. En algunas realizaciones, el grado de O-acetilación de los oligosacáridos o polisacáridos capsulares de tipo 5 y tipo 8 es de un 10 a un 100 %, de un 20 a un 100 %, de un 30 a un 100 %, de un 40 a un 100 %, de un 50 a un 100 %, de un 60 a un 100 %, de un 70 a un 100 %, de un 80 a un 100 %, de un 90 a un 100 %, de un 50 a un 90 %, de un 60 a un 90 %, de un 70 a un 90 % o de un 80 a un 90 %.

El grado de O-acetilación del polisacárido u oligosacárido puede determinarse mediante cualquier procedimiento conocido en la técnica, por ejemplo, mediante una R N de protones (Lemercinier y Jones 1996, Carbohidrate Research 296; 83 a 96, Jones y Lemercinier 2002, J Pharmaceutical y Biomedical Analysis 30; 1233 a 1247, documentos WO 05/033148 o WO 00/56357). Otro procedimiento que se usa normalmente se describe por Hestrin (1949) J. Biol. Chem. 180; 249 a 261.

En algunas realizaciones, los polisacáridos capsulares de serotipo 5 y/o 8 de la invención se usan para generar unos anticuerpos que son funcionales tal como se mide por la destrucción de bacterias en un modelo de eficacia animal o un ensayo de destrucción opsonofagocítica que muestra que los anticuerpos destruyen las bacterias. Tal funcionalidad puede no observarse usando un ensayo que supervisa la generación de anticuerpos únicamente, lo que no es indicativo de la importancia de la O-acetilación en cuanto a la eficacia.

Epidemiología de Cápsula La asociación de serotipos de cápsula particulares con enfermedad es posible a través de la supervisión de aislados clínicos. De los ocho serotipos de S. aureus diferentes identificados (Karakawa y Vann (1982) sólo los serotipos 1 y 2 son muy encapsulados, y éstos rara vez están aislados. Véase Capsular Polysaccharides of Staphylococcus aureus, p. 285 a 293, En J. B. Robbins, J. C. Hill y J. C. Sadoff (ed.), Seminars in infectious disease, vol. 4, Bacterial Vaccines. Thieme Stratton, Inc. Nueva York). Los estudios han mostrado que aproximadamente de un 85 a un 90 % de los aislados clínicos de S. aureus expresan CP5 o CP8 (Arbeit RD, y col., Diagn. Microbiol. Infect. Dis. (1984) Apr;2(2):85 a 91 ; Karakawa WW, y col., J. Clin.

Microbio). (1985) Sep;22(3):445-7; Essawi T, y col., Trop. Med. Int. Health. (1998) Jul;3(7):576-83; Na'was T, y col., J. Clin. Microbiol. (1998) 36(2):414-20. La mayor parte de las cepas de CP5 y CP8 no tipables son genéticamente de tipo 5 o tipo 8 con contenido en mutaciones en locus de cap5/8 (Cocchiaro, Gómez y col., (2006), Mol. Microbiol. Feb. 59(3):948 a 960). La capsulación para algunas cepas se pierde con rapidez en unas pocas pasadas in vitro lo que se debe a un efecto represor de la alta concentración defosfato en los medios que se usan en diagnóstico clínico sobre la producción de cápsula. Se informó también de que aislados sin cápsula recuperan la expresión de cápsula tras pasar través de vacas. Véase Opdebeck, J.P. y col., J. Med. Microbiol. 19:275 a 278 (1985). Algunas cepas no tipables se hacen positivo de cápsula bajo unas condiciones de crecimiento apropiadas.

Estructura de CP5 y CP8 La unidad de repetición tanto de CP5 como de CP8 está compuesta por ácido 2-acetamido-2-desoxi-D-mannurónico, 2-acetamido-2-desoxi-L-fucosa y 2-acetamido-2-desoxi-D-fucosa. Véase C. Jones y col., Carbohidr. Res. 340:1097 a 1 106 (2005). A pesar de que CP5 y CP8 tienen la misma composición de azúcar, éstos han mostrado que son inmunológicamente distintos. Éstos se diferencian en los enlaces glicosídicos y en el sitio de O-acetilación del ácido urónico. Se observó una N-acetilación incompleta dependiente de cepa de uno de los residuos de FucNAc. Véase Tzianabos y col., PNAS V98: 9365(2001 ).

Polisacárido de cápsula de S. aureus en una composición inmunoqénica El peso molecular de los polisacáridos de cápsula de S. aureus es una consideración importante para su uso en composiciones inmunogénicas. Los polisacáridos de cápsula de alto peso molecular son capaces de inducir ciertas respuestas inmunitarias de anticuerpo debido a una valencia más alta de los epítopos presentes en la superficie antigénica. Los procedimientos que se describen en el presente documento prevén el aislamiento y la purificación de polisacárido de cápsula de tipo 5 y tipo 8 de mucho más alto peso molecular que los que estaban disponibles anteriormente.

Proteína de unión de saliva/MntC/SitC Proteína de unión de saliva/MntC/SitC es una proteína de transportador ABC y tiene homólogos en S. epidermidis y S. aureus. Se hace referencia a ésta en la presente invención como MntC. Esta proteína es una lipoproteina de 32 kDa y se encuentra en la pared de célula bacteriana. Véase Sellman y col., y Cockayne y col., Infect. Immun. 66: 3767(1998). En S. epidermidis, ésta es un componente de un operón regulado por hierro. Muestra una homología considerable con ambas adhesinas incluyendo FimA de S. parasanguis, y con lipoproteinas de una familia de transportadores ABC con unas funciones de transporte de hierro metálico probadas o putativas. (Véase el cuadro 12 para cepas de S. aureus y secuencias.) Proteína MntC de S. aureus El homólogo de S. aureus de MntC se conoce como proteína de unión de saliva y se dio a conocer en la patente de los Estados Unidos con n.° 5.801 .234 y puede incluirse en una composición inmunogénica de la invención. La secuencia de proteína para el homólogo de S. aureus de proteína de unión de saliva/MntC/SitC se encuentra en el número de registro de GenBank NP_371 155 para la cepa Mu50 (también se conoce como SAV0631 ). El identificador de secuencia es SEQ ID NO: 1 19. El número de registro para la secuencia de nucleótidos para el genoma completo de la cepa Mu50 es NC_002758.2 (coordenadas 704988-705917).

Proteína SitC de S. epidermidis El homólogo de S. epidermidis de proteína de unión de saliva/MntC/SitC se conoce como SitC y se dio a conocer en Sellman y col., (Sellman y col., Infecí. Immun. octubre de 2005; 73(10): 6591 a 6600). La secuencia de proteína para el homólogo de S. epidermidis de proteína de unión de saliva/MntC/SitC se encuentra en el número de registro de GenBank YP_187886.1 (también se conoce como SERP0290). El identificador de secuencia es SEQ ID NO: 121.

El número de registro para la secuencia de nucleótidos para el genoma completo de la cepa RP62A, es NC_002976 (coordenadas 293030-293959). Otras moléculas de SitC candidatas pueden derivarse a partir de varias especies de organismos para su uso en una composición inmunogénica de la invención, algunas de las cuales se enumeran en el cuadro 1 a continuación.

CUADRO 1 Proteína Especies Cepa de ejemplo Registro de proteína SitC S. haemolyticus JCSC1435 BAE03450.1 SitC S. epidermidis ATCC 12228 AAO04002.1 SitC S. saprophyticus ATCC 15305 BAE19233.1 SitC S. xylosus DSM20267 ABR57162.1 SitC S. carnosus TM300 CAL27186.1 Proteínas de unión a hierro de S. aureus Otro antígeno candidato potencial para considerarse para su uso en las composiciones inmunogénicas de la invención incluye el determinante B de superficie de hierro de proteína de superficie de S. aureus (IsdB). Esta MSCRAMM se describió por Mazmanian y col. (Mazmanian, SK y col. Proc. Nati. Acad. Sci., USA 99:2293 a 2298 (2002)) y se ha sometido a prueba posteriormente y se muestra eficaz como un candidato de vacuna en un modelo de infección murino y un estudio de inmunogenicidad de macaco Rhesus de Kuklin, y col. (Kuklin, NA, y col. Infection and Immunity, Vol. 74, n.° 4, 2215 a 2223, (2006)). Esta molécula de IsdB está presente en varias cepas de S. aureus, incluyendo la cepa MRSA252 (número de registro de proteína CAG40104.1 ); cepa Newman (número de registro de proteína BAF67312.1 ); cepa MSSA476 (número de registro de proteína CAG42837.1 ); cepa Mu3 (número de registro de proteína BAF78003.1); cepa RF122 (número de registro de proteína CAI80681.1).

Antígenos candidatos: Las composiciones inmunogénicas de la presente invención pueden incluir también uno o más de los siguientes antígenos: Opp3a, DltD, HtsA, LtaS, IsdA, IsdC, SdrF, SdrG, SdrH, SrtA, SpA, Sbi alfa-hemolisina (hla), beta-hemolisina, proteína A de unión a fibronectina (fnbA), proteína B de unión a fibronectina (fnbB), coagulasa, Fig, map, leucocidina Panton-Valentine (pvl), alfa-toxina y sus variantes, gamma-toxina (hlg) y variantes, ica, transportador ABC inmunodominante, transportador Mg2+, transportador ABC de Ni, RAP, autolisina, receptores de laminina, IsaA/PisA, IsaB/PisB, SPOIIIE, SsaA, EbpS, Sas A, SasF, SasH, EFB (FIB), SBI, Npase, EBP, sialoproteína II de unión a hueso, precursor de aureolisina (AUR)/Sepp1 , Cna, y fragmentos de los mismas tal como M55, TSST-1 , mecA, poli-N-acetilglucosamina (PNAG/dPNAG) exopolisacárido, GehD, EbhA, EbhB, SSP-1 , SSP-2, HBP, proteína de unión a vitronectina, HarA, EsxA, EsxB, Enterotoxina A, Enterotoxina B, Enterotoxina C1 , y autolisina novedosa. En ciertas realizaciones de la invención, cuando la composición inmunogénica comprende ciertas formas de CP5 y/o CP8, puede no comprender además PNAG.

Formulaciones de composición inmunogénica En una modalidad, las composiciones inmunogénicas de la invención comprenden además al menos uno de un adyuvante, un tampón, un crioprotector, una sal, un catión divalente, un detergente no iónico, un inhibidor de oxidación por radicales libres, un diluyente o un portador.

Las composiciones inmunogénicas de la invención pueden comprender además uno o más conservantes además de una pluralidad de antígenos proteicos estafilocócicos y conjugados de polisacárido capsular-proteína. La FDA requiere que los productos biológicos en viales de múltiples dosis (múltiples dosis) contengan un conservante, con sólo unas pocas excepciones. Los productos de vacuna con contenido en conservantes incluyen vacunas con contenido en cloruro de benzetonio (ántrax), 2-fenoxietanol (DTaP, HepA, Lyme, Polio (parenteral)), fenol (Pneumo, Typhoid (parenteral), Vaccinia) y timerosal (DTaP, DT, Td, HepB, Hib, Influenza, JE, Mening, Pneumo, Rabies). Conservantes aprobados para su uso en fármacos inyectables incluyen, por ejemplo, clorobutanol, m-cresol, metilparaben, propilparaben, 2-fenoxietanol, cloruro de benzetonio, cloruro de benzalconio, ácido benzoico, alcohol bencílico, fenol, timerosal y nitrato fenilmercúrico.

Las formulaciones de la invención pueden comprender además uno o más de un tampón, una sal, un catión divalente, un detergente no iónico, un crioprotector tal como un azúcar, y un antioxidante tal como un eliminador de radicales libres o agente quelante, o cualquier combinación múltiple de los mismos. La elección de un componente cualquiera, por ejemplo, un agente de quelación, puede determinar si es deseable otro componente (por ejemplo, un eliminador) o no. La composición final que se formula para la administración ha de ser estéril y/o libre de pirógenos. El experto puede determinar de forma empírica qué combinaciones de estos y otros componentes serán óptimas para la inclusión en las composiciones inmunogénicas con contenido en conservante de la invención, dependiendo de una variedad de factores tales como las condiciones de almacenamiento y de administración particulares que se requieren.

En ciertas realizaciones, una formulación de la invención que es compatible con la administración parenteral comprende uno o más tampones fisiológicamente aceptables que se seleccionan de, pero sin limitarse a, Tris (trimetamina), fosfato, acetato, borato, citrato, glicina, histidina y succinato. En ciertas realizaciones, la formulación está tamponada a dentro de un intervalo de pH de aproximadamente 6.0 a aproximadamente 9.0, preferentemente de aproximadamente 6.4 a aproximadamente 7.4.

En ciertas realizaciones, puede ser deseable ajustar el pH de la composición inmunogénica o formulación de la invención. El pH de una formulación de la invención puede ajustarse usando técnicas convencionales en la técnica. El pH de la formulación puede ajustarse para ser de entre 3.0 y 8.0. En ciertas realizaciones, el pH de la formulación puede ser, o puede ajustarse para ser, entre 3.0 y 6.0, 4.0 y 6.0, o 5.0 y 8.0. En otras realizaciones, el pH de la formulación puede ser, o puede ajustarse para ser, aproximadamente 3.0, aproximadamente 3.5, aproximadamente 4.0, aproximadamente 4.5, aproximadamente 5.0, aproximadamente 5.5, aproximadamente 5.8, aproximadamente 6.0, aproximadamente 6.5, aproximadamente 7.0, aproximadamente 7.5, o aproximadamente 8.0. En ciertas realizaciones, el pH puede ser, o puede ajustarse para ser, en un intervalo de 4.5 a 7.5, o de 4.5 a 6.5, de 5.0 a 5.4, de 5.4 a 5.5, de 5.5 a 5.6, de 5.6 a 5.7, de 5.7 a 5.8, de 5.8 a 5.9, de 5.9 a 6.0, de 6.0 a 6.1 , de 6.1 a 6.2, de 6.2 a 6.3, de 6.3 a 6.5, de 6.5 a 7.0, de 7.0 a 7.5 o de 7.5 a 8.0. En una modalidad específica, el pH de la formulación es de aproximadamente 5.8.

En ciertas realizaciones, una formulación de la invención que es compatible con la administración parenteral comprende uno o más cationes divalentes, incluyendo pero sin limitarse a, MgCI2, CaCI2 y MnCI2, a una concentración variando de aproximadamente 0.1 mM a aproximadamente 10 mM, prefiriéndose con hasta aproximadamente 5 mM.

En ciertas realizaciones, una formulación de la invención que es compatible con la administración parenteral comprende una o más sales, incluyendo pero sin limitarse a, cloruro de sodio, cloruro de potasio, sulfato de sodio, y sulfato de potasio, presentes a una fuerza iónica que es fisiológicamente aceptable por el sujeto tras la administración parenteral e incluidas a una concentración final para producir una fuerza iónica u osmolaridad seleccionadas en la formulación final. La fuerza iónica u osmolalidad finales de la formulación se determinará por múltiples componentes (por ejemplo, iones de compuesto(s) de tamponamiento y otras sales de no tamponamiento. Una sal preferida, NaCI, está presente desde un intervalo de hasta aproximadamente 250 mM, seleccionándose las concentraciones de sal para complementar otros componentes (por ejemplo, azúcares) de tal modo que la osmolaridad total final de la formulación es compatible con la administración parenteral (por ejemplo, inyección intramuscular o subcutánea) y promoverá la estabilidad a largo plazo de los componentes inmunogénicos de la formulación de composición inmunogénica a lo largo de varios intervalos de temperatura. Formulaciones libres de sal tolerarán intervalos aumentados del uno o más crioprotectores seleccionados para mantener los niveles de osmolaridad finales deseados.

En ciertas realizaciones, una formulación de la invención que es compatible con la administración parenteral comprende uno o más crioprotectores que se seleccionan de, pero sin limitarse a, disacáridos (por ejemplo, lactosa, maltosa, sacarosa o trehalosa) y polihidroxi-hidrocarburos (por ejemplo, dulcitol, glicerol, manitol y sorbitol).

En ciertas realizaciones, la osmolaridad de la formulación está en un intervalo de aproximadamente 200 mOs/L a aproximadamente 800 mOs/L, con un intervalo preferido de aproximadamente 250 mOs/L a aproximadamente 500 mOs/L, o aproximadamente 300 mOs/L a aproximadamente 400 mOs/L. Una formulación libre de sal puede contener, por ejemplo, de aproximadamente un 5 % a aproximadamente un 25 % de sacarosa, y preferentemente de aproximadamente un 7 % a aproximadamente un 15 %, o aproximadamente un 10 % a aproximadamente un 12 % de sacarosa. Alternativamente, una formulación libre de sal puede contener, por ejemplo, de aproximadamente un 3 % a aproximadamente un 12 % de sorbitol, y preferentemente de aproximadamente un 4 % a un 7 %, o aproximadamente un 5 % a aproximadamente un 6 % de sorbitol. Si se añade una sal tal como cloruro de sodio, a continuación el intervalo eficaz de sacarosa o sorbitol se reduce relativamente. Estas y otras consideraciones tales como la osmolalidad y la osmolaridad se conocen bien en la técnica.

En ciertas realizaciones, una formulación de la invención que es compatible con la administración parenteral comprende uno o más inhibidores de la oxidación por radicales libres y/o agentes quelantes. Una variedad de eliminadores de radicales libres y agentes de quelación se conocen en la técnica y se aplican a las formulaciones y los procedimientos de uso que se describen en el presente documento. Los ejemplos incluyen pero no se limitan a etanol, EDTA, una combinación de EDTA/etanol, trietanolamina, manitol, histidina, glicerol, citrato de sodio, hexafosfato de inositol, tripolifosfato, ácido ascórbico/ascorbato, ácido succínico/succinato, ácido málico/maleato, desferal, EDDHA y DTPA, y varias combinaciones de dos o más de los anteriores. En ciertas realizaciones, al menos puede añadirse un eliminador de radicales libres no reductor a una concentración que aumenta eficazmente la estabilidad a largo plazo de la formulación. También puede añadirse uno o más inhibidores de la oxidación por radicales libres/agentes de quelación en varias combinaciones, tal como un eliminador y un catión divalente. La elección de agente de quelación determinará si es necesaria o no la adición de un eliminador.

En ciertas realizaciones, una formulación de la invención que es compatible con la administración parenteral comprende uno o más tensioactivos iónicos, incluyendo pero sin limitarse a, ésteres de ácido graso de polioxietileno sorbitano, Polysorbate-80 (Tween 80), Polysorbate-60 (Tween 60), Polysorbate-40 (Tween 40) y Polysorbate-20 (Tween 20), polioxietileno-alquil éteres, incluyendo pero sin limitarse a, Brij 58, Brij 35, así como otros tales como Tritón X- 00; Tritón X-1 14, NP40, Span 85 y la serie de tensioactivos no iónicos de Pluronic (por ejemplo, Pluronic 121 ), con componentes preferidos Polysorbate-80 a una concentración de aproximadamente un 0.001 % a aproximadamente un 2 % (prefiriéndose hasta aproximadamente un 0.25 %) o Polysorbate-40 a una concentración de aproximadamente de un 0.001 % a un 1 % (prefiriéndose hasta aproximadamente un 0.5 %).

En ciertas realizaciones, una formulación de la invención comprende uno o más agentes de estabilización adicionales adecuados para su administración parenteral, por ejemplo, un agente reductor que comprende al menos un grupo tiol (-SH) (por ejemplo, cisteína, N-acetilcisteina, glutatión reducido, tioglicolato de sodio, tiosulfato, monotioglicerol, o mezclas de los mismos). Alternativa u opcionalmente, las formulaciones de composición inmunogénica que contienen conservante de la invención pueden estabilizarse adicionalmente eliminando el oxígeno de los recipientes de almacenamiento, protegiendo a la formulación de la luz (por ejemplo, usando recipientes de vidrio de color ámbar).

Las formulaciones de composición inmunogénica que contienen conservante de la invención pueden comprender uno o más portadores o excipientes farmacéuticamente aceptables, lo que incluye cualquier excipiente que no induce por sí mismo una respuesta inmunitaria. Los excipientes adecuados incluyen pero no se limitan a macromoléculas tal como proteínas, sacáridos, poli(ácidos lácticos), poli(ácidos glicólicos), aminoácidos poliméricos, copolímeros de aminoácidos, sacarosa (Paoletti y col, 2001 , Vaccine, 19:21 18), trehalosa, lactosa y agregados de lípidos (tales como gotas de aceite o liposomas). Tales portadores son bien conocidos por el experto. Excipientes farmacéuticamente aceptables se analizan, por ejemplo, en Gennaro, 2000, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20a edición, ISBN:0683306472.

Las composiciones de la invención pueden estar liofilizadas o en forma acuosa, es decir disoluciones o suspensiones. Las formulaciones líquidas pueden administrarse de forma ventajosa directamente a partir de su forma envasada y son por lo tanto ideales para inyección sin la necesidad de reconstitución en medio acuoso tal como se requiere de otro modo para composiciones liofilizadas de la invención.

La administración directa de composiciones inmunogénicas de la presente invención a un sujeto puede llevarse a cabo mediante la administración parenteral (por vía intramuscular, por vía intraperitoneal, por vía intradérmica, por vía subcutánea, por vía intravenosa, o en el espacio intersticial de un tejido); o mediante administración rectal, oral, vaginal, tópica, transdérmica, intranasal, ocular, auditiva, pulmonar u otra administración mucosa. En una modalidad preferida, la administración parenteral es mediante inyección intramuscular, por ejemplo, en el muslo o el brazo del sujeto. La inyección puede ser a través de una aguja (por ejemplo, una aguja hipodérmica), pero alternativamente puede usarse una inyección libre de aguja. Una dosis intramuscular típica es de 0.5 mi. Las composiciones de la invención pueden prepararse en varias formas, por ejemplo, para inyección o bien como disoluciones líquidas o bien como suspensiones. En ciertas realizaciones, la composición puede prepararse como un polvo o pulverización para su administración pulmonar, por ejemplo, en un inhalador. En otras realizaciones, la composición puede prepararse como un supositorio u óvulo vaginal, o para su administración nasal, auditiva u ocular, por ejemplo, como una pulverización, gotas, gel o polvo.

Envasado y Formas de dosificación Las composiciones inmunogénicas de la invención pueden envasarse forma de dosis unitaria o múltiples dosis (por ejemplo, 2 dosis, 4 dosis, o más). Para formas de múltiples dosis, habitualmente pero no necesariamente se prefieren los viales con respecto a las jeringuillas previamente cargadas. Los formatos de múltiples dosis adecuados incluyen pero no se limitan a: de 2 a 10 dosis por recipiente a 0.1 a 2 mi por dosis. En ciertas realizaciones, la dosis es una dosis de 0.5 mi. Véase, por ejemplo, la solicitud de patente internacional WO2007/127668, que se incorpora por referencia en el presente documento.

