DE69731357T2

DE69731357T2 - Funktionelles antigenfragment von tetanustoxin und tetanusvakzine

Info

Publication number: DE69731357T2
Application number: DE69731357T
Authority: DE
Inventors: Morihiro Suita-shi MATSUDA
Original assignee: Research Foundation for Microbial Diseases of Osaka University BIKEN
Current assignee: Research Foundation for Microbial Diseases of Osaka University BIKEN
Priority date: 1996-03-23
Filing date: 1997-03-24
Publication date: 2006-02-02
Anticipated expiration: 2017-03-25
Also published as: JP4229341B2; EP0845270B1; EP0845270A1; WO1997035612A1; US6372225B1; CA2216425C; KR100266924B1; DE69731357D1; KR19990007784A; CA2216425A1; EP0845270A4

Description

Hintergrund der Erfindung
Technisches Fachgebiet
Die vorliegende Erfindung betrifft ein funktionales Antigenfragment des Tetanustoxins und einen Tetanusimpfstoff, der dasselbe umfasst. Insbesondere ist die vorliegende Erfindung mit einem spezifischem funktionalen Antigenfragment des Tetanustoxins befasst, welches äußerst nützlich als ein Antigen für einen Tetanusimpfstoff ist, da das funktionale Antigenfragment nicht nur dadurch vorteilhaft ist, dass es äußerst hervorragend bezüglich der Verringerung von Nebenwirkungen ist, wenn es als ein Antigen verwendet wird, verglichen mit dem gegenwärtigen Tetanusimpfstoff, der als ein Antigen ein vollständiges Tetanustoxin-Toxoid umfasst, aber auch dadurch, dass es eine Immunwirksamkeit hat, die im Wesentlichen der eines vollständigen Tetanustoxin-Toxoids gleich ist. Die vorliegende Erfindung ist auch befasst mit einem sehr sicheren und wirksamen Tetanusimpfstoff (Tetanus-Toxoid), umfassend das funktionale Antigenfragment des Tetanustoxins als einen wirksamen Bestandteil, einen kombinierten Impfstoff, umfassend den Tetanusimpfstoff und mindestens einen von dem Tetanusimpfstoff verschiedenen Impfstoff, und Verfahren zur Herstellung des Antigenfragments und der Impfstoffe.
Stand der Technik
Wie allgemein bekannt ist Tetanus eine Infektionskrankheit mit extrem hoher Sterblichkeit, welche ernsthafte Symptome hervorruft, z. B. Opisthotonus und Dyspnoe. Tetanusbazillen sind weit verbreitet in der Umwelt und ihre Sporen werden gewöhnlich im Boden und Tierfäkalien gefunden. Deshalb ist jedes Individuum der Gefahr einer Tetanusinfektion bei verschiedenen Arten von Verletzungen ausgesetzt, wie z. B. Stichwunden und Quetschwunden. Überdies können übliche Chemotherapien unter Verwendung von Antibiotika und Muskelrelaxantien die Sterblichkeit nicht stark ändern, wenn ein Individuum mit Tetanusbazillen infiziert ist, sei es, dass die Tetanuspatienten älter oder jung sind. In entwickelten Ländern ereigneten sich die meisten Todesfälle durch Tetanus kürzlich unter den älteren Patienten, die in ihrem Säuglingsalter einer Impfung gegen Tetanus entgangen sind.
Ferner ist die im Erwachsenenalter verbliebene Immunität zur Verhinderung einer Tetanusinfektion nicht ausreichend, wenn das Individuum unerwartet eine Verletzung bei Erdbeben, Bränden oder Verkehrsunfällen erleidet, sogar wenn ein Individuum im Säuglings- oder Kindesalter eine Tetanusimpfung zur basalen Immunisierung erhält und eine Auffrischung erhält. Deshalb ist es für über 40-jährige Erwachsene, insbesondere ältere Personen, wichtig, persönlich eine Auffrischungsinjektion zu erhalten, um den Schutz gegen Tetanus sicherzustellen.
In entwickelten Ländern haben eine Zunahme der Anzahl der Geburten von Kindern in Krankenhäusern und Verbesserungen bei Lebensumgebungen und Gesundheitspflege, eine Verbesserung bei der Qualität der medizinischen Notversorgung bezüglich der Bereitstellung von Toxoiden und Antitoxinen, und obligatorischen Impfungen für jüngere Leute, die Anzahl der Tetanuspatienten auf 1/30 dessen von vor einem halben Jahrhundert reduziert. Außerdem ist Tetanus eine nicht-epidemische Krankheit und wird nicht von Person zu Person übertragen. Deshalb wird die Wichtigkeit zur Vorbeugung vor dieser Krankheit gern übersehen. Jedoch wird, sogar heutzutage, die Anzahl der weltweiten Tetanustodesfälle auf etwa 1 Million pro Jahr geschätzt, einschließlich meist neonataler Tetanustodesfälle, welche in Entwicklungsländern vorherrschend sind. Aufgrund des weitverbreiteten Drogenmißbrauchs nimmt darüber hinaus die Anzahl der Tetanuspatienten, die durch kontaminierte Injektionsnadeln infiziert werden, kürzlich ebenfalls zu.
Unter diesen Umständen wird Tetanus jetzt als eine Krankheit wahrgenommen, die durch Impfung verhindert werden soll, anstatt behandelt zu werden, und Vorsorgemaßnahmen gegen Tetanus werden aktiv unternommen. Z. B. wird bei dem ausgedehnten Immunisierungsprogramm (EPI, Expanded Programm of Immunization) der Weltgesundheitsorganisation (WHO) die Impfung gegen Tetanus als eine der wichtigsten Aufgaben wahrgenommen, und das Impfprogramm wird gefördert. Die "International Conference on Tetanus", deren eines Ziel es ist, die Tetanuskrankheit auszumerzen, wird seit 1963 etwa alle 3 Jahre in verschiedenen Ländern abgehalten.
Wie aus dem Vorstehenden ersichtlich, ist Tetanus eine Krankheit, die durch ein ubiquitäres Bakterium verursacht wird, dessen Sporen unmöglich von der Erde ausgemerzt werden können, und es ist keine Übertreibung festzustellen, dass Impfung gegen Tetanus der einzige Weg ist, den Tod menschlicher Lebewesen aufgrund von Tetanus, unabhängig von Alter und Geschlecht, auf Null zu reduzieren, und dass die Impfung für alle menschlichen Lebewesen wesentlich ist, die auf der Erde geboren werden, nicht nur gegenwärtig sondern auch in der Zukunft.
Zur Verhinderung von Tetanus ist Tetanus-Toxoid als ein Impfstoff verwendet worden. Tetanus-Toxoid, das als ein wirksamer Bestandteil für den Tetanusimpfstoff verwendet wird, ist mit Formalin entgiftetes Tetanustoxin. Solch ein Tetanus-Toxoid ist verwendet worden, sowohl in reiner Form ohne ein Adjuvanz, oder in der Form einer präzipitierten Antigenpräparation, adsorbiert auf einer kleinen Menge eines Aluminiumsalzes als ein Adjuvanz, als auch in der Form einer kombinierten Antigenpräparation, hergestellt durch Mischen des Tetanus-Toxoids mit anderen Impfstoffen, wie z. B. Diphtherie-Toxoid, Pertussisimpfstoff und Haemophilus Influenzae b Impfstoff. Kindern wird Tetanus-Toxoid allgemein in der Form des sogenannten kombinierten DPT-Impfstoffs verabreicht, welches eine Mischung von Impfstoffen in adsorbierter Form aus Diphtherie (D), Tetanus (T) und Pertussis (P) ist. Für eine vorbeugende Tetanusbehandlung von verletzten Patienten wird ein reiner T-Toxoidimpfstoff oder ein kombinierter DT-Toxoidimpfstoff verwendet. Diese Toxoide werden weltweit weitverbreitet verwendet und die T-Toxoidpräparationen sind in der Welt als einer der wirksamsten und wichtigsten Impfstoffe geschätzt worden. Jedoch haben die gegenwärtigen Tetanus-Toxoidpräparationen verschiedene Probleme, die gelöst werden müssen. Z. B. hat das Tetanus-Toxoid dadurch Nachteile, dass es verschiedene nachteilige Nebenwirkungen gibt, dass die Produktqualität zwischen unterschiedlichen Herstellern ungleich ist, dass die Aufrechterhaltung der Immunität nur auf etwa 5 bis 10 Jahre begrenzt ist und deshalb wiederholte Impfungen notwendig sind, damit der Antitoxinlevel ausreicht, um Tetanusinfektion zu verhindern. Somit hat das übliche Tetanus-Toxoid Probleme, die bezüglich Sicherheit, Qualitätskontrolle, Aufrechterhaltung der Immunität, und Bequemlichkeit, Arbeitsersparnis und Wirtschaftlichkeit bei der Verabreichung gelöst werden müssen. Um die Verwendung des Tetanusimpfstoffs zu fördern, muß deshalb eine große Anzahl von Problemen gelöst werden, hauptsächlich unter dem Gesichtspunkt einer Massenproduktion eines qualitativ hochwertigen Tetanusimpfstoffs.
Nachfolgend wird der Stand der Technik im Zusammenhang mit der primären Aufgabe der vorliegenden Erfindung erörtert, welche es ist, ein Tetanustoxin-Antigen bereitzustellen, welches nicht nur äußerst hervorragend bezüglich der Verminderung von nachteiligen Nebenwirkungen ist, wenn es als ein Impfstoff verwendet wird, sondern auch eine hohe Immunwirksamkeit zeigt, und somit die vorstehenden den Stand der Technik begleitenden Probleme löst.
Verschiedene nachteilige Nebenwirkungen sind bekannt, die Verwendung von üblichen Tetanus-Toxoidimpfstoffen zu begleiten. Verschiedene nachteilige Nebenwirkungen, wie z. B. örtliche Reaktionen an Injektionsstellen (z. B. Hautrötung, Empfindlichkeit, Schwellung, Ödem und keimfreier Abszeß), systemisches Fieber; und, obwohl selten, Allergie (z. B. örtliche Anaphylaxie, anaphylaktischer Schock, Serumkrankheits-ähnliche Typ III Überempfindlichkeit und verzögerte Überempfindlichkeit) und ernsthafte allgemeine Reaktionen (z. B. peripherale Neuropathie, Lymphdrüsenerkrankung, Brachialplexus-Neuropathie, Guillain-Barret Syndrom und akute Querschnittsmyelitis) sind berichtet worden (siehe "Vaccine", 2. Ausgabe, herausgegeben von S. A. Plotkin und E. A. Mortimer, Seiten 75–77, W. B. Saunders Company, 1994; "Mandell, Douglas und Bennett's Principles and Practice of Infectious Diseases", 4. Auflage, herausgegeben von G. L. Mandell et al., Seite 2781, Churchill Livingstone & Son, Inc., 1995; Journal of the American Medical Association, 264 (18), Seite 2448, 1990 und 271 (20), Seite 1629, 1994; und Lancet, 339, Seiten 1111–1112, 02. Mai, 1992).
Verschiedene Versuche, diese nachteiligen Nebenwirkungen des Tetanus-Toxoidimpfstoffs zu reduzieren oder zu beseitigen, sind unternommen worden. Z. B. die Entwicklung eines Verfahrens, um hochreines Toxoid zu erhalten, die Verwendung modifizierter oder neuer Adjuvanzien, und die individuelle Verwendung der Fragmente A, B und C (welche Untereinheiten des Tetanustoxins sind und welche unten erklärt werden) als einen aktiven Bestandteil für einen Impfstoff sind vorgeschlagen worden. Von diesen Versuchen bezüglich der Verfahren zur Verwendung eines Tetanustoxinfragments als Beispiele für bei diesen Verfahren verwendete Tetanustoxinfragmente können genannt werden, das Fragment C, hergestellt durch Verdau des Tetanustoxins mit Trypsin und/oder Papain (siehe ungeprüfte veröffentlichte Japanische Patentanmeldungen Nrn. 50-71820, 51-82719 und 52-83928), Fragment A-B, hergestellt durch Verdau des Tetanustoxins mit Papain (siehe ungeprüfte veröffentlichte Japanische Patentanmeldung Nr. 53-26319), ein Antigen, erhalten durch Expression eines Gens, das für Fragment C in E. coli, Hefe oder Salmonella kodiert (siehe ungeprüfte veröffentlichte Japanische Patentanmeldung Nr. 3-285681, vor der Prüfung veröffentlichte Japanische Patentanmeldung (Kohyo) Nr. 4-506005, Internationale Anmeldungsveröffentlichungen Nrn. WO 90/15871 und WO 94/03615, und EP-A-0 209 281) und ein synthetisiertes Epitop von Fragment C (siehe Veröffentlichung der Internationalen Anmeldung Nr. WO 94/00484). Jedoch wurde keiner dieser üblichen Tetanustoxinfragmentimpfstoffe praktisch verwendet, weil alle von diesen Tetanustoxinfragmentimpfstoffen eine geringe Antigenität und Immunwirksamkeit haben, verglichen mit denen des üblichen Tetanus-Toxoids, umfassend das Toxoid des gesamten Tetanustoxinmoleküls. In der Zwischenzeit ist es gelungen, das Tetanustoxin-Gen zu klonieren, und sowohl die Nukleotidsequenz als auch die Aminosäuresequenz des Tetanustoxinmoleküls zu bestimmen [siehe EMBO Journal, 5 (10), 2495–2501, 1986 und Nucleic Acid Research, 14 (19), 7809–7812, 1986 (die gesamte Aminosäuresequenz des vollständigen Tetanustoxinmoleküls ist in SEQ ID NO. 1 gezeigt)]. Ferner werden, basierend auf der vorstehenden Information über die gesamte Nukletidsequenz und Aminosäuresequenz, Fragmente des Tetanustoxin-Gens exprimiert und synthetische Peptide werden als Teile des Tetanustoxinmoleküls hergestellt, und außerdem wurde die Bestimmung der Epitopbereiche des Tetanustoxins unter Verwendung der Expressionsprodukte der DNA-Fragmente des Gens und der synthetisierten Peptide versucht [siehe Infection and Immunity, 57 (11), 3498–3505, 1989 und Molecular Immunology, 31 (15), 1141–1148, 1994]. Tetanusimpfstoffe, umfassend solche Tetanustoxin-Epitope als aktive Bestandteile, wurden jedoch nicht erreicht.
Zusammenfassung der Erfindung
Der gegenwärtige Erfinder hat Tetanustoxin lange erforscht, bis heute seit mehr als 20 Jahren, seit den frühen 70er Jahren, als die Reinigung des Tetanustoxins zu einem hohen Maß nicht erreicht werden konnte und die detaillierte Struktur und die Eigenschaften des Tetanustoxinmoleküls unbekannt waren. Der gegenwärtige Erfinder studierte die Fähigkeit zur Toxinproduktion der Tetanusbazillen extensiv. Er hat ferner extensive und intensive Studien zur Entwicklung eines Tetanusimpfstoffantigens, welches äußerst hervorragend bezüglich der Verringerung von nachteiligen Nebeneffekten der üblichen Tetanusimpfstoffe ist, umfassend, als ein Antigen, das vollständige Tetanustoxin-Toxoid, aber auch eine Immunwirksamkeit hat, welche im Wesentlichen dieselbe wie die des vollständigen Tetanustoxin-Toxoids ist. Folglich hat er gefunden, dass ein spezifisches funktionales Antigenfragment (nachfolgend einfach als "FFA" bezeichnet), stammend aus Tetanustoxin, als ein Antigen für einen Tetanusimpfstoff wirksam ist, und äußerst hervorragend der Verringerung von nachteiligen Nebenwirkungen ist. Die vorliegende Erfindung wurde basierend auf den neuen Erkenntnissen vollendet.
Deshalb ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Tetanusantigen bereitzustellen, welches äußerst hervorragend bezüglich der Verringerung von nachteiligen Nebenwirkungen des üblichen vollständigen Tetanustoxin-Toxoids ist, aber auch eine Immunwirksamkeit hat, die im Wesentlichen der eines vollständigen Tetanustoxin-Toxoids gleich ist.
Es ist eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, einen Tetanusimpfstoff bereitzustellen, welcher äußerst hervorragend bezüglich der Verringerung von nachteiligen Nebenwirkungen der gegenwärtigen Impfstoffe ist und eine Immunwirksamkeit hat, welche im Wesentlichen der eines üblichen vollständigen Tetanus-Toxoidimpfstoffs gleich ist bereitzustellen.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren zur Herstellung des vorstehend erwähnten Tetanusimpfstoffs bereitzustellen.
Noch eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren zur Herstellung des vorstehend erwähnten funktionalen Antigenfragments (FFA) als einen Tetanusantigenimpfstoff bereitzustellen.
Die vorhergehenden und weitere Aufgaben, Eigenschaften und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden für den Fachmann aus der folgenden detaillierten Beschreibung und den angefügten Ansprüchen zusammen mit der begleitenden Sequenzliste und den Zeichnungen ersichtlich werden.
Kurze Beschreibung der Sequenzliste
SEQ ID NO. 1 ist eine Form der gesamten Aminosäuresequenz des vollständigen Tetanustoxinmoleküls, das in der vorliegenden Erfindung verwendet wird.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
In den begleitenden Zeichnungen:
1(a) ist eine diagrammartige Ansicht der Struktur des vollständigen Tetanustoxinmoleküls, das in der vorliegenden Erfindung verwendet wird;
1(b) ist eine diagrammartige Ansicht einer beschnittenen Form des vollständigen Tetanustoxinmoleküls;
1(c) zeigt ein dreiteiliges [A-B·C] Model des vollständigen Tetanustoxinmoleküls;
2(a) ist eine diagrammartige Ansicht, die eine Auswahl der N-terminalen Aminosäuresequenzen des funktionalen Tetanustoxinantigenfragments zeigt; und
2(b) ist eine diagrammartige Ansicht eines Strukturmodells des vollständigen Tetanustoxinmoleküls.
Beschreibung der Bezugszeichen

