KR100266924B1 - 파상풍독소의 기능적 단편 항원 및 파상풍 백신 - Google Patents
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Abstract
전장 파상풍 독소 분자의 전장 아미노산 서열의 N-말단에 존재하는 이황화물 다리를 형성하는데 관여하는 두개의 시스테인 잔기간의 부분적 아미노산 서열중의 상호인접한 아미노산 잔기를 각각 연결시켜주는 펩티드 결합으로부터 선택되는 하나이상의 펩티드 결합을 분해하는 단계, 이황화물 다리를 분해하는 단계, 및 파상풍 독소 분자상의 기들사이의 비공유결합을 분해하는 단계로 구성된 방법으로 얻는 것과 실질적으로 동일한 1종이상의 단편을 포함하는 파상풍 독소의 기능적 단편항원이 개시되어 있다; 여기에서 SDS-폴리아크릴아미드겔 전기영동법으로 측정시 90,000 내지 110,000의 분자량을 갖고 등전점전기영동법으로 측정시 7.25±0.5의 등전점을 갖는다. 본 발명의 FFA는 파상풍 백신 항원으로 만족스러운 면역역가, 즉, 전장 파상풍 독소 톡소이드와 실질적으로 동일한 면역역가를 갖을 뿐만아니라, 부작용의 감소에 대하여 매우 우수하다. 또한, 본 발명은 FFA의 대량 제조방법, FFA를 함유하는 파상풍백신 및 파상풍백신외의 1종이상의 백신을 함유하는 혼합백신을 제공한다.
Description
공지된 바와 같이, 파상풍은 후궁반장 및 호흡곤란과 같은 심각한 증상을 동반하는 매우 치사율이 높은 감염성 질병이다. 테타누스 바실리(Tetanus bacilli)는 주위환경에 널리 분포되어 있고, 이들의 포자는 통상적으로 토양, 동물의 변등에서 발견된다. 그러므로, 모든 사람들은 자상 및 창상과 같은 각종유형의 외상으로부터의 파상풍감염의 위험에 노출되어 있다. 더우기, 테타누스 바실리에 감염되었을때, 항생제, 근육이완제등을 이용한 통상적 화학치료는 파상풍환자 가 고령 또는 젊던지 치명률을 크게 변화시킬 수는 없다. 선진국에서는, 파상풍에 의한 대부분의 죽음은 유아기때에 파상풍에 대한 백신접종을 하지않은 고령의 환자들 중에서 최근에 발생하고 있다.
또한, 유아기 및 소아기때 기초 면역에 대한 파상풍 백신접종 및 추가면역의 예방접종을 받은 사람조차, 성인시에 남아있는 면역은 지진, 화재, 교통사고등에서의 예기치못한 상처를 입은 사람의 경우 파상풍 감염을 방지하는데에는 불충분하다. 그러므로, 약 40세이상의 환자, 특히 고령의 환자는 파상풍에 대한 보호를 확실히 하기 위하여 추가면역주사를 개인적으로 받는 것이 중요하다.
선진국에서는, 병원내 분만수의 증가, 생활환경 및 위생의 향상, 톡소이드 및 항독소의 준비에 대한 구명구급의료의 향상 및 저연령층에 대한 강제적 백신접종은 파상풍환자의 수를 반세기전의 1/30로 줄였다. 더우기, 파상풍은 비유행성 질병이고 사람에서 사람으로 전염되지 않는다. 그러므로, 이 질병의 예방의 중요성은 간과되는 경향이 있다. 그러나, 현재에서조차, 세계의 파상풍 사망의 수는 개도국에서 만연되고 있는 대부분의 신생아 파상풍 사망을 포함하여 1년에 약 백만명으로 추정된다. 또한, 널리 퍼진 약제의 남용때문에, 또한 감염된 주사바늘을 통한 파상풍 환자의 수도 최근에 증가하고 있다.
이러한 상황하에서, 파상풍은 현재 치료보다는 백신에 의해 예방되어야 하는 질병으로 인식되고 있으며, 파상풍에 대한 예방 조치가 활발히 취해지고 있다.
예컨대, 세계보건기구(WHO)의 면역화의 확대계획(EPI)에서, 파상풍에 대한 백신접종이 가장 중요한 일중의 하나로 채택되고 있으며, 백신접종계획이 진척되고 있다. 이의 목적중의 하나가 파상풍질병을 근절하는 것인, "파상풍에 대한 국제회의"가 1963년 이후 여러 나라에서 약 3년마다 열리고 있다.
상기로부터 명백한 바와 같이, 파상풍은 포자를 토양으로부터 박멸하는 것이 불가능한 편재성 세균에 의해 유발되는 질병이고, 파상풍에 대한 백신접종만이 연령 및 성별에 상관없이 파상풍으로 인한 사람의 사망을 0으로 줄일 수 있는 유일한 방법이고, 백신접종은 현재뿐만아니라 미래에 태어날 모든 사람에게 필수적이라고 말하는 것은 과정된 것은 아니다.
파상풍 예방을 위해서, 파상풍 톡소이드가 백신으로서 사용되어 왔다. 파상풍 백신용 유효성분으로서 사용되는 파상풍 톡소이드는 포르말린으로 무독소화된 파상풍 독소이다. 이러한 파상풍 독소는 보강제가 없는 플레인(plain) 형태 또는 보강제로서 소량의 알루미늄염상에 흡착된 침전 항원제제의 형태 또는 디프테리아 톡소이드, 백일해 백신 및 헤모필러스 인플루엔자 b 백신과 같은, 기타 백신과 파상풍 톡소이드를 혼합하여 제조한 혼합 항원 제제의 형태로 사용되어 왔다. 유아에게는, 파상풍 톡소이드는 통상적으로 흡착된 형태의 디프테리아(D), 파상풍(T) 및 백일해(P) 백신의 혼합물인 소위 DPT 혼합 백신의 형태로 투여한다. 외상 환자의 파상풍예방적 치료를 위해서는 플레인 T 톡소이드 백신 또는 DT 혼합 톡소이드 백신을 사용한다. 이런 톡소이드는 전세계적으로 널리 이용되고 있으며 T 톡소이드 제제는 가장 유효하고 중요한 백신중의 하나로 세계에서 매우 높게 인정되어 왔다. 그러나, 현재의 파상풍 톡소이드 제제는 해결하여야할 여러 문제점을 갖는다. 예컨대, 파상풍 톡소이드는 다양한 부작용이 있고, 제품의 질이 상이한 제조자들에서 불균일하며, 면역의 보유는 단지 약 5 내지 10년으로 한정되어, 반복적인 백신접종이 파상풍 감염을 예방하기에 충분한 항독소수준을 유지시키기 위하여 필요하다는 점에서 불리하다. 따라서, 통상적 파상풍 톡소이드는 안정성, 품질의 관리, 면역성의 보유 및 투여에서의 용이함, 노동력 절감 및 경제성에 대해 풀어야할 문제점을 갖는다. 그러므로, 파상풍 백신의 이용을 촉진하기 위해서는, 주로 고품질 파상풍 백신의 대량 생산의 관점에서 많은 수의 문제점을 해결하여야 할 필요가 있다.
이후, 종래기술은 파상풍 독소 항원을 제공하고, 백신으로 사용하는 경우 부작용의 감소에 대하여 매우 우수할 뿐만아니라, 높은 면역역가를 보여 종래기술에 수반되는 전술한 문제점을 해결하는 본 발명의 주목적과 관련하여 토의한다.
다양한 부작용이 통상적 파상풍 톡소이드 백신의 사용에 수반됨이 공지되어 있다. 주사부위에서의 국부적 반응(예, 발적, 압통, 팽창, 유종 및 무균농상), 전신발열 ; 및 비록 드물기는 하지만, 알러지(예, 국부 과민증, 과민성 쇼크, 혈청병양의 Ⅲ형 과민증 및 지연형 과민증) 및 심각한 통상적 반응(예, 말단신경장애, 림프절장애, 완신경총장애, 귈랑바레증후군 및 급성횡단 척수염)과 같은 각종 부작용이 보고되어 있다(참조, S.A.Plotkin and E.A. Mortimer 편 "Vaccine", 제 2 판, 75-77 쪽, W.B.Saunders Company 1994 년 간행; G.L.Mandell et al 편 "Mandell, Douglas and Bennett's Principles and Practice of infectious Diseases" 제 4 판, 2781 쪽, Churchill Livingstone ＆ Son,Inc.1995 년 간행; Journal of the American Medical Association, 264(18), p.2448, 1990 및 271(20), p.1629, 1994; 및 Lancet, 339,pp.1111-1112, 2 May 1992).
이러한 파상풍 톡소이드 백신의 부작용을 감소 또는 제거하고자 하는 많은 시도가 행해져 왔다. 예컨대, 고도로 정제된 톡소이드의 수득방법의 개발, 변성 또는 새로운 보강제의 사용, 및 단편 A, B 및 C(파상풍 독소의 서브유니트이고 이하에 설명된다)의 백신용 활성성분으로서의 개별적 사용이 제안되었다. 이러한 시도들 중에서, 파상풍 독소 단편을 이용하는 기술에 있어서, 이 기술에서 사용되는 파상풍 독소의 단편의 예로는, 트립신 및/또는 파파인으로 파상풍 독소를 소화시켜 제조한 단편 C(참조, 특개소 50-71820, 51-82719 및 52-83928), 파파인으로 파상풍 독소를 소화시켜 제조한 단편 A-B(참조, 특개소 53-26319), 대장균, 효모 또는 살모넬라에서 단편 C를 코딩하는 유전자를 발현시켜 수득한 항원(참조, 특개평 3-285681, 특표평 4-506005 및 국제출원공보 WO 90/15871 및 WO 94/03615 및 EP-A-O 209 281) 및 단편 C의 합성 에피토프(참조, 국제출원공보 WO 94/00484)를 언급할 수 있다. 그러나, 이런 모든 파상풍 독소 단편 백신은 전장 파상풍 독소분자의 톡소이드를 함유하는 통상적 파상풍 톡소이드와 비교하여, 낮은 항원성 및 면역역가를 갖기 때문에 상기의 통상적 파상풍 독소 단편 백신의 어느 것도 실제적으로 사용되지 못하였다. 한편, 파상풍 독소 유전자의 클로닝, 및 파상풍 독소 분자의 아미노산 서열 및 뉴클레오티드 서열의 결정이 완성되었다[참조, EMBO Journal, 5(10), 2495-2501, 1986 및 Nucleic Acid Research, 14(19), 7809-7812, 1986(전장 파상풍 독소 분자의 전장 아미노산 서열은 SEQ ID NO.1에 나타내었다)]. 또한, 전체 뉴클레오티드 서열 및 아미노산 서열에 대한 정보에 기초하여, 파상풍 독소 유전자의 단편을 발현시키고, 합성 펩티드를 파상풍 독소 분자의 일부로서 제조하며, 또한, 파상풍 독소의 에피토프 영역의 결정을 유전자 DNA 단편 및 합성 펩티드의 발현물을 이용하여 시도하였다[참조, Infection and Immunity, 57(11), 3498-3505, 1989 및 Molecular Immunology, 31(15), 1141-1148, 1994]. 그러나, 이러한 파상풍 독소 에피토프를 유효성분으로 함유하는 파상풍 백신은 완성되지 않았다.
