KR20230123464A

KR20230123464A - 프로테오글리칸 접합체 및 이의 응용

Info

Publication number: KR20230123464A
Application number: KR1020237017056A
Authority: KR
Inventors: 시안차오 주; 화겐 첸; 시슈앙 시옹; 잉 리; 주안주안 왕; 창 리우; 칭펭 시아; 이지 마오; 주 왕; 엔화 쉔
Original assignee: 상하이 레이노박스 바이올로직스 컴퍼니 리미티드; 상하이 마이크로돔 바이오테크 컴퍼니 리미티드
Priority date: 2020-10-20
Filing date: 2021-10-19
Publication date: 2023-08-23
Also published as: CA3196222A1; CN116507359A; EP4234572A1; WO2022083585A1; AU2021367018A1; JP2023546740A; US20230405104A1

Abstract

파상풍 간균 독소 단백질 변이체를 제공하며, 상기 파상풍 간균 독소 단백질 변이체는 상기 파상풍 간균 독소 단백질의 C 단편 및 상기 파상풍 간균 독소 단백질의 전좌 영역 부분 단편을 포함하고; 프로테오글리칸 접합체를 더 제공하며, 상기 프로테오글리칸 접합체는 폐렴연쇄상구균 유래의 다당류 및 파상풍 간균 독소 단백질 절단체(truncate)를 포함하고; 면역원성을 향상시키는 방법을 더 제공하며, 상기 방법은 폐렴연쇄상구균 유래의 다당류 및 파상풍 간균 독소 단백질 절단체(truncate)를 포함하는 프로테오글리칸 접합체를 제공하는 단계를 포함한다.

Description

프로테오글리칸 접합체 및 이의 응용

본 출원은 생물의약 분야에 관한 것으로, 보다 상세하게는 프로테오글리칸 접합체 및 이의 응용에 관한 것이다. 상기 프로테오글리칸 접합체는 폐렴연쇄상구균 유래의 다당류 및 파상풍 간균 독소 단백질 절단체(truncate)를 포함한다. 상기 프로테오글리칸 접합체는 폐렴연쇄상구균 협막 다당류의 면역원성을 향상시킬 수 있다.

과거 "폐렴쌍구균"으로 불렸던 폐렴연쇄상구균(Streptococcus pneumoniae, 폐렴구균)은, 협막이 있는 그람양성 쌍구균으로, 협막 다당류의 조성 차이에 따라, 91개 이상의 혈청형으로 나눌 수 있으며, 그 중 협막 다당류는 중요한 병원성 인자이다. 폐렴구균성 질환은 전 세계적으로 심각한 공중 보건 문제 중 하나이다. 세계보건기구(WHO)에 따르면, 2005년 전 세계적으로 매년 160만 명이 폐렴구균 질환으로 사망했고, 여기에는 70만 내지 100만 명의 5세 이하 어린이가 포함되며, 그 중 대부분이 개발도상국에 거주한다. 폐렴구균이 어린이의 신체 건강을 심각하게 위협하고 있음을 알 수 있다. 선진국에서는, 폐렴구균 질환이 주로 2세 이하의 어린이와 노인, 및 모든 연령대의 면역기능 저하자에서 발생한다.

폐렴구균 다당류 접합 백신은 폐렴구균 다당류와 담체 단백질의 컨쥬게이트에 의해 형성되며, 담체 단백질은 폐렴 다당류의 면역원성 향상에 매우 중요한 역할을 한다. 폐렴연쇄상구균 백신에 대한 국내외 다수의 임상연구에서, 보호 효과가 나타나지 않아 종료된 경우가 드물지 않다(Marilla G Lucero et al, The Pediatric Infectious Disease Journal. 28 (6): 455 462, JUN 2009)(Jan Poolman et al, Vaccine. 2009 May 21; 27(24): 3213-22). 따라서, 면역원성이 더욱 강한 폐렴연쇄상구균 백신을 유도할 수 있는 방안의 개발이 시급하다.

본 출원은 파상풍 간균 단백질 변이체를 제공하며, 상기 파상풍 간균 단백질 변이체는 파상풍 간균 독소 단백질의 C 단편 및 상기 파상풍 간균 독소 단백질의 전좌 영역 부분 단편을 포함하고, 상기 단백질 변이체는 담체 단백질로서 폐렴연쇄상구균 다당류와 접합하며, 폐렴연쇄상구균 다당류 면역원성을 향상시키는 효과를 갖는다. 본 출원은 프로테오글리칸 접합체를 더 제공하며, 상기 프로테오글리칸 접합체는 폐렴연쇄상구균 유래의 다당류 및 파상풍 간균 독소 단백질 절단체(truncate)를 포함하고, 상기 다당류 접합체는 현저하게 더욱 우수한 면역원성을 갖는다. 본 출원은 면역원성을 향상시킬 수 있는 방법을 더 제공하며, 상기 방법은 폐렴연쇄상구균 유래의 다당류 및 파상풍 간균 독소 단백질 절단체(truncate)를 포함하는 프로테오글리칸 접합체를 제공하는 단계를 포함하고, 상기 방법은 폐렴연쇄상구균 면역원성을 향상시킬 수 있다.

일 양상에서, 본 출원은 파상풍 간균 독소 단백질 변이체를 제공하며, 여기에는 상기 파상풍 간균 독소 단백질의 C 단편 및 상기 파상풍 간균 독소 단백질의 전좌 영역 부분 단편이 포함된다.

일부 구현예에서, 상기 전좌 영역 부분 단편은 상기 파상풍 간균 독소 단백질의 전좌 영역의 T 세포 에피토프 P2를 포함한다.

일부 구현예에서, 상기 전좌 영역 부분 단편은 상기 파상풍 간균 독소 단백질의 829 내지 864번째 아미노산을 포함한다.

일부 구현예에서, 상기 전좌 영역 부분 단편은 SEQ ID NO:7 내지 8 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열을 포함한다.

일부 구현예에서, 상기 파상풍 간균 독소 단백질의 C 단편은 SEQ ID NO:3으로 표시되는 아미노산 서열을 포함한다.

일부 구현예에서, 상기 파상풍 간균 독소 단백질 변이체는 SEQ ID NO:1 내지 2 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열을 포함한다.

다른 일 양상에서, 본 출원은 프로테오글리칸 접합체를 제공하며, 여기에는 폐렴연쇄상구균 유래의 다당류 및 파상풍 간균 독소 단백질 절단체(truncate)(TTD)가 포함된다.

일부 구현예에서, 상기 다당류는 폐렴연쇄상구균 협막 다당류에서 유래한다.

일부 구현예에서, 상기 다당류는 하나 이상의 폐렴연쇄상구균 혈청형을 구비한다.

일부 구현예에서, 상기 다당류는 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F 및 33F로 이루어진 군 중 어느 하나의 폐렴연쇄상구균 혈청형으로부터 선택된다.

일부 구현예에서, 상기 파상풍 간균 독소 단백질 절단체(truncate)는 상기 파상풍 간균 독소 단백질의 C 단편을 포함한다.

일부 구현예에서, 상기 파상풍 간균 독소 단백질 절단체(truncate)는 상기 파상풍 간균 독소 단백질의 C 단편을 포함하고, 여기에서 상기 다당류는 1, 3, 5, 6A, 6B, 7F, 10A, 12F, 15B, 19A, 19F 및 33F로 이루어진 군 중 어느 하나의 폐렴연쇄상구균 혈청형으로부터 선택된다.

일부 구현예에서, 상기 파상풍 간균 독소 단백질 절단체(truncate)는 파상풍 간균 독소 단백질의 C 단편 및 상기 파상풍 간균 독소 단백질의 전좌 영역 부분 단편을 포함한다.

일부 구현예에서, 상기 전좌 영역 부분 단편은 상기 파상풍 간균 독소 단백질의 전좌 영역의 광범위한 T 세포 에피토프 P2를 포함한다.

일부 구현예에서, 상기 파상풍 간균 독소 단백질 절단체(truncate)는 SEQ ID NO:1 내지 3 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열을 포함한다.

일부 구현예에서, 상기 다당류와 상기 파상풍 간균 독소 단백질 절단체(truncate)의 질량비는 0.4 내지 2.5이다.

일부 구현예에서, 1형 폐렴연쇄상구균 다당류와 상기 단백질 절단체(truncate)의 질량비는 0.4 내지 2.5이다.

일부 구현예에서, 3형 폐렴연쇄상구균 다당류와 상기 단백질 절단체(truncate)의 질량비는 0.4 내지 2.5이다.

일부 구현예에서, 5형 폐렴연쇄상구균 다당류와 상기 단백질 절단체(truncate)의 질량비는 0.4 내지 2.5이다.

일부 구현예에서, 6A형 폐렴연쇄상구균 다당류와 상기 단백질 절단체(truncate)의 질량비는 0.4 내지 2.5이다.

일부 구현예에서, 6B형 폐렴연쇄상구균 다당류와 상기 단백질 절단체(truncate)의 질량비는 0.4 내지 2.5이다.

일부 구현예에서, 7F형 폐렴연쇄상구균 다당류와 상기 단백질 절단체(truncate)의 질량비는 0.4 내지 2.5이다.

일부 구현예에서, 10A형 폐렴연쇄상구균 다당류와 상기 단백질 절단체(truncate)의 질량비는 0.4 내지 2.5이다.

일부 구현예에서, 12F형 폐렴연쇄상구균 다당류와 상기 단백질 절단체(truncate)의 질량비는 0.4 내지 2.5이다.

일부 구현예에서, 15B형 폐렴연쇄상구균 다당류와 상기 단백질 절단체(truncate)의 질량비는 0.4 내지 2.5이다.

일부 구현예에서, 19A형 폐렴연쇄상구균 다당류와 상기 단백질 절단체(truncate)의 질량비는 0.4 내지 2.5이다.

일부 구현예에서, 19F형 폐렴연쇄상구균 다당류와 상기 단백질 절단체(truncate)의 질량비는 0.4 내지 2.5이다.

일부 구현예에서, 33F형 폐렴연쇄상구균 다당류와 상기 단백질 절단체(truncate)의 질량비는 0.4 내지 2.5이다.

일부 구현예에서, 상기 프로테오글리칸 접합체는 컨쥬게이트 방법을 채택해 상기 다당류와 상기 단백질 변이체를 컨쥬게이트할 수 있다.

일부 구현예에서, 상기 컨쥬게이트 방법은 브롬화 수소법, CDAP법, 환원 아민법 중 어느 하나의 방법을 포함한다.

다른 일 양상에서, 본 출원은 면역원성을 향상시키는 방법을 제공하며, 여기에는 폐렴연쇄상구균 유래의 다당류 및 파상풍 간균 독소 단백질 절단체(truncate)를 포함하는 프로테오글리칸 접합체를 제공하는 단계가 포함된다.

일부 구현예에서, 상기 파상풍 간균 독소 단백질 절단체(truncate)는 파상풍 간균 독소 단백질의 C 단편을 포함한다.

일부 구현예에서, 상기 파상풍 간균 단백질의 C 단편은 SEQ ID NO:3으로 표시되는 아미노산 서열을 포함한다.

일부 구현예에서, 상기 파상풍 간균 독소 단백질 절단체(truncate)는 파상풍 간균 독소 단백질의 C 단편 및 파상풍 간균 독소 단백질 전좌 영역 부분 단편을 포함한다.

일부 구현예에서, 상기 파상풍 간균 독소 단백질의 전좌 영역 부분 단편은 상기 파상풍 간균 독소 단백질의 829 내지 864번째 아미노산을 포함한다.

일부 구현예에서, 상기 폐렴연쇄상구균 다당류와 상기 파상풍 간균 독소 단백질 절단체(truncate)의 질량비는 0.4 내지 2.5이다.

일부 구현예에서, 상기 방법은 컨쥬게이트 방법을 채택해 상기 다당류와 상기 단백질 변이체를 컨쥬게이트하는 단계를 포함한다.

일부 구현예에서, 상기 박테리아 다당류 면역원성을 향상시키는 단계는 다당류 CRM197 접합체보다, 상기 프로테오글리칸 접합체의 면역원성을 더 높이는 단계를 포함한다.

일부 구현예에서, 상기 면역원성이 더 높은 것은 동물 면역 시험에서 검출되는 것이다.

일부 구현예에서, 상기 동물 면역 시험은 상기 프로테오글리칸 접합체와 보조제를 면역 항원으로 배합하는 단계를 포함한다.

일부 구현예에서, 상기 면역 항원의 주사 방법은 복강주사, 피하주사, 근육주사 및/또는 정맥주사를 포함한다.

일부 구현예에서, 상기 동물 면역 시험은 획득한 면역 동물의 혈청 중의 항체에 대해 ELISA 검출을 수행하는 단계를 포함한다.

일부 구현예에서, 상기 동물 면역 시험은 획득한 면역 동물의 혈청에 대해 옵소노파고사이토시스(opsonophagocytosis) 살균 시험을 수행하는 단계를 포함한다.

일부 구현예에서, 상기 동물은 마우스, 래트 및/또는 토끼를 포함한다.

일부 구현예에서, 상기 보조제는 수산화알루미늄, 인산알루미늄 및/또는 프로인트 보조제 등을 포함한다.

다른 일 양상에서, 본 출원은 핵산 분자를 제공하며, 여기에는 상기 파상풍 간균 독소 단백질을 암호화하는 변이체가 포함된다.

일부 구현예에서, 상기 핵산 분자의 SEQ ID NO:4 내지 6으로 표시되는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.

다른 일 양상에서, 본 출원은 벡터를 제공하며, 여기에는 상기 핵산 분자가 포함된다.

다른 일 양상에서, 본 출원은 세포를 더 제공하며, 여기에는 상기 핵산 분자 또는 상기 벡터가 포함된다.

다른 일 양상에서, 본 출원은 담체 단백질을 더 제공하며, 여기에는 상기 파상풍 간균 독소 단백질 변이체가 포함된다.

다른 일 양상에서, 본 출원은 약학 조성물을 더 제공하며, 여기에는 상기 프로테오글리칸 접합체 및 선택적으로 약학적으로 허용 가능한 보조제가 포함된다.

다른 일 양상에서, 본 출원은 약물 제조에 사용되는 파상풍 간균 독소 단백질 변이체의 용도를 더 제공한다.

다른 일 양상에서, 본 출원은 약물 제조에 사용되는 상기 다당류 접합체의 용도를 더 제공한다.

일부 구현예에서, 상기 약물은 폐렴연쇄상구균성 질환을 예방 및/또는 치료하는 데 사용된다.

일부 구현예에서, 상기 폐렴연쇄상구균성 질환은 폐렴, 패혈증, 뇌수막염 및/또는 중이염을 포함한다.

다른 일 양상에서, 본 출원은 백신을 더 제공하며, 여기에는 상기 프로테오글리칸 접합체, 상기 약학 조성물 및/또는 선택적으로 약학적으로 허용 가능한 보조제가 포함된다.

다른 일 양상에서, 본 출원은 폐렴연쇄상구균성 질환을 예방하는 방법을 더 제공하며, 여기에는 필요로 하는 피험자에게 상기 프로테오글리칸 접합체, 상기 핵산 분자, 상기 벡터, 상기 세포, 상기 담체 단백질, 상기 약학 조성물 및/또는 상기 백신을 투여하는 단계가 포함된다.

다른 일 양상에서, 본 출원은 항체 제조를 위한 항원으로서 상기 다당류 접합체의 용도를 더 제공한다.

일부 구현예에서, 상기 항체는 분리된 균주의 진단적 분류에 사용된다.

다른 일 양상에서, 본 출원은 키트를 더 제공하며, 여기에는 상기 다당류 접합체가 포함된다.

일부 구현예에서, 상기 키트는 분리된 균주의 진단적 분류에 사용된다.