S -- S: Disulfidbrücke
*: Einschnitt
-----: nicht-kovalente Bindung

In dem Einbuchstabenwiedergabesystem zur Wiedergabe der Aminosäurereste einer Aminosäuresequenz geben die Buchstaben jeweils die folgenden Aminosäurereste wieder:
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein funktionales Antigenfragment des Tetanustoxins bereitgestellt, das mindestens ein Fragment umfasst, welches das gleiche ist, wie jenes, das durch ein Verfahren erhältlich ist, das die Schritte umfasst: Spalten von mindestens einer Peptidbindung, ausgewählt aus Peptidbindungen, die einzeln gegenseitig benachbarte Aminosäurereste in einer Aminosäureteilsequenz zwischen zwei Cysteinresten, die an der Bildung einer Disulfidbrücke beteiligt sind, die am N-Terminus der gesamten Aminosäuresequenz eines vollständigen Tetanustoxinmoleküls vorhanden ist, verbinden, Spalten der Disulfidbrücke und Spalten von nicht-kovalenten Bindungen [wie in 2(b) angegeben] zwischen Gruppen auf dem Tetanustoxinmolekül;
wobei das funktionale Antigenfragment des Tetanustoxins aufweist:

(a) ein Molekulargewicht von von 90.000 bis 110.000, wie durch ein SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese-Verfahren gemessen;
(b) einen isoelektrischen Punkt von 7,25 ± 0,5, wie durch ein isoleketrisches Fokusierungsverfahren gemessen; und
(c) eine Immunwirksamkeit, die der eines vollständigen Tetanustoxin-Toxoids gleich ist.

Zum einfachen Verständnis der vorliegenden Erfindung werden die wesentlichen Eigenschaften und verschiedenen bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung nachfolgend aufgezählt.

1. Ein funktionales Antigenfragment des Tetanustoxins, das mindestens ein Fragment umfasst, welches das gleiche ist, wie jenes, das durch ein Verfahren erhältlich ist, das die Schritte umfasst: Spalten von mindestens einer Peptidbindung, ausgewählt aus Peptidbindungen, die einzeln gegenseitig benachbarte Aminosäurerest in einer Aminosäureteilsequenz zwischen zwei Cysteinresten, die an der Bildung einer Disulfidbrücke beteiligt sind, die am N-Terminus der gesamten Aminosäuresequenz des gesamten Tetanustoxinmoleküls, gezeigt in SEQ ID NO: 1, vorhanden ist, verbinden, Spalten der Disulfidbrücke und Spalten von nicht-kovalenten Bindungen zwischen Gruppen auf dem Tetanustoxinmolekül; wobei das funktionale Antigenfragment des Tetanustoxins aufweist:
(a) ein Molekulargewicht von von 90.000 bis 100.000, wie durch ein SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese-Verfahren gemessen;
(b) einen isoelektrischen Punkt von 7,25 ± 0,5, wie durch ein isoleketrisches Fokusierungsverfahren gemessen; und
(c) eine Immunwirksamkeit, die im Wesentlichen der eines vollständigen Tetanustoxin-Toxoids gleich ist, wobei jedes des mindestens einen Fragments unabhängig eine N-terminale Aminosäuresequenz aufweist, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus den folgenden Aminosäuresequenzen (1) bis (8): (1) KIIPPTNIRENLYNRTASLTDLGGELCIK, (SEQ ID NO. 2) (2) IIPPTNIRENLYNRTASLTDLGGELCIK, (SEQ ID NO. 3) (3) ENLYNRTASLTDLGGELCIK, (SEQ ID NO. 4) (4) NLYNRTASLTDLGGELCIK, (SEQ ID NO. 5) (5) NRTASLTDLGGELCIK, (SEQ ID NO. 6) (6) TASLTDLGGELCIK, (SEQ ID NO. 7) (7) SLTDLGGELCIK, (SEQ ID NO. 8) und (8) GGELCIK, (SEQ ID NO. 9).
2. Das funktionale Antigenfragment des Tetanustoxin gemäß Punkt 1 oben, welches mit einem Fixiermittel stabilisiert ist.
3. Einen Tetanusimpfstoff, umfassend, als einen wirksamen Bestandteil, das funktionale Antigenfragment des Tetanustoxins gemäß einem der Punkte 1 oder 2 oben in einer immunogen wirksamen Menge.
4. Einen kombinierten Impfstoff, umfassend, als einen von einer Vielzahl von wirksamen Bestandteilen, das funktionale Antigenfragment des Tetanustoxins gemäß einem der Punkte 1 oder 2 oben in einer immunogen wirksamen Menge.
5. Ein Verfahren zur Herstellung eines Tetanusimpfstoffes, welches das Stabilisieren eines funktionalen Antigenfragments des Tetanustoxins mit einem Fixiermittel umfasst, wobei das funktionale Antigenfragment des Tetanustoxins mindestens ein Fragment umfasst, welches im Wesentlichen das gleiche ist, wie jenes, das durch ein Verfahren erhältlich ist, umfassend die Schritte des Sammelns und Reinigens eines extrazellulären Tetanustoxins aus einem Kulturfiltrat von Clostridium tetani, um ein extrazelluläres Tetanustoxinmolekül zu erhalten, Spalten einer Disulfidbrücke, die am N-Terminus der gesamten Aminosäuresequenz des extrazellulären Tetanustoxinmoleküls vorhanden ist, und Spalten von nicht-kovalenten Bindungen zwischen Gruppen auf dem extrazellulären Tetanustoxinmolekül; wobei das funktionale Antigenfragment des Tetanustoxins aufweist:
(a) ein Molekulargewicht von von 90.000 bis 110.000, wie durch ein SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese-Verfahren gemessen;
(b) einen isoelektrischen Punkt von 7,25 ± 0,5, wie durch ein isoleketrisches Fokusierungsverfahren gemessen; und
(c) eine Immunwirksamkeit, die der eines vollständigen Tetanustoxin-Toxoids gleich ist, wobei jedes des mindestens einen Fragments unabhängig eine N-terminale Aminosäuresequenz aufweist, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 und SEQ ID NO: 9.
6. Ein Verfahren zur Herstellung eines funktionalen Antigenfragments des Tetanustoxins, umfassend: Ligation einer DNA, die für das funktionale Antigenfragment des Tetanustoxins gemäß Punkt 1 oder 2 oben kodiert, mit einem Vektor; Transformation einer Bakterienzelle, außer Clostridium tetani, oder einer Hefezelle mit dem Vektor; und Expression der DNA, die für das funktionale Antigenfragment des Tetanustoxins kodiert.

