ES2642076T3 - Composiciones inmunogénicas de antígenos de Staphylococcus aureus - Google Patents

Description

imagen1

imagen2

imagen3

imagen4

imagen5

imagen6

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

polisacárido libre en relación con el polisacárido total. En una realización, el tipo 5 u 8 polisacárido tiene un peso molecular entre 20 kDa y 1.000 kDa.

En una realización, el conjugado tiene un peso molecular de entre aproximadamente 50 kDa y aproximadamente

5.000 kDa. En una realización, el conjugado tiene un peso molecular de entre aproximadamente 200 kDa y aproximadamente 5.000 kDa. En una realización, el conjugado inmunogénico tiene un peso molecular de entre aproximadamente 400 kDa y aproximadamente 2.500 kDa. En una realización, el conjugado inmunogénico tiene un peso molecular de entre aproximadamente 500 kDa y aproximadamente 2.500 kDa. En una realización, el conjugado inmunogénico tiene un peso molecular de entre aproximadamente 600 kDa y aproximadamente 2.800 kDa. En una realización, el conjugado inmunogénico tiene un peso molecular de entre aproximadamente 700 kDa y aproximadamente 2.700 kDa. En una realización, el conjugado inmunogénico tiene un peso molecular de entre aproximadamente 1.000 kDa y aproximadamente 2.000 kDa; de entre aproximadamente 1.800 kDa y aproximadamente 2.500 kDa; de entre aproximadamente 1.100 kDa y aproximadamente 2.200 kDa; de entre aproximadamente 1.900 kDa y aproximadamente 2.700 kDa; de entre aproximadamente 1.200 kDa y aproximadamente 2.400 kDa; de entre aproximadamente 1.700 kDa y aproximadamente 2.600 kDa; de entre aproximadamente 1.300 kDa y aproximadamente 2.600 kDa; de entre aproximadamente 1.600 kDa y aproximadamente 3.000 kDa.

Por consiguiente, en una realización, la proteína de portador dentro del conjugado inmunogénico de la invención es la CRM197, y la CRM197 se une covalentemente con el polisacárido capsular a través de un enlace de carbamato, un enlace de amida, o ambos. El número de residuos de lisina en la proteína de portador que se han conjugado con un polisacárido capsular puede caracterizarse como un intervalo de lisinas conjugadas. Por ejemplo, en una composición inmunogénica dada, la CRM197 puede comprender de 5 a 15 lisinas de entre 39 con enlace covalente con el polisacárido capsular. Otra forma de expresar este parámetro es que de un 12 % a un 40 % de lisinas de CRM197 tienen enlace covalente con el polisacárido capsular. En algunas realizaciones, la parte de CRM197 del polisacárido unido covalentemente a la CRM197 comprende de 5 a 22 lisinas con enlace covalente con el polisacárido. En algunas realizaciones, la parte de CRM197 del polisacárido unido covalentemente a la CRM197 comprende de 5 a 23 lisinas con enlace covalente con el polisacárido. En algunas realizaciones, la parte de CRM197 del polisacárido unido covalentemente a la proteína de portador de comprende de 8 a 15 lisinas con enlace covalente con el polisacárido. En algunas realizaciones, la parte de CRM197 del polisacárido unido covalentemente a la proteína de portador de comprende de 8 a 12 lisinas con enlace covalente con el polisacárido. Por ejemplo, en una composición inmunogénica dada, la CRM197 puede comprender de 18 a 22 lisinas de entre 39 con enlace covalente con el polisacárido capsular. Otra forma de expresar este parámetro es que de un 40 % a un 60 % de lisinas de CRM197 tienen enlace covalente con el polisacárido capsular. En algunas realizaciones, la CRM197 comprende de 5 a 15 lisinas de entre 39 con enlace covalente con el CP8. Otra forma de expresar este parámetro es que de un 12 % a un 40 % de lisinas de CRM197 tienen enlace covalente con el CP8. En algunas realizaciones, la CRM197 comprende de 18 a 22 lisinas de entre 39 con enlace covalente con el CP5. Otra forma de expresar este parámetro es que de un 40 % a un 60 % de lisinas de CRM197 tienen enlace covalente con el CP5.

Tal como se analiza anteriormente, el número de residuos de lisina en la proteína de portador conjugado con el polisacárido capsular puede caracterizarse como un intervalo de lisinas conjugadas, que puede expresarse como una razón molar. Por ejemplo, la razón molar de lisinas conjugadas con respecto a CRM197 en el conjugado inmunogénico de CP8 puede ser de entre aproximadamente 18:1 a aproximadamente 22:1. En una realización, el intervalo de razón molar de lisinas conjugadas con respecto a CRM197 en el conjugado inmunogénico de CP8 puede ser de entre aproximadamente 15:1 a aproximadamente 25:1. En algunas realizaciones, el intervalo de razón molar de lisinas conjugadas con respecto a CRM197 en el conjugado inmunogénico de CP8 puede ser de entre aproximadamente 14:1 a aproximadamente 20:1; de aproximadamente 12:1 a aproximadamente 18:1; de aproximadamente 10:1 a aproximadamente 16:1; de aproximadamente 8:1 a aproximadamente 14:1; de aproximadamente 6:1 a aproximadamente 12:1; de aproximadamente 4:1 a aproximadamente 10:1; de aproximadamente 20:1 a aproximadamente 26:1; de aproximadamente 22:1 a aproximadamente 28:1; de aproximadamente 24:1 a aproximadamente 30:1; de aproximadamente 26:1 a aproximadamente 32:1; de aproximadamente 28:1 a aproximadamente 34:1; de aproximadamente 30:1 a aproximadamente 36:1; de aproximadamente 5:1 a aproximadamente 10:1; de aproximadamente 5:1 a aproximadamente 20:1; de aproximadamente 10:1 a aproximadamente 20:1; o de aproximadamente 10:1 a aproximadamente 30:1. Asimismo, la razón molar de lisinas conjugadas con respecto a CRM197 en el conjugado inmunogénico de CP5 puede ser de entre aproximadamente 3:1 y 25:1. En una realización, el intervalo de razón molar de lisinas conjugadas con respecto a CRM197 en el conjugado inmunogénico de CP5 puede ser de entre aproximadamente 5:1 a aproximadamente 20:1. En una realización, el intervalo de razón molar de lisinas conjugadas con respecto a CRM197 en el conjugado inmunogénico de CP5 puede ser de entre aproximadamente 4:1 a aproximadamente 20:1; de aproximadamente 6:1 a aproximadamente 20:1; de aproximadamente 7:1 a aproximadamente 20:1; de aproximadamente 8:1 a aproximadamente 20:1; de aproximadamente 10:1 a aproximadamente 20:1; de aproximadamente 11:1 a aproximadamente 20:1; de aproximadamente 12:1 a aproximadamente 20:1; de aproximadamente 13:1 a aproximadamente 20:1; de aproximadamente 14:1 a aproximadamente 20:1; de aproximadamente 15:1 a aproximadamente 20:1; de aproximadamente 16:1 a aproximadamente 20:1; de aproximadamente 17:1 a aproximadamente 20:1; de aproximadamente 18:1 a aproximadamente 20:1; de aproximadamente 5:1 a aproximadamente 18:1; de aproximadamente 7:1 a aproximadamente 16:1; o de

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

aproximadamente 9:1 a aproximadamente 14:1.

Otra forma de expresar el número de residuos de lisina en la proteína de portador conjugado con el polisacárido capsular puede ser como un intervalo de lisinas conjugadas. Por ejemplo, en un conjugado inmunogénico de CP8 dado, la CRM197 puede comprender de 5 a 15 lisinas de entre 39 con enlace covalente con el polisacárido capsular. Alternativamente, este parámetro puede expresarse como un porcentaje. Por ejemplo, en un conjugado inmunogénico de CP8 dado, el porcentaje de lisinas conjugadas puede ser de entre un 110 % y un 50 %. En algunas realizaciones, de un 20 % a un 50 % de lisinas puede tener enlace covalente con el CP8. Aún más alternativamente, de un 30 % a un 50 % de lisinas de CRM197 puede tener enlace covalente con the CP8; de un 10 % a un 40 % de lisinas de CRM197; de un 10 % a un 30 % de lisinas de CRM197; de un 20 % a un 40 % de lisinas de CRM197; de un 25 % a un 40 % de lisinas de CRM197; de un 30 % a un 40 % de lisinas de CRM197; de un 10 % a un 30 % de lisinas de CRM197; de un 15 % a un 30 % de lisinas de CRM197; de un 20 % a un 30 % de lisinas de CRM197; de un 25 % a un 30 % de lisinas de CRM197; de un 10 % a un 15 % de lisinas de CRM197; o de un 10 % a un 12 % de lisinas de CRM197 tienen enlace covalente con el CP8. Asimismo, en un conjugado inmunogénico de CP5 dado, la CRM197 puede comprender de 18 a 22 lisinas de entre 39 con enlace covalente con el polisacárido capsular. Alternativamente, este parámetro puede expresarse como un porcentaje. Por ejemplo, en un conjugado inmunogénico de CP5 dado, el porcentaje de lisinas conjugadas puede ser de entre un 40 % y un 60 %. En algunas realizaciones, de un 40 % a un 60 % de lisinas puede tener enlace covalente con el CP5. Aún más alternativamente, de un 30 % a un 50 % de lisinas de CRM197 puede tener enlace covalente con el CP5; de un 20 % a un 40 % de lisinas de CRM197; de un 10 % a un 30 % de lisinas de CRM197; de un 50 % a un 70 % de lisinas de CRM197; de un 35 % a un 65 % de lisinas de CRM197; de un 30 % a un 60 % de lisinas de CRM197; de un 25 % a un 55 % de lisinas de CRM197; de un 20 % a un 50 % de lisinas de CRM197; de un 15 % a un 45 % de lisinas de CRM197; de un 10 % a un 40 % de lisinas de CRM197; de un 40 % a un 70 % de lisinas de CRM197; o de un 45 % a un 75 % de lisinas de CRM197 tienen enlace covalente con el CP5.

La frecuencia de unión de la cadena de polisacárido capsular a una lisina en la molécula portadora es otro parámetro para la caracterización de conjugados de polisacáridos de cápsula. Por ejemplo, en una realización, al menos un enlace covalente entre CRM197 y polisacárido tiene lugar para al menos cada de 5 a 10 unidades de repetición de sacárido del polisacárido capsular. En otra realización, hay al menos un enlace covalente entre CRM197 y polisacárido capsular para cada de 5 a 10 unidades de repetición de sacárido; cada de 2 a 7 unidades de repetición de sacárido, cada de 3 a 8 unidades de repetición de sacárido; cada de 4 a 9 unidades de repetición de sacárido; cada de 6 a 11 unidades de repetición de sacárido; cada de 7 a 12 unidades de repetición de sacárido; cada de 8 a 13 unidades de repetición de sacárido; cada de 9 a 14 unidades de repetición de sacárido; cada de 10 a 15 unidades de repetición de sacárido; cada de 2 a 6 unidades de repetición de sacárido, cada de 3 a 7 unidades de repetición de sacárido; cada de 4 a 8 unidades de repetición de sacárido; cada de 6 a 10 unidades de repetición de sacárido; cada de 7 a 11 unidades de repetición de sacárido; cada de 8 a 12 unidades de repetición de sacárido; cada de 9 a 13 unidades de repetición de sacárido; cada de 10 a 14 unidades de repetición de sacárido; cada de 10 a 20 unidades de repetición de sacárido; cada de 5 a 10 unidades de repetición de sacárido del polisacárido capsular. En otra realización, al menos un enlace entre CRM197 y polisacárido capsular tiene lugar para cada 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, o 20 unidades de repetición de sacárido del polisacárido capsular.

La activación química de los polisacáridos y la conjugación posterior con la proteína de portador pueden obtenerse por medios convencionales. Véanse, por ejemplo, las patentes de los Estados Unidos con n.os 4.673.574 y

4.902.506. Otros procedimientos de activación y de conjugación pueden usarse alternativamente.

“Proteína de portador” o “portador de proteína” tal como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier molécula de proteína que puede conjugarse con un antígeno (tal como los polisacáridos capsulares) frente a la que se desea una respuesta inmunitaria. La conjugación de un antígeno tal como un polisacárido con una proteína de portador puede dar lugar a que el antígeno sea inmunogénico. Las proteínas de portador son preferentemente proteínas que son no tóxicas y no reactogénicas y que pueden obtenerse en suficiente cantidad y pureza. Ejemplos de proteínas portadoras son toxinas, toxoides o cualquier material de reacción cruzada mutante (CRM197) de la toxina a partir de tétanos, difteria, tos ferina, especies Pseudomonas, E. coli, especies de Staphylococcus, y especies de Streptococcus. Las proteínas de portador deberían de poder someterse a procedimientos de conjugación convencionales. En una realización particular de la presente invención, se usa CRM197 como la proteína de portador.

CRM197 (Wyeth/Pfizer, Sanford, NC) es una variante no tóxica (es decir, un toxoide) de toxina diftérica aislada a partir de cultivos de la cepa C7 de Corynebacterium diphtheriae (β197) que se hace crecer en casaminoácidos y en un medio basado en extracto de levadura. CRM197 se purifica a través de ultra-filtración, precipitación de sulfato de amonio, y cromatografía de intercambio iónico. Un cultivo de cepa C7 de Corynebacterium diphtheriae (197), que producen la proteína CRM197, se ha depositado con la Colección Americana de Cultivos Tipo, Rockville, Maryland y se le ha asignado el número de registro ATCC 53281. Otros toxoides diftéricos son también adecuados para su uso como proteínas portadoras.

Otras proteínas portadoras adecuadas incluyen toxinas bacterianas inactivadas tales como toxoide tetánico, toxoide de tos ferina, toxoide del cólera (por ejemplo, tal como se describe en la solicitud de patente internacional WO2004/083251), E. coli LT, E. coli ST, y exotoxina A a partir de Pseudomonas aeruginosa. Pueden también usarse

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

proteínas de la membrana exterior bacteriana tal como el complejo de proteína de la membrana exterior c (OMPC), porinas, proteínas de unión a transferrina, neumolisina, proteína de superficie neumocócica A (PspA), proteína de adhesina neumocócica (PsaA), enterotoxina de C. difficile (toxina A) y citotoxina (toxina B) o proteína de Haemophilus influenzae D. Otras proteínas, tal como ovalbúmina, hemocianina de la lapa californiana (KLH), albúmina de suero bovino (BSA) o derivado de proteína purificado de la tuberculina (PPD) pueden usarse también como proteínas portadoras.

