DE2448530C3

DE2448530C3 - Verfahren zum Herstellen von Derivaten des Diphtherietoxins und diese enthaltende Mittel

Info

Publication number: DE2448530C3
Application number: DE2448530A
Authority: DE
Inventors: Torsten B. Dipl.-Chem. Dr. 3550 Marburg Helting
Original assignee: Behringwerke AG
Current assignee: Siemens Healthcare Diagnostics GmbH Germany
Priority date: 1974-10-11
Filing date: 1974-10-11
Publication date: 1980-03-27
Also published as: IE41909B1; DK144528B; CH622527A5; CA1059026A; IL48281A; DE2448530A1; CH628638A5; ATA775575A; GB1529576A; DK457275A; IE41909L; AU8559375A; DE2448530B2; US4033819A; LU73556A1; BE834446A; FR2287237B1; AU502887B2; JPS5163929A; FR2287237A1

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Derivaten des Diphtherietoxins durch Modifizierung eines Teilmoleküls des Diphtherietoxins und Mittel, insbesondere Diphtherie-Impfstoffe, welche diese Derivate des Diphtherietoxins enthalten.

Die herkömmlichen Diphtherie-Impfstoffe zur aktiven Immunisierung enthalten fast ausschließlich durch Inaktivierung des Diphtherietoxins mit Formaldehyd hergestelltes Antigen. Diese auch als Toxoid bezeichnete Substanz ist mit einer Vielzahl von antigenen Determinaten ausgestattet, wovon nur einige wenige für die Erzeugung von schützenden Antikörpern gegen Diphtherie eine Rolle spielen dürften. Die Abtrennung von für den Schutz unwichtigen determinanten Gruppen ist wünschenswert, um zu antigenen bzw. immunogenen Stoffen zu kommen, die wegen eines engeren Spektrums von antigenen Determinanten eine erhöhte Spezifität und eine verbesserte Verträglichkeit erwarten lassen.

Diphtherietoxin wird von Zellen des Corynebacterium diphtheriae synthetisiert und extrazellulär als eine einzige Polypeptidkette mit einem Molekulargewicht von etwa 62 000 in das Nährmedium freigesetzt. Durch milde Proteolyse in Gegenwart von Verbindungen, die Dkulfidbrücken in Proteinen zu spalten vermögen, z. B. Thiol-Verbindungen, entstehen aus dem Diphtherietoxin zwei charakteristische Bruchstücke, das von dem NH₂-terminalen Teil des Toxins stammende sogenannte Fragmente A (Molekulargewicht ca. 24000) und das von dem Carboxy-terminalen Teil stammende sogenannte Fragment B (Molekulargewicht ca. 38 000). Das Fragment A kann mit Methoden der Proteinchemie relativ leicht isoliert werden und ist in physiologischen Pufferlösungen in nativer Form haltbar. Das Fragment B hingegen kann bekanntlich über längere Zeit in isoliertem Zustand nur in Gegenwart von denaturierenden Agenzien wie Harnstoff, Guanidinhydrochlorid oder oberflächenaktiven Detergenzien inn Lösung gehalten werden. Die Entfernung des Denaturierungsmittels führt zu einem vollständig wasserunlöslichen Fragment B, das eine Handhabung wesentlich erschwert. Dem nichtdenaturierten Fragment B wird jedoch eine entscheidende Rolle bei der Erzeugung von Antikörpern nach parenteraler Verabreichung zugeschrieben.

Der hier vorgelegten Erfindung liegt deshalb die Aufgabe zugrunde, das Fragment B des Diphtherietoxins in einer Weise zu modifizierer, daß es ohne Verlust der Antigenität in einem physiologisch verträglichen Medium in Lösung gehalten werden kann. Im besonderen soll das Fragment B in der modifizierten Form als wesentlich immunogener Bestandteil von Diphtherie-Impfstoffen verwendet werden können und darin das herkömmliche Formaldehydtoxoid ersetzen.

Es wurde gefunden, daß dies durch ein Verfahren erreicht werden kann, dessen Kernpunkt darin besteht, daß die spontane, irreversible Ausfällung des Fragments B, die nach Entfernung der denaturierenden Agenzien wie Harnstoff immer beobachtet wird, dadurch vermieden wird, daß eine geringgradige chemische Modifizierung des Fragments B entweder vor oder nach der Abtrennung des Fragments A aus dem Molekülverband des Diphtherietoxins, das einen Komplex der Fragmente A und B darstellt, durchgeführt wird.

