DE2421083A1 - Verfahren zur herstellung von vaccinen - Google Patents
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Description
Die vorliegende, aus Arbeiten des Pasteur-Institutes hervor- .
gehende Erfindung bezieht sich ciuf die Gebiet der Immunisation.
Sie bezieht sich insbesondere auf neue Vaccine, ihr Herstellungsverfahren und ihre Anwendung zur Verhütung von Krankheiten
sowie auf die durch Verwendung dieser neuen Vaccine hergestellten Hyperimmunseren.
Bekanntlich ist das derzeit zur Umwandlung eines Toxins in ein
Anatoxin am häufigsten verwendete Mittel Formaldehyd. Diese.
Verbindung wird in Form von Formol, d.h.. einer wässrigen Formaldehydlösung,
verwendet. Das bekannte Verfahren besteht in der Inkubation des Toxins in Anwesenheit von Formol bei Temperaturen
von 35-40 C. u/ährend 2-6 Wochen. So erzielt man eine Inaktivierung
des Toxins, die die Herstellung der entsprechenden Vaccine erlaubt.
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Dieses bekannte Verfahren 'ist jedoch nicht auf die Herstellung
won Vaccinen aus allen bekannten Toxinen aniuendbar. So eignet es
sich z'.B. nicht zur Herstellung von Vaccinen aus Schlangengif ten.
Die Inaktivierungsdauer mittels Formoi ist lang.
Es märe daher sehr wünschenswert, ein Verfahren zur möglichst
schnellen Herstellung wirksamer Vaccine zu finden.
Die als Antigene zur Herstellung won Vaccinen dienenden i-iikroorgunismen
werden gewöhnlich durch Wärme, Formol, Phenol oder eine Kombination dieser Kittel inaktiviert. Die bekannten Verfahren
denaturieren manchmal die Schutzantigene. Daher resultiert in bestimmten Fällen ein Verlust der Spezifität des imfTiUnologischen
Ansprechens eines geimpften Patienten.
Zur Inaktivierung des Virus wird häufig Formoi (Polio), ßrPropiolacton
(Polio), UV-Strahlen (Herpes) oder die kombinierte Wirkung dieser chemischen und physikalischen F.ittel verwendet. 5o
wird z.B. der Polio-Virus durch Formol inaktiviert und dann mit ß-Propiolacton behandelt.-
Diese Inaktivierungsverfahren von Antigenen bezüglich der Herstellung
von Vaccinen haben für bestimmte Viren, wie z.B. von Poliomyelitis und Tollwut, gute Ergebnisse geliefert; sie lassen
sich jedoch nicht auf alle Viren von Infektionskrankheiten bei f-iensch und Tier verallgemeinern; so verleihen z.B. die bisher
hergestellten Vaccine gegen Haul- und Klauenseuche nur eine relativ kurze I.Tni-unitat und erfordern jährliche Impfungen. Weiterhin
war es bisher noch nicht möglich, einen wirksamen und gut verträglichen Impfstoff gegen die Toxine von Giftschlangen
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herzustellen. Das zur Zeit einzige Kittel gegen den Biß von Giftschlangen
ist die Serotherapie,
Oft ist es weiterhin notwendig, in das Vaccinepräparat verschiedene
Hilfsmittel, z.B. anorganische Verbindungen, wie Aluminiumhydroxid odor Calciumphosphat, einzuverleiben.
Ziel dor vorliegenden Erfindung ist ein allgemeines Verfahren
zur Herstellung von Vaccinan sowie die erhaltene Vaccine und ihre
Verwendung bei dor Vorsorgebehandlung von hensch und Tier.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich außerdem suf ein Verfahren
zur Herstellung von Vaccinen in sehr kurzer Zeit, z.B. in der-Größenordnung
von einer isinute bis einigen Stunden, im Fall von
[•'likroorogan ismen und ihren Toxinen. Das erfindungsgemäße Verfahren
zur Herstellung van Vaccinen erlaubt weiter die Erzielung des Anutoxins in überlegener Ausbeute im Vergleich zu bekannten Verfahren
.
Außerdem ist ein Ziel der vorliegenden Erfindung ein Verfahren
zur Erzielung neuer Vaccine, insbesondere wirksamer Vaccine gegen Mikroorganismen von Infektionskrankheiten, gegen Mikrobengifte
und Gifte von Giftschlangen. Das erf indungsgema'ße Verfahren erlaubt
auch die Erzielung von Virenvaccincn, von denen verschiedene
neu sine, in einem Zeitraum von wenigen Tagen.
Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung von Vaccinen erfolgt
weiter in Anwesenheit cder Abwesenheit der üblichen Hilfsmittel,
wie Aluminiumhydroxid oder -phosphat oder Calciumphosphat.
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ErfindungsgemäG u/erden Hyperimmunseren durch Verwendung der neuen
Vaccine hergestellt, die bei der Vorsorge- und- Heilbehandlung von Mensch und Tier angewendet u/erden können.
In der allgemeinsten Form bezieht sich die vorliegende Erfindung auf ein Verfahren zur Herstellung von Vaccinen, das dadurch gekennzeichnet
ist, daß man das toxische Produkt mit Glutaraldehyd in ausreichender Konzentration und für eine ausreichende Dauer
zum Entgiften oder Inaktivieren desselben in Derührung bringt und die Reaktion, sobald das Stadium der Entgiftung oder Inakti- ·
vicrung erreicht ist, durch physikalische und/oder chemische f'.ittel
abbricht, wodurch das erhaltene inaktivierte Produkt als Vaccine verwendbar ist und gleichzeitig ein Antigen bleibt und
seine Immunisierungskraft bewahrt.
[-lan weiß allgemein, daß Aldehyde eine entgiftende Wirkung haben,
und es ist bereits vorgeschlagen worden, Glutaraldehyd als Desinfektionsmittel
zu verwenden. Auf dem Gebiet der Immunisierung genügt es jedoch nicht, ein entgiftetes Produkt zu erhalten, damit
dieses ebenfalls als Vaccine verwendbar ist. Es müssen die Bedingungen einer industriellen Herstellung eines Vaccins genau
angegeben sein, die alle Garantien der Wirksamkeit, der Reproduzierbarkeit, der Verwendbarkeit als Impfstoff und der Stabilität
liefern.
Erfinc!ungsge:näß erfolgt die Behandlung mit Glufcacaldehyd bei geregelten
Bedingungen, und gemäß einem Grundmerkmal des Verfahrens
wird die Reaktion in solcher l-Jeise abgebrochen, daß die Toxizität
oes Anfsngsproduktes ohne Üenaturierung aufgehoben wird, d.h.
indem man seine Antigen-fJatur bewahrt.
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Zur Regulierung der Behandlung werden Vorversuche mit dem in Betracht
kommenden toxischen Produkt durchgeführt. Der Fachmann verfügt über Kontrollmaßnahmen in einem gegebenen System zur Feststellung
der zum Entgiften des Produktes wirksamen Glutaraldehydkonzentration und der, Behandlungsdauor. Bei der Behandlung von
am Tier
Toxinen genügt es z.B. nicht, dia Entgiftung/zu verfolgen, sondern
man muß auch den Titer des behandelten Produktes in Ausflockungse-inhoiten
pro Volumen-Einheiten (UF/ccm) und die Ausflöckungszeit
(Kf) feststellen. Wenn man daher im Behandlungsverlauf Im Medium '
keine Flokkulation mehr feststellt, ist man sicher, dafl das entgiftete
Produkt denaturiert morden ist. So man man einerseits den Verlust oder die Abnahme des Titers (UF/ccm) und andererseits die
Zunahme der Ausf löckungszeit (|<f) feststellen. Diese beiden Faktoren
erlauben es, die gewünschte Berührungsdauer des Glutaraldehyds
mit dem toxischen Produkt für eine gegebene Glutar-aldehydkonzentration
und umgekehrt zu bestimmen.
Um die Reaktion abzubrechen, sobald das Produkt entgiftet ist,
können erfindungsgemäß verschiedene Maßnahmen einzeln oder in
Kombination angewendet werden. Erstens kann man die Reaktion durch chemische Eliminierung des überschüssigen Glutaraldehyds unterbrechen,
indem man dem Reaktionsmedium ein Chemikal zufügt, das
mit dem freien Glutaraldehyd reagieren kann. Von den verschiedenen,
dazu geeigneten Mittels werden vorzugsweise Aminosäuren, wie Lysin oder Glycin, öder anorganische Salze, wie Natriumbisulf it, verwwendet.
So kann man z.B. eine wässrige Lysinlösung bei einem pH-Wert zwischen etwa 7-8 verwenden.
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Eine iueitero Haßnahme zur · Eliminierung des überschüssigen Glutaraldehyds
aus dem Raaktinnsmedium besteht in physikalischen Maßnahmen,
insbesondere Dialyse des Mediums gegen eine Lösung
. ("solütion_ tampon"), . . .
/ j z.B. ein solches aus Phosphat ocsr Natriumchlorid. Bei
der Behandlung υοη Keimen mit Glutaraldehyd kann man die Keime
zentrifugieren und sie zur Eliminierung des überschüssigen GIutaraldehyds
paschen. In diesem Fall kann es zu/eckmäßig sein, eine
Glutaraldehydkonzentration zu mahlen, die einer solchen Dauer der Entgiftungsbehandlung entspricht, die mit der Dauer des ■
Zentrifugierungs/Wasch-Uerfahrens vereinbar ist.
Weiterhin luird darauf hingewiesen, daß die durch die erfindungsgemäße
Behandlung mit Glutaraldehyd entgifteten Produkte direkt als Vaccine in flieEbarer Form verwendet werden können; Dennoch
kann man auch Vaccine in adsorbierter Form- herstellen, u/enn man
das fließbare Uaccin z.B. durch Dialyse gegen eine Lösung ("tampon")
z.B. einen Puffer aus Natriumphopshat, eine Lösung aus Calciumchlorid,
oder ujenn man dem durch Dialyse, gegen eine Lösung von
rtetriumchlorid erhaltenen fließbaren A/accin Aluminiumhydroxid
oder -phosphat zufügt; so erhält man ein auf den üblichen Hilfsmittels
(Aluminiumhydroxid, Calciumphosphat usw.) adsorbiertes
Uaccin.
Die erfindungsgemäßen Vaccine sind dadurch gekennzeichnet, daß
die GlutaraldehydEioleküle mit dem toxischen Produkt reagiert
haben.
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In dieser Hinsicht ist die Wirkungsweise von Glutaraldehyd grundsätzlich verschieden von derjenigen des Formaldehyds.
Tatsächlich ist Glutaraldehyd ein bifunktionellos Reagenz, das
gleichzeitig das toxische Ausgangsprodukt entgiften und die Brückenreaktion 'an den' Molekülen dieses Produktes durchführen
kann.
Es wurden Versuche zur Kennzeichnung der aus der Reaktion
zwischen dem Glutaraldehyd und dem toxischen Produkt erhaltenen Produkte gemacht, wobei die verschiedenen Produkte durch eine
Kolonne geleitet und ultrazentrifugiert wurden. Es zeigte sich z.B. im Fall- von Diphterietoxin, daß das native Toxin praktisch'
monomere Produkte umfaßte, wobei der Prozentsatz der Dimeren
unter etwa 10 % lag. Bei einer Entgiftungsbehandlung dieses Diphteriptoxins
mit Formaldehyd war das Reaktionsprodukt, wie festgestellt
wurde, praktisch monomer, wobei die Lösung in den Grenzen von etwa 3-5 /ö praktisch keine Dimeren enthielt. Beim
erfineungsgemäßen Verfahren, d.h. einer Behandlung des Diphterietoxins
mit Glutaraldehyd besteht das Reaktionsprodukt im wesentlichen
aus ["iolekülen mit unterschiedlichem, stark erhöhtem Molekulargewicht. Die restliche Kenge an monomeren Produkten
liegt bei etwa 5-10 %.
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ErfindungsgemäQ wird kein Niederschlag im flüssigen Reaktionsmediüm·
gebildet, wie dies der Fall ist, wenn man ein polymeres Produkt mit hohem Molekulargewicht bildet. Diese Eigenschaft ist
von entscheidender Bedeutung, denn sie resultiert aus den oben beschriebenen kontrollierten Reaktionsbedingungen. Weil die Reaktion
uon Glutaraldehyd und toxischem Produkt abgebrochen ujj.rd,
sobald die Entgiftung erreicht istj bleibt das entgiftete Produkt
als Vaccin wirksam, während sich bei fortdauernder Reaktion eine Verbindung bilden ujür-de, die die gewünschte Immunisierungskraft
nicht mehr besitzen würde.
So ist es nicht zweckmäßig, die Entgiftungsreaktion über einen Grenzwert hinaus fortzusetzen, der in jedem Fall in Abhängigkeit
vom behandelten toxischen Produkt und den Behandlungsbedingungen,
d.h. im wesentlichen der Konzentration der Glutaraldehydlösung und der Behandlungszeit, bestimmt werden kann.
In der Vergangenheit ist Glutaraldehyd bereits zum Inaktivieren von Viren, d.h. der Behinderung ihrer Entwicklung, vorgeschlagen
worden (vgl. z.B. Fred L. Säbel et al "Applied Microbiology",
April 1969, Seite 645-646, Bad. 17, Nr. 4).
Die Arbeitsbedingungen dieser bekannten Verfahren erlauben keine
Konservierung der immunologischen Eigenschaften des Anfangsvirus. So erreicht z.B. in der Sabel-Veröffentlichung die Glutaraldehydkonzentration
5 Gew,-/', bezogen auf die Reaktionsmischung, was einen Wert darstellt, bei welchem die immunologischen Eigenschaften
der Viren verschwunden sind.
Im Gegensatz dazu wird die erfindungsgemäße Behandlung mit Glutaraldehyd
bei geregelten und einer Herstellung von Vaccinen ange-
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2A21083
- 7Sa -
paßten Bedingungen durchgeführt. Man kann tatsächlich einen viralen
Stamm erhalten, der seine Verrnehrungseigenschaften verloren, jedoch seine antigenen Impfstrukturen bewahrt hat. Gemäß einem
wesentlichen Merkmal der vorlisgenden Erfindung wird die Reaktion
zwischen dem Glutaraldehyd und dem behandelten Produkt zu einem kontrollierten Zeitpunkt in solcher Weise abgebrochen, daß die
Toxizität des Anfangspraduktes aufgehoben wird, ohne dieses zu denaturieren.
Ohne an eine besondere Theorie gebunden werden zu wollen wird angenommen, daß bei· den erfindungsgemäßen Reaktionsbedingungen
der Glutaraldehyd eine begrenzte Brücken- oder Polymsrisationsreaktion
zwischen den Molekülen der toxischen Produkte in solcher Weise bewirkt, daß man ein entgiftetes, wertvolles, als Vaccin
verwendbares Produkt erhält.
In der vorliegenden Anmeldung bezieht sich die Bezeichnung "toxisches
Proüukt" auf Mikroben- oder Gifttoxine, auf Kulturen oder Suspensionen von [mikroorganismen, Keimen, Bakterien und Viren.
Somit können die erfinoungsgemäßen Vaccine aus den verschiedenen
Toxinen oder Mischungen dieser Mikroben- oder Gifttoxine sowie aus Keimen, Bakterien, Viren und Mikroorganismen der unterschiedlichsten
Art hergestellt werden.
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Erfindungsgemäß kann man z.B. Vaccine aus Diphterie-, Tetanus-,
q£- und ß-Staphylococcen, Schlangengift-und allen anderen Mikrobenöder
Gifttoxinen sotuie aus Bakterien oder l/iren, wie Staphylococcus
oder Keu.chhustenerreger (Bakterien) oder den Viren von Poliomyelitis oder Maul- und Klauenseuche herstellen. In bestimmten
Fällen können gemischte Vaccine erhalten werden, u/enn man eine Mischung won Toxinen oder Mikroben-Infektionserregern (Bakterien,
Vuren usuj.) nach dem erfindungsgemäßen l/erfahren inaktiviert.
So kann man z.B. ein gemischtes Antitctanus-Antidiphterie-
vaccin herstellen.
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Im Fall von Diphterietoxin ist es vorteilhaft) die Behandlung mit
Glutaraldehyd durchzuführen und die Reaktion durch Zugabe einet
Aminosäure, wie Lysin oder Glycin, abzubrechen. Man. kann auch das flüssige, aus der Behandlung mit Glutaraldehyd erhaltene Produkt
einer Dialyse gegen eine Lösung ("solution tampon") aus Phosphat unterwerfen, was ebenfalls zu einem als Vaccin verwendbaren Produkt
führt, das Anatoxine in adsorbierter Form enthältf nachdem
man die Phosphationen durch das Calcium ausgefällt hat. Der Puf~
forlüsung wird zweckmäßig eine Substanz zur Vermeidung von Verunreinigungen,
u/ie Fierthiolat, zugegeben.