Después de la conjugación del polisacárido capsular con la proteína de portador, los conjugados de polisacáridoproteína se purifican (se enriquecen con respecto a la cantidad de conjugado de polisacárido-proteína) mediante una variedad de técnicas. Estas técnicas incluyen, por ejemplo, operaciones de concentración/diafiltración, precipitación/elución, cromatografía en columna, y filtración profunda. Véanse los ejemplos a continuación.

Después de los conjugados individuales se purifican, éstos pueden combinarse para formular una composición inmunogénica de la presente invención, que puede usarse, por ejemplo, en una vacuna. La formulación de la composición inmunogénica de la presente invención puede llevarse a cabo usando procedimientos reconocidos en la técnica.

Se observa que en la presente divulgación, expresiones tales como “comprende”, “comprendido/a”, “comprendiendo/ que comprende”, “contiene”, “conteniendo/ que contiene” y similares pueden tener el significado que se les atribuye en la ley de patentes de los Estados Unidos; por ejemplo, éstas pueden significar “incluye”, “incluído/a”, “incluyendo/ que incluye” y similares. Tales expresiones se refieren a la inclusión de unos componentes particulares o conjunto de componentes sin excluir cualesquiera otros componentes. Expresiones tales como “consistiendo/ que consiste esencialmente en” y “consiste esencialmente en” tienen el significado que se les atribuye en la ley de patentes de los Estados Unidos, por ejemplo, éstas permiten la inclusión de componentes o etapas adicionales que no restan valor a las características novedosas o básicas de la invención, es decir, éstas excluyen componentes o etapas no mencionados adicionales que restan valor a las características novedosas o básicas de la invención, y éstas excluyen componentes o etapas de la técnica anterior, tal como documentos en la técnica que se indican en el presente documento, especialmente debido a que es un objetivo del presente documento definir unas realizaciones que pueden patentarse, por ejemplo, novedosas, no obvias, de la invención, sobre la técnica anterior, por ejemplo, sobre los documentos que se indican en el presente documento. Y, las expresiones “consiste en” y “consistiendo/ que consiste en” tienen el significado que se atribuye a éstas en la ley de patentes de los Estados Unidos; a saber, que estas expresiones son cerradas. Por consiguiente, estas expresiones se refieren a la inclusión de un conjunto de componentes o un componente particular y a la exclusión de todos los otros componentes.

Una “sustitución de aminoácidos conservativas” se refiere a la sustitución de uno o más de los residuos de aminoácido de una proteína con otros residuos de aminoácido que tienen propiedades físicas y/o químicas similares. Sustitutos para un aminoácido dentro de la secuencia pueden seleccionarse de otros miembros de la clase a la que pertenece el aminoácido. Por ejemplo, los aminoácidos no polares (hidrófobos) incluyen alanina, leucina, isoleucina, valina, prolina, fenilalanina, triptófano y metionina. Aminoácidos con contenido en estructuras de anillo aromático son fenilalanina, triptófano, y tirosina. Los aminoácidos neutrales polares incluyen glicina, serina, treonina, cisteína, tirosina, asparagina, y glutamina. Los aminoácidos con carga positiva (básicos) incluyen arginina, lisinas e histidina. Los aminoácidos con carga negativa (ácidos) incluyen ácido aspártico y ácido glutámico. No se espera que tales alteraciones afecten al peso molecular aparente tal como se determina por electroforesis de gel de poliacrilamida, o punto isoeléctrico. Sustituciones preferidas particulares son: Lys para Arg y viceversa de tal modo que puede mantenerse una carga positiva; Glu para Asp y viceversa de tal modo que puede mantenerse una carga negativa; Ser para Thr de tal modo que puede mantenerse un -OH libre; y Gln para Asn de tal modo que puede mantenerse un NH2 libre.

“Fragmento” se refiere a proteínas en las que solo se incluyen dominios específicos de una proteína más grande. Por ejemplo, proteínas de ClfA y ClfB contienen tantos como 8 dominios cada una si se incluyen las secuencias señal. Se considera que cada uno de un polipéptido que se corresponde con los dominios N1N2N3, N2N3, N1N2, N1, N2, o N3 son fragmentos de ClfA o ClfB. “Fragmento” también se refiere a o bien una proteína o bien un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos de al menos 4 residuos de aminoácido (preferentemente, de al menos 10 residuos de aminoácido, de al menos 15 residuos de aminoácido, de al menos 20 residuos de aminoácido, de al menos 25 residuos de aminoácido, de al menos 40 residuos de aminoácido, de al menos 50 residuos de aminoácido, de al menos 60 residuos de aminoácido, de al menos 70 residuos de aminoácido, de al menos 80 residuos de aminoácido, de al menos 90 residuos de aminoácido, de al menos 100 residuos de aminoácido, de al menos 125 residuos de aminoácido, o al menos 150 residuos de aminoácido) de la secuencia de aminoácidos de un polipéptido o proteína original o un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos de al menos 10 pares de bases (preferentemente de al menos 20 pares de bases, de al menos 30 pares de bases, de al menos 40 pares de bases, de al menos 50 pares de bases, de al menos 50 pares de bases, de al menos 100 pares de bases, de al menos 200 pares de bases) de la secuencia de nucleótidos del ácido nucleico original.

“Actividad funcional” de un anticuerpo o “anticuerpo funcional”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a un anticuerpo que, en un mínimo, puede unirse específicamente con un antígeno. Funciones adicionales se conocen en la técnica y pueden incluir componentes adicionales del sistema inmunitario que efectúan el aclaramiento o la destrucción del patógeno tal como a través de opsonización, ADCC o citotoxicidad mediada por

imagen7

imagen8

imagen9

imagen10

imagen11

imagen12

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

mediada después de la captación por fagocitos. Hay muchos ejemplos convincentes de esto a partir de estudios que usan antígenos de polisacárido Gram positivos, tal como polisacárido capsular Streptococcus pneumoniae y polisacárido capsular de S. aureus. Véase Lee y col., Crit. Rev. Micro. 29:333 a 349 (2003). Hay menos evidencia de actividad opsónica que se induce mediante antígenos proteicos Gram positivos. La captación por fagocitos se ha observado, pero la destrucción directa ha resultado más difícil de mostrar. Se ha mostrado que los anticuerpos monoclonales frente a proteínas confieren protección frente a exposición de S. aureus en modelos animales de infección; y mecanismos diferentes de destrucción opsonofagocítica puede tener en cuenta la protección observada.

La inducción de anticuerpos que tiene una actividad funcional medible, tal como actividad opsonofagocítica (OPA) es un indicador de si un antígeno particular es útil para la inclusión en las composiciones inmunogénicas de la presente invención. Otros indicadores incluyen pero sin limitarse a expresión de antígeno en la superficie celular durante la expresión in vivo tal como se mide usando anticuerpos específicos de antígeno o la capacidad de los anticuerpos para inhibir/neutralizar función antigénica.

Especies/ cepas

El tipo de cualquier particular hospital o cepa de enfermedad es útil para determinar el origen, el grado de relación clonal y la supervisión de la epidemiología de los brotes. Numerosos procedimientos están disponibles para el timado de cepas de S. aureus. La definición práctica clásica para una especie bacteriana es un grupo de cepas que se caracterizan por mas de un 70 % de hibridización genómica (hibridización genómica ADN-ADN de DDH) y más de un 97 % de identidad de secuencia de gen de ARN ribosómico 16S. Véase Vandamme y col., Microbiol. Rev.

60:407 a 438 (1996). El tipado bacteriófago (BT) es un procedimiento de tipado de cepas de S. aureus en base a su susceptibilidad a lisis por ciertos tipos de fago. Véase Blair y col., Bull. W.H.O. 24:771 a 784 (1961). Este procedimiento antiguo adolece de una falta de reproducibilidad entre laboratorios y un fallo de un 15 a un 20 % al tipar aislados.

Composiciones inmunogénicas de antígeno único frente a multiantígeno

Surge la pregunta de si la composición inmunogénica óptima para proteger frente a una infección de las cepas de S. aureus predominantes debería de estar compuesta por un único componente o múltiples componentes. Numerosos estudios han mostrado que unas composiciones inmunogénicas en base a una única proteína o componente de carbohidrato puede ofrecer alguna protección frente a exposición a una cepa de S. aureus que expresa ese componente en ciertos modelos animales. Es importante destacar que, se ha mostrado también que la protección frente a un único antígeno puede depender de la cepa seleccionada.

Se han investigado proteínas de superficie, tal como adhesinas, como vacunas de único componente. Por ejemplo, ratones inmunizados con ClfA de S. aureus desarrollaron una artritis menos severa que los ratones con una proteína de control. Véase Josefsson y col., J. Infect. Dis. 184:1572 a 1580 (2001). Fragmentos de la adhesina de unión a colágeno (cna) ofrecieron protección en un modelo de septicemia de ratón. Véase Nilsson, y col., J. Clin. Invest., 101:2640 a 2649 (1998). La inmunización de ratones con el dominio A de ClfB podría reducir la colonización nasal en un modelo de ratón. Véase Schaffer y col., Infect. Immun. 74:2145 a 2153 (2006).

Una de las catorce proteínas de secuestro de hierro de S. aureus conocidas como IsdB se está investigando en una formulación inmunogénica monovalente para protección frente a infección por S. aureus. Esta proteína ha mostrado un buen efecto de protección en ratones y una buena inmunogenicidad en primates no humanos. Véase Kuklin y col., Infect. Immun. 74:2215 a 2223 (2006).

Debido al vasto potencial de S. aureus para evolucionar o sustituir a diferentes proteínas para realizar las mismas o similares funciones, la formulación inmunogénica óptima para proteger la mayor cantidad de personas frente a la mayor cantidad de enfermedades por S. aureus es una formulación multiantígeno que comprende 2 o más (por ejemplo, 3, 4, 5, etc.) antígenos adecuadamente seleccionados y presentados en una formulación inmunogénica. En ciertas realizaciones, una composición inmunogénica de la divulgación comprende tres o más antígenos que se seleccionan de un polipéptido de factor de aglutinación A (ClfA) de S. aureus aislado, un polipéptido de factor de aglutinación B (ClfB) de S. aureus aislado, un polisacárido capsular de S. aureus aislado de tipo 5 (CP5) conjugado con una proteína de portador, un polisacárido capsular de S. aureus aislado de tipo 8 (CP8) conjugado con una proteína de portador y una proteína MntC de S. aureus aislada. En ciertas realizaciones, una composición inmunogénica de la divulgación comprende cuatro o más antígenos que se seleccionan de un polipéptido de factor de aglutinación A (ClfA) de S. aureus aislado, un polipéptido de factor de aglutinación B (ClfB) de S. aureus aislado, un polisacárido capsular de S. aureus aislado de tipo 5 (CP5) conjugado con una proteína de portador, un polisacárido capsular de S. aureus aislado de tipo 8 (CP8) conjugado con una proteína de portador y una proteína MntC de S. aureus aislada. En ciertas realizaciones, una composición inmunogénica de la invención comprende un polipéptido de factor de aglutinación A (ClfA) de S. aureus aislado, un polipéptido de factor de aglutinación B (ClfB) de S. aureus aislado, un polisacárido capsular de S. aureus aislado de tipo 5 (CP5) conjugado con una proteína de portador, un polisacárido capsular de S. aureus aislado de tipo 8 (CP8) conjugado con una proteína de portador y una proteína MntC de S. aureus aislada como antígenos.

imagen13

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

serina-aspartato (repetición de SD), que se piensa que abarca la capa de peptidoglicano. La repetición de SD va seguida por una región de extensión de membrana que incluye el motivo LPXTG (SEQ ID n.º: 125) para enlace covalente de la proteína a peptidoglicano. ClfA se describe en la patente de los Estados Unidos con n.o 6.008.341.

La región de unión a ligandos de ClfA que comprende N1N2N3 del dominio A (figura 1) abarca los aminoácidos 40 a

559. Los dominios N de ClfA se han asignado tal como sigue: N1 engloba los residuos 45 a 220; N2 engloba los residuos 229 a 369; y N3 engloba los residuos 370 a 559. Véase Deivanayagam y col. EMBO J. 21:6660 a 6672 (2002). Para facilidad de referencia puede hacerse referencia a los dominios de N1N2N3 como N123, de forma similar puede hacerse referencia a N2N3 como N23. En preparaciones de N1N2N3 recombinante, se ha encontrado que el dominio de N1 es sensible a proteasa y se escinde o hidroliza fácilmente para dejar el N2N3 como un fragmento recombinante de unión a ligandos estable. Véase Deivanayagam y col. EMBO J. 21:6660 a 6672 (2002). La estructura de cristal del fragmento de N2N3 de unión a fibrinógeno de dominio A de ClfA, reveló que tanto N2 como N3 están dominados mediante cadenas beta antiparalelas. Además de las cadenas beta antiparalelas, el dominio de N2 contiene una hélice alfa de vuelta única y dos hélices 310 y el dominio de N3 contiene tres hélices

310. Véase Deivanayagam y col. EMBO J. 21:6660 a 6672 (2002). El alineamiento de secuencia de N2 y N3 revela solo un 13 % de identidad de secuencia y un 36 % de similitud de secuencia a lo largo de sus longitudes. Véase Deivanayagam y col. EMBO J. 21:6660 a 6672 (2002). La topología de los dominios de N2 y de N3 es similar al clásico pliegue de IgG y se ha propuesto que sean variantes novedosas del pliegue de IgG. Véase Deivanayagam y col. EMBO J. 21:6660 a 6672 (2002).

Secuencia de ClfA

El gen para la proteína de factor de aglutinación A, designada ClfA, se ha clonado, secuenciado y analizado en detalle a nivel molecular (McDevitt y col., Mol. Microbiol. 11: 237 a 248 (1994); McDevitt y col., Mol. Microbiol. 16:895 a 907 (1995)). Los identificadores de secuencia para las secuencias de aminoácidos de ClfA a partir de 111 aislados causantes de enfermedades de S. aureus se muestran en la tabla 10. La secuencia de aminoácidos de la longitud total del ClfA silvestre (incluyendo la secuencia señal) a partir de la cepa de S. aureus PFESA0237, se muestra en el SEQ ID n.º: 130. Esta secuencia muestra una tirosina en la posición 338, que se cambia a una alanina en la forma mutada de ClfA. La longitud total del gen que codifica el ClfA silvestre a partir de la cepa de S. aureus PFESA0237, que comprende la región de N123, la región de repetición y la región de anclaje se muestra en el SEQ ID n.º: 131. La secuencia de aminoácidos de las formas mutadas de Y338A de ClfA se muestran en el SEQ ID n.º: 123. No obstante, ha de observarse que el cambio de una tirosina a una alanina, que tiene lugar en el ClfA silvestre en la posición 338 de SEQ ID n.º: 130, y que se designa como Y338A, se muestra en la forma mutada de ClfA, en el SEQ ID n.º: 123 en la posición 310. Además, la forma mutada de ClfA que se muestra en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID n.º: 123 es la forma adulta de ClfA sin la secuencia señal, teniendo en cuenta de este modo la diferencia en cuanto a la posición de esta mutación entre el SEQ ID n.º: 130 y el SEQ ID n.º: 123.