Nachfolgend wird die vorliegende Erfindung im Detail beschrieben.
Bei der vorliegenden Erfindung bezeichnet Ala einen Alaninrest, Arg einen Argininrest, Asn einen Asparaginrest, Asp Asparaginsäurerest, Cys einen Cysteinrest, Gln einen Glutaminrest, Glu einen Glutaminsäurerest, Gly einen Glycinrest, His einen Histidinrest, Ile einen Isoleucinrest, Leu einen Leucinrest, Lys einen Lysinrest, Met einen Methioninrest, Phe einen Phenylalaninrest, Pro einen Prolinrest, Ser einen Serinrest, Thr einen Threoninrest, Trp einen Tryptophanrest, Tyr einen Tyrosinrest und Val einen Valinrest.
Wie oben erwähnt umfasst das funktionale Antigenfragment des Tetanustoxins der vorliegenden Erfindung mindestens ein Fragment, welches im Wesentlichen das gleiche ist, wie jenes, erhalten durch ein Verfahren, umfassend die Schritte: Spalten von mindestens einer Peptidbindung, ausgewählt aus Peptidbindungen, die einzeln gegenseitig benachbarte Aminosäurereste in einer Aminosäureteilsequenz zwischen zwei Cysteinresten, die an der Bildung einer Disulfidbrücke beteiligt sind, die am N-Terminus der gesamten Aminosäuresequenz eines vollständigen Tetanustoxinmoleküls, gezeigt in SEQ ID NO: 1, vorhanden ist, verbinden, Spalten der Disulfidbrücke und Spalten von nicht-kovalenten Bindungen [wie in 2(b) angegeben] zwischen Gruppen auf dem Tetanustoxinmolekül.
Als eine bevorzugte Ausführungsform des funktionalen Antigenfragments des Tetanustoxins der vorliegenden Erfindung kann das funktionale Antigenfragment des Tetanustoxins erwähnt werden, wobei jedes oben erwähnte mindestens eine Fragment unabhängig eine N-terminale Aminosäuresequenz aufweist, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus den folgenden Aminosäuresequenzen (1) bis (8):
(1) KIIPPTNIRENLYNRTASLTDLGGELCIK, (SEQ ID NO. 2)
(2) IIPPTNIRENLYNRTASLTDLGGELCIK, (SEQ ID NO. 3)
(3) ENLYNRTASLTDLGGELCIK, (SEQ ID NO. 4)
(4) NLYNRTASLTDLGGELCIK, (SEQ ID NO. 5)
(5) NRTASLTDLGGELCIK, (SEQ ID NO. 6)
(6) TASLTDLGGELCIK, (SEQ ID NO. 7)
(7) SLTDLGGELCIK, (SEQ ID NO. 8) und
(8) GGELCIK, (SEQ ID NO. 9).
Ferner kann das funktionale Antigenfragment des Tetanustoxins der vorliegenden Erfindung mit einem Fixiermittel stabilisiert sein.
Für eine weitere Klarstellung der wesentlichen Merkmale der vorliegenden Erfindung werden die technischen Merkmale der vorliegenden Erfindung beschrieben werden, indem die Entwicklung der vorliegenden Erfindung erklärt wird.
Isolierung eines Stammes von Clostridium tetani mit hoher Toxin-Produktionsfähigkeit
In der vorliegenden Erfindung wird ein Stamm von Clostridium tetani mit hoher Toxin-Produktionsfähigkeit verwendet. Der gegenwärtige Erfinder isolierte einen Unterstamm mit hoher Toxin-Produktionsfähigkeit durch Einzelkolonieisolierung aus dem Stamm Harvard H47, der ein bekannter C. tetani Stamm, stammend aus einem bekannten C. tetani Stamm, genannt der Harvard-Stamm [ATCC (American Type Culture Collection) Zugangs-Nr. 10779], ist, und er benannte den erhaltenen Unterstamm als "Clostridium tetani Stamm Harvard H47 Biken Unterstamm" (nachfolgend einfach als "Biken Unterstamm" bezeichnet"). Auch fand der gegenwärtige Erfinder, dass die Produktion des Tetanustoxins unter der Kontrolle von genetischer Information ist, die in der C. tetani Zelle von der Plasmid-DNA getragen wird (Biken Journal, 20, 105–115, 1977). Ferner war der gegenwärtige Erfinder erfolgreich bei der Massenproduktion des Tetanustoxins durch Kultivierung des Biken Unterstamms, indem er das auf der vorstehenden Feststellung basierende Kultivierungsverfahren verwendete, und bei der hohen Reinigung des Tetanustoxins.
Somit ist es bei der vorliegenden Erfindung zuerst notwendig, dass ein Stamm von Clostridium tetani mit hoher Toxin-Produktionsfähigkeit ausgewählt wird und als eine Zuchtkultur verwendet wird. Eine Zuchtkultur kann eine Kultur eines transformierten Mikroorganismus, wie z. B. Hefe, Escherichia coli oder Bacillus subtilis, der durch gentechnische Verfahren unter Verwendung der unten erwähnten für FFA kodierenden DNA erhalten wird, verwendet werden.
Art der Bildung von und toxische Aktivität von Tetanustoxin
In den C. tetani Zellen wird Tetanustoxin zuerst in der Form einer einzelnen Polypeptidkette (vollständiges Tetanustoxinmolekül in einer nicht-unterbrochenen intakten Form) mit einem Molekulargewicht von etwa 150.000 (nachfolgend häufig als "intrazelluläres Toxin" bezeichnet) produziert. Durch die Autolyse der Zelle wird das Tetanustoxin nachfolgend aus den Zellen in das extrazelluläre Medium (nachfolgend wird das in das extrazelluläre Medium freigesetzte Toxin häufig als "extrazelluläres Toxin" bezeichnet) freigesetzt. Wenn das Toxin aus den Zellen freigesetzt wird, wird mindestens eine Bindung in den Peptidbindungen, die gegenseitig benachbarter Aminosäurerest in der Aminosäureteilsequenz zwischen zwei Cysteinresten, die an der Bildung einer Disulfidbrücke beteiligt sind, die am N-Terminus der gesamten Aminosäuresequenz des vollständigen Tetanustoxinmoleküls vorhanden ist, durch eine Protease, hergestellt durch C. tetani, gespalten, um dadurch mindestens zwei Polypeptidketten zu bilden. Jedoch sind die zwei Polypeptidketten durch die am N-Terminus des vollständigen Tetanustoxinmoleküls vorhandene Disulfidbrücke miteinander vereinigt, d. h. diese Polypeptidketten nehmen eine unterbrochene (nicked) Form an [siehe 1(a) und 1(b); Biochemical and Biophysical Research Communications, 57, 1257–1262, 1974; ibid. 68, 668–674, 1976; ibid. 77, 268–274, 1977], und ferner sind die zwei Polypeptidketten auch miteinander durch nicht-kovalente Bindungen [siehe 2(b)] vereinigt. Die Umwandlung des Tetanustoxinmoleküls aus der intakten Form in die unterbrochene Form verstärkt die Toxinaktivität des Tetanustoxins vielfach, und die Unterbrechung ist wesentlich für das Auslösen der toxischen Wirkung. Um Arbeit bei der Herstellung des funktionalen Antigenfragments zu sparen ist es deshalb bevorzugt, das extrazelluläre Tetanustoxin als ein Ausgangsmaterial zu verwenden, welches bereits in die unterbrochene Form umgewandelt worden ist [siehe 1(b)].
Untereinheitstruktur des Tetanustoxins und der Mechanismus der Manifestation der Toxizität des Tetanustoxins
Als ein Ergebnis der einzigartigen Untersuchungen des gegenwärtigen Erfinders wurden zwei funktionale komplementäre Polypeptidketten, nämlich L (leichte) Kette und H (schwere) Kette aus dem vollständigen Tetanustoxinmolekül erhalten. D. h. der gegenwärtige Erfinder war erfolgreich bei der Isolierung und Reinigung dieser Fragmente (L- und H-Ketten), um dadurch die einzelne L-Kette und H-Kette zu erhalten, welche natürlich genug sind, um fähig zu sein, die Toxinaktivität des vollständigen Tetanustoxinmoleküls zu reproduzieren, wenn diese L- und H-Ketten in dem vollständigen Tetanustoxinmolekül wieder hergestellt werden, obwohl jede der individuell erhaltenen L-Kette und H-Kette nicht toxisch ist.
Darüber hinaus isolierte und reinigte der gegenwärtige Erfinder auch die folgenden drei Fragmente erfolgreich: Die C-terminale Hälfte der H-Kette (Fragment C), ein Fragment (Fragment A-B), erhalten durch entfernen des Fragmentes C aus dem vollständigen Tetanustoxinmolekül, und ein Fragment (Fragment B), erhalten durch Abtrennen des Fragmentes A (d. h. L-Kette) aus dem gereinigten Fragment A-B.
Ferner untersuchte der gegenwärtige Erfinder nach der Herstellung des vollständigen Tetanustoxinmoleküls und der oben erwähnten Fragmente A, B, C, A-B und B-C, d. h. aller drei Untereinheiten des Tetanustoxins und der Komplexe der benachbarten Untereinheiten, die Unterschiede der Funktionen dieser Fragmente, und die Beziehung zwischen der Untereinheitstruktur des Tetanustoxins und des Mechanismus der toxischen Wirkung des Tetanustoxins und schlug ein "dreigeteiltes [A-B·C] Molekülmodell" [siehe 1(c); Biken Journal, 26, 133–143; 1983 und "Botulinum Neurotoxin and Tetanus toxin", herausgegeben von L. L. Simpson, Seiten 69–92 (Kapitel 4), Academic Press, 1989] vor.
Dieses dreigeteilte molekulare Modell wurde als das geeignetste molekulare Model des Tetanustoxins bei der 8. Internationalen Konferenz über Tetanus (1988) akzeptiert. Gemäß dem dreiteiligen [A-B·C] Modell hat Fragment C die Rolle, das Tetanustoxinmolekül zum Zentralnervensystem zu tragen (Buchstabe "C" bedeutet "Träger"), Fragment B hat die Rolle, das Tetanustoxinmolekül an die präsynaptische Membran der Nervenzelle zu binden und die Rolle das Tetanustoxinmolekül in das Cytoplasma zu transportieren (Buchstabe "B" bedeutet "Bindung"), und Fragment A hat die Rolle, die auf der enzymatischen Aktivität basierende toxische Aktivität zu zeigen (Buchstabe "A" bedeutet "Aktiv") (siehe "8. Internationale Konferenz über Tetanus", herausgegeben von G. Nistco et al., S. 170–171, Phythagora Press, Rom-Mailand, 1989; Infection and Immunity, 57, 3588–3593, 1989; Toxicon, 27, 385–392, 1989; ibid. 28, 737–741, 1990).
Vielfalt der Fragmente des Tetanustoxins
Bis 1989 bestand unter Forschern in der Welt weder Einigkeit über die Länge, das Molekulargewicht noch die Nomenklatur von jedem der Fragmente des Tetanustoxins, und diese Situation bereitete Schwierigkeiten beim Informationsaustausch und Diskussionen über die Struktur-Funktionsbeziehung der Untereinheiten des Tetanustoxins zwischen Forschern. Deshalb war es erwünscht, eine gemeinsame Basis für die Untersuchung an Tetanustoxin durch Verwendung einheitlicher Definitionen und Fragmentmodelle zu etablieren.
In solch einer Situation schlug der gegenwärtige Erfinder das oben erwähnte dreiteilige molekulare Modell zum erstenmal vor. D. h. der gegenwärtige Erfinder wies auf die Nachteile des Fehlens der Einigkeit über die Längen, Molekulargewichte und Nomenklaturen der Tetanustoxinfragmente hin, und der gegenwärtige Erfinder betonte die Notwendigkeit einheitlicher Definitionen für die Fragmente und schlug die obigen Modelle vor [siehe das vorstehend erwähnte "Botulinum Neurotoxin und Tetanus Toxin", herausgegeben von L. L. Simpson, S. 69–92 (Kapitel 4)].
Es wird angenommen, dass der Grund, warum eine Vielfalt von Fragmenten aus dem vollständigen Tetanustoxinmolekül erhalten werden, nicht nur an den genetischen Unterschieden der von unterschiedlichen Forschern verwendeten C. tetani Anzuchtstämme liegt, sondern auch darin, dass es feine Unterschiede bei den verschiedenen Arbeitsbedingungen gibt, die von Forschern zum Erhalten des Tetanustoxins und Fragmenten desselben verwendet werden, wie z. B. die Kultivierungsbedingungen für den Anzuchtstamm, die Autolysebedingungen für die kultivierten Zellen, um das extrazelluläre Toxin, welches bereits in eine unterbrochene Form umgewandelt wurde, zu erhalten, und die Behandlungsbedingungen für ein extrahiertes zelluläres Toxin, d. h. die Bedingungen zum Verdau des extrahierten intrazellulären Toxins durch eine Protease in eine unterbrochene Form, und die Behandlungsbedingungen des extrahierten extrazellulären Toxins mit einem Reduzierungsmittel, einem Denaturierungsmittel oder einem Solubilisierungsmittel, wobei Beispiele für Bedingungen zur Behandlung des extrahierten intrazellulären Toxins umfassen: die Enzymarten und Reagenzien, die Behandlungstemperatur, die Behandlungszeit, die Konzentration des Enzyms oder Reagenz, den pH der Behandlungslösung und die physikalischen Bedingungen für die Behandlung des extrahierten Toxins, d. h. Rühren oder Schütteln, oder es in einem stationären Zustand halten.
Definition von "FFA" der vorliegenden Erfindung
Das funktionale Antigenfragment (FFA) der vorliegenden Erfindung ist ein funktionales Antigenfragment des Tetanustoxins, das mindestens ein Fragment umfasst, welches im Wesentlichen das gleiche ist, wie jenes, das durch ein Verfahren erhalten wird, das die Schritte umfasst: Spalten von mindestens einer Peptidbindung, ausgewählt aus Peptidbindungen, die einzeln gegenseitig benachbarte Aminosäurereste in einer Aminosäureteilsequenz zwischen zwei Cysteinresten, die an der Bildung einer Disulfidbrücke beteiligt sind, die am N-Terminus der gesamten Aminosäuresequenz eines vollständigen Tetanustoxinmoleküls vorhanden ist, Verbinden, Spalten der Disulfidbrücke und Spalten von nicht-kovalenten Bindungen [wie angegeben in 2(b)] zwischen Gruppen auf dem Tetanustoxinmolekül;
wobei das funktionale Antigenfragment des Tetanustoxins aufweist:

(a) ein Molekulargewicht von von 90.000 bis 110.000, wie durch ein SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese-Verfahren gemessen;
(b) einen isoelektrischen Punkt von 7,25 ± 0,5, wie durch ein isoleketrisches Fokusierungsverfahren gemessen; und
(c) eine Immunwirksamkeit, die der eines vollständigen Tetanustoxinmoleküls gleich ist.