Gegenstand der Erfindung ist demnach ein Verfahren zur Herstellung von Derivaten des Fragments B des Diphtherietoxins, die in physiologisch verträglichen Lösungen beständig sind, dadurch gekennzeichnet, daß man eine wäßrige Lösung des Diphtherietoxins vor oder nach der Behandlung mit einem proteolytischen Enzym in Gegenwart einer Disulfid-Brücken spaltenden Verbindung mit einem aliphatischen Mono- oder Dialdehyd der Kettenlänge von 1-6 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise Formaldehyd, mit einer Aldehyd-Konzentration von 0,0015 M bis 0,035 M, vorzugsweise 0,002-0,02 M bei 1-20° C, vorzugsweise 1-6° C, 5 Minuten bis 50 Stunden, vorzugsweise 2-20 Stunden, reagieren läßt, die Derivate des Fragments B aus der erhaltenen Lösung in Gegenwart eines denaturierenden Agens mit proteinchemischen Isolierungsverfahren gewinnt und gegebenenfalls vom denaturierenden Agens abtrennt.

Nach der Isolierung des Derivates des Fragments B kann das denaturierende Agens durch Dialyse oder andere vergleichbare Methoden, die die Abtrennung niedermolekularer Stoffe von hochmolekularem Pro-

tein gestatten, beispielsweise durch Gelfiltration, entfernt werden. Mit gleichen Maßnahmen ist auch der zur Umsetzung eingesetzte und dabei nicht verbrauchte Aldehyd aus den Ansätzen zu beseitigen.

Das entsprechend dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellte Derivat zeigt danach in physiologisch verträglichen, isotonisch wäßrigen Medien nicht mehr die von dem nativen Fragment B bekannten Denaturierungs- und Ausfällungserscheinungen. Wie das Fragment B hat das Derivat nicht mehr die vom Diphtherietoxin bekannte giftige Eigenschaft. Es verhält sich als Antigen und ist in der Lage, schützende Antikörper gegen Diphtherie im menschlichen oder tierischen Organismus zu induzieren.

Das erfindungsgemäß hergestellte Derivat ist mit üblichen proteinchemischen Methoden weiter zu reinigen. Bei der bekannt hohen Toxizität des nativen Diphtherietoxins und der ebenso bekannten Tatsache, daß Eiweißfraktionierungsmethoden nur in den seltensten Fällen zu einer 100%igen Abtrennung von Begleitsubstanzen, insbesondere ähnlich strukturierten Eiweißkörpern, führen, ist es jedoch vorteilhaft, das erfindungsgemäß hergestellte Produkt einer weiteren Aldehydbehandlung zu unterziehen, die zu modifizierten Derivaten des Fragments führt und die dadurch gekennzeichnet ist, daß man das erfindungsgemäß hergestellte Derivat des Fragments B mit einem aliphatischen Mono- oder Dialdehyd der Kettenlänge von 1-6 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise Formaldehyd, bis zu einer Aldehydkonzentration von 0,035 M bis 0,35 M versetzt und 14-28 Tage bei 20-37° C stehen läßt, den Aldehyd z. B. durch Dialyse entfernt und das modifizierte Derivat des Fragments B gewinnt.

Die zusätzliche Aldehydbehandlung führt zu einer weiteren Stabilität des Fragments B in wäßrigen Medien. Es ist demnach naheliegend, riaß dieses stabile Derivat des Fragments B auch dadurch erhalten werden kann, daß Diphtherietoxin, wie für die Herstellung des Fragments B bekannt, mit einem proteolytischen Enzym in Gegenwart von Disulfidbrückenspaltenden Stoffen, z. B. Thiol-Verbindungen umgesetzt die Lösung mit einem denaturierenden Agens versetzt, das Fragment B vorteilhaft durch Chromatographie, insbesondere Gelfiltration, gewonnen, das denaturierende Agens zweckmäßig durch Dialyse entfernt wird und das Fragment B anschließend sofort zusammen mit einem aliphatischen Mono- oder Dialdehyd der Kettenlänge von 1-6 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise Formaldehyd, in einer Konzentration von 0,0015 M bis 0,035 M 5 Minuten bis 50 Stunden bei 1-20° C stehen gelassen wird. Gewünschtenfalls kann eine zweite Aldehydbehandlung zur Modifizierung des Derivates angeschlossen werden. Es kann jedoch auch das Fragment B unmittelbar nach dessen Isolierung mit der für die Modifizierung des Derivates verwendeten höheren Aldehydmenge umgesetzt werden.