ClfB: Organización de dominio

ClfB es una proteína de S. aureus que tiene actividad de unión a fibrinógeno y desencadena que S. aureus forme grupos en presencia de plasma. ClfB es una proteína de MSCRAMM y muestra la organización de dominio de MSCRAMM característica incluyendo un dominio A que es la región funcional con contenido en el sitio activo para unión a ligandos (por ejemplo, fibrinógeno, fibronectina, elastina, queratina). El dominio A va seguido por una región que está compuesta por repeticiones de serina-aspartato (repetición de SD), que se piensa que abarca la capa de peptidoglicano. La repetición de SD va seguida por una región de extensión de membrana que incluye el motivo LPXTG (SEQ ID n.º: 125) para enlace covalente de la proteína a peptidoglicano. ClfB se describe en el documento WO 99/27109 y en la patente de los Estados Unidos 6.680.195.

The internal organización de ClfB N-terminal dominio A es very similar organización como found en ClfA. El dominio A se compone de tres subdomains N1, N2, y N3. La región de unión a ligandos de ClfB que comprende N1N2N3 del dominio A (figura 1) abarca los aminoácidos 44 a 585. Para facilidad de referencia puede hacerse referencia a los dominios de N1N2N3 como N123, de forma similar puede hacerse referencia a N2N3 como N23. Los dominios N de ClfB se han asignado tal como sigue: N1 engloba los residuos 44 a 197; N2 engloba los residuos 198 a 375; y N3 engloba los residuos 375 a 585. En ClfA, se encontró que la estructura de cristal del dominio A tiene una única versión del pliegue de inmunoglobulina y por analogía puede especularse que el caso para ClfB es el mismo. Véase Deivanayagam y col., EMBO J. 21:6660 a 6672 (2002). Incluso a pesar de que la organización de los dominios A de ClfB y ClfA es similar, la identidad de secuencia es solo de un 26 %. Véase Ni Eidhin y col., Mol. Microbiol. 30:245 a 257 (2002).

Secuencia de ClfB

El gen que codifica ClfB se clasifica como un gen de adhesión de núcleo. Las secuencias de ClfB a partir de 92 cepas de S. aureus asociadas con múltiples estados de enfermedad se resumen en la tabla 11. Secuencias adicionales se obtuvieron a partir de GenBank.

Otras MSCRAMM

Otras MSCRAMM pueden considerarse para su uso en una composición inmunogénica de la presente invención.

imagen14

imagen15

5

10

15

20

25

30

35

40

45

Estructura de CP5 y CP8

La unidad de repetición tanto de CP5 como de CP8 está compuesta por ácido 2-acetamido-2-desoxi-D-mannurónico, 2-acetamido-2-desoxi-L-fucosa y 2-acetamido-2-desoxi-D-fucosa. Véase C. Jones y col., Carbohidr. Res. 340:1097 a 1106 (2005). A pesar de que CP5 y CP8 tienen la misma composición de azúcar, éstos han mostrado que son inmunológicamente distintos. Éstos se diferencian en los enlaces glicosídicos y en el sitio de O-acetilación del ácido urónico. Se observó una N-acetilación incompleta dependiente de cepa de uno de los residuos de FucNAc. Véase Tzianabos y col., PNAS V98: 9365(2001).

Polisacárido de cápsula de S. aureus en una composición inmunogénica

El peso molecular de los polisacáridos de cápsula de S. aureus es una consideración importante para su uso en composiciones inmunogénicas. Los polisacáridos de cápsula de alto peso molecular son capaces de inducir ciertas respuestas inmunitarias de anticuerpo debido a una valencia más alta de los epítopos presentes en la superficie antigénica. Los procedimientos que se describen en el presente documento prevén el aislamiento y la purificación de polisacárido de cápsula de tipo 5 y tipo 8 de mucho más alto peso molecular que los que estaban disponibles anteriormente.

Proteína de unión de saliva/MntC/SitC

Proteína de unión de saliva/MntC/SitC es una proteína de transportador ABC y tiene homólogos en S. epidermidis y

S. aureus. Se hace referencia a ésta en la presente invención como MntC. Esta proteína es una lipoproteina de 32 kDa y se encuentra en la pared de célula bacteriana. Véase Sellman y col., y Cockayne y col., Infect. Immun. 66: 3767(1998). En S. epidermidis, ésta es un componente de un operón regulado por hierro. Muestra una homología considerable con ambas adhesinas incluyendo FimA de S. parasanguis, y con lipoproteinas de una familia de transportadores ABC con unas funciones de transporte de hierro metálico probadas o putativas. (Véase la tabla 12 para cepas de S. aureus y secuencias.)

Proteína MntC de S. aureus

El homólogo de S. aureus de MntC se conoce como proteína de unión de saliva y se dio a conocer en la patente de los Estados Unidos con n.o 5.801.234 y puede incluirse en una composición inmunogénica de la invención. La secuencia de proteína para el homólogo de S. aureus de proteína de unión de saliva/MntC/SitC se encuentra en el número de registro de GenBank NP_371155 para la cepa Mu50 (también se conoce como SAV0631). El identificador de secuencia es SEQ ID n.º: 119. El número de registro para la secuencia de nucleótidos para el genoma completo de la cepa Mu50 es NC_002758.2 (coordenadas 704988-705917).

Proteína SitC de S. epidermidis

El homólogo de S. epidermidis de proteína de unión de saliva/MntC/SitC se conoce como SitC y se dio a conocer en Sellman y col., (Sellman y col., Infect. Immun. octubre de 2005; 73(10): 6591 a 6600). La secuencia de proteína para el homólogo de S. epidermidis de proteína de unión de saliva/MntC/SitC se encuentra en el número de registro de GenBank YP_187886.1 (también se conoce como SERP0290). El identificador de secuencia es SEQ ID n.º: 121.

El número de registro para la secuencia de nucleótidos para el genoma completo de la cepa RP62A, es NC_002976 (coordenadas 293030-293959). Otras moléculas de SitC candidatas pueden derivarse a partir de varias especies de organismos para su uso en una composición inmunogénica de la invención, algunas de las cuales se enumeran en la tabla 1 a continuación.

Tabla 1

Proteína

Especies Cepa de ejemplo Registro de proteína

SitC

S. haemolyticus JCSC1435 BAE03450.1

SitC

S. epidermidis ATCC 12228 AAO04002.1

SitC

S. saprophyticus ATCC 15305 BAE19233.1

SitC

S. xylosus DSM20267 ABR57162.1

SitC

S. carnosus TM300 CAL27186.1

Proteínas de unión a hierro de S. aureus

Otro antígeno candidato potencial para considerarse para su uso en las composiciones inmunogénicas de la invención incluye el determinante B de superficie de hierro de proteína de superficie de S. aureus (IsdB). Esta MSCRAMM se describió por Mazmanian y col. (Mazmanian, SK y col. Proc. Natl. Acad. Sci., USA 99:2293 a 2298 (2002)) y se ha sometido a prueba posteriormente y se muestra eficaz como un candidato de vacuna en un modelo de infección murino y un estudio de inmunogenicidad de macaco Rhesus de Kuklin, y col. (Kuklin, NA, y col. Infection

imagen16

imagen17

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

Las composiciones de la invención pueden estar liofilizadas o en forma acuosa, es decir disoluciones o suspensiones. Las formulaciones líquidas pueden administrarse de forma ventajosa directamente a partir de su forma envasada y son por lo tanto ideales para inyección sin la necesidad de reconstitución en medio acuoso tal como se requiere de otro modo para composiciones liofilizadas de la invención.

La administración directa de composiciones inmunogénicas de la presente invención a un sujeto puede llevarse a cabo mediante la administración parenteral (por vía intramuscular, por vía intraperitoneal, por vía intradérmica, por vía subcutánea, por vía intravenosa, o en el espacio intersticial de un tejido); o mediante administración rectal, oral, vaginal, tópica, transdérmica, intranasal, ocular, auditiva, pulmonar u otra administración mucosa. En una realización preferida, la administración parenteral es mediante inyección intramuscular, por ejemplo, en el muslo o el brazo del sujeto. La inyección puede ser a través de una aguja (por ejemplo, una aguja hipodérmica), pero alternativamente puede usarse una inyección libre de aguja. Una dosis intramuscular típica es de 0,5 ml. Las composiciones de la invención pueden prepararse en varias formas, por ejemplo, para inyección o bien como disoluciones líquidas o bien como suspensiones. En ciertas realizaciones, la composición puede prepararse como un polvo o pulverización para su administración pulmonar, por ejemplo, en un inhalador. En otras realizaciones, la composición puede prepararse como un supositorio u óvulo vaginal, o para su administración nasal, auditiva u ocular, por ejemplo, como una pulverización, gotas, gel o polvo.

Pueden determinarse unas cantidades óptimas de componentes para una composición inmunogénica particular mediante unos estudios convencionales que implican la observación de unas respuestas inmunitarias apropiadas en los sujetos. Siguiendo una vacunación inicial, los sujetos pueden recibir una o varias inmunizaciones de refuerzo separadas de forma adecuada.

Acondicionamiento y Formas farmacéuticas

Las composiciones inmunogénicas de la invención pueden envasarse forma de dosis unitaria o múltiples dosis (por ejemplo, 2 dosis, 4 dosis, o más). Para formas de múltiples dosis, habitualmente pero no necesariamente se prefieren los viales con respecto a las jeringuillas previamente cargadas. Los formatos de múltiples dosis adecuados incluyen pero no se limitan a: de 2 a 10 dosis por recipiente a 0,1 a 2 ml por dosis. En ciertas realizaciones, la dosis es una dosis de 0,5 ml. Véase, por ejemplo, la solicitud de patente internacional WO2007/127668. Las composiciones pueden presentarse en viales u otros recipientes de almacenamiento adecuados, o pueden presentarse en dispositivos de administración cargados previamente, por ejemplo, jeringuillas de un solo componente o múltiples componentes, que pueden suministrarse con o sin agujas. Una jeringuilla habitualmente, pero no necesariamente, contiene una dosis individual de la composición inmunogénica con contenido en conservante de la invención, a pesar de que también se prevén jeringuillas de múltiples dosis, cargadas previamente. De forma similar, un vial puede incluir una dosis individual pero alternativamente puede incluir múltiples dosis.

Los volúmenes de dosificación eficaces pueden establecerse de forma rutinaria, pero una dosis típica de la composición para inyección tiene un volumen de 0,5 ml. En ciertas realizaciones, la dosis se formula para la administración a un sujeto humano. En ciertas realizaciones, la dosis se formula para la administración a un sujeto humano adulto, joven, adolescente, niño o lactante (es decir, no más de un año de edad) y en realizaciones preferidas puede administrarse mediante inyección.

Las composiciones inmunogénicas líquidas de la invención son también adecuadas para reconstituir otras composiciones inmunogénicas que se presentan en forma liofilizada. Cuando una composición inmunogénica va a usarse para tal reconstitución extemporánea, la invención proporciona un kit con dos o más viales, dos o más jeringuillas cargadas preparadas, o uno o más de cada, usándose el contenido de la jeringuilla para reconstituir el contenido del vial antes de la inyección, o viceversa.

Alternativamente, las composiciones inmunogénicas de la presente invención pueden liofilizarse y reconstituirse, por ejemplo, usando uno de una multitud de procedimientos para la liofilización que se conocen bien en la técnica para formar partículas secas, de forma regular (por ejemplo, esférica), tal como microgránulos o esferas, que tienen características de partícula tal como tamaños de diámetro medio que pueden seleccionarse y controlarse variando los procedimientos exactos que se usan para prepararlos. Las composiciones inmunogénicas pueden comprender además un adyuvante que puede prepararse opcionalmente con o estar contenido en partículas secas, de forma regular (por ejemplo, esféricas) separadas tal como microgránulos o esferas. En tales realizaciones, la presente invención proporciona además un kit de composición inmunogénica que comprende un primer componente que incluye una composición inmunogénica seca, estabilizada, que comprende además opcionalmente uno o más conservantes de la invención, y un segundo componente que comprende una disolución acuosa, estéril, para la reconstitución del primer componente. En ciertas realizaciones, la disolución acuosa comprende uno o más conservantes, y puede comprender opcionalmente al menos un adyuvante (véase, por ejemplo, el documento WO2009/109550.

Aún en otra realización, un recipiente del formato de múltiples dosis se selecciona de uno o más del grupo que consiste en, pero sin limitarse a, artículos de vidrio de laboratorio generales, matraces, vasos de precipitados, cilindros graduados, fermentadores, biorreactores, tubos, tuberías, bolsas, jarras, viales, cierres para viales (por

5

15

25

35

45

55

ejemplo, un tapón de caucho, un tornillo en la tapa), ampollas, jeringuillas, jeringuillas de doble cámara o de múltiples cámaras, tapones de jeringuilla, émbolos de jeringuillas, cierres de caucho, cierres de plástico, cierres de vidrio, cartuchos y plumas desechables y similares. El recipiente de la presente invención no está limitado en cuanto al material de fabricación, e incluye materiales tal como vidrio, metales (por ejemplo, acero, acero inoxidable, aluminio, etc.) y polímeros (por ejemplo, termoplásticos, elastómeros, elastómeros termoplásticos). En una realización particular, el recipiente del formato es un vial de vidrio Schott tipo 1 de 5 ml con un tapón de butilo. El experto apreciará que el formato expuesto anteriormente no es de ningún modo una lista exhaustiva, sino que simplemente sirve como guía para el experto con respecto a la variedad de formatos disponibles para la presente invención. Formatos adicionales contemplados para su uso en la presente invención pueden encontrarse en catálogos publicados de vendedores y fabricantes de equipos de laboratorio tal como United States Plastic Corp. (Lima, OH), VWR.

Evaluación de Composiciones inmunogénicas

En una realización, la presente invención proporciona composiciones inmunogénicas que comprenden al menos tres antígenos a partir de un organismo de S. aureus.