본 출원에 관련된 발명의 구체적인 특징은 첨부된 청구범위에 기재되어 있다. 본 출원에 관련된 발명의 특징 및 이점은 이하에서 상세히 설명되는 예시적인 구현예 및 첨부 도면을 참조하여 더 잘 이해될 수 있다. 첨부 도면에 대한 간략한 설명은 다음과 같다:
도 1은 본 출원에 따른 파상풍 간균 독소 단백질 절단체(truncate)(TTD) 발현 플라스미드의 전기영동도이다.
도 2는 본 출원에 따른 TTD가 대장균에서 발현된 후의 전기영동도이다.
도 3은 본 출원에 따른 TTD가 정제된 후의 전기영동도이다.
도 4는 본 출원에 따른 TTD가 정제된 후의 SEC-HPLC 프로파일이다.
도 5는 본 출원에 따른 3형 다당류-TTD-1, 2, 3 및 3형 다당류 CRM197 접합체 면역 후 마우스 혈청 중 항체 역가이다.
도 6은 본 출원에 따른 3형 다당류-TTD-1 및 3형 다당류 CRM197 접합체 면역 후 마우스 혈청 중 특이적 항체의 옵소노파고사이토시스(opsonophagocytosis) 기능이다.
도 7은 본 출원에 따른 6B형 다당류-TTD-1 및 6B형 다당류 CRM197 접합체 면역 후 마우스 혈청 중 항체 역가이다.
도 8은 본 출원에 따른 6B형 다당류-TTD-1 및 6B형 다당류 CRM197 접합체 면역 후 마우스 혈청 중 특이적 항체의 옵소노파고사이토시스 기능이다.
도 9는 본 출원에 따른 15B형 다당류-TTD-3 및 15B형 다당류 CRM197 접합체 면역 후 마우스 혈청 중 항체 역가이다.
도 10은 본 출원에 따른 15B형 다당류-TTD-3 및 15B형 다당류 CRM197 접합체 면역 후 마우스 혈청 중 특이적 항체의 옵소노파고사이토시스 기능이다.
도 11은 본 출원에 따른 6A형 다당류-TTD-3 및 6A형 다당류 CRM197 접합체 면역 후 마우스 혈청 중 항체 역가이다.
도 12는 본 출원에 따른 6A형 다당류-TTD-3 및 6A형 다당류 CRM197 접합체 면역 후 마우스 혈청 중 특이적 항체의 옵소노파고사이토시스 기능이다.
도 13은 본 출원에 따른 7F형 다당류-TTD-1 접합체 및 7F형 다당류 CRM197 접합체 면역 후 토끼 혈청 중 항체 역가이다.
도 14는 본 출원에 따른 7F형 다당류-TTD-3 및 7F형 다당류 CRM197 접합체 면역 후 마우스 혈청 중 특이적 항체의 옵소노파고사이토시스 기능이다.
도 15는 본 출원에 따른 10A형 다당류-TTD-2 접합체 및 10A형 다당류 CRM197 접합체 면역 후 토끼 혈청 중 항체 역가이다.
도 16은 본 출원에 따른 10A형 다당류-TTD-2 및 10A형 다당류 CRM197 접합체 면역 후 마우스 혈청 중 특이적 항체의 옵소노파고사이토시스 기능이다.
도 17은 본 출원에 따른 19A형 다당류-TTD-1 접합체 및 19A형 다당류 CRM197 접합체 면역 후 토끼 혈청 중 항체 역가이다.
도 18은 본 출원에 따른 19A형 다당류-TTD-1 접합체 및 19A형 다당류 CRM197 접합체 면역 후 토끼 혈청 중 특이적 항체의 옵소노파고사이토시스 기능이다.
도 19는 본 출원에 따른 1형 다당류-TTD-3 접합체 및 1형 다당류 CRM197 접합체 면역 후 토끼 혈청 중 항체 역가이다.
도 20은 본 출원에 따른 1형 다당류-TTD-3 접합체 및 1형 다당류 CRM197 접합체 면역 후 토끼 혈청 중 특이적 항체의 옵소노파고사이토시스 기능이다.
도 21은 본 출원에 따른 5, 12F, 33F, 19F형 다당류-TTD 및 상응하는 다당류-CRM197 접합체 면역 후 마우스 혈청 중의 항체 역가이다.

이하에서는 특정한 구체적인 실시예로 본 출원 발명의 구현예을 설명하며, 당업자는 본 명세서에 개시된 내용으로부터 본 출원 발명의 기타 장점 및 효과를 용이하게 이해할 수 있다.

용어 정의

본 출원에서, 용어 "파상풍 간균"은 "파상풍균"(clostridium tetani)으로도 불리며, 통상적으로 감염성, 중독성 질환을 유발할 수 있는 박테리아를 의미한다. 이는 독소 단백질을 합성하여 피감염자의 신경계에 영향을 미칠 수 있다. 상기 파상풍 간균이 생성하는 독소 단백질은, "파상풍 간균 독소 단백질", "파상풍 간균류 독소" 또는 "파상풍 경련 독소"로 불릴 수 있다. 상기 파상풍 간균 독소 단백질은 A, B 및 C의 세 개의 단편을 포함할 수 있으며, 각각의 단편의 분자량은 약 50kDa일 수 있다. 예를 들어, A 단편은 엔도펩티다제 활성을 갖는 촉매 영역일 수 있다. 예를 들어, B 단편은 전좌 도메인일 수 있다. 예를 들어, C 단편은 수용체와 접합하는 능력을 갖는 도메인일 수 있다(Ana C. Calvo, Int. J. Mol. Sci. 2012, 13, 6883-6901; doi:10.3390/ijms13066883). 예를 들어, B 단편은 SEQ ID NO:7로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, B 단편은 SEQ ID NO:8로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, C 단편은 SEQ ID NO:3으로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 본 출원에서, 용어 "파상풍 간균 독소 단백질 전좌 영역"은 상기 파상풍 간균 독소 단백질의 B 단편을 지칭할 수 있다. 본 출원에서, 용어 "파상풍 간균 독소 단백질 C 단편"은 상기 파상풍 간균 독소 단백질의 C 단편을 지칭할 수 있다.

본 출원에서, 용어 "단백질 변이체", "변이체"는 통상적으로 자연 생물학적 활성 단백질 또는 폴리펩티드와 서열 상동성을 갖는 화합물을 지칭한다. 본 출원에 따른 단백질 변이체는 하나 이상의 아미노산 잔기를 부가(삽입 포함), 결실, 변형 및/또는 치환함으로써 변경된 아미노산 서열을 갖는 단백질을 포함할 수 있으며, 이는 동시에 모 서열의 적어도 하나의 생물학적 활성을 유지한다. 예를 들어, 변이체는 모 단백질과 적어도 약 0%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98% 또는 적어도 약 99%의 서열 동일성을 가질 수 있다. 변이체는 자연적으로 존재하거나 자연적으로 존재하지 않을 수 있다. 당업계에 공지된 기술을 사용해 자연적으로 존재하지 않는 변이체를 생성할 수 있다. 단백질 변이체는 보존적 또는 비보존적 아미노산 치환, 삭제 또는 부가를 포함할 수 있다. 본 출원에서, 상기 "파상풍 간균 독소 단백질 변이체"는 상기 파상풍 간균 독소 단백질 부분 아미노산 서열이 결실된 단백질을 지칭할 수 있다.

본 출원에서, 용어 "절단체(truncate)"는 통상적으로 전체보다 적은 임의 사물을 지칭한다. 본 출원에서, 상기 "파상풍 간균 독소 단백질 절단체(truncate)(TTD)"는 상기 아미노산 서열이 파상풍 간균 독소 단백질 전체 서열보다 적은 화합물을 지칭할 수 있다. 예를 들어, 절단체(truncate)는 모 단백질의 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98% 또는 적어도 약 99%보다 적은 아미노산 서열을 갖는다. 절단체(truncate)는 자연적으로 존재하거나 자연적으로 존재하지 않을 수 있다. 당업계에 공지된 기술을 사용해 자연적으로 존재하지 않는 절단체(truncate)를 생성할 수 있다.

본 출원에서, 용어 "T 세포 에피토프"는 통상적으로 T 림프구에 의해 인식될 수 있는 폴리펩티드 또는 단백질 단편을 지칭한다. 상기 "T 세포 에피토프 P2"는 통상적으로 파상풍 간균 독소 단백질이 T 세포에 의해 인식될 수 있는 폴리펩티드를 지칭하며, 여기에는 p2, p4 및/또는 p30이 포함될 수 있다. 예를 들어, p2는 모든 MHC(주조직 적합성 복합체)를 인식하는 DR 분자를 가질 수 있다. 상기 T 세포 에피토프 p2는 파상풍 간균 독소 단백질 830 내지 844번째 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, p30은 다량의 상이한 MHC II와 접합할 수 있으며, T 세포에 의해 인식될 수 있는 것으로 나타나고, 면역원성의 특성을 갖는다. 상기 T 세포 에피토프 p30은 파상풍 간균 독소 단백질 947 내지 967번째 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 상기 T 세포 에피토프 p4는 파상풍 간균 독소 단백질 1273 내지 1284번째 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 본 출원에서, 예를 들어, 단백질 변이체는 상기 "T 세포 에피토프 p2" 영역을 포함할 수 있다.

본 출원에서, 용어 "폐렴연쇄상구균 협막 다당류", "폐렴연쇄상구균 다당류" 및 "폐렴구군 다당류"는 상호 호환하여 사용할 수 있으며, 통상적으로 폐렴연쇄상구균 표면의 느슨한 점액 물질을 지칭한다. 폐렴연쇄상구균 다당류는 주로 T 세포에 의존하지 않는 유기체의 면역 응답을 유발한다. 본 출원에서, 상기 면역 응답은 유기체가 항원 자극을 받은 후, 면역 세포가 항원 분자를 인식, 활성화, 증식 및 분화하여, 면역 물질을 생성하고 특이적 면역 효과를 발생시키는 과정을 포함할 수 있다. 상기 면역 응답은 항원 제시, 림프구 활성화, 면역 분자 형성 및 면역 효과 생성 등과 같은 일련의 생리학적 반응을 포함할 수 있다. 폐렴연쇄상구균은 협막 다당류 항원성의 차이에 따라 상이한 혈청형으로 나뉠 수 있다. 일부 경우에, 협막 다당류 항원의 차이에 따라, 폐렴연쇄상구균은 91가지 혈청형을 포함할 수 있다. 폐렴연쇄상구균의 주요 병원성 혈청형은 24가지를 포함할 수 있으며, 이는 각각 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F 및 33F이다.

일부 경우에, 폐렴연쇄상구균의 협막 다당류는 반복되는 올리고당 단위를 포함할 수 있으며, 상기 올리고당 단위는 최대 8개 당 잔기를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 협막 다당류는 전장 다당류일 수 있다. 일부 경우에, 협막 다당류는 하나의 올리고당 단위 또는 자연 길이보다 짧은 반복되는 올리고당 단위의 당 사슬일 수 있다.

본 출원에서, 용어 "폐렴연쇄상구균성 질환"은 통상적으로 폐렴연쇄상구균이 유기체를 감염시켜 발생하는 질환으로, 어린이 폐렴, 뇌수막염, 균혈증, 급성 중이염 및 부비동염 등을 포함하나 이에 한정되지 않는다.

본 출원에서, 용어 "담체 단백질"은 통상적으로 미생물 유래의 당 또는 다당류와 접합할 수 있으며, 미생물의 당 또는 당류를 피험자 생체내로 운반하여 면역 응답을 유발하는 단백질, 단백질 상동체 또는 폴리펩티드를 지칭한다. 당과 담체 단백질이 접합된 후 당의 면역원성을 강화할 수 있는데, 이것이 당을 흉선 비의존적 항원(thymus independent antigen)에서 흉선 의존적 항원(thymus dependent antigen)으로 전환하여, 면역 기억을 유발할 수 있기 때문이다. 흉선 의존적 항원은, T 세포 의존적 항원으로 불릴 수도 있으며; 흉선 비의존적 항원은, T 세포 비의존적 항원으로 불릴 수도 있다. 어린이, 노인, 면역 결핍자의 경우, T 세포 의존적 항원은 유효한 면역 응답을 일으키고, 면역 효과를 더욱 유지시킬 수 있는 항체를 생성할 수 있다. 본 출원에서, 용어 "프로테오글리칸 접합체"는, 상기 담체 단백질이 박테리아 유래의 당 또는 다당류와 접합된 후 생성되는 단일 구조의 물질이다.

본 출원에서, 용어 "컨쥬게이트"는 두 부분의 물질이 공유 또는 비공유 방식으로 접합되어 형성된 단일 구조를 의미하며, 그 중 제1 부분은 항원, 특히 다당류이고, 제2 부분은 면역원성 담체, 예를 들어 담체 단백질이다. 상기 접합은 분자 사이의 공유 화학 결합을 통하거나 연결기를 통해 구현할 수 있으며, 예를 들어 아디픽 디히드라자이드(adipic dihydrazide)가 있다.

본 출원에서, 용어 "면역원성"은 통상적으로 면역 응답을 유발할 수 있는 성능을 지칭하며, 여기에는 세포 활성화, 증식, 분화를 자극하여, 면역 이펙터 물질 항체를 생성하고 림프구를 감작할 수 있는 특성이 포함되나 이에 한정되지 않는다. 본 출원에서, 상기 면역원성이 더 높다는 것에는 피험자를 면역화한 후, 피험자 혈청 중 항체 역가가 더 높고, 혈정형 특이적 항체가 더 많으며 살균 효율이 더 높다는 것이 포함되나 이에 한정되지 않는다.

본 출원에서, 용어 "다당류와 단백질 질량비"는 통상적으로 접합체 중 단백질이 글리코실화 변형 정도를 측정하는 데 사용될 수 있으며, 상이한 질량비는 접합체의 면역원성에 영향을 미치고, 유리 다당류, 유리 단백질은 모두 접합 반응의 기질에 속하는데, 접합체 중 유리된 협막 다당류는 접합체의 면역 반응을 저하시킬 수 있으며, 과량의 유리 단백질도 면역 반응에 대한 억제 작용을 나타낼 수 있다. 일부 경우에, 접합체 분자 크기 분포는 제품의 면역원성과 직접적으로 관련이 있으며, 접합 공정과 접합체 안정성을 측정하는 중요한 지표이기도 하다.

본 출원에서, 용어 "벡터"는 통상적으로 클로닝된 하나 이상의 핵산 분자의 전사 및 번역에 필요한 조절 서열을 포함하고, 이로써 핵산 분자를 전사 및 클로닝할 수 있도록 하는 벡터를 지칭한다. 상기 벡터는 핵산 분자에 작동 가능하게 연결된 하나 이상의 조절 서열을 함유할 수 있으며, 사용하는 숙주 세포 유형에 따라 이 조절 서열을 선택할 수 있다. 조절 서열은 프로모터, 인핸서 및 기타 발현 제어 요소를 포함하며, 예를 들어 폴리아데닐화(폴리(A)+) 서열이 있다. 기타 벡터 조성은 신호 서열, 복제 기점, 하나 이상의 선택 유전자 및 전사 종결 서열 중 하나 이상을 포함할 수 있으나 이에 한정되지 않는다.

본 출원에서, 용어 "약학 조성물"은 통상적으로 필요로 하는 피험자에게 투여하기에 적합한 조성물을 지칭한다. 예를 들어, 본 출원에 따른 약학 조성물은, 본 출원에 따른 프로테오글리칸 접합체 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다.

본 출원에서, 용어 "백신"은 특정 병원체 또는 질환에 대해 피험자에서 치료적 정도의 면역성을 유도하기에 효과적인 활성 성분을 함유하는 시약 또는 조성물을 지칭한다. 본 출원에서, 상기 백신은 박테리아 다당류 및 담체 단백질을 포함할 수 있다. 본 출원에서, 상기 백신은 기타 면역원성 활성 성분을 더 포함할 수 있다. 본 출원에서, 상기 박테리아 다당류와 단백질의 접합체는 다성분 백신 중 일종의 활성 성분으로 사용될 수도 있다. 본 출원에서, 상기 "백신"은 의약 조성물을 더 포함할 수 있으므로, 통상적으로 약학적으로 허용 가능한 희석제, 담체 또는 부형제를 포함한다. 이는 다른 활성 성분을 포함할 수도, 포함하지 않을 수도 있다. 일부 경우에, 이는 면역 반응(예를 들어 항박테리아 다당류의 기타 단백질 및/또는 기타 항감염체)을 유도하는 기타 성분을 추가로 포함하는 조합 백신일 수 있다.

본 출원에서, 용어 "ELISA"는 통상적으로 효소 결합 면역 흡착 검정을 지칭한다. 이는 면역 검출에 사용되는 다양한 방식을 포함할 수 있다. 예를 들어, ELISA 방법은 샌드위치 ELISA, 가교 ELISA, 직접 ELISA, 간접 ELISA 등을 포함할 수 있다. 일부 경우에, ELISA 면역 검정은 수동 검정일 수 있으며, 자동 방식에 의해 실시될 수도 있다. 예를 들어, 본 출원에서, ELISA법을 이용해 폐렴연쇄상구균 다당류 면역원성을 평가할 수 있다.

본 출원에서, 용어 "옵소노파고사이토시스 살균 시험"은 "OPA"로 불리기도 하며, 통상적으로 항체, 보체를 통해 박테리아 등의 미립자 항원에 대한 식세포의 식균 작용을 촉진시키는 시험이다. 상기 항체는 피험자 유래의 항원 면역을 거쳐 생성된 항체를 포함한다. 상기 항체는 혈청 유래를 포함한다. 상기 식세포는 식세포 또는 분화능을 갖는 세포(예를 들어, HL(Hela 세포)-60)로부터 분화된 식세포를 포함한다. 상기 박테리아는 폐렴연쇄상구균을 포함한다.

본 출원에서, 용어 "피험자" 또는 "개체" 또는 "동물" 또는 "환자"는 본 출원의 약학 조성물 투여가 필요한 피험자를 지칭하기 위해 상호 호환적으로 사용되며, 예를 들어 포유동물 피험자가 있다. 동물 피험자에는 인류, 비인류 영장류, 개, 고양이, 기니피그, 토끼, 래트, 마우스, 말, 황소, 젖소 등이 포함되며, 예를 들어 마우스, 예를 들어 래트, 예를 들어 토끼가 있다. 여기에서 상기 토끼는 큰 토끼일 수 있으며, 예를 들어, 뉴질랜드 흰토끼가 있다.