[발명의 요약]
본 발명자는 고수준의 파상풍 독소의 정제가 달성될 수 없고 파상풍 독소분자의 상세한 구조 및 특성은 알려져 있지 않았던 1970년대 초부터 20년이상 현재까지 파상풍 독소에 대하여 장기간 연구하여 왔다. 본 발명자는 테타누스 바실리의 독소생산능을 광범위하게 연구하였다. 추가로 본 발명자는 항원으로서 전장 파상풍 독소 톡소이드를 함유하는 통상적 파상풍 백신의 부작용의 감소에 대하여 매우 우수할 뿐만아니라, 실질적으로 전장 파상풍 독소 톡소이드와 동일한 면역역가를 갖는 파상풍 백신 항원의 개발을 위하여 광범위하고 집중적인 연구를 하였다. 그결과, 본 발명자는 파상풍 독소로부터 유래힌 특이 기능적 단편 항원(이후 단순히 "FFA"로 칭함)은 파상풍 백신용 항원으로서 유효하고, 부작용의 감소에 매우 우수함을 발견하였다. 본 발명은 이러한 새로운 발견에 기초하여 완성되었다.
그러므로, 본 발명의 목적은 통상적 전장 파상풍 독소 톡소이드의 부작용의 감소에 대하여 매우 우수할 뿐만아니라, 실질적으로 전장 파상풍 독소 톡소이드와 동일한 면역역가를 갖는 파상풍 항원을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 현재의 백신의 부작용의 감소에 대하여 매우 우수하고, 통상적 전장 파상풍 톡소이드 백신과 실질적으로 동일한 면역역가를 갖는 파상풍백신을 제공하는 것이다.
본 발명의 추가의 목적은 전술한 파상풍 백신의 제조방법을 제공하는 것이다.
또한 본 발명의 추가의 목적은 파상풍 백신 항원으로서 전술한 기능적 단편항원(FFA)를 제조하는 방법이다.
본 발명의 앞서의 목적 및 기타 목적들, 특징 및 이점은 서열목록 및 도면을 첨부된 이하의 상세한 설명 및 청구항으로부터 당업자에게는 명백해질 것이다.
[서열이 간략한 설명]
SEQ ID NO. 1은 본 발명에서 사용하는 전장 파상풍 독소 분자의 전장 아미노산 서열의 한 형태이다.
본 발명은 파상풍 독소의 기능적 단편 항원 및 이를 함유하는 파상풍 백신에 관한 것이다. 좀더 구체적으로는, 본 발명은 전장 파상풍 독소 톡소이드를 항원으로 함유하는 현재의 파상풍 백신과 비교하여, 항원으로 사용시 부작용의 감소가 아주 우수하다는 점뿐만아니라, 실질적으로 전장 파상풍 독소 톡소이드와 동일한 면역역가를 갖는다는 점에서 기능적 단편 항원이 유리하기 때문에 파상풍 백신용 항원으로서 아주 유용한 특정의 파상풍 독소의 기능적 단편 항원에 관한 것이다. 또한 본 발명은 유효성분으로 파상풍 독소의 기능적 단편 항원을 함유하는 매우 안전하고 효과적인 파상풍 백신(파상풍 톡소이드), 파상풍 백신과 파상풍 백신외의 1종이상의 백신을 함유하는 혼합 백신, 단편 항원 및 백신의 제조방법에 관한 것이다.
제1(a)도는 본 발명에서 사용하는 전장 파상풍 독소 분자 구조의 도면이다.
제1(b)도는 전장 파상풍 독소 분자의 니크(nicked)형태의 도면이다.
제1(c)도는 전장 파상풍 독소 분자의 3 조[A-B·C] 모델을 보여준다.
제2(a)도는 파상풍 독소의 기능적 단편 항원의 N-말단 아미노산 서열의 다양성을 보여주는 도면이다.
제2(b)도는 전장 파상풍 독소 분자의 구조 모델의 도면이다.
[참조부호의 설명]
S--S : 이황화물 다리
* : 니크
------ : 비공유결합
아미노산 서열의 아미노산 잔기를 나타내기 위한 1문자 설명체계에 있어서, 문자들은 각각 하기 아미노산 잔기를 나타낸다.
A 알라닌
C 시스테인
D 아스파르트산
E 글루탐산
F 페닐알라닌
G 글리신
H 히스티딘
I 이소로이신
K 리진
L 로이신
M 메티오닌
N 아스파라긴
P 프롤린
Q 글루타민
R 아르기닌
S 세린
T 트레오닌
V 발린
W 트립토판
Y 티로신
본 발명에 따라, 고정화제로 안정화되기 전의 파상풍 독소의 기능적 단편 항원이 전장 파상풍 독소 분자의 전장 아미노산 서열의 N-말단에 존재하는 이황화물 다리를 형성하는데 관여하는 두개의 시스테인 잔기간의 부분적 아미노산 서열중의 상호인접한 아미노산 잔기를 각각 연결시켜주는 펩티드 결합으로부터 선택되는 하나이상의 펩티드 결합을 분해하는 단계, 이황화물 다리를 분해하는 단계, 및 파상풍 독소 분자상의 기들 사이의 실질적으로 모든 비공유결합[도 2(b)에 나타낸 바와 같이]을 분해하는 단계로 구성된 방법으로 얻는 것과 실질적으로 동일한 1종 이상의 단편을 포함하는, 고정화제로 안정화된 파상풍 독소의 기능적 단편 항원이 제공된다. 고정화제로 안정화되기 전의 파상풍 독소의 기능적 단편 항원은 이하의 특성을 갖는다:
(a) SDS-폴리아크릴아미드겔 전기영동법으로 측정시 90,000 내지 110,000의 분자량 및
(b) 등전점전기영동법으로 측정시 7.25±0.5의 등전점.
본 발명의 이해를 용이하게 하기 위하여, 본 발명의 기본적 특징 및 각종 바람직한 구현예를 이하에 열거하였다.
1. 고정화제로 안정화되기 전의 파상풍 독소의 기능적 단편 항원이 전장 파상풍 독소 분자의 전장 아미노산 서열의 N-말단에 존재하는 이황화물 다리를 형성하는데 관여하는 두개의 시스테인 잔기간의 부분적 아미노산 서열중의 상호인접한 아미노산 잦기를 각각 연결시켜주는 펩티드 결합으로부터 선택되는 하나이상의 펩티드 결합을 분해하는 단계, 이황화물 다리를 분해하는 단계, 및 파상풍 독소 분자상의 기들 사이의 실질적으로 모든 비공유결합을 분해하는 단계로 구성된 방법으로 얻는 것과 실질적으로 동일한 1종이상의 단편을 포함하는, 고정화제로 안정화된 파상풍 독소의 기능적 단편 항원: 고정화제로 안정화되기 전의 상기 파상풍 독소의 기능적 단편 항원은 이하의 특성을 갖는다:
(a) SDS-폴리아크릴아미드겔 전기영동법으로 측정시 90,000 내지 110,000의 분자량 및
(b) 등전점전기영동법으로 측정시 7.25±0.5의 등전점.
2. 1종이상의 단편의 각각은 독립적으로 이하의 아미노산 서열 (1) 내지 (8)으로 구성된 군으로부터 선택한 N-말단 아미노산 서열을 갖는, 전항 1기재의 파상풍 독소의 기능적 단편 항원:
3. 파상풍균(Clostridium tetani)의 배양여과물로부터 세포외 파상풍독소를 수집 및 정제하여 세포외 파상풍독소 분자를 수득하는 단계, 세포외 파상풍 독소분자의 전장 아미노산 서열의 N-말단에 존재하는 이황화물 다리를 분해하는 단계 및 세포외 파상풍 독소분자상의 기들 사이의 실질적으로 모든 비공유결합을 분해하는 단계로 구성된 방법으로 수득하는 것과 실질적으로 동일한 1종이상의 단편을 포함하는 파상풍 독소의 기능적 단편 항원을 고정화제로 안정화시키는 것을 특징으로 하는 파상풍 백신의 제조방법 :
파상풍독소의 기능적단편항원은 하기의 특성을 갖는다:
(a) SDS-폴리아크릴아미드겔 전기영동법으로 측정시 90,000 내지 110,000의 분자량 및
(b) 등전점전기영동법으로 측정시 7.25±0.5의 등전점.
4. 상기 3항에 있어서, 1종이상의 단편은 각각 독립적으로 이하의 아미노산 서열 (1) 내지 (8)으로 구성된 군으로부터 선택한 N-말단 아미노산 서열을 갖는 방법:
5. 전항 1 또는 2항에 기재된 파상풍독소의 기능적단편항원을 유효성분으로서 유효한 면역원량으로 함유하는 파상풍백신.
6. 전항 1 또는 2항에 기재된 파상풍독소의 기능적 단편항원을 복수의 유효성분중의 하나로서 유효한 면역원량으로 함유하는 혼합백신.
이후, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명에 있어서, Ala는 알라닌 잔기, Arg는 아르기닌 잔기, Asn는 아스파라긴 잔기, Asp는 아스파르트산 잔기, Cys 시스테인 잔기, Gln 글루타민 잔기, Glu 글루탐산 잔기, Gly는 글리신 잔기, His는 히스티딘 잔기, Ile 이소로이신 잔기, Leu 로이신 잔기, Lys 리진 잔기, Met 메티오닌 잔기, Phe 페닐알라닌 잔기, Pro 프롤린 잔기, Ser는 세린 잔기, Thr 트레오닌 잔기, Trp 트립토판 잔기, Tyr 티로신 잔기를 나타내고 Val는 발린을 나타낸다.
전술한 바와 같이, 본 발명의 파상풍독소의 기능적 단편항원은 전장 파상풍 독소 분자의 전체 아미노산 서열의 N-말단에 존재하는 이황화물 다리를 형성하는데 관여하는 두개의 시스테인 잔기간의 부분적 아미노산 서열중의 각 상호인접한 아미노산 잔기를 연결시켜주는 펩티드 결합으로부터 선택한 하나이상의 펩티드 결합을 자르는 단계, 이황화물 다리를 자르는 단계, 및 파상풍 독소 분자상의 기들중의 비공유결합[도 2(b)에 나타낸 바와 같이]를 자르는 단계로 구성된 방법으로 얻는 것과 실질적으로 동일한 1종이상의 단편을 포함한다.
본 발명의 파상풍독소의 기능적 단편항원의 바람직한 구현예로서, 전술한 1종이상의 단편의 각각은 독립적으로 이하의 아미노산 서열 (1) 내지 (8)로 구성된 군으로부터 선택한 N-말단 아미노산 서열을 갖는, 파상풍 독소의 기능적 단편 항원을 언급할 있다:
또한, 본 발명의 파상풍독소의 기능적 단편항원은 고정화제로 안정화될 수 있다.
본 발명의 기본적인 특징을 명시하기 위하여, 본 발명의 기술적 특징들을 본 발명의 개발을 설명함으로서 기술할 것이다.
[높은 독소생산능을 갖는 파상풍균 균주의 분리]
본 발명에서는, 높은 독소생산능의 파상풍균 균주를 사용한다. 본 발명자는 Harvard 균주[ATCC(American Type Culture Collection) 기탁번호 10779]로 불리는 공지된 파상풍균 균주로부터 유래한 공지된 파상풍균 균주인 Harvard H47균주로부터 단일 콜로니분리로 높은 독소생산능을 갖는 아주를 분리하였고, 수득한 아주를 파상풍 Harvard H47 균주 Biken 아주로 명명하였다(이후 단순히 "Biken 아주"로 칭함). 또한, 본 발명자는 파상풍독소의 생산은 파상풍세포내 플라스미드 DNA에 의해 운반되는 유전정보의 지배하에서 행해짐을 발견하였다(Biken Journal, 20, 105-115, 1977). 또한, 상기 발견에 기초한 배양방법을 이용하여, 본 발명자는 Biken 아주의 배양에 의한 파상풍독소의 대량생산 및 파상풍독소의 고도의 정제에 성공하였다.