Varias pruebas in vitro se usan para evaluar la inmunogenicidad de las composiciones inmunogénicas de la invención. Por ejemplo, un ensayo opsónico in vitro se realiza incubando juntos una mezcla de células estafilocócicas, suero inactivado por calor con contenido en específico anticuerpos para los antígenos en cuestión, y una fuente de complemento exógena. La opsonofagocitosis continúa durante la incubación de células polimorfonucleares (PMN) recién aisladas o células efectoras diferenciadas tal como HL60 y la mezcla anticuerpo/complemento/célula estafilocócica. Las células bacterianas que se recubren con anticuerpo y complemento se destruyen tras la opsonofagocitosis. Las unidades de formación de colonias (ufc) de las bacterias que sobrevivieron que se recuperan de la opsonofagocitosis se determinan colocando en placa la mezcla de ensayo. Se informa de los títulos como el recíproco de la más alta dilución que proporciona un 50 % de destrucción bacteriana, tal como se determina por comparación con controles de ensayo.

Un ensayo ELISA celular completo se usa también para evaluar la inmunogenicidad in vitro y la exposición de superficie del antígeno, en el que la cepa bacteriana de interés (S. aureus) se recubre sobre una placa, tal como una placa de 96 pocillos, y se hace que sueros de prueba a partir de un animal inmunizado reaccionen con las células bacterianas. Si cualquier anticuerpo, específico para el antígeno de prueba, es reactivo con un epítopo de superficie expuesta del antígeno, puede detectarse mediante procedimientos convencionales conocidos por un experto en la técnica.

Cualquier antígeno que muestre la actividad in vitro deseada se prueba a continuación en un modelo de exposición animal in vivo. En ciertas realizaciones, se usan composiciones inmunogénicas en la inmunización de un animal (por ejemplo, un ratón) mediante procedimientos y vías de inmunización conocidos por los expertos en la técnica (por ejemplo, intranasal, parenteral, oral, rectal, vaginal, transdérmica, intraperitoneal, intravenosa, subcutánea, etc.). Siguiendo la inmunización del animal con una composición inmunogénica de Staphylococcus sp. particular, el animal se expone a una Staphylococcus sp. y se somete a ensayo para resistencia frente a la infección por estafilococos.

En una realización, se inmunizan ratones libres de patógeno y se exponen a S. aureus. Por ejemplo, se inmunizan ratones con una o más dosis del antígeno deseado en una composición inmunogénica. Posteriormente, los ratones se exponen a S. aureus y se supervisa la supervivencia a lo largo del tiempo después de la exposición.

Procedimientos de Inmunización

Se proporcionan también procedimientos para immunizar un huésped para evitar infecciones por estafilococos. En una realización preferida, el huésped es un ser humano. Por lo tanto, un huésped o sujeto se administra una cantidad inmunogénica de una composición inmunogénica tal como se describe en el presente documento. Una cantidad inmunogénica de una composición inmunogénica puede determinarse realizando un estudio de respuesta a dosis en el que los sujetos se inmunizan con unas cantidades gradualmente en aumento de la composición inmunogénica y la respuesta inmunitaria se analiza para determinar la dosificación óptima. Los puntos de inicio para el estudio pueden inferirse a partir de datos de inmunización en modelos animales. La cantidad de dosificación puede variar dependiendo de las condiciones específicas del individuo. La cantidad puede determinarse en pruebas de rutina por medios conocidos por los expertos en la técnica. En algunas realizaciones, el procedimiento de inmunización de un huésped para evitar enfermedad, afección o infección por estafilococos comprende un tratamiento en seres humanos, veterinaria, en animales o en la agricultura. Otra realización proporciona un procedimiento de inmunización de un huésped para evitar enfermedad, afección o infección por estafilococos asociada con una Staphylococcus sp. en un sujeto, comprendiendo el procedimiento la generación de una preparación de anticuerpos policlonales o monoclonales a partir de la composición inmunogénica que se describe en el presente documento, y usando dicha preparación de anticuerpos para conferir inmunidad pasiva al sujeto.

Una cantidad inmunológicamente eficaz de la composición inmunogénica en un número apropiado de dosis se administra al sujeto para provocar una respuesta inmunitaria. El individuo tratado no debería de exhibir las manifestaciones clínicas más graves de la infección por estafilococos. La cantidad de dosificación puede variar

imagen18

imagen19

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

(2002).

El alineamiento de secuencia de N2 y N3 revela solo un 13 % de identidad de secuencia y un 36 % de similitud de secuencia a lo largo de sus longitudes. Véase Deivanayagam y col. EMBO J. 21:6660 a 6672 (2002). La topología de los dominios de N2 y de N3 es similar al clásico pliegue de IgG y se ha propuesto que sean variantes novedosas del pliegue de IgG. Véase Deivanayagam y col. EMBO J. 21:6660 a 6672 (2002). Formas recombinantes de ClfA que se usan en las composiciones inmunogénicas que se describen en el presente documento son fragmentos de ClfA que comprenden uno o más de los dominios N, por ejemplo, N1N2N3, N2N3 y se denominan en el presente documento como “ClfA recombinante” o “rClfA”. Además, cualquier rClfA debe ser aquél que mantenga la estructura nativa de los dominios N individuales y epítopos críticos pero que no interfiera con procesos normales del individuo inmunizado después de la administración (es decir, que no se una al fibrinógeno). Estudios mutacionales han mostrado que la mutación de Y338A (N2) eliminaba completamente la unión del fragmento N23 fragmento a fibrinógeno. (Esta posición Y338A se refiere a un cambio de una tirosina a una alanina en la posición 338 en la forma inmadura de la secuencia de polipéptido con la secuencia líder aún unida. Este cambio puede verse en la posición 310 en la forma adulta del polipéptido de ClfA mutado de SEQ ID n.º: 123 que muestra una falta de unión a fibrinógeno). Véase Deivanayagam y col. EMBO J. 21:6660 a 6672 (2002). Por lo tanto, la mutación Y338A se ha adoptado para todos los fragmentos de ClfA en los siguientes estudios.

De forma similar, formas recombinantes de ClfB que se usan en las composiciones inmunogénicas que se describen en el presente documento son fragmentos de ClfB que comprende uno o más de los dominios N, por ejemplo, N1N2N3, N2N3 y a los que se hace referencia en el presente documento como “ClfB recombinante” o “rClfB”. Además, cualquier rClfB debería de ser uno que mantenga la estructura nativa de los dominios N individuales y epítopos críticos pero que no interfiera con los procesos normales de los individuo inmunizados después de la administración (es decir, que no se una a fibrinógeno). (Véase, por ejemplo, Walsh, E.J. y col. Microbiology (2008), 154, 550 a 558).

ClfA y ClfB: Visión de conjunto de la estrategia de clonación

Las diferentes formas de proteína de rClfA que se usan para generar datos de eficacia preclínica incluyen HisClfA(N123); T7ClfA(N123); T7ClfA(N123); Y338A; ClfA(N23) y ClfA(N23)Y338A. Véase la figura 1. El gen ClfA contiene la región A que codifica la secuencia a partir de S. aureus PFESA0237 que se corresponde con residuos 40 a 559. El marco de lectura clonado a partir de S. aureus se fusionó con la etiqueta de His de N-terminal y secuencias de ligador del vector (MRGSHHHHHHGS SEQ ID n.º: 127) junto con tres secuencias de codificación adicionales (KLN) que se introducen en el C-terminal. (Véase a continuación para el procedimiento detallado). La proteína que se expresa a partir de este vector se usó para todos los experimentos a los que se hace referencia como HisClfA(N123).

Las diferentes formas de rClfA se derivaron de la región A (residuos 40 a 559 de ClfA expresados mediante S. aureus PFESA0237 (fila superior). La HisClfA(N123) se expresa usando el promotor T5 contenido en pQE30 y todas las otras formas se expresan usando el sistema de expresión basado en pET de T7.

Dos formas de ClfB (T7ClfB N1N2N3 y ClfB N23) se utilizaron para estudios de animales preclínicos.

Procedimiento de clonación de ClfA

La secuencia de codificación de ClfA que se corresponde con residuos de aminoácido 40 a 559 a partir de la cepa de S. aureus PFESA0237 se clonó y la mutación, Y338A, se introdujo para eliminar la unión a fibrinógeno. El gen ClfA mutado se introdujo en un vector de expresión de ARN polimerasa de T7, pET9a (Novagen) para proporcionar un plásmido, pLP1179. La secuencia de ADN de la región que comprende el promotor T7 y la región de codificación en pLP1179 es SEQ ID:124. El vector de expresión se transformó en BLR(DE3) de E. coli (Novagen) para la producción de ClfA recombinante.

La construcción de T7ClfA(N123)Y338A implicaba varias etapas. Un resumen de las etapas de clonación que se usan para la construcción del plásmido de expresión final, pLP1179 se muestra en la figura 2.

La secuencia de ADN de ClfA presente en pQEClf40 se corresponde con residuos de aminoácido 40 a 559 de ClfA que se clonaron originalmente en el sitio de clonación de BamHI/HindIII de pQE30. Esto crea una fusión de etiqueta de His en el extremo N-terminal de ClfA y la adición de tres residuos en el C-terminal. La región de codificación de ClfA presente en (AmpR) pQEClf40 se subclonó en el vector KanR pET 27b (Novagen) para crear pLP1137. Además la secuencia de ADN de ClfA que se corresponde con residuos de aminoácido 221 a 559 se clonó en el sitio de clonación NdeI-HindIII de pET27b para crear pLP1134. La etiqueta de His de N-terminal de ClfA se sustituyó con el T7 N-terminal subclonando el fragmento de ADN BamHI-BlpI a partir de pQEClf40 en pET9a (Novagen) para crear pLP1153. La secuencia de codificación de T7ClfA(N123) presente en pLP1153 contiene 11 Residuos de aminoácido N-terminal a partir de la etiqueta T7 de pET9a seguido por tres residuos de aminoácido a partir de secuencias de ligador más los tres residuos derivados de ligador C-terminal originalmente presentes en pQE30Clf40. La mutación Y338A se introdujo en lugar primer lugar en la secuencia de codificación de ClfA(N23) de pLP1134 para crear pLP1168. Más tarde un fragmento de ADN de PstI-SnaBI con contenido en la mutación Y338A a partir de ClfA(N23) de pLP1168 se sustituyó en PstI-SnaBI de secuencia de codificación de T7ClfA(N123) de pLP1153 para crear

imagen20

5

10

15

20

25

30

35

40

lectura abierto de rMntC. El segundo conjunto de cebadores se alinean con la secuencia de codificación de rMntC permitiendo amplificar la secuencia que se corresponde con residuos de aminoácido 19 a 309. Sitios de enzimas de restricción se incorporaron en los extremos de 5' de estos cebadores para facilitar la clonificación direccional. Se llevó a cabo una PCR en un Termociclador de Peltier (MJ Research Inc, Walthan, MA) con una Premezcla de ADN Polimerasa TaKaRa PrimeSTAR HS (Takara Bio USA, Madison, WI). El producto de PCR se purificó mediante QIAEX II (Qiagen, Valencia, CA), se escindió con las endonucleasas de restricción apropiadas (New England BioLabs, Ipswich, MA) y se subclonó en el vector de expresión accionado por promotor araBAD pBAD18Cm. Este vector también contiene el péptido señal de la lipoproteina P4 a partir de H. influenza. El producto de PCR de MntC se subclonó en marco en el sentido de 3’ a partir del péptido señal P4 para crear pLP1194. La secuencia de ADN de la región de codificación MntC de pLP1194 se muestra en el SEQ ID n.º: 120. La MntC que se expresa a partir de pLP1194 es una lipoproteina. El ADN plásmido recombinante se secuenció mediante un ABI PRISM BigDyeTM Terminator V.3.1 (Applied Biosystems, Foster City, CA) y la proteína recombinante se expresó en BLR de E. coli (NOVAGEN) para la producción de rMntC lipidada.

Producción y Purificación de MntC Lipidada

Para la producción de MntC lipidada, se hizo que BLR de E. coli/pLP1194 creciera en un medio definido en modo por lote alimentado por glucosa en biorreactores. Cuando el cultivo alcanzó una densidad óptica (DO 600) de aproximadamente 60, la expresión de rMntC se indujo conmutando la alimentación a una mezcla de glucosa y arabinosa. El cultivo se recolectó aproximadamente 24 horas después de la inducción.

Las células se vieron afectadas y se recogió la fracción insoluble. MntC lipidada se encontró asociada con la membranas celulares debido a la modificación de lípido. MntC se extrajo a partir de la fracción de membrana con un detergente (Zwittergent ZW-312). Después de la eliminación del residuo insoluble, se encontró la MntC lipidada en la fracción soluble. La fracción soluble se aplicó a una columna con contenido en una resina de modo de mezclado y se eluyó con un gradiente de sal y pH lineal. Las fracciones con contenido en MntC se identificaron y se agruparon. Se añadió sulfato de amonio al conjunto y el material se aplicó a una columna con contenido en Butyl-Sepharose y se eluyó. Las fracciones con contenido en MntC se identificaron, se desalaron y se cargaron en una columna de intercambio catiónico (SP-Sepharose). Después de la elución con un gradiente de sal, las fracciones con contenido en rMntC se identificaron y se agruparon.

Clonificación de S. aureus MntC no lipidada

La secuencia de ADN empleada para expresar rMntC no lipidada se aisló por amplificación de PCR a partir de pLP1194 plásmido. La secuencia resultante se corresponde con residuos de aminoácido 19 a 309 y no contiene la secuencia señal que dirige la secreción y lipidación. La secuencia de ADN de la región de codificación rMntC de pLP1215 se encuentra en ADN SEQ ID n.º: 120.

Para crear pLP1215, MntC se amplificó mediante PCR a partir de pLP1194. La secuencia de ADN de MntC presente en pLP1215 se corresponde con residuos de aminoácido 19 a 309 y El primer codón para este constructo se introdujo en el cebador directo que se usa en la amplificación del gen. Los cebadores que se usan para PCR también contienen sitios de enzimas de restricción en los extremos de 5’ para facilitar la clonificación direccional (tabla 2). La PCR y purificación del gen amplificado se llevó a cabo tal como se describe anteriormente. Producto de PCR purificado se escindió con las endonucleasas de restricción apropiadas (New England BioLabs, Ipswich, MA) y se subclonó en el promotor vector de expresión accionado por T7 pET28a (Novagen, Madison, WI). El ADN de plásmido recombinante pLP1215 se secuenció mediante un ABI PRISM BigDyeTM Terminator V.3.1 (Applied Biosystems, Foster City, CA) y la proteína recombinante se expresó en BLR(DE3) de ADN de plásmido de E. coli. para pLP1215 se purificó y se usó para transformar E. coli HMS174(DE3) para evaluar la expresión de proteínas.

Tabla 2: Cebadores de MntC.

