DE2461439A1 - Schuetzendes pertussis-antigen und verfahren zu seiner herstellung sowie jenes enthaltende mittel - Google Patents

Schuetzendes pertussis-antigen und verfahren zu seiner herstellung sowie jenes enthaltende mittel

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DE2461439A1 DE19742461439 DE2461439A DE2461439A1 DE 2461439 A1 DE2461439 A1 DE 2461439A1 DE 19742461439 DE19742461439 DE 19742461439 DE 2461439 A DE2461439 A DE 2461439A DE 2461439 A1 DE2461439 A1 DE 2461439A1
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Description

2A6U39
BFHRINGV/ΞΡΚΕ AKTIENGESELLSCHAFT, Karburr (Lahn)
Aktenzeichen: Hoe 7^/B 032 - Ka 214
Datum: 23. Dezember 1974
Schützendes Pertussis-Antigen und Verfahren zu seiner Herstellung sowie jenes enthaltende Mittel
Die Erfindung betrifft ein adsorbiertes schützendes Antigen von Eordetella pertussis sowie ein Verfahren zu dessen Herstellung durch Extraktion der Keime und eine anschliessend e Adsorption de"" extrahierten Antigene an ein Trägermaterial, ferner Mittel, insbesondere Pertussis-Impfstoffe, welche diese adsorbierten Antigene enthalten.
Die herkömmlichen Pertussis-Impfstoffe zur aktiven Immunisierung gegen Keuchhusten enthalten meist abgetötete Keime der Bordetella pertussis. Von den Pertussiskeimen ist bekannt, dass sie beim Impfling häufig lokal an der Impfstelle Schmerzen und Entzündungenj aber auch Fieber und in seltenen Fällen zudem neurologische Komplikationen wie die gefürchtete Enze-JL/ J. XCX-L. J- VJ- Ξ "C" jT*^-iX^ GsJ^V- AiOi* ·
Es ist deshalb schon versucht worden, den keimhaltigen Impfstoff durch einen Extraktimpfstoff mit dem Ziel einer -besseren Verträglichkeit zu ersetzen. Die mehrfach beschriebene Herstellung von Extrakten aus Pertussislteimen mittels Salzlösungen führt z.wt zu einer Solubilisierung eines geringen Teils des
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Schutzantigenkomplexes; die Ausbeuten sind relativ niedrig, die Extrakte bestehen wie die Keime aus einer Vielzahl von · Komponenten, die z.T. toxisch sind und zu keiner Verbesserurig ,% der Verträglichkeit des Impfstoffes" beim Impfling "führen.
Eine v/eitere Reinigung der Salzextrakte ist v/egen der PoIydicpersität des antirenen Materials stark eingeschränkt. Kit den üblichen biochemischen Reinigungsverfahren erreicht man im wesentlichen eine Verteilung der schützenden Aktivität in mehrere Fraktionen, ohne dabei die spezifische Schutzaktivität wesentlich erhöhen zu können.
Zur Verbesserung der Ausbeute wurde auch schon versucht, die Pertussiskeime beispielsweise mit Ultraschall aufzuschliessen. Abgesehen \ron dem erhöhten apparativen Aufv/and ist dieses Verfahren ebenso urbefriedigend, weil danit das Problem der höheren Reinheit des Schutzantigens nicht gelöst werden konnte.
Es ist hier erwähnenswert, dass der sogenannte histaminsensibilisierende Faktor der Fertussiskeime durch Behandlung mit einer wässrigen Kochsalzlösung, die k i>i Harnstoff enthält, gewonnen werden kann. Dabei war es nicht möglich, den Harnstoff ohne Aktivitätsverlust in bezug auf Histaminsensibilisierung zu entfernen. Es ist strittig, ob die histaminsensibilisierende Aktivität dem Schutzantigen ganz oder teilweise entspricht. Neben Hinweisen darauf, dass es sich um verschiedene Komponenten handelt, ist von Tato, Ύ., Symp. Series Immunobiol. Standard., Vol. 13, S. 214-220, beschrieben, dass die Behandlung eines 22 S-Pertussisantigens mit Harnstoff zu einer Zerstörung der schützenden Aktivität führt.