Die Isolierung eines modifizierten Fragments B aus herkömmlichem Diphtherietoxoid ist nicht möglich, da hier durch Einsatz von wesentlich höheren Formaldehydmengen eine kovalente Quervernetzung zwischen den Fragmenten A und B stattgefunden hat. Es besteht jedoch kein Hinderungsgrund, jede das nicht denaturierte Fragment B enthaltende Lösung erfindungsgemäß mit Aldehyden umzusetzen, um zu Derivaten mit den vorteilhaften Eigenschaften bezüglich Stabilität und Antigenität zu kommen.

Als Ausgangsmaterial werden Diphtherietoxinhaltige wäßrige Medien eingesetzt, wie sie auch für die Gewinnung des Fragments B verwendet werden, beispielsweise bezüglich Diphtherietoxin angereicherte mehr oder weniger vorgereinigte Kulturf iltrate, hochgereinigte Toxinpräparationen oder Fragment-B-Lösungen.

Proteolytische Enzyme, die bei der Herstellung des Fragments B Verwendung finden, sind Pronase, Pa-

i» pain, Subtilisin, vorzugsweise jedoch Trypsin in löslicher oder in einer an einen festen Träger gebundenen Form. Es hat sich als vorteilhaft erwiesen, die proteolytische Reaktion mit Hilfe eines Inhibitors, Trypsin beisielsweise mit einem Trypsin-Inhibitor aus tieri-

i"' sehen Organen oder Pflanzen abzustoppen. Bei Verwendung von trägergebundenen proteolytischen Enzymen erübrigt sich der Einsatz von Inhibitoren.

Als Disulfid-Brücken-spaltende Verbindungen werden ThioJverbindungen bevorzugt. Hierfür kom-

-'i> men beispielsweise in Frage Cystein, Mercaptoäthanol, Dithioerythrol, vorzugsweise jedoch Dithiothreitol.

Unter denaturierenden Agenzien im Sinne des vorgelegten Verfahrens sind chemische Verbindungen zu

.'"> verstehen, mit deren Hilfe eine Lösung von Wasserstoffbindungen in Proteinmolekülen bewerkstelligt werden kann. Bekannte Wasserstoffbindungen-lösende Agenzien sind beispielsweise Harnstoff oder Guanidinhydrochlorid.

in Von Harnstoff ist bekannt, daß das Fragment B mit dessen Hilfe bei Konzentration >0,6 M in Lösung gehalten werden kann. Vorteilhaft werden etwa 4-6 M Harnstoff oder etwa 2-4 M Guanidinhydrochlorid verwendet.

ti Gegenstand der Erfindung sind auch Mittel, die die erfindungsgemäßen Diphtherietoxin-Derivate enthalten, insbesondere Diphtherie-Impfstoffe zur Prophylaxe der Diphtherie-Erkrankung oder zur Herstellung von Diphtherie-Antiseren, aber auch dia-

■iii gnostische Präparate. Zur Erhöhung der Lösungsstabilität des erfindungsgemäß hergestellten Produkts kann es zweckmäßig sein, dem physiologisch verträglichen, wäßrigen Medium, in dem dieses gelöst ist, Aminosäuren oder Kohlenhydrate zuzusetzen.

ii Die Eignung der Produkte als Impfstoffe wird im folgenden durch Versuche bewiesen, die eine gute Verträglichkeit und Wirksamkeit des Produkts bescheinigen.

.„ Verträglichkeitstest

Da bei dem herkömmlichen Formaldehyd-Toxoid insbesondere auf allergische Reaktionen vom verzögerten Typ geachtet werden muß, wurde das Produkt gemäß der Erfindung mit dem herkömmlichen Toxoid ,ι im folgenden Versuch verglichen:

Gruppen ä 10 Meerschweinchen erhielten:

A. 0,5 ml des Produkts nach Beispiel 1 mit 0,1 mg Protein/ml, an 0,02% Al(OH)₃-GeI absorbiert, und 3 Wochen später 0,5 ml desselben Antigens

w) mit 0,04 mg/ml ohne Al(OH)₃.

B. 0,5 ml eines herkömmlichen Formaldehyd-ToxoidsmitO.l mg Protein/ml, an 0,02% Al(OH), adsorbiert, und 3 Wochen später 0,5 ml desselben Antigens mit 0,04 mg/ml ohne Al(OH)₃.

h^ri . 2 Tage später erhielten sämtliche Tiere 0,1 ml der beiden Antigene intrakutan in drei Verdünnungen (10 μg/ml, 1 μg/ml und 0.1 μg/ml). Die Hautdicke an der Injektionsstelle wurde nach 0,24 und 48 Stunden

gemessen. Die durchschnittliche Zunahme der Hautdicke als Maß für die allergische Reaktion war mit dem herkömmlichen Toxoid größer als bei dem erfindungsgemäßen Produkt.