본 출원에서, 용어 "상동성"은 통상적으로 비교하는 아미노산 서열 및 비교하는 뉴클레오티드 서열과 일정한 상동성을 갖는 아미노산 서열 또는 뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 용어 "상동성"은 서열 "동일성"과 같을 수 있다. 상동 서열은 대상 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8% 또는 99.9% 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 통상적으로, 상동체는 대상 아미노산 서열과 동일한 활성 부위 등을 포함할 것이다. 상동성은 유사성(즉, 유사한 화학적 성질/기능을 갖는 아미노산 잔기) 측면에서 고려될 수 있으며, 서열 동일성 측면에서 상동성을 표현할 수도 있다. 본 출원에서, 아미노산 서열 또는 뉴클레오티드 서열의 SEQ ID NO 중 어느 하나가 백분율 동일성을 갖는다고 언급된 서열 SEQ ID NO의 전체 길이 상에서 상기 백분율 동일성을 갖는 서열을 의미한다.

서열 동일성을 결정하기 위해, 서열 정렬을 수행할 수 있으며, 이는 당업자가 이해하는 다양한 방식에 의해 수행될 수 있고, 예를 들어 BLAST, BLAST-2, ALIGN, NEEDLE 또는 Megalign(DNASTAR) 소프트웨어 등을 사용한다. 당업자는 정렬을 위한 적절한 매개변수를 결정할 수 있으며, 여기에는 비교되는 전장 서열에서 최적의 정렬을 구현하는 데 필요한 임의의 알고리즘이 포함된다.

본 출원에서, 용어 "및/또는"은 선택 항목 중 어느 하나 또는 선택 항목 모두를 의미하는 것으로 이해되어야 한다.

본 출원에서, 용어 "포함" 또는 "포괄"은 통상적으로 명확하게 지정한 특징을 포함하는 것을 의미하나, 다른 요소를 배제하지는 않는다.

본 출원에서, 용어 "약"은 통상적으로 지정 값 이상 또는 이하 0.5% 내지 10% 범위 내의 변동을 지칭하며, 예를 들어 지정 값 이상 또는 이하 0.5%, 1%, 1.5%, 2%, 2.5%, 3%, 3.5%, 4%, 4.5%, 5%, 5.5%, 6%, 6.5%, 7%, 7.5%, 8%, 8.5%, 9%, 9.5% 또는 10%의 범위 내 변동이다.

발명의 상세한 내용

단백질 변이체

일 양상에서, 본 출원은 파상풍 간균 독소 단백질(tetanus toxin) 변이체(Tetanus Toxin Domain, TTD)를 제공하며, 야생형 파상풍 간균 독소 단백질(NBCI 등록번호 WP011100836)의 아미노산 서열과 비교할 때, 상기 파상풍 간균 독소 단백질 변이체는 상기 파상풍 간균 독소 단백질의 C 단편 및 상기 파상풍 간균 독소 단백질의 전좌 영역 부분 단편을 포함한다.

일부 경우에, 상기 파상풍 간균 단백질 변이체는 유전공학 재조합 단백질 기술을 통해, 파상풍 간균 독소 단백질 N-말단의 아미노산 서열을 제거하여, N-말단 부분 아미노산 서열을 포함하지 않는 새로운 단백질 단편을 획득하였다. 파상풍 간균 독소 단백질 N-말단의 A 단편은 신경전달물질이 방출되는 것을 억제함으로써 독성 작용을 일으킬 수 있으므로, 본 출원에서는, 독성이 있는 N-말단의 단편을 당업계의 통상적인 기술로 제거하였다.

일부 경우에, 상기 파상풍 간균 독소 단백질의 C 단편은 SEQ ID NO:3으로 표시되는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에, 상기 파상풍 간균 독소 단백질의 C 단편은 SEQ ID NO:3으로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 약 70%(예를 들어, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 적어도 약 100%)의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.

일부 경우에, 상기 파상풍 간균 독소 단백질 전좌 영역 부분 단편은 상기 파상풍 간균 독소 단백질의 전좌 영역의 T 세포 에피토프 P2를 포함한다.

일부 경우에, 예를 들어, 상기 파상풍 간균 독소 단백질 전좌 영역 부분 단편은 상기 파상풍 간균 독소 단백질의 829 내지 864번째 아미노산을 포함한다.

일부 경우에, 상기 파상풍 간균 독소 단백질 전좌 영역 부분 단편은 상기 파상풍 간균 독소 단백질 전좌 영역의 1 내지 36개 아미노산, 예를 들어 1개 아미노산, 2개 아미노산, 3개 아미노산, 4개 아미노산, 5개 아미노산, 6개 아미노산, 7개 아미노산, 8개 아미노산, 9개 아미노산, 10개 아미노산, 11개 아미노산, 12개 아미노산, 13개 아미노산, 14개 아미노산, 15개 아미노산, 16개 아미노산, 17개 아미노산, 18개 아미노산, 19개 아미노산, 20개 아미노산, 21개 아미노산, 22개 아미노산, 23개 아미노산, 24개 아미노산, 25개 아미노산 26개 아미노산, 27개 아미노산, 28개 아미노산, 29개 아미노산, 30개 아미노산, 31개 아미노산, 32개 아미노산, 33개 아미노산, 34개 아미노산, 35개 아미노산 또는 36개 아미노산을 포함할 수 있다.

일부 경우에, 상기 829 내지 864번째 아미노산은 SEQ ID NO:1로 표시되는 아미노산 서열의 1 내지 36번째 아미노산 잔기이다.

일부 경우에, 예를 들어, 상기 파상풍 간균 독소 단백질 전좌 영역 부분 단편은 상기 파상풍 간균 독소 단백질의 830 내지 864번째 아미노산, 831 내지 864번째 아미노산, 832 내지 864번째 아미노산, 833 내지 864번째 아미노산, 834 내지 864번째 아미노산, 835 내지 864번째 아미노산, 836 내지 864번째 아미노산, 837 내지 864번째 아미노산, 838 내지 864번째 아미노산, 839 내지 864번째 아미노산, 840 내지 864번째 아미노산, 841 내지 864번째 아미노산, 842 내지 864번째 아미노산, 843 내지 864번째 아미노산, 844 내지 864번째 아미노산, 845 내지 864번째 아미노산, 846 내지 864번째 아미노산, 847 내지 864번째 아미노산, 848 내지 864번째 아미노산, 849 내지 864번째 아미노산, 850 내지 864번째 아미노산, 851 내지 864번째 아미노산, 852 내지 864번째 아미노산, 853 내지 864번째 아미노산, 854 내지 864번째 아미노산, 855 내지 864번째 아미노산, 856 내지 864번째 아미노산, 857 내지 864번째 아미노산, 858 내지 864번째 아미노산, 859 내지 864번째 아미노산, 860 내지 864번째 아미노산, 861 내지 864번째 아미노산, 862 내지 864번째 아미노산, 863 내지 864번째 아미노산을 포함한다.

일부 경우에, 상기 파상풍 간균 독소 단백질의 전좌 영역 부분 단편은 SEQ ID NO:7로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.

일부 경우에, 상기 파상풍 간균 독소 단백질의 전좌 영역 부분 단편은 SEQ ID NO:8로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.

일부 경우에, 상기 파상풍 간균 독소 단백질은 SEQ ID NO:1 내지 3 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 약 70%(예를 들어, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 적어도 약 100%)의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.

일부 경우에, 상기 단백질 변이체는 상기 파상풍 간균 C 단편의 적어도 약 70%(예를 들어 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 적어도 약 100%)의 부분 및 상기 전좌 영역 단편의 적어도 약 70%(적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 적어도 약 100%)의 부분을 포함할 수 있다.

일부 경우에, 상기 단백질 변이체는 SEQ ID NO:1 내지 2 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에, 상기 단백질 변이체는 SEQ ID NO:1 내지 2 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 약 70%(예를 들어, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 적어도 약 100%)의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.

일부 경우에, 상기 단백질 변이체 아미노산 서열에 다양한 부가, 결실 및 치환을 수행하여, 분자의 담체 능력에 불리한 영향을 미치지 않으면서, 변이체를 생성할 수 있다. 예를 들어, 보존적 및 반보존적 아미노산 치환을 수행할 수 있다. 예시적인 보존적 아미노산 치환은 알라닌에서 세린으로; 아르기닌에서 라이신으로; 아스파라긴에서 글루타민 또는 히스티딘으로; 시스테인에서 세린으로; 글루타민에서 아스파라긴으로; 글루탐산에서 아스파르트산으로; 글리신에서 프롤린으로; 히스티딘에서 아스파라긴 또는 글루타민으로; 이소류신에서 류신 또는 발린으로; 류신에서 발린 또는 이소류신으로; 라이신에서 아르기닌, 글루타민 또는 글루탐산으로; 메티오닌에서 류신 또는 이소류신으로; 페닐알라닌에서 티로신, 류신 또는 메티오닌으로; 세린에서 트레오닌으로; 트레오닌에서 세린으로; 트립토판에서 티로신으로; 티로신에서 트립토판 또는 페닐알라닌으로; 발린에서 이소류신 또는 류신으로의 변형을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 예를 들어 단백질 공학 분야에서 통상의 당업자는, 본원에 언급된 보존적 및 반보존적 돌연변이가 TTD의 담체 기능에 영향을 미치지 않음을 이해할 것이다. 예를 들어, 다양한 목적을 위한 돌연변이에 적합한 영역(예를 들어, 폴리펩티드 "태그"를 부가하여 단백질의 정제를 단순화)에는 C-말단 및 N-말단 영역이 포함된다.

다른 일 양상에서, 본 출원은 핵산 분자를 제공하며, 여기에는 상기 파상풍 간균 독소 단백질을 암호화하는 변이체가 포함된다. 일부 경우에, TTD를 암호화하는 핵산 서열에는 야생형의 TTD 핵산 서열, 서열 단편, 상보적 서열 및/또는 이의 상동체가 포함된다. 일부 경우에, 상기 TTD를 암호화하는 핵산 서열에는 야생형 TTD 핵산 서열의 돌연변이, 절단, 치환 돌연변이 또는 전좌가 포함된다.

일부 경우에, 상기 TTD 단백질이 발현하는 핵산 암호화 서열은 코돈 최적화를 통해 획득한다. 예를 들어, 상기 TTD 단백질의 핵산 암호화 서열은 SEQ ID NO:4 내지 6 중 어느 하나로 표시된다. 예를 들어, 상기 코돈 최적화된 TTD 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO:4 내지 6 중 어느 하나로 표시되는 뉴클레오티드 서열과 적어도 약 70%(예를 들어, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 적어도 약 100%)의 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 상기 파상풍 간균 독소 단백질의 C 단편 핵산 암호화 서열은 코돈을 최적화하여 획득한다. 예를 들어, 상기 파상풍 간균 독소 단백질의 C 단편의 핵산 암호화 서열은 SEQ ID NO:6으로 표시된다. 예를 들어, 상기 코돈 최적화된 파상풍 간균 독소 단백질의 C 단편은 SEQ ID NO:6으로 표시되는 뉴클레오티드 서열과 적어도 약 70%(예를 들어, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 적어도 약 100%) 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 상기 코돈 최적화는 상기 TTD의 단백질 발현량을 향상시킬 수 있다. 예를 들어, 상기 코돈 최적화를 거친 후, 상기 TTD 단백질이 발현하는 핵산 서열이 세포에 도입된 후, 단백질 발현량, 서열 완전성, 서열 정확성 및/또는 증폭 상황이 적어도 약 10% 증가한다(예를 들어, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90% 또는 그 이상).

일부 경우에, 상기 TTD 단백질은 상기 T 세포 에피토프 p2를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 상기 T 세포 에피토프 p2는 파상풍 간균 독소 단백질 830 내지 844번째 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 상기 TTD 단백질은 상기 T 세포 에피토프 p2의 아미노산 서열과 적어도 약 70%(예를 들어, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 적어도 약 100%) 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다.

일부 경우에, 상기 TTD 단백질은 그 발현 서열을 단백질 발현 벡터에 클로닝함으로써, 고생산량의 단백질 발현을 구현할 수 있다. 일부 경우에, 상기 단백질 발현 벡터의 숙주는 당업계에서 일반적으로 사용되는 발현 시스템, 예를 들어, 대장균 발현 시스템, 피키아 파스토리스(Pichia pastoris) 발현 시스템, 또는 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 발현 시스템, 곤충 세포 발현 시스템, 식물 세포 발현 시스템 및/또는 포유동물 발현 시스템일 수 있다. 예를 들어, 상기 단백질 발현 시스템은 대장균 발현 시스템을 포함할 수 있다.

다른 일 양상에서, 본 출원은 벡터를 제공하며, 여기에는 상기 핵산 분자가 포함된다. 일부 경우에, 상기 벡터는 상기 핵산 분자, 복제 시작 부위, 선별 마커 유전자, 다중 클로닝 부위, 인핸서, 프로모터 및 터미네이터를 포함할 수 있다. 발현 벡터는 다양한 유형이 있을 수 있으며, 임의 적합한 발현 벡터를 사용할 수 있다. 통상적으로 사용하는 것은 플라스미드 발현 벡터, cosmid 벡터이며 바이러스 벡터가 더 있다. 일부 경우에, 상기 벡터는 원핵 발현 벡터 및 진핵 발현 벡터를 포함할 수 있다. 예를 들어 대장균 발현 시스템의 pET300, pET302, pBAD 벡터; M13과 기타 사상 단일 가닥 DNA 파지와 같은 파지 DNA의 유도체; 피키아 파스토리스 발현 시스템의 pPIC9, pPIC9K, pPIC3K, pPICZ; 바실러스 서브틸리스 발현 시스템의 pGPST, pEB10, pEB20, pUB18; 포유동물 발현 시스템의 SV40, 아데노바이러스, 레트로바이러스 유래의 DNA 서열의 잘 알려진 유도체와 기능성 포유동물 벡터(예를 들어 상술한 것들)의 조합 유래의 셔틀 벡터, 및 기능성 플라스미드와 파지 DNA가 있다. 일부 경우에, 상기 벡터는 pGEX-4T, pET21을 포함할 수 있다.

다른 일 양상에서, 본 출원은 세포를 제공하며, 상기 세포는 상기 핵산 분자 및/또는 상기 벡터를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 상기 핵산 분자는 코돈이 최적화된 TTD의 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 본 출원에 따른 세포는 발현이 정확한 상기 TTD 단백질일 수 있다. 상기 세포는 진핵 생물 및 원핵 생물 유래의 세포를 포함할 수 있으며, 예를 들어 사카로미세스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae), 피키아 파스토리스, 대장균, 바실러스 서브틸리스, sf9, 식물 세포, CHO 세포, HEK293 세포, COS 세포, BHK 세포, SP2/0 세포, NIH3T3 세포 등이 있다. 본 출원에서, 상기 세포는 대장균 세포를 포함할 수 있다.

다른 일 양상에서, 본 출원은 담체 단백질을 제공하며, 여기에는 상기 파상풍 간균 단백질 변이체 및 상기 단백질 변이체 유도체, 상동체, 유사체를 포함한다. 일부 경우에, 상기 파상풍 간균 단백질 변이체는 박테리아 유래의 다당류 또는 이로부터 유래된 올리고당을 결합할 수 있다. 일부 경우에, 상기 박테리아 다당류는 폐렴연쇄상구균 다당류, 야토균(Francisella tularensis) 다당류, 바실러스 안트라시스(Bacillus anthracis) 다당류, 헤모필루스 인플루엔자(Haemophilus influenzae) 다당류, 살모넬라 티피(Salmonella typhi) 다당류, 살모넬라 종 다당류 및 시겔라(Shigella) 다당류를 포함하나 이에 한정되지 않는다.

프로테오글리칸 복합체 및 제조 방법

다른 일 양상에서, 본 출원은 프로테오글리칸 접합체를 제공하며, 상기 프로테오글리칸 접합체는 상기 폐렴연쇄상구균 유래의 다당류 및 상기 파상풍 간균 독소 단백질 절단체(truncate)를 포함할 수 있다. 대부분의 다당류는 흉선 의존적 면역 응답 반응을 유도할 수 없으며, 2세 미만의 어린이나 노인은 면역력을 얻을 수 없기 때문에, 단백질 담체와 화학적으로 결합시켜 다당류가 흉선 의존적 특성을 갖도록 해야 하며, 이를 통해 비교적 강한 면역원성을 유도함과 동시에, 항다당류 및 항단백질의 항체를 유도할 수 있다.

일부 경우에, 상기 "폐렴연쇄상구균 유래의 다당류"는 폐렴연쇄상구균 협막 유래의 다당류와 다당류 유래의 올리고당을 포함할 수 있다. 상기 폐렴연쇄상구균은 자연 유래의 폐렴연쇄상구균일 수 있으며, 인위적으로 조작된 폐렴연쇄상구균일 수도 있다. 협막 다당류의 항원성에 따라, 폐렴연쇄상구균은 91가지의 혈청형을 포함할 수 있으며, 폐렴구균의 주요 병원성 혈청형에는 24가지가 포함될 수 있고, 이는 각각 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F 및 33F이다. 일부 경우에, 상기 프로테오글리칸 접합체의 다당류는 하나 이상의 폐렴연쇄상구균 혈청형을 가지며, 예를 들어, 적어도 1가지, 적어도 2가지, 적어도 3가지, 적어도 4가지, 적어도 5가지, 적어도 6가지, 적어도 7가지, 적어도 9가지, 적어도 12가지, 적어도 15가지 또는 적어도 24가지이다.