Als ein Ergebnis der Forschung durch den gegenwärtigen Erfinder wurde gefunden, dass verschiedene Typen von N-terminalen Aminosäuresequenzen von FFA erhalten werden können [siehe 2(a)]. Bei der vorliegenden Erfindung ist es bevorzugt, dass das funktionale Antigenfragment des Tetanustoxins eine N-terminale Aminosäuresequenz aufweist, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus den acht in 2(a) gezeigten Aminosäuresequenzen. Ferner hat das funktionale Antigenfragment des Tetanustoxins (FFA) der vorliegenden Erfindung eine Immunwirksamkeit, die im Wesentlichen die gleiche ist, wie jene des vollständigen Tetanustoxin-Toxoids. Darüber hinaus ist das funktionale Antigenfragment des Tetanustoxins (FFA) der vorliegenden Erfindung äußerst hervorragend bezüglich der Verminderung von ungünstigen Nebenwirkungen, verglichen mit herkömmlichen vollständigen Tetanustoxin-Toxoiden. Der Ausdruck "Immunwirksamkeit" bedeutet die Fähigkeit, das Auftreten von Tetanussymptomen zu verhindern. Bei der vorliegenden Erfindung bedeutet der Ausdruck "mit einer Immunwirksamkeit, welche im Wesentlichen die gleiche ist, wie die des Toxoids des vollständigen Tetanustoxinmoleküls", dass das FFA eine relative Wirksamkeit (Verhältnis der Wirksamkeit von FFA bezogen auf die Wirksamkeit des vollständigen Tetanustoxin-Toxoids) von 1 ± 0,2 zeigt, wie durch ein Verfahren gemessen, in welchem ein Impfstoff, enthaltend FFA, und ein Impfstoff, enthaltend das vollständige Tetanustoxin-Toxoid, hergestellt durch das in Referenzbeispiel 14 beschriebene Verfahren, der Messung der Immunwirksamkeit durch den Parallelleitungsassay unter Verwendung des vollständigen Toxin-Toxoids einer bekannten internationalen Wirkungseinheit als eine Referenz und unter Verwendung eines Herausforderungstoxins mit einem bekannten LD₅₀ (mittlere letale Dosis), beschrieben in Beispiel 1(5) unterzogen werden. Die Ergebnisse werden durch das in Referenzbeispiel 15 beschriebene Zählverfahren analysiert.
Somit stellt die vorliegende Erfindung auch einen Einzelantigen-Tetanusimpfstoff bereit, umfassend FFA als einen aktiven Bestandteil, wie z. B. eine reine Präparation, eine adsorbierte Präparation oder eine lyophilisierte Präparation, und einen kombinierten Impfstoff, umfassend FFA als eine von einer Mehrzahl von aktiven Bestandteilen, wie z. B. einen DPT kombinierten Impfstoff, einen DT kombinierten Impfstoff oder einen kombinierten Impfstoff, umfassend FFA und mindestens einen Antigenimpfstoff, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus anderen Antigenimpfstoffen als FFA, wie z. B. Influenza B Antigenimpfstoff, inaktivierten Poliomyelitis Antigenimpfstoff, inaktivierten Hepatitis B Antigenimpfstoff und inaktivierten Japanische Encephalitis Antigenimpfstoff, und ein Verfahren zur Herstellung der oben erwähnten Impfstoffe in großen Mengen.
Nachfolgend wird die Herstellung des FFA der vorliegenden Erfindung, die Präparation eines Impfstoffs unter Verwendung des hergestellten FFA und die Tests zur Evaluation des hergestellten Impfstoffs erklärt.
(1) Anzuchtmikroorganismen
Bezüglich des Mikroorganismus, der als eine Anzuchtkultur zum Erhalten des funktionalen Antigenfragments (FFA) der vorliegenden Erfindung verwendet wird, gibt es keine bestimmte Einschränkung solange der Mikroorganismus hohe Toxin-Produktionsfähigkeit hat. Beispiele von solchen Mikroorganismen umfassen den Unterstamm des Clostridium tetani Harvard Stamms, und andere C. tetani Stämme mit im Wesentlichen derselben oder einer höheren Produktionsfähigkeit für Tetanustoxin, wie oder als der des Harvard Stamms. Insbesondere ist es z. B. bevorzugt, den Biken Unterstamm mit hoher Toxin-Produktionsfähigkeit zu verwenden (Referenzbeispiel 1), erhalten durch eine Einzelkolonieisolierung aus dem Harvard Stamm H47, welcher ein bekannter C. tetani Stamm, stammend aus dem Harvard Stamm [hinterlegt mit ATCC (American Type Culture Collection) unter der Zugangsnr. 10779], ist.
Ferner kann als ein Anzuchtmikroorganismus auch ein transformierter Mikroorganismus verwendet werden, erhalten durch ein Verfahren, in welchem ein Mikroorganismus, wie z. B. Hefe oder Eschericheria coli, Bacillus subtilis, mit einem Gen transformiert wird, das für FFA kodiert, indem gentechnischen Verfahren verwendet werden. Insbesondere kann z. B. als ein Anzuchtmikroorganismus Eschericheria coli, transformiert mit einer großen Menge eines Expressionsvektors mit einer DNA, kodierend für FFA, funktional daran ligiert, wobei transformiertes E. coli gemäß dem in Referenzbeispiel 2 beschriebenen Verfahren, unten erwähnt, erhalten wird.
(2) Medium
Übliche Medien können für die Kultivierung des Anzuchtorganismus zum Erhalten von FFA verwendet werden. Z. B. kann ein übliches Flüssigmedium zur Kultivierung eines anaeroben Mikroorganismus für die Kultivierung der oben erwähnten Anzuchtmikroorganismen verwendet werden. Beispiele für solche Flüssigmedien umfassen gekochtes Fleischmedium, PYG (Pepton, Hefeextrakt, Glukose) Medium, GAM (Gifu anaerobes Medium) Nährlösung, Kalbinfusionsmedium, Thioglycolatmedium, Leber-Leber Nährlösung, RCM (verstärktes Clostridiummedium) Nährlösung und DRCM (differentielles verstärktes Clostridiummedium) Nährlösung. Um die Wachstumseigenschaften der Mikroorganismen und/oder die Aufrechterhaltung des niedrigen Oxidations-Reduktionspotentials zu verbessern, kann, falls gewünscht, ein Medium modifiziert werden durch Austausch, Zusatz oder Entfernung von Bestandteilen desselben, oder durch verändern der Menge der Bestandteile desselben. Unter diesen Medien ist Leber-Leber Nährlösung für die Verwendung bei der Herstellung einer Anzuchtkultur bevorzugt, und ein modifiziertes Lathammedium, entworfen von dem gegenwärtigen Erfinder (Referenzbeispiel 3), ist bevorzugt für die Verwendung bei der Produktion von Tetanustoxin aus der Anzuchtkultur.
(3) Kulturbedingungen
Bezüglich der Bedingungen zur Kultivierung des Anzuchtmikroorganismus zum Erhalten von FFA gibt es keine bestimmte Beschränkung. Z. B. wird ein Stamm von C. tetani mit hoher Toxin-Produktionsfähigkeit unter Kulturbedingungen kultiviert, in welchen die Inkubationstemperatur von etwa 30 bis etwa 37°C ist, bevorzugt von etwa 34 bis etwa 36°C, und die Inkubationszeit von etwa 1 bis etwa 8 Tagen ist, insbesondere von etwa 1 bis etwa 2 Tagen zum Extrahieren des intrazellulären Toxins, und insbesondere von etwa 4 bis etwa 7 Tagen zum Ernten des extrazellulären Toxins.
(4) Ausgangsmaterialien für die Herstellung von FFA
Bei der vorliegenden Erfindung wird FFA hergestellt unter Verwendung des vollständigen Tetanustoxinmoleküls, erhalten aus Zellen, kultiviert wie oben beschrieben. Beispiele für Ausgangsmaterialen für die Herstellung von FFA umfassen einen Zellextrakt (enthaltend ein intrazelluläres Tetanustoxin) der Mikroorganismen, kultiviert wie oben beschrieben, und einen Kulturüberstand oder ein Kulturfiltrat (jeweils enthaltend ein extrazelluläres Tetanustoxin in einer unterbrochenen Form), erhalten durch ein Verfahren, in welchem den kultivierten Zellen gestattet wird, sich der Autolyse zu unterziehen, und die nicht-lysierten Zellen und die Zelltrümmer, enthalten in dem resultierenden Autolyseprodukt, werden durch Zentrifugation oder Filtration entfernt. Wenn es gewünscht ist, FFA aus intrazellulärem Tetanustoxin herzustellen, ist es notwendig, das intrazelluläre Tetanustoxin mit einer Protease, wie z. B. Trypsin oder Chymotrypsin, zu spalten, um dadurch das intrazelluläre Tetanustoxin in eine unterbrochene Form umzuwandeln. Um Arbeit im Herstellungsprozeß zu sparen und eine hohe Ausbeute zu erreichen, ist es deshalb bevorzugt, als ein Ausgangsmaterial einen Kulturüberstand oder ein Kulturfiltrat, jeweils enthaltend ein extrazelluläres Tetanustoxin in einer unterbrochenen Form, zu verwenden.
(5) Vorläufige Reinigung des Tetanustoxins
Das vollständige Tetanustoxinmolekül aus dem Ausgangsmaterial kann grob durch übliche Verfahren gereinigt werden. Beispiele für solche üblichen Verfahren umfassen das Aussalzen durch Verwendung von Ammoniumsulfat, Alkohol-Präzipitation, Adsorption auf und Desorption von einem Gel, und Ultrafiltration unter Verwendung von kommerziell erhältlichen Membranen. Bei der vorliegenden Erfindung wird das vollständige Tetanustoxinmolekül, erhalten durch diese vorläufigen Reinigungsverfahren, als "partiell gereinigtes vollständiges Tetanustoxin" bezeichnet.
(6) Hochreinigung von Tetanustoxin
Das partiell gereinigte vollständige Tetanustoxin, erhalten durch das in Punkt (5) oben beschriebene Verfahren, kann hoch gereinigt werden, durch, z. B. ein Verfahren, das sowohl Dichtegradienten-Ultrazentrifugation als auch Gleichgewichtsdichtegradienten-Ultrazentrifugation verwendet (siehe ungeprüfte Japanische Patentanmeldung, offengelegte Beschreibung Nr. 07-89951), oder ein Verfahren, das eine geeignete Kombination üblicher Verfahren verwendet, wie z. B. Ultrazentrifugation, Gelfiltration, Ionenaustauschchromatographie und Hochleistungschromotographie. Bei der vorliegenden Erfindung kann ein hochreines vollständiges Tetanustoxinmolekül, erhalten durch diese Reinigungsverfahren (nachfolgend häufig einfach als "hochreines Tetanustoxin" bezeichnet), als ein Material für die Herstellung von FFA der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Das hochreine Tetanustoxin muß bezüglich seiner Eignung zur Verwendung als vollständiges Tetanustoxinmolekül bestätigt werden. Die Bestätigung der Eignung kann z. B. durch Bestimmen der MLD (minimale letale Dosis; Referenzbeispiel 4), der Lf-Einheit (Einheit der Ausflockung; Referenzbeispiel 5), oder dem Proteingehalt (Referenzbeispiel 6) durchgeführt werden.
(7) Herstellung von FFA
Bei der vorliegenden Erfindung wird FFA aus dem oben erwähnten hochreinen Tetanustoxin hergestellt. Wenn das hochreine Tetanustoxin, das für die Herstellung von FFA verwendet wird, aus intrazellulärem Tetanustoxin hergestellt wird, ist es zuerst notwendig, das intrazelluläre Tetanustoxin mit einer Protease, wie z. B. Trypsin oder Chymotrypsin, mild zu verdauen oder zu spalten, um das Toxin in eine unterbrochene Form umzuwandeln. Zwei funktionell komplementäre Fragmente des Tetanustoxins können hergestellt werden durch ein Verfahren, umfassend die Schritte: Spalten einer Disulfidbrücke, vorhanden am N-Terminus des gereinigten Tetanustoxins in der unterbrochenen Form, durch ein Reduzierungsmittel, und Spalten von nicht-kovalenten Bindungen zwischen Gruppen auf dem Tetanustoxinmolekül durch ein Denaturierungsmittel. Beispiele für Reduzierungsmittel umfassen übliche Reduzierungsmittel, wie z. B. Natriumthioglycolat, Dithiothreitol (nachfolgend einfach als "DTT" bezeichnet), Glutathion, Mercaptoethanol, Hydrogensulfid, Natriumborhydrid, Natriumsulfid und Ammoniumsulfid. Als Denaturierungsmittel können übliche Denaturierungsmittel verwendet werden. Beispiele für diese Mittel umfassen Guanidinthiocyanat, Guanidinhydrochlorid, Harnstoff und Natriumdodecylsulfat. Bei der vorliegenden Erfindung werden DTT und Harnstoff bevorzugt. Bezüglich einer bevorzugten Weise der Verwendung von DTT, z. B., die Endkonzentration von DTT in einer Lösung, enthaltend das Toxinprotein in einer Menge von etwa 1 bis 10 mg/ml ist allgemein in dem Bereich von 10 bis 200 mM, vorzugsweise von 50 bis 150 mM, und die Reaktion wird bei 15 bis 35°C für 20 bis 180 Minuten ausgeführt. Bezüglich einer bevorzugten Weise der Verwendung von Harnstoff, z. B., die Endkonzentration von Harnstoff in einer Lösung, enthaltend das Toxinprotein in einer Menge von etwa 1 bis etwa 10 mg/ml ist allgemein in dem Bereich von 0,5 bis 10 M, vorzugsweise von 1 bis 5 M, und die Reaktion wird bei 5 bis 35°C für 10 Sekunden bis 15 Minuten ausgeführt. Jedes von diesen Reagenzien wird zu dem Ausgangsmaterial zugegeben, so dass die Konzentration des Reagenz in den jeweiligen oben erwähnten Konzentrationsbereich fällt. In der vorliegenden Erfindung wird DTT in der Form einer Lösung (siehe Referenzbeispiel 8; nachfolgend wird diese Lösung als "DTT Tris-Puffer" bezeichnet) verwendet, und die Lösung wird zu dem Ausgangsmaterial in einer Menge von etwa dem 5 bis etwa 50-fachen Volumen der Menge des Ausgangsmaterials zugegeben, um DTT mit Tetanustoxin umzusetzen. Harnstoff wird in der Form einer gesättigten Lösung oder direkt in der Form von Kristallen verwendet.
Als eine Folge der oben erwähnten Behandlungen mit DTT und Harnstoff wird das vollständige Tetanustoxinmolekül in der unterbrochenen Form gespalten, um eine Lösung zu erhalten, die FFA enthält. Durch Verdünnen der Lösung, die FFA enthält, um dadurch die Konzentration an Harnstoff zu verringern, kann FFA als ein hochreines Tetanustoxinfragment durch Fraktionierung oder Abtrennung unter Verwendung einer Absorbanz bei 280 nm als einem Index erhalten werden (siehe Referenzbeispiel 7). Die Reinigung kann z. B. durch ein kombiniertes Verfahren unter Verwendung von sowohl Dichtegradienten-Ultrazentrifugation als auch Gleichgewichtsdichtegradienten-Ultrazentrifugation (siehe ungeprüfte Japanische Patentanmeldung No. 07-89951), SDS-PAGE (Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese), Gelfiltration, Membranfiltration, Ionenaustauschchromatographie und Hochleistungsflüssigchromatograhpie durchgeführt werden. Durch diese Reinigungsverfahren werden zwei Fraktionen mit unterschiedlichen Molekulargewichten, entsprechend 2 Peaks, die bei 280 nm auftreten, erhalten, und FFA wird in der Fraktion mit höherem Molekulargewicht gefunden. Diese Fraktion, enthaltend FFA, wird als ein aktiver Bestandteil für einen FFA-Tetanusimpfstoff verwendet. Das vollständige Tetanustoxinmolekül kann gemäß den unten beschriebenen Verfahren hergestellt werden (Referenzbeispiel 13).
Das Molekulargewicht, die Antigenspezifität und die Aminosäuresequenz von dem vollständigen Tetanustoxinmolekül und von FFA kann z. B. bestimmt werden durch SDS-PAGE (Referenzbeispiel 10), eine Präzipitationsreaktion in Gel (Referenzbeispiel 11) und einem Verfahren unter Verwendung eines Peptidsequenzers (Referenzbeispiel 12).
(8) Stabilisierung von FFA
Bei dem FFA der vorliegenden Erfindung fehlt ein vollständiger oder das meiste des Bereichs des Fragments A, welches das aktive Zentrum ist, das die Toxizität zeigt, so dass der FFA der vorliegenden Erfindung keine Toxizität hat. Deshalb kann der FFA als solches als ein Toxoid ohne Entgiftung verwendet werden. Jedoch ist es für die Stabilisierung der stereochemischen Struktur von FFA als ein Antigen bevorzugt, eine Stabilisierung (Fixierung) des Tetanustoxin FFA durchzuführen. Beispiele für Fixierungsmittel (Fixierungs- oder Stabilisierungsreagenz) umfassen übliche Entgiftungsmittel, wie z. B. Formalin, Glutaraldehyd und β-Propiolacton. Wenn z. B. Formalin als ein Fixierungsmittel verwendet wird, ist es bevorzugt, dass das Volumenverhältnis von Formalin zu der FFA-Lösung etwa innerhalb des Bereichs von 0,0004 bis 0,7% (v/v) ist. Die Fixierungstemperatur ist etwa innerhalb des Bereichs von 3 bis 37°C und die Fixierungszeit ist etwa innerhalb des Bereichs von 5 bis 180 Tagen. Wenn die Gefahr besteht, dass die Antigenität von FFA durch die Fixierung verschlechtert wird, werden die Fixierungsbedingungen moderat verändert durch Verringerung der Konzentration an Fixierungsmittel, Verringerung der Fixierungstemperatur oder Zugeben von neutralen Aminosäuren, wie z. B. Glycin und Serin, oder basischen Aminosäuren, wie z. B. Lysin und Arginin. Wenn freies Formaldehyd in der Lösung nach der Fixierung verbleibt, kann, falls gewünscht, es durch Zugabe von Natriumhydrogensulfid in einer zu der Menge des Formaldehyds äquivalenten Menge neutralisiert werden, oder kann entfernt werden durch Filtration unter Verwendung einer Membran oder durch Dialyse. Nach der Fixierungsbehandlung wird die FFA-Lösung bei 4°C für die nachfolgende Verwendung als eine Sammellösung von Tetanustoxinvakzin zur Herstellung eines Tetanusimpfstoffs gelagert. Nach der Fixierungsbehandlung werden das behandelte vollständige Tetanustoxinmolekül und das behandelte FFA als ein "vollständiges Tetanustoxin-Toxoid" bzw. ein "FFA-Toxoid" bezeichnet.
(9) Herstellung von FFA-Tetanusimpfstoff
Die in Punkt (8) oben erhaltene FFA-Toxoid-Sammellösung kann verdünnt werden, um einen Impfstoff, umfassend das FFA-Toxoid in einer immunogen wirksamen Menge, zu erhalten. Z. B. kann die Sammellösung mit einer isotonischen Salzlösung oder mit Puffer oder einem Gewebekulturmedium verdünnt werden, so dass der Proteingehalt des Impfstoffs für ein Einzelantigentoxoid von 20 bis 200 μg wird, oder 8 bis 80 μg für ein adsorbiertes Toxoid.
Wenn die Sammellösung wie oben erwähnt verdünnt wird, kann ein Stabilisator zur Erhöhung der Hitzebeständigkeit des Impfstoffs oder ein Adjuvanz als ein Hilfsmittel zur Erhöhung der Immunwirksamkeit zu der Wirkstofflösung zugegeben werden. Es ist bevorzugt, dass der Stabilisator zu dem Impfstoff in einer Menge von 0,01 bis 10% (W/V) zugegeben wird, und das Adjuvanz wird in einer Menge von 0,1 bis 50 mg pro ml des Impfstoffs zugegeben. Beispiele für Stabilisatoren umfassen Saccharide, Aminosäuren, Gelatine-Hydrolisat und humanes Albumin. Beispiele für Adjuvanzien umfassen Gele, fähig die verzögerte Abgabe von Antigenen zu bewirken, wie z. B. Kalziumphosphat, Aluminiumphosphat, Aluminiumsulfat, Tonerde und Bentonit; und Mittel zur Induktion der Antikörperproduktion, wie z. B. Muramyldipeptid-Derivate, Krestin und Picibanil.
Nachfolgend wird der Einzelantigenimpfstoff oder der adsorbierte Impfstoff in kleine Behälter, wie z. B. Ampullen oder Phiolen, dispensiert. Dann werden die Behälter hermetisch abgedichtet, z. B. durch Schmelzdichtung, und der versiegelte Impfstoff wird als eine reine oder adsorbierte Präparation bereitgestellt. Wenn der Impfstoff nach der Dispensierung lyophilisiert wird, kann der Impfstoff als eine lyophilisierte Präparation bereitgestellt werden. Ferner kann der Impfstoff in der Form einer kombinierten Impfstoffpräparation, wie z. B. einem binären DT-Impfstoff, einem ternären DPT-Impfstoff oder einem quatären Impfstoff, bereitgestellt werden.
Jede dieser Präparationen wird verschiedenen Tests unterzogen, um die Eignung zur Verwendung als ein Toxoid oder einen Impfstoff zu verifizieren. Das heißt, jede dieser Präparationen wird verschiedenen Tests auf Wirksamkeit, Sicherheit und Homogenität gemäß einer relevanten Vorschrift (wie z. B. einer Vorschrift mit dem Titel "Tetanus-Toxoid", einer Vorschrift mit dem Titel "adsorbiertes Tetanus-Toxoid", einer Vorschrift mit dem Titel "kombiniertes Diphterie-Tetanus-Toxoid", oder einer Vorschrift mit dem Titel "kombinierter Diphterie-Pertussis- Tetanusimpfstoff") in der Mitteilung Nr. 217 des Japanischen Ministeriums für Gesundheit und Soziales: "Seibutsugakuteki Seizai Kijun (minimale Anforderungen für biologische Produkte), um dadurch dessen Eignung zur Verwendung als ein Impfstoff zu verifizieren. Nur die verifizierten Präparationen werden einer praktischen Verwendung zugeführt. Bezüglich der Verabreichungsweise wird eine Präparation z. B. gewöhnlich durch subkutane oder intramuskuläre Injektion in einer Menge von 0,5 ml pro Person verabreicht. Im Falle einer lyophilisierten Präparation wird diese vor Verwendung in sterilem destilliertem Wasser gelöst, um dadurch eine Lösung mit dem Ursprungsvolumen vor der Lyophilisierung zu erhalten.
(10) Messung der Immunwirksamkeit des FFA-Tetanusimpfstoffs
Die Immunwirksamkeit des FFA-Tetanusimpfstoffs der vorliegenden Erfindung wird gemessen unter Verwendung immunisierter Tiere (Meerschweinchen oder Mäusen) durch einen Wirksamkeitsassay unter Verwendung eines Erregertoxins mit einem bekannten LD₅₀ (mittlere letale Dosis), oder einem Assay für Toxinneutralisierungsaktivität von Antiseren, gemäß der Vorschrift mit dem Titel "Tetanus-Toxoid", oder der Vorschrift mit dem Titel "adsorbiertes Tetanus-Toxoid" in der Mitteilung No. 217 des Japanischen Ministeriums für Gesundheit und Soziales: "Seibutsugakuteki Seizai Kijun (minimale Anforderungen für biologische Produkte). Zusätzlich zu den oben erwähnten Tests wird bei der vorliegenden Erfindung die relative Immunwirksamkeit von FFA gegenüber der des vollständigen Tetanus-Toxoids gemessen, indem ein weiterer Wirksamkeitsassay unter Verwendung eines Erregertoxins durchgeführt wird, wobei das Zählverfahren (Referenzbeispiel 15) angewandt wird.
(11) Tierversuche über die nachteiligen Nebenwirkungen von FFA-Tetanus-Toxoid
Tierversuche über die Nebenwirkungen des FFA-Tetanusimpfstoffs der vorliegenden Erfindung können gemäß üblichen Verfahren ausgeführt werden. Beispiele für Tierversuche, welche zur Evaluation der nachteiligen Nebenwirkungen von Tetanus-Toxoid angewandt werden können, umfassen den passiven kutanen Anaphylaxie (PCA) Test unter Verwendung von Ratten, welcher auf einer unmittelbaren allergischen Reaktion basiert, dem Fußballenreaktionstest unter Verwendung von Mäusen, welcher auf einer verzögerten allergischen Reaktion basiert und den intradermalen Reaktionstest unter Verwendung von Meerschweinchen (Referenzbeispiel 16), wobei der Test auf einer verzögerten allergischen Reaktion basiert.
Beste Art zur Ausführung der Erfindung
Nachfolgend wird die vorliegende Erfindung detaillierter mit Bezug auf die folgenden Beispiele und Referenzbeispiele beschrieben werden, aber sie sollten nicht als limitierend für den Umfang der vorliegenden Erfindung aufgefaßt werden.
In den folgenden Referenzbeispielen sind die Richtlinien zur Ausführung der vorliegenden Erfindung spezifisch gezeigt.
[Referenzbeispiel 1] Isolierung einer Einzelkolonie eines C. tetani Stamms mit hoher Toxin-Produktionsfähigkeit
Kolonien von C. tetani Havard Stamm A47 werden auf einer Platte mit Zeissler's Blutagar [hergestellt durch Zugabe von Glucose und defibriniertem Rinderblut zu einem kommerziell erhältlichen nicht-modifizierten Agarmedium in solchen Mengen, dass es eine Endkonzentration an Glucose von 2% (W/V) und eine Endkonzentration an defibriniertem Rinderblut von 20% (V/V) ergeben würde, gefolgt von Mischen] gebildet und die gebildeten Kolonien werden individuell in einem modifizierten Lathammedium (siehe Referenzbeispiel 3 unten) inokuliert und inkubiert, um Kulturen zu erhalten. von jeder der erhaltenen Kulturen wird der Lf-Wert gemäß dem in Referenzbeispiel 5 unten beschriebenen Verfahren gemessen. Aus den oben erwähnten Kolonien wird die Kolonie, die für die Kultur mit dem höchsten Lf-Wert verwendet wird, als ein Bikenunterstamm des C. tetani Havardstamms A47 verwendet, welche eine hohe Toxin-Produktionsfähigkeit hat.
[Referenzbeispiel 2] Herstellung von Transformanten mit hoher Toxin-Produktionsfähigkeit für FFA