따라서, 본 발명에서는, 첫째로 높은 독소생산능의 파상풍균 균주를 선택하여 이를 종균으로서 사용하는 것이 필요하다. 종균으로서, 후술되는 FFA를 코딩하는 DNA를 이용하여 유전공학기술에 의해 수득되는, 효모, 대장균, 고초균 등과 같은 미생물의 형질전환체의 배양물을 사용할 수 있다.
[파상풍독소의 형성양식 및 독성 활성]
파상풍균세포에서, 파상풍 독소는 먼저 분자량 약 150,000의 단일 폴리펩티드사슬(비니크(non-nicked)된 온전한 형태의 전장 파상풍독소분자)의 형태로 생산된다(이후, 종종 "세포내 독소"로 칭한다). 이어서, 세포의 자기융해로, 파상풍독소는 세포로부터 세포외 매질로 방출된다(이후, 세포외 매질로 방출된 독소는 종종 "세포외 독소"로 칭한다). 독소가 세포로부터 방출되는 경우, 전장 파상풍독소분자의 전장 아미노산 서열의 N-말단내 존재하는 이황화물 다리를 형성하는데 관여하는 두 시스테인 잔기사이의 부분적 아미노산 서열중의 상호 인접한 아미노산 잔기를 연결하는 펩티드 결합에서 하나이상의 결합이 파상풍균에 의해 생산되는 프로테아제에 의해 분해되어, 둘이상의 폴리펩티드 사슬을 형성시킨다. 그러나, 두개의 폴리펩티드 사슬은 전장 파상풍 독소분자의 N-말단내 존재하는 이황화물 다리에 의해 상호 연결된다. 즉, 이러한 폴리펩티드 사슬은 니크형태를 취하여[참조, 도 1(a) 및 1(b); Biochemical and Biophysical Research Communications, 57, 1257-1262, 1974; ibid. 68, 668-674, 1976; ibid. 77, 268-274, 1977], 또한, 두개의 폴리펩티드 사슬이 비공유결합에 의해 상호 연결된다[참조, 도 2(b)]. 온전한 형태에서 니크형태로의 파상풍 독소분자의 전환은 파상풍독소의 독소활성을 수배 증가시키고, 니킹(nicking)은 독소작용을 이끌어내는데 필수적이다. 그러므로, 기능적 단편 항원의 제조를 위한 노동을 절감하기 위해서는, 출발물질로서, 미리 니크형태로 전환된 세포외 파상풍 독소를 사용하는 것이 바람직하다[참조, 도 1(b)].
[파상풍독소의 서브유니트구조 및 파상풍독소의 독성작용발현 메카니즘]
본 발명자의 창의적인 연구의 결과로, 두개의 기능적으로 보완적인 폴리펩티드사슬, 즉, L(light) 사슬 및 H(heavy) 사슬은 전장 파상풍독소분자로부터 얻어진다. 즉, 본 발명자는 이러한 단편들(L 및 H 사슬)을 분리 및 정제하여, 비록 개별적으로 수득된 L 사슬 및 H 사슬의 각각은 독성이 아니더라도, 이러한 L 및 H 사슬을 전장 파상풍독소분자로 재구성하는 경우 전장 파상풍독소분자의 독소활성을 재생시킬 수 있을 만큼 천연적인, L 사슬 및 H 사슬을 개별적으로 수득하는데 성공하였다.
또한, 본 발명자는 이하의 세개의 단편들을 성공적으로 분리 및 정제하였다: H 사슬의 C-말단 반쪽(단편C), 단편C를 전장 파상풍 독소 분자로부터 제거하여 수득한 단편(단편 A-B) 및 정제된 단편 A-B로부터 단편 A(즉, L사슬)을 분리하여 수득한 단편(단편 B).
또한, 전장 파상풍 독소 분자 및 전술한 단편 A,B,C,A-B 및 B-C, 즉, 파상풍 독소의 세개의 모든 서브유니트 및 인접 서브유니트의 복합체를 제조한 후, 본 발명자는 이러한 단편들의 작용의 차이, 파상풍독소의 서브유니트 구조와 파상풍 독소의 독작용의 메카니즘사이의 상관관계를 조사하여, "3조[A-B·C]분자 모델"을 제안하였다[참조, 도 1(c); Biken Journal, 26, 133-143, 1983; L.L. Simpson 편 "Botulinum Neurotoxin and Tetanus toxin", pp.69-92(제 4 장), Academic Press, 1989].
상기 3조 분자모델은 파상풍에 대한 제 8 차 국제회의(1988)에서 파상풍 독소의 가장 적절한 분자모델로서 인정되었다. 3조[A-B·C]모델에 따라, 단편C는 파상풍 독소분자를 중추신경계(문자 "C"는 "Carrier"를 의미한다)로 운반하는 역할을 하며, 단편B는 파상풍독소분자를 신경세포의 접합부전막에 결합시키고 파상풍 독소 분자를 세포질내로 운송시키는 역할을 하며(문자 "B"는 Binding을 의미한다), 단편A는 효소활성에 기초한 독소활성을 나타내는 역할을 한다(문자 "A"는 Active"를 의미한다)(참조, G.Nistco등 편"8th International Conference on Tetanus", pp. 170-171, Phythagora Press, Rome-Milan, 1989; Infection and Immunity, 57, 3588-3593, 1989; Toxicon, 27, 385-392, 1989; ibid. 28, 737-741, 1990).
[파상풍독소의 단편의 다양성]
1989년까지, 세계의 연구자들 사이에서 파상풍 독소의 각각의 단편들의 길이, 분자량 및 명칭에 대한 합의점이 없었으며, 이러한 상황으로 인해 연구자들 사이에서 파상풍독소의 서브유니트의 구조-작용관계에 대한 정보의 교환 및 토론에 어려움이 있었다. 그러므로, 단편 모델의 단일 정의를 이용함으로서 파상풍독소에 대한 연구를 위한 공통기준을 확립하는 것이 바람직하였다.
이러한 상황하에서, 본 발명자는 최초로 전술한 3조 분자모델을 제안하였다. 즉, 본 발명자는 파상풍 독소단편의 길이, 분자량 및 명칭에 대한 합의의 부재의 불리한 점을 지적하였고, 본 발명자는 단편들의 통일된 정의의 필요성을 강조하였으며 상기 모델을 제안하였다[참조, 전술한 L.L. Simpson 편, "Botulinum Neurotoxin and Tetanus toxin", pp.69-92(제 4 장)].
다양한 단편이 전장 파상풍 독소 분자로부터 수득되는 이유는 다른 연구자들에 의해 사용되는 파상풍균의 종자균주의 유전적 차이뿐만 아니라, 파상풍 독소 및 이의 단편을 수득하기 위힌 연구자들이 이용하는 다양한 작업조건에서의 미묘한 차이, 예컨대 종자균주에 대한 배양조건, 미리 니크형태로 전환된 세포외 독소를 수득하기 위한 배양된 세포에 대한 자기융해조건 및 추출된 세포내 독소에 대한 처리조건, 즉, 추출된 세포내 독소를 프로테아제로 소화시켜 니크형태로 전환시키시 위한 조건 및 환원제, 변성화제, 가용화제 등으로 추출된 세포내 독소를 처리하는 조건에 있는 것으로 믿어지며, 여기에서 추출된 세포내 독소를 처리하기 위한 조건의 예로는, 효소 및 시약의 유형, 처리온도, 처리시간, 효소 또는 시약의 농도, 처리용액의 pH 및 추출된 세포내 독소의 처리를 위한 물리적 조건, 즉, 교반 또는 진탕, 또는 정지상태에서의 독소의 유지를 들 수 있다.
[본 발명의 "FFA"의 정의]
본 발명의 기능적 단편 항원(FFA)는 전장 파상풍 독소 분자의 전장 아미노산 서열의 N-말단에 존재하는 이황화물 다리를 형성하는데 관여하는 두개의 시스테인 잔기간의 부분적 아미노산 서열사이의 상호 인접한 아미노산 잔기를 각각 연결시켜주는 펩티드 결합으로부터 선택한 하나이상의 펩티드 결합을 분해하는 단계, 이황화물 다리를 분해하는 단계, 및 파상풍 독소 분자상의 기들 사이의 비공유결합[도 2(b)에 나타낸 바와 같이]를 분해하는 단계로 구성된 방법으로 얻는 것과 실질적으로 동일한 1종이상의 단편을 포함하는 파상풍 독소의 기능적 단편 항원이다.
파상풍독소의 기능적단편항원은 이하의 특성을 갖는다:
(a) SDS-폴리아크릴아미드겔 전기영동법으로 측정시 90,000 내지 110,000의 분자량 및
(b) 등전점전기영동법으로 측정시 7.25±0.5의 등전점.
본 발명에 의한 연구의 결과, FFA의 다양한 유형의 N-말단 아미노산서열을 수득할 수 있음을 발견하였다[참조, 도 2(a)]. 본 발명에 있어서, 파상풍 독소 기능적 단편 항원은 도 2(a)에 나타낸 8개의 아미노산 서열로 구성된 군에서 선택한 N-말단 아미노산 서열을 갖는다. 또한, 본 발명의 파상풍 독소의 기능적 단편 항원(FFA)는 전장 파상풍 독소 톡소이드와 실질적으로 동일한 면역역가를 갖는 것이 바람직하다. 또한, 본 발명의 파상풍 독소의 기능적 단편 항원(FFA)은 통상적인 전장 파상풍 독소 톡소이드와 비교하여 부작용의 감소에 대하여 매우 우수하다. 용어 "면역역가"은 파상풍의 증세의 발생을 방지하는 능력을 의미한다. 본 발명에 있어서, "전장 파상풍 독소 분자의 톡소이드와 실질적으로 동일한 면역역가를 갖는"이란 표현은, FFA를 함유하는 백신 및 참고예 14에 기재된 방법으로 제조한 전장 파상풍 독소 톡소이드를 함유하는 백신을, 기준으로서 공지된 국제단위의 역가의 전장 독소 톡소이드를 이용하고 실시예 1(5)에 기재된 공지의 LD50(50％ 치사량)의 독소공격을 이용하는 평행선 검정법으로 면역역가를 측정하는 방법으로 측정시, FFA는 1±0.2의 상대역가(전장 파상풍독소 톡소이드의 역가에 대한 FFA의 역가의 비)를 보임을 의미한다.
따라서, 또한 본 발명은 유효성분으로서 FFA를 함유하는 단일-항원 파상풍 백신, 예컨대 플레인 제제, 흡착제제 또는 냉동건조 제제 및 복수의 유효성분중의 하나로 FFA를 함유하는 혼합백신, 예컨대 DPT 혼합 백신, DT 혼합 백신, 또는 FFA 및 FFA 외 백신 항원들로 구성된 군에서 선택한 1종이상의 백신항원, 예컨대 인플엔자 B 백신 항원, 불활성화된 폴리오 백신항원, 불활성화된 B 간염 백신, 불활성화된 일본뇌염 백신 항원등을 함유하는 혼합 백신 및 전술한 백신의 대량 생산방법을 제공한다.
이후, 본 발명의 FFA의 제조, 제조된 FFA를 이용한 백신의 제조, 제조된 백신을 평가하기 위한 시험 등을 설명한다.
(1) 종자 미생물
본 발명의 기능적단편 항원(FFA)을 수득하기 위한 종균으로 사용하는 미생물에 대해서는, 미생물이 높은 독생산능력을 갖는 한 특별한 제한은 없다. 이러한 미생물의 예로는 파상풍 Harvard 균주의 아주 및 Harvard 균주와 동일한 또는 이상의 파상풍독소에 대한 생산능을 실질적으로 갖는 기타 파상풍균주를 들 수 있다. 구체적으로는, 예컨대, Harvard 균주[기탁번호 제 10779 호로 ATCC(American Type Culture Collection)에 기탁된]로부터 유래하는 공지된 파상풍 균주인 Harvard H 47 균주로부터 단일 콜로니 분리로 수득되는 높은 독성생산능의 Biken 아주(참고예1)를 사용하는 것이 바람직하다.