Im Fall von Tetanustoxin ist es auch möglich, ein flüssiges, die Anatoxine enthaltendes Vaccin oder ein solches in adsorbierter
Form zu erhalten.
Beim rohen oder gereinigten o^-Staphylococcustoxin kann man die
Behandlung mit Glutaraldehyd durchführen und das erhaltene Produkt der Einwirkung von Lysin oder Glycin oder der Dialyse gegen
eine Pufferlösung aus Natriumchlorid mit zugefügtem Kerthiolat unterwerfen.
Bei der Entgiftung von Schlangengiften erhält man die Vaccine
durch Glutaraldehydbehandlung, an die sich zweckmäßig eine Dia- " lyse oder die Zugabe einer Aminosäure anschließt. Zur Herstellung
des Vaccins kann man wie folgt verfahren: nach der Zugabe von · iierthiolat zum flüssigen Anagift wird mit Kerthiolat gegen eine
Lösung eines Phosphat puff ers Na2HO. (0,07 M) dialyisert und auf
einem sterilen Seitz-Filter filtriert, wodurch man ein flüssiges,
die nüssigen Anatoxine enthaltendes Vaccin erhält. Anschließend
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ΛΙ
-s-
kann man einer sterilen 0,07Γ'Ί Lösung aus Calciumchlorid gemischt
tuerden, ums zu einem auf Calciumphosphat adsorbierten Vaccin mit
einem pH-Wert von 6,8-7,00 führt.
Man kann das flieöbare Uaccin auch gegen eine Lösung aus Natriumchlorid
dialysieren, filtrieren und als Hilfsmittel Aluminiumhydroxid oder -diphosphat zufügen.
In gleicher Weise können Keuchhustenvaccine in flüssiger oder
adsorbierter Form hergestellt u/erden.
Bei "der Inaktivierung von Poliomyelitis-Viren ist es interessant,
u.a. die Glutaraldehydkonzcntration zu regeln, um eine Denaturierung
der Viren auf ein Minimum zu reduzieren.
Allgemein kann der Fachmann zahlreiche Faktoren zur Erzielung uiirk
sanier und befriedigender Vaccine variieren, uiie z.B.: die Konzentration
des Gluaraldehyds, die Berührungszeit mit dem toxischen Produkt, die i\!atur des toxischen Produktes» Auch die Reinheit
des toxischen Produktes söiuie die Behandlungstemperatur können
eine Rolle spielen, u/obei letztere gewöhnlich um Zimmertemperatur
oder zwischen etiua 35-40°C, insbesondere 37°C. , liegt.
Neben den Faktoren, die die Regelung des Verfahrens-beeinflussen,
müssen selbstverständlich auch physikalische oder chemische f-iaßnahmen
berücksichtigt u/erden, die den Abbruch der Glutaraldehyoreaktion
mit dem toxischen Produkt erlauben. Wenn in der vorliegenden Anmelüung, insbesondere bei der genauen Beschreibung des
Verfahrens, von der "3erührungs"- oder 'Inkubationszeit" die Rede
ist, handelt es sich um die genaue Berührungsdauer von Glutar-
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aldehyd und toxischem Produkt, wobei die Reaktion unmittelbar nach der angegebenen Zeit durch mindestens eine der unten beschriebenen
physikalischen oder chemischen Maßnahmen abgebrochen wird.
Wie oben erwähnt, besteht eine wirksame Maßnahme im Kampf gegen die eigene'Toxizität von Glutaraldehyd darin, die Inaktivierungsbehandlung
mit Glutaraldehyd durchzuführen und dem ReaktionsnerJium Lysin zuzufügen, wobei das Lysin ein Beispiel für vorteilhafte
Aminosäuren oder äquivalente Chemikalien ist, die die Glutaraldehyd-Antigen-Reaktion
blockieren können.
Das erfindungsgemäße· Verfahren führt zu atoxischen Derivaten, die
als Vaccine mit erhöhter Immunisierungskraft dienen können, nämlich
flüssige bzw. fließbaTe Vaccine, dis perseoder in Anu/ssanheit der
üblichen Hilfsmittel (z.B. Aluminiumhydroxid oder -phosphat, CaI-ciumphosphat,
Öl-Uasser-Mischungen usw.) verwendet werden können.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich weiterhin auf Hyperimmunseren,
die man durch Entnahme beim Menschen oder einem Tier, wie Pferd, Esel, Ziege, erhält, denen ein .erfindungsgemäßes
Vaccin für verkürzte Dauer entsprechend den üblichen Immunisierungsverfahren verabreicht wurde. Diese Seren können in bekannter
Weise bei Mensch und Tier zur Vorsorge- oder Heilbehandlung von Erkrankungen verwendet werden, die durch Mikroorganismen oder
deren Derivate entsprechend dem verabreichten Vaccin hervorgerufen werden. Diese Seren sind auch als Diagnoseprodukte verwendbar.
£m folgenden wirddie Einwirkung von Glutaraldehyd in unterschiedlichen
Konzentrationen bezogen auf die Berührungszeit bei 37°C.
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■ auf Toxine· in unterschiedlichen Stadien der Reinigung, auf Bakterien,
Gifte und Viren im einzelnen beschrieben.
Die. folgende Beschreibung bezieht sich, nacheinander auf
A - Diphterietoxin·
B - Tetanustoxin ■
C - rohes ^-Staphylococcustoxin D - gereinigtes o(-Staphylococcustoxin
E - rohes ß-Staphylococcustoxin F - gereinigtes ß-Staphylococcustoxin"
G - Gifte der Schlangen Aspis, Berus und Ammodytes und anderer
Schlangen
H - Staphylococcuskeime I -.Keuchhustenbazillus
3 - Poliomyelitisvirus
K - Maul- und Klauenseuchenvirus.
In verschiedenen Fällen wurde auch die Immunigenkraft der Derivate
untersucht.
In Absatz L ujurde die Eigentoxizität von Glutaraldehyd untersucht.
Schließlich zeigt Absatz H die Erzielung eines gemischten Antitetanus-Antidiphterie-Uaccins.
Die eingesetzten molaren Konzentrationen des Glubaraldehyds luaren
lüie folgt:
0,0263h = 10,7 ecm Glutaraldehyd pro 1 (25-^ige Lösung)
0,00263M =1,07 ecm Glutaraldehyd pro 0.052K = 21,4 ecm Glutaraldehyd pro 1
0,O0526M = 2,14 ecm Glutaraleehyd pro
A09847/1137
Weiterhin wurden mehrere unterschiedliche Konzentrationen untersucht,
insbesondere sehr schwache Konzentrationen, die bis zu· 0,00131M oder darunter führten, und zwar entsprechend dem behandelten
toxischen Produkt.
Die folgende genaue Beschreibung zeigt den Einfluß verschiedener Faktoren auf die Reaktion zwischen toxischem Produkt und Glutaraldehyd
sowie Maßnahmen zur Kontrolle der Reaktion nach dem erfindungsgemäßen
Verfahren.
Zur Darstellung der bei den Versuchstieren festgestellten Reaktionen
wurden die folgenden Abkürzungen verwendet:
ER Erythem
ES Schorf
ES->cic vernarbender Schorf
ES eic vernarbter Schorf
PES wenig Schorf
TrES Spuren von Schorf
LI leichte Verhärtung
TLI sehr leichte Verhärtung
FR leichte Reaktion in Erythemform
TFR sehr leichte Reaktion in Erythemform
N Knoten PEr = leichtes Erythem
PN kleiner Knoten trN = Spuren von Knoten
tr . Spuren- Nd = nicht verdünnt
RAS nichts festzustellen
Die folgende Beschreibung enthält weiterhin die folgenden Abkürzungen:
UF internationale Ausflockungseinheiten
UAI internationale antitoxische Einheiten
DKiH hämolytische Mindestdosis
DCH kombinierte hämolytische Dosis
4 09 8*7/1137
A. Entqiftunqsuntersuchung vnn Dinhteriotoxin
1. Einwirkung qon Glutaraldehyd auf reines Toxin bei 500 UF/ccn
Die Tabellen 1 und 2 zeigen Ergebnisse aus der Einwirkung von Glutaraldehyd bei Endkonzentrationen von 0,0263M und 0,00263Μ.
Die Einwirkung von Glutaraldehyd einer Konzentration von 0,0263t-",
d.hu gleich einer üblicherweise zum Entgiften dieses Toxins während
einer Dauer von mindestens 2 Wochen bei 37 C. verwendeten Fcimclmenge,
läßt die Ausflockungskraft dieses Toxins nach .1-stündiger
Berührung bei derselben Tempuratur vollständig verloren gehen.
409847/1 137
Entgiftung von reinem Diphterietoxin bei 5DO UF/ecm durch Einwirkung von Glutar-
altiehyd einer endgültigen Konzentration von 0,0263M
Berühr.zeit UF/ccm Kf · Unschädlichkeitstsgt bei f'iesrschuieinchsn*; festgestellt nach
bei 370C _ 24 std 48 std 72 std __1 Woche ?. Wochen .3. Wpch.en
bei 370C _ 24 std 48 std 72 std __1 Woche ?. Wochen .3. Wpch.en
24 stu
1 Woche
fna**
PES RAS
ES PES
PES
ES RAS
ic.
Fna**
RAS RAS
RAS ES
RAS ES
RAS ES
tot ES
ES RAS
tot
4 Wochen
| 1 min ' | 470 | 1 min | ES ES |
ES ES |
mm mm | um — | ES >cic. ES-?" eic » |
mm mm | •m, am, |
| ■'! std | fna** | RAS RAS |
RAS PES |
ES ES |
ES ■ ES |
RAS trES->cic. |
ES ES |
ES-?· eic. ES eic. |
|
| 3 std | fna** | PES RAS |
ES RAS |
tr PES ■ |
RAS t'r.ES |
ES -> eic. RAS |
.RAS N |
RAS RAS |
|
| 6 std | fna** | ES RAS |
ES RAS |
ES RAS |
ES cjJG&u. RAS |
||||
ta eic. RAS
* = Injektion von 0,5 ecm subkutan bei 2 Kaerschuieinchen von 250 g
** s flockt nicht aus
** s flockt nicht aus
CD OO CO
ω
χι
to
χι
to
C
O
•Η
-P
O
•Η
-P
C
O
.ν
ω
χι •π
χι •π
ω sz ο ο
VO
CM
□
CM
□
- JZ
α ο
C ω JZ
-P
-P co G) σΐ
-P CO CU θ
G)
χ: ο C •Η
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ω ω
σι ω
•Η" Xl
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C
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E χ: ο
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cn cn 'X cc er tr
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-P
co
S* D|
ca
U JZ
ω ο
LT\ C CO OJ -H
cn ω -a
ωχ:
ο
a
CN
409847/1137
Beieiner Glutarladehydkonzentration von 0,00263M erhielt man eine wesentlich woniger deutliche Verringerung der Au-sf locküngstiters,.
die jedoch derjenigen mit Forrriol nach längerer Berührungszeit überlegen ist.
Eine Untersuchung der Heerschujänchen auf Resttoxizität der Präparate
zeigte nach 1-stündiger Berührung mit einer Konzentration
von 0,00263F., daß das Toxin fast vollständig entgiftet ist. f'iach 3-stündiger Berührung führt das Präparat mit einem Titer
von 420 UF/ccm nur zum Tod des F.eerschweinchens.
[■'.an kann nie Eigentoxizität von Glutaraldehyd durch Einwirkung '
von Lysin oder durch Dialyse unterdrücken.
2. Einwirkung von Glutaraldehyd auf teilweise gereinigtes P„ Toxin
Die Tabellen 3 und 4 zeigen Ergebnisse aus der Einwirkung von
Glutaraldehyd auf ein teilweise gereinigtes Toxin mit 250 UF/ccm.
In diesem Fall sind die zur Erzielung einer vollständigen Entgiftung
zu verwendenden Glutaraldehydkonzentrationen höher. Das Präparat wurde durch Einwirkung von 0,0263Fi Glutarladehyd nach
3-stündiger Berührung vollständig entgiftet, blieb jedoch nach 1-wüehiger Berührung bei einer Konzentration von 0,00263Fi noch
toxisch. In diesem Fall wurde auch eine Verringerung der Ausflockungskraft
festgestellt.
3. Einwirkung von Glutaraldehyd auf ein rohes, ultrafiltriertes
Diphtherietoxin mit 450Π UF/ccm
Die Tabellen 5 und 6 zeigen Versuchergebnisse mit einer Endkonzentration
von Glutaraldehyd von 0,0263l·· und 0,00263?·'..
409847/1137
ZO
- i/t -
Wiaderum ujui-cIb nach 1-stündiger Berührung bei einer Konzentration
won 0,0263H eine vollständige Entgiftung festgestellt.
Das Präparat umr nach 2-iuöchiger Berührung bei einer Konzentration
von O,ÜO263H nicht entgiftet.
A. Wersucheerqebnisse einer Entgiftung won Diphterietoxin
Man kann eine vollständige Entgiftung ohne Denaturierung des
Diphterietoxins nach 1- bis 3-stündiger Berührung erreichen, ujenn man die Glutaraldehydkonzentrationen in Bezug suf die
Proteinkonzentration des verwendeten Präparates berücksichtigt,
409847/1137
Entgiftung von teilweise gereinigtem (P ) Diphterietoxin rcit 2500 UF/ccm durch
Einwirkung von Glutaraldehyd einer Endkonzentration von· 0,0263H
Einwirkung von Glutaraldehyd einer Endkonzentration von· 0,0263H
Berühr, zeit Ausflockung vor Unschädlichkeitstest bei f-ieerschujainchen*·; festgestellt nach
bei 37 C. Dialyse 24 'std 46 std 72 std 1 Woche 2 Wochen 3 Wochen
bei 37 C. Dialyse 24 'std 46 std 72 std 1 Woche 2 Wochen 3 Wochen
| 1 | min | LJ F/ ecm | Kf | __ | — | _ — | _ — | — | _- | |
| 3 | std | 2 4DÜ | 3 in in | RAS RAS |
RAS RAS |
RAS RAS |
RAS RAS |
RAS RAS |
RAS RAS |
|
| 24 | std | 145 0 | 5 0 min | RAS RAS |
RAS RAS |
RAS RAS |
tot RAS |
RAS | RAS | |
| O CO OO ** |
3 | Tage | 1400 | 5 std | RAS RAS |
RAS RAS |
RAS RAS |
RAS RAS |
RAS RAS |
RAS RAS |
| -α CO |
1 | Woche | 1250** | 24 std ' | RAS RAS |
RAS RAS |
RAS RAS |
RAS RAS |
RAS RAS |
RAS RAS |
| 1000 trübe |
24 std | |||||||||
* = zujei 250-g-Meerschiueinchen erhielten subkutan 0,5 ecm nach'Verdünnung auf ΐ/ΐθ
mit 9-/00-ig, steriler NaCl Lösung injiziert
mit 9-/00-ig, steriler NaCl Lösung injiziert
** = feiner Niederschlag
Entgiftung von teilweise gereinigtem(P ') Diphterietoxin mit 250GlJF/ccm durch Ein-• wirkung von Glutaraldehyö einer Endkonzentration von 0.00263Fi
Berühr.zeit Ausflockung vor Dialyse Ausflockung nach Dialyse gegen Unschjädlichkeitstest bei
bei 37 C. gegen K/K./M/15 Lösung k/K„ Losung Meerschweinchen
O
CP
Ο?
CP
Ο?