Constructos de Expresión

Nombre del cebador Secuencia (5'-3')

MntC lipidada

5'SA926-MntCups imagen21

(pLP1194)

3'SA926-MntCdown 5'BamHISA926_MntC imagen22

imagen23

imagen24

5

10

15

20

25

30

35

40

45

(continuación)

SA CP8

CP Purificado Total mg MW (kDa) (g/mol) Proteína (Lowry) % (p/p) NA (barrido de 260nm) % (p/p) O-Acetilo RMN %

6

438 29,0 2,4 2 100

7

179 20,4 0,37 0,12 108

8

101 46,9 Bajo el umbral de detección 0,5 94

9

91 65,1 1,15 2,45 96

10

578 35,5 2,47 0,65 75

Selección de peso molecular de los polisacáridos capsulares

Este análisis cinético muestra que un amplio intervalo de pesos moleculares de polisacáridos de cápsula puede generarse mediante los procedimientos que se describen en el presente documento. Inicialmente, se produjeron unos polisacáridos más grandes mediante las células bacterianas, y posteriormente, un intervalo de peso molecular deseado puede seleccionarse y a continuación purificarse mediante la manipulación del pH y las condiciones de calor de las etapas de calentamiento y de hidrólisis.

El tratamiento térmico del caldo de fermentación de S. aureus era una etapa de proceso entre la fermentación y recuperación de CP. Esta etapa de proceso usa calor para tratar el caldo de pH ajustado durante un periodo especificado. Los fines del tratamiento térmico a un pH bajo eran destruir células, inactivar enterotoxinas, liberar polisacárido unido a célula, y reducir el peso molecular al tamaño deseado. Entre estos fines, la reducción de peso molecular era la menor en términos de tiempo de procesamiento requerido en esta etapa. Por lo tanto, los otros fines se lograron de forma inevitable dentro del plazo de tiempo del tratamiento considerado.

Tratamiento térmico

Se determinaron temperatura y pH condiciones para seleccionar varios intervalos de peso molecular de los polisacáridos de cápsula. El pH del caldo se ajustó con ácido sulfúrico concentrado. A continuación, la temperatura del caldo se elevó hasta el valor fijado. El tiempo de tratamiento térmico empezó en cuanto la temperatura alcanzó el punto fijado. Cuando se alcanzó el tiempo de tratamiento deseado, el caldo se enfrió hasta temperatura ambiente. Se tomaron muestras en procedimiento para determinar la concentración de polisacárido y el peso molecular mediante sistemas de HPLC y SEC-MALLS, respectivamente. Los datos de MW se usaron en el análisis cinético. Los perfiles de MW se determinaron a lo largo del tiempo de CP5 a un pH de 4,0, 4,5 y 5,0 y CP8 a un pH de 3,5, 4,0, y 5,0. Véase las figuras 5A y 5B.

La cinética de hidrólisis ácida suave de polisacáridos se realizó usando purificado CP-5 y CP-8 que se obtiene a partir del procedimiento. La disolución de polisacárido purificado se ajustó al pH deseado para el experimento con ácido sulfúrico. Las muestras se colocaron en un baño de aceite equipado con un sistema de control de la temperatura de precisión. Cada muestra se extrajo a un intervalo de tiempo predeterminado y se extinguió en un cubo de hielo. Al final del experimento, una alícuota de tampón Tris 1 M (pH 7,5) se añadió a la muestra para ajustar el pH de nuevo a aproximadamente 7. Las muestras se analizaron mediante un sistema SEC-MALLS. Los datos de MW se usaron en el análisis cinético. El efecto de la temperatura sobre MW perfiles de CP5 a un pH de 4,5 y CP8 a un pH de 3,5 se determinó a lo largo del tiempo. Véase las figuras 6A y 6B. Este procedimiento de hidrólisis ácida puede implementarse usando el fermentador cultivo o a una fase de purificación intermedia o, tal como se muestra en este caso, usando el polisacárido purificado. Otras etapas de reducción de peso molecular, tal como sonicación o sheer, puede implementarse de forma similar.

Resultados

El efecto de pH tras la reducción de MW en un tratamiento térmico se muestra en las figuras 5A y 5B para CP-5 y CP-8, respectivamente. Puede observarse que un pH más bajo era más eficaz para reducir el tamaño de polisacárido. Los datos también sugieren que CP-5 era más difícil de hidrolizar que CP-8 al mismo pH. Considerando los perfiles de CP8, pueden generarse intervalos de pesos moleculares de entre 300 kDa y 600 kDa usando un pH de 5 a 95 ºC durante entre 15 minutos y 120 minutos. De forma similar, elegir un pH de 4 a 95 ºC durante entre 15 minutos y 120 minutos puede proporcionar unos intervalos de peso molecular de polisacárido CP8 de entre 250 kDa y 450 kDa. Además, elegir un pH de 3,5 a 95 ºC durante entre 15 minutos y 120 minutos puede proporcionar unos intervalos de peso molecular de polisacárido CP8 de entre 120 kDa y 450 kDa.

El efecto de la temperatura sobre la reducción de MW se realizó usando los polisacáridos purificados recuperados a partir del procedimiento de recuperación. Los resultados se muestran en las figuras 6A y 6B. Tal como se muestra, cuanto más alta es la temperatura, más rápida es la velocidad de hidrólisis y más amplio es el intervalo de los pesos moleculares de polisacárido que se produce con el tiempo. El uso de una temperatura más baja, de 55 ºC frente a 95 ºC al mismo pH, produce un intervalo más estrecho de pesos moleculares de polisacárido.

Además, la figura 7 muestra la correlación entre el peso molecular de purificado CP5 y CP8 con el tiempo de

imagen25

5

15

25

35

45

55

seguido por purificación. Después de la introducción de un grupo tiol con contenido en ligador en el polisacárido y un grupo haloacetilo en el portador de proteína CRM197, CP5 de S. aureus y polisacáridos CP8 se unieron al portador de proteína a través de un enlace tioéter. Se introdujeron grupos bromoacetilo en la proteína CRM197 mediante reacción de grupos amina con el éster de N-hidroxisuccimida de ácido bromoacético. Para generar CP tiolado, los grupos carboxilato activados de carbodiimida de ácido N-acetilmannosaminourónico en CP se acoplaron con el grupo hidrazida del ligador heterobifuncional de hidrazida reactiva-sulfhidrilo 3-(2-piridilditio)-propionil-hidrazida (PDPH). Tioles de PDPH-CP tiolado, generados mediante reducción con DTT y purificados mediante SEC en una columna Sephadex G25, reaccionaron con los grupos bromoacetilo de proteína activada dando como resultado enlace covalente de tioéter formado mediante desplazamiento de bromo entre CP y la proteína. Los grupos bromoacetilo sin reaccionar se “taparon” con clorhidrato de cisteamina (clorhidrato de 2-aminoetanotiol). La mezcla de reacción se concentró a continuación y se sometió a diafriltración. Los grupos bromoacetilo no conjugados restantes se taparon con clorhidrato de cisteamina para garantizar que no quedaba ningún grupo bromoacetilo reactivo tras la conjugación. Éste formó un enlace covalente entre el extremo de tiol de cisteamina y el grupo acetilo en el residuo de lisina tras el desplazamiento de bromo.

Tiolación de polisacárido capsular de S. aureus con PDPH

El polisacárido se activó en primer lugar mediante tiolación con PDPH. Se mezcló el polisacárido con una disolución madre de PDPH recién preparada (250 mg/ml en DMSO), una disolución madre de EDAC (90 mg/ml en diH2O), y disolución madre de tampón MES (0,5 M, pH 4,85) para fabricar la disolución final 0,1 M de MES, y 2 y 4 mg CP/ml a la vez que se mantiene a una razón en peso CP:PDPH:EDAC de 1:5:3 para CP 5 y 1:0,6:1,25 para CP 8. Se incubó esta mezcla durante 1 hora a temperatura ambiente y a continuación se dializó frente a un volumen 1000Xde H2O destilada cuatro veces usando un dispositivo de diálisis 3500 MWCO a entre 4 y 8 ºC para eliminar PDPH sin reaccionar. El polisacárido unido a PDPH se hizo DTT 0,2 M y se incubó a temperatura ambiente durante 3 horas o durante la noche a entre 4 y 8 ºC. Se separaron el DTT en exceso así como los productos secundarios de la reacción del sacárido activado mediante SEC usando resina Sephadex G25 y agua destilada como la fase móvil. Las fracciones se sometieron a ensayo mediante el ensayo de DTDP para grupos tiol y se agruparon las fracciones positivas que eluían cerca del volumen vacío de la columna. Se sometió a ensayo el conjunto de fracciones mediante los ensayos de PAHBAH y de O-acetilo para determinar el grado de activación que se expresa como un porcentaje molar de las unidades de repetición con contenido en un grupo tiol (concentración molar de tioles/concentración molar de las unidades de repetición). Se liofilizó el polisacárido activado y se almacenó a -25 ºC hasta que era necesario para la conjugación.

Activación de proteína de portador

Por separado, se activó la proteína de portador mediante bromoacetilación. CRM197 se diluyó hasta 5 mg/ml con NaCl al 0,9 % tamponado con fosfato 10 mM pH 7 (PBS) y a continuación se hizo NaHCO3 0,1 M pH 7,0 usando disolución madre 1 M. El éster de N-hidroxisuccinimida del ácido bromoacético (BAANS) se añadió a una razón CRM197 :BAANS 1:0,25 (p:p) usando una disolución madre de BAANS de DMSO 20 mg/ml. Esta mezcla de reacción se incubó a entre 4 y 8 ºC durante 1 hora a continuación se purificó usando SEC sobre Sephadex G-25. El CRM197 activado purificado se sometió a ensayo mediante el ensayo de Lowry para determinar la concentración de proteína y a continuación se diluyó con PBS hasta 5 mg/ml. Se añadió sacarosa a un 5 % p/vol como un crioprotector y se congeló la proteína activada y se almacenó a -25 ºC hasta que era necesaria para la conjugación.

Reacción de acoplamiento

Una vez se prepararon el polisacárido de cápsula activado y la proteína de portador activada, se combinaron los dos en una reacción de conjugación. Se disolvió el polisacárido tiolado y liofilizado en borato 0,16 M pH 8,95, se mezcló CRM197 bromoacetilado descongelado y agua destilada para fabricar la disolución final de borato 0,1 M, razón 1:1 en p/p de CRM197:CP, y polisacárido 1 mg/ml para CP8 y 2 mg/ml polisacárido para CP5. Se incubó esta mezcla a temperatura ambiente durante entre 16 y 24 horas. Se taparon los grupos bromoacetilo sin reaccionar en la proteína añadiendo clorhidrato de cisteamina en una razón de CRM197:cisteamina de 1:2 (p/p) usando una disolución 135 mg/ml de cisteamina disuelta en borato 0,1 M pH 8,95 y se incubó durante 4 horas a temperatura ambiente. El conjugado de polisacárido de cápsula-CRM197 (conjugado) se purificó mediante diafiltración 50 veces frente a NaCl al 0,9 % usando un ultrafiltro de polietersulfona de 100K.

Los resultados de la reproducibilidad de estudios de tiolación de CP5 y CP8 con PDPH mostraron que el grado de activación de CP5 estaba en el intervalo 11 a 19 % lo que corresponde a aproximadamente una molécula de ligador unida por diez unidades de repetición de CP a una molécula de ligador por cinco unidades de repetición. La activación de CP8 estaba en el intervalo de 12 a 16 %, lo que era muy similar a la activación de CP5.

La bromoacetilación de residuos de lisina de CRM197 fue muy consistente, dando como resultado la activación de 19 a 25 lisinas de las 39 lisinas disponibles. La reacción produjo altos rendimientos de proteína activada.

Conjugación de CP con CRM197 mediante química de conjugación de CDI/CDT

CDI y CDT proporcionan un procedimiento de conjugación de una sola etapa en el que el polisacárido se activa en un entorno anhidro (DMSO) para formar imidazol o restos de carbamato de triazol con restos acilimidazol o aciltriazol

imagen26

(continuación)

Pase

Poli, MW (kDa) Rendimiento de Sac (%) Sacárido libre (%) MW mediante SEC-MALLS (kDa) Lisinas modificadas

3

105 79 3 719 7

4

100 86 2 630 9

5

87 90 3 595 6

Ambas químicas de conjugación producen CP con enlace covalente con proteína de portador. No hubo diferencias significativas en polisacárido de cápsula libre, razón de CP-proteína y rendimientos de conjugados generados 5 mediante estos dos procedimientos.

Ejemplo 5: Diversidad de Secuencia de Fragmentos de polipéptido N1, N2 y N3 de ClfA

En el presente ejemplo se evaluó la heterogeneidad de secuencia de proteína de fragmentos de polipéptido de ClfA N1, N2 y N3 a partir de aislados que dan lugar a enfermedad que se obtienen a partir de varias fuentes. Los genes de ClfA se secuenciaron a partir de las cepas de S. aureus asociadas con múltiples estados patológicos. La

10 información de secuencia a partir de cepas adicionales se obtuvo a partir de GenBank para generar secuencias a partir de cepas relevantes. La tabla 10 enumera diferentes secuencias de ClfA.

El alineamiento de secuencia de proteínas de ClfA a partir de diferentes cepas que dan lugar a enfermedad de S. aureus se muestra en la figura 8A a 8E. Las secuencias de proteína se alinearon usando MUSCLE. Véase Edgar,

R.C. Nucleic Acids Research 32 (5):1792 a 1797 (2004). Los alineamientos se mostraron usando SHOWALIGN.

15 Véase Rice, P. y col., “EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite” Trends in Genetics, 16 (6): 276 a 277 (2000). Muchas de las secuencias se repitieron múltiples veces sin variación. Por motivos de claridad, cada secuencia única se colocó en el alineamiento solo una vez. Véase la figura 8A a 8E. Solo se incluyeron secuencias únicas en el listado de secuencia. Por ejemplo, la secuencia de proteína de ClfA_001 se obtuvo a partir de múltiples cepas diferentes sin variación alguna. Véase la figura 8A a 8E. El número de listado de secuencia para

20 cualquier secuencia puede también obtenerse a partir de la tabla 10: Listados de secuencia y cepas de ClfA. La tabla 10 enumera una cepa a modo de ejemplo que contenía esta misma secuencia de proteína ClfA_001. Esta secuencia se muestra en la primer fila del alineamiento en la figura 8A a 8E. Este alineamiento de secuencias únicas del antígeno de ClfA indica que los polimorfismos se distribuyeron a lo largo de la totalidad de la región A (N1-N2-N3) de ClfA. En algunos casos, para cualquier secuencia de proteína de ClfA única dada, se descubrió más de una

25 secuencia de nucleótidos, que codifica la misma proteína. Solo la secuencia de ADN de aparición más frecuente se incluyó en el listado de secuencia y en la tabla 10. Para ClfA, las siguientes secuencias se dan a conocer en el presente documento y no se encuentran en GenBank: ClfA_003, ClfA_005, ClfA_008, ClfA_009, ClfA_013, ClfA_014, ClfA_015, ClfA_016, ClfA_017, ClfA_018, ClfA_019, ClfA_020, ClfA_021, ClfA_022, ClfA_023, y ClfA_024.

