CH628246A5

CH628246A5 - Verfahren zur herstellung eines schuetzenden pertussis-antigens.

Info

Publication number: CH628246A5
Application number: CH1660875A
Authority: CH
Inventors: Torsten Bertil Dr Helting
Original assignee: Behringwerke Ag
Priority date: 1974-12-24
Filing date: 1975-12-22
Publication date: 1982-02-26
Also published as: IL48730A0; US4029766A; MX3785E; DE2461439B2; DK586575A; IL48730A; ES443624A1; ATA980275A; CA1059027A; AU8780875A; DK143317C; AT355203B; IE42622B1; GB1537849A; IE42622L; SE7514601L; DE2461439C3; JPS5188623A; DE2461439A1; SE431057B

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines schützenden Antigens von Bordetella pertussis.

Die herkömmlichen Pertussis-Impfstoffe zur aktiven Immunisierung gegen Keuchhusten enthalten meist abgetötete Keime der Bordetella pertussis. Von den Pertussiskeimen ist bekannt, dass sie beim Impfling häufig lokal an der Impfstelle Schmerzen und Entzündungen, aber auch Fieber und in seltenen Fällen zudem neurologische Komplikationen, wie die gefürchtete Enzephalitis, verursachen.

Es ist deshalb schon versucht worden, den keimhaltigen Impfstoff durch einen Extraktimpfstoff mit dem Ziel einer besseren Verträglichkeit zu ersetzen. Die mehrfach beschriebene Herstellung von Extrakten aus Pertussiskeimen mittels Salzlösungen führt zwar zu einer Solubilisierung eines geringen Teils des Schutzantigenkomplexes; die Ausbeuten sind relativ niedrig, die Extrakte bestehen wie die Keime aus einer Vielzahl von Komponenten, die zum Teil toxisch sind und zu keiner Verbesserung der Verträglichkeit des Impfstoffes beim Impfling führen.

Eine weitere Reinigung der Salzextrakte ist wegen der Polydispersität des antigenen Materials stark eingeschränkt. Mit den üblichen biochemischen Reinigungsverfahren erreicht man im wesentlichen eine Verteilung der schützenden Aktivität in mehrere Fraktionen, ohne dabei die spezifische Schutzaktivität wesentlich erhöhen zu können.

Zur Verbesserung der Ausbeute wurde auch schon versucht, die Pertussiskeime beispielsweise mit Ultraschall auf-zuschliessen. Abgesehen von dem erhöhten apparativen Aufwand ist dieses Verfahren ebenso unbefriedigend, weil damit das Problem der höheren Reinheit des Schutzantigens nicht gelöst werden konnte.

Es ist hier erwähnenswert, dass der sogenannte histaminsensibilisierende Faktor der Pertussiskeime durch Behandlung mit einer wässrigen Kochsalzlösung, die 4 Mol Harnstoff enthält, gewonnen werden kann. Dabei war es nicht möglich, den Harnstoff ohne Aktivitätsverlust in bezug auf Histaminsensibilisierung zu entfernen. Es ist strittig, ob die histaminsensibilisierende Aktivität dem Schutzantigen ganz oder teilweise entspricht. Neben Hinweisen darauf, dass es sich um verschiedene Komponenten handelt, ist von Y. Sato, Symp. Series Immunobiol. Standard, Vol. 13, S. 214 bis 220, beschrieben worden, dass die Behandlung eines 22S-Pertussis-Antigens mit Harnstoff zu einer Zerstörung der schützenden Aktivität des Antigens führt.

Der vorliegenden Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, aus Pertussis-Keimen einen schützenden Antigen-Komplex in löslicher Form in grösseren Ausbeuten und gegebenenfalls höherer Reinheit als mit Hülfe des bisher bekannten Verfahren zu gewinnen und so ein gereinigtes Antigen zu erhalten, das als wesentliche aktive Komponente in Pertussisimpfstoffen verwendet werden kann.

Es wurde nun gefunden, dass diese Aufgabe mit Hilfe eines Verfahrens gelöst werden kann, das im wesentlichen darauf beruht, dass Pertussiskeime mit denaturierenden Agentien behandelt werden, worauf das solubilisierte Material nach Abtrennung der Keime, gewünschtenfalls sofort oder nach weiterer Reinigung, im denaturierenden Milieu, an einem wasserunlöslichen Trägermaterial adsorbiert wird und anschliessend das Denaturierungsmittel von der wässrigen Suspension des schützenden Antigens abgetrennt wird.