• Ur'/ccm
Kf
UF/ccm
K f
| 1 | min | 2400 | 2 | min | 2125 | 4 | min* | 24 | std | nach | Injektion | tot |
| 3 | std | 2250 | 3 | min | 2125 | 4 | min' | 24 | std | nach | Injektion | tot |
| 24 | std | 2125 | 3 | min | 2100 | 4 | min | 24 | std | nach | Injektion | tot |
| 3 | Tage | 2100 | 7 | min | 1650 | 5 | min | 24 | std | nach | Injektion | tot |
| 1 | VJ ac he | 1850 | 1 ι |
0 min | ||||||||
O CO CO
Die Glutaraldehydkonzentrationen vor der Verwendung sind höher,
wenn es sich um ein rohes Präparat (mit erhöhtem Proteingehalt) oder urn eine höhere Konzentration des zu entgiftenden Präparates
handelt. -
Somit müssen die Entgiftungsbedingungen durch eine Voruntersuchung
präzisiert werden. Das erfindungsgemäße Verfahren hat
öcn Vorteil, wesentlich schneller als das Entgiftungsvcrfahren
durch Einwirkung von Formol und Wärme zu sein.-
lierstellung van Diphterie-Anatoxinen durch Einwirkung von
Glutari-luehyd auf .ein reines Toxin und Untersuchung tier
Impfkraft in fließbarer oder adsorbierter Forn
Die folgende Untersuchung beschäftigt sich mit dem Einfluß von Lysin auf die ImmunisierungGkraft. So konnte bestimmt werden,
daß die durch Glutaraldehyd entgifteten Anatoxine bei Abbruch der Reaktion durch Lysin eine höhere Immunisierungskraft haben als
die in Abwesenheit von Lysin erhaltenen Anatoxine.
Die nach 1- bis 3-stündiger Bebrütung mit Glutaraldehyd einer Konzentration von 0,00263Fi mit und ohne 'Stabilisierung durch
Lysin erhaltenen Anatoxine wurden untersucht.
Die Tabelle 9 zeigt wiederum, daß die Präparate nach 1-stündiger
Berührung nicht vollstä-ndig entgiftet sind. Nach 3-stündiger
•Berührung bildet sich bei den mit einem Präparat ohne Lysin
behandelten Tieren Schorf; diese Reaktion beruht sicherlich auf - der Anwesenheit von freien Glutaraldehyd, denn sie läßt sich
nach der Einwirkung von Lysin nicht mehr feststellen.
409847/1137
Diese Beobachtungen werden durch die Untersuchung der dermonekrotischen
Toxizität derselben Anatoxine nach Dialyse bestätigt (vgl. Tabelle 10.).
Die mit den Präparaten nach 3-stündiger Berührung faGtnnstollten
Reaktionen sind in diesem Fall gleich (Ab'uiesenheit won freiGm Lysin). Mit nicht verdünnten Präparaten läßt sich, sicherlich
aufgrund einer Reizung, eine leichte Reaktion beobachten.
Die nach 1-stündiger Berührung erhaltenen Präparate sind toxisch.
409847/1137
Tabelle 5 : -
Entgiftung von rohem, ultrafiltriertern Diphterietoxin mit 4500 UF/ccm durch Einwirkung
von Glutar aldehyd einer Endkonzentration von 0,0263M
B'erühr.zeit
bei 37 C.
UF/ccm
KF
Unschädlichkeitstest bei Meerschweinchen *: festgestellt nach
std 48 std 72 std 1 Woche 2 Wochen
| 1 min | 4300 | 4 min | mm mm | RAS RAS |
RAS RAS |
M mm | « mm | 'T |
| 1 std | 3900 | 11 min | RAS RAS |
RAS RAS |
RAS RAS |
RAS RAS |
RAS RAS ' |
|
| 3 std | 3800 | 14 min | RAS RAS |
RAS RAS |
RAS RAS |
RAS RAS |
RAS ' RAS |
|
| 6 std | 3600 | 22 min | RAS RAS |
RAS ■ RAS |
RAS RAS |
RAS RAS |
RAS RAS |
|
| 24 std | 3375 | 35 min | RAS RAS |
RAS RAS |
RAS RAS |
RAS RAS |
||
| 1 Woche | 3000 | 3 std | RAS RAS |
RAS RAS |
RAS RAS |
tot | ||
| 2 Wochen | 2820 | 2 std 30 | RAS · RAS |
tot | ||||
* = zu/ei 250-g-Meerschiueinchen erhielten subkutan 0,5 ecm nach Verdünnung auf
ΐ/ίθ mit einer 9-foo-ig. sterilen NaCl Lösung injiziert
Serühr.zeit
bei 37°C.
bei 37°C.
mie Tabelle 5 mit einer Endkonzentration des Glutaraidehyds von 0,0D263M■
UF/ccm Kf Unschädlichkeitstest bei neersch'u/einchsn
| 1 | min | 4500 | 3 | min | 24 | std | nach | Injektion | tot |
| 1 | std | 4500 | ■P- | min | 24 | std | nach | Injektion | tot |
| 3 | std | 4500 | 4 | min | 24 | std | nach | Injektion | tot |
| 6 | std | 4500 | 4 | min | 24 | std | nach | Injektion | tot |
| 24 | std | 3300 | 4 | min | 24 | std | nach | Injektion | tot |
| 1 | Woche | 3250 | VJI | min | 24 | std | nach | Injektion | tot |
| 2 | VJo c hen | 3250 | 3 | min | |||||
CD OO CO
: Tabelle 9
Herstellung eines Anatoxins durch Einwirkung von Glutaraldehyd einer Endkonzen-
tration von 0,00263M
1. kontrolliert vor Dialyse
Berühr, zeit UF/ccm Kf Unschädlichkeitstest bei Γ-'ieerschueinchen, festgestellt nach
Berühr, zeit UF/ccm Kf Unschädlichkeitstest bei Γ-'ieerschueinchen, festgestellt nach
bei 370C.
24 std
48 std
Woche
2 Wochen
3 Wochen
| 1 min | 520 | 1 | j 5 min | ES LI | -- | -- | __ | -- |
| 1 std | 500 | 4 | min | Fr LT | ES LI | tot | ||
| RAS | Li | tot | ||||||
| 1 std + | 475 | 4 | , 5 min | FR LI | PN | N | RAS | RAS |
| 15 min 0.01 M | T FR- | N | tot | |||||
| Lysin | T FR | |||||||
| 3 std | 450 | 7 | min | FR LI | LI , . | ES | ES | ES eic. |
| RAS | LI ES | ES | ES | ES eic. | ||||
| 3 std + | 43 0 | 8 | min | RAS | ES | RAS | RAS | RAS |
| 15 min 0,01 M | T LI | .RAS | RAS | RAS | ||||
| Lysin- | ||||||||
-P-hO
CD CXD CO
Herstellung eines Anatoxins durch cinujirkung von Glutaraldehyd einer Endkonzentration
von 0,00263i"i (
2. kontrolliert nach Dialyse gegen eine Lösung aus N
0,07Γ·ϊ + Merthiolat 1:10 000
| Berühr.zeit | vor D | ialyse | nach | Dialyse | derrnonekrotisc | K an | he Toxizität bei | |
| bei 370C. | UoI. ccn |
in UF/ccm | UoI. ecm |
in UF/ccm | >20 16 . o 0 |
inchen* | ||
| , 1 Std | 30 | 500 | 28, | 6 450 | Wd 1/10 1/100 1/1000 |
>20 >2Q 12 0- |
> 20 PES 18 0 0 |
|
| 098A7 | 1 std + 15 min 0,0if Lysin |
30 | 475 | 27", | 5 440 | Nd" 1/10 1/100 1/1000 |
12 G G Q |
ES >20 ES >20 16 G |
| /1137 | 3 std | 30 | 450 | 27, | 5 430 | i'Jd 1/10 1/100 1/1000 |
14 0 0 G ■ |
□ α cd
VO |
| 3 std + 1 5 min 0,01R Lysin |
30 | 430 | 28, | 1 420 | Nd 1/10 1/100 1/10 00 |
nicht ver.sch. G 0 0 |
* zwei männliche usife Kaninchen, luurden intradermal mit 0,1 ecm injiziert;
die Feststellung der Reaktionen erfolgte 48 Stunden nach der Injektion
die Feststellung der Reaktionen erfolgte 48 Stunden nach der Injektion
-P-iNJ
CD CO CO
- -36 -
Die Tabellen 11 bis 14 zeigen, daß die Gewichtsenttaicklung der
mit 4 Arten v/on Anatoxinen (adsorbiert und nicht adsorbiert)
geimpften Tieren normal ist. Bei den mit dem adsorbierten Impfstoff geimpften Tieren wurde ein Erythem oder Knoten festgestellt,
ums v/ollständig normal ist.
Die vier Vaccine wurden insgesamt sehr gut vertragen; während
der Beobachtungszeit wurde kein Sterbefall festgestellt.
Die Tabelle 15 zeigt den zirkulierenden Antikörpertiter in internationalen
Einheiten. Die adsorbierton Vaccine haben eine höhere Immunogenkraft als die flüssigen Vaccine.
Das beste Immunisierungsansprechen lieferte das mit Abbruch der
Reaktion durch Lysin erhaltene, adsorbierte Anatoxin.
Gewichtsehtwicklung und Verträglichkeit bei Meerschweinchen,
die im Abstand von 15 Tagen durch zwei Injektionen geimpft
wurden:
flüssigsg Anatoxin (erhalten ohne Einwirkung von Lysin)
flüssiges Anatoxin (erhalten mit Einwirkung von Lysin)
adsorbiertes Anatoxin (erhalten ohne Einwirkung von Lysin)
adsorbiertes Anatoxin (erhalten mit Einwirkung von Lysin)
Untersuchung der Impfkraft flüssiger Anatoxino, erhalten durch '
Einwirkung von 0,0263M Glutaraldehyd nach unterschiedlichen Berührungszeiten bei einem teilweise gereinigten (P9) Diph-'
terietoxin rnit 2000 UF/ccrn
Die Tabelle 16 zeigt wiederum, daß sich der Verlust im Ausflokkungstiter
mit der Berührungszeit bei 370C. erhöht.
Die verschiedenen Anatoxine wurden auf 30 üF/'ccm, bezogen auf
den Ausgangstiter, verdünnt und in flüssiger Form an Keerschweinchen
injiziert.
409847/1137
Die Tabelle 17 zeigt, daß sich der nach dieser Impfung erhaltene
Antikörperu/ert nach 1 Minute Berührungszeit senkt. Somit gibt
es keine Bildung eines Derivates mit vergleichbarer Impfkraft luxe die oben untersuchten, adsorbierten Anatoxine.
409847/1137
flüssiges Anatoxine mit 30 UF/ccm, erhalten nach 3-stündiger Berührung
mit Glutaraldehyd einer Entjlconzentratian von 0«00263M
mit Glutaraldehyd einer Entjlconzentratian von 0«00263M
| 1 . I η j e k t. | 24 | festgestelltas | Gericht | m α oaer | andere Beobach | tungen nach | |
| 280 | RAS | std 48 std | 4 Tags | 5 Tage | 2 Wochen 2. Iniekt. |
3 Wochen | |
| 275 | ■ , LI | TL I | RAS | 320 | 330 | 380 | |
| 300 | RAS | RAS ' | TF R | 325 | 340 | 380 | |
| 280 | tr | RAS | RAS | 340 | 370 | 41.0 | |
| O | 2 80 | RAS | TF R | Pi-J TF R | 325 | 360 TrN | 420 |
| CO OO |
310 | RAS | RAS | RAS | 315 | 320 | 360 |
| *■» | RAS | N | 325 | 360 | 400 | ||
CD OO CO
Flüssiges Anatoxin mit 30 ÜF/ccm, erhalten nach 3-stündiger Berührung mit Glutar- ■
aldehyd einer Endkonzentration von 0,00263M und nach Einwirkung von Lysin mährend
1 5 min bei 37 c.
CO CD
CO
| festqestelltes | 24 std | Gewicht in c | j oder anaere | Beobachtunqen nach | 2 Wochen 2. In.iekt. |
3 Wochen |
| 1. Injekt. | LI | 48 std | 4 Tage | 5 Tage | 360 | 390 |
| 310 | RAS | LI | TL I | 320 | 340- | 3BO |
| 290 | RAS | RAS | RAS | 290 | 350 | 390 |
| 295 | LI | RAS | RAS | 310 | 320 | 350 |
| 280 | LI | RAS | RAS | 300 | 290 | 310 · |
| 260 | RAS | Er TLI | TLI | 270 | 360 | 390 |
| 310 | TLI | RAS | 330 |
ι U tu
TO K)
CD CD CO
Anatoxin, adsorbiert auf 30 UF/ccm, erhalten nach 3-stündiger Berührung mit Glütaraldehyd einer Endkonzentration von 0,00263M bei 37 C.
|
festgestelltes Gewicht in q .oder 'andere Beobachtungen nach
O
(O
OO
(O
OO
| 1. In.i'ekt. | 24 | std | 48 | std | 4 | Taqe | 5 Taqe | 2 Wochen | 3 Wochen |
| 2. In.iekt. | |||||||||
| 290 ' | Er | 14 | Er | 14 | N | rosa | 320 | 350 N | 365 N |
| 280 | Er | 12 | ER | 12 | N | rosa | 315 | 340N | 340 N |
| 290 | TR | R | TF | R | IM | rasa | 325 | 340 . ■ | 400 N |
| 270 | LI | LI | P | Er | 325 | 350 | 380 RAS ' | ||
| 270 | Er | 12 | Er | 12 | N | rosa | 300 | 340 H | 370 N |
| 290 | TF | R | Er | 10 | PN | P Er | 315 | 380 | 410 PN |
K) IS)
CD OO CO
Tabelle 14 . ;
Anatoxin, adsorbiert auf 30 UF/ccm., erhalten nach 3-stündiger Berührung mit Glutar
aldehyd einer Endkonzentration von 0,00263M und nach Einwirkung von Lysin während
15 min bei 37 C.
festgestelltes Geiujcht in q oder andere Beobachtungen nach
O CD OO
| 1. Injekt. | 24 | S UO | 48 | std | 4 | Tage | 5 Tage | 2 Wochen 2. Iniekt. |
3 Wochen |
| 300 | Er | 1 1 | Er | 11' | N | rosa | 350 | 370 N | 400 |
| 310 | Er | 11 | Er | 11 | .N | iweißrosa | 335 | 350 TM | 360 |
| 250 | Er | 11 | Er | 11 | PN | lcht. rosa | 320 | 320 | 350 |
| 300 | RAS | TF | R | 300 | 360 | 4OU | |||
| 310 | Er | 11 | Er | 11 | N | rosa | 330 | 350 N | 370 |
| 300 | Er | 20 | Er | 15 | i\l | rosa | 325 | 340 N ' | 390 |
Zirkulierender Antidphtherie-Antikörpertiter nach 2 Impfinjektionen mit
flüssigen oder adsorbierten Anatoxinen, die nach 3-stündigar Bebrütung
bsi 37 C. mit einer 0,00263Fi Glutaraldehydlüsung erhalten waren, wobei
die Reaktion durch Lysineinwirkung oder Dialyse abgebrochen
flüssigen oder adsorbierten Anatoxinen, die nach 3-stündigar Bebrütung
bsi 37 C. mit einer 0,00263Fi Glutaraldehydlüsung erhalten waren, wobei
die Reaktion durch Lysineinwirkung oder Dialyse abgebrochen
. UJUrde ; ;
Bebrütungzeit , zirkulierender Antikörpertiter in internat. Antikörpereinhsiten/ccm
bei 37 C. flüssige Vaccine adsorbierte Vaccine
bei 37 C. flüssige Vaccine adsorbierte Vaccine
mit 30 'JF/ccrn
mit 30 UF/ccm
| 3 | S | td | min | Lysin | ο, | 75 | 2 | 5 |
| 3 | S | td η | 0, | 75 | 2, | |||
| - 15 | ||||||||
Die Titer wurden an entnommenen Blutmischungen gleichen Volumens bestimmt
O CO CJ
3*
Tabelle 16 2421083
Untersuchung der Impfkraft flüssiger Anatoxine, erhalten
durch Einwirkung von 0,0263H Glutaraldehyd auf ein teilweise gereinigtes (P?) Diphterietoxin mit 2000 UF/ccn
1« Herstellung der Anatoxine
Berühr.zeit Ausflockung vor Dialyse Ausflockung nach Dialyse
bei 37 C. UF/ccn Kf UF/ccm Kf
| 1 min | 1650 | 4 | min | 1200 | 4 min |
| 3 std | 1260 | 55 | min | 1170 | 1 std |
| 24 std | 1060 | 1 | std 30 | 1000 | 4 std |
| 3 Tage | 1000 | 24 | std | 900 | 24 std |
| 1 Woche | 900 | 24 | std | 900 | 24 std |
2. Zirkulierender Diphterie-Antikörpertiter, ausgedrückt in
internationalen antitoxischen Einheiten nach 2 Impfinjektionen
verschiedener Anatoxine
Berühr.zeit flüssige Anatoxine mit 30 UF/ccm bei 37 C. internat. antitox. Einh./ccrn
1 min 0,25
3 std < 0,01
std <0,01
3 Tage <0,01
1 Woche <O,O1
Im folgenden werden die Ergebnisse einer Entgiftung von einoa "
teilweise gereinigten (P3) Diphterietoxin mit 2500 UF/ccm durch
Glutaraloehydeinwirkung einer Endkonzentration von 0,0263K während
unterschiedlicher Berührungszeiten angegeben. Weiterhin uurde cie I.pfkraft der verschiedenen, so erhaltenen Anatoxine
untersucht.