Der hier vorgelegten Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, einen schützenden Antigenkomplex in löslicher Form aus Pertussiskeimen in grösseren Ausbeuten und ggf. höherer Reinheit als bisher zu gewinnen und das gereinigte Antigen als wesentlich wirksamen Anteil in Fertussisimpfstoffen zu verwenden.
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Es wurde gefunden, daß dies durch ein Verfahren erreicht werden kann, dessen Kernpunkt darin besteht, daß Pertussiskeitne mit Lösungen denaturierender Agenzien behandelt werden, die Keime abgetrennt und das solubilisierte Material entweder sofort oder nach weiterer Reinigung im denaturierenden Milieu an ein wasserunlösliches Trägermaterial adsorbiert wird.
Gegenstand der Erfindung ist demnach ein Verfahren zur Herstellung eines adsorbierten schützenden Antigens von Bordetella pertussis, dadurch gekennzeichnet, daß man Keime von Bordetella pertussis mit einer wässrigen Lösung eines Denaturierungsmittels und eines Neutralsalzes mischt, den flüssigon Überstand vom Rückstand der Keime abtrennt, ihm, gegebenenfalls
nach vorheriger Reinigung, in Gegenwart des Denaturierungsmittels ein wasserunlösliches Adsorptionsmittel zusetzt und danach das Denaturierungsmittel von der wässrigen Suspension d 'S schützenden Antigens abtrennt.
Die Behandlung der Pertussiskeime mit der Lösung, die zu einer Extraktion der Keime führt, erfolgt im einfachsten Fall durch Stehenlassen der in der Lösung möglichst homogen suspendierten Keime. Bei dieser Maßnahme muß jedoch mit den längsten Extraktionszeiten gerechnet werden. Schon ein sachtes Bewegen der Keime, wie es durch einfaches Rühren erreicht werden kann, verbessert den Wirkungsgrad der Extraktion. Geräte, wie sie für Homogenisierungszwecke bekannt sind, können zur Erhöhung der Ausbeute und zur Verkürzung dir Zeit mit Vorteil eingesetzt werden. Je nach dem angewandten Bewegungsinittel beträgt die Extraktionszeit etwa 0,5 - 48 Stunden. Im Durchschnitt muß mit einer Extraktionsdauer von 18 Stunden gerechnet werden.
Die Extraktionstemperatur beträgt zweckmässig 1 - ^O C. Temperaturen unter Raumtemperatur, etwa im Bereich zwischen 1 und 10 Cj sind bevorzugt.
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Die Mischung wird während der Extraktioriszeit bei einem pH-Wert zwischen 6 und 10, vorzugsweise bei pH 8 gehalten. Falls .sicli dieser pH-Wert nicht von allein einstellt, kann er durch
Zusatz geeigneter Pu fferlösungen geschaffen werden.
Die Trennung von Extrakt und Keimrückstand erfolgt zweckmässig durch Zentrifugation. Auch Filtrationsvorrichtungen, die Mikroorganismen zurückzuhalten vermögen, sind zur Gewinnung des zellfreien Extraktes geeignet.
Es hat sich überraschend gezeigt, daß das schützende Antigen in einer Lösung, die Denaturierungsmittel enthält, die Eigenschaften eines relativ einheitlich aufgebauten Stoffes aufveist. Seine weitere Reinigung ist deshalb in Gegenwart des Denaturierungsmittels möglich. Eine geeignete Maßnahme hierzu ist beispielsweise die Gelchromatographie, bei der eine Abtrennung von toxischen Komponenten vom schützenden Antigen erreicht werden kann, wenn die Entwicklung mit einem Denaturierungsraittel enthaltenden Puffer vorgenommen wird. Als Medium für die Gelchromatographie eignen sich besonders mit Epichlorhydrin vernetztes Dextran, im Handel als Sephadex^ ' der Firma Pharmacia, Uppsala, oder Copolymere von Acrylamid
und Methylenbisacrylamid, im Handel als Bio-Gel Pv 'der Firma Bio-Rad Laboratories, Richmond/USA.
Als Puffersubstanzen im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens kommen die bei biochemischen Arbeiten zur Stabilisierung des pH-Wertes der Lösung eingesetzten chemischen Verbindungen. ±i Frage, vorteilhaft jene, die von N.E. Good et al=(1966) in Biochemistry 5, h67-h~7, beschrieben sind, beispielsweise Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan. Es hat sich als zweckmäßig erwiesen, den verwendeten P_ufferlösungen geringe Mengen (etwa 1-20 dim) an sogenannten Chelat- oder· Komplexbildern, beispielsweise Athylendiamin-tetraacetat (ΕΒΓΑ) zuzusetzen.