Las composiciones pueden presentarse en viales u otros recipientes de almacenamiento adecuados, o pueden presentarse en dispositivos de administración cargados previamente, por ejemplo, jeringuillas de un solo componente o múltiples componentes, que pueden suministrarse con o sin agujas. Una jeringuilla habitualmente, pero no necesariamente, contiene una dosis individual de la composición inmunogénica con contenido en conservante de la invención, a pesar de que también se prevén jeringuillas de múltiples dosis, cargadas previamente. De forma similar, un vial puede incluir una dosis individual pero alternativamente puede incluir múltiples dosis.

Los volúmenes de dosificación eficaces pueden establecerse de forma rutinaria, pero una dosis típica de la composición para inyección tiene un volumen de 0.5 mi. En ciertas realizaciones, la dosis se formula para la administración a un sujeto humano. En ciertas realizaciones, la dosis se formula para la administración a un sujeto humano adulto, joven, adolescente, niño o lactante (es decir, no más de un año de edad) y en realizaciones preferidas puede administrarse mediante inyección.

Las composiciones inmunogénicas líquidas de la invención son también adecuadas para reconstituir otras composiciones inmunogénicas que se presentan en forma liofilizada. Cuando una composición inmunogéníca va a usarse para tal reconstitución extemporánea, la invención proporciona un kit con dos o más viales, dos o más jeringuillas cargadas preparadas, o uno o más de cada, usándose el contenido de la jeringuilla para reconstituir el contenido del vial antes de la inyección, o viceversa.

Alternativamente, las composiciones inmunogénicas de la presente invención pueden liofilizarse y reconstituirse, por ejemplo, usando uno de una multitud de procedimientos para la liofilización que se conocen bien en la técnica para formar partículas secas, de forma regular (por ejemplo, esférica), tal como microgránulos o esferas, que tienen características de partícula tal como tamaños de diámetro medio que pueden seleccionarse y controlarse variando los procedimientos exactos que se usan para prepararlos. Las composiciones inmunogénicas pueden comprender además un adyuvante que puede prepararse opcionalmente con o estar contenido en partículas secas, de forma regular (por ejemplo, esféricas) separadas tal como microgránulos o esferas. En tales realizaciones, la presente invención proporciona además un kit de composición inmunogénica que comprende un primer componente que incluye una composición inmunogénica seca, estabilizada, que comprende además opcionalmente uno o más conservantes de la invención, y un segundo componente que comprende una disolución acuosa, estéril, para la reconstitución del primer componente. En ciertas realizaciones, la disolución acuosa comprende uno o más conservantes, y puede comprender opcionalmente al menos un adyuvante (véase, por ejemplo, el documento WO2009/109550 (que se incorpora en el presente documento por referencia).

Aún en otra modalidad, un recipiente del formato de múltiples dosis se selecciona de uno o más del grupo que consiste en, pero sin limitarse a, artículos de vidrio de laboratorio generales, matraces, vasos de precipitados, cilindros graduados, termentadores, biorreactores, tubos, tuberías, bolsas, jarras, viales, cierres para viales (por ejemplo, un tapón de caucho, un tornillo en la tapa), ampollas, jeringuillas, jeringuillas de doble cámara o de múltiples cámaras, tapones de jeringuilla, émbolos de jeringuillas, cierres de caucho, cierres de plástico, cierres de vidrio, cartuchos y plumas desechables y similares. El recipiente de la presente invención no está limitado en cuanto al material de fabricación, e incluye materiales tal como vidrio, metales (por ejemplo, acero, acero inoxidable, aluminio, etc.) y polímeros (por ejemplo, termoplásticos, elastómeros, elastómeros termoplásticos). En una modalidad particular, el recipiente del formato es un vial de vidrio Schott tipo 1 de 5 mi con un tapón de butilo. El experto apreciará que el formato expuesto anteriormente no es de ningún modo una lista exhaustiva, sino que simplemente sirve como guía para el experto con respecto a la variedad de formatos disponibles para la presente invención. Formatos adicionales contemplados para su uso en la presente invención pueden encontrarse en catálogos publicados de vendedores y fabricantes de equipos de laboratorio tal como United States Plástic Corp. (Lima, OH), VWR.

Evaluación de Composiciones inmunogénicas En una modalidad, la presente invención proporciona composiciones inmunogénicas que comprenden al menos tres antígenos a partir de un organismo de S. aureus.

Varias pruebas in vitro se usan para evaluar la inmunogenicidad de las composiciones inmunogénicas de la invención. Por ejemplo, un ensayo opsónico in vitro se realiza incubando juntos una mezcla de células estafilocócicas, suero inactivado por calor con contenido en específico anticuerpos para los antígenos en cuestión, y una fuente de complemento exógena. La opsonofagocitosis continúa durante la incubación de células polimorfonucleares (PMN) recién aisladas o células efectoras diferenciadas tal como HL60 y la mezcla anticuerpo/complemento/célula estafilocócica. Las células bacterianas que se recubren con anticuerpo y complemento se destruyen tras la opsonofagocitosis. Las unidades de formación de colonias (ufe) de las bacterias que sobrevivieron que se recuperan de la opsonofagocitosis se determinan colocando en placa la mezcla de ensayo. Se informa de los títulos como el recíproco de la más alta dilución que proporciona un 50 % de destrucción bacteriana, tal como se determina por comparación con controles de ensayo.

Un ensayo ELISA celular completo se usa también para evaluar la inmunogenicidad in vitro y la exposición de superficie del antígeno, en el que la cepa bactenana de interés (S. aureus) se recubre sobre una placa, tal como una placa de 96 pocilios, y se hace que sueros de prueba a partir de un animal inmunizado reaccionen con las células bacterianas. Si cualquier anticuerpo, específico para el antígeno de prueba, es reactivo con un epítopo de superficie expuesta del antígeno, puede detectarse mediante procedimientos convencionales conocidos por un experto en la técnica.

Cualquier antígeno que muestre la actividad in vitro deseada se prueba a continuación en un modelo de exposición animal in vivo. En ciertas realizaciones, se usan composiciones inmunogénicas en la inmunización de un animal (por ejemplo, un ratón) mediante procedimientos y vías de inmunización conocidos por los expertos en la técnica (por ejemplo, intranasal, parenteral, oral, rectal, vaginal, transdérmica, ¡ntraperitoneal, intravenosa, subcutánea, etc.). Siguiendo la inmunización del animal con una composición inmunogénica de Staphylococcus sp. particular, el animal se expone a una Staphylococcus sp. y se somete a ensayo para resistencia frente a la infección por estafilococos.

En una modalidad, se inmunizan ratones libres de patógeno y se exponen a S. aureus. Por ejemplo, se inmunizan ratones con una o más dosis del antígeno deseado en una composición inmunogénica. Posteriormente, los ratones se exponen a S. aureus y se supervisa la supervivencia a lo largo del tiempo después de la exposición.

Procedimientos de Inmunización Se proporcionan también procedimientos para immunizar un huésped para evitar infecciones por estafilococos. En una modalidad preferida, el huésped es un ser humano. Por lo tanto, un huésped o sujeto se administra una cantidad inmunogénica de una composición inmunogénica tal como se describe en el presente documento. Una cantidad inmunogénica de una composición inmunogénica puede determinarse realizando un estudio de respuesta a dosis en el que los sujetos se inmunizan con unas cantidades gradualmente en aumento de la composición inmunogénica y la respuesta inmunitaria se analiza para determinar la dosificación óptima. Los puntos de inicio para el estudio pueden inferirse a partir de datos de inmunización en modelos animales. La cantidad de dosificación puede variar dependiendo de las condiciones específicas del individuo. La cantidad puede determinarse en pruebas de rutina por medios conocidos por los expertos en la técnica. En algunas realizaciones, el procedimiento de inmunización de un huésped para evitar enfermedad, afección o infección por estafilococos comprende un tratamiento en seres humanos, veterinaria, en animales o en la agricultura. Otra modalidad proporciona un procedimiento de inmunización de un huésped para evitar enfermedad, afección o infección por estafilococos asociada con una Staphylococcus sp. en un sujeto, comprendiendo el procedimiento la generación de una preparación de anticuerpos policlonales o monoclonales a partir de la composición inmunogénica que se describe en el presente documento, y usando dicha preparación de anticuerpos para conferir inmunidad pasiva al sujeto.

Una cantidad inmunológicamente eficaz de la composición inmunogénica en un número apropiado de dosis se administra al sujeto para provocar una respuesta inmunitaria. El individuo tratado no debería de exhibir las manifestaciones clínicas más graves de la infección por estafilococos. La cantidad de dosificación puede variar dependiendo de condiciones específicas del individuo, tal como edad y peso. Esta cantidad puede determinarse en pruebas de rutina por medios conocidos por los expertos en la técnica.

En una modalidad, pacientes al os que se administran composiciones inmunogénicas de la invención muestran una reducción en las tasas de estado de portador de S. aureus. Tal reducción en estado de portador o un intervalo de tiempo prolongado invertido como un no portador a continuación de la administración de una composición inmunogénica es significativa desde una perspectiva de necesidad médica. Por ejemplo, una reducción en el estado de portador de S. aureus global en portadores puede evaluarse a continuación de una dosis de vacuna multiantígeno de S. aureus. Por ejemplo, 1 día antes de la administración de una composición inmunogénica, un grupo de adultos con edades de 18 a 50 años puede examinarse en busca de estado de portador mediante aplicación de hisopo nasal y de garganta seguidos por cultivo para determinar su estado de portador. A continuación, puede administrarse al grupo una composición inmunogénica de la invención, recibiendo un grupo un control. Aplicación de hisopo nasal y de garganta se realizó semanalmente a lo largo de un periodo de 12 semanas, y se realiza mensualmente hasta 6 meses después de la administración de la composición inmunogénica y en comparación con placebo. Un punto final primario es comparar las tasas de estado de portador en pacientes después de la administración de una composición inmunogénica frente a placebo en intervalos de 3 meses después de la inmunización.

Modelos animales de Infección por estafilococos Varios modelos animales se describen a continuación para su uso para evaluar la eficacia de una cualquiera de las composiciones inmunogénicas que se describen en el presente documento.

Modelo murino de septicemia (Pasiva o Activa) Modelo de inmunización pasiva Se inmunizan unos ratones de forma pasiva por vía intraperitoneal (i.p.) con IgG inmunitario o anticuerpo monoclonal. Los ratones se exponen posteriormente 24 horas más tarde a una dosis letal de S. aureus. La exposición bacteriana se administra por vía intravenosa (i.v.) o i.p. lo que asegura que cualquier supervivencia puede atribuirse a la interacción in vivo específica del anticuerpo con las bacterias. Se determina que la dosis de exposición bacteriana es la dosis que se requiere para conseguir una septicemia letal de aproximadamente un 20 % de los ratones de control no inmunizados. La evaluación estadística de los estudios de supervivencia puede llevarse a cabo mediante un análisis de Kaplan-Meier.

Modelo de inmunización activa En este modelo, ratones (por ejemplo, ratones de Swiss Webster) se inmunizan de forma activa por vía intraperitoneal (i.p.) o por vía subcutánea (SC) con un antígeno diana a 0, 3 y 6 semanas (u otro programa de vacunación similar separado apropiadamente) y posteriormente se exponen a S. aureus en la semana 8 por vía intravenosa. La dosis de exposición bacteriana se calibra para obtener aproximadamente un 20 % de supervivencia en el grupo de control a lo largo de un periodo de 10 a 14 días. La evaluación estadística de los estudios de supervivencia puede llevarse a cabo mediante un análisis de Kaplan-Meier.

Modelo de endocarditis infecciosa (Pasiva o Activa) Un modelo de inmunización pasiva para endocarditis infecciosa (IE) causada por S. aureus se ha usado anteriormente para mostrar que el ClfA puede inducir una inmunidad protectora. Véase Vernachio y col., Antmicro. Agents & Chemo. 50:511 a 518 (2006). En este modelo de IE, se usan conejos o ratas para simular unas infecciones clínicas que incluyen un catéter venoso central, bacteriemia, y siembra hematógena a órganos distales. A unos conejos o ratas cateterizados con vegetaciones de válvula aórtica estériles se les administra una única o múltiples inyecciones intravenosas de un anticuerpo monoclonal o policlonal específico para el antígeno diana. Posteriormente, los animales se exponen por vía i.v. con a S. aureus o S. epidermidis cepa. A continuación, después de una exposición, corazón, vegetaciones cardíacas, y tejidos adicionales, incluyendo ríñones, y sangre se recolectan y se cultivan. La frecuencia de infección por estafilococos en cardíaca tejido, ríñones, y sangre se mide a continuación. En un estudio, cuando los animales se expusieron a o bien MRSE ATCC 35984 o bien MRSA 67-0, se mostraron unas reducciones significativas en la velocidad de infección usando o bien la preparación de anticuerpos policlonales o bien la de anticuerpos monoclonales frente a ClfA. Véase Vernachio y col., Antmicro. Agents & Chemo. 50:51 1 a 518 (2006).

El modelo de endocarditis infecciosa se ha adaptado también para los estudios de inmunización activa tanto en conejos como en ratas. Se inmunizan conejos o ratas por vía intramuscular o por vía subcutánea con un antígeno diana y se exponen a S. aureus dos semanas más tarde por vía intravenosa.

Modelo de pielonefritis En el modelo de pielonefritis, se inmunizan ratones en las semanas 0, 3 y 6 (u otro programa de inmunización separado apropiadamente) con los antígenos diana. Posteriormente, los animales se exponen por vía i.p. o i.v. a PFESA0266 de S. aureus. Después de 48 horas, los ríñones se recolectan y se recuentan las UFC bacterianas.

Anticuerpos y Composiciones de anticuerpos La invención proporciona además anticuerpos y composiciones de anticuerpos que se unen específica y selectivamente a uno o más antígenos de una composición inmunogénica de la presente invención. En algunas realizaciones, los anticuerpos se generan después de la administración a un sujeto de una composición inmunogénica de la presente invención. En algunas realizaciones, la invención proporciona unos anticuerpos purificados o aislados que se dirigen contra uno o más de los antígenos de una composición inmunogénica de la presente invención. En algunas realizaciones, los anticuerpos de la presente invención son funcionales tal como se mide por la destrucción de bacterias o bien en un modelo de eficacia animal o bien a través de un ensayo de destrucción opsonofagocítica. En algunas realizaciones, los anticuerpos de la invención confieren inmunidad pasiva a un sujeto. La presente invención proporciona además unas moléculas de polinucleótido que codifican un anticuerpo o fragmento de anticuerpo de la invención, y una célula o línea celular (tal como células de hibridoma u otras líneas celulares diseñadas por ingeniería genética para la producción recombinante de anticuerpos) y un animal transgénico que produce un anticuerpo o una composición de anticuerpo de la invención, usando unas técnicas bien conocidos por los expertos en la técnica.

Los anticuerpos o composiciones de anticuerpos de la invención pueden usarse en un procedimiento de tratamiento o prevención de una enfermedad, afección o infección por estafilococos asociada con una Staphylococcus sp. en un sujeto, comprendiendo el procedimiento la generación de una preparación de anticuerpos policlonales o monoclonales, y el uso de dicho anticuerpo o composición de anticuerpo para conferir inmunidad pasiva al sujeto. Los anticuerpos de la invención pueden ser útiles también para procedimientos de diagnóstico, por ejemplo, detectar la presencia o cuantificar los niveles de uno o más antígenos de las composiciones inmunogénicas de la presente invención.

EJEMPLOS Los siguientes ejemplos muestran algunas realizaciones de la presente invención. No obstante, ha de entenderse que estos ejemplos son para ilustración sólo y no pretenden definir completamente las condiciones y el alcance de la presente invención. Debe apreciarse que cuando se han dado condiciones de reacción típicas (por ejemplo, temperatura, tiempo de reacción, etc.), también pueden usarse condiciones por encima y por debajo de los intervalos especificados, a pesar de que en general de manera menos conveniente. Tdoas las partes y porcentajes a las que se hace referencia en el presente documento son en peso y todas las temperaturas están expresadas en grados centígrados a menos que se especifique lo contrario.

Además, los siguientes ejemplos se llevaron a cabo usando técnicas convencionales, que se conocen bien y son rutinarias para los expertos en la técnica, excepto cuando se describa lo contrario en detalle. Tal como se indicó anteriormente, los siguientes ejemplos están representados para fin ilustrativo, y no deben interpretarse de ningún modo como limitantes del alzance de la presente invención.

EJEMPLO 1 Producción de Antígenos ClfA y Club El factor de aglutinación A (ClfA) y B (CIfB) son proteínas de superficie de S. aureus responsables de la unión a proteínas huésped incluyendo fibrinógeno (ClfA, CIfB) y citoqueratina 10 (CIfB). ClfA y CIfB son miembros de una familia de proteínas con contenido en el motivo LPXTG carboxilo terminal (SEQ ID NO: 125) que permite que la proteína se una covalentemente con la superficie celular. Tanto ClfA como CIfB pertenecen a la familia de proteínas (componentes superficiales microbianos que reconocen las moléculas adhesivas de la matriz, o MSCRAMM) que reconocen y se unen a proteínas de matriz extracelular huésped tal como fibrinógeno (ClfA y CIfB), fibronectina (FnbA y FnbB), colágeno (Cna), y otras. Todas estas proteínas comparten la secuencia señal de amino terminal que media el transporte a la superficie celular. Las MSCRAMM también incluyen un dominio A que es la región funcional que contiene un sitio de unión a ligando para fibrinógeno, fibronectina, elastina, y queratina. El dominio A puede ir seguido de una región que está compuesta por repeticiones de serina-aspartato (repetición de SD), que se piensa que abarca la capa de peptidoglicano. La repetición de SD va seguida por una región de extensión de membrana que incluye el motivo LPXTG (SEQ ID NO: 125) para enlace covalente de la proteína a peptidoglicano.

Las regiones de unión a ligando de ClfA y CIfB que comprende N1 N2N3 del dominio A abarcan los aminoácidos 40 a 559. Los dominios N de ClfA / CIfB se han asignado tal como sigue: N1 engloba los residuos 45 a 220; N2 engloba los residuos 229 a 369; y N3 engloba los residuos 370 a 559. Véase Deivanayagam y col. EMBO J. 21 :6660 a 6672 (2002). En preparaciones de ClfA N1 N2N3 recombinante, se ha encontrado que el dominio de N1 es sensible a proteasa y se escinde o hidroliza fácilmente para dejar el N23 como un fragmento recombinante de unión a ligando estable. Véase Deivanayagam y col. EMBO J. 21 :6660 a 6672 (2002). De forma similar, se mostró que el dominio N1 de CIfB es también sensible a proteasa y podría escindirse fácilmente mediante metaloproteasa de S. aureus (McAleese, F. M. y col. J. Biol. Chem. 2001 , 276, págs. 29969 a 29978). La estructura de cristal del fragmento N23 de unión a fibrinógeno N23 del dominio A de ClfA, reveló que tanto N2 como N3 están dominados por cadenas beta antiparalelas. Además de las cadenas beta antiparalelas, el dominio de N2 contiene una hélice alfa de vuelta única y dos hélices 310 y el dominio de N3 contiene tres hélices 310. Véase Deivanayagam y col. EMBO J. 21 :6660 a 6672 (2002).

El alineamiento de secuencia de N2 y N3 revela sólo un 13 % de identidad de secuencia y un 36 % de similitud de secuencia a lo largo de sus longitudes. Véase Deivanayagam y col. E BO J. 21 :6660 a 6672 (2002). La topología de los dominios de N2 y de N3 es similar al clásico pliegue de IgG y se ha propuesto que sean variantes novedosas del pliegue de IgG. Véase Deivanayagam y col. EMBO J. 21 :6660 a 6672 (2002).

Formas recombinantes de CIfA que se usan en las composiciones inmunogénicas que se describen en el presente documento son fragmentos de CIfA que comprenden uno o más de los dominios N, por ejemplo, N1 N2N3, N2N3 y se denominan en el presente documento como "CIfA recombinante" o "rCIfA". Además, cualquier rCIfA debe ser aquél que mantenga la estructura nativa de los dominios N individuales y epítopos críticos pero que no interfiera con procesos normales del individuo inmunizado después de la administración (es decir, que no se una al fibrinógeno). Estudios mutacionales han mostrado que la mutación de Y338A (N2) eliminaba completamente la unión del fragmento N23 fragmento a fibrinógeno. (Esta posición Y338A se refiere a un cambio de una tirosina a una alanina en la posición 338 en la forma inmadura de la secuencia de polipéptido con la secuencia líder aún unida. Este cambio puede verse en la posición 310 en la forma adulta del polipéptido de CIfA mutado de SEQ ID NO: 123 que muestra una falta de unión a fibrinógeno). Véase Deivanayagam y col. EMBO J. 21 :6660 a 6672 (2002). Por lo tanto, la mutación Y338A se ha adoptado para todos los fragmentos de CIfA en los siguientes estudios.

De forma similar, formas recombinantes de ClfB que se usan en las composiciones inmunogénicas que se describen en el presente documento son fragmentos de CIfB que comprende uno o más de los dominios N, por ejemplo, N1 N2N3, N2N3 y a los que se hace referencia en el presente documento como "CIfB recombinante" o "rCIfB". Además, cualquier rCIfB debería de ser uno que mantenga la estructura nativa de los dominios N individuales y epítopos críticos pero que no interfiera con los procesos normales de los individuo inmunizados después de la administración (es decir, que no se una a fibrinógeno). (Véase, por ejemplo, Walsh, E.J. y col. Microbiology (2008), 154, 550 a 558).

CIfA y CIfB: Visión de conjunto de la estrategia de clonación Las diferentes formas de proteína de rCIfA que se usan para generar datos de eficacia preclínica incluyen HisClfA(Ni23); T7ClfA(N 23); T7ClfA(Ni23); Y338A; ClfA(N2¾ y ClfA(N23)Y338A. Véase la figura 1. El gen CIfA contiene la región A que codifica la secuencia a partir de S. aureus PFESA0237 que se corresponde con residuos 40 a 559. El marco de lectura clonado a partir de S. aureus se fusionó con la etiqueta de His de N-terminal y secuencias de ligador del vector (MRGSHHHHHHGS SEQ ID NO: 127) junto con tres secuencias de codificación adicionales (KLN) que se introducen en el C-terminal. (Véase a continuación para el procedimiento detallado). La proteína que se expresa a partir de este vector se usó para todos los experimentos a los que se hace referencia como HisClfA(Ni23).