409847/1137
Es wurden die folgenden Berührungszeiten angewendet:
1 min,' 7 min, 20 min, 1 std, 3 std und 19 std.
Die Tabelle 17a zeigt, daß das Toxin bereits nach 1 Minute langer Berührung entgiftet ist.und daß seine Ausflockungskraft als
Funktion der Berührungzeit weitgehend verringert ist. 2») Durchgang durch eine Sephadex G 100 Kolonne - .
Die nach Durchgang von 10 ecm als Standard dienenden P2 Diphtherietoxin
mit 2500 UF/ccm zeigt eine üblicherweise einem monomeren Toxin entsprechende Spitze im Rohr Nr. 26.
Nach Durchgang von 10 ecm der verschiedenen Anatoxine liegen dagegen
die Spitzen bei. Rohr Nr. 16, was die Anwesenheit
von Proteinen mit erhöhtem Molekulargewicht entsprechend den polymerisierten.Toxinen anzeigt.
Die Menge an polymerem Toxin erhöht sich mit der Berührungszeit bei 370C.
Die Tabelle 17 b zeigt die erhaltenen Ergebnisse, Es ist interessant,
die Beziehung zwischen den Entgiftungsergebnissen und
dem Maß an Polymerisation der Toxine festzustellen. 3e länger die Reaktionsdauer ist, umso höher wird, wie ersichtlich, die
Menge an polymerem Toxin, während die Entgiftung sehr früh abgebrochen
werden muß, um zu interessanten Vaccinen zu führen. Erfindungsgemäß wird daher das Polymsrisationsausmaß der Toxine
begrenzt.
409847/1137
3.) Untersuchung der Impfkraft·der polymeren Spitzen
(Rohr Nr. 16)
Die in den Rohren Nr- 16 erhaltenen Anatox'ine u/urden in
flüssiger und auf 30 UF/ccm verdünnter Form injiziert.
Die nach 1 und 7 Minuten Berührung mit Glutaraldehyd erhaltenen Anatoxine ergaben einen höheren Antikörpertiter als die nach
Formolbehandlung eines Toxins erhaltenen Materialien.
Die Titer nehmen mit längerer Berührungzeit ab (Tabelle 17c).
4G9847/1137
Untersuchung der Impfkraft flüssiger Anatoxine aus der Einwirkung von Glutaraldehyd
(0,0263M) u/ährend unterschiedlicher Berührungszeit eines teilweise
gereinigten (P2) Oiphterietoxins mit 2500 LJF/ccm
gereinigten (P2) Oiphterietoxins mit 2500 LJF/ccm
3. Entgiftung des (P„) Toxins
Berühr.zeit
bei 37°C.
bei 37°C.
UF/ccm KF
Unschädlichkeitstest bei Meerschweinchen, festqest« nach,
in.jiz. 2 Tage 3 Tage 4 Tage 5 Tage 6 Tage 7 Tage
| 1 | min | 1600 | 3 | min | 355 350 |
RAS RAS |
RAS RAS |
RAS RAS |
RAS RAS |
RAS RAS |
• 330 380 |
| 7 | min | 1140 | 3 | min | 350 375 |
RAS RAS |
RAS RAS |
RAS RAS |
RAS RAS |
RAS RAS |
360 4OG |
| 20 | min | 875 | 3 | min | 335 310 |
RAS RAS |
RAS RAS |
·. RAS RAS |
RAS RAS |
RAS RAS |
370 370 |
| 1 | std | 720 | 4 | min | 345 345 |
RAS RAS |
RAS RAS |
RAS RAS |
RAS RAS |
RAS RAS |
360 370 |
| 3 | std | 525 | 5 | min | 350 345 |
RAS RAS |
RAS RAS |
RAS RAS |
RAS RAS |
RAS RAS |
350 380 |
| 19 | std | 400 | 1, | 5 min | 320 305 |
RAS RAS |
RAS RAS |
RAS RAS |
RAS RAS |
RAS RAS |
350 330 |
O OO CO
Ergebnisse nach Durchgang des teilweise (P2) gereinigten Diphterietoxins mit 2500 UF/ccm
durch eine Kolonne; Entgiftung durch Einwirkung von 0,0263M GlutaiaLdehyd mährend
unterschiedlicher Berührungszeiten
Glutaraldehyd Kontrolle Berühr.zeit;
bei 37 C.
UF/ccm
Art des Toxins
1 min 7 min 20 min 1 std
2500 1600
monomer (Rohr Nr. 26)
1140
875
720
std 525
19 std
400
polymer (Rohr Nr. 16)
aiacnsende Kenge
Zirkulierender Diphterie-Antikörpertiter in internat.
antitoxischen Einheiten nach 2 Impfinjektionen unterschiedlicher,
auf 30 Ur/ccm verdünnter Anatoxine
Anatoxine, erhalten durch
Einwirkung von Glutaraldehyd UAl/ccm ' .
bei 37 C. nach
;
1 min 1
7 min , 0,50
20 min 0,25
Ί std 0,25
3 std 0,25
19 std 0,075
Kontrolle (Formal) 0,25
Weiterhin wurde die Entgiftung eines teilweise gereinigten (P2)
Diphterietoxins mit 3000 UF/ccm durch Glutaraldehydeinwirkung bei unterschiedlichen Endkonzentrationen und Berührungszeiten
untersucht.
Es wurden "die folgenden Konzentrationen verwendet: 0-,00263Mj 0-,00526M; 0,00789M; 0,0105M; 0,0131H; O,O157M.
Die Berührungszeiten variierten von 5 Minuten bis zu 3 Stunden.
Die Tabelle 17d zsigt, daß man nach 30 Minuten Berührung bei
37 C. für Konzentrationen des Glutaraldehyd von 0,0157M und
O,O131M, nach 1 Stunde bei einer Konzentration von 0,0105M und
nach 3 Stunden bei einer Konzentration von 0,0789R die Entgiftung
erreicht. Die der Einwirkung von Konzentrationen von 0,00526f".
und 0,00263K; unterworfenen Proben wurden nach 3-stünciger Berührung
nicht entgiftet.
409847/1137
•Td · 2421083 Entgiftung von teilweise gereinigtem (P7) Diphterietoxin
bei 3000 UF/ccm durch Glutaraldehydeiniuirkung bei unterschiedlichen Endkonzentrationen und Berührungszeiten
Konzentration Berühr.zeit
UF/ccni . Toxizität (festgestellt bei Keerschweinchen)
0,00263M
0,00526M
0,00526H
0,00526H
0,00789R
0,0105K
0, 0131Fi
0,0157M
1 std 3 std
15 min 1 std 3 std
15 min 1 std 3 std
5 min 30 min 1 std
5 min 30 min 1 std
5 min 30 min
1 std
2400 2200
2280 2000 1950 2200 1800 1500 2280 1800
1500 2375 1400 1350
1800 1290 1200
toxisch
toxisch
toxisch entgiftet
toxisch entgiftet
toxisch entgiftet
toxisch entgiftet
1,- Einwirkung von Glutaraldehyd auf gereinigtes Toxin mit
500 UF/ccm .
Die Tabelle 18 zeigt die Uersuchsergebnisse mit einer Glutaraldahydandkonzentration
von 0,00263M.
Nach einer Berührung von einer Minute erhielt man eine vollständige
Entgiftung. Festgestellt iuird eine stärkere Verringerung
des Ausflockungstiters als mit Formol bei einer Berührungszeit über oder um 1 Stunde.
409847/1137
2. Herstellung von Tetanus-Anatoxinen durch Einwirkung von Glträt Glutaraldehyd oder Formol und Vergleich der Impfkraft flüssiger
oder adsorbierter Vaccine . ._
Die Anatoxinpräparate wurden nach 5 Minuten und 1-stündiger Berührung
mit Glutaraldehyd untersucht, wobei als Vergleichsgrundlage ein bei üblichen Bedingungen durch Formol entgiftetes Anatoxin
verwendet wurde.
Die 6 Impfstoffe wurden sehr gut vertragen; es wurden weder eine
Reaktion noch eine Gewichtsverminderung bei den untersuchten Tieren beobachtet.
Die Tabelle 19 zeigt die zirkulierenden Antikörpertiter. Die durch Einwirkung von Glutaraldehyd erhaltenen Vaccine, und
insbesondere die nach 5 Minuten langer Berührung erhaltenen, zeigten eine höhere Imrnunogenkraft als die durch Einwirkung von
Formol erhaltenen Stoffe.
Die mit Glutaraldehyd hergestellten, flüssigen oder adsorbierten Anatoxine ergaben praktisch das gleiche Immunisierungsansprechen,
während das durch Einwirkung von Formol hergestellte, adsorbierte Anatoxin ein besseres Ansprechen als dasselbe flüssige Präparat
ergibt.
Weiterhin wurde die Entgiftung von gereinigtem Tetanustoxin mit 525 UF/ccm durch Glutaraldehydeinwirkung unterschiedlicher Endkonzentrationen
und bei unterschiedlichen Berührungszeiten untersucht.
Es wurden die folgenden Konzentrationen verwendet:
0,002631··.; 0,00', 97K; 0,υυΐ3ΐΠ; 0,00066Κ; 0,G0033K.
409847/1137
Die Tabelle 19a zeigt, daß die Entgiftung nach 15 Minuten Berührung
bei 370C. bei Glutaraldehydkonzentrationen υοη 0,00263Γϊ und
0,00197M, nach 30 'Minuten bei Konzentrationen von O,OO131M erzielt
mird. Die der Einwirkung von Konzentrationen von 0,00066Γ·"ι
und 0,00033M unterworfenen Proben wurden selbst in 3-stündiger
Berührung nicht entgiftet.
■ Entgiftung von gereinigtem Tetanustoxin mit 525 UF/ccm
durch Glutaraldehydeiniuirkung bei unterschiedlicher
Endkonzentration und Berührungszeit
Konzentration Berühr.
zeit
UF/ccm Toxizität (festgestellt bei
Mäusen)
0,00263R
O,GO197M
0f00i3iM
1 min 5 min
470 450
15 min 30 min 1 std 3 std
420 400 380 350
1 in 5 min
480 470
15 min 30 min 1 std 3 std
450 425 400 390
5 min 1 5 min
470 450
30 min 1 std 3 std
430 425 400
toxisch
entgiftet
toxisch
entgiftet
toxisch
entgiftet
| 1 5 min | 470 | toxisch | |
| 0,00066h | 30 min | 470 | |
| 1 std | 460 | ||
| 3 std | 460 | ||
| 15 min | 470 | toxisch | |
| 0,00033M | 30 min 1 std |
450 460 |
|
| 3 std | 460 | ||
409847/ 1137
C. Einwirkung von Glutaraldehyd auf rohesp(-Staphylococcustoxin
mit 10 DCH/ccm (0,040 mo proteinischer Stickstoff pro ecm)
Die .Tabellen 20 und 21 "zeigen die Ergebnisse der Einu/irkung von
Glutaraldehyd mit Endkonzentrationen von 0,0526M und 0,00526M.-
Die Einwirkung von Glutaraldehyd einer Konzentration von 0,0526M,
d.h. entsprechend der üblicherweise zum Entgiften dieses Toxins während einer Dauer von mindestens einer Woche bei 37 C. verwendeten
Formolmenge ergab eine sofortige Entgiftung des Toxins.
Nach 1-wDchiger Berührung bei 37 C. uiurde ein vollständiger Verlust
des Titers festgestellt.
Im Gegensatz dazu bewirkte eine Konzentration von 0,00526H nach
1-WDchiger Berührung' bei 37 C. keine Entgiftung.
Die Tabelle 22 zeigt, daß eine Glutaraldehydkonzentration von
0,0263ί·Ί zum Entgiften des rohen Toxins in 5 Minuten ausreicht,
wobei sich der Titer nach einer einstündigen Berührung verringert.
0,0263ί·Ί zum Entgiften des rohen Toxins in 5 Minuten ausreicht,
wobei sich der Titer nach einer einstündigen Berührung verringert.
Die Tabelle 23 zeigt, daß der Titer mährend einer Konservierung
des Anatoxins bei +4 C. in Anwesenheit von Glutaraldehyd unverändert
blieb, während, uiie bereits erwähnt, durch Bebrütung bei
37 C. eine Verringerung festgestellt wurde.
Die Tabelle 24 bestätigt die optimale Glutaraldehydkonzentration von 0,0263M zum Entgiften von rohem Toxin bei 10 U/ccm in 5 Minuten
bei üblicher Temperatur ohne Verlust des Titers, wenn die
Berührungszeit nicht überschritten wird.
Berührungszeit nicht überschritten wird.
409847/1137
Entgiftung von gereinigtem Tetanustoxin mit 500 UF/ccm durch Einwirkung von Glutar-
aldehyd einer Endkonzentration von 0,00263M
Berühr.zeit UF/ccm Kf injiz. Unschädlichkeitstest bei Mäusen*; . festgestellt nach
bei 370C._ Verdünn.·__ __2_4_s_t_d 4B s.td 72 std 6 Tage
| 1 | min | 430 | 20 min | 1/10 1/100 |
RAS ■ RAS |
RAS RAS |
RAS RAS |
RAS' RAS |
| 1 | std | 330 | 40 min | 1/10 1/100 . |
RAS RAS |
RAS RAS |
RAS RAS |
RAS RAS ' |
| "3 | std | 330 | 60 min | 1/10 1/100 |
RAS RAS |
RAS RAS |
RAS RAS |
RAS RAS |
6 std
3.3 0
60 min
I/IO 1/1OO
RAS RAS
RAS R A3
RAS RAS
RAS RAS
| 24 | std | 300 | 1 | std | 10 | I/IO I/IOO |
RAS RAS |
RAS . RAS |
RAS .RAS |
RAS RAS |
| 48 | std | 300 | 1 | std | 15 | I/IO 1/100 |
RAS RAS |
RAS RAS |
RAS RAS |
RAS RAS |
| 1 | Woche | 300 | 1 | std | 15 | 1/10 I/IOO |
RAS RAS |
- ' RAS RAS |
RAS RAS |
RAS RAS |
| 2 | Wochen | 300 | 1 | std | 15 | I/IO I/IOO |
RAS RAS |
RAS RAS |
.RAS ■■■ RAS |
R.AS RAS |
= drei Mäuse erhielten intramuskulär nach Verdünnung auf 1 /1*0 und 1/1OO mit einer
physiologischen Kochsalzlösung eine Injektion von 1 ecm
Zirkulierender antitetanischer Antikörpertiter, ausgedrückt in internat. antitoxischen
Einheiten nach zwei Impfinjektionen mit flüssigen ader adsorbierten
Anatoxinen, erhalten nach ·
a) 5 Minuten langer Bebrütung bei 37 C. mit einer Glutaraldehydlösung von 0,00263M
b) 1-stündiger Bebrütung bei 37 C. mit einer Glutaraldehydlösung von'Q,00263M
c) 2-uiöchiger Bebrütung bei 37 C. mit 2 %a Formol
Anatoxine, erhalten durch flüssiges Vaccin mit 30 UF/ccm adsorbiertes Vaccin mit 30 UF/ccm
Einwirkung von intern.antitox. Einheiten/ccm in tern, antitox. Einheit en/ecm
^>a (a) Glutaraldehyd (5 min 9ς 97 ς
O Berührung) ■ ' co
,**. (b) Glutaraldehyd (1 std _π . 'on
-J Berührung) 20 - 20
«j, (c) Forrnol 2 8 '
Die Blutentnahme erfolgte 2 Wochen tach der zuzeiten Injektion. Die Seren von 6 geimpften *♦*
Meerschweinchen in jeder Gruppe uiurden auf ein gleiches Volumen gemischt. '
CD OO CO
H*
Entgiftung von rohem oC-Staphyiococcentoxin durch
Einwirkung uon Glutaraldehyd einer Endkahzentration
von 0,0526K
Berühr, zeit
bsi 370C.
bsi 370C.