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Die Wahl des Adsorptionsmittels richtet sich im wesentlichen nach dem gewünschten Verwendungszweck des schützenden Antigens. Im Fälle des bevorzugten Anwendungsbereiches eines Pertussis-,Impfstoffes wird als Adsorbens ein in der Vakzineherstellung r':'4 erprobtes immunologisches Adjuvans bevorzugt· Dies kann anorganischen Ursprungs sein, wie Calciumphosphat oder Aluminiumoxid; vorzugsweise v/ird AlPO. und/oder Co^-Aluminiumhydroxid in einer Endkonzentration (Foststoffkonzentration im fertigen Produkt) von 0,05 <£ bis 0, ■'( ^(w/v)vervendet. Es kommen jedoch auch organische Polymere, insbesondere polyanionische Adjuvantien in Frage, die in den Lösungen der vorliegenden De—
naturierungsnii t teln unlöslich sind, z. B. Derivate der Polyarcylsäure. Ist eine Applikation an Menschen und Tieren nicht beabsichtigt, kann jedes beliebige für die Adsorption von Proteinen verwendete Adsorbens der Lösung des schützenden Antigens zugefügt werden.
Die Entfernung det, Denaturierungsmittels erfolgt zweckmässig durch Dialyse. Da das schützende Antigen im physiologischen Milieu durcii die Dialysemerabran nicht durchtreten kann, wird bei zunehmendem Austritt de3 Denaturierungsmittels durch die Membran das schützende Antigen auf dem Adsorbens niedergeschlagen.
■ Falls ein steriles Präparat gewünscht wird, Kann, die Aufarbeitung von der Extraktion bis zu dem adsorbierten Material unte'· sterilen Bedingungen erfolgen. Alternativ wird vor der Entfernung des Denaturierungsmittels und vor der Zugabe des adsorbens eine Keimfreifitration vorgenommen. Die weitere Aufarbeitung hat sodann anter sterilen Bedingungen zu erfolgen.
Unter Denaturierungsmitteln im Sinne des erfindungsgemässen Verfahrens sind chemische Verbindungen zu verstehen, mit deren Hilfe eine Dissoziation von Proteinmolekfi_len in Untereinheiten, insbesondere durch Lösung von Wasserstoffbindungen bewerk-
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stelli^t werden kann. Bef- mders geeignet sind hierfür Harnstoff odor Guanidin sowie deren Salze, insbesondere auch Guanidinhydrochlorid. Die Beraturierungsnirtel werden in Konzentrationen von 2-6 Mol/l, vorzugsweise 4-6 Mol/l bezogen auf die Gesamt lösung, angewandt.
An Neutralalzen werden bevorzugt die wasserlöslichen Alkaxihalogenide wie NaCl oder KCi und zi,ar in einer Konzentration von 0,5-3 Mol/l, vorzugsweise 1 fiol/l bezogen auf die Gesantlösung·. Denaturierungsmi ttel und i.eutral salze haben bei der Extraktion des schii czenden Antigens eine synergistische Wirkung.
Als Ausgangsmaterial für das erfindun^sgemässe Verfahren kommen Bordetella pertussis-Keime in Pra^e. Sie werden auf bekannte Weise beispielsweise durch Züchten in Cohen-¥heeler-!iähr·- iusung bei ca«. 35" C unter Rühren vermehrt und durch Säurefällung, durch Fällung mit organischer. Lösungsmitteln oder durch Zentrifugation gewonnen. Man geht bei der Anreicherung der Keime beispielsweise so vor, daß man die Bordetella pertussis-Fermesterkultür einer sauren Fällung bei pH 3 - 5> vorzugsweise pH 4, unterwirft. Zur Säurefällung sind alle Mineralsäuren, vorzugsweise 1 Ii Salzsäure- geeignet; ferner organische Säuren, z, B. Essigsäure. Keime, die durch Zentrifugation von dem Kulturmedium getrennt wurden, eignen, sich ebenso gut wie mit Hilfe von Aceton oder säuregefällte Keime. Die Keime werden vorteilhaft in wässriger Suspension eirige-
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setzt. Die Konzentration kann 5G-1Cr - 1000·Ί0, vorzugsweise
10C-IO^ ...h00·ιο° pro ml betragen.