Las diferentes formas de rCIfA se derivaron de la región A (residuos 40 a 559 de CIfA expresados mediante S. aureus PFESA0237 (fila superior). La HisClfA(N123) se expresa usando el promotor T5 contenido en pQE30 y todas las otras formas se expresan usando el sistema de expresión basado en pET de T7.

Dos formas de ClfB (T7ClfB N1 N2N3 y ClfB N23) se utilizaron para estudios de animales preclínicos.

Procedimiento de clonación de CIfA La secuencia de codificación de CIfA que se corresponde con residuos de aminoácido 40 a 559 a partir de la cepa de S. aureus PFESA0237 se clonó y la mutación, Y338A, se introdujo para eliminar la unión a fibrinógeno. El gen CIfA mutado se introdujo en un vector de expresión de ARN polimerasa de T7, pET9a (Novagen) para proporcionar un plásmido, pLP1 179. La secuencia de ADN de la región que comprende el promotor T7 y la región de codificación en pLP1179 es SEQ ID: 124. El vector de expresión se transformó en BLR(DE3) de E. coli (Novagen) para la producción de CIfA recombinante.

La construcción de T7ClfA(Ni23)Y338A implicaba varias etapas. Un resumen de las etapas de clonación que se usan para la construcción del plásmido de expresión final, pLP1 79 se muestra en la figura 2.

La secuencia de ADN de CIfA presente en pQECIf40 se corresponde con residuos de aminoácido 40 a 559 de CIfA que se clonaron originalmente en el sitio de clonación de BamHI/HindIII de pQE30. Esto crea una fusión de etiqueta de His en el extremo N-terminal de ClfA y la adición de tres residuos en el C-terminal. La región de codificación de ClfA presente en (AmpR) pQECIf40 se subclonó en el vector KanR pET 27b (Novagen) para crear pLP1137. Además la secuencia de ADN de ClfA que se corresponde con residuos de aminoácido 221 a 559 se clonó en el sitio de clonación Ndel-Hindlll de pET27b para crear pLP1 134. La etiqueta de His de N-terminal de ClfA se sustituyó con el T7 N-terminal subclonando el fragmento de ADN BamHI-BIpl a partir de pQECIf40 en pET9a (Novagen) para crear pLP 153. La secuencia de codificación de T7ClfA(N-i23) presente en pLP1 153 contiene 1 1 Residuos de aminoácido N-terminal a partir de la etiqueta T7 de pET9a seguido por tres residuos de aminoácido a partir de secuencias de ligador más los tres residuos derivados de ligador C-terminal originalmente presentes en pQE30Clf40. La mutación Y338A se introdujo en lugar primer lugar en la secuencia de codificación de ClfA(N23) de pLP1 134 para crear pLP1 168. Más tarde un fragmento de ADN de PstI-SnaBI con contenido en la mutación Y338A a partir de ClfA(N23) de pLP1 168 se sustituyó en PstI-SnaBI de secuencia de codificación de T7ClfA(Ni23) de pLP1 153 para crear pLP1 171. Un sitio de unión a ribosoma interno presente en la secuencia de codificación de T7ClfA(Ni23)Y338A de pLP1 171 se alteró mediante mutaciones silenciosas en posiciones de ADN 339 y 342 del ORF T7 rCIfA Y338A, que cambia de G a T y G a A, respectivamente. El plásmido resultante, pLP1176, se usó a continuación para eliminar los residuos externos, originalmente derivados de pQE30Clf40, entre la etiqueta T7 y el inicio de la región de codificación de ClfA. Los tres residuos de C-terminal derivados de ligador se eliminaron también en este momento.

El rCIfA expresado mediante el plásmido resultante, pLP1 179 (figuras 2 y 3), contiene sólo los 11 aminoácidos de N-terminal fusionados a residuo 40 a 559 de ClfA(Ni23)Y338A. La secuencia de ADN de la región que comprende el promotor T7 y la secuencia de codificación de T7 rClfA(Ni23)Y338A de pLP 179 es SEQ ID NO:124.

Cepas bacterianas y Plásmidos La pET9a de estructura principal de plásmido (que se obtiene a partir de Novagen) se usó para la construcción de pLP1 179, que expresa T7ClfA(Ni23)Y338A a partir de un promotor T7. El plásmido contiene el gen de resistencia de kanamicina (KanR) para selección positiva. La cepa de E. coli huésped BL21 (DE3) [F- ompT hsdSB (rB-mB-) gal dcm (DE3)] (Novagen) se usó originalmente para obtener la expresión de T7ClfA(Ni23)Y338A. La designación DE3 indica el lisogen lambda con contenido en la gen de ARN polimerasa T7 bajo el control del promotor lacUV5 (inducible por IPTG) que se usa para la expresión inducida de ARN polimerasa de T7 y la transcripción posterior a partir del promotor T7 proximal a la secuencia de codificación de ClfA(Ni23)Y338A presente en pLP1 179. Tras recibir información de que la cepa huésped lisogénica BL21 (DE3) es capaz de inducción de fago de lisis tras fermentaciones a gran escala, la cepa huésped se cambió a la cepa huésped recA BLR(DE3) [F- ompT hsdSB (rB-mB-) gal dcm A(sri-recA)306::Tn10(TcR) (DE3)] (Novagen).

Producción y Purificación de CIfA Para la producción de CIfA, se hizo que BLR(DE3) de E. coli/pl_P1 79 creciera en medio definido en modo por lote alimentado por glucosa en biorreactores. Cuando el cultivo alcanzó una densidad óptica (DO 600) de entre 30 y 50, la expresión de CIfA se indujo mediante la adición de IPTG. El cultivo se recolectó entre 3 a 16 horas después de la inducción.

Las células se vieron afectadas y la fracción soluble clarificada se recogió. Después de la adición de sulfato de amonio, el material se aplicó a una columna con contenido en resina Fenil-Sepharose y se eluyó. Las fracciones con contenido en CIfA se identificaron, se dializaron y se cargaron en una columna de intercambio aniónico (Q-Sepharose). Después de la elución con un gradiente de sal, las fracciones con contenido en CIfA se identificaron, se concentraron mediante ultrafiltración y se cargaron en una columna de exclusión molecular (Superdex-75). Las fracciones con contenido en CIfA se identificaron y se agruparon. La pureza del CIfA en este punto fue de aproximadamente un 98 % tal como se mide por SDS-PAGE.

Clonificación y Purificación de ClfB N1 N2N3 La secuencia de codificación de ClfB que se corresponde con residuos de aminoácido 44 a 542 se clonó en un vector de expresión de ARN polimerasa de T7, pET28a (Novagen) para proporcionar un plásmido pPX1 189. El vector de expresión se transformó en BLR(DE3) de E. coli (Novagen) para la producción de CIfB recombinante. (Véase Walsh, y col., Microbiology 154: 550 a 558 (2008)).

Para la producción de CIfB, se hizo que BLR(DE3) de E. coli/pLP1 179 creciera en un medio definido en modo por lote alimentado por glucosa en biorreactores. Cuando el cultivo alcanzó una densidad óptica (DO 600) de entre 30 y 50, la expresión de CIfB se indujo mediante la adición de IPTG. El cultivo se recolectó entre 3 a 16 horas después de la inducción.

Las células se vieron afectadas y la fracción soluble clarificada se recogió. El pH de la fracción soluble se ajustó a un pH de aproximadamente 3.2 y las impurezas precipitadas se eliminaron. El pH de la fracción soluble con contenido en CIfB se reajustó a un pH de aproximadamente 8.0 y se dializó para eliminar sales. Después de la adición de sulfato de amonio, el material se aplicó a una columna con contenido en resina Fenil-Sepharose y se eluyó. Las fracciones con contenido en CIfB se identificaron, se dializaron y se cargaron en una columna de intercambio aniónico (Q-Sepharose). Después de la elución con un gradiente de sal, las fracciones con contenido en CIfB se identificaron, se concentraron mediante ultrafiltración y se cargaron en una columna de exclusión molecular (Superdex-75). Las fracciones con contenido en CIfB se identificaron y se agruparon. La pureza del CIfB en este punto fue de aproximadamente un 94 % tal como se mide por SDS-PAGE.

EJEMPLO 2 Producciones de Antígenos: MntC de Staph Aureus Clonificación de MntC Lipidada de S. aureus MntC recombinante se clonó originalmente a partir de la cepa de S. aureus Mu50. La secuencia de codificación de rMntC se amplificó mediante PCR a partir de ADN genómico de Mu50 de S. aureus. Dos pares de cebadores anidados se usaron para la amplificación (cuadro 2). El primer par de cebadores, en el sentido de 5'SA926-MntC y en el sentido de 3'SA926-MntC, se alinean con la secuencia en el sentido de 5' y en el sentido de 3' del marco de lectura abierto de rMntC. El segundo conjunto de cebadores se alinean con la secuencia de codificación de rMntC permitiendo amplificar la secuencia que se corresponde con residuos de aminoácido 19 a 309. Sitios de enzimas de restricción se incorporaron en los extremos de 5' de estos cebadores para facilitar la clonificación direccional. Se llevó a cabo una PCR en un Termociclador de Peltier (MJ Research Inc, Walthan, MA) con una Premezcla de ADN Polimerasa TaKaRa PrimeSTAR HS (Takara Bio USA, Madison, Wl). El producto de PCR se purificó mediante QIAEX II (Qiagen, Valencia, CA), se escindió con las endonucleasas de restricción apropiadas (New England BioLabs, Ipswich, MA) y se subclonó en el vector de expresión accionado por promotor araBAD pBAD18Cm. Este vector también contiene el péptido señal de la lipoproteina P4 a partir de H. influenza. El producto de PCR de MntC se subclonó en marco en el sentido de 3' a partir del péptido señal P4 para crear pLP1 194. La secuencia de ADN de la región de codificación MntC de pLP1 194 se muestra en el SEQ ID NO: 120. La MntC que se expresa a partir de pLP1 194 es una lipoproteina. El ADN plásmido recombinante se secuenció mediante un ABI PRISM BigDyeTM Terminator V.3.1 (Applied Biosystems, Foster City, CA) y la proteína recombinante se expresó en BLR de E. coli (NOVAGEN) para la producción de rMntC lipidada.

Producción y Purificación de MntC Lipidada Para la producción de MntC lipidada, se hizo que BLR de E. coli/pLP1 194 creciera en un medio definido en modo por lote alimentado por glucosa en biorreactores. Cuando el cultivo alcanzó una densidad óptica (DO 600) de aproximadamente 60, la expresión de rMntC se indujo conmutando la alimentación a una mezcla de glucosa y arabinosa. El cultivo se recolectó aproximadamente 24 horas después de la inducción.

Las células se vieron afectadas y se recogió la fracción insoluble. MntC lipidada se encontró asociada con la membranas celulares debido a la modificación de lípido. MntC se extrajo a partir de la fracción de membrana con un detergente (Zwittergent ZW-312). Después de la eliminación del residuo insoluble, se encontró la MntC lipidada en la fracción soluble. La fracción soluble se aplicó a una columna con contenido en una resina de modo de mezclado y se eluyó con un gradiente de sal y pH lineal. Las fracciones con contenido en MntC se identificaron y se agruparon. Se añadió sulfato de amonio al conjunto y el material se aplicó a una columna con contenido en Butyl-Sepharose y se eluyó. Las fracciones con contenido en MntC se identificaron, se desalaron y se cargaron en una columna de intercambio catiónico (SP-Sepharose). Después de la elución con un gradiente de sal, las fracciones con contenido en rMntC se identificaron y se agruparon.

Clonificación de S. aureus MntC no lipidada La secuencia de ADN empleada para expresar rMntC no lipidada se aisló por amplificación de PCR a partir de pLP1 194 plásmido. La secuencia resultante se corresponde con residuos de aminoácido 19 a 309 y no contiene la secuencia señal que dirige la secreción y lipidación. La secuencia de ADN de la región de codificación rMntC de pLP1215 se encuentra en ADN SEQ ID NO: 120.

Para crear pLP1215, MntC se amplificó mediante PCR a partir de pLP1 194. La secuencia de ADN de MntC presente en pLP1215 se corresponde con residuos de aminoácido 19 a 309 y El primer codón para este constructo se introdujo en el cebador directo que se usa en la amplificación del gen. Los cebadores que se usan para PCR también contienen sitios de enzimas de restricción en los extremos de 5' para facilitar la clonificación direccional (cuadro 2). La PCR y purificación del gen amplificado se llevó a cabo tal como se describe anteriormente. Producto de PCR purificado se escindió con las endonucleasas de restricción apropiadas (New England BioLabs, Ipswich, MA) y se subclonó en el promotor vector de expresión accionado por T7 pET28a (Novagen, Madison, Wl). El ADN de plásmido recombinante pLP1215 se secuenció mediante un ABI PRISM BigDyeTM Terminator V.3.1 (Applied Biosystems, Foster City, CA) y la proteína recombinante se expresó en BLR(DE3) de ADN de plásmido de E. coli. para pLP1215 se purificó y se usó para transformar E. coli HMS174(DE3) para evaluar la expresión de proteínas.

CUADRO 2 Cebadores de MntC Constructos de Nombre del cebador Secuencia (5'-3') Expresión MntC lipidada 5'SA926-MntCups CAC AAA ATT TAC GAA ETIQUETA (pLP1 194) AAA GAA ACG AG (SEQ ID NO: 109) 3'SA926-MntCdown AAA ATA TTG GAG ATA CCA ATA I I I ETIQUETA GTT G (SEQ ID NO: 1 10) 5'BamHISA926_MntC TTT CTT GGA TCC GGT ACT GGT GGT AAA CAA AGC AGT G (SEQ ID NO: 111 ) 3'SphlSA926_MntC TTT CTT GCA TGC TTA TTT CAT GCT TCC GTG TAC AGT TTC (SEQ ID NO: 1 12) MntC no lipidada 5'NcolMntC TTT CTT CCA TGG GTA CTG GTG (PLP1215) GTA AAC AAA GCA G (SEQ ID NO: 1 13) 3'BlplMntC TTT CTT GCT CAG CAT TAT TTC ATG CTT CCG TGT ACA G (SEQ ID NO: 1 14) Los oligonucleótidos de síntesis que se usan para generar constructos de rMntC. Sitios de endonucleasa de restricción están subrayados. Los nucleótidos en negrita indican el primer codón para el constructo de rMntC no lipidado.

Producción v Purificación de RMntC no lipidada Para la producción de rMntC no lipidada, se hizo que E. coli HMS174(DE3)/pLP1215 creciera en un medio definido en modo por lote alimentado por glucosa en biorreactores. Cuando el cultivo alcanzó una densidad óptica (DO 600) de aproximadamente 60 a 80, la expresión de rMntC se indujo mediante adición de IPTG. El cultivo se recolectó aproximadamente 24 horas después de la inducción. Las células se vieron afectadas y la fracción soluble clarificada se recogió. El lisado se aplicó a una columna con contenido en una resina de intercambio catiónico (SP-Sepharose) y se eluyó con un gradiente de sal lineal. Las fracciones con contenido en MntC se identificaron. Después de la adición de sulfato de amonio, el material se aplicó a una columna con contenido en resina Fenil-Sepharose y se eluyó. Después de la elución, las fracciones con contenido en rMntC se identificaron, se agruparon, y se desalaron. La pureza de la rMntC en este punto fue de > 95 % tal como se mide por SDS-PAGE.

EJEMPLO 3 Producción de Polisacáridos de cápsula CP5 y CP8 En el presente ejemplo, se describe la producción de varios tamaños de polisacáridos de cápsula de tipo 5 y 8 de S. aureus. Las estructuras de los polisacáridos CP5 y CP8 se muestran en la figura 4. Los procedimientos que se describen en el presente documento son eficaces para producir CP5 y CP8 con pesos moleculares que varían de aproximadamente 50 kDa a 800 kDa. En base a las características de crecimiento y a la cantidad de cápsula que se produce, la cepa PFESA0266 se eligió para producción de CP5 mientras que se usaron unas cepas PFESA0005 o PFESA0286 para la producción de CP8. Las cápsulas aisladas a partir de las cepas PFESA0005 y PFESA0286 mostraron que eran idénticas.

Para la producción de polisacáridos capsulares, se hizo que las cepas crecieran en un medio complejo que consistía principalmente en una fuente de carbono (o bien lactosa o bien sacarosa), harina de soja hidrolizada como la fuente de nitrógeno, y trazas de metales. Se hizo que las cepas crecieran en biorreactores durante de 2 a 5 días.

La purificación de CP5 y CP8 que se usa para la preparación de conjugados se realizó mediante dos procedimientos diferentes que se basan en una temperatura elevada y en un pH bajo para efectuar la liberación de cápsula a partir de la célula y reducir el peso molecular del polisacárido. El peso molecular resultante depende del momento, la temperatura y el pH de la etapa de hidrólisis.

La caracterización de CP5 y CP8 se realizó usando las técnicas que se especifican en el cuadro 3. Los polisacáridos de cápsula que se producen mediante el presente procedimiento dan como resultado polisacáridos puros con bajos niveles de proteína, NA, peptidoglicano y TA contaminantes. Véanse los cuadros 4 y 5.

CUADRO 3 Ensayos de caracterización para CP5 y CP8 de S. aureus purificado Especificidad Ensayo Proteína residual ensayo colorimétrico de Lowry Acidos nucleicos residuales barrido de 260nm Ácido teicoico residual ensayo colorimétrico de fosfato Peptidoglicano residual HPAEC-PAD Tamaño SEC-MALLS Composición HPAEC-PAD Identidad 1 H-RMN o reacción con AcM específico O-acetilación 1 H-RMN Concentración MALLS-RI o HPAEC-PAD En el primer procedimiento, a continuación de la liberación de la cápsula a partir de la célula y de la reducción de peso molecular, la preparación de cápsula se trata con un cóctel de enzimas (ribonucleasa, desoxiribonucleasa, lisozima, y proteasa) para digerir impurezas. Después de la incubación, las impurezas residuales se precipitan mediante la adición de etanol (concentración final de aproximadamente un 25 %). Después de la eliminación del etanol residual, disolución con contenido en cápsula se cargó en una columna de intercambio aniónico (Q-Sepharose) y se eluyó con un gradiente de sal lineal. Las fracciones con contenido en cápsula se agruparon y se trataron con metaperyodato de sodio. Este tratamiento dio como resultado la hidrólisis oxidativa del contaminante de ácido teicoico residual, pero no afectó al CP5 o CP8. La reacción se extinguió mediante la adición de etilenglicol. El material se concentró y se diafiltró frente a dH20 para eliminar cualesquiera productos secundarios y reactivos residuales.

El segundo procedimiento se usó para producir cápsulas did not involve el uso de enzimas para digerir las varias impurezas derivadas de célula. En el presente procedimiento, a continuación de la liberación de la cápsula a partir de la célula y de la reducción de peso molecular el caldo de fermentación hidrolizado se clarificó por microfiltración seguida por ultrafiltración y diafiltración. La disolución se trató con carbono activado para eliminar impurezas. Después del tratamiento de carbono, el material se trató con metaperyodato de sodio para oxidar el ácido teicoico residual seguido por una extinción con propilenglicol. El material se concentró y se diafiltró frente a dH20 para eliminar cualesquiera productos secundarios y reactivos residuales.

Cápsulas que se produce usando cualquiera de los procedimientos dan como resultado polisacáridos puros con bajos niveles de contaminantes de proteína, ácido nucleico y ácido teicoico. Los procedimientos que se describen pueden usarse para producir unos intervalos específicos de los polisacáridos de alto peso molecular deseados simplemente variando las condiciones de hidrólisis. Un intervalo particularmente ventajoso de polisacáridos de alto peso molecular, variando de 70 a 150 kDa, es útil para fabricar composiciones inmunogénicas conjugando polisacárido con una proteína de portador.

Ejemplos de polisacárido de cápsula de alto peso molecular que pueden obtenerse mediante los procedimientos que se describen en el presente documento se muestran en el cuadro 4 a continuación. Los lotes de CP5 de más alta MW purificado también tenían una alta pureza tal como se indica por no TA, peptidoglicano y proteína residual baja. Véase el cuadro 4. El intervalo de pesos moleculares en esos ejemplos abarcaba de 132,7 kDa a 800 kDa y los polisacáridos purificados estaban muy O-acetilados, variando de un 90 a un 100 %, y un 100 % para la N-Acetilación. Véase el cuadro 4.

Ejemplos de polisacárido de cápsula de peso molecular más bajo que pueden obtenerse mediante los procedimientos que se describen en el presente documento se muestran en el cuadro 5 a continuación. Los lotes de CP8 de más baja MW purificado tenían una alta pureza tal como se indica por la ausencia de ácido teicoico (TA), peptidoglicano y proteína residual baja. Véase el cuadro 5. El intervalo de pesos moleculares más bajos abarcaba de 20.4 kDa a 65.1 kDa y los polisacáridos purificados estaban muy O-acetilados, variando de 75 a 96 %. Los niveles de contaminación de ácido nucleico eran bajos, variando de un 0.5 % a un 2,45 %. Véase el cuadro 5.

CUADRO 4 Caracterización de Preparaciones de CP5 SA CP-5 MW (kDa) CP (mg/ml) O-Acetilo (%) RMN Identidad RMN N-acet¡l (%) RMN 1 800.1 3.164 100 Pass 100 2 132.7 1.172 90 Pass 100 3 335.4 0.975 90 Pass 100 4 366.8 0.865 90 Pass ND CUADRO 5 Caracterización de preparaciones de CP8 SA CP-8 CP Purificado MW(kDa) Proteína (Lowry) % NA (barrido de O-Acetilo Total mg (g/mol) (P/P) 260nm) % (p/p) RMN % 5 310 27.0 1.2 0.94 100 6 438 29.0 2.4 2 100 7 179 20.4 0.37 0.12 108 8 101 46.9 Bajo el umbral de 0.5 94 detección 9 91 65.1 1.15 2.45 96 10 578 35.5 2.47 0.65 75 Selección de peso molecular de los polisacáridos capsulares Este análisis cinético muestra que un amplio intervalo de pesos moleculares de polisacáridos de cápsula puede generarse mediante los procedimientos que se describen en el presente documento. Inicialmente, se produjeron unos polisacáridos más grandes mediante las células bacterianas, y posteriormente, un intervalo de peso molecular deseado puede seleccionarse y a continuación purificarse mediante la manipulación del pH y las condiciones de calor de las etapas de calentamiento y de hidrólisis.

El tratamiento térmico del caldo de fermentación de S. aureus era una etapa de proceso entre la fermentación y recuperación de CP. Esta etapa de proceso usa calor para tratar el caldo de pH ajustado durante un periodo especificado. Los fines del tratamiento térmico a un pH bajo eran destruir células, inactivar enterotoxinas, liberar polisacárido unido a célula, y reducir el peso molecular al tamaño deseado. Entre estos fines, la reducción de peso molecular era la menor en términos de tiempo de procesamiento requerido en esta etapa. Por lo tanto, los otros fines se lograron de forma inevitable dentro del plazo de tiempo del tratamiento considerado.