DiiH/cpm DCH/ccm Titrierunqsv/erfahren
Toxin Anatoxin
Kontrolle
.5 min
1 std
1 std
3 std
6 std
24 std
6 std
24 std
4 Tage
1 Woche
2048
0 0. 0 0 0 0 0
10 10
| 0 | 7 |
| 0 | 7 |
| 0 | 5 |
| 0 | 3 |
| 0 | 2 |
| 0 | 1 |
| 0 d |
|
| Tabelle 21 |
= Toxin ohne Glutaraldehyd
Entgiftung des rohen c^-Toxins durch Einwirkung von
Glutaraldehyd einer Endkonzentration von 0,00526F.
DCH/ccm litrierunqsverfahren
Toxin Anatoxin
| Berühr.zeit bei 37 C |
ühH/c |
| Kontrolle* | 2048 |
| 5 min | 1024 |
| 1 std · | 1 024 |
| 3 std | 512 |
| 6 std | 256 |
| 24 std | 256 |
| 4 Tage 1 Woche |
256 512 |
10
10
10
10
10 8 8 8
= Toxin ohne Glutaraldehyd
409847/1
Entgiftung des rohen e<w-Toxins durch Einwirkung von
Glutaraldehyd einer unterschiedlichen Endkonzentration
Endkonzentration Berühr, zeit bei DKH/ccrn DCH/ccm
normafer Temp.
| Toxin ohne Glutarladehyd |
-- | 2048 | Tabelle.23 | 10 |
| O,0131M | 5- min 1 std |
64 32 |
10 10 |
|
| Ö,D263M | 5 min 1 std |
0 0 |
10 B |
|
| 0,0394M | 5 min • 1 std |
0 0 |
10 | |
| D..0526M | 5 min . 1 std |
0 0 |
10 | |
Stabilität des Titers eines rohen 0(-Toxins, entgiftet,
durch Glutaraldehyd einer Endkonzentration von 0,0263H
| Konservierungs- | Konservierunqstemperatur | +37UC. DGH/ccm |
| zeit | 40C. DCH/ccm |
10 |
| 5 min | 10 | 6,6 |
| 24 std | 10 | |
| 3 Tage | 10 | 6,6 |
| 4 Tage | 10 | — |
| 5 Tage | 10 | 5 |
| 1 Woche | 10 | 5 |
| 2 Wochen | 10 | — |
| 3 Wochen | 10 | |
| 1 Monat | 10 |
409847/1137
Entgiftung von rohem (X-Staphylococcustoxin durch Glutaraldehyd unterschiedlicher
Konzentration bei normaler Temperatur. (Berühr.zsit = 5 min)
| Glutaraldehyd einer Endkon- zentration von |
Toxin ohne Glutaralde hyd |
0,00526M | 0,0141M | 0,0263Fi | 0,0394M | 0,0526 | ■ | |
| DMH/ccm DCH/ccm |
2048 10 |
1024 10 |
128 10 |
0 10 |
0 io |
0 10 |
||
| ►09847/' | • | • | ||||||
| M37 |
CD OD U)
2421Q83
D) Einwirkung von Glutaraldehyd auf gereinigtes </-Staphy~
lococcustoxin ;
Die Tabelle 25 zeigt die -Wirkung unterschiedlicher Glutaraldehydkonzentrationen
nach Zugabe zu einem gereinigten oC -Staphylococcus·
toxin; ωίε ersichtlich, ist die Konzentration von 0,00526M zum
Entgiften eines Toxins won 137 DCH/ccm (Gesamtstickstoff 0,633
mg/ccir.) am günstigsten.
Die Tabelle 26 zeigt die Stabilität dieses bei 4 C. und 37 C.
konseruierten Anatoxins (behandelt mit Lysin einer Konzentration von 0,1Fi oder einer Dialyse unterujorf en).
Entgiftung von gereinigtem (A-Staphyolococcustoxin mit
137 DCH/ccm (Gesamtstickstoff 0,633 mg/ccm) in Bicarbonatlösung
(F.orthiolat auf 1/1O OOü) durch Glutaraldehyd
unterschiedlicher Konzentration
Berühr.zeit O,OO131M
bei normal. Temp.
0,00263F, 0,00526i*1. 0,0131 Fi
| ζ.5 min | DKH/ecm | ^1000 | ^1000 > | 1000 | <50 |
| 30 min | ui.H/ccn | ^1000 | ^1000 | >1O | ^1O |
| 1 std | DFiH/ccfn DCü/ccm |
nicht ent- qiftet |
nicht ent giftet |
138 | 66 |
| Ausbeut | S | — — | 100 -O | 50 ,'-. |
btabilitätskontrolle eines gereinigten «X-Staphylococcustoxins
πit 137 DCH/ccm in Bicarbonatlüsung; 1 g/l durch
0,00526t-i Glutaraldehyd
| ohn | e Lysin'· | 370C. | mit | Lysin*' | 37°C. | |
| nach Dialyse u-'.H/ccin in vivo |
RAS | RAS | <8 RAS |
<8 RAS |
||
| nach 20 Taoen bsi | A0C. | <8 RAS |
A0C. | <8 RAS |
||
| DF.H/ccm in vivo |
RAS | <8 RAS |
||||
| nach 31 Tagen in vivo |
<8 RAS |
RAS |
A09847/ 1 137
Sl
*■ = ohne Lysin Dialyse gegen NaCl (9/oa-ig) una tferthiolat
. (1/1Π 000)
** nach 15 Minuten bei 370C. mit Lysin einer Endkonzentration
** nach 15 Minuten bei 370C. mit Lysin einer Endkonzentration
0,01K und Dialyse gegen NaCl (9$}o-ia) und Merthiolat
(1/10 000)
E) Untersuchung der Impfkraft Gines rohen Staphylococcustoxins,
entgiftet durch Glutaraldehyd und dann gereinigt und auf einen Titer gebracht, der demjenigen der bekannten
Formolvaccine äquivalent ist
Die Tabelle 27 zeigt,·daß die Immunogenkraft einss durch Glutaraldehyd
entgifteten Toxins gleich derjenigen des durch Formol entgifteten Toxins ist.
In Tabelle 28 ist* die Entwicklung der Antikörperujerte bei den
geimpften Tieren dargestellt.
Tabelle 29 zeigt, daß sich die Immunogenkraft nach Impfung mit
einem rohen, durch überschüssiges Glutaraldehyd entgifteten Toxin, d.h. entsprechend einar Konzentration von 0,0526Γ·Ί, verringert.
■ " . .
Vergleichsmerte des Antistaphylolysentiters, erhalten
nach Impfung von Kaninchen mit gereinigten c(-Anatoxinen von 6,6 DCH/ccm
Entgiftung durch Entgiftung durch Formol" (4/bo-ig) Glutaraldehyd einer
und Lagerung bei Endkonzentration von
0,0263f,; Berührungszeit = 5 min
37°C.
Antistaphylolysiniuert
riss Kaninchenserums
nach 3 intramuskul.
Injektionen von 1 ecm alle 15 Tage; Blutentnahme 15 Tage nach der letzten Injektion
nach 3 intramuskul.
Injektionen von 1 ecm alle 15 Tage; Blutentnahme 15 Tage nach der letzten Injektion
2 U/ccm
10 U/ccm
10 U/ccm
3 U/ccm
3 U/ccm 3 U/ccm
3 U/ccm
409847/1 137
Entwicklung der Antikörperuierte nach -Impfung mit
gereinigten J^ -Staphylococcus-Anatoxinen, entgiftet
durch
1) Formol (4,5 foo-ft) + 9 Tage bei 37 C.
2) Glutaraldehyd einer Endkonzentration von 0,0263Fi
und 5 Minuten langer Berührung
Titer des gereinigten Toxins = 6,6 DCH/ccm ,
Zahl der Antistaphylolysinwert im Kaninchenserum nach Impfung
Injektion mit Anatoxin
| entgiftet | ,1 | <o, | durch | Form öl | entgiftet durch aldehyd |
,1 <0,1 < | 0 | Glutar | |
| O | Kontr..<0 | ,1 | o, | 1 < | CO,1 | ^O1 | ,5 0,5 | 0 | |
| 1 | O | ,1 | ' 3 | VJl | 0,1 | o, | 2 | 2 | ,1 |
| 2 | O | 10 | 3 | 2 | 3 | 3 | |||
| 3 | 2 | 3 | 3 |
Die Versuchsbedingungen waren wie folgt: Die Kaninchen erhielten intramuskulär alle 15 Tage 1 ecm Impfstoff injiziert. Die Blutentnahme
erfolgte 15 Tage nach jeder Impfung.
Entwicklung des Antikörpertiters nach Impfung von Kaninchen
mit rohem (A-Staphylococcus-Anatoxin, entgiftet durch über-,
schüssigen Glutaraldehyd (Endkonzentration 0,052611)
Titer ; <1 DCH/ccm
Zahl der Antistaphylolysiniyert in DCH/ccm im Kaninchenserum
Injektion nach Impfung mit dem Anatoxin
KO, 1 0,1 0,5 0,5
Die Versuchsbedingungen waren wie folgt: Die Kaninchen wurden alle 15 Tage intramuskulär mit 1 ecm Impfstoff geimpft. Die Blutentnahme
erfolgte 15 Tage nach jeder Impfung.
| 0 | Kontr. | S 0, | 1 | <o | ,1 |
| 1 | o, | 1 | 0 | ,1 | |
| 2 | 1 | 0 | ,5 | ||
| 3 | 1 | 0 | ,5 |
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si
F) Einwirkung von Glutaraldehyc! auf rohes ß-Staphylococcus-»
toxin
Die Tabellen 30 und 31 betreffen ein Toxin mit 1,25 DCH/ccm, das
nicht durch Glutäraldehyd bei Konzentrationen von 0,0526f-"i und
G,O131M entgiftet worden urnr.
Die Tabellen 32 und 33 betreffen ein Toxin mit 6,6 DCH/ccm, das nicht durch Glutaralaehyd bei Konzentrationen von 0,0526M und
0,01 31M entgiftet morden war.
Die Tabellen 34 und 35 betreffen ein 6-Toxin mit 10 DCH/ccm und
eine Glutaraldehydkanzentration von 0,0526Fi und 0,0789H. Die
0,0526M Glutarladehydlösung entgiftete das Toxin nicht, mährend
Glutäraldehyd einer Konzentration von 0,0789H wirksam war. Das
Q-Toxin mit 10 DCH/ccm wurde in 5 Minuten mit 100-/£iger Ausbeute
entgiftet; wiederum wurde eine Verringerung des Titers bei längerer Berührung von 24 Stunden bei 37 C. festgestellt.
Die Ergebnisse dieser Versuche zeigen eine direkte Beziehung zu/iechen dem Titer des Toxins, der Glutaraldehydkonzentration
und der Berührungzeit zur Erzielung einer vollständigen Entgiftung
mit erhöhter Ausbeute.
Der Einfluß der drei Parameter und der Weise, wie das Toxin
erhalten wird, sind auch in Tabelle 36 dargestellt.
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-Vf-
Tabelle 30
Entgiftung von rohem S-Toxin durch Glutaraldehydeintuirkung
einer Endkonzentration von Q,0526M
| Berühr.ze | it DKH/ecm | .128 | DCH/ccm - T | - | < 0,1 | ltrierUnqsverrrhren |
| bei 37 | C | 8 | Toxin | <0,1 | Anatoxin | |
| Kontr,* | 4 | . 1.25- | ohne Glutaraldehyd | 1,25 | ||
| 5 min | 0 | <0,7 | 0,7 | |||
| 1 std | 0 | <0,7 | Tabelle 31 | <0,7 | ||
| 3 std | 0 | <0,7 | <0,7 | |||
| 6 std | ■ 0 | __ | -- | |||
| 24 std | 0 | |||||
| 1 Woche | -- | |||||
| 2 Wochen | <0,1 | |||||
| * = Toxin | ||||||
Entgiftung von rohem ß-Toxin durch Glut-araldehydeiniuirkung
einer Endkonzentration van 0,01311s
| Berühr.zeit | DRH/ccm | - | 128 | DCH/ccm - | TitrierunqsvGrfahren |
| bei 37 C. | 128 | Toxin | Anatoxin | ||
| Kontr,* | 32 | 1,25 | 1,25 | ||
| 5 min | 32 | 1 | 1 | ||
| 1 std | 32 | 1,25 | 1 | ||
| 3 std· | 32 | 1 | 1 | ||
| 6 std | 32 | __ | -- | ||
| 24 std | 32 | <0,7 | <0,7 | ||
| 1 Woche | < 0,2 | -- | |||
| 2 Wochen | — — | — H |
= Toxin ohne Glutaraldehyd
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Entgiftung von rohem ß-Toxin durch Glutaraldehydeiniuirkung
einer Endkonzentration von 0,05261'.
| Berühr.zeit bei 370C.1 |
DMH/ccm | DCH/ccm - | Glutaraldehyd | Tabelle 33 | Titrier.unqsverfahren |
| Toxin | « | Anatoxin | |||
| Kontrolle* | 6096 | 6,6 | 6,6 | ||
| 5 min | 128 | 3 | 3 | ||
| .1 std | 32 | 2 | 2 | ||
| 3 std | 16 | 0,8 | 0,8 | ||
| 6 std | 16 | -- | -- | ||
| 1 Woche | 2 | 0 | -- | ||
| 2 Wochen | 0 | 0 | 0 | ||
| * = Toxin ohne | |||||
Entgiftung von rohern ß-ioxin durch Glutaraldehydeiniuirkung
einer Endkonzentration von 0,0131M
Berühr, zeit DHH/ccrn DCH/ccm - Titrierunqsvarf ahren
bei 37°C. Toxin Anatoxin
Kontrolle* 4096 6,6 6,6
5 min 1024 5 1 std 1024 5
3 std -- 5
6 std 1024 4 24 std 1024
1 Woche 1024 4
2 Wochen . 1024 2 * = Toxin ohne Glutaraldehyd
Entgiftung von rohem ß-Toxin durch Glutaraldehydeinuiirkung
einer Endkonzentration von 0,0526t'i
Berühr, zeit DMH/ccrn DCH/ccm -Titrierunqsverfahren
| 8000 | Toxin | Anatoxin | |
| Kontrolle* | 256 | 10 | 10 |
| 5 min | 122 | 6,6 | 10 |
| 1 std | 128 | 5 | 6,6 |
| 3 std. | 64 | 3 | 3 |
| 6 std | 8 | 2 | 3 |
| 24 std | o - | O | |
* = Toxin ohne Glutaraldehyd
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Entgiftung won rohem ß-Toxin durch Glutaraldehydeinwirkung
einer Endkonzentration von 0,0789M
Berühr.zeit DHH/ccm DCH/ccm -Titrierunqsverfahren
bei 370 C. ; Toxin Anatoxin
10 10
0 10 0 " 5
0 3
0 1
0 <0,5 * = Toxin ohne Glutaraldehyd
.Tabelle 36
Entgiftung von rohem ß-Toxin durch Glutaraldehyd in weniger als 5 Minuten bei normaler Temperatur
als Funktion von
- dem Titer des Toxins
- der Glutaraldehydkonzentration
- der Herkunft des Toxins
aus . errr.entisruorrichur.g: pH = 7,7
Rührkolbsn: ■ pH = 7
Die Ergebnisse sind in DHH/ccm angegeben.
Glutaraldehyd- Rührkolben; Fermentierungsvorrichtung
konzentration Titer in DCH/ccm Titer in DCH/ccm
| Kontrolle* | . 8000 |
| 5 min | 32 |
| 1 std | 0 |
| 3 std | 0 |
| 6. std | 0 |
| 24 std | 0 |
| ,0131K | 5 | 28 | 6,6 | 1 ,25 | - 5 | 6,6 | 10 ' | |
| 0 | ,0526l·! | 1 | 0 | 1024 | .64 | 256 | 1024 | -- |
| 0 | 0789M. | 0 | 0 | 0 | 64 | 64 | 256 | |
| o, | Einwirkung | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | ||
| von | Glutaraldehyd | auf versch | iedene | Gifte | ||||
Es wurden verschiedene Versuche zur Feststellung der Mindestzeit zum Entgiften verschiedener Gifte durchgeführt.
Nach mehreren Versuchen wurde eine Konzentration von 10,7 ecm
Glutaraldehydlösung pro 1 Gift verwendet, das selbst in einer Verdünnung von 4 g/l physiologischer Kochsalzlösung vorlag.