Die Wirksamkeit von Pertussisimpfstoffen wird im Tierversuch nach einem von Kendrick 1947 angegebenen Verfahren durchgeführt (P.L. Kendrick, G. Eldcring, M.K. Dixon und J. Hisner, Amer.J.Publ.Health _3_7, 803 (19Z»7) und Fed. Reg. 33, No. 118, 8818, Paragraph 73.4o4 (1968)). Hierbei werden je 18 Mäuse mit dem Pertussisantigen in drei Verdünnujigsstufen immunisiert
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und die beiastungsfähige Immunität nach 13 Tagen durch eine intracerebrale Infektion mit 2OO LDs0 lebenden Keimen von B. pertussis geprüft. Als Standard-Präparat wird stets eine Vakzine mit bekanntem Schutzwert mitgeführt. Der in diesem Test gefundene Schutzwert ist ein Maß für die schützende Wirkung des Impfstoffes am Menschen (vgl. hierzu Medical Res. Council Brit. Med. J. No. 5123, 994 (1959)).
Bei Extraktion von Pertussis-Keimsuspensionen mit einer Keiüidichte von 100 - 109 Keimen pro ml je nach den angewandten Bedingungen des hier beschriebenen Verfahrens wurden Werte von 25 bis 7 5 ΙΕ/ml gefunden. Ein Impfstoff mit mindestens 8 ΙΕ/ml wird als wirksamer Impfstoff allgemein anerkannt.
Die Toxizität wird nach den Richtlinien des U.S. Department of Health. Education and Welfare bestimmt:
10 Mäuse erhalten 0,5 ml der 1:2 verdünnten zu prüfenden Pertussis-Vakzine. Gemäß den Forderungen der National Institutes of Health (NIH) in Federal Reg. 33_, No. 118, 8818, (1968), Paragraph 73-403, werden Gewichtszunahmen von 3 g/7 Tage gefordert. Bei einem erfindungsgemäß hergestellten Pertussis-Antigen beträgt die durchschnittliche Gewichtszunahme der Tiere nach 72 Stunden 1-3 g und nach 7 Tagen 5-6 g. Es enthält somit keine toxischen Anteile der Pertussis-Keime und ist gut verträglich.
Neben dem aufgezeigten Verfahren zur Herstellung des schützenden Pertussis-Antigens sind Gegenstand der Erfindung schützende Antigene, die durch Parameter zu kennzeichnen sind, welche sich durch ihre Herstellung nach d&m vorgelegten Verfahren ergeben.
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Schließlich sind Gegenstand der Erfindung Mittel, die das erfindungsgemäße schützende Pertussis-Antigen enthalten, insbesondere Pertussis-Impfstoffe zur Prophylaxe äss Keuchhustens oder zur Herstellung von therapeutisch oder diagnostisch verwendbaren Pertussis-Antisoren, aber auch diagnostische Präparate, die das schützende Pertussis-Antigen oder davon gewonnene Antiseren enthalten.
Die Suspension des Antigens kann mit antimikrobiellen Konservierungsmitteln v/ie Natrium-timerfonat versetzt v/erden. Das Pertussis-Antigen kann zur Herstellung eines polyvalenten Impfstoffes mit anderen Antigenen und bzw. oder Toxoiden in herkömmlicher Weise vermischt werden.
Die vorliegende Erfindung stellt einen wesentlichen Fortschritt bei dr^.r Herstellung des schützenden Pertussis-Antigens bzw. von Pertussis-Irpfstoffen dar. Das Verfahren ist einfach. Die erzielte Sclivtzaktivität des adsorbierten Extrakt-Antiger.s ist im Hinblick auf bisher aus der Literatur bekannten Daten überraschend hoch. Die hoho Ausbeute in dem Extrakt wird auch dadurch verdeutlicht, daß Keime, die einer 6M-Harnstoffextraktion unterzogen v/aren, 80% oder mehr ihrer Schutzaktivität verloren haben. Bei salzextrahierten Keimen dagegen . findet man nach /abtrennung des Extraktes lediglich einen Verlust von 10-20% an Schutzaktivität. Dadurch, daß der Antigen-Extrakt in einem denaturierenden Milieu keine wesentliche Polydispersität aufweist, ist eine Abtrennung von toxischen Komponenten möglich. Danach ist eine bedeutende Steigerung der Verträglichkeit des Antigens bei seiner Applikation bei Menschen, insbesondere Kindern, zu erwarten.