Tabla 10: Listados de secuencia y cepas de ClfA

Cepa a modo de Ejemplo

ADN-ClfA NT SEQ ID n.º: Proteína-ClfA AA SEQ ID n.º: % Identidad a Antígeno

PFESA0131

clfA_001-1 61 clfA_001 62 99

PFESA0074

clfA_002-1 63 clfA_002 64 92

PFESA0072

clfA_003-1 65 clfA_003 66 99

PFESA0159

clfA_004-1 67 clfA_004 68 94

PFESA0154

clfA_005-1 69 clfA_005 70 91

PFESA0096

clfA_006-1 71 clfA_006 72 91

PFESA0269

clfA_007-1 73 clfA_007 74 91

PFESA0081

clfA_008-1 75 clfA_008 76 97

PFESA0005

clfA_009-1 77 clfA_009 78 95

PFESA0139

clfA_010-1 79 clfA_010 80 99

PFESA0237

clfA_011-1 81 clfA_011 82 100

PFESA0157

clfA_012-1 83 clfA_012 84 96

PFESA0069

clfA_013-1 85 clfA_013 86 92

PFESA0002

clfA_014-1 87 clfA_014 88 98

PFESA0147

clfA_015-1 89 clfA_015 90 91

PFESA0094

clfA_016-1 91 clfA_016 92 98

5

10

15

20

25

30

35

(continuación)

Cepa a modo de Ejemplo

ADN-ClfA NT SEQ ID n.º: Proteína-ClfA AA SEQ ID n.º: % Identidad a Antígeno

PFESA0143

clfA_017-1 93 clfA_017 94 97

PFESA0129

clfA_018-1 95 clfA_018 96 99

PFESA0128

clfA_019-1 97 clfA_019 98 92

PFESA0148

clfA_020-1 99 clfA_020 100 91

PFESA0140

clfA_021-1 101 clfA_021 102 98

PFESA0152

clfA_022-1 103 clfA_022 104 91

PFESA0141

clfA_023-1 105 clfA_023 106 96

PFESA0160

clfA_024-1 107 clfA_024 108 94

La filogenia de las secuencias de proteína ClfA se examinó y se construyó un árbol filogenético. Se alinearon las secuencias usando ClustalW. Véase Chenna R, Sugawara H, Koike T, y col. Nucleic Acids Research. 31(13):3497 a3500 (2003). Árboles se muestrearon con reemplazamiento 1.000 veces y demostraron con MEGA 4.0. Véase Tamura K, y col., Molecular Biology & Evolution. 24(8):1596 a 1599 (2007). Los valores de muestreo con reemplazamiento, que se indican en las ramas, son el número de veces que la rama se reprodujo en 1.000 ensayos. Se considera que unos valores menos de 500 (un 50 % de reproducibilidad) están escasamente soportados.

El secuencias de ClfA formas un árbol con 2 ramas principales. Véase la figura 9. La separación de estos dos grupos está muy soportada en la filogenia. Una rama (parte superior) incluye 9 secuencias que están bastante relacionadas entre sí (de un 96 a un 99 % de identidad) pero que están menos relacionadas con el clfA_011 de secuencia de candidato, al que éstas son de un 91 a un 92 % idénticas. El segundo grupo, que incluye clfA_011, es más diverso y la filogenia en este grupo no está tan bien soportada. Estas secuencias de proteína varían de un 93 a un 99 % idénticas entre sí.

Ejemplo 6: Diversidad de Secuencia de Fragmentos de polipéptido N1, N2 y N3 de ClfB

En el presente ejemplo, se evaluó la heterogeneidad de secuencia de proteína de los fragmentos de polipéptido de ClfB N1, N2 y N3 a partir de 92 asilados causantes de enfermedad que se obtienen a partir de varias fuentes. Se secuenciaron genes de ClfB a partir de las cepas de S. aureus asociadas con múltiples estados patológicos. Véase la tabla 11. Información con respecto a cepas adicionales se obtuvo a partir de GenBank para generar secuencias adicionales.

El alineamiento de secuencia de proteínas de ClfB a partir de diferentes cepas que dan lugar a enfermedad de S. aureus se muestra en la figura 10A a 10E. Las secuencias de proteína se alinearon usando MUSCLE. Véase Edgar,

R.C. Nucleic Acids Research 32 (5):1792 a 1797 (2004). Los alineamientos se mostraron usando SHOWALIGN. Véase Rice, P. y col., “EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite” Trends in Genetics, 16 (6): 276 a 277 (2000). Véase la figura 10A a 10E alineamiento de ClfB. Como con ClfA, muchas de las secuencias se repitieron múltiples veces sin variación. Por motivos de claridad, cada secuencia única se colocó en el alineamiento solo una vez. Véase la figura 10A a 10E. Solo se incluyeron secuencias ClfB únicas en el listado de secuencia. Por ejemplo, la secuencia de ClfB_006 se obtuvo a partir de múltiples cepas diferentes sin variación alguna. Esta secuencia se muestra en la primera fila del alineamiento en la figura 10A a 10E. El número de listado de secuencia para cualquier secuencia puede también obtenerse a partir de la tabla 11. Este alineamiento de secuencias únicas representativas del antígeno de ClfB indica que los polimorfismos estaban distribuidos a lo largo de la totalidad de la región A (N1-N2-N3) de ClfB. De forma similar a ClfA, para cualquier secuencia única dada de proteína de ClfB, se descubrió más de una secuencia de nucleótidos que codifica la misma proteína. Solo la secuencia de ADN de aparición más frecuente se incluyó en el listado de secuencia y en la tabla 11. Para ClfB, las siguientes secuencias se dan a conocer en el presente documento y no se encuentran en GenBank: ClfB_001, ClfB_004, ClfB_005, ClfB_010, ClfB_011, ClfB_013, ClfB_014, ClfB_015, ClfB_016, ClfB_017, ClfB_018, ClfB_019, ClfB_020, ClfB_021, ClfB_022, ClfB_023, y ClfB_024. El árbol filogenético se muestra en la figura 11.

Tabla 11: Listados de secuencia y Cepas de ClfB

Cepa a modo de Ejemplo

ADN-ClfB SEQ ID n.º: Proteína-ClfB SEQ ID n.º: % Identidad a Antígeno

PFESA0286

clfB_001-1 15 clfB_001 16 95

PFESA0159

clfB_002-1 17 clfB_002 18 95

RF122

clfB_003-1 19 clfB_003 20 94

PFESA0271

clfB_004-1 21 clfB_004 22 95

(continuación)

Cepa a modo de Ejemplo

ADN-ClfB SEQ ID n.º: Proteína-ClfB SEQ ID n.º: % Identidad a Antígeno

PFESA0081

clfB_005-1 23 clfB_005 24 95

PFESA0080

clfB_006-1 25 clfB_006 26 100

PFESA0270

clfB_007-1 27 clfB_007 28 99

PFESA0269

clfB_008-1 29 clfB_008 30 95

PFESA0145

clfB_009-1 31 clfB_009 32 94

PFESA0069

clfB_010-1 33 clfB_010 34 95

PFESA0002

clfB_011-1 35 clfB_011 36 96

PFESA0128

clfB_013-1 37 clfB_013 38 96

PFESA0129

clfB_014-1 39 clfB_014 40 95

PFESA0136

clfB_015-1 41 clfB_015 42 99

PFESA0139

clfB_016-1 43 clfB_016 44 99

PFESA0140

clfB_017-1 45 clfB_017 46 96

PFESA0141

clfB_018-1 47 clfB_018 48 94

PFESA0144

clfB_019-1 49 clfB_019 50 97

PFESA0150

clfB_020-1 51 clfB_020 52 96

PFESA0152

clfB_021-1 53 clfB_021 54 96

PFESA0156

clfB_022-1 55 clfB_022 56 96

PFESA0163

clfB_023-1 57 clfB_023 58 94

PFESA0211

clfB_024-1 59 clfB_024 60 99

Ejemplo 7: Diversidad de Secuencia De MntC Clones de S. aureus que dan lugar a enfermedad

En el presente ejemplo, se evaluó la heterogeneidad de secuencia de proteína de genes de MntC a partir de 104

5 aislados que dan lugar a enfermedad que se obtienen a partir de varias fuentes. Se secuenciaron genes de MntC a partir de las cepas de S. aureus asociadas con múltiples estados patológicos. Véase la tabla 12. Información con respecto a cepas adicionales se obtuvo a partir de GenBank para generar secuencias de cepas.

El alineamiento de secuencia de proteínas MntC a partir de diferentes cepas que dan lugar a enfermedad de S. aureus se muestra en la figura 12A y 12B. Las secuencias de proteína se alinearon usando MUSCLE. Véase Edgar, 10 R.C. Nucleic Acids Research 32 (5):1792 a 1797 (2004). Los alineamientos se mostraron usando SHOWALIGN. Véase Rice, P. y col., “EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite” Trends in Genetics, 16 (6): 276 a 277 (2000). Véase la figura 12. Como con ClfA, muchos de las secuencias se repitieron múltiples veces sin variación. Por motivos de claridad, cada secuencia única se colocó en el alineamiento solo una vez. Véase la figura

12. Solo se incluyeron secuencias de MntC únicas en el listado de secuencia. Por ejemplo, la secuencia de

15 MntC_001 se obtuvo a partir de diferentes cepas sin variación alguna. Véase la figura 12. Esta secuencia se muestra en la primera fila del alineamiento en la figura 12. El número de listado de secuencia para cualquier secuencia puede también obtenerse a partir de la tabla 12. Solo la secuencia de ADN correspondiente más frecuente se incluyó en el listado de secuencia. Para MntC, las siguientes secuencias se dan a conocer en el presente documento y no se encuentran en GenBank: MntC_002, MntC_006, MntC_007, MntC_008, y MntC_009.

20 Tabla 12: Listados de secuencia y cepas de MntC

Cepa

ADN-MntC SEQ ID n.º: Proteína-MntC SEQ ID n.º: % Identidad a Antígeno

PFESA0129

MntC_001-1 1 MntC_001 2 99

PFESA0142

MntC_002-1 3 MntC_002 4 99

PFESA0139

MntC_003-1 5 MntC_003 6 99

PFESA0286

MntC_006-1 7 MntC_006 8 99

PFESA0136

MntC_007-1 9 MntC_007 10 99

imagen27

Análisis citométrico de flujo

Se hicieron crecer aislados de S. aureus tal como se describe en el procedimiento de modelo de tubo de diálisis de rata. Se bloquearon aproximadamente 107 células bacterianas en tampón de tinción (solución salina equilibrada de Hank con un 10 % de sueros de cabra) durante 1 hora en hielo. Las células bacterianas se centrifugaron durante 5 5 minutos a 10.000 rpm, se retiró el sobrenadante, y se incubaron las células con anticuerpo de ratón o anticuerpo de control de isotipo durante 30 minutos en hielo. Las células se lavaron a continuación y se tiñeron con IgG de cabra anti-ratón conjugado con FITC (Jackson ImmunoResearch) en hielo durante 30 minutos. Se lavaron las bacterias dos veces con tampón de tinción, se fijaron con 2 % paraformaldehído y se adquirieron datos y se analizaron usando citómetro de flujo FACS Caliber y Cell quest software (Becton, Dickinson y Co.). Se recogieron un total de 30.000

10 acontecimientos para cada muestra.

Tabla 13a: Expresión de perfiles de antígeno en aislados de tipo 5 de CP de S. aureus.

Antígeno

CP ClfA MntC

Tiempo [h]

T0 1 4 6 24 72 T0 1 4 6 24 72 T0 1 4 6 24 72

PFESA0266

bacteriemia + - ± + / / + - ± + / / NT NT NT NT NT NT

herida

+ - - - ± + + - ± + + + - ± ± ± ± ±

PFESA0272

bacteriemia + + + + / / + - + + / / - - - - / /

herida

+ - - - + ! + - ± ± ± ! - - - ± ! !

PFESA0094

bacteriemia + - ± + / / + - ± ! / / - - - - / /

herida

+ - - + + + + - - + + + - - - ± ± ±

PFESA0093

bacteriemia + - ± + / / + - ± + / / NT NT NT NT NT NT

herida

+ - - ± + + + - - - ± ± - - - ± ± ±

PFESA0028

bacteriemia + - - + / / + - ± ± / / - - ± ± / /

herida

+ - - - - - + - - ± ± ± - - - ± ± -

PFESA0029

bacteriemia - - ± + / / + - - + / / - - - + / /

herida

- - - - ± ± + - - - - ± - - - ± ± -

/ = Se realizaron experimentos de bacteriemia durante 6 horas ! = el animal murió durante el experimento NT = no sometido a prueba

imagen28

imagen29

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

Cada composición inmunogénica se formuló con 500 μg de adyuvante AlPO4. Las composiciones inmunogénicas se administraron mediante inyección subcutánea en el cuello. Se extrajo la sangre de los conejos en la semana 0, 6 y 8. ELISA se realizó sobre sueros agrupados e individuales y se determinaron los tíulos de anticuerpo de punto final como la inversa de la dilución DO405 0,1.

Los resultados mostraron que el aumento de la cantidad de rClfA cuando se combinaba con conjugado bivalente no afectaba a las respuestas de anticuerpos capsulares. Los niveles de anticuerpos frente a ambos serotipos capsulares estaban en el mismo intervalo que en conejos inmunizados con conjugado bivalente solo (datos no mostrados). Los niveles de anticuerpos frente a CP5 y CP8 fueron 2,5 veces más bajos a dosis de 10 (103 K) y 100 μg (106 K) en comparación con 1 μg de dosis de rClfA (273 K). Se produjo un efecto de refuerzo tras la segunda y tercera inyección. La formulación inmongénica de polisacárido bivalente no conjugado (CP5 + CP8, 50 μg de cada uno) combinada con 100 μg de rClfA no indujo anticuerpos específicos de CP. La respuesta de anticuerpos específicos de rClfA no se vio muy afectada por la dosis, cuando los títulos estaban entre 1 X 105 y 1 X 106 tras tres dosis para dosis de 1, 10 y 100 μg (datos no mostrados). También los niveles de respuseta anti-ClfA logrados cuando se administra con polisacáridos CP5 y CP8 conjugados o no conjugados fueron similares.

Ejemplo 10: Formulación de tres antígenos -Inmunogenicidad en conejos con altos títulos de Ac frente a CP5, CP8 y ClfA antes de la inmunización.