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- IiK -
Unter diesen Bedingungen sind d.ie Mindestzeiten zum Entgiften entsprechend der Gifte sehr unterschiedlich:
Aspis Berus· Ammodytes 3,5 std bei 37°C. Dendraspis , 9 std
Naja Naja ' 3 std
Mischung aus Naja Melanoleuca
Nigricollis . 3 std Haja
Mischung aus Bitis Gabonica
Lachesis 3 std Echis Carinatus
Nach Zugabe des Glutaraldehyd zur Giftlösung u/urden Gruppen von
je 6 Mäusen jade halbe Stunde injiziert.
Das Produkt luurde als entgiftet angesehen, luenn 4 der 6 Mäuse
eine intravenöse Injektion von 0,5 ecm einer Verdünnung von 1/1O überlebten. Zu diesem Zeitpunkt wurde die Einwirkung von
Glutaraldehyd blockiert, indem man dem Anagift eine gleiche Menge einer Lysinlösung zugab.
Verwendung der Anaqifte zur Hyperimmunisierunq von Pferden
Durch 1 Monate lange Immunisierung von Pferden durch 12 Injektionen wurden mit den folgenden Giften ausgezeichnete Ergebnisse
erzielt:
Aspis, Berus, Ammodytes, Dendraspis, Bitis Gabonica und Lachesis, und zwar entsprechend dem folgenden Protokoll
Montag 5 ecm
Mittwoch 10 ecm
Freitag 15 ecm
Kontag 20 ecm
Mittufoch 40 ecm
Freitag 60 ecm und 2,5 ecm Freund'sches Hilfsmittel
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Montag » BO ecm Donnerstag 120 ecm
Hontag 160 ecm und 2,5 ecm Fraund'sches Hilfsmittel
Donnerstag 200 ecm Montag 250 ecm
Die Blutentnahmen erfolgten 8.Tage nach der letzten Injektion.
Die in einem Monat erhaltenen Seren waren in jeder Hinsicht mit den nach dem klassischen Verfahren in 4 oder 6 Monaten erzielten
vergleichbar.
Bezüglich der Gifte von Echis Carinatus und den verschiedenen Naja-Arten war die Immunität der Pferde nach einem Monat Behändlung
mit Anagiften schwach, jedoch ausreichend, daß die Pferde
massive Dosen des reinen Giftes aushielten.
Impfversuche von Kaninchen mit' Anagiften von
Aspis, Berus, Ammodytes ;
Sechs Kaninchen erhielten eine intramuskuläre Injektion von
0,5 ecm Aspis, Berus, Ammodytes Gift in 4 foo-iger Konzentration,
das, wie beschrieben, vorher mit Glutaraldehyd und Lysin behandelt worden uiar. Die alle sieben Tage
in die Muskeln des.linken Schenkels gemachten Injektionen führten
zu keinerlei mechanischer Behinderung oder allgemeinen Reaktionen.
Eine Blutuntersuchung 20 Tage nach der ersten Injektion und.vor
der vierten Impfung zeigte eine gute Immunisierung der Tiere gegen die drei Gifte.
Somit erlaubt es die Verwendung von Glutaraldehyd zum Entgiften von Schlangengiften, Pferde in nur einem Monat anstelle von
4-6 Monaten nach den alten Verfahren zu hyperimmunisieren, und
Kaninchen können in mehreren Injekti.onen von 0,5'ecm gegen das
Gift von drei europäischen Vipern geimpft werden.
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Berühr.Zeit bei 370C.
Entgiftung v/on Berus-Gift in einer Lösung von 1 mg/ccm durch Einwirkung von
Glutaraldehyd in Endkonzentrationen von 0,02631·'] und 0,00263M
Glutaraldehyd in Endkonzentrationen von 0,02631·'] und 0,00263M
Unschädlichkeitstest bei Mäusen
Gift + Glut, aid. O, 0263M
std
std
std
std
std
std std
Gift + Glut.- Kontrolle I 0,0263M Glut.-ald;
0,00263Fi Gift ohne aldehyd in 9-$
Glut.-aldehyd NaCl
(Kontrolle II)
Glut.-aldehyd NaCl
(Kontrolle II)
Tod in 30 see Tod in 30 see Tod in 30 see Überleben
und in 1 min und in 1 min und in 1 min
2 Tote in 30 Tod in 2 min Tod in 30 see Überleben see, 2 Überleb.
2 Tote in see, 2 Überleb. Überleben
Überleben
Überleben
Überleben
und in 1 min
Tod in 2 min Tod in 30 see und in 1 min
Tod in ΙΟΙ 5 min
Tod in 30-35 min
Überleben Überleben
Tod in 30 see und in 1 min
Tod in 5 min Tod in 5 min
Überleben Überleben
Überleben Überleben
Tod in 5 min Überleben
Mäuse von 16-18 g erhielten Injektionen nach Verdünnung auf 1/1O
0,00263Γ·ί Glut.-aldehyd in 3-%o
NaCl
(Kontrolle III)
(Kontrolle III)
Überleben Überleben
Überleben Überleben
Überleben
Überleben Überleben
CD OO CO
Entgiftung von Haja Maja Gift in einer Lösung von
1. mg/ccm durch Glutaraldehydeinwirkung mit Endkonzentrationen
von O,0263M und Q,Q0263T'l
Berühr.zeit Unschädlichkeitstest bei Hausen*
bei 37 C, Kontrollgift Gift + Glutar- Gift und.Glutar-■ ".-.
aldehyd 0, Q263M aldehyd Q,00263H
0 std 3 Tote in 6 4 Tote in 4 min 3 Tote in 6 min? min; 1 Tote 1 Tote in 35 min
in 40 min
Ί std . 4 Tote in 4 Tote in 10 min 4 Tote in'10 min
6 min
2 std 4 Tote in 1 Tote in 30 min 4 Tote in 14 min
5 min
3 std 4 Tote in Überleben 3 Tote in 14 min,
6 min 1 Tote in 60 min
6 std 4 Tote in Überleben 3 Tote in 18 min, 6 min 1 Tote in 30 min
24 std 4 Tote in Überleben Überleben 6 min
48 std 4 Tote in Überleben . Überleben 10 min
* = Mäuse von 16-18 g erhielten Injektionen von 0,5 ecm einer auf
1/1O verdünnten Lösung.
Herstellung eines auf Calciumphosphat adsorbierten Impfstoffes gegen Aspis, Berus und Ammodyfces
1. Einwirkung von Glutaraldehyd
Eine Mischung der Gifte von Aspis, Berus und Ammodytes in 9-^igei·
fJatriumchloridlösung und mit einer Konzentration von jeweils '
1 mg/ccm jedes Giftes wurde durch Einwirkung von 0,0263H Glutaraldehyd
mährend 3 Stunden bei 370C. entgiftet. Nach Zugabe eines
gleichen Volumens Lysin (O1If-!, pH 6,8-7,00) wurde die Mischung
15 F.inuten bei 37 C. bebrütet und mehrere Tage im Eisschrank aufgehoben.
Während der Behandlung wurde das Präparat tief gelb.
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2. Herstellung des Impfstaffes
Zu 2 1 Anagift u/urde Merthiolat in einer Menge von 2 °/
zugefügt und das Präparat dann lange gegen eine Lösung aus
Na2HPO4 (0,07Fi mit 2 °/ooo Merthiolat.) dialysiert und
auf einem Seitz-Sterilisationsfilter filtriert. Dann u/urde ein
gleiches Volumen einer sterilen 0,07Fi Calciumchloridlösung zugefügt, u/odurch man einen auf Calciumphosphat adsorbiertes Impfstoff mit einem pH-Wert von 6,8-7,00 erhielt.
zugefügt und das Präparat dann lange gegen eine Lösung aus
Na2HPO4 (0,07Fi mit 2 °/ooo Merthiolat.) dialysiert und
auf einem Seitz-Sterilisationsfilter filtriert. Dann u/urde ein
gleiches Volumen einer sterilen 0,07Fi Calciumchloridlösung zugefügt, u/odurch man einen auf Calciumphosphat adsorbiertes Impfstoff mit einem pH-Wert von 6,8-7,00 erhielt.
Es ururden Kontrollen auf Sterilität, Stickstoff, Unschädlichkeit
und Immunodiffusicrn in Gelose nach unterschiedlichen Herstellungsstufen durchgeführt, nämlich
vor Dialyse gegen 0,07 Na2HPO4
vor Dialyse gegen 0,07 Na2HPO4
nach Dialyse gegen die Q,07M Lösung aus Na?HP0.
nach Filtration auf dem Seitz-Filter und
am Endprodukt (vgl. die Tabellen 39 bis 44).
H) Einwirkung von Glutaraldehyd auf q/L -Staphylococcos-Keine
Die Tabelle 45 zeigt, daß eine Glutaraldehydkonzentration von
0,0131Fi u/ährend 5 Minuten zum Inaktivieren von ©(-Staphyloceccus-Keimen auf eine Dichte von 25 D.O. NIH D.O. (optische Dichteeinheiten NIH (USA)) ausreicht.
nach Filtration auf dem Seitz-Filter und
am Endprodukt (vgl. die Tabellen 39 bis 44).
H) Einwirkung von Glutaraldehyd auf q/L -Staphylococcos-Keine
Die Tabelle 45 zeigt, daß eine Glutaraldehydkonzentration von
0,0131Fi u/ährend 5 Minuten zum Inaktivieren von ©(-Staphyloceccus-Keimen auf eine Dichte von 25 D.O. NIH D.O. (optische Dichteeinheiten NIH (USA)) ausreicht.
Die Tabelle 46 zeigt, daß sich der Agglutinationsu/ert bei Kanin-
geiuaschenen
chen, die mit dem so aktivierten,/und dann in 9-?&o-igem NaCl auf eine Dichte von 15 D.O. NIH gebrachten o(-Keimen sich regelmäßig erhöhte. Die Tabelle 47 zeigt, daß die Impfung dieselbe Erhöhung des Antikörpertiters wie eine Impfung mit of-Staphylococcus-Keimen bewirkt, die durch Wärme getötet u/urden.
chen, die mit dem so aktivierten,/und dann in 9-?&o-igem NaCl auf eine Dichte von 15 D.O. NIH gebrachten o(-Keimen sich regelmäßig erhöhte. Die Tabelle 47 zeigt, daß die Impfung dieselbe Erhöhung des Antikörpertiters wie eine Impfung mit of-Staphylococcus-Keimen bewirkt, die durch Wärme getötet u/urden.
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Herstellungsstofe Sterilität Stickstoff in des· Vaccins mqN/ccm
Immunoüiffusion
in Gelose
nach Dialyse gegen 0,07M Na0HPO. Lös.
0,207 '
zahlreiche Linien
nach Filtration
auf Seitz-Filter
auf Seitz-Filter
adsorbiertes
Uaccin
Uaccin
übereinstimmend
übereinstimmend
0,167
zahlreiche Linien
Verringerung der Zahl der Linien (bestehen bleibend)
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Unschädlichkeitskontrolle im Verlauf der Herstellung des Antigift-Impfstoffes
Polant-Antigift + 0,05M Lysin + 2 U/ooo Kerthiolat, nicht dialysiert.
Verdün. Geai.b. Unschädlichkeitstest bei Mäusen*
π j e kt. gemachte Beobachtungen
Tage
age
4 Tage 5 Tage 6 Tage
Gewicht;- g gem. Beobachtung Tage '
| 17 | RAS |
| 17 | tot |
| 17 | RAS |
| 17 | tot |
| 18 | RAS |
| 17 | RAS |
| 17 | RAS |
| 16 | RAS |
| 17 | RAS |
| 18 | RAS |
| 18 | RAS |
| 17 | RAS |
RAS RAS
RAS tot
| RAS | RAS |
| RAS | RAS |
| RAS | RAS |
| RAS | RAS |
| RAS | RAS |
| RAS | RAS |
| RAS | RAS |
| RAS | RAS |
| RAS | RAS |
RAS RAS RAS
20
21,5
23,5
RAS RAS RAS
1/10
RAS RAS
RAS RAS RAS RAS
RAS RAS
RAS RAS RAS RAS
25,5
22
22
25
25
25
21,5
25
25
21,5
RAS RAS
RAS RAS RAS RAS
= 6 Mäuse von 16-22 g erhielten eine subkutane Injektion von 0,5 ecm
Antigift-Uaccin + 0,05Ki Lysin+ 2 %ΰο ί-ierthiolat, gegen 0,07M
2 °/ooo Merthiolat dialysiart
und
Verdün. Getu.b.
Injekt,
Injekt,
. α
Unschädlichkeitstest bei Mäusen
gemachte Beobachtungen
Tage 3 Tage
4 Tage 5 Tage
6 Tage Gewicht; g gemachte Beobachtungen 7 Tage .
Nd
18
17.
18
17
18
16
RAS RAS RAS RAS RAS RAS
RAS RAS RAS RAS RAS RAS
| RAS | RAS |
| RAS | RAS |
| RAS | RAS |
| RAS | RAS |
| RAS | RAS |
| RAS | RAS |
| RAS | RAS |
| RAS | RAS |
| RAS | RAS |
| RAS | RAS |
| RAS | RAS |
| RAS | RAS |
RAS RAS .RAS RAS RAS RAS 21,5
25,5
24,5
23,5
RAS RAS RAS RAS RAS RAS
1/10
17
19
17
16
17
17
19
17
16
17
17
RAS RAS RAS RAS RAS RAS
RAS RAS RAS RAS RAS RAS
RAS RAS RAS RAS RAS RAS
20,5
25,5
RAS RAS RAS RAS RAS RAS
Antigift-Vaccin + 0,05M Lysin + 2 °/οαα Merthiolat, gegen D,07M Na2HPG4 und
Merthiolat dialyisert und auf einem Seitz-Filter filtriert
Merthiolat dialyisert und auf einem Seitz-Filter filtriert
7
ODO
Verdn. G
Unschädlichkeitstest bei Mäusen
|
ro <
• |
q | 24 std | qemachte | aeobachtunqen | 4 Taqe | 5 Taae | 6 Taqe | Geujicht; | 27 | g Beobachtung | RAS | |
| 21 | RAS | 48 std | 72 std | RA3 | RAS , | R'AS | 7 | 22 | Täqe | RAS | ||
| 21 | RAS | RAS | RAS | RAS | RAS | RAS | 28 | RAS | ||||
| Nd 22 | RAS | RAS | RAS | RAS | RAS | -RAS | • 27 | RAS | ||||
| 22 | RAS | RAS | RAS | RAS | RAS | RAS | '23 | RAS | ||||
| 18 | RAS | RAS | RAS | RAS | RAS | RAS | 26 | RAS | ||||
| O | 21 | RAS | RAS | RAS | RAS | RAS | RAS | 3D | RAS | |||
| CD | 22 | RAS | RAS | RAS | RAS | RAS | RAS | 23 | RAS | |||
| -J | 21 | RAS | RAS | RAS | RAS | RAS | RAS | 27 | RAS . | |||
| 1/10 22 | RAS | RAS | RAS | RAS | RAS | RAS | 27 | RAS | ||||
| ω | 22 | RAS | ' RAS | RAS | RAS | RAS | RAS | 18,5 . | •RAS | |||
| ■»J | 18,5 | RAS | RAS | RAS | RAS | RAS | RAS | 27 | RAS | |||
| 22 | RAS | RAS | RAS | RAS | RAS | RAS | ||||||
| RAS | RAS | |||||||||||
CD OO CO
| Verdun. Geiu.b. | 2 Tage | Tabelle 43 | 4Tage | 5 Tage | 6 Tage | Gewicht | ; g Beobachtung | RAS | |
| Injekt. | RAS | adsorbiertes Antigift-Vacein | RAS | RAS | RAS | 7 Tage | RAS | ||
| Q | RAS | Unschääilichkeitstest bei Mäusen* | RAS | RAS | RAS | 24 | RAS | ||
| 17 | RAS | qemachte Beobachtungen | RAS | RAS | RAS | 25 | RAS | ||
| 17 | RAS | 3 Taqe | RAS | RAS | RAS | 26 | RAS | ||
| Nd 18 | RAS | RAS | RAS | RAS | RAS | ' 24,5 | RAS | ||
| 17 | RAS | RAS | RAS | RAS | RAS | 24 | RAS RAS" |
||
| 16 | RAS RAS |
RAS | RAS RAS |
RAS RAS |
RAS RAS |
25 | RAS | ||
| 17 | RAS | RAS | RAS | RAS | RAS | 24 25 |
RAS | ||
| 16 17 |
RAS | RAS | RAS | . RAS | RAS | 23 | RAS | ||
| W CO OO •e^ -ο |
17 | RAS | RAS | RAS | RAS | RAS | 24,5 | RAS | |
| 1/10 17 | RAS | RAS RAS |
RAS | RAS | RAS | 25 | |||
| CU | 16 | RAS | 25 | ||||||
| 16 | RAS | ||||||||
| RAS | |||||||||
| RAS | |||||||||
* 6 Mäuse v/on 16-22 g erhielten subkutan eine Injektion von 0,25 ecm
adsorbiertes Antigift-l/accin .