일부 경우에, 상기 프로테오글리칸 접합체의 다당류는 1, 3, 5, 6A, 6B, 7F, 10A, 12F, 15B, 19A, 19F 및 33F로 이루어진 군 중 어느 하나의 폐렴연쇄상구균 혈청형으로부터 선택될 수 있다.

본 출원에서, 상기 폐렴연쇄상구균 협막 유래의 당은 협막 다당류 유래의 올리고당을 더 포함할 수 있다. 상기 "다당류"는 통상적으로 적어도 10개의 단당류로 구성된 중합체 당류 고분자 탄수화물을 포함하는 것을 지칭한다. 상기 "올리고당"은 적어도 2개의 당 잔기를 포함한다. 폐렴연쇄상구균의 협막 다당류는 최대 8개 당 잔기를 포함하는 반복 올리고당 단위일 수 있다. 일부 경우에, 항원으로서 협막 당류는 전장 다당류일 수도 있고, 하나의 올리고당 단위일 수도 있고, 또는 반복 올리고당 단위의 자연 길이의 당 사슬보다 짧은 단위일 수도 있다. 일부 경우에, 상기 프로테오글리칸 접합체에 존재하는 모든 당은 모두 다당류이다.

일부 경우에, 상기 다당류 및/또는 올리고당은 자연 발생 다당류 및/또는 올리고당이 아닐 수 있으며, 이는 당업계에 공지된 임의 기술로 합성될 수도 있고, 자연 발생 화합물로부터 유도되거나 이를 변형하여 획득할 수도 있다. 예를 들어, 전장 다당류는 "크기 조정"을 거칠 수 있는데, 예를 들어 이들의 크기는 다양한 방법으로 축소될 수 있으며, 예를 들어 산 가수분해 처리, 과산화물 처리, 후속적으로 과산화물 처리를 하여 올리고당 단편을 생성함으로써 그 크기를 조정할 수 있다. 예를 들어 다당류 및/또는 올리고당에 대한 변형은 정제, 카르복실화, 술폰화, 황산화, 해중합 및/또는 탈아세틸화를 포함할 수 있다.

일부 경우에, 다당류 및/또는 올리고당에 대한 변형은 그 활성화 전일 수 있으며, 후처리의 단계를 채택할 수도 있다.

일부 경우에, 변형된 다당류 또는 올리고당은 야생형보다 항원성이 증가할 수 있다.

일부 경우에, 본 출원에 따른 다당류 및/또는 올리고당은 상기 폐렴연쇄상구균의 항원 결합 단편으로부터 유래할 수 있다.

일부 경우에, 본 출원에 따른 다당류 및/또는 올리고당은 상이한 유형 및/또는 균주 유래의 다당류 및/또는 올리고당의 단편이 합성 수단에 의해 연결되어, 복수의 에피토프를 포함하는 다당류 및/또는 올리고당을 형성할 수 있다.

일부 경우에, 폐렴연쇄상구균 다당류는 당업계에 공지된 기술로 제조할 수 있다. 예를 들어, 제조된 폐렴연쇄상구균 균종을 증폭 배양한 후 멸균 및 불활성화하고, 맑은 배양액을 수집하며, 다당류 침전제를 첨가한 다음, 정제 단계를 통해 정제 다당류를 획득한다. 정제 단계는 NaCl 용액을 첨가하여 복합 당을 용해시키고, 용해 후 원심분리하여, 상청액을 취하고, 알코올을 첨가하여 불순물 및 당 침전물을 제거하는 단계를 포함할 수 있다. 여러 번 세척 및 침전시켜 불순물을 제거하고, 이온 교환 컬럼 및 복합형 필러와 같은 크로마토그래피로 정제하여 정제된 다당류를 획득할 수 있다.

일부 경우에, 상기 파상풍 간균 독소 단백질 절단체(truncate)는 상기 파상풍 간균 독소 단백질의 C 단편 및 상기 파상풍 간균 독소 단백질 변이체를 포함할 수 있다.

일부 경우에, 상기 파상풍 간균 독소 단백질 절단체(truncate)는 상기 파상풍 간균 독소 단백질의 C 단편을 포함할 수 있다.

일부 경우에, 상기 파상풍 간균 독소 단백질 절단체(truncate)는 SEQ ID NO:1 내지 3 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 상기 파상풍 간균 독소 단백질 절단체(truncate)는 SEQ ID NO:1 내지 3 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 약 70%(예를 들어, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 적어도 약 100%)의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 상기 파상풍 간균 독소 단백질 절단체(truncate)를 발현하는 핵산 암호화 서열은 코돈을 최적화하여 획득한다. 예를 들어, 파상풍 간균 독소 단백질 절단체(truncate)의 핵산 암호화 서열은 SEQ ID NO:4 내지 6 중 어느 하나로 표시된다. 예를 들어, 상기 코돈 최적화된 파상풍 간균 독소 단백질 절단체(truncate)의 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO:4 내지 6 중 어느 하나로 표시되는 뉴클레오티드 서열과 적어도 약 70%(예를 들어, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 적어도 약 100%)의 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다.

일부 경우에, 상기 프로테오글리칸 접합체는 상기 파상풍 간균 독소 단백질의 절단체(truncate) 및 상기 어느 하나의 혈청형 폐렴연쇄상구균 유래의 협막 다당류 또는 이로부터 유래된 올리고당을 포함한다. 일부 경우에, 상기 프로테오글리칸 접합체는 상기 파상풍 간균 독소 단백질의 절단체(truncate) 및 상기 폐렴연쇄상구균 유래 협막 다당류 또는 이로부터 유래된 올리고당을 포함하며 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F 및 33F로 이루어진 군 중 어느 하나의 폐렴연쇄상구균 혈청형으로부터 선택된다. 일부 경우에, 상기 프로테오글리칸 접합체는 상기 파상풍 간균 독소 단백질의 절단체(truncate) 및 상기 폐렴연쇄상구균 유래 협막 다당류 또는 이로부터 유래된 올리고당을 포함하며 1, 3, 5, 6A, 6B, 7F, 10A, 12F, 15B, 19A, 19F 및 33F로 이루어진 군 중 어느 하나의 폐렴연쇄상구균 혈청형으로부터 선택된다. 일부 경우에, 상기 프로테오글리칸 접합체는 상기 파상풍 간균 독소 단백질의 C 단편 및 폐렴연쇄상구균 유래 협막 다당류 또는 이로부터 유래된 올리고당을 포함하며 1, 3, 5, 6A, 6B, 7F, 10A, 12F, 15B, 19A, 19F 및 33F로 이루어진 군 중 어느 하나의 폐렴연쇄상구균 혈청형으로부터 선택된다. 일부 경우에, 상기 프로테오글리칸 접합체는 상기 파상풍 간균 독소 단백질의 C 단편 및 폐렴연쇄상구균 유래 협막 다당류 또는 이로부터 유래된 올리고당을 포함하며 1, 3, 6A 및 15B로 이루어진 군 중 어느 하나의 폐렴연쇄상구균 혈청형으로부터 선택된다. 일부 경우에, 상기 프로테오글리칸 접합체는 상기 파상풍 간균 독소 단백질 변이체 TTD-1 및 폐렴연쇄상구균 유래 협막 다당류 또는 이로부터 유래된 올리고당을 포함하며 3, 6B, 7F 및 19A로 이루어진 군 중 어느 하나의 폐렴연쇄상구균 혈청형으로부터 선택된다. 일부 경우에, 상기 프로테오글리칸 접합체는 상기 파상풍 간균 독소 단백질 변이체 TTD-1 및 10A형 폐렴연쇄상구균 유래 협막 다당류 또는 이로부터 유래된 올리고당을 포함한다.

본 출원에서, 상기 단백질은 적어도 1개(예를 들어 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개 또는 적어도 5개)의 상기 다당류와 접합될 수 있으며, 상기 다당류는 1가지 또는 1가지 이상(예를 들어 적어도 2가지, 적어도 3가지 또는 적어도 4가지)의 폐렴연쇄상구균 혈청형의 다당류를 포함할 수 있다. 본 출원에서, 상기 다당류는 하나 이상의 단백질 분자와 접합될 수 있다(예를 들어 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개 또는 적어도 5개).

본 출원에서, 상기 "질량비"는 상기 다당류의 분자 질량과 상기 단백질의 분자 질량의 비율을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 상기 다당류와 상기 파상풍 간균 독소 단백질 절단체(truncate)의 질량비는 0.4 내지 2.5일 수 있다.

일부 경우에, 3형 폐렴연쇄상구균 다당류와 상기 단백질 절단체(truncate)의 질량비는 0.4 내지 2.5일 수 있다.

일부 경우에, 5형 폐렴연쇄상구균 다당류와 상기 단백질 절단체(truncate)의 질량비는 0.4 내지 2.5일 수 있다.

일부 경우에, 6A형 폐렴연쇄상구균 다당류와 상기 단백질 절단체(truncate)의 질량비는 0.4 내지 2.5일 수 있다.

일부 경우에, 6B형 폐렴연쇄상구균 다당류와 상기 단백질 절단체(truncate)의 질량비는 0.4 내지 2.5일 수 있다.

일부 경우에, 12F형 폐렴연쇄상구균 다당류와 상기 단백질 절단체(truncate)의 질량비는 0.4 내지 2.5일 수 있다.

일부 경우에, 15B형 폐렴연쇄상구균 다당류와 상기 단백질 절단체(truncate)의 질량비는 0.4 내지 2.5일 수 있다.

일부 경우에, 19A형 폐렴연쇄상구균 다당류와 상기 단백질 절단체(truncate)의 질량비는 0.4 내지 2.5일 수 있다.

일부 경우에, 19F형 폐렴연쇄상구균 다당류와 상기 단백질 절단체(truncate)의 질량비는 0.4 내지 2.5일 수 있다.

일부 경우에, 33F형 폐렴연쇄상구균 다당류와 상기 단백질 절단체(truncate)의 질량비는 0.4 내지 2.5일 수 있다.

본 출원에서, 상기 프로테오글리칸 접합체는 임의의 공지된 컨쥬게이트 기술에 의해 제조될 수 있다. 접합 방법은 1-시아노-4-디메틸아미노피리딘 테트라플루오로보레이트(1-cyano-4-dimethylaminopyridinie tetrafluoroborate, CDAP)를 이용한 당의 활성화에 의존하여 시아네이트 에스테르를 형성할 수 있다. 따라서 활성화된 당은 직접 또는 스페이서(링커)기를 통해 담체 단백질 상의 아미노와 접합될 수 있다. 예를 들어, 스페이서는 시스타민 또는 시스테아민일 수 있으며, 티올화(thiolated) 다당류를 생산하며, 후자는 말레이미드 활성화된 담체 단백질(예를 들어 GMBS 사용) 또는 할로아세틸화 담체 단백질(예를 들어 요오도아세트이미드(예를 들어 에틸 요오도아세트이미드) 또는 브로모아세트산 N-숙신이미딜 에스테르(bromoacetic acid N-succinimidyl ester) 또는 SIAB, 또는 SIA, 또는 SBAP 사용)과 반응 후에 획득된 티오에테르 결합을 통해 담체와 컨쥬게이트될 수 있다. 일부 경우에, 다당류의 특성에 따라, 브롬화시안법(US5952454), 1-시아노-4-디메틸아미노피리딘 테트라플루오로보레이트(1-cyano-4-dimethylaminopyridinie tetrafluoroborate, CDAP)(EP0720485), 과요오드산 산화법(US4711779)을 선택할 수 있다.

면역원성 개선 방법

다른 일 양상에서, 본 출원은 면역원성을 향상시키는 방법을 제공하며, 여기에는 폐렴연쇄상구균 유래의 다당류 및 파상풍 간균 독소 단백질 절단체(truncate)를 포함하는 프로테오글리칸 접합체를 제공하는 단계가 포함될 수 있다. 대부분의 다당류는 2형 T 세포 비의존적 항원(T cell-independent type 2, TI-2)에 속하며, 유기체에 유입된 후, B 세포 표면의 항원 인식 수용체, 즉 표면 면역글로불린 분자(surface immunoglobulin molecule, sIg)와 가교되어 B 세포를 활성화할 수 있으며, 일련의 다운스트림 변화를 일으키고, B 세포를 항체를 분비할 수 있는 형질 세포로 분화하며, 전체 면역 과정에 T 세포가 관여하지 않기 때문에, 면역 기억이 형성되지 않고, 생산되는 항체는 주로 친화력이 비교적 낮은 IgM과 IgG2이다. 당단백질을 결합한 후, 프로테오글리칸 접합체는 항체 제시 세포에 의해 제시될 수 있으며, 성숙한 B 세포는 T 헬퍼 세포에 의해 활성화되어, IgG 유사 항체를 유도하며, 면역 기억 응답을 일으킬 수 있다. 따라서 담체 단백질 유형은 다당류 접합체 면역원성에 영향을 미친다. 가장 전형적인 사례는 DT를 단백질 담체로 하는 Hib 접합 백신의 철시이다: 파상품류 독소(TT), CRM197 등의 단백질을 담체로 하는 접합 백신에 비해, DT를 담체로 하는 Hib 접합 백신은 생후 18개월 이하의 영유아에게서 면역원성이 비교적 낮기 때문에, 시판 후 도태되었다. 그 외, 11가 폐렴 접합 백신에 대한 해외 임상 연구에서, 디프테리아 혼합 백신과 함께 면역화할 경우, TT를 담체로 하는 다당류 혈청 항체가 현저하게 억제되는 것으로 나타났으며, 이 연구는 해당 결과로 인해 연구개발이 종료되었으나, 이러한 억제 효과는 DT를 담체로 하는 접합체에는 나타나지 않았다.

현재, 시판되는 접합 백신에 사용되는 담체 단백질에는 디프테리아 독소(DT), 디프테리아 독소 돌연변이체(CRM197), 파상풍류 독소(TT), B군 유행성 뇌척수막염 외막 단백질 복합체(OMP), 비정형 헤모필루스 인플루엔자 단백질 D(PD)가 포함된다. 현재 연구 및 개발 중인 담체 단백질로는 재조합 녹농균 외독소 A(rEPA), 재조합 황색포도상구균 장독소 C1(rSEC), 콜레라 독소 B 아단위(CTB) 등이 더 있다. 디프테리아 독소 비독성 변이체(CRM197)는 일반적으로 사용되는 것으로서, 임상적으로 안전하고 효과적인 담체 단백질로 입증되었으며, 이미 시판되는 폐렴구균 다당류 접합 백신에 널리 사용되고 있다. CRM197은 비독성 파지 β 197tox로 감염된 코리네박테리움 디프테리아(C diphtheriae)에 의해 생성되며, 파지 β 197tox는 독소 생성 carynephage b의 니트로소구아니딘(nitrosoguanidine) 돌연변이 유발에 의해 생성된다(Uchida 등 Nature New Biology (1971) 233;8-11). CRM197 단백질은 디프테리아 독소와 서열 및 분자량이 유사하나, 구조 유전자 중 단일 염기 변화에서 디프테리아 독소와 차이가 있다. 이로 인해 52번째 아미노산이 글리신에서 글루타민으로 바뀌며, 해당 변화는 단편이 NAD에 접합될 수 없게 만들어 독성을 갖지 않게 된다(Pappenheimer 1977, Ann Rev, Biochem. 46;69-94, Rappuoli Applied and Environmental Microbiology Sept 1983p560-564).

화이자에서 개발한 13가 폐렴구균 접합 백신 Prevenar-13은 2010년 미국에서 CRM197(디프테리아 독소 비독성 변이체)을 담체 단백질로 사용해 처음 출시되었으나, 임상 적용에서 상이한 혈청형 다당류의 면역원성은 상당히 다른 것으로 밝혀졌다. TTD는 신규한 담체 단백질로서 CRM197과의 비교는 중요한 임상적 의미와 가치가 있다. 본 출원에서, 상기 면역원성의 향상이란, 상기 다당류가 파상풍 간균 절단체(truncate)에 결합된 후, 다당류 면역원성을 향상시키는 작용을 갖는 것을 의미한다. 일부 경우에, 상기 면역원성의 개선은, 다당류 CRM197 접합체에 비해, 상기 다당류와 파상풍 간균 절단체(truncate)의 접합체가 나쁘지 않거나 더 높은 면역원성을 갖는다는 것을 포함한다.

본 출원에서, 상기 면역원성은 당업자가 익히 알고 있는 임의 방법으로 검출될 수 있다. 일부 경우에, 상기 검출 방법은 다음 단계를 포함할 수 있다: 다당류-단백질 절단체(truncate) 접합체 및 다당류-CRM197 접합체를 각각 선택적 보조제에 첨가하여, 면역 항원을 제조하고; 상기 면역 항원은 피험자 체내에 도입될 수 있으며, 일정 기간 내에 피험자의 혈액 샘플을 추출하여 검출을 수행한다. 본 출원에서, 상기 보조제는 수산화알루미늄 겔, 인산알루미늄 또는 명반의 알루미늄염을 포함할 수 있으나, 칼슘염, 마그네슘염, 철염 또는 아연염과 같은 다른 금속염일 수도 있고; 또는 아실화 티로신, 또는 아실화 당, 양이온 유도되거나 음이온 유도된 당, 또는 폴리포스파젠(polyphosphazene)을 함유한 불용성 혼합액일 수 있다. 일부 경우에, 상기 보조제는 수산화알루미늄, 인산알루미늄 및/또는 프로인트 보조제를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 상기 도입은 정맥주사, 복강주사, 근육주사, 피하주사 등을 통한 주사 방식을 포함할 수 있다.