Durchschnittliche Zunahme der Hautdicke in nach Injektion, gemessen mit Kutimeter

autdickenmeßgerät der Fa. Hauptner):

V₁₀ mm

A. Mit dem Produkt gemäß

Erfindung immunisierte Tiere Reaktion

24 Std. 48 Std.

Challenge mit erfindungs	5,3	0,16
gemäßem Produkt
Challenge mit herkömml.	7,0	1,8
Toxoid
Mit dem herkömmlichen
Toxoid immunisierte Tiere
Challenge mit erfindungs	5,7	3,0
gemäßem Produkt
Challenge mit herkömml.	9,1	4,9
Toxoid	Wirksamkeitstest

Gruppen ä 5 Meerschweinchen erhielten subkutan 0,5 ml (20 μg) einer Suspension des Produkts nach Beispiel 1, adsorbiert an 0,2% Al(OH)₃-GeI. 4 Wochen später wurden die Tiere mit 0,3 mg Diphtherietoxin, entspr. 10 minimal-tödlicher Dosen (= dim = dosis letalis minima), vergiftet. Sämtliche Tiere überlebten die Vergiftung. Dasselbe Produkt verabreicht als adsorbatfreier Immpfstoff mit 100 μg/Tier, führte zu einer Überlebensrate von 20 %.

Um einen Vergleich mit der Situation der Menschen ziehen zu können, die schon einen Diphtherieantitoxintiter haben, wurden Gruppen ä 5 Meerschweinchen mit herkömmlichem Toxoid vorimmunisiert. Die Dosis des herkömmlichen Impfstoffes wurde so gewählt, daß der Antitoxintiter nach 28 Tagen stets unter 0,125 ΙΕ/ml Serum betrug. Am Tag 28 wurden Antigene, die laut den Beispielen hergestellt worden waren, in unterschiedlichen Dosen als adsorbatfreie Impfstoffe verabreicht und der Antitoxintiter 10 Tage später ermittelt. Tiere, die 0,2-0,4 μg/Tier des Produkts laut Beispiel 2 bekommen hatten, zeigten eine Erhöhung des Antitoxintiters um das 30-60fache.

Die Erfindung soll an den nachstehenden Beispielen näher erläutert werden.

Beispiel 1

Diphtherietoxin (100000 Flockungseinheiten = Lf-Einheiten, entspr. ca. 270 mg Protein) wird als 0,1% Proteinlösung in 0,1 M Phosphatpuffer, pH 7,8 mit Formaldehyd bis zu einer Endkonzentration von 0,015 M Aldehyd versetze und 16 Stunden bei 4° C stehen gelassen. Die Lösung wird in einen Dialysierschlauch gefüllt und anschließend gegen die lOfache Menge von 0,1 M Trishydroxymethylaminomethan-HCl-Puffer (TRIS) von pH 8,0 dialyciert, danach mit Trypsin (2 μg/ml) in Gegenwart von Dithiothreitol (DTT) (1,5 mg/ml) während 60 Minuten bei 37° C inkubiert und anschließend mit Trypsininhibitor aus Rinderlunge (3 μg/ml) versetzt. Nach Ankoiizentrierung der Lösung auf eine Endkonzentration von 10 mg Protein pro ml auf einem Ultrafilter wird Harnstoff bis zu einer Konzentration von 6 M/l hinzugefügt und die Lösung auf eine Säule (4,5 X 100 cm) von Sephadex® G-150 (Warenzeichen der Fa. Pharmacia, Uppsala), äquilibriert mit 6 M Harnstoti in 0,1 M Trispuffer, pH 8,0 und DTT 0,001 M, aufgetragen. Die Elution erfolgt mit dem Äquilibrierungsgemisch. Bei der Chromatographie werden durch Messung der UV-Absorption bei 280 nm drei Proteinpeaks erkennbar. Der erste, kleinste Peak stellte hochmolekulares Material dar und wird verworfen. Der zweite Peak enthält das Derivat des Fragments B. Es kann zur Weiterreinigung einer Rechromatographie unterzogen werden. Peak 3 enthält das Fragment A.