Das Verfahren wird in den folgender. Beispielen erläutert.
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A Ά-
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Beispiel 1
Zu 40 1 einer Pertussis-Kcimsuspcnsion mit 100 · 10 K/ml werden 6 1 1 M Tris(hydroxymethyl)aminomethan-HCl-Puffer pH 8,0 enthaltend 50 mM EDTA hinzugefügt. Nach dem Mischen werden 14,4 leg Ha . stoff und 3,48 kg NaCl zugesetzt, das Volumen wird mit Wasser auf ein Volumen von 60 1 eingestellt und die Sus. ,nsion über Nacht mit einem Magnetrührer gerührt. Nach Ent;irnung der Keime durch Zentrifugation (Sharpless-Durchlaufzentrifuge) werden 3 1 einer 2%igen C^pension von AlPO4 im Gemisch mit einer Suspension von 1% Al(OH)3 hinzugefügtDer Harnstoff wird anschließend durch Dialyse gegen sterile 0,15 M NaCl, in einem Hollow-Fibcr-Gerät der Fa. Amicon, entfernt. Nach Absitzen des Adsorbats wird das Gesamtvolumen mit isotonischer Kochsalzlösung auf 40 1 eingestellt. Ein so hergestelltes Immunogen brachte im Schutztest nach Kendrick 25 ΙΕ/ml.
Ein aus dem gleichen Ausgangsmaterial durch Behandlung der Keime mit 0,5 M NaCl hergestellter Extrakt zeigte im Schutzversuch lediglich 4,5 IE/ml.
An der Maus gemessene Toxizität: Tag 3 + 3,2 g; Tag 7 + 5,3 g.
Beispiel 2
Bei einem Extraktionsverfahren nach Beispiel 1, iedoch aus-
gehend von 200 · 10 K/ml und einer wäßrigen Lösung von 6 M Guanidin-Kydrochlorid + 1 M NaCl wu^de der Schutzwert des Extraktes mit 76 ΙΕ/ml ·<·-οε^:η.
An der Maus gemessene Tox i zi ι :i t.: Tag 3 +1,0 g; Tag 7 + 5.2 g
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Beispiel 3
Der Extrakt gewonnen laut Beispiel 1, jedoch mit 9,6 kg Harnstoff statt 14,4 kg wird an einem Ultrafilter auf 2 1 eingeengt und auf eine Säule von Sephadex * ' G-I50, äquilibriert mit dem Extraktionspuffer (enthaltend 4 M Harnstoff), aufgetragen. Der eingeengte Extrakt brachte vor der Chromatographie bei einem zu 80-10 K/ml äquivalenten \'olurnen 8,25 ΙΕ/ml entsprechend 130 ΙΕ/mg Protein. Das Material entsprechend dem Ausschlußvolumen der Säule bis zu einem Mojpkulargewicht von ca. 90.OOO wird gepoolt und dor Ho:...«stoff durch Dialyse gegen 0,15 M Kochsalzlösung entfernt, pie nach der Chromatographie gewonnene Fraktion wurde auf ein der Keiradichte von 3<5θ·1Ο k/ml äquivalenten Volumen eingeengt und bi-achte in dem Schutzversuch 84,3 ΙΕ/ml entsprechend 5^-J ΙΕ/ing r^uoein.
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Claims (1)

  1. iäs»
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    - 11 -
    PATENTANSPRÜCHE:
    Verfahren zur Herstellung eines adsorbierten scHützenden
    Antigens von Bordetella pertussis, dadurch gekennzeichnet, daß man Keime von Bordetella pertussis mit einer wässrigen Lösung eines Denaturierungsmittels und eines Neutralsalzes mischt, den flüssigen Überstand vom Rückstand der Keime
    abtrennt, ihm in Gegenwart des Denaturierungsmittels ein
    wasserunlösliches Adsorptionsmittel zusetzt und danach das Denaturierungsmittel von der wässrigen Suspension des
    adsorbier ten schützenden Antigens abtrennt.
    2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die
    Keime in wässriger Lösung in einer Konzentration von 50*10
    bis 1000*10 /ml eingesetzt werden.