일부 경우에, 상기 검출 방식은 가교 ELISA, 직접 ELISA, 간접 ELISA, 방사 면역 분석법, 전기 화학 발광법, 표면 플라즈몬 공명, ELISpot법, 면역 PCR법을 포함하여 면역 혈청 중의 항체 역가를 검출할 수 있다. 일부 경우에, 상기 검출 방법은 옵소노파고사이토시스 살균 시험을 통해 특이적 항체의 생성을 검출하는 것을 포함할 수 있다.

약학 조성물, 백신, 용도 및 예방 방법

다른 일 양상에서, 본 출원은 약학 조성물을 제공하며, 여기에는 상기 프로테오글리칸 접합체 및 선택적으로 약학적으로 허용 가능한 보조제가 포함된다. 적합한 보조제는 수산화알루미늄 겔, 인산알루미늄 또는 명반과 같은 알루미늄염을 포함할 수 있으나, 칼슘염, 마그네슘염, 철염 또는 아연염과 같은 다른 금속염일 수도 있고; 또는 아실화 티로신, 또는 아실화 당, 양이온 유도되거나 음이온 유도된 당, 또는 폴리포스파젠을 함유한 불용성 혼합액일 수 있다.

다른 일 양상에서, 본 출원은 약물 제조에서 파상풍 간균 독소 단백질 변이체의 용도를 제공한다. 일부 경우에, 상기 용도는 박테리아성 질환, 예를 들어 황색포도상구균, 표피포도상구균, α-용혈성 연쇄상구균, β-용혈성 연쇄상구균, 비용혈성 연쇄상구균, 폐렴구균, 장구균 등에 의해 유발되는 질환과 같은, 그람 양성 박테리아에 의해 유발되는 질환의 치료를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 상기 용도는 뇌수막염구균, 임균, 모락셀라 카라랄리스(Moraxella catarrhalis), 아시네토박터(Acinetobacter), 슈도모나스(Pseudomonas), 알칼리게네스 패칼리스(Alcaligenes faecalis), 브루셀라(Brucella), 백일해 간균(Bordetella pertussis), 레지오넬라(Legionella), 살모넬라(Salmonella), 시겔라(Shigella), 클렙시엘라(Klebsiella)와 같은 그람 음성 박테리아에 의해 유발되는 질환의 치료를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 상기 박테리아성 질환은 폐렴연쇄상구균성 질환을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 상기 폐렴연쇄상구균성 질환은 폐렴, 패혈증, 뇌수막염 및/또는 중이염을 포함할 수 있다.

다른 일 양상에서, 본 출원은 약물 제조에서 상기 다당류 접합체의 용도를 제공한다. 일부 경우에, 상기 용도는 박테리아성 질환의 예방 및/또는 치료를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 상기 박테리아성 질환은 폐렴연쇄상구균성 질환을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 상기 폐렴연쇄상구균성 질환은 폐렴, 패혈증, 뇌수막염 및/또는 중이염을 포함할 수 있다.

본 출원에서, 상기 "예방"은 통상적으로 질환 또는 이의 하나 이상의 증상의 발생 및 발병, 재발 및/또는 확산을 사전에 특정한 조치를 취함으로써 방지하는 것을 지칭한다. 상기 "치료"는 통상적으로 질환을 제거 또는 개선하거나, 질환과 관련된 하나 이상의 증상을 완화하는 것을 지칭한다. 예를 들어, 본 출원에 따른 파상풍 간균 독소 단백질 변이체 및/또는 이로 제조된 약물을 사용하여 박테리아성 질환의 발생, 발병, 재발 및/또는 확산을 방지한다. 예를 들어, 본 출원에 따른 다당류 접합체 및/또는 이로 제조된 약물을 사용하여 박테리아성 질환의 발생, 발병, 재발 및/또는 확산을 방지한다. 예를 들어, 상기 박테리아성 질환은 폐렴연쇄상구균성 질환일 수 있다. 예를 들어, 상기 폐렴연쇄상구균성 질환은 폐렴, 패혈증, 뇌수막염 및/또는 중이염을 포함할 수 있다.

다른 일 양상에서, 본 출원은 백신을 제공하며, 여기에는 상기 프로테오글리칸 접합체, 상기 약학 조성물 및/또는 선택적으로 약학적으로 허용 가능한 보조제가 포함될 수 있다. 상기 프로테오글리칸 접합체는 상기 파상풍 간균 독소 단백질 절단체(truncate), 상기 파상풍 간균 독소 단백질 변이체 및/또는 상기 파상풍 간균 독소 단백질의 C 단편을 포함할 수 있다. 각각의 유형의 담체 단백질은 하나 이상의 당의 담체로 사용될 수 있으며, 여기에서 상기 당은 동일하거나 상이할 수 있다. 예를 들어, 폐렴연쇄상구균 혈청형 3과 5는 동일한 담체 단백질과 접합되거나, 담체 단백질의 동일한 분자 또는 동일한 담체 단백질의 상이한 분자와 접합될 수 있다. 일부 경우에, 두 가지 이상의 상이한 당은 동일한 담체 단백질과 접합되거나, 담체 단백질의 동일한 분자 또는 동일한 담체 단백질의 상이한 분자와 접합될 수 있다.

본 출원의 약학 조성물을 함유하는 백신 제형은 계통 경로 또는 점막 경로를 통해 상기 백신을 투여할 수 있으며, 이는 감염되기 쉬운 포유동물의 보호 또는 치료에 사용된다. 이러한 투여는 근육, 복강내, 피내 또는 피하 경로를 통한 주사; 또는 점막을 통한 경구/소화관, 호흡기, 비뇨생식관으로의 투여를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 상기 약학 조성물의 조성은 동일한 시간 또는 상이한 시간에 병용 투여할 수 있다(예를 들어 동일한 시간 또는 백신의 임의 박테리아 단백질 조성을 투여하고 1 내지 2주 후, 폐렴연쇄상구균 당 접합체를 단독으로 투여하여, 이들 둘 상호 간의 면역 응답이 최적의 배합에 도달하도록 할 수 있음). 병용 투여하는 경우, 선택적 보조제가 임의 또는 모든 상이한 투여에 존재할 수 있다. 단일 투여 경로 외에, 2가지의 상이한 투여 경로를 사용할 수도 있다. 예를 들어, 당 또는 당 접합체는 근육내(또는 피내) 투여할 수 있으며, 박테리아 단백질은 점막(또는 피내) 투여할 수 있다.

다른 일 양상에서, 본 출원은 폐렴연쇄상구균성 질환을 예방하는 방법을 제공하며, 여기에는 필요로 하는 피험자에게 상기 프로테오글리칸 접합체, 상기 핵산 분자, 상기 벡터, 상기 세포, 상기 담체 단백질, 상기 약학 조성물 및/또는 상기 백신을 투여하는 단계가 포함될 수 있다. 일부 경우에, 상기 폐렴연쇄상구균성 질환은 폐렴, 패혈증, 뇌수막염 및/또는 중이염을 포함할 수 있다.

일부 경우에, 본 출원에서 제공하는 프로테오글리칸 접합체, 상기 약학 조성물 및/또는 약학적으로 허용 가능한 보조제는 항혈청을 제조하는 데 사용될 수 있다. 일부 경우에, 본 출원에서 제공하는 프로테오글리칸 접합체, 상기 약학 조성물 및/또는 약학적으로 허용 가능한 보조제는 항체를 제조하는 데 사용될 수 있다. 상기 프로테오글리칸 접합체는 상기 파상풍 간균 독소 단백질 절단체(truncate), 상기 파상풍 간균 독소 단백질 변이체 및/또는 상기 파상풍 간균 독소 단백질의 C 단편을 포함할 수 있다. 각각의 유형의 담체 단백질은 하나 이상의 당의 담체로 사용될 수 있으며, 여기에서 상기 당은 동일하거나 상이할 수 있다. 상기 당은 폐렴연쇄상구균 협막 다당류일 수 있다.

일부 경우에, 본 출원에서 제공하는 프로테오글리칸 접합체, 상기 약학 조성물 및/또는 약학적으로 허용 가능한 보조제는 샘플 중의 항체를 검출하는 데 사용될 수 있다. 일부 경우에, 본 출원에서 제공하는 프로테오글리칸 접합체, 상기 약학 조성물 및/또는 약학적으로 허용 가능한 보조제는 샘플 중의 항체를 검출하는 키트를 제조하는 데 사용될 수 있다.

예를 들어, 상기 항체는 박테리아의 항체일 수 있다. 예를 들어, 상기 박테리아의 항체는 폐렴연쇄상구균의 항체일 수 있다. 예를 들어, 폐렴연쇄상구균 혈청형 3의 항체, 폐렴연쇄상구균 혈청형 5의 항체, 폐렴연쇄상구균 혈청형 6A의 항체, 폐렴연쇄상구균 혈청형 6B의 항체, 폐렴연쇄상구균 혈청형 10A의 항체, 폐렴연쇄상구균 혈청형 12F의 항체, 폐렴연쇄상구균 혈청형 15B의 항체, 폐렴연쇄상구균 혈청형 19A의 항체 및/또는 폐렴연쇄상구균 혈청형 33F의 항체가 있다.

일부 경우에, 본 출원에서 제공하는 파상풍 간균 독소 단백질 변이체, 파상풍 간균 독소 단백질 절단체(truncate) 및/또는 상기 파상풍 간균 독소 단백질의 C 단편은 항-파상풍 간균 독소의 항체 제조, 항-파상풍 간균 독소의 항원 및/또는 백신 제조, 및/또는 파상풍 간균 독소 항체를 진단하는 키트에 사용될 수도 있다.

임의의 이론에 의해 제한하려는 의도가 아니며, 하기 실시예는 본 출원의 단백질 변이체, 제조 방법 및 용도 등을 설명하기 위한 것일 뿐이며, 본 발명의 범위를 제한하지 않는다.

실시예

실시예 1: TTD 재조합 단백질 서열 설계

이미 공개된 Clostridium tetani의 tetanus neurotoxin 서열(NBCI WP011100836) 및 이의 결정체 구조(PDB: 5N0B)를 기반으로, 본 출원은 파상풍 간균 독소 단백질 절단체(truncate)(Tetanus Toxin Domain, TTD)를 설계하여, 파상풍 간균 독소 단백질(Tetanus toxin, TT)의 N-말단 서열을 배제하고, 이의 C-말단 서열을 포함시켰다. 따라서 해당 TTD 단백질은 파상풍 간균 독소 단백질의 독성이 없으나, 그 C-말단의 도메인 및 기능적 단편을 보유하였으며, 단백질의 정상적인 절첩, 안정성을 유지하는 것을 기반으로, T 세포 에피토프와 구조적 유연성을 제공하여, 화학적 컨쥬게이트에 더욱 유리하다.

설계한 단백질 서열 01(TTD-1)은 TT 서열에서 N-말단 828개 아미노산을 제거한 후, 획득한 487개 아미노산을 포함하는 TTD 단백질 서열이며, 즉 N-말단의 펩티다제 M27 및 부분 전좌 영역이 제거되었고, C-말단의 기능적 도메인(수용체 결합 도메인)은 유지되었으며, 아미노산 서열은 SEQ ID NO:1로 표시된다. 상응하는 핵산 서열(TTD-4)는 코돈 최적화를 거친 후 SEQ ID NO:4로 표시된다.

설계한 단백질 서열 02(TTD-2)는 TT 서열에서 N-말단 839개 아미노산을 제거한 후, 획득한 476개 아미노산을 포함하는 TTD 단백질 서열이며, 즉 N-말단의 펩티다제 M27 및 부분 전좌 영역이 제거되었고, C-말단의 기능적 도메인(수용체 결합 도메인)은 유지되었으며, 아미노산 서열은 SEQ ID NO:2로 표시된다. 상응하는 핵산 서열(TTD-5)은 코돈 최적화를 거친 후 SEQ ID NO:5로 표시된다.

설계한 단백질 서열 03(TTD-3)은 TT 서열에서 N-말단 864개 아미노산을 제거한 후, 획득한 451개 아미노산을 포함하는 TTD 단백질 서열이며, 즉 N-말단의 펩티다제 M27 및 부분 전좌 영역이 제거되었고, C-말단의 기능적 도메인(수용체 결합 도메인)은 유지되었으며, 아미노산 서열은 SEQ ID NO:3으로 표시된다. 상응하는 핵산 서열(TTD-6)은 코돈 최적화를 거친 후 SEQ ID NO:6으로 표시된다.

실시예 2: 발현 벡터 구축 및 단백질 발현

대장균 단백질 발현 시스템을 이용하기 위해, 설계한 단백질 TTD 및 상응하는 유전자 서열을 순차적으로 유전자 서열 합성, 프라이머 설계, PCR 증폭, 분자 클로닝 등 일반적인 기술을 통해 단백질 발현 벡터에 구축하여(예를 들어 pGEX-4T, pET21), 재조합 발현 플라스미드를 획득하였다. 재조합 단백질 발현 플라스미드를 BL21(DE3) 수용성 세포(Thermo Fisher)에 형질전환시킨 후, 재조합 발현 플라스미드를 획득하였다. TTD-4, TTD-5 및 TTD-6의 PCR 전기영동 결과는 도 1에 도시된 바와 같다. 보존된 균종을 Amp⁺가 포함된 플레이트 상에 스트리킹하여 활성화시키고, 단일 클론을 선택하여 Amp⁺가 포함된 LB 액체 배지에 접종하였으며, 37℃ 및 250rpm에서 밤새 배양하였다. 배양된 균종을 비율에 따라 희석하여 Amp⁺가 함유된 LB 액체 배지에 접종하였으며, 37℃에서 OD600이 0.5 내지 1.5에 도달할 때까지 진탕 배양한 후, 1mM IPTG를 첨가하여 유도하였다. 배양 종료 후, 1mL 샘플을 취하여 원심분리하였으며, 상청액을 제거한 후 용해액을 첨가하였고, SDS-PAGE 전기영동 분석을 수행하여, 재조합 단백질의 발현을 확인하였다. 전기영동 결과는 도 2에 도시된 바와 같으며, 모두 표적 TTD 단백질을 획득하였다.

실시예 3: TTD 단백질의 정제

재조합 TTD 균종을 발효하여 수득한 균체 25g을, 10배의 50mM Tris-HCl 완충액을 사용해 250mL의 시스템으로 용해시키고, 고압 균질기로 2회 파쇄하였으며, 고속 원심분리를 거친 후 침전물을 제거하고, 상청액을 유지시켰다. 상청액에 황산암모늄을 첨가하여 침전시키고, 저온에서 2시간 동안 교반한 다음, 1시간 동안 고속 원심분리하여 침전물을 수집하였으며, 수집하여 획득한 침전물을 완충액으로 용해시킨 후, 한외여과를 통해 액체를 교환한 후, 각각 복합 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피를 통과시키고, 상이한 NaCl 농도 구배로 용출시켜, 불순물을 제거하였으며, 최종적으로 순도가 95%를 초과하는 TTD 단백질을 수득하였다. 정제 결과는 도 3에 도시된 바와 같다. 정제된 TTD 단백질의 SEC-HPLC 분석에 따르면, 단백질의 균일성이 우수하였다. TTD-1의 SEC-HPLC 결과는 도 4에 도시된 바와 같다.

실시예 4: 폐렴연쇄상구균 다당류 제조

제조된 폐렴연쇄상구균 균종(ATCC) 튜브 하나를 진탕 플라스크에 접종하고, 37℃ CO₂ 배양상자에서 하룻밤 배양한 후, 현미경 검사 결과 정상이면, 배양액을 10리터 발효기에 접종하여, 6 내지 10시간 동안 발효시켰다. 배양이 종료된 후, 불활성화제를 첨가하여 멸균 및 불활성화한 다음, 원심분리를 통해 맑은 배양액을 수집하고, 맑은 배양액에 다당류 침전제를 첨가하여, 조 침전 복합당을 수득하였다. 그 후 일련의 정제를 거쳐 정제 다당류를 획득하였다. 통상적으로 정제 다당류의 정제 공정은, NaCl 용액을 첨가하여 복합당을 용해시키고, 용해시킨 후 원심분리하여, 상청액을 취하고, 알코올을 첨가하여 불순물 및 침전된 당을 제거하는 단계를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 여러 번 세척 및 침전시켜 불순물을 제거하고, 이온 교환 컬럼 및 복합형 필러와 같은 크로마토그래피로 정제하여 정제된 다당류를 획득할 수 있다. 제조된 상이한 유형의 다당류는 질량 분석을 통과하였으며, 각각의 지표는 유럽 약전 표준에 부합하였는데, 예를 들어 단백질 및 핵산 등 불순물 함량이 모두 1% 미만이었다.