Gegenstand der Erfindung ist daher das in Patentanspruch 1 definierte Verfahren.

Die Behandlung der Pertussis-Keime mit der genannten wässrigen Lösung, die im Effekt zu einer Extraktion der Keime führt, kann im einfachsten Fall durch Stehenlassen der in der Suspension möglichst homogen suspendierten Keime erfolgen. Bei diesem Vorgehen muss jedoch mit den längsten Extraktionszeiten gerechnet werden. Schon ein sachtes Bewegen der Keime, wie es durch einfaches Rühren erreicht werden kann, verbessert den Wirkungsgrad der Extraktion. Geräte, wie sie für Homogenisierungszwecke bekannt sind, können zur Erhöhung der Ausbeute und zur Verkürzung der Zeit mit Vorteil eingesetzt werden. Je nach Art des verwendeten Bewegungsmittels beträgt die Extraktionsdauer in der Regel 0,5 bis 48 Stunden. Im Durchschnitt muss mit einer Extraktionsdauer von etwa 18 Stunden gerechnet werden.

Die Extraktionstemperatur beträgt zweckmässigerweise 1 bis 40°C, wobei Temperaturen unterhalb Raumtemperatur, etwa im Bereich von 1 bis 10°C, bevorzugt sind.

Die Mischung wird während der Dauer der Extraktion zweckmässigerweise bei einem pH-Wert von 6 bis 10, vorzugsweise bei pH 8, gehalten. Falls sich dieser pH-Wert nicht von allein einstellt, kann er durch Zusatz geeigneter Pufferlösungen geschaffen werden.

Die Trennung von Extrakt und Keimrückstand erfolgt zweckmässigerweise durch Zentrifugation. Auch Filtrationsvorrichtungen, die Mikroorganismen zurückzuhalten vermögen, sind zur Gewinnung des zellfreien Extraktes geeignet.

Es hat sich überraschend gezeigt, dass das schützende Antigen in einer Lösung, die Denaturierungsmittel enthält, die Eigenschaften eines relativ einheitlich aufgebauten Stoffes aufweist. Seine weitere Reinigung ist deshalb in Gegenwart des Denaturierungsmittels möglich. Eine geeignete

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Massnahme hierzu ist beispielsweise die Gelchromatographie, bei der eine Abtrennung von toxischen Komponenten vom schützenden Antigen erreicht werden kann, wenn die Entwicklung mit einem Denaturierungsmittel enthaltenden Puffer vorgenommen wird. Als Medium für die Gelchromatographie eignen sich insbesondere mit Epichlorhydrin vernetztes Dextran, im Handel als Sephadex® der Firma Pharmacia, Uppsala, sowie Copolymere von Acrylamid und Methylen-bis-acrylamid, im 'Handel als Bio-Gel P® der Firma Bio-Rad Laboratories, Richmond/USA.

Als Puffersubstanzen kommen allgemein die bei biochemischen Arbeiten zur Stabilisierung des pH-Wertes der Lösung eingesetzten Verbindungen in Betracht, vorteilhafterweise jene, die im Handbook of Biochemistry, Cleveland (Ohio), 2nd Edition, S. 238, beschrieben sind, z.B. Tris-(hy-droxymethyl)-aminomethan. Es hat sich als vorteilhaft erwiesen, den verwendeten Pufferlösungen geringe Mengen (etwa 1 bis 20 mMol) an sogenannten Chelat- oder Komplexbildnern, beispielsweise Äthylendiamin-tetraacetat (EDTA) zuzusetzen.

Die Wahl des zu verwendenden Adsorbens richtet sich im wesentlichen nach dem gewünschten Verwendungszweck des schützenden Antigens. Für die bevorzugten Anwendungsbereiche von Pertussisimpfstoffen wird als Adsorbens ein in der Vakzineherstellung erprobtes immunologisches Adjuvans bevorzugt. Dies kann anorganischen Uursprungs sein, wie Calciumphosphat oder Aluminiumoxid; vorzugsweise wird AIP04 und/oder Cy-Aluminiumhydroxid in einer Endkonzentration (Feststoffkonzentration im fertigen Produkt) von 0,05% bis 0,4% (w/v) verwendet. Es kommen jedoch auch organische Polymere, insbesondere polyanionische Adjuvan-tien in Frage, die in den Lösungen der vorliegenden Denaturierungsmittel unlöslich sind, z.B. Derivate der Polyacrylsäu-re. Ist eine Applikation an Menschen und Tieren nicht beabsichtigt, kann jedes beliebige für die Adsorption von Proteinen verwendbare Adsorbens der Lösung des schützenden Antigens zugefügt werden.