Geiuicht b. Unschädlichkeitstest bei Meerschweinchen*
Geiuicht b. Unschädlichkeitstest bei Meerschweinchen*
Injektion gemachte Beobachtungen Gewicht; g Beobachtung
q 24 std 48 std 3 Tage 4 Tage 5 Tage 6 Tage 7 Tage
RAS RAS RAS RAS RAS RAS 400 RAS RAS RAS RAS RAS RAS RAS 360 RAS RAS RAS RAS RAS RAS «AS 380 RAS
RAS RAS RAS RAS RAS RAS 370 RAS RAS RAS RAS RAS RAS RAS 340 RAS RAS RAS RAS RAS RAS RAS 370 RAS
RAS RAS RAS RAS RAS RAS 330 RAS <£
RAS RAS RAS RAS RAS RAS 345 RAS
RAS RAS RAS RAS RAS RAS 350 RAS
RAS RAS RAS RAS RAS RAS 350 RAS
RAS RAS RAS RAS RAS RAS 355 RAS
RAS RAS RAS RAS RAS RAS 350 RAS
* = acht Meerschweinchen von ettua 300"g erhielten subkutan 1 ecm des ni-ht verdünnten Präparates ^
injiziert; die viex letzten Meerschweinchen sind Kontrolltiere ohne Injektion ' ^.
O CO U)
C3
| ierung von | Tabelle 45 | durch | ,0526F, | 0,0131M | |
| Inaktiv | Medium* | O<.-Staphylococcus-Ke im en Glutaraldehyd |
Wachsturn der Keime bei 25 D.O. NIH nach Glutaraldehydeinujirkung mit den folgenden Endkonzentrationen** |
0 | 0 |
| Berühr.zeit bei 370C |
Kontrolle - 0, | 0 | 0 | ||
| as | + | 0 | 0 | ||
| cn | + | 0 | 0 | ||
| 5 min | HB | + | 0 | 0 | |
| BS | + | 0 | 0 | ||
| Ch | + | 0 | 0 | ||
| 30 min | NB | + | 0 | 0 | |
| χ BS |
+ | 0 | 0 | ||
| Ch | + | 0 | 0 | ||
| 2 std | NB | + | 0 | 0 | |
| BS | + | 0 | 0 | ||
| Ch | + | 0 | 0 | ||
| 3 std | NB | + | 0 | 0 | |
| BS | + | 0 | 0 | ||
| Ch | + | ||||
| 24 std | NB | + | |||
* Bo = "baute au sang" Ch = Chapman-Fiedium
NB = fJährbouillon ** = Aktivitätskontrolle durch Animpfen von
Chapman-Fiedium und Nährbouillon. Die Ablesung erfolgte nach 48 Stunden bei 37°C.
409847/1137
| O (Kontr.) | 0 |
| +0,5 | 1/40 |
| +1 | 1/80 |
| +1 | 1/640 |
| + 1 | 1/800 |
| + 1 | 1/800 |
-N-
■ Tabelle 46
Impfung durch inaktivierte i>t-Keime; ot-Keime in
9-foe-ig. NaCl Lösung gewaschen und .durch 5 Minuten
lange Einwirkung von Glutaraldehyd einsr Endkonzentration von O,O131H inaktiviert, gewaschen und
auf eine optische Dichte von 15 D.O. I\!IH gebracht
Injektion von Agglutinationswert des Serums von 2 Kaninchen
ecm \ .
1/10 1/20 1/640 1/1600 1/1600
Die Injektionen erfolgten intramuskulär alle 15 Tage. Die Blutentnahme
erfolgte 15 Tage nach jeder Impfung.
Vergleich der Antikörper-Werte bei Kaninchen, die mit ς/L -Staphylococcus-Keimen geimpft waren; die Keime waren
durch 1,25-stündige Wärmeeinwirkung, bei 62 C. und durch
5 Minuten lange Glutaraldehydeinwirkung einer Endktmzentration
von 0,0ΐ3ΐί·ϊ inaktiviert
Zahl d. Aqqlutinationswert im Serum der geimpft. Kaninchen
Injektionen durch Wärme inaktivierte durch Glutaraldehyd inak-Keine tivierte Keime
0 (Kontrolle) 0 0 0 0 0 0
1 - 0,5 ecm 1/40 1/2O i/40 i/20 1/4O i/40
2 - 1 ecm 1/80 i/40 1/80 i/40 1/80 1/16O
3 - 1 ecm 1/320 1/320 1/320 1/320 1/320 1/640 Die Impfstoffinjektionen einer optischen Dichte von 15 NIH-Einheiten
erfolgten bei den Kaninchen alle 15 Tage. Die Blutentnahme erfolgte 15 Tage nach jeder Impfinjektion.
40984771137
-Bi-
Untersuchung der Inaktivierung von Q-Staphylococcus-Keimen durch
Glutaraldehyd als Funktion der Konzentration von Glutaraldehyd der Berührungzeit
der Dichte der K'eime und des verwendeten Mediums. Impfkraft der inaktivierten Keime
Die Tabellen 48 und 49 zeigen, daß eine Glutaraldehydkonzentraition
von 0,0131M mährend 5 Hinuten oder von 0,00263M mährend
einer halben Stunde ausreichten, um ß-Staphylococcus-Keime einer Dichte von 30 D.O. NIH zu inaktivieren.
Die Tabelle 50 zeigt die Proportionalität der zum Inaktivieren der Keime
notwendigen Zeit (bei normaler Temperatur) zur Endkonzentration des Glutaraldehyds.
Die Tabelle 51 zeigt die Wirkung einer Glutaraldehydkonzentration ■von O,O131H auf unterschiedliche Keirr.dichten; wie ersichtlich,
genügen 15 Minuten zum Inaktivieren von Keimen selbst einer Dichte von.300 D.O. NIH.
Die Tabelle 52 zeigt, daß die Anwesenheit von 0,0065M Glutaraldehyd
in einem Kulturmedium das Wachstum der Staphylococcen inhibiert. Dieser l/ersuch zeigt die Wirkung von Glutaraldehyd
•selbst in Anwesenheit organischer Substanzen.
Die Tabelle 53 zeigt die Zunahme des Antikörper-Titers bei Kaninchen,
die mit durch Glutaraldehyd inaktivierten ß-Keimen geimpft sind.
409847/1137
- es -
Inaktivierung von ß-Staphylococcus-Keimen durch
Glutaraldehyd
Berühr.zeit
bei 37°C.
bei 37°C.
Medium* Aktivität der Keime bei 31 D.O.NIH nach Einwirkung
von Glutaraldehyd bei Endkonzentrationen wie folgt:** .
Kontrolle 0
0,0526M
0,0151M
| 5 min | CH | + | 0 | 0 |
| NB | + | 0 | 0 | |
| + | 0 | 0 | ||
| 30 min | CH | + | 0 | O |
| NB | + | 0 | 0 | |
| BS | + | O | 0 | |
| 2 std | CH . | + | 0 | 0 |
| NB | + | 0 | 0 | |
| BS | + - | 0 | O . | |
| 3 std | CH | + | 0 | 0 |
| NB | + | 0 | O | |
| BS | + | 0 | 0 | |
| 24 std | Ch | + | 0 | 0 |
| NB | + | 0 | 0 |
* = siehe Tabelle 45
** = siehe ebenfalls Tabelle 45
Inaktivierung von ß-Staphylococcus-Keimen durch
GlutaraldehydeinuJirkung
Berühr.zeit Medium* Wachstum von Keimen bei 29 D.O. NIH nach
bei 37 C. Einwirkung von Glutaraldehyd der folgenden
Endkonzentrationen**
Kontrolle 0
0,0131M O,OÜ263M
5 min
BS
Ch
Ch
NB
0 0 0
| Min | BS + | 0 | 0 | |
| 30 | Ch + | 0 | 0 | |
| NB + | 0 | 0 | ||
| std | BS + | 0 | 0 | |
| 2 | CH + | 0 | 0 | |
| MB + | 0 | 0 | ||
* und ** siehe oben
409 8 47/1137
Inaktivierung von ß-S-taphylococcus-Keimen durch Glutaraldehydeinuirkung
mit unterschiedlicher Konzentration und Zeit
mit unterschiedlicher Konzentration und Zeit
Keime in 9-j5io-ig.NaCl Aktivität der Keime nach Einwirkung von Glutaraldchyd der folgenden End-
D.O. NIH konzentration* ;
Berührung bei norm. Kontrolle 0,0i3iFi 0,0065Fi Q,OD131M 0,00065Fi 0,000i3iFi 0,000065Fi 0,0000131F|
Temperatur 0 ' . __
Temperatur 0 ' . __
| < 5 | min | |
| 30 | min | |
| Jf* O CO OO Jf* |
1 2 |
std std |
| -J | 4 | std |
| -*■ | 24 | std |
| 0 | + | + |
| 0 | 0 | + |
| 0 | 0 | ; |
| 0 | 0 | 0 |
| 0 | 0 | 0 |
| 0 | 0 | 0 |
Ca) ι ij.
♦Aktivitätskontrolle durch Animpfen von Nährbouillon, Die Ablesung erfolgte nach ,
Stunden bei 370C.
O OO GO
Inaktivierung von G-Staphylococcus-Keimen durch Glutaraldehyd-einujirkung einer
Endkonzentration von O,O131K* als Funktion von
1) der optischen Dichte (NIH Einheiten)
2; der Derührungzeit
Endkonzentration von O,O131K* als Funktion von
1) der optischen Dichte (NIH Einheiten)
2; der Derührungzeit
Berühr.zeit ^ei Inaktivierung auf Nährbouillon (nach 48 std bei 370C.)
C. ootische Dichte
50
150
2'DO
300
| O | Kontrolle (Keime vor Berührung) ' |
+ | + | * | + | i | + | .i |
| 40 CO |
< 5 min 18 | 0 | 0 | t | + | 0 | 0 | D |
| £ | 15 min 18 | 0 | 0 | G | • + | 0 | 0 | 0 |
| *>■» | 30 min 37 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | .0 |
| 1 std 37 | 0 | ■ ο | 0 | ι 0 | . 0 | 0 | 0 | |
| 2 std 37 | 0 | 0 | ,0 | 0 | Q | 0 | 0 | |
| 4 atd 37 | ■♦ | + | 0 | 0 | + | |||
| Kontrollkeime nach,4 std bei 37°r |
+ | |||||||
Die Keime tuurden gewaschen und mit einer 9-j6o-ig. NaCl Lösung auf die angegebene optische
Dichte verdünnt.
Dichte verdünnt.
CD CO CO
- 05 Tabelle 52
Inhibierung des Wachstums von Q-Staphylococcuskeimen
in Kulturmedium (Gesamtstickstoff .2,856 mg/ccm)-•
durch Glutaraldehydeinujirkung
Endkonzentra- Medium + Glut.-aldehyd
tion des Glut,- D.O. MIH**
aldehyds - .
nach 18 std bei 370C.
| 0 (Kontrolle) | 0 |
| O1OOOAM | 0,1 |
| 0,0008M. | 0,3 |
| 0,0016M | 0,7 |
| 0,0033f-'i | 0,7 |
| 0,0065M | , 1'7 |
| 0,0131M | 5,4 |
| 0.0263M | 26,6 |
| Medium + aldehyd* |
Keime + Glutar- |
| D.O. [JIH | IJachstum |
| nach 18 | std bei 370C. |
| 9 | + |
| 9 | + |
| 9 | + |
| 9 | + |
| 7,3 | + |
| 1,7 | O |
| 5,4 | O |
| 26,6 | 04 |
* = gleichmäßige Beimpfung aller Medien mittels' Draht■(Schlaufe)
** = bezogen auf die Nährbouillon
Entwicklung der Antikörperwerte bei Kaninchen, die mit durch
Glutaraldehyd inaktivierten Staphylococcus-Keimen geimpft
sind. Die Q-Keime wurden gewaschen und in 9-5^e-Jg. NaCl Lösung
suspendiert, durch Einwirkung von Glutaraldehyd einer Endkonzentration von O,O131H inaktiviert und erneut gewaschen
und auf eine optische Dichte von 18 D.O. NIH gebracht
| Zahl | der | 15 ecm | Agglutinationstiter des Seru | mit | . 0 | 0 |
| Injektionen | ecm | 1/10 | 1/40 | |||
| 0 Kontrolle | ecm | Impfstoff | 1/160 | 1/40 | ||
| 1- 0, | ecm | Il | 1/640 | 1/160 | ||
| 2- 1 | ecm | Il | 1/800 | 1/320 | ||
| 3-1 | ecm | H | 1/1600 | 1/640 | ||
| 4- 1 | ecm | Ii | 1/800 | |||
| 5- 1 | Il | -- | 1/800 | |||
| 6- 1 | Il | |||||
| 7- 1 |
Die Kaninchen erhielten intramuskulär alle 15 Tage eine Impfstoffinjektion.
Die Blutentnahme erfolgte 15 Tage nach jeder Impfung.
409847/1137
- 66 I. Inaktivierung einer Kultur von Keuchhustenkeiman
1) Einwirkung von Glutaraldehyd auf den Stamm 134 mit 200 UDü/ccm
Das Überleben der Bakterien wurde nach Animpfen eines Bordet-Gengou-Mediums
untersucht (Tabelle 54). Die Kultur war nach 1 Minuten langer Bebrütung in Anwesenheit von Glutaraldehyd einer
Endkonzentration von O,O131M vollständig inaktiviert.
2) Herstellung von Keuchhustenimpfstoff durch Einwirkung von
GlutaiaLdehyd oder Wärme und Vergleichsuntersuchung der
Impfkraft
Die Vaccine u/urden nach 1 Minuten langer Glutaraldehydeinwirkung
bei 37 C. oder nach 1/2-stündigem Stehen im Wasserbad von 56°C.
untersucht.
Tabelle 55 zeigt, daß das durch Wärme inaktivierte flüssige Vaccin
eine bessere Immunogenkraft hat.
Im besonderen gewählten Beispiel war die zur Inaktivierung verwendete
Glutaraldehydmenge zu hoch, so daß das durch Glutaraldehyd inaktivierte Präparat eine schlechtere Immunogenkraft zeigt.
Inaktivierung einer Kultur von Keuchhustenkeimen durch Einwirkung einer Glutaraldehyd-Endkonzentration von 0,00131M
und Q,000131H
1) Einwirkung von Glutaraldehyd
Der erste Versuch zeigte, .daß die Keuchhustenkultur nach 1 Minuten
langer Bebrütung in Anwesenheit von Glutaraldehyd einer Endkonzentration
von 0,01 31 Γί vollständig inaktiviert war.
Es wurde eine Reihe von Versuchen durchgeführt, um die Wirkung
von Glutaraldehyd bei weniger hohen Konzentrationen zu untersuchen. Die Tabelle 55 [bis) zeigt, daß die Kultur auch nach
1 Minuten langer Berührung mit Glutaraldehyd einer Endkonzentration von O,OO131K inaktiviert war. Im Gegensatz dazu zeigt
409847/1137
Tabelle 55 (ter), daß eine Konzentration von 0,000131M die Keime nicht inaktiviert.
2) Untersuchung der Impfkraft
2) Untersuchung der Impfkraft
Die Impfkraft einer während einer Minute bei einer Glutaraldehydkonzentration
von O,OO131M inaktivierten Kultur wurde im Vergleich
zu derselben, bei üblichen Bedingungen durch Wärme inaktivierten Kultur untersucht. Es ujurde festgestellt, daß die Immunisierungskraft
praktisch identisch ist.
Inaktivierung einer Keuchhustenkultur vom Stamm 134 mit
200 UDü/ccm'"durch' GlutaraldehydeinuJirkung einer Endkonzentration
von 0,0i3iM
Berühr.zeit Wachstum nach Animpfen eines Bordst-Gengon-Mediums
bei 37°C. vor1 Wäschen der Keime nach Waschen der Keime
mit 9-7bo-in.lMaCl mit 9-9uc-JQ. MaCl
1 min 0 0
15 min 0 0
30 min 0 0
1 std 0 ' 0
2 std 0 0 4 std1 0 0
Kontrolle (Keime
ohne Glut.-aldeh.)
ohne Glut.-aldeh.)