또한, 종자 미생물로서, 효모, 대장균, 고초균등과 같은 미생물이 유전공학기술에 의해 FFA를 코딩하는 유전자로 형질전환되는 방법으로 수득된 형질전환체 미생물을 사용할 수 있다. 구체적으로는, 예컨대, 종자미생물로서 벡터에 삽입 연결된 FFA를 코딩하는 DNA를 갖는 다량 발현벡터로 형질전환된 대장균을 사용할 수 있으며, 여기에서 형질전환된 대장균은 후술되는 참고예 2에 기재된 방법에 따라 수득한다.
(2) 배지
통상적 배지를 FFA 수득용 종자미생물을 배양하기 위하여 사용할 수 있다. 예컨대, 혐기성 미생물을 배양하기 위한 통상적 액체배지를 전술한 종자 미생물을 배양하기 위하여 사용할 수 있다. 이러한 액체배지의 예로는 조리된 고기 배지, PYG(펩톤, 효모추출물, 글루코오스)배지, GAM(Gifu 혐기성 배지)브로쓰, 송아지고기침출액 배지, 티오글리콜레이트 배지, 간-간 브로쓰, RCM(Reinforced Clostridial Medium) 브로쓰 및 DRCM(Differential Reinforced Clostridial Medium) 브로쓰를 들 수 있다. 미생물의 생장특성 및/또는 낮은 산화-환원전위의 유지를 향상시키기 위하여 원한다면, 배지는 이의 성분의 치환, 첨가 또는 제거로 변성시킬 수 있다. 이러한 배지들중에서, 간-간 브로쓰가 종균을 제조하는데 사용하기에 바람직하고, 본 발명자에 의해 고안한 변성 Latham 배지(참고예 3)가 종균으로부터 파상풍독소를 생성시키는데 사용하기에 바람직하다.
(3) 배양조건
FFA를 수득하기 위한 종자 미생물을 배양하기 위한 조건에 대해서는 특별한 제한은 없다. 예컨대, 높은 독소생산능의 파상풍균 균주는, 인큐베이션 온도가 약 30 내지 37℃, 바람직하게는 약 34 내지 약 36℃이고, 인큐베이션 시간은 약 1 내지 약 8일, 특히 세포내 독소를 추출하기 위해서는 약 1 내지 약 2일, 특히 세포외 독소를 수집하기 위해서는 약 4 내지 약 7일인, 배양조건하에서 배양한다.
(4) FFA 제조용 출발물질
본 발명에 있어서, FFA는 전술한 바와 같이 배양된 세포로부터 수득한 전장 파상풍 독소분자를 이용하여 제조한다. FFA 제조용 출발물질의 예로는 전술한 바와 같이 배양된 미생물의 세포추출물(세포내 파상풍 독소 함유) 및 배양된 세포를 자기융해시키고, 생성된 자기융해물내 함유된 비융해된 세포 및 세포찌꺼기는 원심분리 또는 여과로 제거하는 방법으로 수득되는 배양 상층액 또는 배양 여과물(각각 니크형태의 세포외 파상풍 독소를 함유)을 들 수 있다. 세포내 파상풍 독소로부터 FFA를 제조하는 것이 바람직한 경우, 트립신 또는 키모트롭신과 같은 프로테아제로 세포내 파상풍 독소를 분해시킨후, 세포내 파상풍 독소를 니크형태로 전환시킬 필요가 있다. 그러므로, 제조공정에서 노동력 절감 및 고수율을 수득하기 위해서는, 출발물질로서, 각각 니크형태로 세포외 파상풍 독소를 함유하는 배양 여과물 또는 배양 상층액을 사용하는 것이 바람직하다.
(5) 파상풍 독소의 예비정제
출발물질내 전장 파상풍독소분자는 통상의 방법으로 대충 정제시킬 수 있다. 이러한 통상적 방법의 예로는 황산암모늄을 이용한 염석, 알코올침전, 겔상의 흡착 및 겔로부터의 탈착 및 시판용 막을 이용한 한외여과를 들 수 있다. 본 발명에 있어서, 이러한 예비 정제법으로 수득되는 전장 파상풍 독소분자는 "부분적으로 정제된 전장 파상풍 독소"로 칭한다.
(6) 파상풍 독소의 고도의 정제
전항(5)에 기재된 방법으로 수득되는 부분적으로 정제된 전장 파상풍 독소는 예컨대, 밀도구배 초원심분리 및 평형밀도구배 초원심분리 양쪽을 이용한 방법(참조 특공평 7-89951) 또는 초원심분리, 겔여과, 이온교환크로마토그래피 및 고성능액체크로마토그래피와 같은 통상의 방법의 적절한 조합을 이용한 방법으로 고도로 정제할 수 있다. 본 발명에 있어서, 이러한 정제법으로 수득되는 고도로 정제된 전장 파상풍 독소 분자(이후, 단순히 "고도로 정제된 파상풍독소"로 종종 칭함)는 본 발명의 FFA 제조용 물질로서 사용할 수 있다. 고도로 정제된 파상풍 독소는 전장 파상풍 독소분자로 사용하기 위해서는 이의 적격성을 확인할 필요가 있다. 적격성의 확인은 예컨대, MLD(최소치사량 ; 참고예 4), Lf 단위(응집의 단위; 참고예 5), 단백질 함량(참고예 6)등을 측정하여 행할 수 있다.
(7) FFA의 제조
본 발명에 있어서, FFA는 전술한 고도로 정제된 파상풍 독소로부터 제조한다. FFA의 제조를 위하여 사용되는 고도로 정제된 파상풍 독소를 세포내 파상풍 독소로부터 제조하는 경우, 처음에 세포내 파상풍 독소를 트립신 또는 키모트립신과 같은 프로테아제로 부드럽게 소화시키거나 분해시켜, 독소를 니크형태로 전환시키는 것이 필요하다. 두개의 기능적으로 보완적인 파상풍 독소의 단편을 니크형태의 정제된 파상풍 독소의 N-말단내 존재하는 이황화물 다리를 환원제로 분해시키는 단계, 및 파상풍 독소분자상의 기들사이의 비공유결합을 변성화제로 분해시키는 단계로 구성된 방법으로 제조할 수 있다. 환원제의 예로는 통상적 환원제, 예컨대 소듐 티오글리콜레이트, 디티오트레이톨(이후 단순히 "DTT"로 칭함), 글루타티온, 메르캅토에탄올, 황화수소, 소듐 보로히드라이드, 황화나트륨, 황화암모늄등을 들 수 있다. 변성화제로서는, 통상적 변성화제를 사용할 수 있다. 이러한 제제의 예로는 구아니딘 티오시안에이트, 구아니딘 히드로클로라이드, 우레아, 소듐 도데실 술페이트등을 들 수 있다. 본 발명에 있어서, DTT 및 우레아가 바람직하다. DTT 사용의 바람직한 방법에 대해서는, 예컨대, 약 1 내지 약 10 ㎎/㎖의 양으로 독소단백질을 함유하는 용액내 DTT의 최종농도는 통상적으로 10 내지 20 mM, 바람직하게는 50 내지 150 mM이고, 반응은 15 내지 35℃에서 20 내지 180분간 실행한다. 우레아 사용의 바람직한 방법에 대해서는, 예컨대, 약 1 내지 약 10 ㎎/㎖의 양으로 독소단백질을 함유하는 용액내 우레아의 최종농도는 통상적으로 0.5 내지 10 M, 바람직하게는 1 내지 5 M이고, 반응은 5 내지 35℃에서 10초 내지 15분간 실행한다. 이러한 시약의 각각은 시약의 농도가 전술한 각각의 농도 범위내가 되도록 출발물질에 가한다. 본 발명에 있어서, DTT는 용액의 형태로 사용하며(참조, 참고예 8; 이후, 이 용액은 "DTT Tris 버퍼"로 칭한다), 용액은 출발물질의 약 5 내지 50 부피배의 양으로 출발물질에 가하여, DTT와 파상풍 독소를 반응시킨다. 우레아는 포화 용액의 형태 또는 결정의 형태로 직접 사용한다.
DTT와 우레아에 의한 전술한 처리의 결과, 니크형태의 전장 파상풍 독소분자는 분해되어 FFA가 함유된 용액이 얻어진다. FFA를 함유하는 용액을 희석시켜 우레아의 농도를 낮춤으로서, FFA는 지수로서 280 nm에서의 흡광도를 이용하여 분별 또는 분리로 고도로 정제된 파상풍 독소 단편으로서 수득할 수 있다(참조, 참고예 7). 정제는 예컨대 밀도구배 초원심분리 및 평형밀도구배 초원심분리 양쪽을 이용한 혼합방법(참조, 특공평 07-89951), SDS-PAGE(소듐 도데실 술페이트-폴리아크릴아미드겔 전기영동), 겔여과, 막여과, 이온교환크로마토그래피, 고성능액체크로마토그래피등으로 실행할 수 있다. 이러한 정제방법으로, 280nm에서 나타나는 두개의 피크에 해당하는 상이한 분자량의 두 분획이 얻어지고, FFA는 더 큰 분자량의 분획에서 발견된다. FFA가 함유된 이 분획은 FFA 파상풍 백신용 유효성분으로서 사용한다. 전장 파상풍 독소분자는 후술되는 방법에 따라 제조할 수 있다(참고예 13). 전장 파상풍독소분자 및 FFA 각각의 분자량, 항원적 특이성, 아미노산 서열등을 예컨대, SDS-PAGE(참고예 10), 겔내 침전반응(참고예 11) 및 펩티드 시퀀서를 이용한 방법(참고예 12)로 측정할 수 있다.
(8) FFA의 안정화
본 발명의 FFA에 있어서, 독성을 보이는 활성부위인 단편 A영역의 전장 또는 대부분이 부재하여, 본 발명의 FFA는 독성이 없다. 그러므로, 이와같은 FFA는 무독화 없이 톡소이드로서 사용할 수 있다. 그러나, 항원으로서 FFA의 입체화학적 구조를 안정화시키기 위하여서는, 파상풍 독소 FFA의 안정화(고정화)를 실행하는 것이 바람직하다. 고정화제(고정 또는 안정화제)의 예로는 통상적 무독화제, 예컨대, 포르말린, 글루타르알데히드, β-프로피오락톤등을 들 수 있다. 예컨대, 포르말린을 고정화제로 사용하는 경우, 포르말린대 FFA 용액의 부피비는 약 0.0004 내지 0.7%(v/v) 내인 것이 바람직하다. 고정화 온도는 약 3 내지 37℃이고, 고정화시간은 약 5 내지 180일이다. FFA의 항원성이 고정화에 의해 손상되는 위험이 있는 경우, 고정화조건은 고정화제의 농도의 저하, 고정화 온도의 저하 또는 천연아미노산, 예컨대, 글리신 및 세린, 또는 염기성 아미노산, 예컨대 리진 및 아르기닌을 첨가하여 완화시킨다. 유리 포름알데히드가 고정화후 용액내 남아있는 경우, 원한다면, 포름알데히드의 양과 동일한 양으로 소듐 히드로겐술파이트를 첨가하여 중화시키거나, 막을 이용한 여과 또는 투석으로 제거할 수 있다. 고정화처리후, FFA 용액은 파상풍백신 제조용 파상풍독소백신의 벌크용액으로 후에 이용하기 위하여 4℃에서 저장한다. 고정화처리후, 처리된 전장 파상풍 독소 분자 및 처리된 FFA는 "전장 파상풍 독소 톡소이드" 및 "FFA 톡소이드"로 각각 칭한다.