Eine DNA des Tetanustoxin-Gens [siehe EMBO Journal, 5 (10), 2495–2502, 1986 und Nucleic Acid Research 14 (19), 7809–7812, 1986] wird mit den Restriktionsenzymen verdaut, wodurch ein 2,7 kb DNA-Fragment (StuI-BspHI) erhalten wird, das für FFA kodiert. Das erhaltene DNA-Fragment wird insertiert in und ligiert mit pSN508 [welches ein Vektor ist, fähig zur Expression großer Mengen E. coli (siehe US-Patent Nr. 4,703,005)], um einen rekombinanten Expressionsvektor zu erhalten. Dann wird der erhaltene rekombinante Expressionsvektor in E. coli Stamm CSH26 eingeführt, um Transformanten mit hoher Toxin-Produktionsfähigkeit für FFA zu bilden. Wenn die Produktion des FFA durch Kultivierung der oben erwähnten Transformanten ausgeführt wird, ist es nicht notwendig, die unten beschriebenen Behandlungen durchzuführen, wie z. B. einen Proteaseverdau des vollständigen Tetanustoxinmoleküls, und eine Behandlung unter Verwendung von Dithiothreitol oder Harnstoff, aber Reinigung ist notwendig. Referenzbeispiel 3 Zusammenstellung des modifizierten Lathammediums (pro 1 Liter Medium)

Polypepton	20 g
Rinderherzextrakt	10 g
Glucose	8,0 g
Natriumchlorid	2,5 g
Magnesiumsulfat (Heptahydrat)	0,1 g
Cystein	0,125 μg
Kalziumpantothenat	1,0 mg
Uracil	1,25 mg
Nikotinsäure	0,25 mg
Thiamin	0,25 mg
Riboflavin	0,25 mg
Pyridoxin	0,25 mg
Biotin	2,5 μg
Vitamin B₁₂	0,05 μg
Folsäure	100 μg
Eisen(III)chlorid (Hexahydrat)	32 mg
Eisensulfat (Heptahydrat)	0,2 g

(Der pH wurde auf 7,0 unter Verwendung von 7 N NaOH eingestellt)

[Referenzbeispiel 4] MLD (minimale letale Dosis)
0,1 bis 0,5 ml von jeder der Verdünnungen der das Tetanustoxin enthaltenden Lösung, welche hergestellt worden sind durch aufeinanderfolgende Verdünnung des Tetanustoxin mit logarithmischen Intervallen von 10^0,5, wird OF1-Mäusen (wiegend 20 bis 25 g) einzeln am Oberschenkel des linken hinteren Beins subkutan oder intramuskulär injiziert. MLD wird basierend auf der Dosis (log. der Dosis)-Antwort (Zeit bis zum Tod) Kurve bestimmt [siehe "Proceedings of the 6th International Conference on Tetanus (Lyon, 1981)" S. 21–32].
[Referenzbeispiel 5] Lf-Einheit (Einheit der Ausflockung)
Der Lf-Wert einer Toxinlösung kann durch das Ramon's Verfahren gemessen werden (Biken Journal, 7, 137–152, 1964). 1 Lf des Toxins, welches die Toxinmenge ist, die mit 1 Einheit des Antitoxins reagiert, wird gemessen. Die Messung des oben erwähnten Lf-Werts kann auch unter Verwendung von SRID (Single Radial Immunodiffusion) ausgeführt werden (siehe Immunochemistry, 2, 235–254, 1965).
[Referenzbeispiel 6] Messung des Proteingehalts
Der Proteingehalt wird gemäß dem "modifizierten Verfahren von Lowry et al., 1951" gemessen, in welchem die Farbreaktion eines Proteins und eines Phenolreagenz colorimetrisch ausgewertet wird. Nachfolgend wird dieses Verfahren einfach als "Phenolreagenzverfahren" bezeichnet.
[Referenzbeispiel 7] Identifizierung von Proteinfraktionen und Vergleich der Proteinkonzentrationen zwischen den Proteinfraktionen
dDie Identifizierung der Proteinfraktionen und der Vergleich der Proteinkonzentrationen zwischen den Proteinfraktionen werden durch Messung der Extinktion von ultraphioletten Strahlen mit einer Wellenlänge von 280 mm (nachfolgend als eine "Extinktion bei 280 mm" bezeichnet) einer Probe ausgeführt.
[Referenzbeispiel 8] Herstellung eines DTT-Tris-Puffers (100 mM)
Ein DTT-Tris-Puffer wird hergestellt durch Mischen von 50 mM Tris(hydroxymethyl)aminomethan-HCl (nachfolgend einfach als "Tris" bezeichnet), 1 mM Ethylenediamintetraacetat-4 Na (nachfolgend einfach als "EDTA") bezeichnet und 100 mM DTT. Der pH des DTT-Tris-Puffers wird auf 8,2 unter Verwendung von 1/10 M HCl eingestellt.
[Referenzbeispiel 9] Herstellung eines Phosphatpuffers
Ein Phosphatpuffer wird hergestellt durch Mischen gleicher molarer Mengen von Lösungen von Dinatriummonohydrogenphosphat und Kaliumdihydrogenphosphat. Die Mengen der zu mischenden Lösungen werden geeignet gewählt, so dass der resultierende Phosphatpuffer einen gewünschten pH-Wert hat.
[Referenzbeispiel 10] Messung der Molekulargewichte von Proteinen durch Verwendung von SDS-Page
Beim SDS-Page kann ein SDS-Pagegel mit einem Gelgehalt von 7,5% (W/V), 7,0% (W/V) (enthaltend 2 M Harnstoff) oder 5,0% (W/V) verwendet werden. Als eine Pufferlösung kann z. B. 10 mM Tris-77 mM Glycinpuffer (pH 8,6) verwendet werden. Nach der Elektrophorese wird das Gel unter Verwendung von Coomassie Brilliantblau gefärbt. Das Molekulargewicht von jedem der Proteine wird individuell aus dem Verhältnis der Migrationsdistanz der Proteinprobe zu der Migrationsdistanz des Markerfarbstoffs oder dem Protein mit bekanntem Molekulargewicht bestimmt. Als eine Folge der gemäß dem obigen Verfahren ausgeführten Messungen wird gefunden, dass die Molekulargewichte (×10⁴) des FFA und des vollständigen Tetanustoxinmoleküls 100.000 bzw. 150.000 sind.
[Referenzbeispiel 11] Bestimmung der Antigenspezifität durch Verwendung der doppelten Immundifusion
Die Antigenspezifität wird bestimmt durch das Verfahren von Ouchterlony unter Verwendung von 1% (W/V) Agarose in 50 mM Tris-0,6 M Glycin-Puffer (enthaltend 1 mM EDTA; pH 8,5) und Pferde anti-Tetanustoxinserum, aus welchem nicht-spezifische Antikörper entfernt werden. Eine Kreuzreaktion der Antigenizität wird zwischen dem FFA und dem vollständigen Tetanustoxinmolekül beobachtet.
[Referenzbeispiel 12] Bestimmung der Aminosäuresequenz des FFA
Die Bestimmung der Aminosäuresequenz des FFA wird ausgeführt unter Verwendung eines automatischen Aminosäuresequenzers, wie z. B. Applied Biosystem Procise Type 492, hergestellt und vertrieben von Perkin Elmer, USA. Das in Beispiel 1 unten erhaltene FFA hat die N-terminale Aminosäuresequenz (7) der 2(a), und das in Beispiel 7 unten erhaltene FFA hat die N-terminale Aminosäuresequenz (4) der 2(a). Ferner kann durch geeignete Wahl der Kultivierungsbedingungen von C. tetani, ein FFA mit einer N-terminalen Aminosäuresequenz (8) der 2(a) erhalten werden. FFA's mit den jeweiligen N-terminalen Aminosäuresequenzen (1) bis (3) und (6) der 2(a) können hergestellt werden aus dem intrazellulärem Tetanustoxin, durch geeignete Wahl der Bedingungen für den Verdau des intrazellulären Tetanustoxinmoleküls mit Trypsin, um das Toxinmolekül in eine unterbrochene Form desselben umzuwandeln, wie z. B. eine Enzymkonzentration, eine Reaktionszeit und eine Reaktionstemperatur. Eine FFA-Präperation mit einer N-terminalen Aminosäuresequenz (5) oder 2(a) kann durch Verdau des intrazellulären Tetanustoxinmoleküls mit Chymotrypsin, um das Toxinmolekül in eine unterbrochene Form desselben umzuwandeln, hergestellt werden. Somit können in der vorliegenden Erfindung 8 unterschiedliche Typen von FFA's, die die jeweiligen N-terminalen Aminosäuresequenzen (1) bis (8) der 2(a) haben, erhalten werden. Diese 8 Typen von FFA's können als ein aktiver Bestandteil eines Tetanusimpfstoffs individuell oder in Kombination verwendet werden.
[Referenzbeispiel 13] Bestimmung des isoelektrischen Punktes von FFA
Der isoelektrische Punkt von FFA wird bestimmt durch ein isoelektrisches Fokussierungsverfahren unter Verwendung eines kommerziell erhältlichen Gels, z. B. eines von Pharmacia Biotech, Schweden hergestellten und unter dem Handelsnamen "Phast Gel IEP 3–9" vertriebenen Gels. Als eine Folge der in den Beispielen gemäß den obigen Verfahren ausgeführten Messungen, wurde gefunden, dass das FFA der vorliegenden Erfindung einen isoelektrischen Punkt innerhalb des Bereichs von 7,25 ± 0,5 hat.
[Referenzbeispiel 14] Herstellung des vollständigen Tetanustoxinmoleküls
Die Anzuchtkultur des C. tetani Stamms, erhalten in Referenzbeispiel 1, wird in einem Kulturmedium, beschrieben in Referenzbeispiel 3, für 44 Stunden inokuliert und die Bakterienzellen werden durch Zentrifugation bei 10.000 × g bei 4°C für 25 Minuten geerntet. Eine 1 M NaCl-Lösung, enthaltend 0,1 M Natriumcitrat, wird in einer Menge von 1/30 Volumen zu der Zellkultur zugegeben, um das intrazelluläre Toxin durch sanftes Schütteln zu extrahieren. Die resultierende Mischung wird bei 4°C über Nacht gerührt, um das Tetanustoxin zu extrahieren, dann wird bei 10.000 × g bei 4°C für 30 Minuten zentrifugiert, um die Zellen und die Zelltrümmer zu entfernen. Unter Verwendung des resultierenden Überstandes als Ausgangsmaterial wird das Toxin im Wesentlichen auf dieselbe Weise wie in Beispiel 1 unten gereinigt, um eine gereinigte vollständige Tetanustoxin-Präparation zu erhalten.
[Referenzbeispiel 15] Zählverfahren für die Evaluation der Immunwirksamkeit