Tratamiento térmico Se determinaron temperatura y pH condiciones para seleccionar varios intervalos de peso molecular de los polisacáridos de cápsula. El pH del caldo se ajustó con ácido sulfúrico concentrado. A continuación, la temperatura del caldo se elevó hasta el valor fijado. El tiempo de tratamiento térmico empezó en cuanto la temperatura alcanzó el punto fijado. Cuando se alcanzó el tiempo de tratamiento deseado, el caldo se enfrió hasta temperatura ambiente. Se tomaron muestras en procedimiento para determinar la concentración de polisacárido y el peso molecular mediante sistemas de HPLC y SEC-MALLS, respectivamente. Los datos de MW se usaron en el análisis cinético. Los perfiles de MW se determinaron a lo largo del tiempo de CP5 a un pH de 4.0, 4.5 y 5.0 y CP8 a un pH de 3.5, 4.0, y 5.0. Véase las figuras 5A y 5B.

La cinética de hidrólisis ácida suave de polisacáridos se realizó usando purificado CP-5 y CP-8 que se obtiene a partir del procedimiento. La disolución de polisacárido purificado se ajustó al pH deseado para el experimento con ácido sulfúrico. Las muestras se colocaron en un baño de aceite equipado con un sistema de control de la temperatura de precisión. Cada muestra se extrajo a un intervalo de tiempo predeterminado y se extinguió en un cubo de hielo. Al final del experimento, una alícuota de tampón Tris 1 M (pH 7.5) se añadió a la muestra para ajustar el pH de nuevo a aproximadamente 7. Las muestras se analizaron mediante un sistema SEC-MALLS. Los datos de MW se usaron en el análisis cinético. El efecto de la temperatura sobre MW perfiles de CP5 a un pH de 4.5 y CP8 a un pH de 3.5 se determinó a lo largo del tiempo. Véase las figuras 6A y 6B. Este procedimiento de hidrólisis ácida puede implementarse usando el fermentador cultivo o a una fase de purificación intermedia o, tal como se muestra en este caso, usando el polisacárido purificado. Otras etapas de reducción de peso molecular, tal como sonicación o sheer, puede implementarse de forma similar.

Resultados El efecto de pH tras la reducción de MW en un tratamiento térmico se muestra en las figuras 5A y 5B para CP-5 y CP-8, respectivamente. Puede observarse que un pH más bajo era más eficaz para reducir el tamaño de polisacárido. Los datos también sugieren que CP-5 era más difícil de hidrolizar que CP-8 al mismo pH. Considerando los perfiles de CP8, pueden generarse intervalos de pesos moleculares de entre 300 kDa y 600 kDa usando un pH de 5 a 95 °C durante entre 15 minutos y 120 minutos. De forma similar, elegir un pH de 4 a 95 °C durante entre 15 minutos y 120 minutos puede proporcionar unos intervalos de peso molecular de polisacárido CP8 de entre 250 kDa y 450 kDa. Además, elegir un pH de 3.5 a 95 °C durante entre 15 minutos y 120 minutos puede proporcionar unos intervalos de peso molecular de polisacárido CP8 de entre 120 kDa y 450 kDa.

El efecto de la temperatura sobre la reducción de MW se realizó usando los polisacáridos purificados recuperados a partir del procedimiento de recuperación. Los resultados se muestran en las figuras 6A y 6B. Tal como se muestra, cuanto más alta es la temperatura, más rápida es la velocidad de hidrólisis y más amplio es el intervalo de los pesos moleculares de polisacárido que se produce con el tiempo. El uso de una temperatura más baja, de 55 °C frente a 95 °C al mismo pH, produce un intervalo más estrecho de pesos moleculares de polisacárido.

Además, la figura 7 muestra la correlación entre el peso molecular de purificado CP5 y CP8 con el tiempo de tratamiento para hidrólisis ácida suave. El polisacárido purificado es el producto final que se obtiene a partir del procedimiento de recuperación detallado anteriormente. Tal como se muestra en la figura 7, el aumento en el tiempo de tratamiento térmico de la cepa de S. aureus PFESA0266 a un pH de 4.5 da como resultado la generación de polisacáridos CP5 de peso molecular más pequeño, mientras que tiempos de tratamiento térmico más cortos a un pH de 4.5 dan como resultado la generación de polisacáridos CP5 de peso molecular más alto. El tamaño de los polisacáridos CP5 oscilaba de aproximadamente 90 kDa a aproximadamente 220 kDa dependiendo de la duración del tiempo de tratamiento térmico a un pH bajo (4.5). De forma similar, el aumento en el tiempo de tratamiento térmico de la cepa S. aureus PFESA0005 a un pH de 3.5 da como resultado la generación de polisacáridos CP8 de peso molecular más bajo, mientras que tiempos de tratamiento térmico más cortos a un pH de 3.5 dan como resultado la generación de polisacáridos CP8 de peso molecular más alto. El tamaño de los polisacáridos CP8 oscilaba de aproximadamente 80 kDa a aproximadamente 220 kDa dependiendo de la duración del tiempo de tratamiento térmico a un pH bajo (3.5). La correlación entre el momento de tratamiento térmico a un pH bajo y el tamaño de los polisacáridos CP5 y CP8 purificados, tal como se muestra en el presente estudio, permite una estimación del tiempo de tratamiento requerido para producir polisacárido purificado con un intervalo especificado de peso molecular.

Es importante indicar que, tal como se muestra anteriormente, puede producirse, liberarse y purificarse el intervalo completo de pesos moleculares de polisacáridos de cápsula para tanto CP5 como CP8 de 20 kDa a más de 800 kDa. Los procedimientos que se describen pueden usarse para producir unos intervalos específicos de polisacáridos de cápsula de alto peso molecular deseados. Un intervalo particularmente ventajoso de alto peso molecular cápsula polisacárido tipo 5 y tipo 8 puede generarse a partir de estos procedimientos que tienen pesos moleculares que varían de 70 a 150 kDa. Véase el cuadro 6. Este intervalo de pesos moleculares de polisacárido de cápsula es útil para fabricar composiciones ¡nmunogénicas conjugando el polisacárido con una proteína de portador. Alternativamente, este intervalo ventajoso de polisacárido de cápsula de alto peso molecular varía de 80 a 140 kDa de CP5 y CP8. Véase el cuadro 6. Otro intervalo ventajoso de polisacárido de cápsula CP5 y CP8 de alto peso molecular va de 90 a 130 kDa, o de 90 a 120 kDa de CP5 y CP8. Véase el cuadro 6. Las condiciones que se usan para generar el polisacárido de cápsula CP5 que tiene un intervalo de peso molecular de aproximadamente 100 a 140 kDa son tal como sigue: 95 °C, pH 4.5 durante 135 minutos. Las condiciones que se usan para generar el polisacárido de cápsula CP8 que tiene un intervalo de peso molecular de aproximadamente 80 a 120 kDa son tal como sigue: 95 °C, pH 3.5 durante 300 minutos.

CUADRO 6 Producción de intervalo específico de CP5 y CP8 de alto peso molecular Pase CP8 MW (kDa) CP5 MW (kDa) 1 98 142 2 89 108 3 108 142 4 108 108 5 89 ND 6 100 ND 7 99 63 8 1 13 72 9 105 74 10 100 63 1 1 87 ND ND = no realizado EJEMPLO 4 Conjugación de Polisacáridos de cápsula CP5 v CP8 con CRMi El presente ejemplo describe procedimientos y ensayos de caracterización que se usan en la producción de CP5-CRM 97 y CP8-CRM 97 de S. aureus conjugados. Varias químicas de conjugación se evaluaron para conjugar polisacáridos de cápsula CP5 y CP8 de S. aureus con una proteína de portador. La conjugación usando PDPH (3-2-piridilditio)-propionil-hidrazida) da como resultado enlace tioéter covalente y CDI/CDT (1 , 1-carboildiimidazol/ , 1 -carboil-di-1 ,2,4-triazol) da como resultado un ligador de un carbono o de cero carbonos entre CP y proteína de portador.

Conjugación de CP con CRMia? mediante química de conjugación de PDPH La química de conjugación de PDPH es un procedimiento de múltiples etapas que implica la activación del polisacárido, la eliminación del grupo protector de tiol, la purificación del producto intermedio de polisacárido activado, la activación y la purificación de la proteína CRM197, y la conjugación de los componentes activados seguido por purificación. Después de la introducción de un grupo tiol con contenido en ligador en el polisacárido y un grupo haloacetilo en el portador de proteína CRMi97, CP5 de S. aureus y polisacáridos CP8 se unieron al portador de proteína a través de un enlace tioéter. Se introdujeron grupos bromoacetilo en la proteína CRIV mediante reacción de grupos amina con el éster de N-hidroxisuccimida de ácido bromoacético. Para generar CP tiolado, los grupos carboxilato activados de carbodiimida de ácido N-acetilmannosaminourónico en CP se acoplaron con el grupo hidrazida del ligador heterobifuncional de hidrazida reactiva-sulfhidrilo 3-(2-piridilditio)-propionil-hidrazida (PDPH). Tioles de PDPH-CP tiolado, generados mediante reducción con DTT y purificados mediante SEC en una columna Sephadex G25, reaccionaron con los grupos bromoacetilo de proteína activada dando como resultado enlace covalente de tioéter formado mediante desplazamiento de bromo entre CP y la proteína. Los grupos bromoacetilo sin reaccionar se "taparon" con clorhidrato de cisteamina (clorhidrato de 2-aminoetanotiol). La mezcla de reacción se concentró a continuación y se sometió a diafriltración. Los grupos bromoacetilo no conjugados restantes se taparon con clorhidrato de cisteamina para garantizar que no quedaba ningún grupo bromoacetilo reactivo tras la conjugación. Éste formó un enlace covalente entre el extremo de tiol de cisteamina y el grupo acetilo en el residuo de lisina tras el desplazamiento de bromo.

Tiolación de polisacárido capsular de S. aureus con PDPH El polisacárido se activó en primer lugar mediante tiolación con PDPH. Se mezcló el polisacárido con una disolución madre de PDPH recién preparada (250 mg/ml en DMSO), una disolución madre de EDAC (90 mg/ml en diH20), y disolución madre de tampón MES (0.5 M, pH 4.85) para fabricar la disolución final 0.1 M de MES, y 2 y 4 mg CP/ml a la vez que se mantiene a una razón en peso CP:PDPH:EDAC de 1 :5:3 para CP 5 y 1 :0.6: 1.25 para CP 8. Se incubó esta mezcla durante 1 hora a temperatura ambiente y a continuación se dializó frente a un volumen 1000Xde H20 destilada cuatro veces usando un dispositivo de diálisis 3500 MWCO a entre 4 y 8 °C para eliminar PDPH sin reaccionar. El polisacárido unido a PDPH se hizo DTT 0.2 M y se incubó a temperatura ambiente durante 3 horas o durante la noche a entre 4 y 8 °C. Se separaron el DTT en exceso así como los productos secundarios de la reacción del sacárido activado mediante SEC usando resina Sephadex G25 y agua destilada como la fase móvil. Las fracciones se sometieron a ensayo mediante el ensayo de DTDP para grupos tiol y se agruparon las fracciones positivas que eluían cerca del volumen vacío de la columna. Se sometió a ensayo el conjunto de fracciones mediante los ensayos de PAHBAH y de O-acetilo para determinar el grado de activación que se expresa como un porcentaje molar de las unidades de repetición con contenido en un grupo tiol (concentración molar de tioles/concentración molar de las unidades de repetición). Se liofilizó el polisacárido activado y se almacenó a -25 °C hasta que era necesario para la conjugación.

Activación de proteína de portador Por separado, se activó la proteína de portador mediante bromoacetilación. CRM197 se diluyó hasta 5 mg/ml con NaCI al 0.9 % tamponado con fosfato 10 mM pH 7 (PBS) y a continuación se hizo NaHC03 0.1 M pH 7.0 usando disolución madre 1 M. El éster de N-hidroxisuccinimida del ácido bromoacético (BAANS) se añadió a una razón CRM197 :BAANS 1 :0.25 (p:p) usando una disolución madre de BAANS de DMSO 20 mg/ml. Esta mezcla de reacción se incubó a entre 4 y 8 °C durante 1 hora a continuación se purificó usando SEC sobre Sephadex G-25. El CRM197 activado purificado se sometió a ensayo mediante el ensayo de Lowry para determinar la concentración de proteína y a continuación se diluyó con PBS hasta 5 mg/ml. Se añadió sacarosa a un 5 % p/vol como un crioprotector y se congeló la proteína activada y se almacenó a -25 °C hasta que era necesaria para la conjugación.

Reacción de acoplamiento Una vez se prepararon el polisacárido de cápsula activado y la proteína de portador activada, se combinaron los dos en una reacción de conjugación. Se disolvió el polisacárido tiolado y liofilizado en borato 0.16 M pH 8.95, se mezcló CRM197 bromoacetilado descongelado y agua destilada para fabricar la disolución final de borato 0.1 M, razón 1 : 1 en p/p de CRMi97:CP, y polisacárido 1 mg/ml para CP8 y 2 mg/ml polisacárido para CP5. Se incubó esta mezcla a temperatura ambiente durante entre 16 y 24 horas. Se taparon los grupos bromoacetilo sin reaccionar en la proteína añadiendo clorhidrato de cisteamina en una razón de CRM-i97:cisteamina de 1 :2 (p/p) usando una disolución 135 mg/ml de cisteamina disuelta en borato 0.1 M pH 8.95 y se incubó durante 4 horas a temperatura ambiente. El conjugado de polisacárido de cápsula-CRMig7 (conjugado) se purificó mediante diafiltración 50 veces frente a NaCI al 0.9 % usando un ultrafiltro de polietersulfona de 100K.

Los resultados de la reproducibilidad de estudios de tiolación de CP5 y CP8 con PDPH mostraron que el grado de activación de CP5 estaba en el intervalo 1 1 a 19 % lo que corresponde a aproximadamente una molécula de ligador unida por diez unidades de repetición de CP a una molécula de ligador por cinco unidades de repetición. La activación de CP8 estaba en el intervalo de 12 a 16 %, lo que era muy similar a la activación de CP5.

La bromoacetilación de residuos de lisina de CRM197 fue muy consistente, dando como resultado la activación de 19 a 25 lisinas de las 39 lisinas disponibles. La reacción produjo altos rendimientos de proteína activada.

Conjugación de CP con CRIV mediante química de conjugación de CDI/CDT CDI y CDT proporcionan un procedimiento de conjugación de una sola etapa en el que el polisacárido se activa en un entorno anhidro (DMSO) para formar imidazol o restos de carbamato de triazol con restos acilimidazol o aciltriazol e hidroxilos disponibles con ácidos carboxílicos. La adición de un portador de proteína (en DMSO) conduce al desplazamiento nucleofílico del imidazol o triazol mediante lisinas y la formación de un enlace de carbamato (para hidroxilos activados) y el enlace de amida (para ácidos carboxílicos activados). Se diluye la disolución de reacción 10 veces en una disolución acuosa para eliminar grupos de activación sin reaccionar y a continuación purificarse mediante diafiltración.

Las dos químicas de conjugación que se produce CP con enlace covalente con la proteína de portador, que se indicaba por la presencia del sacárido y la proteína en las fracciones en cromatografía de exlusión molecular, y mediante análisis de aminoácidos de conjugado de clorhidrato de cisteamina tapado o glicolaldehído tapado.

Resumen de los resultados de la preparación de varios lotes de conjugados preparados mediante químicas tanto de PDPH como de CDI/CDT para ambos serotipos capsulares con tamaño de polisacárido en el intervalo de 20 a 40 kDa se muestran en el cuadro 7 a continuación. No hubo diferencias significativas en el polisacárido de cápsula libre, razón de CP-proteína y rendimientos de conjugados generados mediante estos dos procedimientos de conjugación. La antigenicidad de CP conjugado no se vio alterada por la conjugación tal como se representa mediante la línea de precipitinas de identidad entre conjugados y CP nativo.

CUADRO 7 Caracterización de Preparado de CP5-CRMig7 V CP8-CRM 97 SA mediante dos químicas de conjugación Rendimiento Lisinas Tamaño (Mw o Rendimiento Razón de Sacárido Proteína Conjugado Química de protelna modificadas Kd (% menos de de CP (%) rendimiento libre (%) libre (%) (%) 0,3), sac./prot.)) CP5- CDT 19-27 35 0,5-0,8 10-40 < 1 18-22 38/61 a 76/74 CRM197 SA 7.5 x 105 a 2.3 x PDPH 26-52 40-99 0,4-1 ,0 23-50 ND ND 106 CP8- CDI 46-62 54-55 0,8-0,9 22-25 < 1 7-8 34/57 to 60/57 CRM197 SA PDPH 34-70 61-83 0,6-0,9 15-41 ND 11-16 74 - 92 % Tal como se muestra anteriormente, los procedimientos que se describen en el presente documento pueden usarse para producir unos intervalos específicos de polisacáridos de cápsula de alto peso molecular deseados. El objeto del presente estudio era preparar conjugados a partir de un intervalo preseleccionado de alto pesos moleculares de CP que pudiera ser filtrado y purificado para su uso en composiciones inmunogénicas. En el presente ejemplo, ocho lotes en los que el polisacárido de cápsula CP5 variaba en peso molecular de aproximadamente 90 kDa a aproximadamente 120 kDa se seleccionaron y se realizó la conjugación usando activación con triazol (CDT). Véase el cuadro 8. Los pesos moleculares de los conjugados resultantes oscilaban de 1.533 kDa a 2.656 kDa. El número de lisinas conjugadas por CRM 97 oscilaba de un alto número de 22 a un bajo número de 15. El polisacárido de cápsula libre oscilaba de un alto número de un 18 % a un bajo número de un 1 1 %. Véase el cuadro 8.

CUADRO 8 Conjugados Con Intervalo de MW Preseleccionado de CP5 Pase Poli, MW Rendimiento Sac rido MW Lisinas (kDa) de Sac (%) libre (%) mediante modificadas SEC- MALLS (kDa) 1 121 63 11 2.130 19 2 92 72 16 1.533 22 3 119 74 14 2.656 15 4 115 63 18 1.91 1 15 El cuadro 9 resume el análisis de conjugados de CP8 en los que el polisacárido de cápsula CP8 variaba en peso molecular de aproximadamente 87 kDa a 1 13 kDa y se utilizó la química de conjugación de ¡midazol. Los pesos moleculares de los conjugados resultantes oscilaban de 595 kDa a 943 kDa. El número de lisinas conjugadas por CRMig7 oscilaba de un número alto de 9 a un número bajo de 3. El polisacárido de cápsula libre oscilaba de un número alto de un 6 % a un número bajo de un 2 %. Véase el cuadro 9.

CUADRO 9 Cuadro 9 Conjugados Con Intervalo de MW Preseleccionado de CP8 Pase Poli, MW Rendimiento Sacárido MW Lisinas (kDa) de Sac libre (%) mediante modificadas (%) SEC-MALLS (kDa) 1 99 88 6 943 4 2 1 13 73 5 841 3 3 105 79 3 719 7 4 100 86 2 630 9 5 87 90 3 595 6 Ambas químicas de conjugación producen CP con enlace covalente con proteína de portador. No hubo diferencias significativas en polisacárido de cápsula libre, razón de CP-proteína y rendimientos de conjugados generados mediante estos dos procedimientos.

EJEMPLO 5 Diversidad de Secuencia de Fragmentos de polipéptido N1 , N2 y N3 de CIfA En el presente ejemplo se evaluó la heterogeneidad de secuencia de proteína de fragmentos de polipéptido de CIfA N1 , N2 y N3 a partir de aislados que dan lugar a enfermedad que se obtienen a partir de varias fuentes. Los genes de CIfA se secuenciaron a partir de las cepas de S. aureus asociadas con múltiples estados patológicos. La información de secuencia a partir de cepas adicionales se obtuvo a partir de GenBank para generar secuencias a partir de cepas relevantes. El cuadro 10 enumera diferentes secuencias de CIfA.

El alineamiento de secuencia de proteínas de CIfA a partir de diferentes cepas que dan lugar a enfermedad de S. aureus se muestra en la figura 8A a 8E. Las secuencias de proteína se alinearon usando MUSCLE. Véase Edgar, R.C. Nucleic Acids Research 32 (5): 1792 a 1797 (2004). Los alineamientos se mostraron usando SHOWALIGN. Véase Rice, P. y col., "EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite" Trends in Genetics, 16 (6): 276 a 277 (2000). Muchas de las secuencias se repitieron múltiples veces sin variación. Por motivos de claridad, cada secuencia única se colocó en el alineamiento sólo una vez. Véase la figura 8A a 8E. Sólo se incluyeron secuencias únicas en el listado de secuencia. Por ejemplo, la secuencia de proteína de ClfA_001 se obtuvo a partir de múltiples cepas diferentes sin variación alguna. Véase la figura 8A a 8E. El número de listado de secuencia para cualquier secuencia puede también obtenerse a partir del cuadro 10: Listados de secuencia y cepas de CIfA. El cuadro 10 enumera una cepa a modo de ejemplo que contenía esta misma secuencia de proteína ClfA_001. Esta secuencia se muestra en la primer fila del alineamiento en la figura 8A a 8E. Este alineamiento de secuencias únicas del antígeno de CIfA indica que los polimorfismos se distribuyeron a lo largo de la totalidad de la región A (N1-N2-N3) de CIfA. En algunos casos, para cualquier secuencia de proteína de CIfA única dada, se descubrió más de una secuencia de nucleótidos, que codifica la misma proteína. Sólo la secuencia de ADN de aparición más frecuente se incluyó en el listado de secuencia y en el cuadro 10. Para CIfA, las siguientes secuencias se dan a conocer en el presente documento y no se encuentran en GenBank: ClfA_003, ClfA_005, ClfA_008, ClfA_009, ClfA_013, ClfA_014, ClfA_015, ClfA_016, ClfA_017, ClfA_018, ClfA_019, ClfA_020, ClfA_021 , ClfA_022, ClfA_023, y ClfA_024.