실시예 5: 폐렴연쇄상구균 다당류-단백질 접합체 제조

폐렴연쇄상구균 다당류는 활성화를 거친 후 담체 단백질과 화학적 반응 활성을 갖는다. 다당류-단백질 화학적 컨쥬게이트는 직접 컨쥬게이트되거나 링커를 통해 실시될 수 있으며, 예를 들어 링커 아디픽 디히드라자이드를 이용해 컨쥬게이트한다. 화학적 컨쥬게이트의 통상적인 방법에는 브롬화시안법, CDAP법 또는 환원 아민법이 있다(US5952454, EP0720485, US4711779). 컨쥬게이트을 통해 획득한 다당류-단백질 접합체는 비교적 강한 면역원성을 유도하며, 동시에 항다당류와 항단백질에 대한 특이적 항체를 유도할 수 있다.

브롬화시안법을 사용하여 박테리아성 다당류-단백질 접합체를 제조하는 단계는 다음과 같다: 정제 다당류 200mg을 0.9% NaCl 용액 20ml에 용해시키고, 브롬화시안을 첨가하며, 0.5N NaOH 용액을 첨가하고, 용액 pH를 10.5로 조정하고, 10 내지 15분 동안 반응시킨 후, 0.5N HCl을 첨가하여 용액 pH를 7.8로 조정하였다. 그 후 아디픽 디히드라자이드 용액(ADH)을 첨가하여 다당류-ADH 유도체를 제조하였다. 동시에 담체 단백질(TTD 또는 CRM97)과 EDC(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodimide hydrochloride)를 반응시켜, 담체 단백질 유도체를 제조하였다. 마지막으로 다당류-ADH 유도체와 활성화 담체 단백질을 비율에 따라 혼합한 후, 반응시켜 다당류-단백질 접합체를 생성한 다음, 한외여과 또는 크로마토그래피로 농축하여, 불순물 및 미반응 물질을 제거하였으며, 정제하여 다당류-단백질 접합체를 수득하였다.

CDAP법을 사용하여 박테리아 다당류-단백질 접합체를 제조하는 단계는 다음과 같다: 전형적인 반응에서, 폐렴 다당류(50mg)를 10ml의 붕산나트륨 완충액(100mM, pH 9.0)에 용해시킨 후, 순차적으로 CDAP 용액, 및 0.2 N NaOH 용액을 첨가하여 반응액의 pH를 9.0으로 조절하였다. 실온에서 교반하여 5 내지 10분 동안 반응시킨 후, 0.1N HCl 용액을 첨가하여 pH를 7.5로 조정하였다. 그 후 반응액을 G25 컬럼을 통해 탈염하여, 활성화된 다당류를 수집하였다. 동시에 담체 단백질을 0.1M NaHCO3 pH8.0 완충액에 용해시킨 후, 활성화된 다당류와 혼합하였으며, 상온에서 6 내지 10시간 동안 교반하였다. 반응이 종료된 후, 한외여과를 통해 농축하고 액체를 교체하며, 불순물을 제거하여, 최종적으로 다당류-단백질 접합체를 수득하였다.

환원 아민법을 사용하여 박테리아성 다당류-단백질 접합체를 제조하는 단계는 다음과 같다: 전형적인 반응에서, 동결건조된 다당류를 인산염 완충액(4mg/ml)에 용해시키고, 100mM 과요오드산나트륨 용액을 첨가하여, 밤새 교반하였으며, G25 컬럼을 통해 탈염하여, 활성화된 다당류를 수득하였다. 동시에 담체 단백질을 인산염 완충액에 용해시킨 후, 비율에 따라 활성화된 다당류 용액과 혼합하고, 일정 당량의 소듐 시아노보로하이드라이드(sodium cyanoborohydride)를 첨가하였으며, 실온 또는 37℃에서 밤새 교반하였다. 반응 종료 후, 반응액을 크로마토그래피하여, 불순물을 제거하였으며, 정제하여 다당류-단백질 접합체를 수득하였다.

실시예 6 내지 15: 프로테오글리칸 접합체의 면역원성 평가

마우스 면역 실험 방안: 폐렴연쇄상구균 다당류-단백질 접합체를 수산화알루미늄 또는 인산알루미늄 보조제에 첨가하여, 면역 항원을 제조하였으며, 6 내지 8주령의 Balb/c 마우스를 선택해 복강 면역을 수행하였고, 각각의 군의 마우스는 5 내지 8마리이며, 매회 면역 용량 2μg씩 0일째, 14일째, 21일째에 면역을 수행하였고, 21일째와 35일째에 채혈하여 그 다당류의 면역원성을 평가하였다.

토끼 면역 실험 방안: 다당류-단백질 접합체를 프로인트 보조제에 첨가하여, 면역 항원으로 제조하였고, 2 내지 2.5kg의 뉴질랜드 흰토끼를 선택하여, 각각의 군에 2마리씩 면역을 수행하였다. 처음에 프로인트 완전 보조제로 항원과 유화 혼합하여, 피하 면역을 수행하였고, 용량은 200㎍이었으며; 14일째에는 프로인트 불완전 보조제로 항원과 유화 혼합하여, 2차 피하 면역을 수행하였고, 용량은 200㎍이었으며; 28일째에는 100㎍ 항원으로 정맥 면역화를 수행하였다. 또한 21일째와 42일째에 혈액을 채취하여 이의 다당류의 면역원성을 평가하였다.

ELISA법으로 폐렴연쇄상구균 다당류 면역원성 평가: 폐렴연쇄상구균 다당류를 코팅 완충액으로 희석하고, 96-웰 ELISA 플레이트에 웰당 100μl씩 코팅하였으며, 37℃에서 5시간 동안 배양한 후 플레이트를 세척하였다. 마우스, 토끼 항혈청을 흡착제로 처리한 후, 마우스 혈청을 먼저 1:200으로 희석(토끼 혈청은 먼저 1:10000으로 희석)한 후, 2.5배 구배 희석을 수행하고, 8개 구배로 희석한 다음, ELISA 플레이트에 웰당 50μl씩 첨가하고, 밤새 배양하였다. 플레이트를 세척한 후, 2차 항체를 1:20000으로 희석한 후 ELISA 플레이트에 웰당 100μl씩 첨가하고, 2시간 배양한 후 플레이트를 세척한 다음, 1 mg/ml의 PNPP-Na 발색 기질을 웰당 100μl씩 첨가하고, 2시간 동안 배양한 후, 웰당 50μl씩 3M NaOH를 첨가하여 반응을 정지시키고, 기계에서 405nm의 파장에서의 흡광도를 판독하였다. 측정된 웰의 OD 값과 음성 웰의 OD 값의 비율이 2.1 이상이면 양성으로 판단하고, 각각의 혈청의 항체 역가는 희석 최대 배수를 양성으로 하는 희석 값으로 정의하며, 각각의 면역 동물군의 항체 역가의 기하 평균값을 계산하고, T-test를 이용하여 상이한 군 간의 통계학적 유의성을 분석하였다.

폐렴연쇄상구균 협막 다당류 특이적 항체 옵소노파고사이토시스 살균 시험: 폐렴연쇄상구균을 10⁵ CFU/ml로 희석하고, 96-웰 세포 작업 플레이트에 웰당 10μl씩 첨가하였다. 불활성화된 혈청 샘플을 구배 희석한 후 상술한 세포 작업 플레이트에 웰당 20μl씩 첨가하여, 균체와 항혈청을 700rpm/min에서 30분 동안 배양하였으며, DMF 분화된 HL-60 세포를 HBSS 완충액으로 세척한 후 1×10⁷개/ml 농도로 조정한 다음, 1×10⁷개/ml의 세포액을 희석된 보체와 부피비 1:4로 혼합하고, 혼합액을 웰당 50μl씩 96-웰 세포 작업 플레이트에 첨가하였다. 96-웰 세포 작업 플레이트를 믹서에 넣고, 5% CO₂, 온도가 37℃인 CO₂ 배양상자에 넣고, 45분간 진탕 배양하였다. 옵소노파고사이토시스가 중지된 후, 샘플을 혈액 플레이트에 점적하고, CO₂ 배양상자에서 밤새 배양하였다. 각각의 희석된 혈청 하의 살균율을 계산하였다.

실시예 6: 담체 단백질 TTD의 3형 다당류에 대한 면역 증강 효과

3형(T3) 폐렴연쇄상구균 다당류-TTD 접합체와 3형 폐렴연쇄상구균 다당류-CRM197의 면역 효과를 비교함으로써, 해당 유형의 폐렴연쇄상구균 다당류-TTD의 마우스에서의 면역 증강 효과를 분석하였다.

3형 다당류-CRM197 접합체 및 3형 다당류-TTD-1, 2, 3 접합체로 마우스를 각각 면역화하고, 21일째와 35일째의 항체 역가를 각각 평가하였다. 결과는 도 5에 도시된 바와 같이, 35일째에, T3-TTD-1, T3-TTD-2, T3-TTD-3군은 모두 더 높은 항체 역가를 유도할 수 있었다.

35일째 면역 혈청의 항체 역가에 대해 군 간 분석을 수행하였으며, ANOVA 일원 분산 분석에 따르면, T3-TTD군과 T3-CRM197군을 비교하면, P=0.001<0.01이며, 통계적 차이가 통계학적으로 매우 유의하였는데, 이는 TTD-1, TTD-2 및 TTD-3 담체 단백질이 모두 CRM197보다 더욱 현저한 면역 증강 효과를 가졌음을 설명한다.

T3-CRM197군과 T3-TTD-1군의 두 군을 35일째 면역 혈청에 대해 OPA 시험을 수행하였다. 결과는 도 6에 도시된 바와 같이, T3-CRM197와 T3-TTD-1, T3-TTD-2 및 T3-TTD-3의 IC₅₀(50% 살균율일 때 항혈청의 희석 배수)은 각각 1599와 9926, 7142 및 5728이었다. 이 결과는 TTD-1, TTD-2 및 TTD-3 담체 단백질 접합체가 유도 생성한 3형 다당류 특이적 항체가 모두 CRM197 담체 단백질 접합체보다 현저하게 많음을 보여준다.

실시예 7: 담체 단백질 TTD의 폐렴 6B형 다당류에 대한 면역 증강 효과

6B형(T6B) 폐렴연쇄상구균 다당류-TTD-1 접합체와 6B형 폐렴연쇄상구균 다당류-CRM197의 면역 효과를 비교함으로써, 해당 유형의 폐렴연쇄상구균 다당류-TTD-1의 마우스에서의 면역 증강 효과를 분석하였다.

6B형 다당류-CRM197 접합체 및 6B형 다당류-TTD-1 접합체로 마우스를 각각 면역화하고, 21일째와 35일째의 항체 역가를 각각 평가하였다. 결과는 도 7에 도시된 바와 같이, 35일째에, 6B 다당류-TTD-1 접합체는 더 높은 항체 역가를 유도할 수 있었다.

6B-TTD-1군, 6B-CRM197군의 두 군의 21일째 및 35일째의 면역 혈청에 대해 OPA 시험을 수행하였다. 결과는 도 8에 도시된 바와 같이, 6B-TTD-1과 6B-CRM197 면역 21일째 혈청의 IC₅₀(50% 살균율일 때 항혈청의 희석 배수)은 각각 2851과 746.3이었고, 6B-TTD-1과 6B-CRM197 면역 35일째 혈청의 IC₅₀(50% 살균율일 때 항혈청의 희석 배수)은 각각 7677과 1802였으며, 이는 TTD-1 담체 단백질 접합체가 CRM197 담체 단백질 접합체보다 더 높은 6B형 다당류 특이적 기능성 항체를 유도할 수 있음을 보여준다.

실시예 8: 담체 단백질 TTD의 폐렴 15B형 다당류에 대한 면역 증강 효과

15B형(T15B) 폐렴연쇄상구균 다당류-TTD-3 접합체와 15B형 폐렴연쇄상구균 다당류-CRM197의 면역 효과를 비교함으로써, 해당 유형의 폐렴연쇄상구균 다당류-TTD의 마우스에서의 면역 증강 효과를 분석하였다.

15B형 다당류-CRM197 접합체와 15B형 다당류-TTD-3 접합체로 각각 마우스를 면역화시킨 후, 21일째와 35일째의 항체 역가를 각각 평가하였으며, 그 결과를 도 9에 도시된 바와 같이, 35일째에, 다당류-TTD-3 접합체는 보다 높은 항체 역가를 유도할 수 있었다.

15B-CRM197군과 15B-TTD-3군의 두 군에서 21일째와 35일째의 면역 혈청에 대해 OPA 시험을 수행하였다. 결과는 도 10에 도시된 바와 같이, 15B-CRM197과 15B-TTD-3의 21일째 면역 혈청 IC₅₀이 각각 1392와 2633이었다. 15B-CRM197과 15B-TTD-3의 35일째 면역 혈청 IC₅₀은 각각 9005와 14997이었다. 이는 TTD-3 담체 단백질 접합체가 유도 생산한 15B형 다당류 특이적 항체가 CRM197 담체 단백질 접합체보다 현저하게 많음을 보여준다.

실시예 9: 담체 단백질 TTD의 폐렴 6A형 다당류에 대한 면역 증강 효과

6A형(T6A) 폐렴연쇄상구균 다당류-CRM197 접합체 및 6A형 다당류-TTD-3 접합체로 마우스를 면역화하고, 21일째 및 35일째에 항체 역가를 각각 평가하였다(도 11 참조). 35일째에, 다당류-TTD 접합체는 다당류-CRM197보다 낮지 않은 항체 역가를 유도할 수 있었다.

T6A-CRM197군과 T6A-TTD-3군의 두 군에서 21일째와 35일째의 면역 혈청에 대해 OPA 시험을 수행하였다. 결과는 도 12에 도시된 바와 같이, T6A-CRM197과 T6A-TTD-3의 21일째 면역 혈청 IC₅₀이 각각 458과 1606이었다. T6A-CRM197과 T6A-TTD-3의 35일째 면역 혈청 IC₅₀은 각각 9103과 20850이었다. 이는 TTD-3 담체 단백질 접합체가 유도 생산한 6A형 다당류 특이적 항체가 CRM197 담체 단백질 접합체보다 현저하게 높음을 보여준다.

실시예 10: 담체 단백질 TTD의 폐렴 7F형 다당류에 대한 면역 증강 효과

7F형(T7F) 폐렴연쇄상구균 다당류-TTD-1 접합체와 다당류-CRM197 접합체의 비교를 수행하였다. 다당류-CRM197 접합체 및 다당류-TTD-1 접합체로 마우스를 각각 면역화하고, 21일째와 35일째의 항체 역가를 각각 평가하였다. 결과는 도 13에 도시된 바와 같이, 35일째에, 7F 다당류-TTD-1 접합체는 다당류-CRM197의 항체 역가에 상당하도록 유도할 수 있었다.

T7F-CRM197군과 T7F-TTD-1군의 두 군에서 21일째와 35일째의 면역 혈청에 대해 OPA 시험을 수행하였다. 결과는 도 14에 도시된 바와 같이, T7F-CRM197과 T7F-TTD-1의 21일째 면역 혈청 IC₅₀이 각각 1213과 1925이었다. T7F-CRM197과 T7F-TTD-1의 35일째 면역 혈청 IC₅₀은 각각 5362과 7975이었다. 이는 TTD-1 담체 단백질 접합체가 유도 생산한 7F형 다당류 특이적 항체가 CRM197 담체 단백질 접합체보다 낮지 않음을 보여준다.

실시예 11: 담체 단백질 TTD의 폐렴 10A형 다당류에 대한 면역 증강 효과

10A형(T10A) 폐렴연쇄상구균 다당류-TTD-2 접합체와 다당류-CRM197 접합체의 비교를 수행하였다. 다당류-CRM197 접합체와 다당류-TTD-2 접합체로 각각 마우스를 면역화시킨 후, 21일째와 35일째의 항체 역가를 각각 평가하였으며, 그 결과는 도 15에 도시된 바와 같이, 35일째에, 10A형 다당류-TTD-2 접합체는 다당류-CRM197 접합체보다 높은 항체 역가를 유도할 수 있었다.

T10A-CRM197군과 T10A-TTD-2군의 두 군을 35일째 면역 혈청에 대해 OPA 시험을 수행하였다. 결과는 도 16에 도시된 바와 같이, T10A-CRM197과 T10A-TTD-2의 35일째 면역 혈청 IC₅₀은 각각 23264 및 30709였다. 결과는 TTD-2 담체 단백질 접합체가 유도 생산한 10A형 다당류 특이적 항체가 CRM197 담체 단백질 접합체에 상당하였음을 보여준다.

실시예 12: 담체 단백질 TTD의 폐렴 19A형 다당류에 대한 면역 증강 효과

19A형(T19A) 폐렴연쇄상구균 다당류-TTD 접합체와 19A형 폐렴연쇄상구균 다당류-CRM197의 면역 효과를 비교함으로써, 해당 유형의 폐렴연쇄상구균 다당류-TTD의 뉴질랜드 흰토끼에서의 면역 증강 효과를 분석하였다.

19A형 다당류-CRM197 접합체 및 19A형 다당류-TTD-1 접합체로 뉴질랜드 흰토끼를 각각 면역화하고, 21일째와 42일째의 항체 역가를 각각 평가하였다. 결과는 도 17에 도시된 바와 같이, 42일째에, 다당류-TTD 접합체는 더 높은 항체 역가를 유도할 수 있었다.