(9) FFA 파상풍 백신의 제조
전항(8)에서 수득한 FFA 톡소이드 벌크 용액은 희석하여 FFA 톡소이드를 유효 면역원량으로 함유하는 백신을 수득할 수 있다. 예컨대, 벌크 용액은 염의 등장용액 또는 버퍼 또는 조직배양용 배지로 희석하여 백신의 단백질 함량이 단일항원 톡소이드에 대해 20 내지 200㎍ 또는 흡착된 톡소이드에 대해 8 내지 80㎍가 되게 할 수 있다.
벌크 용액을 전술한 바와 같이 희석하는 경우, 백신의 내열성을 증가시키기 위한 안정화제 또는 면역역가를 증가시키기 위한 보충제로서 보강제를 백신 용액에 가할 수 있다. 안정화제는 0.01 내지 10%(w/v)의 양으로 백신에 첨가하고, 보강제는 백신의 1㎖당 0.1 내지 50㎎의 양으로 첨가하는 것이 바람직하다. 안정화제의 예로는 사카라이드, 아미노산, 젤라틴가수분해물, 인간 알부민등을 들 수 있다. 보강제의 예로는 항원의 방출을 유지시킬 수 있는 겔, 예컨대, 인산칼슘, 인산알루미늄, 황산알루미늄, 알루미나, 벤토나이트등; 및 항체생산 유도성 제제 예컨대, 무라밀디펩티드 유도체, 오일류등을 들 수 있다.
이어서, 단일항원 백신 또는 흡착된 백신은 작은 용기, 예컨대 앰플 또는 바이알에 분산시킨다. 이어서, 용기를 용접밀봉, 예컨대 융합밀봉시키고, 밀봉된 백신을 플레인 또는 흡착제제로서 제공한다. 백신을 분산후 냉동건조시키는 경우, 백신은 냉동건조제제로서 제공될 수 있다. 또한, 백신은 혼합 백신제제, 예컨대 DT 이성분 백신, DPT 삼성분 백신, 사성분 백신등과 같은 형태로 제공할 수 있다.
이러한 제제들의 각각은 톡소이드 또는 백신으로서 사용의 적합성을 입증하기 위하여 다양한 시험을 행한다. 즉, 이러한 제제의 각각은 일본 후생성 고지 제 217 호의 관련 규정: 생물학적제제기준(생물학적 제품에 대한 최소의 요건)(예, "파상풍 톡소이드"의 규정, "흡착된 파상풍 톡소이드"의 규정, "디프테리아-파상풍 톡소이드"의 규정 또는 "디프테리아-백일해-파상풍 혼합 백신"의 규정)에 따라 유효성, 안정성 및 균질성에 대한 각종 시험을 행하여 백신으로서 사용의 이의 적격성을 입증한다. 단지 입증된 제제만을 실용화한다. 투여 방법에 대해서는, 예컨대, 제제는 통상적으로 1인당 0.5㎖의 양으로 피하 또는 근육내주사로 투여한다. 냉동건조제제의 경우에 있어서는, 사용전, 살균증류수에 용해시켜 냉동건조전의 원래부피의 용액을 얻는다.
(10) FFA 파상풍 백신의 면역역가의 측정
본 발명의 FFA 파상풍 백신의 면역역가는 일본 후생성 고지 제 217 호: 생물학적제제기준(생물학적 제품에 대한 최소의 요건)의 "파상풍 톡소이드"의 규정 또는 "흡착된 파상풍 톡소이드"의 규정에 따라, 항혈청의 독소중화활성의 검정 또는 공지의 LD50(50%치사량)의 독소공격을 이용한 역가검정으로 면역된 동물(기니 돼지 또는 마우스)을 이용하여 측정한다. 전술한 시험외에, 본 발명에서는, 전장 파상풍 톡소이드에 대한 FFA의 상대 면역역가를 독성공격을 이용한 추가의 역가검정을 시행하며, 여기에서 스코어 방법(참고예 15)를 사용한다.
(11) FFA 파상풍 톡소이드의 부작용에 대한 동물시험
본 발명의 FFA 파상풍 백신의 부작용에 대한 동물 시험을 통상적 방법에 따라 실행할 수 있다. 파상풍 톡소이드의 부작용을 평가하기 위해 사용할 수 있는 동물시험의 예로는, 즉시형 알러지반응에 기초하는 쥐를 이용한 수신피부 과민증(PCA) 시험, 지연형 알러지 반응에 기초한 마우스를 이용한 푸트패드(footpad)반응 시험 및 지연형 알러지 반응을 기초하는 기니 돼지를 이용한 피내 반응시험(참고예 16)을 들 수 있다.
이후, 본 발명은 이하의 실시예 및 참고예를 참고로하여 좀더 상세히 기술할 것이나, 이는 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
이하의 참고예에서, 본 발명을 실행하기 위한 가이드라인을 구체적으로 나타내었다.
[참고예 1]
높은 독소생산능을 갖는 파상풍균주의 단일 콜로니의 분리
파상풍 Harvard A47 균주의 콜로니를 Zeissler 혈액아가 [글루코오스 및 탈피부린화 소혈액을 시판용 비개질 아가배지에 2%(w/v)의 최종 글루코오스 농도 및 20%(v/v)의 최종 탈피부린화 소혈액 농도가 되는 양으로 첨가한후, 혼합하여 제조한다] 플레이트상에 형성시키고, 형성된 콜로니를 각각 변성 Latham 배지(참조, 하기 참고예 3)에 접종 및 배양하여 배양주를 수득한다. 수득한 배양주의 각각에 대하여, Lf 값을 하기 참고예 5에 기술된 방법에 따라 측정한다. 전술한 콜로니로부터, 가장 높은 Lf 값을 갖는 배양주를 위해 사용된 콜로니를 갖는 파상풍 Harvard A47 균주의 Biken 아주로서 사용하며, 이는 높은 독소생산능을 갖는다.
[참고예 2]
FFA을 위한 높은 독소생산능을 갖는 형질전환체의 제조:
파상풍독소유전자의 DNA[참조 EMBO JOURNAL, 5(10), 2495-2502, 1986; Nucleic Acid Research 14(19), 7809-7812, 1986]을 제한효소로 소화시켜, FFA를 코딩하는 2.7 kb DNA 단편(Stu I-Bsp HI)를 수득한다. 수득한 DNA 단편은 pSN508[대장균에서 다량발현할 수 있는 벡터(참조, 미국 특허 4,703,005)]에 삽입접합시켜 재조합 발현 벡터를 수득한다. 이어서, 수득한 재조합 발현 벡터를 대장균 균주 CSH26에 도입하여 FFA을 위한 높은 독소생산능을 갖는 형질전환체를 형성시킨다. FFA의 제조를 전술한 형질전환체를 배양하여 실행하는 경우, 전장 파상풍독소분자의 프로테아제 소화와 같은 후술되는 처리 및 디티오트레이톨 또는 우레아를 이용한 처리를 할 필요는 없지만 정제는 필요하다.
[참고예 3]
변성 Latham 배지의 조성(배지 1ℓ기준)
폴리펩톤 20g
소심장추출물 10g
글루코오스 8.0g
염화나트륨 2.5g
황산마그네슘(7 수염) 0.1g
시스틴 0.125μg
칼슘 판토텐에이트 1.0mg
우라실 1.25mg
니코틴산 0.25mg
티아민 0.25mg
리보플라빈 0.25mg
피리독신 0.25mg
바이오틴 2.5μg
비타민 B120.05μg
폴산 100μg
염화철(Ⅲ)(6 수염) 32mg
(pH는 7N NaOH를 이용하여 7.0으로 조정한다)
[참고예 4]
MLD(최소치사량):
대수간격 100.5로 파상풍독소를 연속적으로 희석하여 제조한 0.1 내지 0.5㎖의 각각의 파상풍독소함유 용액의 희석액을 각각 OFI 마우스(체중 20 내지 25g)의 좌측뒷다리의 대퇴부에 피하 또는 근육내 주사한다. 용량(용량의 로그)-반응(사망시간) 곡선에 기초하여 MLD를 측정한다[참조, "Proceedings of the 6th International Conference on Tetanus(Lyon, 1981)" pp.21-32].
[참고예 5]
Lf 단위(응집의 단위):
독소 용액의 Lf 값은 라몬의 방법으로 측정할 수 있다(Biken Journal, 7, 137-152, 1964). 항독소 1단위와 반응하는 독소의 양인 1Lf의 독소를 측정한다. 또한, 전술한 Lf 값의 측정은 SRID(Single Radial Immunodiffusion)를 이용하여 실행할 수 있다(참조, Immunochemistry, 2, 235-254, 1965).
[참고예 6]
단백질 함량의 측정:
단백질 함량은 단백질 및 페놀 시약의 색반응을 색도계로 평가하는 로워리등의 개량법에 따라 측정한다. 이후, 이 방법은 단순히 "페놀 시약 방법"으로 칭한다.
[참고예 7]
단백질 분획의 검출 및 단백질 분획사이의 단백질농도에 대한 비교
단백질 분획의 검출 및 단백질 분획 사이의 단백질 농도의 비교는 시료의 280nm 파장의 자외선 흡광도(이후, "280nm에서의 흡광도"로 칭함)를 측정하여 행한다.
[참고예 8]
DTT-Tris 버퍼의 제조(100 mM)
DTT-Tris 버퍼를 50 mM 트리스(히드록시메틸)아미노메탄-HCl(이후, 단순히 "Tris"로 칭함), 1 mM 에틸렌디아민테트라아세테이트-4 Na(이후, 단순히 "EDTA"로 칭함) 및 100 mM DTT을 혼합하여 제조한다. DTT-Tris 버퍼의 pH를 1/10 M HCl를 이용하여 8.2로 조정한다.
[참고예 9]
포스페이트버퍼의 제조
포스페이트버퍼를 동몰량의 디소듐 모노히드로겐포스페이트와 칼륨 디히드로겐포스페이트 용액을 혼합하여 제조한다. 혼합하는 용액의 양은 적절히 선택하여 생성된 포스페이트버퍼가 목적하는 pH 값을 갖도록 한다.
[참고예 10]
SDS-PAGE를 이용한 단백질의 분자량의 측정
SDS-PAGE에서, 7.5%(w/v), 7.0%(w/v)(2M 우레아함유), 5.0%(w/v) 등의 겔함량을 갖는 SDS-PAGE 겔을 사용할 수 있다. 버퍼 용액으로서, 예컨대, 10mM Tris-77 mM 글리신 버퍼(pH 8.6)을 사용할 수 있다. 전기영동후, 겔은 코마시에 브릴런트 블루를 이용하여 염색한다. 각 단백질의 분자량을 시료 단백질의 이동거리 대 마커염료 또는 공지된 분자량의 단백질의 이동거리의 비로부터 각각 결정한다. 전술한 방법에 따라 행해지는 측정의 결과, FFA 및 전장 파상풍 독소분자의 분자량(x 104)은 각각 100,000 및 150,000이었다.
[참고예 11]
이중 면역확산을 이용한 항원특이성의 측정
항원 특이성은 50 mM Tris-0.6M 글리신 버퍼중의 1 %(w/v) 아가로오스(1 mM EDTA를 함유;pH 8.5) 및 비특이적 항체가 제거된 말 항-파상풍 독소 혈청을 이용한 오우치터로니(Ouchterlony)의 방법으로 측정한다. 항원성의 교차반응이 FFA와 전장 파상풍 독소분자사이에서 관찰된다.