CUADRO 10 Listados de secuencia y cepas de ClfA Cepa a modo NT SEQ AA SEQ ID % Identidad de Ejemplo ADN-CIfA ID NO: Proteína-CIfA NO: a Antigeno PFESA0131 clfA_001 -1 61 ClfA 001 62 99 PFESA0074 ClfA 002-1 63 ClfA 002 64 92 PFESA0072 ClfA 003-1 65 ClfA 003 66 99 PFESA0159 clfA_004-1 67 ClfA 004 68 94 PFESA0154 ClfA 005-1 69 ClfA 005 70 91 PFESA0096 ClfA 006-1 71 ClfA 006 72 91 PFESA0269 ClfA 007-1 73 ClfA 007 74 91 PFESA0081 ClfA 008-1 75 ClfA 008 76 97 PFESA0005 ClfA 009-1 77 ClfA 009 78 95 PFESA0139 ClfA 010-1 79 ClfA 010 80 99 PFESA0237 ClfA 01 -1 81 ClfA 011 82 100 PFESA0157 ClfA 012-1 83 ClfA 012 84 96 PFESA0069 ClfA 013-1 85 ClfA 013 86 92 PFESA0002 ClfA 014-1 87 ClfA 014 88 98 PFESA0147 ClfA 015-1 89 ClfA 015 90 91 PFESA0094 ClfA 016-1 91 ClfA 016 92 98 PFESA0143 ClfA 017-1 93 ClfA 017 94 97 PFESA0129 ClfA 018-1 95 ClfA 018 96 99 PFESA0128 ClfA 019-1 97 ClfA 019 98 92 PFESA0148 ClfA 020-1 99 ClfA 020 100 91 PFESA0140 ClfA 021 -1 101 ClfA 021 102 98 PFESA0152 ClfA 022-1 103 ClfA 022 104 91 PFESA0141 ClfA 023-1 105 ClfA 023 106 96 PFESA0160 ClfA 024-1 107 ClfA 024 108 94 La filogenia de las secuencias de proteína ClfA se examinó y se construyó un árbol filogenético. Se alinearon las secuencias usando ClustalW. Véase Chenna R, Sugawara H, Koike T, y col. Nucleic Acids Research. 31 (13):3497 a 3500 (2003). Árboles se muestrearon con reemplazamiento 1.000 veces y demostraron con MEGA 4.0. Véase Tamura K, y col., Molecular Biology & Evolution. 24(8): 1596 a 1599 (2007). Los valores de muestreo con reemplazamiento, que se indican en las ramas, son el número de veces que la rama se reprodujo en 1.000 ensayos. Se considera que unos valores menos de 500 (un 50 % de reproducibilidad) están escasamente soportados.

El secuencias de CIfA formas un árbol con 2 ramas principales. Véase la figura 9. La separación de estos dos grupos está muy soportada en la filogenia. Una rama (parte superior) incluye 9 secuencias que están bastante relacionadas entre sí (de un 96 a un 99 % de identidad) pero que están menos relacionadas con el clf A_01 1 de secuencia de candidato, al que éstas son de un 91 a un 92 % idénticas. El segundo grupo, que incluye clf A_01 1 , es más diverso y la filogenia en este grupo no está tan bien soportada. Estas secuencias de proteína varían de un 93 a un 99 % idénticas entre sí.

EJEMPLO 6 Diversidad de Secuencia de Fragmentos de polipéptido N1 , N2 y N3 de Club En el presente ejemplo, se evaluó la heterogeneidad de secuencia de proteína de los fragmentos de polipéptido de ClfB N1 , N2 y N3 a partir de 92 asilados causantes de enfermedad que se obtienen a partir de varias fuentes. Se secuenciaron genes de ClfB a partir de las cepas de S. aureus asociadas con múltiples estados patológicos. Véase el cuadro 1 1 . Información con respecto a cepas adicionales se obtuvo a partir de GenBank para generar secuencias adicionales.

El alineamiento de secuencia de proteínas de ClfB a partir de diferentes cepas que dan lugar a enfermedad de S. aureus se muestra en la figura 10A a 10E. Las secuencias de proteína se alinearon usando MUSCLE. Véase Edgar, R.C. Nucleic Acids Research 32 (5): 1792 a 1797 (2004). Los alineamientos se mostraron usando SHOWALIGN. Véase Rice, P. y col., "EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite" Trends in Genetics, 16 (6): 276 a 277 (2000). Véase la figura 10A a 10E alineamiento de ClfB. Como con ClfA, muchas de las secuencias se repitieron múltiples veces sin variación. Por motivos de claridad, cada secuencia única se colocó en el alineamiento sólo una vez. Véase la figura 10A a 10E. Sólo se incluyeron secuencias ClfB únicas en el listado de secuencia. Por ejemplo, la secuencia de ClfB_006 se obtuvo a partir de múltiples cepas diferentes sin variación alguna. Esta secuencia se muestra en la primera fila del alineamiento en la figura 10A a 10E. El número de listado de secuencia para cualquier secuencia puede también obtenerse a partir del cuadro 11. Este alineamiento de secuencias únicas representativas del antígeno de ClfB indica que los polimorfismos estaban distribuidos a lo largo de la totalidad de la región A (N1 -N2-N3) de ClfB. De forma similar a ClfA, para cualquier secuencia única dada de proteína de ClfB, se descubrió más de una secuencia de nucleótidos que codifica la misma proteína. Sólo la secuencia de ADN de aparición más frecuente se incluyó en el listado de secuencia y en el cuadro 1 1 . Para ClfB, las siguientes secuencias se dan a conocer en el presente documento y no se encuentran en GenBank: ClfB_001 , ClfB_004, ClfB_005, ClfB_010, ClfB_01 1 , ClfB_013, ClfB_014, ClfB_015, ClfB_016, ClfB_017, ClfB_018, ClfB_019, ClfB_020, ClfB_021 , ClfB_022, ClfB_023, y ClfB_024. El árbol filogenético se muestra en la figura 11.

CUADRO 11 Listados de secuencia y Cepas de Club Cepa a modo SEQ ID Proteína- SEQ ID % Identidad a de Ejemplo ADN-CIfB NO: ClfB NO: Antígeno PFESA0286 clfB 001-1 15 clfB 001 16 95 PFESA0159 ClfB 002-1 17 clfB 002 18 95 RF122 ClfB 003-1 19 ClfB 003 20 94 PFESA0271 clfB 004-1 21 clfB 004 22 95 PFESA0081 clfB 005-1 23 clfB 005 24 95 PFESA0080 clfB 006-1 25 ClfB 006 26 100 PFESA0270 ClfB 007-1 27 ClfB 007 28 99 PFESA0269 clfB 008-1 29 clfB 008 30 95 PFESA0145 clfB 009-1 31 clfB 009 32 94 PFESA0069 clfB 010-1 33 ClfB 010 34 95 PFESA0002 clfB 01 1-1 35 ClfB 01 1 36 96 PFESA0128 clfB 013-1 37 clfB 013 38 96 PFESA0129 clfB 014-1 39 ClfB 014 40 95 PFESA0136 clfB 015-1 41 clfB 015 42 99 PFESA0139 clfB 016-1 43 clfB 016 44 99 PFESA0140 ClfB 017-1 45 ClfB 017 46 96 PFESA0141 clfB 018-1 47 clfB 018 48 94 PFESA0144 clfB 019-1 49 clfB 019 50 97 PFESA0150 ClfB 020-1 51 clfB 020 52 96 PFESA0152 ClfB 021-1 53 clfB 021 54 96 PFESA0156 clfB 022-1 55 ClfB 022 56 96 PFESA0163 clfB 023-1 57 clfB 023 58 94 PFESA021 1 clfB 024-1 59 clfB 024 60 99 EJEMPLO 7 Diversidad de Secuencia De MntC Clones de S. aureus que dan lugar a enfermedad En el presente ejemplo, se evaluó la heterogeneidad de secuencia de proteína de genes de MntC a partir de 104 aislados que dan lugar a enfermedad que se obtienen a partir de varias fuentes. Se secuenciaron genes de MntC a partir de las cepas de S. aureus asociadas con múltiples estados patológicos. Véase el cuadro 12. Información con respecto a cepas adicionales se obtuvo a partir de GenBank para generar secuencias de cepas.

El alineamiento de secuencia de proteínas MntC a partir de diferentes cepas que dan lugar a enfermedad de S. aureus se muestra en la figura 12. Las secuencias de proteína se alinearon usando MUSCLE. Véase Edgar, R.C. Nucleic Acids Research 32 (5): 1792 a 1797 (2004). Los alineamientos se mostraron usando SHOWALIGN. Véase Rice, P. y col., "EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite" Trends in Genetics, 16 (6): 276 a 277 (2000). Véase la figura 12. Como con ClfA, muchos de las secuencias se repitieron múltiples veces sin variación. Por motivos de claridad, cada secuencia única se colocó en el alineamiento sólo una vez. Véase la figura 12. Sólo se incluyeron secuencias de MntC únicas en el listado de secuencia. Por ejemplo, la secuencia de MntC_001 se obtuvo a partir de diferentes cepas sin variación alguna. Véase la figura 12. Esta secuencia se muestra en la primera fila del alineamiento en la figura 12. El número de listado de secuencia para cualquier secuencia puede también obtenerse a partir del cuadro 12. Sólo la secuencia de ADN correspondiente más frecuente se incluyó en el listado de secuencia. Para MntC, las siguientes secuencias se dan a conocer en el presente documento y no se encuentran en GenBank: MntC_002, MntC_006, MntC_007, MntC_008, y MntC_009.

CUADRO 12 Listados de secuencia y cepas de MntC Cepa ADN-MntC SEQ ID Proteína- SEQ ID % Identidad NO: MntC NO: a Antígeno PFESA012 9 MntC 001-1 1 MntC 001 2 99 PFESA014 2 MntC 002-1 3 MntC 002 4 99 PFESA013 9 MntC 003-1 5 MntC 003 6 99 PFESA028 6 MntC 006-1 7 MntC 006 8 99 PFESA013 6 MntC 007-1 9 MntC_007 10 99 PFESA015 0 MntC 008-1 1 1 MntC 008 12 99 PFESA015 3 MntC 009-1 13 MntC 009 14 99 EJEMPLO 8 Expresión de superficie de CIfA, CP5, CP8 Y MntC En vivo Durante Infección S. aureus es responsable de dar lugar a una serie de infecciones humanas. Por consiguiente, las bacterias han de adaptarse a diferentes nichos ambientales mediante expresión diferencial de factores de virulencia que se requieren para la infección. La expresión de antígenos diana se estudió en tres ensayos en vivo de roedores para evaluar su expresión durante la infección: un modelo de herida para medir expresión del antígeno en el sitio de infección primario, un modelo de bacteriemia que supervisa la expresión de antígeno en la sangre, y un modelo de cámara permanente que supervisa la expresión de antígeno durante unas condiciones de nutriente/oxígeno limitados. Para todos estos modelos los roedores se expusieron a bacterias en el sitio de estudio. A continuación de la infección, se recolectaron bacterias en varios puntos de tiempo y expresión de antígeno (CIfA, CP5, CP8, MntC) se evaluó usando microscopía inmunofluorescente (herida y bacteriemia) o citometría de flujo (cámara).

Materiales y procedimientos Expresión en el modelo de herida Los experimentos de infección de heridas consisten en 5 animales/grupo y hasta 5 grupos para un máximo de 25 animales/experimento. Ratones macho C57BL/6 de seis a ocho semanas (sem.) de edad se sometieron a cirugía para incrustar un bucle de sutura en una incisión del músculo de muslo. Esto proporciona un sustrato de cuerpo extraño para la unión bacteriana y reduce significativamente la dosis mínima infecciosa necearía para producir una infección estafilocócica en la herida. Se introdujeron cinco µ? de o bien S. aureus o bien solución salina estéril en la incisión bajo la sutura de tejido profunda de seda 4-0. La piel se cerró con suturas de 4-0 de Prolene o adhesivo quirúrgico (por ejemplo, cianoacrilato). Los animales se sacrificaron en puntos de tiempo entre 30 min y 10 días tras la infección y se extirpó el músculo del muslo, se homogeneizó y se recontaron las bacterias. Se analizaron las bacterias a la vista de la de infección para determinar la expresión de antígeno mediante microscopía confocal inmunofluorescente (SI).

Expresión en el modelo de bacteriemia Se inmunizaron grupos de 10 ratones CD-1 o Balb/C de cuatro semanas de edad con 1 pg de proteína o CP conjugado mediante inyección subcutánea en las semanas 0, 3 y 6. Se extrajo la sangre a los animales en las semanas O y 8 seguido por una exposición intraperitoneal a S. aureus que se hace crecer hasta la fase log tardía en TSB. Tres horas tras la exposición los animales se sacrificaron y se extrajo la sangre para microscopía confocal SI.

Expresión en el modelo de tubo de diálisis permanentes Se hicieron crecer aislados de S. aureus durante la noche sobre placas de TSA a 37 °C. Las bacterias se rasparon de las placas y volvieron a suspenderse en PBS estéril y la DO600 se ajustó a 1 , aproximadamente 109 unidades de formación de colonias (ufe) /mi. Las bacterias se diluyeron hasta una concentración de 103 ufc/ml y se inocularon en tubos de diálisis. Una alícuota de la suspensión se sembró en placa para determinar el número real de ufe. Se preparó un tubo de diálisis con 3.5 kDa de MWCO para implante mediante esterilización en etanol al 70 % durante 30 minutos seguido por un enjuague extenso en agua estéril y a continuación solución salina estéril. Una alícuota de 2 mi de la suspensión bacteriana se transfirió al tubo de diálisis, se cerró la bolsa con un nudo, y a continuación se enjuagó extensamente con solución salina estéril. Se anestesiaron ratas Sprague Dawley ratas macho (6 semanas de edad) y se realizó una incisión de 2 a 3 cm a lo largo de la línea central dorsal. Se crearon espacios en el sitio de incisión separando cuidadosamente la piel del tejido subyacente. El subo se implantó en los espacios y se cerró la piel usando grapas quirúrgicas. Después de 24 h, se sacrifiaron las ratas, se retiró el tubo, y se recuperaron las bacterias para análisis citométrico de flujo.

Microscopía inmunofluorescente (SI) La sangre de 5 ratones se agrupó en citrato de sodio helado, pH 7.0 (concentración final, 0.4 %). Las células eucarióticas se lisaron con NP-40 al 1 % (Pierce Biotechnology). Las bacterias se lavaron dos veces con PBS y se incubó durante la noche a 4 °C con suero inmunitario o preinmunitario de conejo (1 : 100) y se detectaron con anticuerpos de cabra anti-conejo conjugado con ALEXA488 (1 :250, Invitrogen). Las bacterias marcadas se secaron sobre un portaobjetos de microscopio y se montó un cubreobjetos con medio Vectashield HardSet (Vector Laboratories, Inc.). Se obtuvieron imágenes con un microscopio confocal espectral Leica TCS SL (Leica Microsystems).

Análisis citométrico de flujo Se hicieron crecer aislados de S. aureus tal como se describe en el procedimiento de modelo de tubo de diálisis de rata. Se bloquearon aproximadamente 107 células bacterianas en tampón de tinción (solución salina equilibrada de Hank con un 10 % de sueros de cabra) durante 1 hora en hielo. Las células bacterianas se centrifugaron durante 5 minutos a 10.000 rpm, se retiró el sobrenadante, y se incubaron las células con anticuerpo de ratón o anticuerpo de control de isotipo durante 30 minutos en hielo. Las células se lavaron a continuación y se tiñeron con IgG de cabra anti-ratón conjugado con FITC (Jackson ImmunoResearch) en hielo durante 30 minutos. Se lavaron las bacterias dos veces con tampón de tinción, se fijaron con 2 % paraformaldehido y se adquirieron datos y se analizaron usando citómetro de flujo FACS Caliber y Cell quest software (Becton, Dickinson y Co.). Se recogieron un total de 30.000 acontecimientos para cada muestra.

CUADRO 13A Expresión de perfiles de antígeno en aislados de tipo 5 de CP de S. aureus Tiempo [h] T0 1 4 6 24 72 T0 1 4 6 24 72 TO 1 4 6 24 72 bacteriemia + - ± + / / + - ± + / / NT NT NT NT NT NT PFESA0266 herida + - - - ± + + - ± + + + ± ± ± ± ± bacteriemia + + + + / / + - + + / - - - / / PFESA0272 herida + - - - + ! + - ± ± ± ! - - ! bacteriemia + - ± + / + - ± / - - - / / Afino herida + - - + + + + - - + + + - - - ± ± ± bacteriemia + - ± + / / + - ± + NT NT NT NT NT NT PFESA0093 herida + - - ± + + + - - - ± ± - - - ± ± ± bacteriemia + - - + / / + - ± ± / / - - ± ± / / PFESA0028 herida + - - - - - + - - ± ± ± - - - ± ± - bacteriemia - - ± + / / + - - + / - - + / / PFESA0029 herida - - - - ± ± + - - - - ± - - ± ± - / = Se realizaron experimentos de bacteriemia durante 6 horas ! = el animal murió durante el experimento NT no sometido a prueba CUADRO 13B Expresión de perfiles de antíqeno en aislados de tipo 8 de CP de S. aureus Antígeno CP ClfA ntC Tiempo (h) TO 1 4 6 24 72 TO 1 4 6 24 72 TO 1 4 6 24 72 PFESA0003 Bacteriemia + ± + / + ± + NT NT NT NT NT NT Herida + + + + + + - ± + + NT NT NT NT NT NT PFESA0286 Bacteriemia + + / + + NT NT NT NT NT NT Herida + - - + ! + - + + NT NT NT NT NT NT PFESA0005 Bacteriemia + ± ± / + + + + NT NT NT NT NT NT Herida NT NT ! NT NT NT NT NT NT NT NT NT NT NT NT PFESA0002 Bacteriemia + / + ± ± ± + / / Herida + - - + + + - - NT ± ± ± + PFESA0269 Bacteriemia + / + ± ± / / Herida - - i + + + - - ± NT - - ± ± PFESA0268 Bacteriemia + + + / + + ± + / / Herida + + + + + - - NT - ± ± PFESA0025 Bacteriemia + / + + NT NT NT NT NT NT Herida + - - - + ± + - - NT ± + PFESA0283 Bacteriemia + / + + + ± ± ± ± / / Herida + - - + ! + + NT ± ± ± PFESA0027 Bacteriemia + ± / + ± ± NT NT NT NT NT NT Herida + - ± ± + + + - ± + NT ± + PFESA0001 Bacteriemia + / + NT NT NT NT NT NT Herida + - - ± ± + + - - - NT ± PFESA0095 Bacteriemia + / + + NT NT NT NT NT NT Herida + - - + + + - - NT ± PFESA0271 Bacteriemia + + + NT NT NT NT NT NT Herida + - - - + + + - + + NT ± ± ± + PFESA0271 Bacteriemia + ± + / + ± ± NT NT NT NT NT NT Herida + - + + + - + NT ± ± / = se realizaron experimentos de bacteriemia durante 6 horas. ! = el animal murió durante el experimento NT no sometido a prueba CUADRO 13C Expresión de antígeno S. aureus en el tubo de diálisis permanente Frecuencia de positive células (% de total) Time (horas) 0 3 6,0 9,0 13,0 18.0 30,0 PFESA0266 de S. aureus ClfA 69.8 13.7 8.5 8.0 12.5 8.8 16.4 CP5 28.0 1.9 1.8 6.1 7.1 5.2 9.6 MntC 91.4 4.3 5.6 2.9 20.8 37.0 33.2 S. aureus PFESA0005 Time (horas) 0 3 6.0 9.0 13.0 18.0 24.0 ClfA 98.6 63.9 69.7 24.3 36.1 98.6 99.0 CP8 77.3 43.0 18.0 7.5 1 1.8 96.4 94.0 MntC 5.9 7.7 12.5 2.6 2.9 9.3 9.9 Resultados Se sometieron a prueba una combinación de diecinueve aislados de S. aureus para determinar la expresión de ClfA, CP5, CP8, o MntC sobre la superficie celular de S. aureus durante la infección (cuadro 13A, 13B, y 13C). Estos aislados incluían cepas clínicamente relevantes recientes y eran diversos tal como se monitorizó mediante MLST. La expresión de antígeno dependía de la cepa, el punto de tiempo, y el modelo de infección. La variación en expresión de antígeno entre aislados en diferentes entornos in vivo (flujo sanguíneo frente a herida) apoya el uso de una composición inmunogénica de múltiples antígenos para inducir una amplia cobertura de aislados estafilocócicos en una variedad de diferentes infecciones. Los antígenos se expresaron en superficie dentro de las primeras 24 horas de infección y son por lo tanto componentes válidos para una composición inmunogénica anti-estafilocócica. Los antígenos proteicos ClfA y MntC eran accesibles para la tinción en presencia de expresión de la cápsula indicando que la presencia de cápsula no enmascara las proteínas de los anticuerpos que se dirigen contra ellos.

La mayor parte de los aislados de tipo 8 sometidos a prueba no expresaban CP en la sangre hasta puntos de tiempo tardíos tras la exposición (> 4 horas) (véase el cuadro 3A-C). Estos resultados muestran que en CP de S. aureus está diferencialmente regulado dependiendo del microentorno in vivo, es decir, el sitio de infección. Estos resultados pueden explicar Iso resultados de eficacia inconsistentes notificados para conjugados de CP8 en modelos animales.

Los resultados de expresión in vivo sugieren que ninguna formulación inmunogénica de un solo antígeno proporcionará amplia cobertura frente a la mayoría de infecciones por S. aureus. Hay demasiada diversidad de fenotipos de expresión por cepas individuales dentro de microentornos in vivo. Por lo tanto, se requiere una composición inmunogénica que consiste en más de un antígeno para evitar enfermedad por S. aureus.

EJEMPLO 9 Inmunogenicidad de formulaciones de múltiples antígenos con contenido en conjugados de ClfA. CP5- y CP8-CRMia7 En el presente ejemplo, se evaluaron la inmunogenicidad de combinaciones de ClfA, CP5-CRM197 y CP8-CRMi97.

A. Formulación de composición inmunogénica de dos antígenos (CP5-CRMiQ7/CP8-CRMig7) - efecto de la dosis sobre las respuestas de anticuerpos anti-capsulares en conejo En el presente ejemplo, se evaluó el efecto de la dosis sobre la inmunogenicidad de la formulación inmunogénica de CP5-CRMi97 y CP8-CRMi97 combinado en conejos. Se inmunizaron los conejos en la semana 0, 3 y 6 con conjugado bivalente más 125 pg de AIP04 administrado mediante inyección subcutánea. Las dosis evaluadas en este estudio estudio fueron 0.1 pg, 1 pg, o 10 pg de cada uno de CP5-CRM 97 y CP8-CRM197 (dosis final de CP-CRMi97 combinado de 0.2 pg, 2 pg, y 20 pg). La dosis del conjugado refleja el componente total de polisacárido del conjugado de polisacárido de proteína. Se extrajo la sangre de los conejos en la semana 0, 3, 6 y 8. Se realizó ELISA en sueros agrupados e individuales. Se determinaron los títulos de anticuerpo finalse como la inversa de la dilución a DO405 0.1. Se realizó un análisis estadístico sobre los títulos de la semana 8 individuales. Los resultados mostraron que los títulos de anticuerpo específico más altos CP5 y CP8 de 5 X 105 para CP5 y 1 X 106 para CP8 se indujeron mediante vacunación de conejos con formulación inmunogénica bivalente a 1 pg de dosis de CP de cada componente (datos no mostrados).