T19A-CRM197군과 T19A-TTD-1군의 두 군을 42일째 면역 혈청에 대해 OPA 시험을 수행하였다. 결과는 도 18에 도시된 바와 같이, 19A-CRM197과 19A-TTD-1의 42일째 면역 혈청 IC₅₀은 각각 8617 및 35780였다. 결과는 TTD-1 담체 단백질 접합체가 유도 생산한 19A형 다당류 특이적 항체가 CRM197 담체 단백질 접합체보다 현저하게 많음을 보여준다.

실시예 13: 담체 단백질 TTD의 폐렴 1형 다당류에 대한 면역 증강 효과

1형(T1) 폐렴연쇄상구균 다당류-TTD-3 접합체와 다당류-CRM197 접합체의 비교를 수행하였다. 다당류-CRM197 접합체 및 다당류-TTD-3 접합체로 토끼를 각각 면역화하고, 21일째와 42일째의 항체 역가를 각각 평가하였다. 결과는 도 19에 도시된 바와 같이, 42일째에, 다당류-TTD 접합체는 더 높은 항체 역가를 유도할 수 있었다.

T1-CRM197군과 T1-TTD-3군의 두 군에서 21일째와 42일째의 면역 혈청에 대해 OPA 시험을 수행하였다. 결과는 도 20에 도시된 바와 같이, T1-CRM197과 T1-TTD-3의 21일째 면역 혈청 IC₅₀이 각각 6523과 35571이었다. T1-CRM197과 T1-TTD-3의 42일째 면역 혈청 IC₅₀은 각각 193732와 493114이었다. 이는 TTD-3 담체 단백질 접합체가 유도 생산한 1형 다당류 특이적 항체가 CRM197 담체 단백질 접합체보다 현저하게 높음을 보여준다.

실시예 14: 담체 단백질 TTD의 기타 유형 폐렴연쇄상구균 다당류에 대한 면역 증강 효과

다른 혈청형 폐렴연쇄상구균 다당류 접합체에는, 예를 들어 5, 12F, 33F, 19F가 있다. 다당류-CRM197 접합체 및 다당류-TTD 접합체로 마우스를 각각 면역화하고, 21일째와 35일째의 항체 역가를 각각 평가하였다(도 21에 도시된 바와 같음). 35일째에, 다당류-TTD 접합체는 더 높은 항체 역가를 유도할 수 있었다.

본 발명은 동시에 TTD 단백질의 다른 혈청형 폐렴 다당류에 대한 면역 증강 효과를 비교하였으며, TTD 단백질이 CRM197보다 더 높은 면역원성을 유도할 수 있음을 발견하였다. 예를 들어, 다당류-CRM197 접합체와 다당류-TTD 접합체로 마우스를 각각 면역화하고, 21일째와 35일째의 항체 역가를 각각 평가하였는데, 35일째에, 다당류-TTD 접합체가 유도한 항체 역가와 다당류-CRM197 접합체의 항체 역가 비율이 2 내지 20배에 달했으며, 이는 담체 단백질로서 TTD의 장점을 더욱 설명한다.

실시예 15: 다당류와 TTD 변이체 접합체의 면역원성

TTD 변이체의 설계: 단백질 서열 01, 02 및 03을 기반으로, N-말단에서 길이가 상이한 아미노산을 절단하고, 이의 C-말단 서열을 포함시켰다.

다당류-TTD 변이체 접합체의 면역원성: X형 다당류-CRM197 접합체(TX-CRM197군) 및 X형 다당류-TTD 접합체(TX-TTD)로 마우스를 각각 면역화하고, 21일째 및 35일째에 항체 역가를 각각 평가하였다. 35일째에, 다당류-TTD 접합체는 더 높은 항체 역가를 유도할 수 있었다. X는 어느 하나의 폐렴연쇄상구균 다당류 당 유형이다.

TX-CRM197군과 TX-TTD군의 두 군을 35일째 면역 혈청에 대해 OPA 시험을 수행하였다. 결과는 TTD 담체 단백질 접합체가 유도 생산한 X형 다당류 특이적 항체가 CRM197 담체 단백질 접합체보다 현저하게 많다는 것을 보여준다.

전술한 상세한 설명은 첨부된 청구범위를 제한하기 위한 것이 아니며, 설명 및 예시의 방식으로 제공되었다. 당업자는 현재 본 출원에 나열된 구현예의 다양한 변형을 용이하게 수행할 수 있으며, 이는 첨부된 청구범위 및 그 등가물의 범위 내에 속한다.

SEQUENCE LISTING <110> SHANGHAI REINOVAX BIOLOGICS CO., LTD <120> Proteoglycan conjugate and application thereof <130> 0180-PA-003 <160> 8 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 487 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> TTD-1 <400> 1 Met Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu 1 5 10 15 Lys Lys Leu Glu Ser Lys Ile Asn Lys Val Phe Ser Thr Pro Ile Pro 20 25 30 Phe Ser Tyr Ser Lys Asn Leu Asp Cys Trp Val Asp Asn Glu Glu Asp 35 40 45 Ile Asp Val Ile Leu Lys Lys Ser Thr Ile Leu Asn Leu Asp Ile Asn 50 55 60 Asn Asp Ile Ile Ser Asp Ile Ser Gly Phe Asn Ser Ser Val Ile Thr 65 70 75 80 Tyr Pro Asp Ala Gln Leu Val Pro Gly Ile Asn Gly Lys Ala Ile His 85 90 95 Leu Val Asn Asn Glu Ser Ser Glu Val Ile Val His Lys Ala Met Asp 100 105 110 Ile Glu Tyr Asn Asp Met Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu 115 120 125 Arg Val Pro Lys Val Ser Ala Ser His Leu Glu Gln Tyr Gly Thr Asn 130 135 140 Glu Tyr Ser Ile Ile Ser Ser Met Lys Lys His Ser Leu Ser Ile Gly 145 150 155 160 Ser 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285 Tyr Tyr Leu Ile Pro Val Ala Ser Ser Ser Lys Asp Val Gln Leu Lys 290 295 300 Asn Ile Thr Asp Tyr Met Tyr Leu Thr Asn Ala Pro Ser Tyr Thr Asn 305 310 315 320 Gly Lys Leu Asn Ile Tyr Tyr Arg Arg Leu Tyr Asn Gly Leu Lys Phe 325 330 335 Ile Ile Lys Arg Tyr Thr Pro Asn Asn Glu Ile Asp Ser Phe Val Lys 340 345 350 Ser Gly Asp Phe Ile Lys Leu Tyr Val Ser Tyr Asn Asn Asn Glu His 355 360 365 Ile Val Gly Tyr Pro Lys Asp Gly Asn Ala Phe Asn Asn Leu Asp Arg 370 375 380 Ile Leu Arg Val Gly Tyr Asn Ala Pro Gly Ile Pro Leu Tyr Lys Lys 385 390 395 400 Met Glu Ala Val Lys Leu Arg Asp Leu Lys Thr Tyr Ser Val Gln Leu 405 410 415 Lys Leu Tyr Asp Asp Lys Asn Ala Ser Leu Gly Leu Val Gly Thr His 420 425 430 Asn Gly Gln Ile Gly Asn Asp Pro Asn Arg Asp Ile Leu Ile Ala Ser 435 440 445 Asn Trp Tyr Phe Asn His Leu Lys Asp Lys Ile Leu Gly Cys Asp Trp 450 455 460 Tyr Phe Val Pro Thr Asp Glu Gly Trp Thr Asn Asp 465 470 475 <210> 3 <211> 451 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> TTD-3 <400> 3 Lys Asn Leu Asp Cys Trp Val Asp Asn Glu Glu Asp Ile Asp Val Ile 1 5 10 15 Leu Lys Lys Ser Thr Ile Leu Asn Leu Asp Ile Asn Asn Asp Ile Ile 20 25 30 Ser Asp Ile Ser Gly Phe Asn Ser Ser Val Ile Thr Tyr Pro Asp Ala 35 40 45 Gln Leu Val Pro Gly Ile Asn Gly Lys Ala Ile His Leu Val Asn Asn 50 55 60 Glu Ser Ser Glu Val Ile Val His Lys Ala Met Asp Ile Glu Tyr Asn 65 70 75 80 Asp Met Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg Val Pro Lys 85 90 95 Val Ser Ala Ser His Leu Glu Gln Tyr Asp Thr Asn Glu Tyr Ser Ile 100 105 110 Ile Ser Ser Met Lys Lys Tyr Ser Leu Ser Ile Gly Ser Gly Trp Ser 115 120 125 Val Ser Leu Lys Gly Asn Asn Leu Ile Trp Thr Leu Lys Asp Ser Ala 130 135 140 Gly Glu Val Arg Gln Ile Thr Phe Arg Asp Leu Ser Asp Lys Phe Asn 145 150 155 160 Ala Tyr Leu Ala Asn Lys Trp Val Phe Ile Thr Ile Thr Asn Asp Arg 165 170 175 Leu Ser Ser Ala Asn Leu Tyr Ile Asn Gly Val Leu Met Gly Ser Ala 180 185 190 Glu Ile Thr Gly Leu Gly Ala Ile Arg Glu Asp Asn Asn Ile Thr Leu 195 200 205 Lys Leu Asp Arg Cys Asn Asn Asn Asn Gln Tyr Val Ser Ile Asp Lys 210 215 220 Phe Arg Ile Phe Cys Lys Ala Leu Asn Pro Lys Glu Ile Glu Lys Leu 225 230 235 240 Tyr Thr Ser Tyr Leu Ser Ile Thr Phe Leu Arg Asp Phe Trp Gly Asn 245 250 255 Pro Leu Arg Tyr Asp Thr Glu Tyr Tyr Leu Ile Pro Val Ala Tyr Ser 260 265 270 Ser Lys Asp Val Gln Leu Lys Asn Ile Thr Asp Tyr Met Tyr Leu Thr 275 280 285 Asn Ala Pro Ser Tyr Thr Asn Gly Lys Leu Asn Ile Tyr Tyr Arg Arg 290 295 300 Leu Tyr Ser Gly Leu Lys Phe Ile Ile Lys Arg Tyr Thr Pro Asn Asn 305 310 315 320 Glu Ile Asp Ser Phe Val Arg Ser Gly Asp Phe Ile Lys Leu Tyr Val 325 330 335 Ser Tyr Asn Asn Asn Glu His Ile Val Gly Tyr Pro Lys Asp Gly Asn 340 345 350 Ala Phe Asn Asn Leu Asp Arg Ile Leu Arg Val Gly Tyr Asn Ala Pro 355 360 365 Gly Ile Pro Leu Tyr Lys Lys Met Glu Ala Val Lys Leu Arg Asp Leu 370 375 380 Lys Thr Tyr Ser Val Gln Leu Lys Leu Tyr Asp Asp Lys Asp Ala Ser 385 390 395 400 Leu Gly Leu Val Gly Thr His Asn Gly Gln Ile Gly Asn Asp Pro Asn 405 410 415 Arg Asp Ile Leu Ile Ala Ser Asn Trp Tyr Phe Asn His Leu Lys Asp 420 425 430 Lys Thr Leu Thr Cys Asp Trp Tyr Phe Val Pro Thr Asp Glu Gly Trp 435 440 445 Thr Asn Asp 450 <210> 4 <211> 1458 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TTD-4 <400> 4 cagtatataa aagcaaattc taaatttata ggtataactg aactaaaaaa attagaatca 60 aaaataaaca aagttttttc aacaccaatt ccattttctt attctaaaaa tctggattgt 120 tgggttgata atgaagaaga tatagatgtt atattaaaaa agagtacaat tttaaattta 180 gatattaata atgatattat atcagatata tctgggttta attcatctgt aataacatat 240 ccagatgctc aattggtgcc cggaataaat ggcaaagcaa tacatttagt aaacaatgaa 300 tcttctgaag ttatagtgca taaagctatg gatattgaat ataatgatat gtttaataat 360 tttaccgtta gcttttggtt gagggttcct aaagtatctg ctagtcattt agaacaatat 420 ggcacaaatg agtattcaat aattagctct atgaaaaaac atagtctatc aataggatct 480 ggttggagtg tatcacttaa aggtaataac ttaatatgga ctttaaaaga ttccgcggga 540 gaagttagac aaataacttt tagggattta cctgataaat ttaatgctta tttagcaaat 600 aaatgggttt ttataactat tactaatgat agattatctt ctgctaattt gtatataaat 660 ggagtactta tgggaagtgc agaaattact ggtttaggag ctattagaga ggataataat 720 ataacattaa aactagatag atgtaataat aataatcaat acgtttctat tgataaattt 780 aggatatttt gcaaagcatt aaatccaaaa gagattgaaa aattatacac aagttattta 840 tctataacct ttttaagaga cttctgggga aaccctttac gatatgatac agaatattat 900 ttaataccag tagcttctag ttctaaagat gttcaattga aaaatataac agattatatg 960 tatttgacaa atgcgccatc gtatactaac ggaaaattga atatatatta tagaaggtta 1020 tataatggac taaaatttat tataaaaaga tatacaccta ataatgaaat agattctttt 1080 gttaaatcag gtgattttat taaattatat gtatcatata acaataatga gcacattgta 1140 ggttatccga aagatggaaa tgcctttaat aatcttgata gaattctaag agtaggttat 1200 aatgccccag gtatccctct ttataaaaaa atggaagcag taaaattgcg tgatttaaaa 1260 acctattctg tacaacttaa attatatgat gataaaaatg catctttagg actagtaggt 1320 acccataatg gtcaaatagg caacgatcca aatagggata tattaattgc aagcaactgg 1380 tactttaatc atttaaaaga taaaatttta ggatgtgatt ggtactttgt acctacagat 1440 gaaggatgga caaatgat 1458 <210> 5 <211> 1428 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TTD-5 <400> 5 ggaattacag aattaaaaaa gctggagagt aagataaata aggtttttag cacgcctata 60 cctttctcgt atagtaaaaa ccttgactgc tgggtggata acgaagagga catcgacgtc 120 atattgaaaa aatcgactat tttaaattta gacattaaca atgacattat ttcggacatt 180 tcaggcttta actcatcagt aataacttat cctgacgcac aattggtccc tggaatcaac 240 ggtaaagcca tccatctggt gaacaacgaa agttccgaag tgattgtcca taaagctatg 300 gacattgagt ataacgatat gtttaataat ttcactgtga gtttttggct gcgtgtccct 360 aaagtatctg ccagtcactt agagcaatat ggtacgaacg aatactcgat aatttcatct 420 atgaaaaaac atagcttgtc aatcggctca ggctggtccg tctcactgaa gggcaataat 480 cttatctgga ccctgaagga ctctgcgggt gaagtacggc agatcacgtt tagagatctt 540 ccggataaat ttaacgctta tttagcgaac aaatgggtct ttatcactat cacaaatgat 600 cgtctgtcga gcgccaacct ttatattaac ggagtactga tgggtagtgc tgagattacc 660 ggacttggag cgattcggga agacaacaac atcaccctta aacttgatcg ttgtaacaat 720 aataatcagt acgtgagcat cgacaagttt cggatatttt gtaaggcgtt aaatccgaag 780 gaaattgaaa aattatatac atcgtatctg tcaatcactt tcttgcggga tttctggggg 840 aatcctcttc ggtatgatac cgaatactat cttatacctg tggcatctag tagtaaggat 900 gtacagttga agaacattac agattatatg tatcttacca atgcacccag ttacacaaac 960 ggcaagttaa atatctatta tcgccggctt tataacggtc tgaaattcat cataaaaaga 1020 tacactccca acaacgagat agattctttt gtcaagagcg gagacttcat taagttatat 1080 gtcagctaca acaacaatga gcacatagtt ggctacccaa aggacggaaa cgcgtttaac 1140 aacctggatc gtatactgcg ggtgggctat aacgcgcctg ggattccctt gtataaaaag 1200 atggaagcag taaaattgcg cgacttgaag acgtactccg tacaacttaa actttacgac 1260 gacaaaaatg cgagtcttgg attggttggt acgcacaacg gacagatcgg gaatgatccg 1320 aaccgtgaca tcttaattgc atcaaattgg tactttaatc atttgaaaga caaaatcctt 1380 ggctgcgatt ggtattttgt tccgactgat gaggggtgga cgaacgac 1428 <210> 6 <211> 1353 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TTD-6 <400> 6 aaaaaccttg actgctgggt ggataacgaa gaggacatcg acgtcatatt gaaaaaatcg 60 actattttaa atttagacat taacaatgac attatttcgg acatttcagg ctttaactca 120 tcagtaataa cttatcctga cgcacaattg gtccctggaa tcaacggtaa agccatccat 180 ctggtgaaca acgaaagttc cgaagtgatt gtccataaag ctatggacat tgagtataac 240 gatatgttta ataatttcac tgtgagtttt tggctgcgtg tccctaaagt atctgccagt 300 cacttagagc aatatggtac gaacgaatac tcgataattt catctatgaa aaaacatagc 360 ttgtcaatcg gctcaggctg gtccgtctca ctgaagggca ataatcttat ctggaccctg 420 aaggactctg cgggtgaagt acggcagatc acgtttagag atcttccgga taaatttaac 480 gcttatttag cgaacaaatg ggtctttatc actatcacaa atgatcgtct gtcgagcgcc 540 aacctttata ttaacggagt actgatgggt agtgctgaga ttaccggact tggagcgatt 600 cgggaagaca acaacatcac ccttaaactt gatcgttgta acaataataa tcagtacgtg 660 agcatcgaca agtttcggat attttgtaag gcgttaaatc cgaaggaaat tgaaaaatta 720 tatacatcgt atctgtcaat cactttcttg cgggatttct gggggaatcc tcttcggtat 780 gataccgaat actatcttat acctgtggca tctagtagta aggatgtaca gttgaagaac 840 attacagatt atatgtatct taccaatgca cccagttaca caaacggcaa gttaaatatc 900 tattatcgcc ggctttataa cggtctgaaa ttcatcataa aaagatacac tcccaacaac 960 gagatagatt cttttgtcaa gagcggagac ttcattaagt tatatgtcag ctacaacaac 1020 aatgagcaca tagttggcta cccaaaggac ggaaacgcgt ttaacaacct ggatcgtata 1080 ctgcgggtgg gctataacgc gcctgggatt cccttgtata aaaagatgga agcagtaaaa 1140 ttgcgcgact tgaagacgta ctccgtacaa cttaaacttt acgacgacaa aaatgcgagt 1200 cttggattgg ttggtacgca caacggacag atcgggaatg atccgaaccg tgacatctta 1260 attgcatcaa attggtactt taatcatttg aaagacaaaa tccttggctg cgattggtat 1320 tttgttccga ctgatgaggg gtggacgaac gac 1353 <210> 7 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> The amino acid sequence 07 of the translocation region <400> 7 Met Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu 1 5 10 15 Lys Lys Leu Glu Ser Lys Ile Asn Lys Val Phe Ser Thr Pro Ile Pro 20 25 30 Phe Ser Tyr Ser 35 <210> 8 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> The amino acid sequence 08 of the translocation region <400> 8 Gly Ile Thr Glu Leu Lys Lys Leu Glu Ser Lys Ile Asn Lys Val Phe 1 5 10 15 Ser Thr Pro Ile Pro Phe Ser Tyr Ser 20 25