Die relative Wirksamkeit des Tetanus-Toxoids wird unter Verwendung eines Zählverfahrens evaluiert. Veranschaulichend dargestellt werden Tiere für immunologische Experimente, welchen der Tetanusimpfstoff injiziert worden ist, mit Toxin herausgefordert und über eine Woche auf Symptome für Tetanus beobachtet. Die schwere der Symptome wurde gemäß den folgenden Kriterien durch das Zählverfahren evaluiert:

Ergebnisse	Treffer
Das Tier stirbt am ersten Tag:	0
Das Tier stirbt am zweiten Tag:	1
Das Tier stirbt am dritten Tag:	2
Das Tier stirbt oder zeigt schwere Symptome (wie z. B. tonische Convulsion, Schwierigkeiten beim Gehen und hochgradige Atemnot) zwischen dem vierten und siebten Tag:	3
Das Tier überlebt über eine Woche lang mit leichten Symptomen [wie z. B. einer lokalen Lähmung des abdominalen Muskels an der der Injektionsseite gegenüberliegenden Seite (dieses Symptom wird geprüft durch Beobachtung des an seinem Schwanz aufgehängten Tieres)]:	4

Das Tier überlebt über eine Woche lang ohne irgendein Symptom:

8

Die erhaltenen Treffer werden analysiert durch einen Computer unter Verwendung einer Software, entworfen für die statistische Analyse des Parallelleitungsassays, in welcher die Korrelationsanalyse der Treffer hinsichtlich Einheitlichkeit, Linearität und Parallelität ausgeführt wird, um die relative Immunwirksamkeit des Tetanus-Toxoids gegenüber der des vollständigen Standard Tetanustoxin-Toxoids einer bekannten internationalen Einheit zu evaluieren.
[Referenzbeispiel 16] Intradermale Reaktion unter Verwendung von Meerschweinchen
Drei Gruppen von Meerschweinchen werden durch intramuskuläre Injektion mit 1 ml des Tetanusimpfstoffs (10 μg Protein/ml) pro 1 Meerschweinchen sensibilisiert, wobei die oben erwähnten drei Gruppen von Meerschweinchen sensibilisiert werden mit (1) kommerziell erhältlichem teilgereinigten vollständigen Toxin-Toxoid, (2) gereinigtem vollständigem Toxin-Toxoid bzw. (3) FFA-Impfstoff. Vier Wochen nach der Sensibilisierung wird der Rücken von jedem Meerschweinchen rasiert und dann wird den einzelnen Meerschweinchen 0,1 ml des oben erwähnten Tetanus-Toxoids am Rücken derselben intradermal injiziert. Die Proteinkonzentration der Tetanus-Toxoid-Lösung wird variiert (32,0, 10,0 und 3,2 μg), abhängig von der Gruppe zu der ein Meerschweinchen gehört. 24 Stunden nach der Injektion wird bei jedem der Meerschweinchen der Teil, welcher injiziert worden ist, untersucht, um zu sehen, ob eine Hautreaktion, eine Rötung der Haut, eine Verhärtung und/oder eine Nekrose auftritt oder nicht. Wenn das Auftreten der Haut beobachtet wird, wird der Durchmesser der Hautrötung gemessen.
Beispiel 1
(1) Produktion und Reinigung des vollständigen Tetanustoxinmoleküls (unterbrochene Form)
In jedes von 20 Röhrchen (Durchmesser: 6 cm; Höhe: 38 cm), enthaltend 450 ml eines modifizierten Lathammediums (siehe Referenzbeispiel 3) wurde 5 ml der Anzuchtkultur eines Bikenunterstamms des C. tetani Havard Stamms A47 (siehe Referenzbeispiel 1) inokuliert. Die Röhrchen mit losem Bauwollstopfen wurden bei 35°C für 5 Tage inkubiert, bis die Kulturen klar wurden. Diese Kulturen wurden bei 10000 × g bei 4°C für 30 Minuten zentrifugiert, um saubere Kulturüberstände zu erhalten. 8,5 Liter der so als Ausgangsmaterial erhaltenen Kulturüberstände wurden filtriert und für die Reinigung der vollständigen Tetanustoxinmoleküle (unterbrochene Form) verwendet.
Eine gesättigte Lösung (bei 25°C) von Ammoniumsulfat (pH 7,0) wurde zugegeben und mit dem Ausgangsmaterial in einem Eiswasserbad gemischt, um eine Fraktion mit einer Ammoniumsulfatsättigung von 20% bis 40% auszusalzen. Die erhaltene Fraktion wurde in 65 ml 0,06 M Phosphatpuffer (pH 7,5, 4°C) (siehe Referenzbeispiel 9) suspendiert, um eine Suspension mit einer Ammoniumsulfatsättigung von 40% zu erhalten. Die erhaltene Suspension wurde einer Zentrifugation bei 15.000 × g bei 4°C für 30 Minuten unterzogen, um ein Präzipitat zu erhalten. Das erhaltene Präzipitat wurde gewaschen, indem das Präzipitat in 22 ml des oben erwähnten Phosphatpuffers resuspendiert wurde, und das daraus Resultierende wurde einer Zentrifugation unter denselben Zentrifugationsbedingungen wie oben erwähnt unterworfen. Das gewaschene Präzipitat wurde in 22 ml 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,5, 4°C) gelöst und einer Ultrazentrifugation bei 100000 × g bei 4°C für 2 Stunden unterzogen, um den präzipitierten Rückstand zu entfernen, wodurch 20 ml eines Überstandes erhalten werden. Der erhaltene Überstand wurde durch eine Acrodix-Membran (Porendurchmesser: 0,2 μm) (hergestellt und vertrieben von Gelman Co. Ltd., Deutschland) filtriert, und das daraus resultierende Filtrat des teilgereinigten Toxins wurde einer Gelfiltration unterzogen, indem eine mit 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,5) equilibrierte Ultrogel AcA 34 Säule (Innendurchmesser: 2,5 cm, Länge: 100 cm) (hergestellt und vertrieben von LKB-Pharmacia, Schweden) verwendet wird. Bei der Gelfiltration wurde die Elution bei 4°C unter Verwendung des oben erwähnten Phosphatpuffers (Flußrate: 9 ml/h) durchgeführt, und das daraus resultierende Eluat wurde in 1 ml Fraktionen fraktioniert. Von jeder der Fraktionen wurde die Extinktion bei 280 nm (siehe Referenzbeispiel 7) gemessen. Die Fraktionen mit einer hohen Extinktion wurden zusammengefaßt, wodurch ein Gelfiltrationseluat mit einem Gesamtvolumen von 5 ml erhalten wird.
Bezüglich des erhaltenen Eluats wurden die Messung des Proteingehalts gemäß dem Phenolreagenzverfahren (siehe Referenzbeispiel 6), die Messung des MLD pro 1 mg des Proteins (siehe Referenzbeispiel 4) und die Messung des Lf pro 1 mg des Proteins (siehe Referenzbeispiel 5) ausgeführt. Als ein Ergebnis, der Proteingehalt des Eluats war 60 mg/ml, Lf war 400 und MLD war 3, 5 × 10⁷.
Ferner wurden 0,2 ml des Eluats einer Hochleistungsflüssigchromatographie (HPLC) unter Verwendung einer mit 0,1 M Phosphatpuffer (pH 6,8) equilibrierten TSK G3000 SW Säule (Innendurchmesser: 0,75 cm, Länge: 60 cm) (hergestellt und vertrieben von Tosoh Corp., Japan), wobei die Elution unter Verwendung des oben erwähnten Phosphatpuffers (Flußrate: 0,6 ml/Minute) durchgeführt wurde, um dadurch Fraktionen zu erhalten. Die Extinktion bei 280 nm von jeder der Fraktionen wurde gemessen. Als ein Ergebnis wurde ein einzelner scharfer Peak erhalten, welcher anzeigt, dass das vollständige Tetanustoxinmolekül hoch gereinigt war. Bei der unten beschriebenen Präparation des FFA wurde das oben erhaltene Eluat als eine Lösung eines hochgereinigten Volllängen-Tetanustoxinmoleküls (unterbrochene Form) (d. h. eine hochgereinigte Tetanustoxinlösung) verwendet.
(2) Präparation von FFA
18 ml DTT-Tris-Puffer (siehe Referenzbeispiel 8) wurden zu 2 ml der hochgereinigten Tetanustoxinlösung zugegeben, gefolgt von Mischen. Die resultierende Mischung wurde bei 25°C für 60 Minuten umgesetzt, um die in dem vollständigen Tetanustoxinmolekül vorhandenen Disulfidbrücken zu reduzieren. Die resultierende Mischung wurde mit Harnstoff behandelt, indem 4,8 g fester Harnstoff zur Mischung zugegeben wurden, gefolgt vom Mischen, um den festen Harnstoff in der Mischung aufzulösen (Harnstoffendkonzentration: 4 M). Zu dem daraus Resultierendem wurden 20 ml 50 mM Tris-Puffer (enthaltend 0,6 M Glycin, 1 mM EDTA und 1 mM DTT; pH 8,5) zugegeben, und die resultierende Mischung wurde unter Verwendung eines Amicon Ultrafiltrationssystems eingeengt, wodurch 3 ml eines Kondensats erhalten wurden. Das erhaltene Kondensat wurde einer Gelfiltration unter Verwendung einer mit 50 mM Tris-Puffer (enthaltend 0,6 M Glycin, 1 mM EDTA und 1 mM DTT und 2 M Harnstoff; pH 8,5) equilibrierten Ultrogel AcA 44 Säule (Innendurchmesser: 1,5 cm, Höhe: 90 cm) unterzogen. Bei der Gelfiltration wurde die Elution unter Verwendung des oben erwähnten 50 mM Tris-Puffers (Flußrate: 5 ml/H) durchgeführt und das resultierende Eluat wurde in 1,2 ml Fraktionen fraktioniert. Von jeder der Fraktionen wurde die Extinktion bei 280 nm gemessen. Als ein Ergebnis wurden zwei Peaks (Peak 1 und Peak 2) beobachtet. Aus den erhaltenen Fraktionen, die zwei Fraktionen umfassen, von denen jede einen Peak bei 280 nm (d. h. eine Peak 1 Fraktion und eine Peak 2 Fraktion, wobei die Peak 1 Fraktion früher als die Peak 2 Fraktion erhalten wurde) zeigt, wurde ein Satz von 5 Fraktionen (Gesamtmenge: 6 ml), nacheinander erhalten, beginnend mit der Peak 1 Fraktion, und ein weiterer Satz von 5 Fraktionen (Gesamtmenge: 6 ml), nacheinander erhalten, beginnend mit der Peak 2 Fraktion, gesammelt, um eine gesammelte Fraktion 1 bzw. eine gesammelte Fraktion 2 zu erhalten.
Jede der hochgereinigten Tetanustoxinlösungen, die gesammelte Fraktion 1 und die gesammelte Fraktion 2, wurde einem SDS-Page (siehe Referenzbeispiel 10) zur Bestimmung des ungefähren Molekulargewichts und einer Gelpräzipitationsreaktion (siehe Referenzbeispiel 11) zur Bestimmung der Antigenizität unterzogen. Als ein Ergebnis, die Molekulargewichte des gereinigten Tetanustoxins, der gesammelten Fraktion 1 und der gesammelten Fraktion 2 waren etwa 150.000, 100.000 bzw. 50.000. Bezüglich der Antigenizität wurde die Kreuzreaktion der Antigenizität zwischen der hochgereinigten Tetanustoxinlösung und jeder der gesammelten Fraktionen 1 und 2 beobachtet, wohingegen keine Kreuzreaktion zwischen der gesammelten Fraktion 1 und der gesammelten Fraktion 2 beobachtet wurde, was darauf hinweist, dass diese 2 Typen von gesammelten Fraktionen vollständig unterschiedliche Antigenizitäten hatten. Ferner wurden die Proteingehalte der gesammelten Fraktion 1 und der gesammelten Fraktion 2 durch das Phenolreagenzverfahren bestimmt. Die Proteingehalte der gesammelten Fraktion 1 und der gesammelten Fraktion 2 waren 15 mg/ml bzw. 8 mg/ml. Aus den vorstehenden Ergebnissen wurde bestätigt, dass die gesammelte Fraktion 1 FFA enthält. In den unten beschriebenen Arbeitsgängen wurde die gesammelte Fraktion 1 als eine FFA-Lösung verwendet.
(3) Stabilisierung der FFA
4 ml der FFA-Lösung wurde gegen 1/15 M Phosphatpuffer (pH 7,8) bei 4°C über Nacht dialysiert. Nach Beendigung der Dialyse wurde der oben erwähnte Phosphatpuffer zugegen und mit der dialysierten FFA-Lösung gemischt, um dadurch eine Lösung mit einem Gesamtvolumen von 380 ml zu erhalten. 20 ml 500 mM Lysinlösung wurden zu der oben erwähnten FFA-Lösung zugegeben, so dass der Proteingehalt der FFA-Lösung 600 μg/ml betrug. Zu der resultierenden FFA-Lösung wurde Formalin in einer Menge zugegeben, so dass die Formalinendkonzentration 0,2% (V/V) betrug, und die resultierende Mischung wurde einer Inkubierung bei 37°C für 14 Tage unterzogen, um das FFA zu stabilisieren. Dann wurde das stabilisierte FFA gegen 0,58% (W/V) NaCl-Lösung bei 4°C über Nacht dialysiert, um Formaldehyd und Lysin zu entfernen und das Dialysat wurde zur Sterilisierung durch eine Acrodisc-Membran (Porendurchmesser: 0,22 μm) filtriert, wodurch 380 ml Filtrat erhalten wurden. Das erhaltene Filtrat wurde bei 4°C gelagert, und wurde als eine unten beschriebene FFA-Tetanusimpfstoffsammellösung verwendet.
(4) Präparation einer FFA-Tetanusimpfstoffprobe
Die FFA-Tetanusimpfstoffsammellösung wurde mit einer 0,85% (W/V) NaCl-Lösung verdünnt, um eine verdünnte Lösung mit einer Proteinendkonzentration von 50 μg/ml zu erhalten. Das gleiche Volumen einer Al(OH)₃-Gelsuspension [Al(OH)₃-Gehalt: 2 mg/ml] wurde zu der erhaltenen verdünnten Lösung zugegeben, gefolgt von Mischen. Die resultierende Mischung wurde bei 4°C über Nacht stehengelassen, so dass das FFA an das Al(OH)₃-Gel adsorbierte, wodurch eine Impfstoffprobe erhalten wurde. Von der erhaltenen Impfstoffprobe wurden die Aktivitäten derselben (Immunwirksamkeit) und die Sicherheit derselben (Toxizität oder nachteilige Nebenwirkungen) wie unten beschrieben evaluiert.
(5) Evaluation der Immunwirksamkeit der FFA-Tetanusimpfstoffprobe
Die Evaluation der Immunwirksamkeit der FFA-Tetanusimpfstoffprobe wurde durch Experimente unter Verwendung von Mäusen ausgeführt. Als eine Kontrolle wurde ein weiterer Impfstoff im Wesentlichen auf dieselbe Weise wie in den Punkten (3) und (4) hergestellt, außer, dass die Lösung des in Referenzbeispiel 14 hergestellten vollständigen Tetanustoxinmoleküls verwendet wurde. Sowohl der Probenimpfstoff als auch der Kontrollimpfstoff wurden seriell 2,5-fach verdünnt mit einer 0,85% (W/V) NaCl-Lösung, um Verdünnungen mit unterschiedlichen Verdünnungsverhältnissen zu erhalten, welchen den Mäusen wie unten beschrieben verabreicht wurden, wobei mindestens drei Verdünnungen solche Verdünnungsverhältnisse hatten, dass die Verdünnungen Dosis-Antwortbeziehungen zeigten, die in den linearen Bereich der Dosis-Antwortkurve fallen. Unter Verwendung der erhaltenen Impfstoffverdünnungen (d. h. Probenimpfstoffverdünnungen und Kontrollimpfstoffverdünnungen) wurde die Immunisierung der Mäuse wie folgt ausgeführt. Die Probenimpfstoffverdünnungen (jede mit der Menge von 0,5 ml) wurden jeweils 10 zufällig ausgewählten weiblichen ddy/s Mäusen (jede 22 bis 26 g wiegend) durch subkutane Injektion an der Innenseite des Oberschenkels des linken hinteren Beines verabreicht. Vier Wochen nach der Injektion wurde jede der immunisierten Mäuse mit 100 LD₅₀ Standardtoxin (Lot TA-4B) (bereitgestellt vom Nationalen Japanischen Gesundheitsamt) durch subkutane Injektion herausgefordert. Die obigen Arbeitsgänge wurden auch unter Verwendung der Kontrollimpfstoffverdünnungen anstelle der Probenimpfstoffverdünnungen ausgeführt. Nach den obigen Arbeitsgängen wurden über eine Woche Beobachtungen gemacht, ob die Mäuse am Leben waren oder nicht, und bezüglich der Symptome der Mäuse, welche am Leben waren. Die Ergebnisse der Beobachtung wurden durch das Zählverfahren (siehe Referenzbeispiel 15) evaluiert. Die erhaltenen Treffer wurden bezüglich der Varianz und Korrelation mit einem Computer und Verwendung einer Software für die statische Analyse analysiert. Aus den Ergebnissen der statistischen Analyse wurde die relative Immunwirksamkeit der FFA-Tetanusimpfstoffprobe (das Verhältnis der Immunwirksamkeit des Probenimpfstoffs relativ zu der Immunwirksamkeit des Impfstoffs, umfassend das vollständige Tetanustoxin-Toxoid, wobei die Immunwirksamkeit des Kontrollimpfstoffs als 1,0 definiert ist) berechnet. Das obige Experiment wurde viermal wiederholt, und die erhaltenen Werte der relativen Immunwirksamkeit wurden statistisch mit einem Computer analysiert. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 gezeigt. Die Immunwirksamkeit der FFA-Tetanusimpfstoffprobe war im Wesentlichen dieselbe, wie die des Kontrollimpfstoffs, umfassend das vollständige Tetanustoxin-Toxoid.