B. Formulación de tres antíqenos (CP5-CRMifl7 + CP8-CRIV + rCIfA) - estudio del intervalo de dosis de rCIfA con dosis fijas (1 ug) de cada conjugado en conejos Se sometió a prueba el efecto de una combinación de conjugados de rCIfA y CP5 y CP8 sobre la respuesta ¡nmunitaria a cada componente. Se inmunizaron tres grupos con CP5-CRM197 + CP8-CRM197 de S. aureus bivalente (1 pg dosis de cada conjugado) combinado con T7-CIÍA (N1 N2N3) a tres dosis diferentes 1 , 10 y 100 pg. El grupo de control se inmunizó con CP5 y CP8 no conjugado (50 pg de cada uno) combinado con 100 pg de T7-CIÍA (N1 N2N3). Cada composición inmunogénica se formuló con 500 pg de adyuvante AIP04. Las composiciones inmunogénicas se administraron mediante inyección subcutánea en el cuello. Se extrajo la sangre de los conejos en la semana 0, 6 y 8. ELISA se realizó sobre sueros agrupados e individuales y se determinaron los tíulos de anticuerpo de punto final como la inversa de la dilución DO405 0.1.

Los resultados mostraron que el aumento de la cantidad de rCIfA cuando se combinaba con conjugado bivalente no afectaba a las respuestas de anticuerpos capsulares. Los niveles de anticuerpos frente a ambos serotipos capsulares estaban en el mismo intervalo que en conejos inmunizados con conjugado bivalente solo (datos no mostrados). Los niveles de anticuerpos frente a CP5 y CP8 fueron 2.5 veces más bajos a dosis de 10 (103 K) y 100 pg (106 K) en comparación con 1 pg de dosis de rCIfA (273 K). Se produjo un efecto de refuerzo tras la segunda y tercera inyección. La formulación inmongénica de polisacárido bivalente no conjugado (CP5 + CP8, 50 pg de cada uno) combinada con 100 pg de rCIfA no indujo anticuerpos específicos de CP. La respuesta de anticuerpos específicos de rCIfA no se vio muy afectada por la dosis, cuando los títulos estaban entre 1 X 105 y 1 X 106 tras tres dosis para dosis de 1 , 10 y 100 pg (datos no mostrados). También los niveles de respuseta anti-CIfA logrados cuando se administra con polisacáridos CP5 y CP8 conjugados o no conjugados fueron similares.

EJEMPLO 10 Formulación de tres antígenos - Inmunogenicidad en conejos con altos títulos de Ac frente a CP5. CP8 v ClfA antes de la inmunización La composición inmunogénica estafilocócica va dirigida a poblaciones adultas que tienen anticuerpos preexistentes frente a componentes de superficie de S. aureus. Para estudiar el efecto de anticuerpos preexistentes frente a componentes de formulación inmunogénica sobre la respuseta frente a la formulación inmunogénica, se seleccionaron conejos con altos títulos de anticuerpos anti-CP5, anti-CP8, y anti-CIfA que se adquieren de manera natural. Dos grupos de conejos (n = 6/7) se inmunizaron en la semana 0, 3 y 6 con formulación inmunogénica de tres anticuerpos (CP5-CRM197 (1 pg) y CP8-CRM197 (1 pg) y T7-ClfA (N1 2N3)Y338A (10 pg)). Un grupo se inmunizó con la composición inmunogénica que se formula con 500 pg de AIP04 como adyuvante y el segundo grupo se inmunizó con formulación de composición ¡nmunogénica sin contenido en adyuvante. Las composiciones inmunogénicas se administraron mediante inyección subcutánea. Se extrajo la sangre de los conejos en la sem. 0, 3, 6 y 8. Los títulos de anticuerpo frente a CP5, CP8 y rCIfA se determinaron mediante ELISA como títulos de anticuerpos de punto final en suerpos agrupados e individuales (determinado como la inversa de la dilución a DO405 O.I ).

Los resultados mostraron que los conejos títulos de anticuerpos preexistentes que se inducen mediante infección natural respondían a una formulación ¡nmunogénica trivalente con un aumento en los niveles de anticuerpos frenet a todos los componentes de la formulación ¡nmunogénica CP5, CP8 y rCIfA. Un aumento de niveles de Ac fente a cada antígeno de entre 5 veces y 10 veces se mostró incluso en animales con títulos de anticuerpo de 1x106. La presencia del adyuvante en la formulación ¡nmunogénica dio como resultado títulos de anticuerpo más altos en comparación con el grupo inmunizado sin adyuvante (datos no mostrados).

EJEMPLO 11 Efecto del adyuvante sobre las respuestas frente a componentes de polisacárido de cápsula A. Efecto de dos dosis diferentes de AIPQ4 sobre la respuesta frente a composición inmunogénica de conjugado CP5-CRMic¡7/CP8-CRIv1i97 bivalente en conejos Se estudió el efecto de la dosis del adyuvante AIP04 sobre las respuestas frente a CP5 y CP8 en conejos. Se inmunizaron conejos en la semana 0, 3 y 6 con CP5-CRMi97 + CP8-CRM197 de S. aureus bivalente (1 pg de dosis de cada conjugado). Un grupo (n = 5/grupo) se inmunizó con composición inmunogénica formlada con 125 pg y un segundo grupo con 500 pg de AIP04 como adyuvante. Las composiciones inmunogénicas se administraron mediante inyección subcutánea en el cuello. Se extrajo la sangre de los conejos en la semana 0, 6 y 8 y los anticuerpos anti-capsulares se determinaron mediante ELISA como títulos de anticuerpo de punto final determinados como la inversa de la dilución a DO405 0.1 . Los resultados indicaban que no había ninguna diferencia en respusetas de anticuepos espefícicos de CP8 en conejos inmunizados con o bien 125 pg o bien 500 pg de AIP04. La formulación con 125 pg de adyuvante dio respusetas de anticuerpos frente a CP5 más altas. Asimismo, todos los conejos en el grupo de 125 pg respondieron con respuestas de anticuerpos frente a CP5 más altas, mientras que el grupo de 500 pg de adyuvante, hubo dos conejos con baja respuesta frenet a la formulación.

B. Efecto de AIPO4 sobre la inmunogenicidad de formulación de tres antíqenos Se inmunizaron conejos (NZW, n = 6/7 conejos por grupo) en la semana 0, 3 y 6 con formulación de tres antígenos compuesta por CP5-CRMw (1 pg) y CP8-CRM197 (1 pg) y T7-CIÍA (N1 N2N3)Y338A (10 pg). Un grupo de conejos se inmunizó con formulación inmunogénica con 500 pg de AIP04, un segundo grupo se formuló sin adyuvante, el tercer grupo se inmunizó en la semana 0 con formulación inmunogénica con 500 de pg AIP04 y semanas 3 y 6 con formulación inmunogénica sin adyuvante. Se administraron formulaciones inmunogénicas mediante inyección subcutánea, se extrajo la sangre de los conejos en la semana 0, 3, 6 y 8 y se evaluaron los sueros mediante ELISA específico de antigeno. Los resultados mostraron que la presencia de adyuvante en la formulación inmunogénica no tenía un efecto sobre las respuestas anti-CP5 o anti-CP8 en conejos (datos no mostrados). Los títulos GMT de Ac frente a ambas cápsulas eran comparables. No obstante, se produjo un efecto del adyuvante sobre la respustas de anticuerpos específicos de ClfA que se muestra en grupos inmunizados con adyuvante presente en las tres vacunaciones. La segunda y tercera inmunización de refuerzo con formulación inmunogénica que no contenía AIP04 en los conejos estimulados con la formulación inmunogénica con contenido en adyuvante dio respuestas frente a ClfA más altas en comparación con el grupo sin adyuvante.

EJEMPLOS 12 A 29 Evaluación de CIfA de S. aureus, MntC, CP5-CRMig7 v CP8-CRMig? Los resultados de la evaluación preclínica se describió anteriormente en los ejemplos 12 a 29 de los conjugados de CP5 y CP8, CIfA y MntC. Los ejemplos muestran la eficacia de estos antigenos en modelos animales preclínicos. Los ejemplos también muestran que los anticuerpos generados por los conjugados de CP, CIfA y MntC tienen actividad funcional en ensayos in vitro.

Se usaron dos químicas diferentes para conjugar CP con CRM-I 97, pero no se observó ninguna diferencia en cuanto a la eficacia para los conjugados preparados mediante los procedimientos diferentes. La 0-acetilación de los polisacáridos capsulares mostró que afectaba a la generación de anticuerpos funcionales. La evaluación de una composición inmunogénica combinada que comprende CP5-CRM 97, CP8-CRMi97 y CIfA no mostró ninguna interferencia en los niveles de anticuerpos específicos (Ac) frente a cada componente de la formulación inmunogénica.

Materiales v Procedimientos ELISA Se recubrieron placas de ELISA de microtitulación Maxisorp (Nalge Nunc International, Rochester, NY) 18 horas a 4 °C o durante 90 min a 37 °C con 1 pg/ml de antígeno ClfA en PBS pH 7.5. Las placas se lavaron cinco veces en PBST (1X PBS, 0.1 % de Polysorbate 20) y se bloquearon con leche desnatada al 1 % (p/v) en PBS, con un 0.05 % de Polysorbate 20 durante 1 h a temperatura ambiente. Las placas se lavaron dos veces con PBST, y se diluyeron en serie (3 veces) y se añadieron anti-sueros de conejo de 0, 3, 6 y 8 semanas individuales a las placas y se incubó o bien durante la noche a 4 °C o bien 2 h a 37 °C. Las placas se lavaron dos veces, y se detectaron los anticuerpos primarios unidos con IgG de cabra anti-conejo conjugado con peroxidasa del rábano (1 :1.000 dilución) en PBST. Las placas se incubaron durante 1 h a 37 °C a continuación se lavaron y se revelaron con disolución de sustrato de ABTS-peroxidasa, (KPL, Inc., Gaithersburg, MD), a temperatura ambiente durante aproximadamente 20 minutos. La reacción se detuvo mediante la adición de una disolución de SDS al 1 % (v/v). Se midió la absorbancia a 405 nm en un lector de placas automatizado (Molecular Devices Corporation, Sunnyvale, CA). Los títulos de anticuerpo se expresaron como el recíproco de la dilución en suero más alta con un valor de absorbancia de 0.1. Se usó la prueba de la t de Student usando software JMP (SAS Institute, Cary, NC) para determinar diferencias en títulos de anticuerpo entre los diferentes grupos. Se consideró que una probabilidad de menos de 0.05 indicaba una diferencia estadísticamente significativa.

Modelos murinos de septicemia El modelo murino de septicemia imita una enfermedad transmitida por la sangre. Para la inmunización pasiva, se trataron grupos de 15 ratones Swiss-Webster por vía intraperitoneal (i.p.) con IgG. Veinticuatro horas más tarde se expusieron los ratones a S. aureus 659 a 018 a través de una únia inyección intravenosa (i.v.) (0.1 mi) a través de la vena de la cola. Todos los animales se siguieron durante 14 a 15 días, punto en el cual se sacrificaron todos los ratones restantes.

Para inmunización activa, se inmunizaron ratones con un antígeno a 0, 2 y 4 semanas y se expusieron en la semana 6 por vía intravenosa a S. aureus.

Modelo de endocarditis de conejos de inmunización activa Se inmunizaron conejos blancos adultos de Nueva Zelanda por vía intramuscular 4 veces con 25 pg de antígeno. Un día tras la cirugía, se exponen los animales por vía i.v. a un bolo de S. aureus y se determina el número de las unidades de formación de colonias (ufe) en el tejido del corazón 24 horas tras la exposición.

Bacteriemia murina Se usó un modelo de bacteriemia de 3 horas para determinar el efecto de vacunación sobre los números de bacterias en la fase temprana durante una infección. Los ratones se inmunizaron en las semanas 0, 3, y 6 con un antígeno seguido por exposición i.p. a S. aureus en la semana 8. Se extrajo la sangre de los animales 3 horas más tarde y se sembraron en placa diluciones en serie de sangre para recontar las bacterias.

Modelo de pielonefritis murino El modelo de pielonefritis murino imita la diseminación de S. aureus a partir de la bacteriemia. Se inmunizaron grupos de 10 ratones CD-1 hembra de cuatro semanas de edad a las 0, 3 y 6 semanas con antígeno. Los ratones se expusieron mediante inyección i.p. S. aureus. Cuarenta y ocho horas tras la exposición los ratones se sacrificaron y las bacterias se recontaron en el riñon y la sangre.

Modelo de endocarditis de rata El modelo de endocarditis de rata imita a la endocarditis en el ser humano en la que la colonización tiene lugar después de que una infección transportada por la sangre conduce a una colonización de tejido de corazón dañado. Ratas Sprague-Dawley hembra de cinco semanas de edad (Charles River, Kingston, NY) se inmunizaron en las semanas 0, 2 y 4 con 1 g de conjugado de CP5-CRM197 formuado con 100 de AIP04. Se extrajo la sangre de los animales antes de la vacunación en la semana 0 y al final de la semana 5. Setenta y dos horas más tarde, un catéter (tubo de PE-10) se colocó quirúgicamente a través de la arteria carótida en el ventrículo izquierdo del corazón. La colocación del catéter da como resultado la formación de una vegetación estéril a la que los estafilococos pueden unirse tras la infección. Para evitar infecciones que resultan del procedimiento quirúrgico, los animales se trataron con el antibiótico Baytril (5 mg/kg) en el momento de cirugía y 8 horas tras la cirugía. Cuarenta y ocho horas tras la cirugía, las ratas se expusieron a PFESA0266 (aproximadamente 4 x 108 ufe) o SA315 (aproximadamente 1 x 109 ufe) mediante inyección intraperitoneal. Cuarenta y ocho horas tras la exposición las ratas se sacrificaron y se extrajeron los corazones y ríñones y se colocaron en 3 mi de solución salina tamponada con fosfato (PBS). A continuación se homogeneizaron los órganos con un homogeneizador de tejidos (Kinematica AG, Luzernerstrasse, Alemania) y se llevaron hasta 10 mi con PBS. Los homogeneizados se diluyeron a continuación en seire y se sembraron en placa para el recuento bacteriano.

Monitorización de anticuerpos funcionales usando ensayos de destrucción opsonofaqocitica Las células efectoras diferenciadas a partir de una línea celular (por ejemplo, HL60) o células polimorfonucleares (PMN) aisladas de sangre de donante humano usando una disolución LYMPHOLYTE®-poli (Cedarlane laboratories limited, Ontario, Canadá), de acuerdo con el protocolo del fabricante, pueden usarse para este ensayo. Las células efectoras volvieron a suspenderse en tampón de ensayo (medio de Eagle modificado con contenido en un 1 % de albúmina de suero bovino) a una concentración de aproximadamente 2 X 107 células/ml y se colocaron en una incubadora a 37 °C hasta que estuvieron listas para su uso. Se hizo que la cepa de S. aureus PFESA0266 creciera durante la noche sobre unas placas de agar de soja tríptico. Las células bacterianas se rasparon, se lavaron dos veces y volvieron a suspenderse en tampón de ensayo con un contenido de un 5 % de glicerol a una DO 600 = 1 , lo que es igual a una concentración de aproximadamente 5 X 108 ufc/ml. Unas alícuotas de un mi de la suspensión bacteriana se congelaron y se almacenaron a -40 °C hasta que estuvieron listas para su uso. La suspensión bacteriana congelada se descongeló y se ajustó a una concentración de 106 ufc/ml en tampón de ensayo y se colocó en hielo. El ensayo se realizó usando unas placas de polipropileno de 1 mi de 96 pocilios Deep-Well estériles. Unas diluciones en serie en dos veces de muestras de anticuerpo (50 µ?) se prepararon, a lo que siguió la adición de 300 µ? de tampón de ensayo a la mezcla de anticuerpos. Se añadieron bacterias (50 µ?) a las placas y se colocaron en un agitador rotatorio a 4 °C durante 30 minutos. La etapa de opsonización fue seguida por la adición de 50 µ? de complemento humano (un 1 % de la concentración final). Por último, se añadieron 50 µ? de células efectoras (concentración 107 células/ml) a la placa y la suspensión se mezcló bien mediante pipeteo repetido. Una alícuota de 50 µ? de la suspensión se diluyó 10 veces en serie en una disolución de saponina al 1 % estéril, mediante agitación con vértex para minimizar la aglutinación bacteriana y se colocó sobre una placa de agar de soja tríptico por duplicado. La placa de ensayo se incubó a 37 °C durante 1 hora con un mezclado continuo usando un agitador de tipo bandeja giratoria. Al final de la incubación, una alícuota de 50 µ? de suspensión se diluyó 10 veces en serie en una disolución de saponina al 1 % estéril, se mezcló mediante agitación con vórtex para minimizar la aglutinación bacteriana y se colocó sobre una placa de agar de soja tríptico por duplicado. El porcentaje de destrucción se calculó determinando la razón del número de ufe que sobrevivieron a 60 minutos en pocilios con bacterias, anticuerpos, complemento y células efectoras con respecto al número de ufe que sobrevivieron en tubos carentes de anticuerpos pero con contenido en bacterias, complemento y células efectoras. Los controles con contenido en bacterias, complemento, y sueros se incluyeron para ajusfar cualquier reducción en ufe debida a la aglutinación.

Adsorción de complemento El suero a partir de donantes humanos adsorbido frente a cepas de S. aureus PFESA0266, PFESA0286 y PFESA0270 puede usarse como una fuente de complemento en el ensayo. Se hizo que crecieran unas cepas de S. aureus durante la noche sobre placas de TSA a 37 °C. Las células se rasparon de la placa y volvieron a suspenderse en PBS estéril. Las células bacterianas se centrifugaron a 10.000 rpm durante 10 minutos a 4 °C y el sedimento celular volvió a suspenderse en suero humano para su adsorción.

El suero se incubó con bacterias en un Nutator a 4 °C durante 30 minutos. Las células se centrifugaron, el suero se transfirió a otro tubo con contenido en bacterias y la etapa de adsorción se repitió de nuevo durante 30 minutos. Por último, las células se centrifugaron y el suero se pasó a través de un filtro de 0.2 micrómetros antes de que 0.5 mi de alícuotas se congelaran en nitrógeno líquido.

Procedimiento II - OPA usando células HL-60 Las células HL-60 se diferenciaron de acuerdo con S. Romero-Steiner, y col., Clin Diagn Lab Immunol 4 (4) (1997), págs. 415 a 422. Las células HL-60 recolectadas volvieron a suspenderse en tampón de ensayo (medio de Eagle modificado con contenido en un 1 % de albúmina de suero bovino) a aproximadamente 108 células/ml y se colocaron en una incubadora a 37 °C hasta que estuvieron listas para su uso. Se hizo que S. aureus creciera durante la noche sobre unas placas de agar de soja tríptico. Las células bacterianas se rasparon, se lavaron dos veces y volvieron a suspenderse en tampón de ensayo con un contenido de un 5 % de glicerol a una DO 600 = 1 , lo que es igual a aproximadamente 5 X 108 ufc/ml. Unas alícuotas de un mi de la suspensión bacteriana se congelaron y se almacenaron a -40 °C hasta que estuvieron listas para su uso. La suspensión bacteriana congelada se descongeló y se ajustó a una concentración de 106 ufc/ml en tampón de ensayo y se colocó en hielo. El ensayo se realizó usando unas placas de polipropileno de 1 mi de 96 pocilios Deep-Well estériles. Se prepararon unas diluciones en serie en dos veces de muestras de anticuerpo monoclonal (25 µ?), a lo que siguió la adición de 150 µ? de tampón de ensayo a la suspensión de anticuerpos. Se añadieron bacterias (25 µ?) a las placas y se colocaron en un agitador rotatorio a 4 °C durante 30 minutos seguido por la adición de 25 µ? de complemento humano (un 1 % de la concentración final). Por último, 25 µ? de células HL-60 ( 07 células/ml) se añadieron a la placa y la suspensión se mezcló bien mediante pipeteo repetido. Una alícuota de 25 µ? de la suspensión se diluyó 10 veces en serie en una disolución de saponina al 1 % estéril, se mezcló mediante agitación con vórtex para minimizar la aglutinación bacteriana y se colocó sobre una placa de agar de soja tríptico por duplicado. La placa de ensayo se incubó a 37 °C durante 1 hora con un mezclado continuo usando un agitador de tipo bandeja giratoria. Al final de la incubación, una alícuota de 25 µ? de suspensión se diluyó 10 veces en serie en una disolución de saponina al 1 % estéril, se mezcló mediante agitación con vórtex y se colocó sobre una placa de agar de soja tríptico por duplicado. El porcentaje de destrucción se calculó determinando la razón del número de ufe que sobrevivieron a 60 minutos en pocilios con bacterias, anticuerpos, complemento y células HL-60 con respecto al número de ufe que sobrevivieron en tubos carentes de anticuerpos pero con contenido en bacterias, complemento y células HL-60. Los controles con contenido en bacterias, complemento y AcM se incluyeron para ajusfar cualquier reducción en ufe debida a la aglutinación.

EJEMPLO 12 Demostración de un efecto protector mediante ClfA en modelos animales in vivo Para evaluar si los anticuerpos de conejo policlonales provocados frente a ClfA podían reducir los recuentos de colonias de S. aureus en un modelo murino de septicemia, se usó IgG de conejo anti-CIfA policlonal purificada a dos dosificacioines (0.8 mg y 1.6 mg) en un estudio de inmunización pasiva (figura 13). La exposición de cepa de S. aureus era un aislado clínico reciente, 659 a 018. Ambas dosificacioines de anticuerpo dieron como resultado una reducción significativa de los recuentos de colonias bacterianas en el modelo murino de septicemia (p = 0.0134 para dosis de 1 .8 mg y p = 0.0013 para dosis de 0.8 mg). Este experimento se ha repetido con aislados de S. aureus adicionales con resultados similares (datos no mostrados).

EJEMPLO 13 La inmunización activa con colonización reducida de ClfA del corazón mediante S. Aureus La inmunización activa de los conejos con ClfA dio como resultado la protección en el modelo de endocarditis de conejo. Se encontró una reducción 3-4 log en las ufe de S. aureus recuperadas de vegetaciones cardíacas para animales inmunizados con CIfA en comparación con los animales inmunizados con el control negativo (PBS o AIP04) (figura 14).