Claims

파상풍 간균 독소 단백질 변이체로서,
파상풍 간균 독소 단백질의 C 단편 및 상기 파상풍 간균 독소 단백질의 전좌 영역 부분 단편을 포함하는, 파상풍 간균 독소 단백질 변이체.
제1항에 있어서,
상기 전좌 영역 부분 단편은 상기 파상풍 간균 독소 단백질의 전좌 영역의 T 세포 에피토프 P2를 포함하는, 파상풍 간균 독소 단백질 변이체.
제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 전좌 영역 부분 단편은 상기 파상풍 간균 독소 단백질의 829 내지 864번째 아미노산을 포함하는, 파상풍 간균 독소 단백질 변이체.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 전좌 영역 부분 단편은 SEQ ID NO:7 내지 8 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는, 파상풍 간균 독소 단백질 변이체.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 파상풍 간균 독소 단백질의 C 단편은 SEQ ID NO:3으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는, 파상풍 간균 독소 단백질 변이체.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
SEQ ID NO:1 내지 2 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는, 파상풍 간균 독소 단백질 변이체.
프로테오글리칸 접합체로서,
폐렴연쇄상구균 유래의 다당류 및 파상풍 간균 독소 단백질 절단체(TTD)를 포함하는, 프로테오글리칸 접합체.
제7항에 있어서,
상기 다당류는 폐렴연쇄상구균 협막 다당류에서 유래하는, 프로테오글리칸 접합체.
제7항 또는 제8항에 있어서,
상기 다당류는 하나 이상의 폐렴연쇄상구균 혈청형을 구비하는, 프로테오글리칸 접합체.
제7항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 다당류는 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F 및 33F로 이루어진 군 중 어느 하나의 폐렴연쇄상구균 혈청형으로부터 선택되는, 프로테오글리칸 접합체.
제7항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 파상풍 간균 독소 단백질 절단체(truncate)는 상기 파상풍 간균 독소 단백질의 C 단편을 포함하는, 프로테오글리칸 접합체.
제7항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 파상풍 간균 독소 단백질 절단체(truncate)는 상기 파상풍 간균 독소 단백질의 C 단편을 포함하고, 상기 다당류는 1, 3, 5, 6A, 6B, 7F, 10A, 12F, 15B, 19A, 19F 및 33F로 이루어진 군 중 어느 하나의 폐렴연쇄상구균 혈청형으로부터 선택되는, 프로테오글리칸 접합체.
제7항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 파상풍 간균 독소 단백질의 C 단편은 SEQ ID NO:3으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는, 프로테오글리칸 접합체.
제7항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 파상풍 간균 독소 단백질 절단체(truncate)는 파상풍 간균 독소 단백질의 C 단편 및 상기 파상풍 간균 독소 단백질의 전좌 영역 부위 단편을 포함하는, 프로테오글리칸 접합체.
제14항에 있어서,
상기 전좌 영역 부분 단편은 상기 파상풍 간균 독소 단백질의 전좌 영역의 광범위한 T 세포 에피토프 P2를 포함하는, 프로테오글리칸 접합체.
제14항 또는 제15항에 있어서,
상기 전좌 영역 부분 단편은 상기 파상풍 간균 독소 단백질의 829 내지 864번째 아미노산을 포함하는, 프로테오글리칸 접합체.
제14항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 전좌 영역 부분 단편은 SEQ ID NO:7 내지 8 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는, 프로테오글리칸 접합체.
제7항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 파상풍 간균 독소 단백질 절단체(truncate)는 SEQ ID NO:1 내지 3 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는, 프로테오글리칸 접합체.
제7항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 다당류와 상기 파상풍 간균 독소 단백질 절단체(truncate)의 질량비는 0.4 내지 2.5인, 프로테오글리칸 접합체.
제10항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 1형 폐렴연쇄상구균 다당류와 상기 단백질 절단체(truncate)의 질량비는 0.4 내지 2.5인, 프로테오글리칸 접합체.
제10항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 3형 폐렴연쇄상구균 다당류와 상기 단백질 절단체(truncate)의 질량비는 0.4 내지 2.5인, 프로테오글리칸 접합체.
제10항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 5형 폐렴연쇄상구균 다당류와 상기 단백질 절단체(truncate)의 질량비는 0.4 내지 2.5인, 프로테오글리칸 접합체.
제10항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 6A형 폐렴연쇄상구균 다당류와 상기 단백질 절단체(truncate)의 질량비는 0.4 내지 2.5인, 프로테오글리칸 접합체.
제10항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 6B형 폐렴연쇄상구균 다당류와 상기 단백질 절단체(truncate)의 질량비는 0.4 내지 2.5인, 프로테오글리칸 접합체.
제10항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 7F형 폐렴연쇄상구균 다당류와 상기 단백질 절단체(truncate)의 질량비는 0.4 내지 2.5인, 프로테오글리칸 접합체.
제10항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 10A형 폐렴연쇄상구균 다당류와 상기 단백질 절단체(truncate)의 질량비는 0.4 내지 2.5인, 프로테오글리칸 접합체.
제10항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 12F형 폐렴연쇄상구균 다당류와 상기 단백질 절단체(truncate)의 질량비는 0.4 내지 2.5인, 프로테오글리칸 접합체.
제10항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 15B형 폐렴연쇄상구균 다당류와 상기 단백질 절단체(truncate)의 질량비는 0.4 내지 2.5인, 프로테오글리칸 접합체.
제10항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 19A형 폐렴연쇄상구균 다당류와 상기 단백질 절단체(truncate)의 질량비는 0.4 내지 2.5인, 프로테오글리칸 접합체.
제10항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 19F형 폐렴연쇄상구균 다당류와 상기 단백질 절단체(truncate)의 질량비는 0.4 내지 2.5인, 프로테오글리칸 접합체.
제10항 내지 제30항 중 한 항에 있어서,
상기 33F형 폐렴연쇄상구균 다당류와 상기 단백질 절단체(truncate)의 질량비는 0.4 내지 2.5인, 프로테오글리칸 접합체.
제7항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서,
컨쥬게이트 방법을 채택하여 상기 다당류와 상기 단백질 변이체를 컨쥬게이트할 수 있는, 프로테오글리칸 접합체.
제32항에 있어서,
상기 컨쥬게이트 방법은 브롬화 수소법, CDAP법, 환원 아민법 중 어느 하나의 방법을 포함하는, 프로테오글리칸 접합체.
면역원성을 향상시키는 방법으로서,
폐렴연쇄상구균 유래의 다당류 및 파상풍 간균 독소 단백질 절단체(truncate)를 포함하는 프로테오글리칸 접합체를 제공하는 단계를 포함하는, 면역원성을 향상시키는 방법.
제34항에 있어서,
상기 다당류는 폐렴연쇄상구균 협막 다당류에서 유래하는, 방법.
제34항 또는 제35항에 있어서,
상기 다당류는 하나 이상의 폐렴연쇄상구균 혈청형을 구비하는, 방법.
제34항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 다당류는 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F 및 33F로 이루어진 군 중 어느 하나의 폐렴연쇄상구균 혈청형으로부터 선택되는, 프로테오글리칸 접합체.
제34항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 파상풍 간균 독소 단백질 절단체(truncate)는 파상풍 간균 독소 단백질의 C 단편을 포함하는, 방법.
제34항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 파상풍 간균 독소 단백질 절단체(truncate)는 상기 파상풍 간균 독소 단백질의 C 단편을 포함하고, 상기 다당류는 1, 3, 5, 6A, 6B, 7F, 10A, 12F, 15B, 19A, 19F 및 33F로 이루어진 군 중 어느 하나의 폐렴연쇄상구균 혈청형으로부터 선택되는, 방법.
제38항 또는 제39항에 있어서,
상기 파상풍 간균 독소 단백질의 C 단편은 SEQ ID NO:3으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는, 방법.
제34항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 파상풍 간균 독소 단백질 절단체(truncate)는 파상풍 간균 독소 단백질의 C 단편 및 파상풍 간균 독소 단백질 전좌 영역 부위 단편을 포함하는, 방법.
제41항에 있어서,
상기 전좌 영역 부분 단편은 상기 파상풍 간균 독소 단백질의 전좌 영역의 광범위한 T 세포 에피토프 P2를 포함하는, 방법.
제41항 또는 제42항에 있어서,
상기 파상풍 간균 독소 단백질의 전좌 영역 부분 단편은 상기 파상풍 간균 독소 단백질의 829 내지 864번째 아미노산을 포함하는, 방법.
제34항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 파상풍 간균 독소 단백질 절단체(truncate)는 SEQ ID NO:1 내지 3 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는, 방법.
제34항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 폐렴연쇄상구균 다당류와 상기 파상풍 간균 독소 단백질 절단체(truncate)의 질량비는 0.4 내지 2.5인, 방법.
제37항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 1형 폐렴연쇄상구균 다당류와 상기 단백질 절단체(truncate)의 질량비는 0.4 내지 2.5인, 방법.
제37항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 3형 폐렴연쇄상구균 다당류와 상기 단백질 절단체(truncate)의 질량비는 0.4 내지 2.5인, 방법.
제37항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 5형 폐렴연쇄상구균 다당류와 상기 단백질 절단체(truncate)의 질량비는 0.4 내지 2.5인, 방법.
제37항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 6A형 폐렴연쇄상구균 다당류와 상기 단백질 절단체(truncate)의 질량비는 0.4 내지 2.5인, 방법.
제37항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 6B형 폐렴연쇄상구균 다당류와 상기 단백질 절단체(truncate)의 질량비는 0.4 내지 2.5인, 방법.
제37항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 7F형 폐렴연쇄상구균 다당류와 상기 단백질 절단체(truncate)의 질량비는 0.4 내지 2.5인, 방법.
제37항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 10A형 폐렴연쇄상구균 다당류와 상기 단백질 절단체(truncate)의 질량비는 0.4 내지 2.5인, 방법.
제37항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 12F형 폐렴연쇄상구균 다당류와 상기 단백질 절단체(truncate)의 질량비는 0.4 내지 2.5인, 방법.
제37항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 15B형 폐렴연쇄상구균 다당류와 상기 단백질 절단체(truncate)의 질량비는 0.4 내지 2.5인, 방법.
제37항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 19A형 폐렴연쇄상구균 다당류와 상기 단백질 절단체(truncate)의 질량비는 0.4 내지 2.5인, 방법.
제37항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 19F형 폐렴연쇄상구균 다당류와 상기 단백질 절단체(truncate)의 질량비는 0.4 내지 2.5인, 방법.
제37항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 33F형 폐렴연쇄상구균 다당류와 상기 단백질 절단체(truncate)의 질량비는 0.4 내지 2.5인, 방법.
제34항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 방법은 컨쥬게이트 방법을 채택해 상기 다당류와 상기 단백질 변이체를 컨쥬게이트하는 단계를 포함하는, 방법.
제58항에 있어서,
상기 컨쥬게이트 방법은 브롬화 수소법, CDAP법, 환원 아민법 중 어느 하나의 방법을 포함하는, 방법.
제34항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 박테리아 다당류 면역원성을 향상시키는 단계는 다당류 CRM197 접합체보다, 상기 프로테오글리칸 접합체의 면역원성을 더 높이는 단계를 포함하는, 방법.
제34항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 면역원성이 더 높다는 것은 동물 면역 시험에서 검출되는 것인, 방법.
제61항에 있어서,
상기 동물 면역 시험은 제7항 내지 제33항에 따른 프로테오글리칸 접합체와 보조제를 면역 항원으로 제조하는 단계를 포함하는, 방법.
제62항에 있어서,
상기 면역 항원의 주사 방법은 복강주사, 피하주사, 근육주사 및/또는 정맥주사를 포함하는, 방법.
제61항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 동물 면역 시험은 획득한 면역 동물의 혈청 중의 항체에 대해 ELISA 검출을 수행하는 단계를 포함하는, 방법.
제61항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 동물 면역 시험은 획득한 면역 동물의 혈청에 대해 옵소노파고사이토시스 살균 시험을 수행하는 단계를 포함하는, 방법.
제61항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 동물은 마우스, 래트 및/또는 토끼를 포함하는, 방법.
제62항 내지 제66항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 보조제는 수산화알루미늄, 인산알루미늄 및/또는 프로인트 보조제 등을 포함하는, 방법.
핵산 분자로서,
제1항 내지 제6항에 따른 파상풍 간균 독소 단백질을 암호화하는 변이체를 포함하는, 핵산 분자.
제68항에 있어서,
SEQ ID NO:4 내지 6으로 표시되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 핵산 분자.
벡터로서,
제68항 내지 제69항 중 어느 한 항에 따른 핵산 분자를 포함하는, 벡터.
세포로서,
제68항 내지 제69항 중 어느 한 항에 따른 핵산 분자 또는 제70항에 따른 벡터를 포함하는, 세포.
담체 단백질로서,
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 파상풍 간균 독소 단백질 변이체를 포함하는, 담체 단백질.
약학 조성물로서,
제7항 내지 제33항 중 어느 한 항에 따른 프로테오글리칸 접합체 및 선택적으로 약학적으로 허용 가능한 보조제를 포함하는, 약학 조성물.
용도로서,
약물 제조에서 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 파상풍 간균 독소 단백질 변이체의 용도.
용도로서,
약물 제조에서 제7항 내지 제33항 중 어느 한 항에 따른 다당류 접합체의 용도.
제74항 또는 제75항에 있어서,
상기 약물은 폐렴연쇄상구균성 질환을 예방 및/또는 치료하는 데 사용되는, 용도.
제76항에 있어서,
상기 폐렴연쇄상구균성 질환은 폐렴, 패혈증, 뇌수막염 및/또는 중이염을 포함하는, 용도.
백신으로서,
제7항 내지 제33항 중 어느 한 항에 따른 프로테오글리칸 접합체, 제73항에 따른 약학 조성물 및/또는 선택적으로 약학적으로 허용 가능한 보조제를 포함하는, 백신.
폐렴연쇄상구균성 질환 예방 방법으로서,
필요로 하는 피험자에게 제7항 내지 제33항 중 어느 한 항에 따른 프로테오글리칸 접합체, 제68항 내지 제69항 중 어느 한 항에 따른 핵산 분자, 제70항에 따른 벡터, 제71항에 따른 세포, 제72항에 따른 담체 단백질, 제73항에 따른 약학 조성물 및/또는 제78항에 따른 백신을 투여하는 단계를 포함하는, 폐렴연쇄상구균성 질환 예방 방법.
제79항에 있어서,
상기 폐렴연쇄상구균성 질환은 폐렴, 패혈증, 뇌수막염 및/또는 중이염을 포함하는, 방법.
용도로서,
제7항 내지 제33항 중 어느 한 항에 따른 다당류 접합체가 항원으로서 항체를 제조하는, 용도.
제81항에 있어서,
상기 항체는 분리된 균주의 진단적 분류에 사용되는, 용도.
키트로서,
제7항 내지 제33항 중 어느 한 항에 따른 다당류 접합체를 포함하는, 키트.
제83항에 있어서,
분리된 균주의 진단적 분류에 사용되는, 키트.