Die Entfernung des denaturierenden Mittels erfolgt zweckmässigerweise durch Dialyse. Da das schützende Antigen im physiologischen Milieu durch die Dialysemembran nicht durchtreten kann, wird bei zunehmendem Austritt des Denaturierungsmittels durch die Membran das schützende Antigen auf dem Adsorbens niedergeschlagen.

Falls ein steriles Präparat gewünscht wird, kann das gesamte Verfahren von der Extraktion bis zum fertigen adsorbierten und von Denaturierungsmittel freien Material unter sterilen Bedingungen durchgeführt werden. Alternativ kann vor der Zugabe des Adsorbens eine Keimfiltration vorgenommen werden. In diesem Fall hat die weitere Aufarbeitung unter sterilen Bedingungen zu erfolgen.

Unter Denaturierungsmitteln im Sinne der Erfindung sind chemische Verbindungen zu verstehen, mit deren Hilfe eine Dissoziation von Proteinmolekülen in Untereinheiten, insbesondere durch Lösen von Wasserstoffbindungen, bewirkt werden kann. Besonders geeignet sind hierfür Harnstoff oder Guanidin sowie deren Salze, insbesondere Guanidinhydro-chlorid. Die Denaturierungsmittel werden zweckmässigerweise in einer Konzentration von 2 bis 6, vorzugsweise 4 bis 6, Mol/1, bezogen auf die Gesamtlösung, eingesetzt.

Als Neutralsalze werden die wasserlöslichen Alkalihalogenide, wie NaCl oder KCl, bevorzugt. Sie werden in der Regel in einer Konzentration von 0,5 bis 3, vorzugsweise 1, Mol/1, bezogen auf die Gesamtlösung, eingesetzt. Denaturierungsmittel und Neutralsalze haben bei der Extraktion des schützenden Antigens eine synergistische Wirkung.

Als Ausgangsmaterial für die Durchführung des erfin-dungsmässen Verfahrens werden Keime von Bordetella pertussis verwendet. Sie können nach bekannten Methoden gewonnen werden, z.B. durch Züchten in Cohen-Wheeler-Nähr-lösung, bei etwa 35°C unter Rühren und anschliessende Säurefällung oder Fällung mit organischen Lösungsmitteln oder durch Zentrifugieren. Bei der Anreicherung der Keime geht 5 man beispielsweise so vor, dass man eine Fermenter-Kultur von Bordetella pertussis einer sauren Fällung bei pH 3 bis 5, vorzugsweise bei pH 4, unterwirft. Zur Säurefällung eignen sich praktisch alle Mineralsäuren, wobei In Salzsäure bevorzugt wird, ferner organische Säuren, z.B. Essigsäure, io Keime, die durch Zentrifugieren vom Kulturmedium abgetrennt wurden, sind in gleicher Weise geeignet, wie durch Fällung mit Aceton oder durch Säurefällung gewonnene. Die Keime werden vorteilhafterweise in Form einer wässrigen Suspension eingesetzt. Die Konzentration kann 50 X 109 lì bis 1000 X 109, vorzugsweise 100 X 109 bis 400 X 109, Keime pro ml betragen.

Die Bestimmung der Wirksamkeit von Pertussisimpfstoffen erfolgt im Tierversuch nach einem von Kendrick im Jahre 1947 angegebenen Verfahren [P. L. Kendrick, G. El-2o dering, M. K. Dixon und J. Misner, Amer. J. Pubi. Health 37 (1947) 803 und Fed. Reg. 33 (1968) Nr. 118, 8818, Paragraph 73 404]. Hierbei werden je 18 Mäuse mit dem Pertussis-Antigen in drei Verdünnungsstufen immunisiert. Nach 18 Tagen wird dann die belastungsfähige Immunität durch 25 eine intracerebrale Infektion mit 200 LD50 lebenden Keimen von Bordetella pertussis geprüft. Als Standard-Präparat wird stets eine Vakzine mit bekanntem Schutzwert mitgeführt. Der in diesem Test gefundene Schutzwert ist ein Mass für die schützende Wirkung des Impfstoffes am Menschen [vgl. 30 hierzu Medicai Res. Council Brit. Med. J. Nr. 5128 (1959) 994],