EJEMPLO 14 Efecto protector de MntC en modelos animales in vivo La inmunización activa con MntC ha mostrado una protección consistente de ratones frente a puntos de tiempo tempranos tras la exposición de S. aureus. Los recuentos de bacterias en la sangre de ratones que recibieron exposición i.p. de S. aureus se redujeron significativamente en comparación con los controles inmunizados con PBS (figuras 15A y 15B). Cuatro de entre seis estudios individuales mostraron una reducción significativa en ufc/ml de sangre en animales inmunizados. La protección mediada por inmunización con MntC se mostró usando 2 cepas diferentes de exposición de S. aureus, PFESA0237 (figura 15A) y PFESA0266 (figura 15B).

EJEMPLO 15 Los conjugados de CP5 en modelo de pielonefritis murino Los conjugados de CP5 se evaluaron para determinar su capacidad para proteger a ratones en un modelo de inmunización activa de pielonefritis. La figura 16 muestra los resultados de varios estudios. Los recuentos de bacterias en la sangre de ratones que recibieron exposición i.p. de S. aureus se redujeron significativamente en comparación con controles inmunizados con PBS (figura 16). Seis de entre seis estudios individuales mostraron una reducción significativa en ufc/ml de riñones en animales inmunizados. Los datos mostraron una reducción consistente de la colonización del riñon tras la inmunización activa con conjugado de CP5.

EJEMPLO 16 Los conjugados de CP5 preparados mediante diferentes químicas de conjugación protegen a los ratones frente infecciones experimentales Los estudios de inmunización activa en el modelo de pielonefritis murino se llevaron a cabo usando conjugado de CP5 preparado mediante química o bien de PDPH o bien de CDT. Los procedimientos para conjugar CP5 o CP8 con CRMi97 se describieron anteriormente. Los resultados mostraron que ambos conjugados reducen significativamente la colonización en ratones en comparación con los animales inmunizados sham (cuadro 14).

CUADRO 14 Efecto de PDPH frente a la conjugación de CDT en el modelo de pielonefritis Estudio N° Antígenos Cepa/Dosis logUFC/Riñón Significación Estudio 1 Solución salina + AIPO4 PFESA0266 5.53 ± 1.90 — 1 µg de CP5-C Mi97 (PDPH) + AIPO4 2 x 108 3.01 ± 1.83 p < 0.001 1 pg de CP5-CRMi97 (CDT) + AIPO4 1.67 ± 0.23 p < 0.0001 Estudio 2 Solución salina + AIPO4 PFESA0266 6.17 ± 1.76 — 1 VQ de CP5-CRM197 (PDPH) + AIPO4 2.7 x 108 3.06 ± 1.69 p < 0.0001 1 ug de CP5-CRMi97 (CDT) + AIPO4 1.87 ± 0.69 p < 0.0001 EJEMPL0 17 El conjugado de CP5 proteie en un modelo de endocarditis de rata Se llevaron a cabo cuatro estudios con conjugado de CP5-CRMi97 PDPH y un conjugado no reladcionado (PP5-CRMi97) a 1 pg de dosis. Los conjugados de CP5 reducían significativamente la colonización tanto en el corazón como los ríñones en 2 de 3 experimentos en los que la cepa de exposición de tipo 5 era PFESA0266 (cuadro 15). En el tercer estudio, el título anti-CP5 medio geométrico (GMT) era el ma s bajo de los tres experimentos, pero fue sólo ligeramente más bajo que el título en el experimento previo (51.000 frente a 67.000).

CUADRO 15 La inmunización de CP5-CRMi¾7 reduce las ufe en el modelo de endocarditis de rata logUFC Recuperadas Significación GMT Composición Exposición Título de Corazón Riñon Corazón Riñon inmunogénica Cepa/Dosis CP 1 \sg de CP5- PFESA0266 4.34± 1 .78 3.92±1 .73 103.000 CRM197 1 [¡g de PP5- 2.21 x 108 ufe 7.94± 0.78 6.77± 0.79 p < 0.001 p < 0.05 CRM197 1 pg de CP5- PFESA0266 4.43± 2.30 3.109± 2.33 51 .000 CRM197 Solución salina 6.5 x 107 ufe 5.63± 2.48 4.19± 2.05 No No 1 Mg de CP5- PFESA0266 4.01 ± 2.49 3.90± 1 .92 67.000 CRM197 Solución salina 4.0 x 108 ufe 7.52± 1 .38 6.52± 1 .17 p < 0.0002 P < 0.0002 1 pg de CP5- SA315 8.17± 1 .02 6.92± 1 .20 186.000 CRM197 Solución salina 1 x 109 ufe 8.25± 0.60 6.74± 0.95 No No EJEMPLO 18 Conjugados de CP5-CRM197 en un modelo de pielonefritis Se realizaron estudios iniciales que investigaban la eficacia de los conjugados con CP5 de 25 kDa de MW. Las mejoras en el procedimiento de fermentación dieron como resultado la producción del polisacárido de alto MW, que se conjugó con portador de proteína y se sometió a prueba junto con conjugado de CP5 de 25 kDa CP5. Los conjugados que comprenden CP con MW de 25 kDa (bajo MW) y 300 kDa (alto MW) se prepararon usando química de conjugación de CDT y se evaluaron en el modelo de pielonefritis murino. Tres dosis (0.01 , 0.1 y 1 pg) de los conjugados de HMW se sometieron a prueba y se compararon con el CP5-CRMi97 de LMW control y un conjugado no relacionado (PP5-CRMi97) a 1 pg de dosis. Los resultados mostraron una reducción significativa en las UFC de PFESA0266 de S. aureus recuperadas de los ríñones a un 1 pg de dosis. No hubo ninguna diferencia estadística entre la protección frente a conjugados preparados con CP5 de diferente tamaño a la dosis de 1 pg (cuadro 16). La más baja (0.01 pg y 0.1 pg) del conjugado no provocó una respuesta inmunitaria suficiente para reducir significativamente la infección. El experimento se repitió usando un procedimiento de inmunización y de exposición idéntico. En el experimento repetido, sólo la dosis de 1 pg de CP5-CRMi9 de LMW dio como resultado una reducción significativa en la colonización (p = 0.01). La dosis de 1 pg de CP5-CRMi97 de HMW redujo las ufe en ríñones, no obstante la reducción no fue estadísticamente significativa (p = 0.056).

CUADR0 16 Los conjugados de CP5 protegen en un modelo de pielonefritis de ratón Significación Estudio Antígeno Cepa/Dosis logUFC/Riñón (valor de p) 1 pg de PP5-CRM197 5.34 0.0048 1 pg de CP5 de 25 kDa-CRMw 2.94 1 pg de CP5 de 300 kDa-CRM197 1 PFESA0266 1.7 x 108 2.74 0.0056 0.1 pg de CP5 de 300 kDa-CRMi97 97 5.59 0.01 pg de CP5 de 300 kDa-CRMi97 4.70 1 de PP5-CR 197 5.35 i Mg de CP5 de 25 kDa-CRMi97 3.25 0.01 1 de CP5 de 300 kDa-CRMi97 PFESA0266 3.78 0.06 2 1.7 x 108 0.1 pg de CP5 de 300 kDa -CRM197 4.45 0.01 g de CP5 de 300 kDa-CRMi97 6.08 EJEMPLO 19 La O-acetilación de polisacárido es importante para la inducción de una respuesta de anticuerpos protectores frente a formulación inmunoqénica de conjugado de CP5 Para evaluar la importancia de la O-acetilación de CP5, se O-desaceitló el CP5 nativo (dOAc) y se conjugó con CRIv (dOAc-CRMi97) usando química de conjugación de PDPH. La eficacia del conjugado de dOAcCP-CRMi97 se comparó junto con CP5-CRM197 en un modelo de pielonefritis murino. Los resultados mostraron que el conjugado que carece de grupos O-acetilo (dOAc CP5-CRM197) no es eficaz en este modelo tal como se muestra mediante ningún cambio significativo en la colonización bacteriana en los ríñones. Estos datos (cuadro 17) indican que la O-acetilación era importante para la obtención de anticuerpos funcionales frente a CP5.

CUADRO 17 La inmunización con CP5-CRMig7 O-desacetilado no protege a los ratones frente a la colonización del riñon Estudio N° Antígenos Cepa/Dosis logUFC/Riñón Significación Estudio 1 1 Mg de PP5- CRM197 PFESA0266 3.89 ± 2.24 1 Mg de dOAc CP5-CRM197 7 x 108 4.20 ± 1.75 1 Mg de de CP5-CRM197 1.75 ± 0.39 valor de p < 0.008 Estudio 2 Solución salina PFESA0266 5.08 ± 1.96 1 g de dOAc CP5-CRM197 2.4 x 108 5.89 ± 1.29 1 Mg de CP5-CRM197 2.93 ± 2.1 1 valor de p < 0.02 EJEMPLO 20 La inmunización con conjugado de CP8 reduce la muerte en un modelo de septicemia La eficacia de conjugado de CP8-CRM197 se evaluó en el modelo murino de septicemia después de una exposición a S. aureus PFESA0268 (tipo 8). Se inmunizaron de forma activa ratones Swiss Webster (n = 30) mediante inyección subcutánea con 1 pg de CP8-CRM197 y solución salina ambos formulados con 100 pg de AIP04. El estudio mostró una reducción significativa de septicemia (p = 0.0308) en comparación con ratones inmunizados con AIP04 solo. Véase la figura 17.

EJEMPLO 21 Evaluación del CP8 tratado con base y nativo conjugado en el modelo de bacteriemia murino La importancia de los grupos O-acetilo presesntes en el CP8 nativo antes de la conjugación para la inducción de respuestas de anticuerpos funcionales se evaluó para el cojugado de CP8. El polisacárido de CP8 se O-desacetiló en condiciones básicas suaves y tanto RMN como cromatografía ioónica (Cl) confirmaron la ausencia de O-acetilación en CP8 des-O-Ac-CRM 97.

El modelo de bacteriemia murino se usó para evaluar la eficacia de CP8 nativo frente al tratado con base conjugado con CRM197. Se inmunizaron grupos de ratones BALB/c hembra (15/grupo) en las semanas 0, 3 y 6, con 1 pg de CP8 des-O-Ac - CRMi97 o 1 pg de CP8 O-Ac - CRM 97. Se formularon formulaciones inmunogénicas con 22 pg de AIP04. Los animales se expusieron a S. aureus PFESA0003. Tres horas después de la exposición los ratones se sacrificaron y las bacterias se recontaron en la sangre. Los datos mostraron que había una reducción estadísticamente significativa (p = 0.0362) en las ufe bacterianas recuperadas de la sangre de animales inmunizados con conjugado de CP8 nativo sin tratar tal como se determina mediante la prueba de la t de Student (cuadro 18). En animales que se inmunizaron con conjugado de CP8 tratado con base las ufe bacterianas recuperadas de la sangre fueron similares al grupo de control con solución salina.

CUADRO 18 El conjugado de CP8-CRM197 reduce la bacteriemia de S. aureus PFESA0003 en ratones Significación Antígeno Cepa/Dosis logUFC/Sangre (valor de p) Solución salina 4.35 CP8 des-O-Ac - PFESA0003 4.45 CRM197 1 .14 x 108 CP8 O-Ac - CRM197 3.93 0.03 EJEMPLO 22 Confirmación de la importancia de la O-acetilación como epítopo funcional de CP5 mediante OPA usando AcM con especificidades conocidas Se evaluaron anticuerpos monoclonales frente a CP5 con especificidades para CP5 OAc + (CP5-7-1 ), CP5 OAc + /- (CP5-5-1 ) y CP5 OAc- (CP5-6-1) para determinar la actividad de destrucción de OP frente a la cepa de tipo 5 PFESA0266 (cuadro 19). AcM CP8-3-1 específico frente a CP8 OAc + se usó como control negativo. Los resultados mostraron que el AcM CP5-7-1 (CP5 OAc + específico) media la destrucción de ambas cepas de tipo 5 sometidas a prueba. También el AcM CP5-5-1 que reconocían epítopos compartidos tanto por CP5 OAc + como CP5 OAc- mediaban la destrucción de la cepa PFESA0266. El AcM específico para epítopos presentes en el polisacárido CP5 OAc- no mediaba la destrucción de la cepa PFESA0266. Estos resultados indican que los epítopos de O-acetilo en CP5 están implicados en la actividad funcional de anticuerpos específicos de CP5.

CUADRO 19 AcM específicos frente a CP5 O-acetilado (+) y CP5 O- y des-O-Acetilado (+ /-) son opsónicos frente a PFESA0266 de S. aureus (tipo 5) CP8-3-1 (control CP5-5-1 (O-Ac + /-) CP5-6-1 (O-Ac -) CP5-7-1 (O-Ac +) neg.) ( M9) ( M9) ( M9) ( M9) M9 20 10 5 2.5 20 10 5 2.5 20 10 5 2.5 20 10 5 2.5 % de 28 33 30 21 31 46 49 55 -18 -3 -13 -5 destrucción 12 "5 12 "5 Los datos se notificaron como porcentaje de destrucción y se calcularon determinando la razón del número de ufe que sobrevivieron a 60 minutos en pocilios con bacterias, anticuerpos, complemento y células HL-60 con respecto al número de ufe que sobrevivieron en pocilios carentes de anticuerpos pero con contenido en bacterias, complemento y células HL-60.

EJEMPLO 23 Actividad opsónica de anticuerpos ratón que se inducen frente a conjugados de CP5 de alto y bajo MW Sueros de ratones (n = 5) con altos títulos de CP5 en ELISA de grupos de 1 pg de alto peso molecular y bajo peso molecular del ejemplo 18 se compararon para determinar la actividad opsónica usando PFESA0266 de S. aureus. Los resultados de OPA mostraron que ambos conjugados generaban anticuerpos opsónicos en ratones (cuadro 20). Había una tendencia observada de los conjugados de alto MW a provocar anticuerpos opsónicos de títulos más altos. Datos mostrados como un % medio de destrucción ± SEM para 5 sueros de ratón individuales. Los anticuerpos necesitan ser funcionales tal como se mide por la destrucción de bacterias o bien en un modelo de eficacia animal o bien a través de un ensayo de destrucción opsonofagocítica que muestra que los anticuerpos destruyen las bacterias. Puede que la destrucción funcional no se demuestre usando un ensayo que sólo supervisa la generación de anticuerpos únicamente, lo que no es indicativo de la importancia de conjugados de alto peso molecular en cuanto a la eficacia.

CUADRO 20 Los conjugados de CP5 tanto de LMW como HMW provocan anticuerpos opsónicos Antlgeno: 1 pg de CP5-CRM197 (25 kDa) Antígeno: 1 µg de CP5-CRM197 (300 kDa) titulo de OPA sem 0 título de OPA sem 8 título de OPA sem 0 título de OPA sem 8 < 100 400 < 100 6.400 < 100 < 100 < 100 800 < 100 400 < 100 3.200 < 100 3.200 < 100 3.200 < 100 < 100 < 100 3.200 EJEMPLO 24 Actividad opsónica de sueros de ratones inmunizados con conjugados de CP8 nativos y modificados guímicamente Se compararon sueros de ratón seleccionados (n = 5) con altos títulos de CP8 del el estudio en el ejemplo 21 para determinar la actividad opsónica usando la cepa PFESA0005. Los resultados de OPA (cuadro 21 ) muestran que sólo los conjugados preparados mediante la conjugación de CP8 nativo generaban anticuerpos opsónicos nativos en ratones. Es digno de mención que el conjugado de CP8 des-OAc era inmunogénico en ratones pero los anticuerpos generados no eran opsónicos en este ensayo. Los títulos de OPA se notifican como la inversa de la dilución a la que se observó el 40 % de destrucción. Los anticuerpos necesitan ser funcionales tal como se mide por la destrucción de bacterias o bien en un modelo de eficacia animal o bien a través de ensayo de destrucción opsonofagocítica que muestra que los anticuerpos destruyen las bacterias. Puede que la destrucción funcional no se demuestre usando un ensayo que sólo monitoriza la generación de anticuerpos únicamente, lo que no es indicativo de la importancia de la O-acetilación en cuanto a la eficacia.

CUADRO 21 Actividad opsónica de CP8 nativo frente a CP8-CRM197 des-O-Ac CP8-CRM197 des-O-Ac CP8-CR ,97 Titulo de OP Título de OP Titulo de OP Titulo de OP Sem 0 sueros Sem 8 sueros Sem 0 sueros Sem 8 sueros < 50 < 50 50 150 < 50 < 50 < 50 1.350 < 50 < 50 < 50 450 < 50 < 50 < 50 1.350 < 50 < 50 < 50 4.050 EJEMPLO 25 La destrucción de cepas de tipo 8 mediante antisueros de primate no humano de conjugado de CP8 se inhibe mediante la adición de CP8 nativo Para confirmar la especificidad de la actividad de destrucción en los sueros de primates no humanos inmunizados con conjugado de CP8, se realizó un ensayo en presencia de CP8 nativo. El procedimiento de OP II se usó con las siguientes modificaciones. Unas diluciones en serie en dos veces de muestras de anticuerpo (25 µ?) se prepararon, a lo que siguió la adición de o bien 150 µ? (competidor Pn14) o bien 125 µ? (competidor CP8) de tampón de ensayo a la suspensión de anticuerpos. El competidor era el polisacárido de CP8 purificado (CP8 poli) y polisacárido neumocócico no relacionado (Pn 14 poli) se usó como control. Los polisacáridos se añadieron (50 pg) a la suspensión de anticuerpos y la placa se incubó a 4 °C durante 30 minutos con mezclado de extremo sobre extremo. Tras la incubación con polisacáridos, se añadieron bacterias (25 µ?) a las placas y se colocaron en un agitador rotatorio a 4 °C durante 30 minutos seguido por la adición de 25 µ? de complemento humano (un 1 % de la concentración final). Los resultados (cuadro 22) mostraron que la presencia de CP8 nativo en la mezcla de reacción inhibía la destrucción opsonofagocitica de S. aureus tipo 8. Estos resultados confirman que destrucción opsonofagocitica mediante sueros inmunitarios estaba mediada mediante Ac específicos de cápsula.

CUADRO 22 La adición de polisacárido de CP8 inhibe la destrucción opsonofagocitica se S. aureus mediante sueros inmunitarios Mono Muestra de sueros Titulo de OPA Sem 0 < 50 02D133 Sem. 8 4.050 Sem 0 + 20 pg de CP8 poli < 50 Sem 8 + 20 pg d eCP8 poli < 50 Sem 0 + 20 pg de PM4 poli < 50 Sem. 8 + 20 pg de Pn 14 poli 4.050 Sem. 0 < 50 A4N122 Sem. 8 4.050 Sem 0 + 20 pg de CP8 poli < 50 Sem 8 + 20 pg de CP8 poli < 50 Sem 0 + 20 pg de Pn 14 poli < 50 Sem 8 + 20 pg e Pn 14 poli 1.350 EJEMPLO 26 Los anticuerpos adquiridos de manera natural frente a CIfA median la destrucción opsonofaqocitica de S. Aureus Los seres humanos en la población están naturalmente expuestos S. aureus y por lo tanto tienen anticuerpos preexistentes frente a esa bacteria en su circulación. Se usaron anticuerpos anti-CIfA purificados de humano y se evaluó si los anticuerpos podrían mediar la destrucción opsónica. Se ha demostrado que los anticuerpos frente a CIfA son opsónicos para el polisacárido capsular de S. aureus (datos no mostrados). Se hizo que la cepa PFESA0266 creciera durante la noche en caldo de Columbia con NaCI al 2 %. Las bacterias se opsonizaron con IgG de ser humano purificada por afinidad frente a CIfA o IgG de ser humano purificado por afinidad frente a antígeno irrelevante (control negativo, proteina de SCP estreptocócica) y se sometió a prueba la actividad opsónica. Se usaron células HL-60 diferenciadas en el ensayo opsonofagocítico a una razón de efector/diana de 100:1. Como control adicional, se incluyó un AcM frente a CP5 en el experimento para mostrar la presencia de CP5 en la superficie. Los resultados son el promedio de dos experimentos independientes. Los anticuerpos específicos frente a CIfA y CP5 mediaron la destrucción opsónica y los anticuerpos específicos de SCP (control negativo) no tenían ninguna actividad en este ensayo.

EJEMPLO 27 El conjugado de CP5-CRMig7 genera anticuerpos opsónicos en primates no humanos (NHP) Para comparar la funcionalidad de conjugados de CP5-CRMi97 de alto frente a bajo peso molecular en NHP, se inmunizaron grupos de cinco monos con dosis de 2 y 20 pg de los conjugados con o sin AIP04 adyuvante. Los monos recibieron la primera y segunda vacunación en el día 0 y 28, respectivamente. Las extracciones de sangre del día 0, 14, 28 y 42 se sometieron a prueba para determinar la actividad de OP. Los resultados se resumen en el cuadro 23. El conjugado de HMW de 20 pg tenía los títulos de OP más altos en comparación con otros grupos. Asimismo, la frecuencia de monos positivos para OP era más alta a ambas dosis de los grupos de alto MW que para los grupos de bajo MW correspondientes. Estos resultados muestran que existe una tendencia del conjugado de CP5-CRM 97 de HMW a provocar mejores respuestas de OP que el conjugado de CP5 de LMW en NHP.