    3· Verfahren nach Anspruch 1-2, dadurch gekennzeichnet, daß als Denaturierungsmittel Harnstoff oder Guanidin oder ein Harnstoff- oder Guanidinsalz verwendet wird.
    k. Verfahren nach Anspruch 1.-2 ,dadurch gekennzeichnet, daß der flüssige Überstand in Gegenwart dies Denaturierungsmittels
    vor dem Zusatz des wasserunlöslichen Adsorptionsmittels gereinigt wird.
    5. Verfahren nach Anspruch 1 = h , dadurch gekennzeichnet; daß das Denaturierungsmittel in einer Konzentration von 2-6 Mol/l angewendet wird.
    6. Verfahren nach Anspruch 1 - 5» dadurch gekennzeichnet, daß als Neutralsalz Natrium- und/oder Kaliumchlorid verwendet wird.
    7. Verfahren nach Anspruch 1-6, dadurch gekennzeichnet, daß das Neutralsalz in einer Konzentration von 0,3-3 Mol/l
    angewandt wird.
    8. Verfahren nach Anspruch 1 - 7 > dadurch gekennzeichnet, daß bei einem pH-lvert von 6 - 10 gearbeitet wird.
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    - 12 -
    9· Vorfahren nach Anspruch 1-8, 'dadurch gekennzeichnet, daß bei einer Temperatur von 1 - '\C·' C gearbeitet wird.
    10. Verfahren nach Anspruch 1 - ?, dadurch gekennzeichnet, daß als wasserunlösliches Adsorptionsmittel AlPO, und/oder Cf-Aluminiumhydroxid in einer Konzentration von 0,05 - 0,2 verwendet wird.
    11. Scliü tuendes Pertussis-Antigen gekennzeichnet durch Parameter, die sich durch das Verfahren nach Anspruch 1-10 ergeben.
    12.. Mittel enthaltend Pertussis-Ahti gen nach Anspruch 11.
    13· Keuchhusten-Vakzine enthaltend Pertussis-Antigen nach Anspruch 11.
    60 9827/0946
DE2461439A 1974-12-24 1974-12-24 Verfahren zur Herstellung eines schützenden Antigens von Bordetella Pertussis sowie jenes enthaltendes Mittel Expired DE2461439C3 (de)

Priority Applications (18)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE2461439A DE2461439C3 (de) 1974-12-24 1974-12-24 Verfahren zur Herstellung eines schützenden Antigens von Bordetella Pertussis sowie jenes enthaltendes Mittel
ES443624A ES443624A1 (es) 1974-12-24 1975-12-18 Procedimiento para la preparacion de un antigeno protector de bordetella pertussis.
NL7514858A NL7514858A (nl) 1974-12-24 1975-12-19 Beschermend kinkhoest-antigeen, zijn bereiding en preparaten daarvan.
DK586575A DK143317C (da) 1974-12-24 1975-12-22 Fremgangsmaade til udvinding af et antigen fra bordetella pertussis
CH1660875A CH628246A5 (de) 1974-12-24 1975-12-22 Verfahren zur herstellung eines schuetzenden pertussis-antigens.