Bei Extraktion von Pertussis-Keimsuspensionen mit einer Keimdichte von 100 X 109 Keimen pro ml je nach den angewandten Bedingungen des hier beschriebenen Verfahrens 35 wurden Werte von 25 bis 75 IE/ml gefunden. Ein Impfstoff mit mindestens 8 IE/ml wird als wirksamer Impfstoff allgemein anerkannt.

Die Toxizität wird nach den Richtlinien des U. S. Department of Health, Education and Weifare bestimmt: 40 10 Mäuse erhalten 0,5 ml der 1:2 verdünnten zu prüfenden Pertussis-Vakzine. Gemäss den Forderungen des National Institutes of Health (NIH) in Federai Reg. 33 (1968) Nr. 118, 8818, Paragraph 73 403, werden Gewichtszunahmen von 3 g/7 Tage gefordert. Bei einem erfindungsgemäss her-45 gestellten Pertussis-Antigen beträgt die durchschnittliche Gewichtszunahme der Tiere nach 72 Stunden 1 bis 3 g und nach 7 Tagen 5 bis 6 g. Es enthält somit keine toxischen Anteile der Pertussis-Keime und ist gut verträglich.

Das erfindungsgemäss erhältliche schützende Pertussis-50 Antigen kann zur Herstellung von pharmazeutischen Zubereitungen, insbesondere von Pertussisimpfstoffen zur Prophylaxe des Keuchhustens, sowie zur Herstellung von therapeutischen oder diagnostisch verwendbaren Pertussis-Anti-seren verwendet werden. Die unter Verwendung des erfin-55 dungsgemäss erhältlich schützenden Antigens hergestellten Impfstoffe sind zur parenteralen und oralen Applikation geeignet.

Die Lösung bzw. Suspension des Antigens kann mit anti-mikrobiellen Konservierungsmitteln, wie Timerfon-natrium, 60 versetzt werden.

Das Pertussis-Antigen kann zur Herstellung eines polyvalenten Impfstoffes mit anderen Antigenen und bzw. oder Toxoiden in herkömmlicher Weise vermischt werden.

Die vorliegende Erfindung stellt einen wesentlichen 65 Fortschritt bei der 'Herstellung des schützenden Pertussis-Antigens bzw. von Pertussis-Impfstoffen dar. Das Verfahren ist einfach. Die erzielte Schutzaktivität des absorbierten Extrakt-Antigens ist im Hinblick auf bisher aus der Lite

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ratur bekannten Daten überraschend hoch. Die hohe Ausbeute im Extrakt wird auch dadurch verdeutlicht, dass Keime, die einer Extraktion mit 6-molarem Harnstoff unterworfen worden waren, einen Verlust von 80% oder mehr ihrer Schutzaktivität aufweisen, während bei salzextrahierten Keimen nach Abtrennung des Extraktes lediglich ein Aktivitätsverlust von 10 bis 20% feststellbar war.

Dadurch, dass der Antigen-Extrakt in einem denaturierenden Milieu keine wesentliche Polydispersität aufweist, ist eine Abtrennung von toxischen Komponenten möglich. Dementsprechend ist eine bedeutende Steigerung der Verträglichkeit des Antigens bei seiner Applikation bei Menschen, insbesondere Kindern, zu erwarten.

Das Verfahren wird in den folgenden Beispielen erläutert.

Beispiel 1

Zu 40 1 einer Pertussis-Keimsuspension mit 100 X 109 K/ml werden 6 1 1 M Tris(hydroxymethyl)aminomethan--HCl-Puffer pH 8,0 enthaltend 50 mM EDTA hinzugefügt. Nach dem Mischen werden 14,4 kg Harnstoff und 3,48 kg NaCl zugesetzt, das Volumen wird mit Wasser auf ein Volumen von 60 1 eingestellt und die Suspension über Nacht mit einem Magnetrührer gerührt. Nach Entfernung der Keime durch Zentrifugation (Sharpless-Durchlaufzentrifuge) werden 3 1 einer 2% igen Suspension von A1P04 im Gemisch mit einer Suspension von 1 % Al(OH)3 hinzugefügt. Der Harnstoff wird anschliessend durch Dialyse gegen sterile 0,15 M NaCl, in einem Hollow-Fiber-Gerät der Firma Ami-con, entfernt. Nach Absitzen des Adsorbats wird das Gesamtvolumen mit isotonischer Kochsalzlösung auf 40 1 eingestellt. Ein so hergestelltes Immunogen brachte im Schütztest nach Kendrick 25 IE/ml.