Die Lösung des isolierten Derivates des Fragments B wird mit 0,1 M Phosphatpuffer, pH 7,8 auf 500 ml verdünnt und anschließend gegen denselben Puffer so lange dialysiert, bis eine qualitative Harnstoff-Analyse negativ wird. Die Formaldehydkonzentration der Harnstoff-freien Lösung des Derivates des Fragments B wird anschließend auf 0,07 M gebracht und die Lösung wird sodann 21 Tage bei 37° C inkubiert. Nach einer abschließenden Dialyse gegen 0,15 M NaCl zur Entfernung von freiem Formaldehyd wird das modifizierte Derivat des Fragments B gewonnen. Es kann durch Ultrafiltration ankonzentriert und zu einem Impfstoff in bekannter Weise verarbeitetwerden. Dabei kann als Stabilisator Glycin (0,1 M) oder Lysin (0,05 M) verwendet werden.

Statt Formaldehyd kann auf die molare Aldehydmenge, bezogen auf Glutardialdehyxd, Propionaldehyd oder Butyraldehyd, entweder in beiden Stufen oder auch nur in einer Stufe verwendet werden, um zu einem Produkt mit den gleichen Eigenschaften der guten Löslichkeit und der Antigenität kommen zu können.

Beispiel 2

Diphtherietoxin (100000 Flockungseinheiten = Lf-Einheiten, entspr. ca. 270 mg Protein) wird als 0,l%ige Proteinlösung in 0,1 M Trishydroxymethylaminomethan-HCl-Puffer von pH-Wert 8,0 dialysiert, danach mit Trypsin (2 μg/ml) in Gegenwart von Dithioerythrit (DTE) (1,5 mg/ml) während 60 Minuten bei 37 ° C inkubiert und anschließend mit Trypsininhibitor aus Rinderlunge (3 μg/ml) versetzt. Danach wird Formaldehyd bis zu einer Konzentration von 0,015 M Aldehyd zu der Lösung zugesetzt und 16 Stunden bei 4° C stehen gelassen. Zu dieser Lösung wird Harnstoff bis zu einer Konzentration von 6 M/l hinzugefügt und die Gewinnung des Derivates des Fragments B wie im Beispiel 1 vorgenommen. Gewünschtenfalls kann die anschließende Umsetzung mit 0,07 M Formaldehyd ebenfalls wie im Beispiel 1 erfolgen.

Beispiel 3

Diphtherietoxin (100000 Flockungseinheiten = Lf-Einheiten, entspr. ca. 270 mg Protein) wird als 0,1 %ige Proteinlösung, unter Weglassung der Vorbehandlung mit 0,015 M Aldehyd, mit Trypsin in Gegenwart von Dithiothreitol wie im Beispiel 1 behandelt und wie dort für die Umsetzung des Derivates des Fragments B beschrieben mit 0,07 M Aldehyd weiter verarbeitet und schließlich das modifizierte Derivat des Fragments B gewonnen.

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zum Herstellen von Derivaten des Fragments B des Diphtherietoxins die in physiologisch verträglichen Lösungen beständig sind, d adurch gekennzeichnet, daß man eine wäßrige Lösung des Diphtherietoxins vor oder nach der Behandlung mit einem proteolytischen Enzym in Gegenwart einer Disulfidbrücken spaltenden Verbindung mit einem aliphatischen Mono- oder Dialdehyd der Kettenlänge von i-6 Kohlenstoffatomen in einer Aldehydkonzentration von 0,0015 M bis 0,035 M bei 1-20° C, 5 Minuten bis 50 Stunden reagieren läßt, die Derivate des Fragments B aus der erhaltenen Lösung in Gegenwart eines denaturierenden Agens mit proteinchemischen Isolierungsverfahren gewinnt und gegebenenfalls vom denaturierenden Agens abtrennt.

2. Verfahren zum Herstellen von Derivaten des Fragments B des Diphtherietoxins nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Aldehydbehandlung an von denaturierendem Agens freiem Fragment B durchführt.

3. Verfahren zur Modifizierung der nach Anspruch 1 erhaltenen Derivate des Fragments B des Diphtherietoxins, dadurch gekennzeichnet, daß man diese mit einem aliphatischen Mono- oder Dialdehyd der Kettenlänge von 1-6 Kohlenstoffatomen bis zu einer Aldehyd-Konzentration von 0,035 M bis 0,35 M versetzt und 14-28 Tage bei 20-37° C stehen läßt, den Aldehyd entfernt und das modifizierte Derivat des Fragments B gewinnt.

4. Verfahren zum Herstellen der nach Anspruch 3 erhältlichen modifizierten Derivate des Fragments B des Diphtherietoxins, dadurch gekennzeichnet, daß man die Aldehydbehandlung nach Anspruch 3 an von denaturierendem Agens freiem Fragment B durchführt.

5. Diphtherie-Impfstoff, enthaltend eines der nach den Ansprüchen 1-4 erhaltenen Derivate.