La composición inmunogénica estafilocócica va dirigida a poblaciones adultas que tienen anticuerpos preexistentes frente a componentes de superficie de S. aureus. Para estudiar el efecto de anticuerpos preexistentes frente a componentes de formulación inmunogénica sobre la respuseta frente a la formulación inmunogénica, se seleccionaron conejos con altos títulos de anticuerpos anti-CP5, anti-CP8, y anti-ClfA que se adquieren de manera natural. Dos grupos de conejos (n = 6/7) se inmunizaron en la semana 0, 3 y 6 con formulación inmunogénica de tres anticuerpos (CP5-CRM197 (1 μg) y CP8-CRM197 (1 μg) y T7-ClfA (N1N2N3)Y338A (10 μg)). Un grupo se inmunizó con la composición inmunogénica que se formula con 500 μg de AlPO4 como adyuvante y el segundo grupo se inmunizó con formulación de composición inmunogénica sin contenido en adyuvante. Las composiciones inmunogénicas se administraron mediante inyección subcutánea. Se extrajo la sangre de los conejos en la sem. 0, 3, 6 y 8. Los títulos de anticuerpo frente a CP5, CP8 y rClfA se determinaron mediante ELISA como títulos de anticuerpos de punto final en suerpos agrupados e individuales (determinado como la inversa de la dilución a DO405 0,1).

Los resultados mostraron que los conejos títulos de anticuerpos preexistentes que se inducen mediante infección natural respondían a una formulación inmunogénica trivalente con un aumento en los niveles de anticuerpos frenet a todos los componentes de la formulación inmunogénica CP5, CP8 y rClfA. Un aumento de niveles de Ac fente a cada antígeno de entre 5 veces y 10 veces se mostró incluso en animales con títulos de anticuerpo de 1x106. La presencia del adyuvante en la formulación inmunogénica dio como resultado títulos de anticuerpo más altos en comparación con el grupo inmunizado sin adyuvante (datos no mostrados).

Ejemplo 11: Efecto del adyuvante sobre las respuestas frente a componentes de polisacárido de cápsula

A. Efecto de dos dosis diferentes de AlPO4 sobre la respuesta frente a composición inmunogénica de conjugado CP5-CRM197/CP8-CRM197 bivalente en conejos

Se estudió el efecto de la dosis del adyuvante AlPO4 sobre las respuestas frente a CP5 y CP8 en conejos. Se inmunizaron conejos en la semana 0, 3 y 6 con CP5-CRM197 + CP8-CRM197 de S. aureus bivalente (1 μg de dosis de cada conjugado). Un grupo (n = 5/grupo) se inmunizó con composición inmunogénica formlada con 125 μg y un segundo grupo con 500 μg de AlPO4 como adyuvante. Las composiciones inmunogénicas se administraron mediante inyección subcutánea en el cuello. Se extrajo la sangre de los conejos en la semana 0, 6 y 8 y los anticuerpos anti-capsulares se determinaron mediante ELISA como títulos de anticuerpo de punto final determinados como la inversa de la dilución a DO405 0,1. Los resultados indicaban que no había ninguna diferencia en respusetas de anticuepos espefícicos de CP8 en conejos inmunizados con o bien 125 μg o bien 500 μg de AlPO4. La formulación con 125 μg de adyuvante dio respusetas de anticuerpos frente a CP5 más altas. Asimismo, todos los conejos en el grupo de 125 μg respondieron con respuestas de anticuerpos frente a CP5 más altas, mientras que el grupo de 500 μg de adyuvante, hubo dos conejos con baja respuesta frenet a la formulación.

B. Efecto de AlPO4 sobre la inmunogenicidad de formulación de tres antígenos

Se inmunizaron conejos (NZW, n = 6/7 conejos por grupo) en la semana 0, 3 y 6 con formulación de tres antígenos compuesta por CP5-CRM197 (1 μg) y CP8-CRM197 (1 μg) y T7-ClfA (N1N2N3)Y338A (10 μg). Un grupo de conejos se inmunizó con formulación inmunogénica con 500 μg de AlPO4, un segundo grupo se formuló sin adyuvante, el tercer grupo se inmunizó en la semana 0 con formulación inmunogénica con 500 de μg AlPO4 y semanas 3 y 6 con formulación inmunogénica sin adyuvante. Se administraron formulaciones inmunogénicas mediante inyección subcutánea, se extrajo la sangre de los conejos en la semana 0, 3, 6 y 8 y se evaluaron los sueros mediante ELISA específico de antígeno. Los resultados mostraron que la presencia de adyuvante en la formulación inmunogénica no tenía un efecto sobre las respuestas anti-CP5 o anti-CP8 en conejos (datos no mostrados). Los títulos GMT de Ac frente a ambas cápsulas eran comparables. No obstante, se produjo un efecto del adyuvante sobre la respustas de

imagen30

imagen31

imagen32

5

10

15

20

25

Tabla 14: Efecto de PDPH frente a la conjugación de CDT en el modelo de pielonefritis

Estudio Nº

Antígenos Cepa/Dosis logUFC/Riñón Significación

1 μg de CP5-CRM197 (PDPH) + AlPO4

2 x 108 3,01 ± 1,83 p < 0,001

1 μg de CP5-CRM197 (CDT) + AlPO4

1,67 ± 0,23 p < 0,0001

Estudio 2

Solución salina + AlPO4 PFESA0266 6,17 ± 1,76 -

1 μg de CP5-CRM197 (PDPH) + AlPO4

2,7 x 108 3,06 ± 1,69 p < 0,0001

1 μg de CP5-CRM197 (CDT) + AlPO4

1,87 ± 0,69 p < 0,0001

Ejemplo 17: El conjugado de CP5 proteje en un modelo de endocarditis de rata

Se llevaron a cabo cuatro estudios con conjugado de CP5-CRM197 PDPH y un conjugado no reladcionado (PP5-CRM197) a 1 μg de dosis. Los conjugados de CP5 reducían significativamente la colonización tanto en el corazón como los riñones en 2 de 3 experimentos en los que la cepa de exposición de tipo 5 era PFESA0266 (tabla 15). En el tercer estudio, el título anti-CP5 medio geométrico (GMT) era el ma´s bajo de los tres experimentos, pero fue solo ligeramente más bajo que el título en el experimento previo (51.000 frente a 67.000).

Tabla 15: La inmunización de CP5-CRM197 reduce las ufc en el modelo de endocarditis de rata

logUFC Recuperadas

Significación GMT

Composición inmunogénica

Exposición Cepa/Dosis Corazón Riñón Corazón Riñón Título de CP

1 μg de CP5-CRM197

PFESA0266 4,34± 1,78 3,92±1,73 103.000

1 μg de PP5-CRM197

2,21 x 108 ufc 7,94± 0,78 6,77± 0,79 p < 0,001 p < 0,05

1 μg de CP5-CRM197

PFESA0266 4,43± 2,30 3,109± 2,33 51.000

Solución salina

6,5 x 107 ufc 5,63± 2,48 4,19± 2,05 No No

1 μg de CP5-CRM197

PFESA0266 4,01± 2,49 3,90± 1,92 67.000

Solución salina

4,0 x 108 ufc 7,52± 1,38 6,52± 1,17 p < 0,0002 p < 0,0002

1 μg de CP5-CRM197

SA315 8,17± 1,02 6,92± 1,20 186.000

Solución salina

1 x 109 ufc 8,25± 0,60 6,74± 0,95 No No

Ejemplo 18: Conjugados de CP5-CRM197 en un modelo de pielonefritis

Se realizaron estudios iniciales que investigaban la eficacia de los conjugados con CP5 de 25 kDa de MW. Las mejoras en el procedimiento de fermentación dieron como resultado la producción del polisacárido de alto MW, que se conjugó con portador de proteína y se sometió a prueba junto con conjugado de CP5 de 25 kDa CP5. Los conjugados que comprenden CP con MW de 25 kDa (bajo MW) y 300 kDa (alto MW) se prepararon usando química de conjugación de CDT y se evaluaron en el modelo de pielonefritis murino. Tres dosis (0,01, 0,1 y 1 μg) de los conjugados de HMW se sometieron a prueba y se compararon con el CP5-CRM197 de LMW control y un conjugado no relacionado (PP5-CRM197) a 1 μg de dosis. Los resultados mostraron una reducción significativa en las UFC de PFESA0266 de S. aureus recuperadas de los riñones a un 1 μg de dosis. No hubo ninguna diferencia estadística entre la protección frente a conjugados preparados con CP5 de diferente tamaño a la dosis de 1 μg (tabla 16). La más baja (0,01 µg y 0,1 µg) del conjugado no provocó una respuesta inmunitaria suficiente para reducir significativamente la infección. El experimento se repitió usando un procedimiento de inmunización y de exposición idéntico. En el experimento repetido, solo la dosis de 1 μg de CP5-CRM197 de LMW dio como resultado una reducción significativa en la colonización (p = 0,01). La dosis de 1 μg de CP5-CRM197 de HMW redujo las ufc en riñones, no obstante la reducción no fue estadísticamente significativa (p = 0,056).

5

10

15

20

25

30

Tabla 16. Los conjugados de CP5 protegen en un modelo de pielonefritis de ratón.

Estudio

Antígeno Cepa/Dosis logUFC/Riñón Significación (valor de p)

1 µg de PP5-CRM197

5,34 0,0048

1

1µg de CP5 de 25 kDa-CRM197 PFESA0266 1,7 x 108 2,94

1 µg de CP5 de 300 kDa-CRM197

2,74 0,0056

0,1 µg de CP5 de 300 kDa-CRM197 97

5,59

0,01 µg de CP5 de 300 kDa-CRM197

4,70

1 µg de PP5-CRM197

5,35

1µg de CP5 de 25 kDa-CRM197

3,25 0,01

2

1 µg de CP5 de 300 kDa-CRM197 PFESA0266 1,7 x 108 3,78 0,06

0,1 µg de CP5 de 300 kDa -CRM197

4,45

0,01 µg de CP5 de 300 kDa-CRM197

6,08

Ejemplo 19: La O-acetilación de polisacárido es importante para la inducción de una respuesta de anticuerpos protectores frente a formulación inmunogénica de conjugado de CP5

[0002] Para evaluar la importancia de la O-acetilación de CP5, se O-desaceitló el CP5 nativo (dOAc) y se conjugó con CRM197 (dOAc-CRM197) usando química de conjugación de PDPH. La eficacia del conjugado de dOAcCP-CRM197 se comparó junto con CP5-CRM197 en un modelo de pielonefritis murino. Los resultados mostraron que el conjugado que carece de grupos O-acetilo (dOAc CP5-CRM197) no es eficaz en este modelo tal como se muestra mediante ningún cambio significativo en la colonización bacteriana en los riñones. Estos datos (tabla 17) indican que la O-acetilación era importante para la obtención de anticuerpos funcionales frente a CP5.

Tabla 17: La inmunización con CP5-CRM197 O-desacetilado no protege a los ratones frente a la colonización del riñón

Estudio Nº

Antígenos Cepa/Dosis logUFC/Riñón Significación

Estudio 1

1 μg de PP5-CRM197 PFESA0266 3,89 ± 2,24

1 μg de dOAc CP5-CRM197

7 x 108 4,20 ± 1,75

1 μg de de CP5-CRM197

1,75 ± 0,39 valor de p < 0,008

Estudio 2

Solución salina PFESA0266 5,08 ± 1,96

1 μg de dOAc CP5-CRM197

2,4 x 108 5,89 ± 1,29

1 μg de CP5-CRM197

2,93 ± 2,11 valor de p < 0,02

Ejemplo 20: La inmunización con conjugado de CP8 reduce la muerte en un modelo de septicemia

La eficacia de conjugado de CP8-CRM197 se evaluó en el modelo murino de septicemia después de una exposición a S. aureus PFESA0268 (tipo 8). Se inmunizaron de forma activa ratones Swiss Webster (n = 30) mediante inyección subcutánea con 1 μg de CP8-CRM197 y solución salina ambos formulados con 100 µg de AlPO4. El estudio mostró una reducción significativa de septicemia (p = 0,0308) en comparación con ratones inmunizados con AlPO4 solo. Véase la figura 17.

Ejemplo 21: Evaluación del CP8 tratado con base y nativo conjugado en el modelo de bacteriemia murino

La importancia de los grupos O-acetilo presesntes en el CP8 nativo antes de la conjugación para la inducción de respuestas de anticuerpos funcionales se evaluó para el cojugado de CP8. El polisacárido de CP8 se O-desacetiló en condiciones básicas suaves y tanto RMN como cromatografía ioónica (CI) confirmaron la ausencia de Oacetilación en CP8 des-O-Ac-CRM197.

El modelo de bacteriemia murino se usó para evaluar la eficacia de CP8 nativo frente al tratado con base conjugado con CRM197. Se inmunizaron grupos de ratones BALB/c hembra (15/grupo) en las semanas 0, 3 y 6, con 1 µg de CP8 des-O-Ac -CRM197 o 1 µg de CP8 O-Ac -CRM197. Se formularon formulaciones inmunogénicas con 22 µg de AlPO4. Los animales se expusieron a S. aureus PFESA0003. Tres horas después de la exposición los ratones se sacrificaron y las bacterias se recontaron en la sangre. Los datos mostraron que había una reducción estadísticamente significativa (p = 0,0362) en las ufc bacterianas recuperadas de la sangre de animales inmunizados

imagen33

Ejemplo 24: Actividad opsónica de sueros de ratones inmunizados con conjugados de CP8 nativos y modificados químicamente

Se compararon sueros de ratón seleccionados (n = 5) con altos títulos de CP8 del el estudio en el ejemplo 21 para determinar la actividad opsónica usando la cepa PFESA0005. Los resultados de OPA (tabla 21) muestran que solo 5 los conjugados preparados mediante la conjugación de CP8 nativo generaban anticuerpos opsónicos nativos en ratones. Es digno de mención que el conjugado de CP8 des-OAc era inmunogénico en ratones pero los anticuerpos generados no eran opsónicos en este ensayo. Los títulos de OPA se notifican como la inversa de la dilución a la que se observó el 40 % de destrucción. Los anticuerpos necesitan ser funcionales tal como se mide por la destrucción de bacterias o bien en un modelo de eficacia animal o bien a través de ensayo de destrucción opsonofagocítica que

10 muestra que los anticuerpos destruyen las bacterias. Puede que la destrucción funcional no se demuestre usando un ensayo que solo monitoriza la generación de anticuerpos únicamente, lo que no es indicativo de la importancia de la O-acetilación en cuanto a la eficacia.