Ein aus dem gleichen Ausgangsmaterial durch Behand: lung der Keime mit 0,5 M NaCl hergestellter Extrakt zeigte 5 im Schutzversuch lediglich 4,5 IE/ml.

An der Maus gemessene Toxizität: Tag 3 + 3,2 g; Tag 7 + 5,8 g.

Beispiel 2

io Bei einem Extraktionsverfahren nach Beispiel 1, jedoch ausgehend von 200 X 109 K/ml und einer wässrigen Lösung von 6 M Guanidin-Hydrochlorid + 1 M NaCl wurde der Schutzwert des Extraktes mit 76 IE/ml gemessen.

An der Maus gemessene Toxizität: Tag 3 + 1,0 g; Tag 15 7 + 5,2 g.

Beispiel 3

Der Extrakt gewonnen laut Beispiel 1, jedoch mit 9,6 kg Harnstoff statt 14,4 kg wird an einem Ultrafilter auf 2 1 eingeengt und auf eine Säule von Sephadex® G-150, äquilibriert 20 mit dem Extraktionspuffer (enthaltend 4 M Harnstoff), aufgetragen. Der eingeengte Extrakt brachte vor der Chromatographie bei einem zu 80 X 109 K/ml äquivalenten Volumen 8,25 IE/ml entsprechend 130 IE/mg Protein. Das Material entsprechend dem Ausschlussvolumen der Säule zu 25 einem Molekulargewicht von ca. 90 000 wird gepolt und der Harnstoff durch Dialyse gegen 0,15 M Kochsalzlösung entfernt. Die nach der Chromatographie gewonnene Fraktion wurde auf ein der Keimdichte von 360 X 109 K/ml äquivalentes Volumen eingeengt und brächte in dem Schutz-30 versuch 84,3 IE/ml entsprechend 525 IE/mg Protein.

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Claims

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1. Verfahren zur Herstellung eines schützenden Antigens von Bordetella pertussis, dadurch gekennzeichnet, dass man Keime von Bordetella pertussis mit einer wässrigen Lösung eines, die Dissoziation von Proteinmolekülen in Untereinheiten bewirkenden, Denaturierungsmittels und eines Neutralsalzes behandelt, den flüssigen Überstand vom Rückstand der Keime abtrennt, ein wasserunlösliches Adsorbens zugibt und das Denaturierungsmittel von der wässrigen Suspension des schützenden Antigens abtrennt.

2. Verfahren nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Keime in wässriger Lösung in einer Konzentration von 50 X 109 bis 1000 X 109/ml eingesetzt werden.

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PATENTANSPRÜCHE

3. Verfahren nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man als Denaturierungsmittel Harnstoff oder Guanidin oder deren Salze verwendet.

4. Verfahren nach Patentanspruch 1 oder 3, dadurch gekennzeichnet, dass man das Denaturierungsmittel in einer Konzentration von 2 bis 6 Mol/1 einsetzt.

5. Verfahren nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man als Neutralsalz, Natrium- und/oder Kaliumchlorid verwendet.

6. Verfahren nach Patentanspruch 1 oder 5, dadurch gekennzeichnet, dass man das Neutralsalz in einer Konzentration von 0,3 bis 3 Mol/1 einsetzt.

7. Verfahren nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man bei einem p'H-Wert von 6 bis 10 arbeitet.

8. Verfahren nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man bei einer Temperatur von 1 bis 40°C arbeitet.

9. Verfahren nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man den flüssigen Überstand in Gegenwart des Denaturierungsmittels vor dem Zusatz des Adsorbens reinigt.

10. Verfahrennach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man als wasserunlösliches Adsorbens A1P04 und/oder Cy-Aluminiumhydroxyd in einer Konzentration von 0,05 bis 0,2 Gew.-/Vol.-% verwendet.