CUADRO 23 OPA de suero de NHP tras la inmunización con conjugados de CP5 Título de OPA (40 % de destrucción) Grupo Mono ID Día 0 Día 14 Día 28 Día 42 20 Mg de A2N053 450 1.350 4.050 4.050 CP5 149N < 100 4.050 4.050 4.050 (HMW) + A4L069 < 100 450 150 < 100 AIP04 0.5 A1 N097 < 100 4.050 1.350 1.350 mg/ml A4L014 < 100 < 100 < 100 < 100 2 pg de 02D125 < 100 150 150 < 100 CP5 A4L081 < 100 150 150 150 (HMW) + A2N055 150 450 150 150 AIP04 0.5 A4N084 < 100 < 100 < 100 < 100 mg/ml A1 N085 < 100 150 450 4.050 A4L084 150 150 < 100 < 100 2 M9 de 97N004 150 450 450 450 CP5 A4L055 < 100 < 100 < 100 < 100 (HMW) 97N123 < 100 < 100 150 150 sin AIP04 225N < 100 < 100 < 100 < 100 20 pg de 02D017 < 100 < 100 < 100 < 100 CP5 A4N100 < 100 150 150 4.050 (LMW) + 257N < 100 < 100 < 100 < 100 AIP04 0.5 A4L046 < 100 < 100 < 100 < 100 mg/ml A1 N098 < 100 150 < 100 < 100 2 M9 de 96N022 150 150 450 150 CP5 02D005 < 100 1.350 450 1.350 (LMW) + 02D1 13 < 100 150 150 < 100 AIPO4 0.5 A2N040 150 150 < 100 < 100 mg/ml A4L056 150 150 < 100 < 100 EJEMPLO 28 Los conjugados de polisacárido de cápsula que comprenden polisacáridos de alto peso molecular muestran una inmunogenicidad aumentada en comparación con los conjugados que comprenden polisacáridos de bajo peso molecular Se llevaron a cabo estudios en primatos no humanos (NHP) para evaluar la inmunogenicidad de diferentes formulaciones de conjugado de cápsula. Se sometieron a prueba dos formulaciones a dos niveles de dosificación diferentes (2 y 20 g). La primear formulación estaba compuesta por un polisacárido de alto peso molecular (HMW) (aproximadamente 130 kDa) conjugado con CRIv . La segunda formulación contenía un polisacárido de bajo peso molecular (LMW) (aproximadamente 25 kDa) conjugado con CRM197. Se vacunaron grupos de cinco primates con una dosis individual de una u otra vacuna y se monitorizaron los títulos inmunitarios antes de la vacunación y dos semanas tras la vacunación. Los títulos de OPA se definieron como la dilución de suero requerida para destruir el 40 % de cepa de S. aureus PFESA0266 en un ensayo de OPA. Los títulos de anticuerpo también se monitorizaron mediante ELISA. Se observó una actividad aumentada para la vacuna de HMW en comparación con la formuilación de LMW (cuadro 24), que se demuestra por un aumento de diez veces en los títulos de anticuerpo para la vacuna de HMW vacuna en comparación con la vacuna de LMW. La tasa de sujetos que responden a OPA para los NHP que recibieron la vacuna de HMW también fue más alta (un 80 % en comparación con un 40 %).

CUADRO 24 Se observa inmunoqenicidad aumentada para vacunas de conjugado de polisacárido de HMW en comparación con vacuna de conjugado de polisacárido de LMW CP5-CRMi97 dosis nivel Media geométrica de Tasa de sujetos que (mcg) por animal PD1* responden a OPA (%)± HMW (125 kDa) 20 32 80 2 21 80 LMW (25 kDa) 20 3 40 2 8 40 * Aumento en veces calculado a partir de título de ELISA de CP5 2 semanas tras la vacunación en comparación con títulos antes de la vacuna. ± Tasa de sujetos que responden calculada a partir de monos que generan un aumento en el título de OPA tras una dosis individual de vacuna 2 semanas tras la vacunación. Cada grupo contenía 5 macacos Rhesus y las vacunas se formularon con AIP04 (250 mcg/dosis) EJEMPLO 29 Formulación de dos antígenos (CP5-CRMi97 v ClfA) - Respuestas en primates no humanos Para evaluar la respuesta inmunitaria a una dosis individual de composiciones inmunogénicas de dos antígenos (CP5-CRM 97 y ClfA) en NHP, se inmunizaron grupos de cinco monos con diferentes dosis de los dos antígenos sin la adición de AIP04. Las extracciones de sangre del día 0, 14, y 28 se sometieron a prueba para determinar la actividad opsnofagocítica (OP) y los títulos de ELISA y los resultados se resumen en el cuadro 24. Los resultados mostraron que la actividad de OP se observaba constantemente en animales inmunizados con CP5 en comparación con un grupo sham CP5. En conjunto, el grupo de 100 g tenía los títulos de ELISA y OP más altos en comparación con otros grupos. No hubo ninguna actividad de destrucción de OP obsersvada con sueros del grupo de CIfA solo. No se observó ninguna interferencia en los grupos a los que se les administraron dosis crecientes de CIfA o CP5. Véase el cuadro 25.

CUADRO 25 Resultados de OPA del estudio de inmunización bivalente en NHP Título de OPA (40 % de destrucción) Grupo N° ID Número Semana: 0 Semana: 2 Semana: 4 A4R054 < 100 150 < 100 180 de CIfA + A4R056 < 100 150 150 20 pg de 130 kDa A4N087 < 100 450 450 CP5 97N152 < 100 450 1.350 A4R027 < 100 1.350 1.350 A4R062 < 100 150 < 100 180 pg de CIfA + 97N149 < 100 150 < 100 2 pg de 130 kDa A4R131 < 100 450 150 CP5 97N025 < 100 450 450 A4N064 < 100 450 450 A4L005 < 100 < 100 < 100 60 g de CIfA + A4R029 < 100 1.350 1.350 20 ¡g de 130 kDa A3N015 < 100 < 100 < 100 CP5 98N021 150 4.050 4.050 A4R137 < 100 < 100 < 100 A1 040 < 100 50 150 60 \jg de ClfA + A2N104 < 100 1.350 < 100 2 [ig 130 de kDa A4L033 < 100 150 < 100 CP5 96N048 < 100 < 100 < 100 A4R032 < 100 < 100 < 100 A4R135 < 100 450 150 A1 N118 < 100 150 150 2 µ? de 130 kDa A4R061 < 100 < 100 1.350 CP5 A4R101 < 100 4.050 1.350 97N137 < 100 1.350 1.350 A4R135 < 100 < 100 < 100 A4N1 15 < 100 150 150 20 de 130 kDa 95N038 < 100 < 100 < 100 CP5 A4N120 < 100 450 450 96N004 < 100 150 150 A4N1 16 < 100 450 450 A3N097 < 100 450 450 100 Mg de 130 kDa A4N108 < 100 1.350 1.350 CP5 98N034 < 100 450 50 99N034 < 100 1.350 4.050 97N057 < 100 < 100 < 100 A4R1 12 150 < 100 150 60 pg de ClfA A4L022 < 100 < 100 < 100 97N100 < 100 < 100 < 100 99N041 150 150 150 Los modelos animales muestran potencial de antiqenos de polisacárido de cápsula de CP5 y CP8 de S. aureus Tanto los conjugados de CP5-CRMi97 como de CP8-CRM 97 indujeron respuestas de anticuerpo especificas de serotipo capsular en ratones, ratas, conejos y primates no humanos (NHP). Los anticuerpos inducidos conjugados eran funcionales en el ensayo de destrucción de opsonofagocitosis funcional in vitro. Se generaron datos para mostrar que la O-Acetilación es importante para la obtención de anticuerpos de protección para tanto CP5 como CP8, y que los grupos O-acetilo son parte de un epítopo reconocido por OPA + AcM frente a CP5. Los AcM que reconocieron CP5 nativo que está O-acetilado son funcionales en OPA y median la destrucción de las bacterias. El conjugado de CP8 indujo anticuerpos funcionales tanto en ratones como en conejos que mediaron la destrucción de cepa de tipo 8 en OPA. La especificidad de destrucción por anticuerpos policlonales o monoclonales se confirmó por la abolición de la destrucción después de la adición del polisacárido nativo homólogo con el ensayo. Los varios modelos de inmunización activa se usaron para mostrar la eficacia preclínica tanto de conjugados de CP5- y de CP8-CRMig7. El conjugado de CP5 mostró eficacia consistente en el modelo de pielonefritis murino y el modelo de endocarditis de rata. La importancia de la O-acetilación de CP5 se confirmó en el modelo de pielonefritis murino, en el que el CP5 des-O-acetilado conjugado con CRM-i97 no protegió a animales frente a infección experimental.

La combinación de los conjugados en una formulación de dos antígenos indujo anticuerpos en ambas cápsulas de CP5 y CP8 y no hubo interferencia con los niveles de anticuerpos específicos inducidos en comparación con inmunizaciones de único antígeno. La combinación de conjugados y CIfA en una formulación de tres antígenos indujo niveles de CP5, CP8 y CIfA alto, y no hubo interferencia con las respuestas de anticuerpo inducidas frente a cualquier antígeno presente en la combinación. Las composiciones inmunogénicas de tres antígenos indujeron respuestas de anticuerpo (Ac) capaces de ser reforzadas para todos los tres componentes en conejos con altos títulos preinmunitarios.

Estos resultados sugieren que CP5 y conjugado de CP8 con CRMig7 deberían incluirse como componentes de formulación inmunogénica de una de composición inmunogénica de S. aureus de protección.

EJEMPLO 30 Requisito de diferentes antíqenos para proteger frente a múltiples S. aureus da lugar a una amplia serie de infecciones variando de infecciones de la piel relativamente leves a infecciones más graves e invasivas tal como endocarditis, fascitis necrotizante, osteomielitis, artritis séptica y neumonía. Cada uno de estos sitios in vivo es único y las bacterias probablemente respondan a las diferencias en los estímulos ambientales alterando sus perfiles de expresión de antígeno a unos más adecuados para la cepa individual para colonizar, crecer y finalmente dar lugar a enfermedad. Tal como se ejemplifica en el ejemplo 12, cepas de S. aureus muestran diversidad de expresión de antígeno in vivo. Es más probable que una composición inmunogénica multicomponente que está compuesta por antígenos diferentes proteja frente a la diversa manifestación de enfermedad causada por S. aureus.

Se mostró ClfA que protegió en una endocarditis y modelos de septicemia de roedor. Se ha informado de que ClfB es importante en la colonización nasal de S. aureus. MntC protegió a ratones en un modelo de bacteriemia murino. El conjugado de CP5 protegió en pielonefritis y endocarditis, y el conjugado de CP8 protegió en pielonefritis y modelos de septicemia de roedor. Estos resultados muestran que una vacuna multicomponente con contenido en estos antígenos protegerá frente a múltiples tipos de enfermedad por S. aureus.

Los modelos animales in vivo aproximan el curso de una infección real y ayudar a esclarecer qué antígenos pueden ser útiles en la protección frente a una enfermedad particular. El cuadro 26 resume resultados a partir de numerosos experimentos realizados en varios modelos in vivo. Se informa de los resultados en cada bloque como cuatro números separados por una barra, por ejemplo, ClfA en un modelo de septicemia tiene los números 27/1/3/31 . El primer número representa el número de expenmentos en los que la inmunización de ClfA produjo un resultado positivo estadísticamente significativa de protección. El segundo número representa el número de experimentos en los que la inmunización de ClfA produjo un resultado positivo de protección que tendió a ser significativo pero que no era estadísticamente significativo. El tercer número representa el número de experimentos en los que la inmunización de ClfA produjo un resultado negativo, pero no fue estadísticamente significativo. El cuarto número es el número total de experimentos realizados. Los primeros tres números deberían sumarse hasta ser iguales al cuarto número.

CUADRO 26 Resumen de protección en modelos animales para antígenos de S. aureus ClfA CP5 CP8 MntC20 Bacteriemia 1/4/0/5 3/0/3/6 1/1/1/3 6/2/5/13 Septicemia 27/1/3/31 1/0/0/1 NT NT Pielonefritis 0/4/2/6 13/1/0/14 NT 1/0/4/525 Endocarditis 3/6/1 /10 3/2/2/7 NT NT NT: No sometido a prueba EJEMPLO 31 Realización de pruebas de varias composiciones inmunoqénicas multiantígeno in vitro e in vivo Varias formulaciones inmunogénicas estafilocócicas multiantígeno con contenido en o bien tres, cuatro o bien cinco antígenos que se seleccionan de los siguientes polipéptidos y/o polisacáridos se someten a prueba para inmunogenicidad y eficacia en varios modelos in vivo: ClfA, ClfB, MntC, CP5- y CP8. Las composiciones inmunogénicas son tal como sigue: (1 ) una composición inmunogénica que comprende: un polipéptido de factor de aglutinación A (ClfA) de S. aureus aislado, un polisacárido capsular de S. aureus aislado de tipo 5 conjugado con CRM197, y un polisacárido capsular de S. aureus aislado de tipo 8 conjugado con CRM197; (2) Una segunda combinación proporciona factor de aglutinación A (ClfA), factor de aglutinación B (ClfB), una MntC aislada, polisacárido capsular de CP5 estafilocócico aislado conjugado con CRM197, y polisacárido capsular de CP8 estafilocócico aislado conjugado con CRM197; (3) Una tercera combinación proporciona una composición inmunogénica que comprende: un polipéptido de factor de aglutinación A (ClfA) de S. aureus aislado, un polipéptido de factor de aglutinación B (ClfB) de S. aureus aislado, o una proteína MntC de S. aureus aislada, un polisacárido capsular de S. aureus aislado de tipo 5 conjugado con CRM197, y un polisacárido capsular de S. aureus aislado de tipo 8 conjugado con CRM197; aislado (4) Una cuarta combinación proporciona una composición inmunogénica que comprende: un polipéptido de factor de aglutinación B (ClfB) de S. aureus aislado, un polisacárido capsular de S. aureus aislado de tipo 5 conjugado con CRM197, y un polisacárido capsular de S. aureus aislado de tipo 8 conjugado con CRMi97; (5) Una quinta combinación proporciona una composición inmunogénica que comprende: un polipéptido de factor de aglutinación B (ClfB) de S. aureus aislado, una proteína MntC de S. aureus aislada, un polisacárido capsular de S. aureus aislado de tipo 5 conjugado con CRM197, y un polisacárido capsular de S. aureus aislado de tipo 8 conjugado con CRMi9 ; y (6) Una sexta combinación proporciona una composición ¡nmunogénica que comprende: un polipéptido de factor de aglutinación A (ClfA) de S. aureus aislado, un polipéptido de factor de aglutinación B (ClfB) de S. aureus aislado, y una proteína MntC de S. aureus aislada. rCIfA y rCIfB se preparan y purifican tal como se describe en el ejemplo 1. MntC se prepara y purifica tal como se describe en el ejemplo 2. CP5 y CP8 aislados se preparan y purifican tal como se describe en el ejemplo 3 y se conjugan con CRM197 tal como se describe en el ejemplo 4.

Más particularmente, los procedimientos que se describen en los ejemplos previos anteriormente se usan para medir la inmunogenicidad y eficacia. Se realizan estudios para determinar si cada uno de los tres, cuatro o cinco componentes, cuando administra solo, o de forma conjunta, induce una respuesta inmunitaria. Estos mismos estudios se usan para determinar si la presencia de uno cualquiera de los cuatro o cinco componentes interfiere o no con la capacidad de cualquiera de los otros tres o cuatro componentes para inducir una respuesta inmunitaria. Además, se realizan estudios para determinar si los cuatro o cinco componentes, cuando se someten a prueba solos, o cuando se someten a prueba de forma conjunta, conferirán protección en cualesquiera uno o más de los modelos animales que se describen anteriormente. Los cuatro o cinco componentes se administran como una dosis individual o como múltiples dosis a un animal, por ejemplo, ratones, ratas, conejos o primates no humanos, tal como se observa en los ejemplos previos anteriores. Se extrae la sangre de los animales y el suero se recoge y se somete a prueba para la presencia de anticuerpos para cada uno de los cuatro o cinco componentes. La presencia de anticuerpos específicos de antígeno se mide mediante cualquier inmunoensayo conocido por los expertos en la técnica, por ejemplo, un ELISA (véanse los ejemplos 1 1 a 29) o una inmonutransferencia de tipo Western (véase el ejemplo 1 ) se usa para evaluar la presencia ausencia de anticuerpos específicos de antígeno. Además, un ensayo opsonofagocítico se usa para determinar si los anticuerpos específicos de antígeno son eficaces en la mediación de la destrucción de los organismos estafilocócicos por células fagocíticas (véanse los ejemplos 1 a 29).

La eficacia in vivo se evalúa también usando cualquier uno o más del animal estudios que se describen anteriormente, tal como, pero sin limitarse a, el modelo de tubo incrustado; el modelo de bacteriemia murino; el modelo de infección en herida; el modelo de pielonefritis murino; el modelo de endocarditis de rata y el modelo murino de septicemia (véanse los ejemplos 1 1 a 30).

EJEMPLO 32 Las combinaciones de antígenos de S. aureus generan anticuerpos en primates no humanos gue potencian la destrucción de la cepa de S.

Aureus Pfe5-1 Se observó una eficacia mejorada, tal como se mide usando el ensayo de OPA, usando combinaciones de antígenos. Se realizó un estudio en primates no humanos se realizó en el que se inmunizaron grupos de 3 a 10 monos con vacunas de múltiples componentes. Los animales recibieron una dosis individual de vacuna y se monitorizaron los títulos de OPA en el día 0 y dos semanas tras la vacunación. Los títulos de OPA se definieron como la dilución de suero requerida para destruir el 50 % de la cepa de S. aureus Pfe5-1 en un ensayo de OPA ensayo. Se observó un aumento de actividad para una combinación de 4 antígenos en comparación con una formuación de vacuna de 3 antígenos (p = 0.0272; figura 18).

Claims

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1.- Una composición inmunogénica que comprende al menos tres componentes que se seleccionan del grupo que consiste en: un polipéptido de factor de aglutinación A (ClfA) de S. aureus aislado, un polipéptido de factor de aglutinación B (ClfB) de S. aureus aislado, una proteína MntC de S. aureus aislada, un polisacárido capsular de S. aureus aislado de tipo 5 conjugado con una proteína de portador, y un polisacárido capsular de S. aureus aislado de tipo 8 conjugado con una proteína de portador.

2. - Una composición inmunogénica que comprende: un polipéptido de factor de aglutinación A (ClfA) de S. aureus aislado, un polisacárido capsular de S. aureus aislado de tipo 5 conjugado con una proteína de portador, y un polisacárido capsular de S. aureus aislado de tipo 8 conjugado con una proteína de portador.

3. - La composición inmunogénica de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada además porque comprende adicionalmente una proteína MntC de S. aureus aislada.

4. - Una composición inmunogénica que comprende: una proteína MntC de S. aureus aislada, un polisacárido capsular de S. aureus aislado de tipo 5 conjugado con una proteína de portador, y un polisacárido capsular de S. aureus aislado de tipo 8 conjugado con una proteína de portador.

5. - La composición inmunogénica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4, caracterizada además porque comprende adicionalmente un polipéptido de factor de aglutinación B (CIfB) de S. aureus aislado.

6. - La composición inmunogénica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizada además porque el polipéptido de ClfA es un fragmento de polipéptido seleccionado del grupo que consiste en un dominio de unión a fibrinógeno; dominios N1 , N2 y N3; y dominios N2 y N3 de ClfA.

7. - La composición inmunogénica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizada además porque el polipéptido de CIfB es un fragmento de polipéptido seleccionado del grupo que consiste en un dominio de unión a fibrinógeno; dominios N1 , N2 y N3; y dominios N2 y N3 de CIfB.

8. - La composición inmunogénica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizada además porque el polipéptido de ClfA se une al fibrinógeno a un nivel reducido en comparación con la unión que se observa a fibrinógeno con ClfA nativo.

9. - La composición inmunogénica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizada además porque el polipéptido de ClfA tiene una sustitución de aminoácidos en uno o más de Tyr 338, Tyr 256, Pro 336, Lys 389, Ala 254 y lie 387.

10.- La composición inmunogénica de conformidad con la reivindicación 9, caracterizada además porque la sustitución de aminoácidos es por Ala o Ser.

1 1 .- La composición inmunogénica de conformidad con la reivindicación 10, caracterizada además porque la Tyr 338 se sustituye por Ala.

12. - La composición inmunogénica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 , caracterizada además porque el polisacárido capsular tipo 5 es un polisacárido capsular de alto peso molecular de entre 20 y 1000 kDa o entre 70 y 300 kDa.

13. - La composición inmunogénica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, caracterizada además porque el polisacárido capsular de tipo 5 está entre un 10 % y un 100 % O-acetilado, entre un 50 y un 100 % O-acetilado o entre un 75 % y un 100 % O-acetilado.

14. - La composición inmunogénica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, caracterizada además porque que el polisacárido capsular de tipo 8 es un polisacárido capsular de alto peso molecular de entre 20 y 1.000 kDa o entre 70 y 300 kDa.

15.- La composición inmunogénica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, caracterizada además porque el polisacárido capsular de tipo 8 está entre un 10 % y un 100 % O-acetilado, entre un 50 y un 100 % O-acetilado o entre un 75 % y un 100 % O-acetilado.

16. - La composición inmunogénica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, caracterizada además porque la proteína de portador es el toxoide C. diphtheriae CRM197.

17. - La composición inmunogénica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, caracterizada además porque la proteína MntC de S. aureus es una proteína lipidada o no lipidada.

18. - La composición inmunogénica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, caracterizada además porque comprende adicionalmente un adyuvante.

19.- La composición inmunogénica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18, caracterizada además porque comprende adicionalmente un portador farmacéuticamente aceptable.

20.- La composición inmunogénica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19, caracterizada además porque comprende adicionalmente un antígeno seleccionado del grupo que consiste en: Opp3a, DltD, HtsA, LtaS, IsdA, IsdB, IsdC, SdrC, SdrD, SdrE, SdrF, SdrG, SdrH, SrtA, SpA, Sbi FmtB, alfa-hemolisina (hla), beta-hemolisina, proteína A de unión a fibronectina (fnbA), proteína B de unión a fibronectina (fnbB), coagulasa, Fig, map, leucocidina Panton-Valentine (pvl), alfa-toxina y sus variantes, gamma-toxina (hlg) y variantes, ica, transportador ABC inmunodominante, transportador Mg2+, transportador ABC de Ni, RAP, autolisina, receptores de laminina, IsaA/PisA, IsaB/PisB, SPOIIIE, SsaA, EbpS, Sas A, SasF, SasH, EFB (FIB), SBI, Npase, EBP, sialoproteína II de unión a hueso, precursor de aureolisina (AUR)/Sepp1 , Cna, y fragmentos de los mismos tal como M55, TSST-1 , mecA, poli-N-acetilglucosamina (PNAG/dPNAG) exopolisacárido, GehD, EbhA, EbhB, SSP-1 , SSP-2, HBP, proteina de unión a vitronectina, HarA, EsxA, EsxB, Enterotoxina A, Enterotoxina B, Enterotoxina C1 , y autolisina novedosa.

21.- El uso de una composición inmunogénica de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20, en la fabricación de un medicamento para la inducción de una respuesta inmunitaria frente a Staphylococcus aureus en un sujeto.

22.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 21 , en donde la respuesta inmunitaria evita o reduce una enfermedad, afección o al menos un síntoma asociado con un organismo estafilocócico en un sujeto.

23. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 22, en donde la enfermedad se selecciona del grupo que consiste en enfermedad invasiva por S. aureus, septicemia y estado de portador.

24. - El uso como el que se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 21 a 23, en donde la respuesta inmunitaria inducida comprende la generación de anticuerpos que tienen actividad opsonofagocítica (OPA) frente a S. aureus.

25.- El uso de una preparación de anticuerpos en la preparación de un medicamento para conferir inmunidad pasiva a un sujeto, en donde dicha preparación de anticuerpos se genera usando una composición inmunogénica de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20.