(6) Experimente unter Verwendung von Meerschweinchen, um das Ausmaß der durch die intradermale Reaktion der FFA-Tetanusimpfstoffprobe verursachten nachteiligen Nebenwirkungen zu evaluieren
Die intradermalen Reaktionen wurden unter Verwendung von Meerschweinchen (std. Hartley, wiegend 300 bis 350 g, 5 Wochen alt, weiblich) (erhalten von Japan SLC, Inc., Japan) gemäß den in Referenzbeispiel 16 beschriebenen Verfahren ausgeführt. Die Sensibilisierung der Meerschweinchen wurde wie folgt ausgeführt. Als Antigene für die Sensibilisierung der Meerschweinchen wurden die FFA-Tetanusimpfstoffprobe (FFA), ein kommerziell erhältliches Tetanus-Toxoid, vermutlich enthaltend ein vollständiges Tetanustoxin-Toxoid (übliches Toxoid) und der Impfstoff, umfassend das gereinigte vollständige Tetanustoxin-Toxoid (vollständiges Toxin-Toxoid) verwendet. Jedes von diesen Antigenen wurde unter Verwendung einer 0,85% (W/V) NaCl-Lösung verdünnt, so dass die Proteinendkonzentration und die Al(OH)₃-Endkonzentration 10 μg/ml bzw. 0,2 mg/ml betrugen, um dadurch drei Arten von Antigenverdünnungen zu erhalten. Die Meerschweinchen wurden zufällig in neun Gruppen, jede bestehend aus drei Meerschweinchen, aufgeteilt und die oben erhaltenen drei Arten von Antigenverdünnungen wurden jeweils den drei Meerschweinchen von jeder der neun Gruppen verabreicht. Nach Beendigung der Sensibilisierungszeitspanne (4 Wochen) wurden die sensibilisierten Meerschweinchen durch die oben erwähnten Antigene durch das folgende Verfahren herausgefordert. Von jedem der oben erwähnten Antigene wurden drei Typen von Verdünnungen derselben mit Proteinendkonzentrationen von 3,2, 1,0 bzw. 0,32 μg/ml hergestellt unter Verwendung von 0,85% (W/V) NaCl-Lösung. Die resultierenden neun Typen von Verdünnungen (bestehend aus drei Typen von Verdünnungen des FFA, drei Typen von Verdünnungen des herkömmlichen Toxoids und drei Typen von Verdünnungen des vollständigen Toxin-Toxoids) wurden den Meerschweinchen verabreicht, so dass die Meerschweinchen, die zu derselben Gruppe gehören, die Verabreichung desselben Typs von Verdünnung erfuhren, wobei die Dosis von jeder der Verdünnungen 0,1 ml war. Als eine Kontrolle wurde jedem der drei Meerschweinchen, welche jeweils mit den oben erwähnten Antigenen auf im Wesentlichen dieselbe Weise wie oben erwähnt sensibilisiert worden waren, 0,1 ml einer 0,85% (W/V) NaCl-Lösung intradermal injiziert. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 gezeigt. Bei jedem der Meerschweinchen, dem die FFA-Tetanusimpfstoffprobe verabreicht worden war, war das Auftreten der intradermalen Reaktion entweder nicht nachweisbar oder deutlich schwach verglichen mit der von den Meerschweinchen, denen der herkömmliche Impfstoff verabreicht worden war, und den Meerschweinchen, denen der Impfstoff, umfassend das vollständige Tetanustoxin-Toxoid, verabreicht worden war.
Beispiel 2
(1) Zubereitung der FFA-Tetanusimpfstoffsammellösung
0,5 l einer Anzuchtkultur eines Bikenunterstamms des C. tetani Harvard Stamms A47 wurde in 80 l modifiziertem Lathammedium, enthalten in einem Edelstahltank mit einem Volumen von 100 l (Durchmesser: 60 cm, Höhe: 50 cm), inokuliert. Der Tank wurde mittels einer Silikonfolie abgedichtet und die Anzuchtkultur wurde bei 35°C für 6 Tage inkubiert, um dadurch eine Kultur zu erhalten. Die erhaltene Kultur wurde zur Sterilisierung durch ein Cellit-Filterpapier gefiltert, wodurch 75 l eines Filtrats erhalten wurden. Das erhaltene Filtrat wurde unter Verwendung des "pericon cassette system" (hergestellt und vertrieben von Millipore, USA) konzentriert, wodurch 7 l eines Kondensats erhalten wurden. Unter Verwendung des erhaltenen Kondensats als Ausgangsmaterial wurde die Reinigung des vollständigen Tetanustoxinmoleküls, die Präparation des FFA und die Stabilisierung des FFA im Wesentlichen auf dieselbe Weise wie in Beispiel 1 durchgeführt, wodurch 450 ml einer FFA-Tetanusimpfstoffsammellösung mit einer Proteinkonzentration von 600 μg/ml erhalten wurden.
(2) Produktion einer reinen FFA-Tetanusimpfstoffpräparation
Die oben erhaltene FFA-Tetanusimpfstoffsammellösung wurde verdünnt unter Verwendung von 1/75 M Phosphatpuffer (pH 6,5), so dass die Proteinendkonzentration der Impfstoffpräparation 60 μg/ml betrug. Zu der resultierenden Verdünnung wurden individuell Sucrose, L-Arginin und Haemaccel (hergestellt und vertrieben von Hoechst Aktiengesellschaft, Deutschland) in dieser Reihenfolge in Mengen zugegeben, so dass die Endkonzentrationen von Sucrose, L-Arginin und Haemaccel 3% (W/V), 1% (W/V) bzw. 2% (W/V) betrugen, gefolgt vom Mischen, um eine Einzelantigenimpfstoffpräparation zu erhalten. Die erhaltene Präparation wurde in Glasphiolen, von denen jede ein Volumen von 1 ml hat, dispensiert, so dass jede Phiole 0,6 ml der Präparation enthielt, und dann wurden die Phiolen abgedichtet. Die erhaltene Einzelantigenimpfstoffpräparation wurde verschiedenen Tests gemäß einer Vorschrift mit dem Titel "Tetanus-Toxoid" in der Mitteilung Nr. 217 des Japanischen Ministeriums für Gesundheit und Soziales: "Seibutsugakuteki Seizai Kijun (minimale Erfordernisse für biologische Produkte)" unterzogen. Als ein Ergebnis wurde die erhaltene Präparation als ein qualifizierter Impfstoff verifiziert.
Beispiel 3
Produktion einer adsorbierten FFA-Tetanusimpfstoffpräparation
Die in Beispiel 2 erhaltene FFA-Tetanusimpfstoffsammellösung wurde verdünnt unter Verwendung von 1/40 M Phosphatpuffer (pH 6,0), so dass die Proteinendkonzentration der Impfstoffpräparation 60 μg/ml betrug. Zu der resultierenden Verdünnung wurde ein Aluminiumphosphatgel in einer Menge zugegeben, so dass die Endkonzentration des Aluminiumphosphatgels der Impfstoffpräparation 0,2 ml/ml betrug, wodurch eine Mischung erhalten wurde. Die erhaltene Mischung wurde bei 4°C für 5 Stunden gerührt, um das FFA an das Aluminiumphosphatgel zu adsorbieren. Die resultierende Mischung wurde einer Zentrifugation bei 2000 rpm für 20 Minuten bei 4°C unterzogen, um das Gel zu sammeln. Das gesammelte Gel wurde in 1/75 M Phosphatpuffer (pH 6,5) suspendiert. Zu der resultierenden Suspension wurden Sucrose, L-Arginin und Haemaccel (hergestellt und vertrieben von Hoechst Aktiengesellschaft, Deutschland) in dieser Reihenfolge in Mengen zugegeben, so dass die Endkonzentrationen von Sucrose, L-Arginin und Haemaccel 3% (W/V), 1% (W/V) bzw. 2% (W/V) betrugen, gefolgt vom Mischen, um eine adsorbierte FFA-Tetanusimpfstoffpräparation zu erhalten. Die erhaltene Präparation wurde in Glasphiolen mit einem Volumen von 1 ml dispensiert, so dass jede Phiole 0,6 ml der Präparation enthielt, und dann wurden die Phiolen abgedichtet. Die erhaltene adsorbierte FFA-Tetanusimpfstoffpräparation wurde verschiedenen Tests gemäß einer Vorschrift mit dem Titel "adsorbiertes Tetanus-Toxoid" in der Mitteilung Nr. 217 des Japanischen Ministeriums für Gesundheit und Soziales: "Seibutsugakuteki Seizai Kijun (minimale Anforderungen für biologische Produkte)" unterzogen.
Als ein Ergebnis wurde die erhaltene Präparation als ein qualifizierter Impfstoff verifiziert.
Beispiel 4
Produktion einer adsorbierten kombinierten DPT-Impfstoffpräparation unter Verwendung von einem FFA-Tetanusimpfstoff
Ein adsorbierter FFA-Impfstoff wurde im Wesentlichen auf dieselbe Weise wie in Beispiel 3 hergestellt, außer, dass die Proteinendkonzentration des adsorbierten FFA-Tetanusimpfstoffs auf 180 μg/ml verändert wurde. Ein adsorbiertes Diphtherie-Toxoid und ein adsorbierter Pertussis-Impfstoff wurden individuell hergestellt, so dass die Konzentration von jedem Toxoid und die Impfstoffkonzentration das dreifache der Arbeitskonzentration betrugen. Der adsorbierte FFA-Tetanusimpfstoff, das adsorbierte Diphtherie-Toxoid und der adsorbierte Pertussis-Impfstoff wurden zusammengemischt, um eine adsorbierte kombinierte DPT-Impfstoffpräparation zu erhalten. Die erhaltene Präparation wurde in Glasphiolen, die jeweils ein Volumen von 10 ml haben, dispensiert, so dass jede Phiole 10 ml der Präparation enthielt, und dann wurden die Phiolen abgedichtet. Die adsorbierte kombinierte DPT-Impfstoffpräparation wurde verschiedenen Tests gemäß einer Vorschrift mit dem Titel "adsorbierter kombinierter Diphtherie-Pertussis-Tetanus-Impfstoff" in der Mitteilung Nr. 217 des Japanischen Ministeriums für Gesundheit und Soziales: "Seibutsugakuteki Seizai Kijun (minimale Anforderung für biologische Produkte)" unterzogen. Als ein Ergebnis wurde die erhaltene Präparation als ein qualifizierter kombinierter Impfstoff verifiziert.
Beispiel 5
Produktion einer adsorbierten kombinierten DT-Impfstoffpräparation unter Verwendung von einem FFA-Tetanusimpfstoff
Ein adsorbierter FFA-Tetanusimpfstoff wurde im Wesentlichen auf dieselbe Weise wie in Beispiel 3 hergestellt, außer, dass die Proteinendkonzentration des adsorbierten FFA-Tetanusimpfstoffs auf 120 μg/ml geändert wurde. Ein adsorbiertes Diphtherie-Toxoid wurde hergestellt, so dass die Toxoidkonzentration das zweifache der Arbeitskonzentration betrug. Der adsorbierte FFA-Tetanusimpfstoff und das Diphtherie-Toxoid wurden zusammengemischt, um eine adsorbierte kombinierte DT-Impfstoffpräparation zu erhalten. Die erhaltene Präparation wurde in Glasphiolen, die je ein Volumen von 1 ml haben, dispensiert, so dass jede Phiole 0,6 ml der Präparation enthielt, und dann wurden die Phiolen abgedichtet. Die erhaltene adsorbierte kombinierte DT-Impfstoffpräparation wurde verschiedenen Tests gemäß einer Vorschrift mit dem Titel "adsorbierter kombinierter Diphtherie-Tetanus-Impfstoff" in der Mitteilung Nr. 217 des Japanischen Ministeriums für Gesundheit und Soziales: "Seibutsugakuteki Seizai Kijun (minimale Anforderungen für biologische Produkte)" unterzogen. Als ein Ergebnis wurde die erhaltene Präparation als ein qualifizierter kombinierter Impfstoff verifiziert.
Beispiel 6
Produktion einer getrockneten FFA-Tetanusimpfstoffpräparation
Eine FFA-Tetanusimpfstoffpräparation wurde im Wesentlichen auf dieselbe Weise wie in Beispiel 2 hergestellt. Die erhaltene FFA-Tetanusimpfstoffpräparation wurde in Glasphiolen, die jeweils ein Volumen von 1 ml haben, dispensiert, so dass jede Phiole 0,6 ml der Präparation enthielt, gefolgt von Gefriertrocknung, um eine getrocknete FFA-Tetanusimpfstoffpräparation zu erhalten. Dann wurden die Phiolen abgedichtet. Von einer der Phiolen wurde die Dichtung entfernt und die getrocknete FFA-Tetanusimpfstoffpräparation wurde mit sterilem destilliertem Wasser gelöst, um 0,6 ml der Impfstofflösung zu erhalten, und die erhaltene Impfstofflösung wurde verschiedenen Tests gemäß einer Vorschrift mit dem Titel "Tetanus-Toxoid" in der Mitteilung Nr. 217 des Japanischen Ministeriums für Gesundheit und Soziales: "Seibutsugakuteki Seizai Kijun (minimale Anforderungen für biologische Produkte)" unterzogen. Als ein Ergebnis wurde die erhaltene Präparation als ein qualifizierter kombinierter Impfstoff verifiziert.
Beispiel 7
Produktion einer FFA-Tetanusimpfstoffprobe und Evaluation der Immunwirksamkeit derselben
Die Produktion des Impfstoffs unter Verwendung des extrazellulären Toxins und die Evaluation der Immunwirksamkeit des produzierten Impfstoffs wurden im Wesentlichen auf dieselbe Weise wie in Beispiel 1 ausgeführt, außer, dass die angewandten Bedingungen wie folgt verändert wurden.
Die Zeit für die Kultivierung der Anzuchtkulturen des C. tetani bei 35°C wurde auf 6 Tage geändert. Die Herstellung des FFA aus der Lösung des vollständigen Tetanustoxinmoleküls (unterbrochene Form), erhalten durch Gelfiltration unter Verwendung einer Ultrogel AcA 34 Säule wurde wie folgt ausgeführt. Ein DTT-Tris-Puffer (siehe Referenzbeispiel 8) wurde zu der oben erwähnten Lösung des vollständigen Tetanustoxinmoleküls in einer Menge von 1 ml pro 2 mg der Lösung des vollständigen Tetanustoxinmoleküls zugegeben, gefolgt vom Mischen. Dann wurde die Reaktion bei 25°C für 60 Minuten durchgeführt, um die in dem Toxinmolekül vorhandene Disulfidbrücke zu reduzieren. Anschließend wurde die resultierende Reaktionsmischung behandelt mit Harnstoff, indem ein fester Harnstoff in einer Menge zugegeben wurde, so dass die Harnstoffendkonzentration 4 M betrug. Die Reaktionsmischung wurde auf eine mit Puffer A (0,2 mM Tris-HCl, enthaltend 2 M Harnstofflösung und 1 mM DTT; pH 7,0) PD10 Säule (hergestellt und vertrieben von Pharmacia Biotech, Schweden) aufgetragen, und die Elution wurde unter Verwendung des oben erwähnten Puffers A durchgeführt, um den DTT-Tris-Puffer in der Reaktionsmischung mit Puffer A zu ersetzen. Das resultierende Eluat, enthaltend dissoziiertes Toxin, wurde einer Säulenchromatographie unter Verwendung einer mit Puffer A equilibrierten Mono Q Säule unterzogen, wobei die Elution ausgeführt wurde unter Verwendung von FPLC (hergestellt und vertrieben von Pharmacia Biotech, Schweden) und Puffer B (gebildet durch Zugabe von NaCl zu Puffer A, wobei die NaCl-Konzentration mit einem linearen Gradienten von 0 auf 0,5 M erhöht wird). In Bezug auf das Eluat wurde eine Analyse auf dieselbe Weise wie in Beispiel 1 durchgeführt. Als ein Ergebnis wurde gefunden, dass unter den Fraktionen des Eluats, die einen Peak bei 280 nm zeigen, die am frühesten erhaltene Fraktion FFA war.
Die Stabilisierung des FFA wurde durch Inkubation der FFA-Lösung in einer Mischung aus 0,067 M Phosphatpuffer (Na-K, pH 7,8), enthaltend 0,2% (V/V) Formalin, und 0,025 M Lysin bei 35°C für 2 Wochen ausgeführt. Das erhaltene stabilisierte FFA wurde verwendet, um den FFA-Tetanusimpfstoff herzustellen.
Die Evaluation der Immunwirksamkeit der FFA-Tetanusimpfstoffprobe wurde mit 4 Sätzen eines Experiments unter Verwendung von Mäusen im Wesentlichen auf dieselbe Weise wie in Punkt (5) des Beispiels 1 ausgeführt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 gezeigt. Wie aus Tabelle 3 klar ersichtlich, hatte die Immunwirksamkeit der FFA-Tetanusimpfstoffprobe im Wesentlichen das gleiche Niveau wie die des Kontrollimpfstoffs, umfassend das vollständige Tetanustoxin-Toxoid (d. h. ein herkömmliches Tetanus-Toxoid). Tabelle 1