LU74088A LU74088A1 (de) 1974-12-24 1975-12-22
US05/643,123 US4029766A (en) 1974-12-24 1975-12-22 Protective antigen from pertussis, process for its preparation and products containing this antigen
CA242,453A CA1059027A (en) 1974-12-24 1975-12-23 Extraction of protective antigen from b pertussis and antigen
SE7514601A SE431057B (sv) 1974-12-24 1975-12-23 Forfarande for framstellning av ett skyddande antigen ur bordetella pertussis
AU87808/75A AU496345B2 (en) 1974-12-24 1975-12-23 Protective antigen from pertussis process for its preparation and products containing this antigen
IE2807/75A IE42622B1 (en) 1974-12-24 1975-12-23 Protective antigen from pertussis, process for its preparation and products containing this antigen
AT980275A AT355203B (de) 1974-12-24 1975-12-23 Verfahren zur herstellung eines schuetzenden antigens von bordetella pertussis
IL7548730A IL48730A (en) 1974-12-24 1975-12-24 Protective pertussis antigen,process for its preparation and products containing this antigen
BE163118A BE837082A (fr) 1974-12-24 1975-12-24 Antigene protecteur de la coqueluche, son procede de preparation et produits contenant cet antigene
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MX766631U MX3785E (es) 1974-12-24 1976-01-05 Procedimiento para la preparacion de un antigeno protector de bordetella pertussis

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SE (1) SE431057B (de)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4248862A (en) * 1978-02-17 1981-02-03 The Secretary Of State In Her Britannic Majesty's Government Of The United Kingdom Of Great Britain And Northern Ireland Immunogenic cell envelope preparations

Families Citing this family (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2393065A1 (fr) * 1977-05-31 1978-12-29 Merieux Inst Procede de separation de lipides d'endotoxines bacteriennes et notamment d'endotoxine de bordetella pertussis
IT1107772B (it) * 1977-08-22 1985-11-25 Cancer Res Inst Royal Procedimento per la produzione di complessi macromolecolari prodotto ottenuto e composizioni farmaceutiche che lo contengono come ingrediente attivo
US4196192A (en) * 1977-10-28 1980-04-01 American Cyanamid Company Combined Haemophilus influenzae type b and pertussis vaccine
NZ188211A (en) * 1977-10-28 1984-09-28 American Cyanamid Co Isolation of polyribosyl ribitol phosphate(prp)from haemophilus influenzae type b;vaccine comprising prp and bordetellapertussis antigens
US4247452A (en) * 1978-03-01 1981-01-27 The Secretary Of State For Defence In Her Britannic Majesty's Government Of The United Kingdom Of Great Britain And Northern Ireland Purification of pertussis haemagglutinins
DE3043291A1 (de) * 1980-11-17 1982-07-01 Dso Pharmachim Vakzine gegen keuchhusten
GB2144129B (en) * 1981-08-24 1985-10-09 Vilas V Likhite Antigens as immunostimulant adjuvants
HU188847B (en) * 1983-02-22 1986-05-28 Human Oltoanyagtermeloe Es Kutato Intezet,Hu Process for producing liophylized combined vaccines
US4705686A (en) * 1986-05-09 1987-11-10 American Cyanamid Process for the preparation of acellular Bordetalla pertussis vaccine
US4845036A (en) * 1987-02-03 1989-07-04 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Process for isolation of the B oligomer of pertussis toxin
US5139776A (en) * 1987-04-24 1992-08-18 The Research Foundation For Microbial Diseases Of Osaka University Method for culturing Bordetella pertussis, a pertussis toxoid and a pertussis vaccine
CA1337859C (en) * 1987-04-24 1996-01-02 Masashi Chazono Method for culturing bordetella pertussis, a pertussis toxoid and a pertussis vaccine
GB9924351D0 (en) * 1999-10-14 1999-12-15 Brennan Frank Immunomodulation methods and compositions
EP2139993A2 (de) * 2007-04-27 2010-01-06 Dow Global Technologies Inc. Verbesserte herstellung und in-vivo-synthese löslicher und rekombinanter virusähnlicher partikel in ikosaeder-form

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3141824A (en) * 1961-05-19 1964-07-21 Lilly Co Eli Pertussis antigen
US3395219A (en) * 1964-12-11 1968-07-30 Merck & Co Inc Process for production of pertussis antigen
US3405218A (en) * 1965-09-22 1968-10-08 Parke Davis & Co Extracting bordetella pertussis antigens with lithium bromide
US3465078A (en) * 1965-10-21 1969-09-02 Sydney Z Spiesel Method of recovering antigens from bordetella pertussis cells

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4248862A (en) * 1978-02-17 1981-02-03 The Secretary Of State In Her Britannic Majesty's Government Of The United Kingdom Of Great Britain And Northern Ireland Immunogenic cell envelope preparations

Also Published As

Publication number Publication date
JPS6222970B2 (de) 1987-05-20
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DK143317B (da) 1981-08-10
CH628246A5 (de) 1982-02-26
SE7514601L (sv) 1976-06-25
SE431057B (sv) 1984-01-16
LU74088A1 (de) 1976-11-11
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DK586575A (da) 1976-06-25
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ATA980275A (de) 1979-07-15
IL48730A0 (en) 1976-02-29
JPS5188623A (de) 1976-08-03
ES443624A1 (es) 1977-04-16
DE2461439C3 (de) 1980-03-20
MX3785E (es) 1981-07-16
IL48730A (en) 1978-10-31

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