[참고예 12]
FFA의 아미노산 서열의 측정
FFA의 아미노산 서열의 측정은 미국 퍼킨 엘머사제의 Applied Biosystem Procise Type 492와 같은 자동 아미노산 시퀀서를 이용하여 행한다. 하기 실시예 1에서 수득한 FFA는 도 2(a)의 N-말단 아미노산 서열(7)을 갖고, 하기 실시예 7에서 수득한 FFA는 도 2(a)의 N-말단 아미노산 서열(4)를 갖는다. 또한, 파상풍의 배양조건을 적절히 선택함으로서, 도 2(a)의 N-말단 아미노산 서열(8)을 갖는 FFA를 수득할 수 있다. 각각 도 2(a)의 N-말단 아미노산 서열(1) 내지 (3) 및 (6)을 갖는 FFA들은, 세포내 파상풍독소 분자를 트립신으로 소화시켜 독소분자를 이의 니크형태로 전환시키기 위한 조건, 예컨대 효소농도, 반응시간 및 반응온도를 적절히 선택하여 세포내 파상풍 독소로부터 제조할 수 있다. 도 2(a)의 N-말단 아미노산 서열(5)를 갖는 FFA 제제는 세포내 파상풍 독소분자를 키모트립신으로 소화시켜 독소분자를 이의 니크형태로 전환시켜 제조할 수 있다. 따라서, 본 발명에 있어서, 도 2(a)의 N-말단 아미노산 서열(1) 내지 (8)을 각각 갖는 8개의 상이한 유형의 FFA를 수득할 수 있다. 이런 8유형의 FFA는 개별적으로 또는 조합하여 파상풍 백신의 유효성분으로서 사용할 수 있다.
[참고예 13]
FFA의 등전점의 측정:
FFA의 등전점을 시판용 겔, 예컨대 스웨덴의 파르마시아 바이오테크사의 상표명 "Phast Gel IEP 3-9"로 시판되는 겔을 이용한 등전점전기영동법으로 측정한다. 상기 방법에 따라 실시예들에서 행한 측정의 결과로, 본 발명의 FFA는 7.25±0.5 범위내의 등전점을 갖는 것을 발견하였다.
[참고예 14]
전장 파상풍 독소분자의 제조
참고예 1에서 수득한 파상풍 균주의 종균을 참고예 3에 기재된 배양배지에 접종하여 44시간동안 배양하고, 세균세포를 4℃에서 25분간 10,000×g로 원심분리하여 수집한다. 0.1M 시트르산나트륨을 함유하는 1M NaCl 용액을 세포배양물의 1/30 부피의 양으로 첨가하여 세포내 독소를 부드럽게 교반하여 추출한다.
생성된 혼합물을 4℃에서 밤새워 교반하여 파상풍 독소를 추출한후, 4℃에서 30분간 10,000×g으로 원심분리하여 세포 및 세포 찌꺼기를 제거한다. 출발 물질로서 생성된 상층액을 이용하여, 독소를 하기 실시예 1과 실질적으로 동일한 방법으로 정제하여 정제된 전장 파상풍 독소 제제를 수득한다.
[참고예 15]
면역역가를 평가하기 위한 스코어방법:
파상풍 톡소이드의 상대 역가를 스코어 방법을 이용하여 평가한다. 구체적으로 언급하면, 파상풍 백신이 주사된 면역학적 실험용 동물을 독소로 공격하고, 파상풍의 증세에 대하여 1주일간 관찰한다. 증세의 심각성을 하기의 기준에 따라 스코어 방법으로 평가한다:
결과 스코어
동물이 1일째 사망 : 0
동물이 2일째 사망 : 1
동물이 3일째 사망 : 2
동물이 4일 내지 7일째 죽거나 심각한 증세
(예, 긴장성경련, 보행곤란 및 호흡곤란)를 보임 3
동물이 약간의 증세를 갖으며 1주일간 생존
[예, 주사측의 반대측복부근육의 국부마비
(이 증세는 동물의 꼬리를 매달아 관찰하여 판정한다)] 4
동물이 임의의 증세없이 1주일간 생존 : 8
얻어진 스코어를 평행선 검정용 통계분석을 위해 고안된 소프트웨어를 이용하여 컴퓨터로 분석하며, 여기에서 스코어의 상관관계 분석은 균일성, 직선성 및 평행성에 관하여 행하여 공지된 국제단위의 표준 파상풍 전장 독소 톡소이드에 대한 파상풍 톡소이드의 상대 면역역가를 평가한다.
[참고예 16]
기니 돼지를 이용한 피내 반응
세개의 군의 기니 돼지를 1기니 돼지당 1㎖의 파상풍 백신(10μg 단백질/㎖)을 근육내 주사하여 감작시키며, 여기에서 전술한 세개의 군의 기니 돼지는 (1) 시판용 부분정제 전장 독소 톡소이드, (2) 정제된 전장 독소 톡소이드 및 (3) FFA 백신으로 각각 감작시킨다. 감작시킨후 4주후, 각 기니 돼지의 등의 털을 깍아낸후, 기니 돼지의 등에 0.1㎖의 전술한 파상풍 톡소이드를 각각 피내주사한다. 파상풍 독소 용액의 단백질 농도는 기니 돼지가 속한 군에 따라 다르다(32.0, 10.0 및 3.2μg). 주사후 24시간뒤, 각각의 기니 돼지에 대하여, 주사된 부분을 조사하여 피부반응, 발적, 경결 및/또는 괴사가 발생했는지에 대해 조사한다. 발적의 발생이 관찰되는 경우, 발적의 직경을 측정한다.
[실시예 1]
(1) 전장 파상풍 독소 분자(니크형태)의 제조 및 정제
450㎖의 변성 Latham 배지(참조, 참고예 3)를 함유하는 각 20개의 튜브(직경: 6㎝; 높이: 38㎝)에, 파상풍 Harvard A47 균주의 Biken 아주(참조, 참고예 1)의 종균 5㎖를 접종한다. 성긴면플러그로 막은 튜브를 배양물이 투명해질 때까지 5일동안 35℃에서 배양한다. 이 배양물을 4℃에서 30분간 10,000×g으로 원심분리하여 투명한 배양물 상층액을 수득한다. 출발물질로서 이렇게 수득한 배양물 상층액 8.5ℓ를 여과하고 전장 파상풍 독소분자(니크형태)의 정제를 위하여 사용한다.
황산암모늄(pH 7.0)의 포화 용액(25℃)을 빙수조내에서의 출발물질에 첨가 및 혼합하여 20% 내지 40%의 포화황산암모늄을 갖는 분획을 염석시킨다. 수득한 분획을 0.06M 포스페이트버퍼(pH 7.5, 4℃)의 65㎖에 현탁시키어(참고, 참고예 9) 40%의 포화황산암모늄을 갖는 현탁액을 수득한다. 수득한 현탁액을 4℃에서 30분간 15,000×g으로 원심분리하여 침전물을 수득한다. 수득한 침전물을 전술한 포스페이트 버퍼 22㎖에 재현탁시켜서 세척하고, 생성물을 전술한 바와 같은 원심분리 조건하에서 원심분리시킨다. 세척된 침전물을 0.1M 포스페이트 버퍼(pH 7.5, 4℃)의 22㎖에 용해시키고, 4℃에서 2시간동안 100,000×g으로 초원심분리시켜 침전된 잔류물을 제거하여, 상층액 20㎖를 수득한다. 수득한 상층액을 Acrodisc 막(기공직경: 0.2㎛)(독일 겔만사제)을 통해 여과시키고, 부분적으로 정제된 독소의 생성된 여과물은 0.1M 포스페이트 버퍼(pH 7.5)로 평형화된 AcA 34 컬럼(내경: 2.5cm, 길이: 100cm)(스웨덴 LKB-파르마시아제)를 이용하여 겔여과시킨다. 겔여과에서, 용출은 전술한 포스페이트 버퍼(유동속도: 9㎖/hr)를 이용하여 4℃에서 실행하고, 생성된 용출물은 1㎖의 분획으로 분획화한다. 각각의 분획에 대하여, 280㎚에서의 흡광도(참조, 참고예 7)를 측정한다. 높은 흡광도를 갖는 분획을 모아, 총부피 5㎖로 겔여과용출물을 수득한다.
수득한 용출물에 대하여, 페놀시약방법(참조, 참고예 6)에 따른 단백질 함량의 측정, 단백질 1mg당 MLD의 측정(참조, 참고예 4) 및 단백질 1mg당 Lf의 측정(참조, 참고예 5)를 행한다. 그 결과, 용출물의 단백질 함량은 60mg/㎖, Lf는 400 그리고 MLD은 3.5×107이다.
또한, 용출물의 0.2㎖를 0.1M 포스페이트 버퍼(pH 6.8)로 평형화된 TSKG 3000 SW 컬럼(내경: 0.75㎝, 길이: 60㎝)(일본 도쇼사제)를 이용하여 고성능액체크로마토그래피시키며, 여기에서 용출은 전술한 포스페이트 버퍼(유동속도: 0.6㎖/분)를 이용하여 실행하여 분획을 수득한다. 각 분획의 280㎚에서의 흡광도를 측정한다. 그 결과, 단일 사프 피크가 관찰되고, 이는 전장 파상풍독소분자가 고도로 정제되었음을 보여준다. 후술되는 FFA의 제조에서, 앞서 수득한 용출물을 고도로 정제된 전장 파상풍 독소분자(니크형태)의 용액으로서 사용한다(즉, 고도로 정제된 파상풍 독소 용액).
(2) FFA 제조
DTT-Tris 버퍼 18㎖(참고, 참고예 8)를 고도로 정제된 파상풍 독소 용액 2㎖에 가한후, 혼합한다. 생성된 혼합물을 25℃에서 60분간 반응시켜 전장 파상풍 독소 분자내 존재하는 이황화물 다리를 감소시킨다. 고형우레아 4.8g을 혼합물에 가함으로써 생성된 혼합물을 우레아로 처리한후, 혼합하여 고형 우레아를 혼합물내 용해시킨다(최종 우레아농도: 4M). 5mM Tris 버퍼 20㎖(0.6M 글리신, 1mM EDTA 및 1mM DTT; pH 8.5)를 생성물에 가하고, 생성된 혼합물을 Amicon ultrafilfration System(미국 그레이스 컴퍼니사제)을 이용하여 응축시켜, 응축물 3㎖를 수득한다. 수득한 응축물 50mM Tris 버퍼(0.6M 글리신, 1mM EDTA 1mM DTT 및 2M 우레아; pH 8.5)로 평형화된 Ultrogel AcA 44 컬럼(내경: 1.5㎝, 높이: 90㎝)을 이용하여 겔여과시킨다. 겔 여과에서, 용출은 전술한 50mM Tris 버퍼(유동속도: 5㎖/hr)를 이용하여 행하고 생성된 용출물을 1.2㎖ 분획으로 분획시킨다. 각 분획에 대하여, 280㎚에서의 흡광도를 측정한다. 그 결과, 두개의 피크(피크 1 및 피크 2)가 관찰된다. 각각 280㎚에서 피크를 보이는 두개의 분획을 포함하는 수득된 분획으로부터(즉, 피크 1분획 및 피크 2분획, 여기에서 피크 1분획은 피크 2분획보다 먼저 수득된다), 피크 1분획으로부터 출발하여 연속적으로 수득되는 일련의 5개의 분획(총량: 6㎖) 및 피크 2분획으로부터 출발하여 연속적으로 수득되는 또다른 일련의 5개의 분획(총량: 6㎖)를 수집하여 각각 수집분획 1 및 수집분획 2를 수득한다.