Tabla 21. Actividad opsónica de CP8 nativo frente a CP8-CRM197 des-O-Ac

CP8-CRM197 des-O-Ac

CP8-CRM197

Título de OP Sem 0 sueros

Título de OP Sem 8 sueros Título de OP Sem 0 sueros Título de OP Sem 8 sueros

< 50

< 50

50 150

< 50

< 50

< 50

1.350

< 50

< 50

< 50

450

< 50

< 50

< 50

1.350

< 50

< 50

< 50

4.050

15 Ejemplo 25: La destrucción de cepas de tipo 8 mediante antisueros de primate no humano de conjugado de CP8 se inhibe mediante la adición de CP8 nativo

Para confirmar la especificidad de la actividad de destrucción en los sueros de primates no humanos inmunizados con conjugado de CP8, se realizó un ensayo en presencia de CP8 nativo. El procedimiento de OP II se usó con las siguientes modificaciones. Unas diluciones en serie en dos veces de muestras de anticuerpo (25 μl) se prepararon, a 20 lo que siguió la adición de o bien 150 μl (competidor Pn14) o bien 125 μl (competidor CP8) de tampón de ensayo a la suspensión de anticuerpos. El competidor era el polisacárido de CP8 purificado (CP8 poli) y polisacárido neumocócico no relacionado (Pn 14 poli) se usó como control. Los polisacáridos se añadieron (50 μg) a la suspensión de anticuerpos y la placa se incubó a 4 ºC durante 30 minutos con mezclado de extremo sobre extremo. Tras la incubación con polisacáridos, se añadieron bacterias (25 μl) a las placas y se colocaron en un agitador

25 rotatorio a 4 ºC durante 30 minutos seguido por la adición de 25 μl de complemento humano (un 1 % de la concentración final). Los resultados (tabla 22) mostraron que la presencia de CP8 nativo en la mezcla de reacción inhibía la destrucción opsonofagocítica de S. aureus tipo 8. Estos resultados confirman que destrucción opsonofagocítica mediante sueros inmunitarios estaba mediada mediante Ac específicos de cápsula.

Tabla 22. La adición de polisacárido de CP8 inhibe la destrucción opsonofagocítica se S. aureus mediante sueros 30 inmunitarios.

Mono

Muestra de sueros Título de OPA

Sem 0

< 50

Sem. 8

4.050

Sem 0 + 20 µg de CP8 poli

< 50

02D133

Sem 8 + 20 µg d eCP8 poli < 50

Sem 0 + 20 µg de Pn14 poli

< 50

Sem. 8 + 20 µg de Pn 14 poli

4.050

Sem. 0

< 50

Sem. 8

4.050

Sem 0 + 20 µg de CP8 poli

< 50

A4N122

Sem 8 + 20 µg de CP8 poli < 50

Sem 0 + 20 µg de Pn14 poli

< 50

Sem 8 + 20 µg e Pn 14 poli

1.350

5

10

15

20

25

30

Ejemplo 26: Los anticuerpos adquiridos de manera natural frente a ClfA median la destrucción opsonofagocítica de S. aureus

Los seres humanos en la población están naturalmente expuestos S. aureus y por lo tanto tienen anticuerpos preexistentes frente a esa bacteria en su circulación. Se usaron anticuerpos anti-ClfA purificados de humano y se evaluó si los anticuerpos podrían mediar la destrucción opsónica. Se ha demostrado que los anticuerpos frente a ClfA son opsónicos para el polisacárido capsular de S. aureus (datos no mostrados). Se hizo que la cepa PFESA0266 creciera durante la noche en caldo de Columbia con NaCl al 2 %. Las bacterias se opsonizaron con IgG de ser humano purificada por afinidad frente a ClfA o IgG de ser humano purificado por afinidad frente a antígeno irrelevante (control negativo, proteína de SCP estreptocócica) y se sometió a prueba la actividad opsónica. Se usaron células HL-60 diferenciadas en el ensayo opsonofagocítico a una razón de efector/diana de 100:1. Como control adicional, se incluyó un AcM frente a CP5 en el experimento para mostrar la presencia de CP5 en la superficie. Los resultados son el promedio de dos experimentos independientes. Los anticuerpos específicos frente a ClfA y CP5 mediaron la destrucción opsónica y los anticuerpos específicos de SCP (control negativo) no tenían ninguna actividad en este ensayo.

Ejemplo 27: El conjugado de CP5-CRM197 genera anticuerpos opsónicos en primates no humanos (NHP)

Para comparar la funcionalidad de conjugados de CP5-CRM197 de alto frente a bajo peso molecular en NHP, se inmunizaron grupos de cinco monos con dosis de 2 y 20 μg de los conjugados con o sin AlPO4 adyuvante. Los monos recibieron la primera y segunda vacunación en el día 0 y 28, respectivamente. Las extracciones de sangre del día 0, 14, 28 y 42 se sometieron a prueba para determinar la actividad de OP. Los resultados se resumen en la tabla 23. El conjugado de HMW de 20 μg tenía los títulos de OP más altos en comparación con otros grupos. Asimismo, la frecuencia de monos positivos para OP era más alta a ambas dosis de los grupos de alto MW que para los grupos de bajo MW correspondientes. Estos resultados muestran que existe una tendencia del conjugado de CP5-CRM197 de HMW a provocar mejores respuestas de OP que el conjugado de CP5 de LMW en NHP.

Tabla 23. OPA de suero de NHP tras la inmunización con conjugados de CP5.

Título de OPA (40 % de destrucción)

Grupo

Mono ID Día 0 Día 14 Día 28 Día 42

A2N053

450 1.350 4.050 4.050

149N

< 100 4.050 4.050 4.050

20 μg de CP5 (HMW) + AlPO4 0,5 mg/ml

A4L069 < 100 450 150 < 100

A1N097

< 100 4.050 1.350 1.350

A4L014

< 100 < 100 < 100 < 100

02D125

< 100 150 150 < 100

A4L081

< 100 150 150 150

2 μg de CP5 (HMW) + AlPO4 0,5 mg/ml

A2N055 150 450 150 150

A4N084

< 100 < 100 < 100 < 100

A1N085

< 100 150 450 4.050

A4L084

150 150 < 100 < 100

97N004

150 450 450 450

2 μg de CP5 (HMW) sin AlPO4

A4L055 < 100 < 100 < 100 < 100

97N123

< 100 < 100 150 150

225N

< 100 < 100 < 100 < 100

02D017

< 100 < 100 < 100 < 100

A4N100

< 100 150 150 4.050

20 μg de CP5 (LMW) + AlPO4 0,5 mg/ml

257N < 100 < 100 < 100 < 100

A4L046

< 100 < 100 < 100 < 100

A1N098

< 100 150 < 100 < 100

96N022

150 150 450 150

02D005

< 100 1.350 450 1.350

2 μg de CP5 (LMW) + AlPO4 0,5 mg/ml

02D113 < 100 150 150 < 100

A2N040

150 150 < 100 < 100

A4L056

150 150 < 100 < 100

Ejemplo 28: Los conjugados de polisacárido de cápsula que comprenden polisacáridos de alto peso molecular muestran una inmunogenicidad aumentada en comparación con los conjugados que comprenden polisacáridos de bajo peso molecular.

Se llevaron a cabo estudios en primatos no humanos (NHP) para evaluar la inmunogenicidad de diferentes formulaciones de conjugado de cápsula. Se sometieron a prueba dos formulaciones a dos niveles de dosificación diferentes (2 y 20 µg). La primear formulación estaba compuesta por un polisacárido de alto peso molecular (HMW) (aproximadamente 130 kDa) conjugado con CRM197. La segunda formulación contenía un polisacárido de bajo peso

molecular (LMW) (aproximadamente 25 kDa) conjugado con CRM197. Se vacunaron grupos de cinco primates con una dosis individual de una u otra vacuna y se monitorizaron los títulos inmunitarios antes de la vacunación y dos semanas tras la vacunación. Los títulos de OPA se definieron como la dilución de suero requerida para destruir el 40 % de cepa de S. aureus PFESA0266 en un ensayo de OPA. Los títulos de anticuerpo también se monitorizaron

5 mediante ELISA. Se observó una actividad aumentada para la vacuna de HMW en comparación con la formuilación de LMW (tabla 24), que se demuestra por un aumento de diez veces en los títulos de anticuerpo para la vacuna de HMW vacuna en comparación con la vacuna de LMW. La tasa de sujetos que responden a OPA para los NHP que recibieron la vacuna de HMW también fue más alta (un 80 % en comparación con un 40 %).

Tabla 24. Se observa inmunogenicidad aumentada para vacunas de conjugado de polisacárido de HMW en 10 comparación con vacuna de conjugado de polisacárido de LMW.

CP5-CRM197 dosis nivel (mcg) por animal

Media geométrica de PD1* Tasa de sujetos que responden a OPA (%)±

HMW (125 kDa)

20 32 80

2

21 80

LMW (25 kDa)

20 3 40

2

8 40

* Aumento en veces calculado a partir de título de ELISA de CP5 2 semanas tras la vacunación en comparación con títulos antes de la vacuna. ± Tasa de sujetos que responden calculada a partir de monos que generan un aumento en el título de OPA tras una dosis individual de vacuna 2 semanas tras la vacunación. Cada grupo contenía 5 macacos Rhesus y las vacunas se formularon con AlPO4 (250 mcg/dosis)

Ejemplo 29: Formulación de dos antígenos (CP5-CRM197 y ClfA) -Respuestas en primates no humanos

[0003] Para evaluar la respuesta inmunitaria a una dosis individual de composiciones inmunogénicas de dos

antígenos (CP5-CRM197 y ClfA) en NHP, se inmunizaron grupos de cinco monos con diferentes dosis de los dos 15 antígenos sin la adición de AlPO4. Las extracciones de sangre del día 0, 14, y 28 se sometieron a prueba para

determinar la actividad opsnofagocítica (OP) y los títulos de ELISA y los resultados se resumen en la tabla 24. Los

resultados mostraron que la actividad de OP se observaba constantemente en animales inmunizados con CP5 en

comparación con un grupo sham CP5. En conjunto, el grupo de 100 μg tenía los títulos de ELISA y OP más altos en

comparación con otros grupos. No hubo ninguna actividad de destrucción de OP obsersvada con sueros del grupo 20 de ClfA solo. No se observó ninguna interferencia en los grupos a los que se les administraron dosis crecientes de

ClfA o CP5. Véase la tabla 25.

Tabla 25: Resultados de OPA del estudio de inmunización bivalente en NHP

Título de OPA (40 % de destrucción)

Grupo Nº

ID Número Semana: 0 Semana: 2 Semana: 4

180 μg de ClfA + 20 μg de 130 kDa CP5

A4R054 A4R056 A4N087 97N152 A4R027 < 100 150 < 100

< 100

150 150

< 100

450 450

< 100

450 1.350

< 100

1.350 1.350

180 μg de ClfA + 2 μg de 130 kDa CP5

A4R062 97N149 A4R131 97N025 A4N064 < 100 150 < 100

< 100

150

< 100

< 100

450 150

< 100

450 450

< 100

450 450

60 μg de ClfA + 20 μg de 130 kDa CP5

A4L005 A4R029 A3N015 98N021 A4R137 < 100 < 100 < 100

< 100

1.350 1.350

< 100

< 100

< 100

150

4.050 4.050

< 100

< 100

< 100

(continuación)

Título de OPA (40 % de destrucción)

Grupo Nº

ID Número Semana: 0 Semana: 2 Semana: 4

60 μg de ClfA + 2 μg 130 de kDa CP5

A1N040 A2N104 A4L033 96N048 A4R032 < 100 150 150

< 100

1.350

< 100

< 100

150

< 100

< 100

< 100

< 100

< 100

< 100

< 100

2 μg de 130 kDa CP5

A4R135 A1N118 A4R061 A4R101 97N137 < 100 450 150

< 100

150 150

< 100

< 100

1.350

< 100

4.050 1.350

< 100

1.350 1.350

20 μg de 130 kDa CP5

A4R135 A4N115 95N038 A4N120 96N004 < 100 < 100 < 100

< 100

150 150

< 100

< 100

< 100

< 100

450 450

< 100

150 150

100 μg de 130 kDa CP5

A4N116 A3N097 A4N108 98N034 99N034 < 100 450 450

< 100

450 450

< 100

1.350 1.350

< 100

450 150

< 100

1.350 4.050

60 μg de ClfA

97N057 A4R112 A4L022 97N100 99N041 < 100 < 100 < 100

150

< 100

150

< 100

< 100

< 100

< 100

< 100

< 100

150

150

150

Los modelos animales muestran potencial de antígenos de polisacárido de cápsula de CP5 y CP8 de S. aureus

5 Tanto los conjugados de CP5-CRM197 como de CP8-CRM197 indujeron respuestas de anticuerpo específicas de serotipo capsular en ratones, ratas, conejos y primates no humanos (NHP). Los anticuerpos inducidos conjugados eran funcionales en el ensayo de destrucción de opsonofagocitosis funcional in vitro. Se generaron datos para mostrar que la O-Acetilación es importante para la obtención de anticuerpos de protección para tanto CP5 como CP8, y que los grupos O-acetilo son parte de un epítopo reconocido por OPA + AcM frente a CP5. Los AcM que

10 reconocieron CP5 nativo que está O-acetilado son funcionales en OPA y median la destrucción de las bacterias. El conjugado de CP8 indujo anticuerpos funcionales tanto en ratones como en conejos que mediaron la destrucción de cepa de tipo 8 en OPA. La especificidad de destrucción por anticuerpos policlonales o monoclonales se confirmó por la abolición de la destrucción después de la adición del polisacárido nativo homólogo con el ensayo. Los varios modelos de inmunización activa se usaron para mostrar la eficacia preclínica tanto de conjugados de CP5-y de

15 CP8-CRM197. El conjugado de CP5 mostró eficacia consistente en el modelo de pielonefritis murino y el modelo de endocarditis de rata. La importancia de la O-acetilación de CP5 se confirmó en el modelo de pielonefritis murino, en el que el CP5 des-O-acetilado conjugado con CRM197 no protegió a animales frente a infección experimental.

La combinación de los conjugados en una formulación de dos antígenos indujo anticuerpos en ambas cápsulas de CP5 y CP8 y no hubo interferencia con los niveles de anticuerpos específicos inducidos en comparación con 20 inmunizaciones de único antígeno. La combinación de conjugados y ClfA en una formulación de tres antígenos indujo niveles de CP5, CP8 y ClfA alto, y no hubo interferencia con las respuestas de anticuerpo inducidas frente a cualquier antígeno presente en la combinación. Las composiciones inmunogénicas de tres antígenos indujeron respuestas de anticuerpo (Ac) capaces de ser reforzadas para todos los tres componentes en conejos con altos

imagen34

Claims (1)

1. imagen1

   imagen2