Gereinigtes vollständiges Toxin-Toxoid: Impfstoff, umfassend das vollständige Tetanustoxin-Toxoid
FFA: Tetanusimpfstoff, umfassend das FFA

Herkömmliches Toxoid: Kommerziell erhältliches Tetanus-Toxoid
Gereinigtes vollständiges Tetanus-Toxoid: Impfstoff, umfassend ein vollständiges Tetanustoxin-Toxoid
FFA: Tetanus-Impfstoff, umfassend das FFA

Das Ausmaß der intradermalen Reaktion ist unter Verwendung einer Angabe, ausgewählt aus sieben Angaben, (*0) bis (+6), gemäss den folgenden Kriterien, basierend auf der Größe (E) der Hautrötung, wobei E ein Wert der Formel
Hauptdurchmesser (mm) der Hautrötung × geringster Durchmesser (mm) der Hautrötung
ist:
*0: (0 E < 1), +1: (1 E < 20), +2: (20 E < 40),
+3: (40 E < 60), +4: (60 E < 80),
+5: (80 E < 100), und +6: (100 E) gezeigt. Tabelle 3

Sequenzliste
Industrielle Anwendbarkeit
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein FFA (funktionales Antigenfragment des Tetanustoxins) für einen Tetanusimpfstoff bereitgestellt, welcher nicht nur dadurch vorteilhaft ist, dass er äußerst hervorragend bezüglich der Verringerung von nachteiligen Nebenwirkungen, verglichen mit dem herkömmlichen Tetanus-Toxoid, ist, sondern auch dadurch, dass er eine Immunwirksamkeit hat, welche im Wesentlichen dieselbe wie die eines herkömmlichen Tetanus-Toxoids ist.
Durch die Verwendung des FFA der vorliegenden Erfindung als einem aktiven Bestandteil für einen Tetanusimpfstoff kann ein Tetanusimpfstoff bereitgestellt werden, welcher nicht nur äußerst hervorragend bezüglich der Verringerung von nachteiligen Nebenwirkungen, verglichen mit einem herkömmlichen Tetanus-Toxoidimpfstoff, ist, sondern auch eine Immunwirksamkeit hat, welche im Wesentlichen dieselbe wie die eines herkömmlichen Tetanus-Toxoidimpfstoffs ist.
Ferner kann der oben erwähnte Tetanusimpfstoff auch in der Form eines kombinierten Impfstoffs, umfassend den Tetanusimpfstoff und mindestens einen vom Tetanusimpfstoff verschiedenen Impfstoff, wie z. B. einen Pertussis-Impfstoff und einen Diphtherie-Impfstoff, bereitgestellt werden.
Sequenzliste

Claims

Ein funktionales Antigenfragment des Tetanustoxins, das mindestens ein Fragment umfasst, welches das gleiche ist, wie jenes, das durch ein Verfahren erhältlich ist, das die Schritte umfasst: Spalten von mindestens einer Peptidbindung, ausgewählt aus Peptidbindungen, die einzeln gegenseitig benachbarte Aminosäurereste in einer Aminosäureteilsequenz zwischen zwei Cysteinresten, die an der Bildung einer Disulfidbrücke beteiligt sind, die am N-Terminus der gesamten Aminosäuresequenz des gesamten Tetanustoxinmoleküls, gezeigt in SEQ ID NO: 1, vorhanden ist, verbinden, Spalten der Disulfidbrücke und Spalten von nicht-kovalenten Bindungen zwischen Gruppen auf dem Tetanustoxinmolekül; wobei das funktionale Antigenfragment des Tetanustoxins aufweist: (a) ein Molekulargewicht von von 90.000 bis 110.000, wie durch ein SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese-Verfahren gemessen; (b) einen isoelektrischen Punkt von 7,25 ± 0,5, wie durch ein isoelektrisches Fokussierungsverfahren gemessen; und (c) eine Immunwirksamkeit, die der eines vollständigen Tetanustoxin Toxoids gleich ist, wobei jedes des mindestens einen Fragments unabhängig eine N-terminale Aminosäuresequenz aufweist, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 und SEQ ID NO: 9.
Das funktionale Antigenfragment des Tetanustoxins nach Anspruch 1, welches mit einem Fixiermittel stabilisiert ist.
Ein Tetanusimpfstoff, umfassend, als wirksamen Bestandteil, das funktionale Antigenfragment des Tetanustoxins aus Anspruch 1 oder 2 in einer wirksamen immunogenen Menge.
Ein kombinierter Impfstoff, umfassend, als eins von einer Mehrzahl von wirksamen Bestandteilen, das funktionale Antigenfragment des Tetanustoxins aus Anspruch 1 oder 2 in einer wirksamen immunogenen Menge.
Verfahren zur Herstellung eines Tetanusimpfstoffes, welches das Stabilisieren eines funktionalen Antigenfragments des Tetanustoxins mit einem Fixiermittel umfasst, wobei das funktionale Antigenfragment des Tetanustoxins mindestens ein Fragment umfasst, welches das gleiche ist, wie jenes, das erhältlich ist durch ein Verfahren, umfassend die Schritte des Sammelns und Reinigens eines extrazellulären Tetanustoxins aus einem Kulturfiltrat von Clostridium tetani, um ein extrazelluläres Tetanustoxinmolekül zu erhalten, Spalten einer Disulfidbrücke, die am N-Terminus der gesamten Aminosäuresequenz des extrazellulären Tetanustoxinmoleküls vorhanden ist, und Spalten von nicht-kovalenten Bindungen zwischen Gruppen auf dem extrazellulären Tetanustoxinmolekül; wobei das funktionale Antigenfragment des Tetanustoxins aufweist: (a) ein Molekulargewicht von von 90.000 bis 110.000, wie durch ein SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese-Verfahren gemessen; (b) einen isoelektrischen Punkt von 7,25 ± 0,5, wie durch ein isoelektrisches Fokussierungsverfahren gemessen; und (c) eine Immunwirksamkeit, die der eines vollständigen Tetanustoxin Toxoids gleich ist, wobei jedes des mindestens einen Fragments unabhängig eine N-terminale Aminosäuresequenz aufweist, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 und SEQ ID NO: 9.
Verfahren zur Herstellung eines funktionalen Antigenfragments des Tetanustoxins, umfassend: Ligation einer DNA, die für das funktionale Antigenfragment des Tetanustoxins aus Anspruch 1 kodiert, mit einem Vektor; Transformation einer Bakterienzelle, ohne Clostridium tetani, oder einer Hefezelle mit dem Vektor; und Expression des funktionalen Antigens des Tetanustoxins aus der DNA, die für das funktionale Antigenfragment des Tetanustoxins kodiert.