각각의 고도로 정제된 파상풍 독소 용액, 수집분획 1 및 수집분획 2를 대략적 분자량을 측정하기 위하여 SDS-PAGE(참조, 참고예 10) 시키고, 항원성을 측정하기 위하여 겔침전반응(참조, 참고예 11) 시킨다. 그 결과, 정제된 파상풍 독소의 분자량, 수집분획 1 및 수집분획 2는 각각 대략 150,000, 100,000, 50,000이다. 항원성에 대하여, 항원성의 교차반응이 고도로 정제된 파상풍 독소 용액과 각 수집분획 1 및 수집분획 2 사이에서 관찰되는 반면, 수집분획 1과 수집분획 2 사이에서는 관찰되지 않는데, 이는 이러한 두 유형의 수집분획은 완전히 상이한 항원성을 갖음을 나타낸다. 또한, 수집분획 1과 수집분획 2의 단백질 함량은 각각 15mg/㎖ 및 8mg/㎖이다. 이러한 결과로부터, 수집분획 1은 FFA를 함유함이 확인되었다. 후술되는 작업에서, 수집분획 1은 FFA 용액으로 사용한다.
(3) FFA의 안정화
FFA 용액 4㎖를 4℃에서 밤새워 1/15 M 포스페이트 버퍼(pH 7.8)를 외액으로서 투석한다. 투석종결후, 전술한 포스페이트 버퍼를 투석된 FFA 용액에 첨가 및 혼합하여 총부피 380㎖의 용액을 수득한다. 50mM 리진 용액 20㎖를 전술한 FFA 용액에 첨가하여 FFA 용액의 단백질 함량이 600μg/㎖이 되게 한다. 생성된 FFA 용액에 최종 포르말린 농도가 0.2%(v/v)이 되는 정도의 양으로 포르말린을 가하고, 생성된 혼합물을 37℃에서 14일동안 배양하여 FFA를 안정화시킨다. 이어서, 안정화된 FFA를 4℃에서 밤새워 0.85%(w/v) NaCl 용액을 외액으로 하여 투석시켜 포름알데히드 및 리진을 제거하고, 투석물을 살균을 위해 Acrodisc 막(기공직경: 0.22㎛)을 통해 여과하여, 380㎖의 여과물을 수득한다. 수득된 여과물을 4℃에서 저장하고, 후술되는 벌크 FFA 파상풍 백신 용액으로서 사용한다.
(4) 시료 FFA 파상풍 백신의 제조
벌크 FFA 파상풍 백신 용액을 0.85%(w/v) NaCl 용액으로 희석하여 최종 단백질 농도 50μg/㎖의 희석용액을 수득한다. 동부피의 Al(OH)3겔 현탁액[Al(OH)3함량: 2mg/㎖]을 수득된 희석용액에 가한후 혼합한다. 생성된 혼합물을 4℃에서 밤새워 정치시켜 FFA가 Al(OH)3겔상에 흡착되도록 하여, 시료 백신을 수득한다. 수득된 시료 백신에 대하여, 이의 활성(면역역가) 및 이의 안정성(독성 또는 부작용)를 후술되는 바와 같이 평가한다.
(5) 시료 FFA 파상풍 백신의 면역역가의 평가
시료 FFA 파상풍 백신의 면역역가의 평가는 마우스를 이용한 실험으로 행한다. 대조군으로서, 참고예 14에서 제조한 전장 파상풍 독소분자의 용액을 사용하는 것만 제외하고, 전항 (3) 및 (4)에서와 실질적으로 동일한 방법으로 또다른 백신을 제조한다. 시료백신 및 대조군백신의 각각에 대하여, 0.85%(w/v) NaCl 용액에 의한 2.5배의 시리얼 희석을 행하여 상이한 희석비의 희석물을 수득하여, 이를 후술되는 바와 같이 마우스에 투여하며, 여기에서 적어도 3개의 희석물은 희석물이 용량-반응곡선의 직선영역내가 되는 용량-반응 관계를 보이는 정도의 희석비를 갖는다. 수득한 백신 희석물(즉, 시료백신희석물 및 대조군 백신 희석물)를 이용하여, 마우스의 면역화를 하기와 같이 실행한다. 시료백신희석물들(각각 0.5㎖의 양을 갖음)을 각각 무작위로 선택된 10마리의 ddy/s 암컷 마우스(각각의 체중 22 내지 26g)의 좌측뒷다리의 대퇴부안쪽에 피하주사하여 투여한다. 주사후 4주후, 각 면역된 마우스를 피하주사로 100 LD50표준 독소(Lot TA-4B)(일본 국립예방위생연구소에 의해 제공) 공격시킨다. 또한 상기의 작업을 시료백신 희석물대신에 대조군 백신 희석물을 사용하여 행한다. 전술한 작업후, 마우스가 생존하는지 및 생존하는 마우스의 증세에 대하여 1주일간 관찰한다. 관찰의 결과는 스코어 방법(참고, 참고예 15)으로 평가한다. 얻어진 스코어를 통계분석용 소프트웨어를 이용한 컴퓨터로 분산 및 상관관계에 대하여 분석한다. 통계적 분석의 결과로부터, 시료 FFA 파상풍 백신의 상대 면역역가(전장 파상풍 독소 톡소이드를 함유하는 백신의 면역역가에 대한 시료백신의 면역역가의 비율, 여기에서 대조군 백신의 면역역가는 1.0으로 정한다)를 계산한다. 전술한 실험을 4회 반복하고, 얻어진 상대 면역역가의 값을 컴퓨터로 통계적으로 분석한다. 결과를 표 1에 나타내었다. 시료 FFA 파상풍 백신의 면역역가는 실질적으로 전장 파상풍 독소톡소이드를 함유하는 대조군 백신과 동일하다.
(6) 시료 FFA 파상풍 백신의 피내반응에 의해 유발되는 부작용의 정도를 평가하기 위한 기니 돼지를 이용한 실험
피내반응을 기니 돼지(std.Hartley, 체중 300 내지 350g, 생후 5주의 암컷)(일본 Japan SLC 사로부터 구입)를 이용하여 참고예 16에 기재된 방법에 따라 행한다. 기니 돼지의 감작은 하기와 같이 행한다. 기니 돼지를 감작시키기 위한 항원으로서는 시료 FFA 파상풍 백신(FFA), 전장 파상풍독소 톡소이드를 아마도 함유하는 시판용 파상풍 톡소이드(통상적 톡소이드) 및 정제된 전장 파상풍 독소 톡소이드(전장 독소 톡소이드)를 함유하는 백신을 사용한다. 이러한 항원의 각각을 0.85%(w/v) NaCl를 이용하여 희석하여 최종 단백질 농도 및 최종 Al(OH)3농도가 각각 10μg/㎖ 및 0.2mg/㎖가 되도록 하여 세가지 유형의 항원희석물을 수득한다. 기니 돼지를 각각 3마리의 기니 돼지로 구성된 9개의 군으로 무작위로 분할하고, 앞서수득한 세가지 유형의 항원 희석물을 각각 9개의 군의 각각의 3마리의 기니 돼지에게 투여한다. 감작화 기간(4주)의 완료후, 감작된 기니 돼지를 하기의 방법으로 전술한 항원으로 공격시킨다. 전술한 각각의 항원에 대하여, 이의 각각 3.2, 1.0 및 0.32μg/㎖의 최종 단백질 농도를 갖는 세가지 유형의 희석물을 0.85%(w/v) NaCl 용액을 이용하여 제조한다. 생성된 아홉가지 유형의 희석물(세가지 유형의 FFA의 희석물, 세가지 유형의 통상적 톡소이드의 희석물 및 세가지 유형의 전장독소 톡소이드의 희석물로 구성된)을 동일군에 속하는 기니 돼지는 동일유형의 희석물의 투여를 받도록 기니 돼지에 투여하며, 여기에서 각 희석물의 용량은 0.1㎖이다. 대조군으로서, 실질적으로 전술한 방법과 동일한 방법으로 전술한 항원으로 각각 감작된 세마리의 각 기니 돼지에게 0.85%(w/v) NaCl 용액 0.1㎖를 피내주사한다. 결과를 표 2에 나타내었다. 시료 FFA 파상풍 백신이 투여된 각각의 기니 돼지에 대하여, 피내반응의 발생이 통상적 백신이 투여된 기니 돼지 및 전장 파상풍 독소 톡소이드를 함유하는 백신이 투여된 기니 돼지와 비교하여 검출되지 않거나 또는 미소하게 검출된다.
[실시예 2]
(1) 벌크 FFA 파상풍 백신 용액의 제조
파상풍 Harvard A47 균주의 Biken 아주의 종균 5ℓ를 부피 100ℓ의 스테인레스 스틸 탱크(직경: 60㎝, 높이: 50㎝)에 함유된 변성 Latham 배지 80ℓ에 접종시킨다. 탱크를 실리콘 쉬트로 밀봉하고, 종균을 35℃에서 6일간 배양하여 배양물을 수득한다. 수득한 배양물을 살균용 셀라이트-필터종이를 통해 여과하여 여과물 75ℓ를 수득한다. 수득한 여과물을 "pericon cassette system"(미국 Millipore 사제)를 이용하여 농축시켜, 응축물 7ℓ를 수득한다.
수득한 응축물을 출발물질로 사용하여, 전장 파상풍 독소 분자의 정제, FFA의 제조 및 FFA의 안정화를 실질적으로 실시예 1과 동일한 방법으로 실행하여, 단백질 농도 600μg/㎖의 벌크 FFA 파상풍 백신 용액 450㎖를 수득한다.
(2) FFA 파상풍 플레인 백신 제제의 제조
상기에서 수득한 벌크 FFA 파상풍 백신 용액을 1/75M 포스페이트 버퍼(pH 6.5)를 이용하여 희석하여 백신제제의 최종 단백질 농도가 60μg/㎖가 되도록한다. 생성된 희석물에 각각 수크로오스, L-아르기닌 및 해마셀(독일 호에크스트 아크티엔게젤샤프트사제) 순으로 수크로오스, L-아르기닌 및 해마셀의 최종 농도가 각각 3%(w/v), 1%(w/v) 및 2%(w/v)가 되는 정도의 양으로 첨가한후, 혼합하여 단일-항원 백신 제제를 수득한다. 수득한 제제를 각 1㎖의 부피의 유리 바이알에 분산시켜, 각각의 바이알에 0.6㎖의 제제가 함유되도록 하고, 이어서 바이알을 밀봉한다. 수득한 단일-항원 백신 제제를 일본 후생성 고지 제 217 호: 생물학적 제제기준(생물학적 제품에 대한 최소의 요건)의 "파상풍 톡소이드" 규정에 따라 각종 시험검정을 행한다. 그 결과, 수득된 제제는 적격의 백신으로 확인되었다.
[실시예 3]
흡착된 FFA 파상풍 백신 제제의 제조
실시예 2에서 수득한 벌크 FFA 파상풍 백신 용액을 1/40 M 포스페이트 버퍼(pH 6.0)를 이용하여 희석하여 백신제제의 최종 단백질 농도가 60μg/㎖가 되도록한다. 생성된 희석물에 백신제제의 최종 인산알루미늄겔의 농도가 0.2㎖/㎖되는 정도의 양으로 첨가하여, 혼합물을 수득한다. 수득한 혼합물을 4℃에서 5시간동안 교반하여 인산알루미늄 겔상에 FFA를 흡착시킨다. 생성된 혼합물을 4℃에서 20분간 2000rpm로 원심분리하여 겔을 수집한다. 수집된 겔을 1/75 M 포스페이트 버퍼(pH 6.5)에 현탁시킨다. 생성된 현탁액에 수크로오스, L-아르기닌 및 해마셀(독일 호에크스트 아크티엔게젤샤프트사제) 순으로 수크로오스, L-아르기닌 및 해마셀의 최종 농도가 각각 3%(w/v), 1%(w/v) 및 2%(w/v)가 되는 정도의 양으로 첨가한후, 혼합하여 흡착된 FFA 파상풍 백신 제제를 수득한다. 수득된 제제를 1㎖ 부피의 유리 바이알의 각각에 0.6㎖의 제제가 함유되도록 유리바이알에 분산시킨후, 바이알을 밀봉한다. 수득한 흡착된 FFA 파상풍 백신 제제를 일본 후생성 고지 제 217 호: 생물학적 제제기준(생물학적 제품의 최소의 요건)의 "흡착된 파상풍 톡소이드"의 규정에 따라 각종 시험을 행한다. 그 결과, 수득된 제제는 적격의 백신으로 확인되었다.
[실시예 4]
FFA 파상풍 백신을 이용한 흡착된 DPT 혼합 백신 제제의 제조
흡착된 FFA 파상풍 백신의 최종 단백질 농도를 180㎍/㎖로 바꾸는 것만 제외하고, 흡착된 FFA 백신을 실시예 3과 실질적으로 동일한 방법으로 제조한다. 흡착된 디프테리아 톡소이드 및 흡착된 백일해 백신을 각각의 톡소이드 농도 및 백신 농도가 실행 농도의 3배가 되도록 각각 제조한다. 흡착된 FFA 파상풍 백신, 흡착된 디프테리아 톡소이드 및 흡착된 백일해 백신을 함께 혼합하여 흡착된 DPT 혼합 백신 제제를 수득한다. 수득된 제제를 10㎖ 부피의 유리 바이알의 각각에 10㎖ 제제가 함유되도록 분산시킨후, 바이알을 밀봉한다. 흡착된 DPT 혼합 백신 제제를 일본 후생성 고지 제 217 호: 생물학적 제제기준(생물학적 제품의 최소의 요건)의 "흡착된 디프테리아-백일해-파상풍 혼합 백신"의 규정에 따라 각종 시험을 행한다. 그 결과, 수득된 제제는 적격의 백신으로 확인되었다.
[실시예 5]
FFA 파상풍 백신을 이용한 흡착된 DT 혼합 백신 제제의 제조
흡착된 FFA 파상풍 백신의 최종 단백질 농도를 120㎍/㎖로 바꾸는 것만 제외하고, 흡착된 FFA 파상풍 백신을 실시예 3과 실질적으로 동일한 방법으로 제조한다. 흡착된 디프테리아 톡소이드를 톡소이드 농도가 실행 농도의 2배가 되도록 제조한다. 흡착된 FFA 파상풍 백신 및 흡착된 디프테리아 톡소이드를 함께 혼합하여 흡착된 DT 혼합 백신 제제를 수득한다. 수득된 제제를 1㎖ 부피의 유리 바이알의 각각에 0.6㎖의 제제가 함유되도록 분산시킨후, 바이알을 밀봉한다. 흡착된 DT 혼합 백신 제제를 일본 후생성 고지 제 217 호: 생물학적 제제기준(생물학적 제품의 최소의 요건)의 "흡착된 디프테리아-파상풍 혼합 백신"의 규정에 따라 각종 시험을 행한다. 그 결과, 수득된 제제는 적격의 백신으로 확인되었다.
[실시예 6]
건조 FFA 파상풍 백신 제제의 제조
FFA 파상풍 백신 제제는 실시예 2와 실질적으로 동일한 방법으로 제조한다. 수득한 FFA 파상풍 백신 제제를 1㎖ 부피의 유리 바이알 각각에 0.6㎖의 제제가 함유되도록 분산시킨후, 냉동건조시켜 건조 FFA 파상풍 백신 제제를 수득한다. 이어서, 바이알을 밀봉한다. 바이알중의 하나를 개봉하고, 건조 FFA 파상풍 백신 제제를 살균증류수로 용해시켜 0.6㎖의 백신용액을 수득하고, 수득한 백신용액을 일본 후생성 고지 제 217 호: 생물학적 제제기준(생물학적 제품의 최소의 요건)의 "파상풍 톡소이드"의 규정에 따라 각종 시험을 행한다. 그 결과, 수득된 제제는 적격의 혼합 백신으로 확인되었다.
[실시예 7]
시료 FFA 파상풍 백신의 제조 및 이의 면역역가의 평가
세포외 독소를 이용한 백신의 제조 및 제조된 백신의 면역역가의 평가를 이용하는 조건을 하기와 같이 바꾸는 것만 제외하고, 실시예 1과 실질적으로 동일한 방법으로 행한다.
35℃에서 파상풍균의 종균의 배양 시간을 6일로 변화시킨다. Ultrogel AcA 34 컬럼을 이용하여 겔 여과로 수득한 전장 파상풍 독소 분자(니트형태)의 용액으로부터 FFA의 제조를 하기와 같이 행한다. DTT-Tris 버퍼(참고, 참고예 8)를 전장 파상풍 독소분자의 전술한 용액에 전장 파상풍 독소분자의 용액의 2㎎당 1㎖의 양으로 첨가한후, 혼합한다. 이어서, 반응을 25℃에서 60분간 실행하여 독소분자내 이황화물 다리를 감소시킨다. 이어서, 최종 우레아 농도가 4M가 되는 정도의 양으로 고형 우레아를 첨가함으로서 생성된 반응 혼합물을 우레아로 처리한다. 반응 혼합물을 버퍼 A(0.2mM Tris-HCl 함유 2M 우레아 용액 및 1mM DTT; pH 7.0)로 평형화된 PD10 컬럼(스웨덴 파르마시아 바이오테크사제)에 적용하고, 반응혼합물내 DTT-Tris 버퍼를 버퍼 A로 대체하기 위하여 전술한 버퍼 A를 이용하여 용출을 행한다. 분해된 독소를 함유하는 생성된 용출물을 버퍼 A로 평형화된 Mono Q 컬럼(스웨덴 파르마시아 바이오테크사제)을 이용하여 컬럼크로마토그래피시키며, 여기에서 용출은 FPLC(스웨덴 파르마시아 바이오테크사제) 및 버퍼 B(NaCl을 버퍼 A에 첨가하여 형성된 것이며, 여기에서 NaCl 농도는 0 내지 0.5M의 직선기울기로 증가한다)를 이용하여 행한다. 수득한 용출물에 대하여, 분석은 실시예 1과 동일한 방법으로 행한다. 그 결과, 280㎚에서 피크를 보이는 용출물의 분획중에서, 가장 빨리 수득된 분획은 FFA였음을 발견하였다.
FFA의 안정화는 FFA 용액을 0.2%(v/v)의 포르말린을 함유하는 0.067M 포스페이트 버퍼(Na-K, pH 7.8) 및 0.025M 리진의 혼합물에서 35℃에서 2주간 배양하여 실행한다.
수득한 안정화된 FFA를 사용하여 FFA 파상풍 백신을 제조한다.
시료 FFA 파상풍 백신의 면역역가의 평가는 실시예 1의 (5)항에서와 실질적으로 동일한 방법으로 마우스를 이용하여 4세트의 실험을 행한다. 결과는 표 3에 나타내었다. 표 3으로부터 명백한 바와 같이, 시료 FFA 파상풍 백신의 면역역가는 실질적으로 전장 파상풍 독소 톡소이드를 함유하는 대조군 백신(즉, 통상적 파상풍 톡소이드)과 실질적으로 동일한 수준을 갖는다.
서열목록
SEQ ID NO. : 1
서열길이 : 1315
서열유형 : 아미노산
토폴로지 : 선형
분자유형 : 펩티드
서열설명
본 발명에 따라, 파상풍 백신용 FFA(파상풍 독소의 기능적 단편 항원)은 통상의 파상풍 톡소이드와 비교하여, 부작용의 감소에 대하여 매우 우수할 뿐만아니라, 실질적으로 통상의 파상풍 톡소이드와 동일한 면역역가를 갖는다는 점에서 유리하다.
본 발명의 FFA를 파상풍 백신의 유효성분으로서 사용하여, 통상의 파상풍 백신과 비교하여, 부작용의 감소에 있어 매우 우수할 뿐만아니라, 실질적으로 통상의 파상풍 톡소이드 백신과 동일한 면역역가를 갖는 파상풍 백신을 제공할 수 있다.
또한, 전술한 파상풍 백신은 백일해 백신 및 디프테리아 백신과 같은 파상풍 백신외의 1종이상의 백신과 파상풍 백신을 함유하는 혼합 백신의 형태로 제공할 수 있다.
Claims (6)
- 고정화제로 안정화되기 전의 파상풍 독소의 기능적 단편 항원이 전장 파상풍 독소 분자의 전장 아미노산 서열의 N-말단에 존재하는 이황화물 다리를 형성하는데 관여하는 두개의 시스테인 잔기간의 부분 아미노산 서열중의 상호인접한 아미노산 잔기를 각각 연결시켜주는 펩티드 결합으로부터 선택되는 하나이상의 펩티드 결합을 분해하는 단계, 상기 이황화물 다리를 분해하는 단계, 및 파상풍 독소 분자상의 기들 사이의 실질적으로 모든 비공유결합을 분해하는 단계로 구성된 방법으로 얻는 것과 실질적으로 동일한 1종이상의 단편을 포함하는, 고정화제로 안정화된 파상풍 독소의 기능적 단편 항원:상기 파상풍 독소의 기능적 단편 항원은 이하의 특성을 갖는다:(a) SDS-폴리아크릴아미드겔 전기영동법으로 측정시 90,000 내지 110,000의 분자량 및(b) 등전점전기영동법으로 측정시 7.25±0.5의 등전점.
- 제1항에 있어서, 1종이상의 단편의 각각은 독립적으로 이하의 아미노산 서열 (1) 내지 (8)으로 구성된 군으로부터 선택되는 N-말단 아미노산 서열을 갖는 파상풍 독소의 기능적 단편 항원:
- 유효성분으로서, 제1항 또는 제2항의 파상풍 독소의 기능적 단편 항원을 유효한 면역원량으로 함유하는 파상풍 백신.
- 복수의 유효성분중의 하나로서, 제1항 또는 제2항의 파상풍 독소의 기능적 단편 항원을 유효한 면역원량으로 함유하는 결합 백신.
- 파상풍균(Clostridium tetani)의 배양여과물로부터 세포외 파상풍 독소를 수집 및 정제하여 세포외 파상풍독소 분자를 수득하는 단계, 세포외 파상풍 독소분자의 전장 아미노산 서열의 N-말단에 존재하는 이황화물 다리를 분해하는 단계 및 세포외 파상풍 독소분자상의 기들 사이의 실질적으로 모든 비공유결합을 분해하는 단계로 구성된 방법으로 수득되는 것과 실질적으로 동일한 1종이상의 단편을 포함하는 파상풍 독소의 기능적 단편 항원을 고정화제로 안정화시키는 것을 특징으로 하는 파상풍 백신의 제조방법:상기 파상풍 독소의 기능적 단편 항원은 하기의 특성을 갖는다:(a) SDS-폴리아크릴아미드겔 전기영동법으로 측정시 90,000 내지 110,000의 분자량 및(b) 등전점전기영동법으로 측정시 7.25±0.5의 등전점.
- 제5항에 있어서, 1종이상의 단편의 각각은 독립적으로 이하의 아미노산 서열 (1) 내지 (8)으로 구성된 군으로부터 선택되는 N-말단 아미노산 서열을 갖는 방법:
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