Titer in internat. Schutzeinheiten eines Präparates
von flüssigem Keuchhustenimpfstoff mit 16 D.O. WIH
pro ecm, bestimmt an Hausen ("Mouse protection test") -
- nach 1 min Berührung bei 370C. mit einer O,O131R
Glutaraldehydlösung
- nach 0,5 sto bei 56 C. in einem Wasserbad
Keime, inaktiviert flüssiges Vaccin mit 16 UDO/ccm durch Schutzeinheiten pro ecm
Glut.-aldehyc
(1 min Berührung) '
Glut.-aldehyd
(1/2 std bei 56°C.) 13'95
409847/1137
te
-CA-' Tabelle 55 (bis)
Inaktivierung einer Keuchhustenkultur (Q 266 S-509) mit 84 UDO/ccm · durch Glutaraldehyceinujirkung
einer Endkonzentration von
Berühr.zeit Wachstum nach Animpfen eines Bordet-Gengou-Hediums
bei 37 C. '
1 min 0
15 min 0
30 min 0
1 std 0
2 std * 0 · 4 std 0
Kantrolle'(Keime ohne Glutaraldehyd) ++++
Tabelle 55 (ter)
i
" mr~~ ■■'■'■■ r
Inaktivierung einer Keuchhustenkultur (Q 266 3-509) mit 84 UDO/ccm durch Glutaraldehydeinu/irkung einer
Endkonzentration von 0,000131 β
Berühr.zeit VJachstum nach Animpfen eines Bordet-Gengou-nediums
bei 370C.
1 min +++
15 min . +++
30 min +++
1 std +++
2 stä +++ • 4 std +++
3. Inaktivierung von^Oliornyelitis-Uiren durch Glutaraldehyd
Es wurden drei Uersuche zur Inaktivierung von Polio-Viren durch
Es wurden drei Uersuche zur Inaktivierung von Polio-Viren durch
Glutaraldehyd durchgeführt.
Uersuch I
Herstellungsbedingungen:
Poliomyelitis-Virus, Typ III Glutaraldehyd: QS auf 0,00263M ("&tuvage"; Dämpfbehandlung)'
5-tägige (12O std) Wasserdampfbehandlung/bei 37°C.
Lagerung bei +4 C. nach Neutralisation durch Natriumbiäulfit
Es luurde festgestellt, daß
a) eine Stunde nach Einführung des Glutaraldehyds die Virus-
A09847/1137
- 6-9 -
suspension sauer wurde, wobei der pH-Wert von 7,2 auf 6,7-6,8
fiel. . "
Nach 24 Stunden erschien eine sich zur Ausflockung entwickelnde
Trübung, die dann ein ziemlich, starkes, sich langsam absetzendes Gerinnsel bildete.
b) nach der Glutaraldehydzugabe der Titer in cytopathogenen Dosen
um 50 ?iVcPer viralen Suspension abnahm, und zwar in einer direkt
dem Logarithmus der Wasserdampfbehandlungsdauer proportionalen Weise.
7 5
Für einen Ausgongstiter von 10 ' DCP 50 pro ecm blieb dennoch
Für einen Ausgongstiter von 10 ' DCP 50 pro ecm blieb dennoch
2 5 nach 120-stünciger Wasserdampfb^ehandlung ein Wert von 10 ' DCP
pro ecm (Dauer der Wasserdampfbehandlung, berechnet auf die Gesarntinaktivierung:
etwa 5,5 Monate)
c) die Inaktivierungskontrollen (500 ecm angeimpft auf Schalen
von Mlkulturen) in 48 Stunden positiv uiar.
l/ersuch II
Virus Poliomyelitis Typ III Glutaraldehyd QS auf 0,00526R
Wasserdampfbehandlung bei 37°C. für 4 Tage (96 std)
Lagerung bei +4 C. nach Neutralisation durch Natriumbisulfit.
Es wurde festgestellt, daß
a) eine Ansäuerung durch Glutaraldehydzugabe auf einen pH-Wert
von etwa 6,5 erfolgte.
Leichte, frühzeitigere, jedoch wesentlich intensivere Ausfällung;
langsames Absetzen einer starken Schicht eines fäserartigen ι« i ed erschlag es.
nachträglich
geändert
409847/1137
- Ύϋ -
b) daß die Insktivierungskurve unregelmäßig ist; nach einem starken
Abfall im Uerlauf der ersten Stunde (Verlust uon 5 log) wird
während 24 Stunden eine ebene Linie und dann in der 48. Stunde mieder ein Abfall festgestellt.
c) die Inaktivierungskontrollen dennoch positiv sind; alle geimpften
Zellkulturen u/aren am 7. Tag zerstört.
l/ersuch III
Mischung aus gleichen Teilen von Viren der drei Polio Arten
Glutaralriehyd QS auf 0,0035Fi
Wasserdampf behandlung bei 37 C. während 12 Tagen Lagerung bei +4 C. nach Neutralisation mit Matriumbisulfit.
Es wurde festgestellt, daß
a) Ansäuerung und Ausfällung vergleichbar uiie in Versuch II waren.
b) die Inaktivierungskurve dasselbe Aussehen wie in Versuch II
mit einem wesentlichen Abfall (fast um 4 log) in den ersten
Stunden, einem geraden Verlauf von der 6. bis zur 24. Stunde und wiederum einem Abfall bis zu 96 Stunden hat.
c) auch hier dennoch und trotz der Verlängerung der Wasserdampfbehandlung
um 8 weitere Tage die Inaktivierung nicht vollständig ist. 40 % der mit dem Endprodukt geimpften Kulturen zeigen sich
positiv.
Die obigen Versuche lassen den Schluß zu, daß
1.) der Glutaraldehyd eine deutliche Inaktivierungswirkung auf
Polio Viren zeigt;
2.) dennoch seine Ausfällungswirkung auf die als Verunreinigungen
des Hediums anwesenden Proteine wahrscheinlich zur Bildung von Adsorbaten und Agglomeraten des Virus führt, was eine vollstän-
409847/1137
- dige Inaktivierung verhindert.
Daher wurde an dem durch Adsorption-Eluierung gereinigten Virus ein weiterer Versuch zur Vermeidung der vorher festgestellten
Ausfällungen bei der Glutaraldohydzugabe zu einer rohen viralen
Suspension durchgeführt. /Dabei waren die Bedingungen wie folgt:
Virus: Typ III, auf "brushite" adsorbiert; in O,1M Phosphatpuffer
gewaschen; durch 0,4M Dinatriumphosphatlösung eluiert; pH 7,4$ dann eine [Jacht bei 37 C. wasserdampf behandelt.
Zugabe des Glutaraldehyds: Q5 auf 0,00263M, 120-stündige Wasserdampfbehandlung
bei 370C. und Lagerung bei + 4 C. nach Neutralisation
mit Natriumbisulfit.
Wie festgestellt wurde, ist der in Dinatriumphosphat eluierte Virus wesentlich wärmeempfindlicher als der rohe Virus; die
Wasserdampfbehandlung während einer Nacht bei 37 C. ließ die-Virulenz
um fast eine Einheit'(ausgedrückt in log) absinken.
Der Glutaraldehyd hat bei der verwendeten Konzentration eine sehr
insentive Wirkung auf den gereinigten Virus; der Virulenzverlust liegt bei etwa 3,5 log in 6 Minuten und bei etwa 4,5 log in 25
Hinuten.·
Nach 1,5 Stunden erreicht oder übersteigt dieser Abfall 6 log,
_ ι
wobei bei einer Verdünnung von 10 , die per se cytotoxisch ist,
wobei bei einer Verdünnung von 10 , die per se cytotoxisch ist,
sich keinerlei . cytopathogene Wirkung zeigt.
In der 6. Stunde erscheint eine Trübung, die sich fortschreitend
intensiviert. In der 24. Stunde sind Aggregate gebildet, die einen leichten Niederschlag ergeben.
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- τβ -
Aggregate und Trübung können durch Filtration auf einer Membran (0,45 Nanometer) eliminiert werden und erscheinen nicht wieder.
Die Inaktivierungskontrollen mit einem auf 2Ü0 ecm gebrachten
Endprodukt, von dem 1 ecm zur Beimpfung von 16 am Oberfläche
der Zellkultur verwendet ujurde, waren"nach 16 Tagen Beoachtung
negativ. Auch die Unterkulturen dieser Kontra Ilen blieben negativ,
Daraus kann geschlossen werden, daß
1.) bei den Bedingungen des Versuches der Polio Virus vollständig inaktiviert wird; und daß
2.) der gereinigte und in eine Phosphatlösung wiederaufgenommene
Virus (pH 7,4) gegenüber 0,Q0263H Glutaraldehyd äußerst empfindlieh
ist.
Die obigen Versuche können insbesondere bezüglich der Glutaraldehydkonzentration
und der Zusammensetzung und des pH-Wertes der Eluierungsflüssigkeit modifiziert werden, um das Herstellungsverfahren
des Vaccins zu verbessern und eine Denaturierungsgefahr des Virus auf ein-. Minimum zu halten.
K. Inaktivierungsuntersuchung einer Kultur von Maul- und
Klauenseuchen-Virus durch Glutaraldehydeinwirkunq -
Einwirkung von Glutaraldehyd auf den Maul- und Klauenseuchen-Uirus
Die Tabelle 56 zeigt, daß die Inaktivierung nach 5 tägiger Bebrütung
in Anwesenheit von Glutaraldehyd einer Endkonzentration von 0,00263M nur unvollständig ist.
Untersuchung der Impfkraft
Untersuchung der Impfkraft
Verwendet wurden Präparate, die durch 5-tägi.ge und 7-tägige Behandlung
bei 37 C. mit Glutaraldehyd inaktiviert waren. Diese
409847/1137
es
-TS-
Präparate wurden auf i/3 verdünnt, indem man 1 UoI. Präparat,
1 Vol. ^a UL- undKlauensBucheA/accin und 1 UoI. Hilfsmittel mischte..
Die Impfung von Meerschweinchen ergab einen Neutralisierungstiter
gegen den f-iaul- und Klauen seuchen\/irus gleich demjenigen, der
mit einem üblichen Uaccin von selben Typ erhalten mird.
Inaktivierung einer Suspension von Maul- und Klauenseuchenvirus
durch Glutaraldehyd einer Endkonzentration von 0,002ό3ίΊ
| Berühr.zeit Ul bei 37°C. |
-P/0,1 ecm |
| Kontrolle ohne _ . Glutaraldehyd |
]O6-1O7 |
| 5 min | >1OO |
| 1 std | >1OO |
| 3 std | >1OO |
| 6 std | ^100 |
| 24 std | 1-5. |
| ÜB std | 1-5 |
| 5 Tage | 0 |
| 7 Tage | 0 |
* = "Unites formant plages" = flächenbildende Einheiten
Die vorliegende Beschreibung soll durch eine Untersuchung der dem Glutaraldehyd inhärenten Toxizität vervollstündigtmerden.
Die Tabellen 57 und 58 zeigen Ergebnisse von Unschädlichkeitstests mit einer Glutaraldehydlösung in 9-700-ig. Natriumchlorid
mit unterschiedlicher Konzentration sou/ie nach Bebrütung dieser
Lösungen mit Lysin.
409847/1137
Die O,iFi Lysin-Kontrollösung ergab keinerlei Unverträglichkeitsreaktion»
Im Gegensatz dazu ergab eine Glutaraldehydlösung uon
0,00263M oder einer höheren Konzentration eine stark positive Reaktion.
Die Bebrütung einer Glutaraldehydlösung mit Lysin neutralisiert die dermonektrotische Wirksamkeit des Aldehyds; diese Reaktion
kann somit zweckmäßig zum Neutralisieren des überschüssigen Glutaraldehyds nach Reaktion mit einem Antigenpräparat angewendet'
werden«.
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| Probe | Glutaraifcdehyd- | Injektion* | Unschädlichkeitstest bei Meerschweinchen nach | RAS PES |
' 48 std | 72 std | 1 Woche | 2 Wach. | 3 Wach· | 4 Woch |
| - | bei 370C. | 7h std | ES RAS |
ES RAS |
PES ' RAS |
tot LI |
RAS | - RAS | ||
| D.0263M lösung; 15 min |
an der Qber-PES Flachs RAS |
RAS ES |
RAS ES |
■ RAS PES |
RAS EScic |
RAS RAS |
RAS RAS |
|||
| in der Tiefe |
||||||||||
0,0D263M Glutaraldehydlösung + 0/1M Lysin
min bei 370C.
min bei 370C.
S 0;000263M Glutaraldehyd.
*·«. lösung; 15 min bei
*·«. lösung; 15 min bei
an der Ober- RAS RAS fläche RAS RAS
RAS RAS
RAS
RAS
RAS
RAS
RAS'
RAS'
RAS RAS
RAS RAS
| in üer Tiefe |
RAS RAS |
RAS. . RAS |
RAS RAS |
. RAS RAS |
RAS RAS |
RAS RAS |
RAS RAS |
| an der Ober fläche |
RAS TFR |
RAS ' TFR |
RAS PES FR |
RAS Γι LI |
RAS RAS - |
RAS RAS |
RiS RAS |
in der
Tiefe
Tiefe
RAS
RAS
RAS
RAS RAS
RAS RAS
RAS
RAS
RAS
RAS
RAS
RAS
RAS RAS
RAS RAS
-» Q,00263M Glutaraldehyd-ω
lösung + O,O1M Lysin
^J 15 min bei 370C.
^J 15 min bei 370C.
An der Ober-
_ fläche
_ fläche
RAS
RAS
RAS
RAS RAS
RAS RAS
PN
RAS
RAS
RAS
RAS
RAS
RAS RAS
RAS RAS
in der
TiBfe
TiBfe
RAS
RAS
RAS
RAS RAS
RAS RAS
RAS
RAS
RAS
RAS
RAS
RAS
RAS RAS
RAS RAS
* = subkutane Injektion von 0,5 ecm jedes Präparates
Lösung aus Unschädlichkeitstest bei Meerschweinchen*;
festgestellt nach
; 24 std 48 std 1 Woche
O,1M Lysin RAS RAS RAS 15 min bei 370C. RAS t _^M§ RAS
0,0263K Glutaraldehyd RAS ES " ES 15 min bei 370C. RAS RAS N
0,0263M Glutaraldehyd RflS . Rfls Rfl5
+0,1h Lysin; Rfts RAS RAS
15 min bex 37 C. i
O1OlM Lysin RAS RAS RAS 15 min bei 37°C. TTR RAS N
0,00263M Glutaraidehyd TFR LI N
15 min bei 370C. RAS RAS N__
0,00263!ί Glutaraldehyd Dnc DQC ..
♦°»!1H. LY d^or RAS RAS RAS
15 Hin bei 37 C.
* . subkutane Injektion von 0,5 ecm jedes Präparates
Weiter wurde die Entgiftung einer Mischung aus gleichen Volumen
von Diphterie-Toxin mit 475 UF/ccm und Tetanus-Taxin mit 475 UF/ccm durch Einwirkung von Glutaraldehyd einer Endkonzentration
uon 0,00263M und bei unterschiedlicher Bsrührungszeit untersucht.
Die Entgiftung erfolgte in 1-/6o-ig. Natriumbicarbonat- und 0,07H
Dinatriumphosphat-medium, ujobei Berührungszeiten von 5 min, 30
min, 1 std, 2 std und 3 std verwendet wurden.
Die Tabellen 59 und 60 zeigen, daß die Entgiftung von Diphterietoxin
im Phosphatmedium wesentlich besser als im Bicarbonatmedium ist. Tatsächlich war es nach 5 Minuten langer Berührung im Dinatriumphosphatmedium
und erst nach 3-stündiger Berührung im Natriumbicarbonatmedium praktisch entgiftet.
409847/1137
Im Gegensatz dazu beeinflußt das Medium die Entgiftung von Tetanustoxin
nicht« . .
Die Tabelle 61 gibt die Prozentsätze der mischpolymerisierten
Titanus- und Diphterie-Einheiten. Wie ersichtlich, mischpolymerisiert das Tetanustoxin im Dinatriumphosphatmedium wesentlich
besser als im Natriumbicarbonatmedium. Dieser Unterschied wurde für das Diphterietoxin nicht festgestellt.
Ungeachtet des verwendeten Mediums erhöht sich der Prozentsatz der mischpolymerisierten Einheiten nicht als Funktion der Berührungszeit.
In der folgenden Tabelle 59, die sich auf die Entgiftung einer
Mischung aus gleichen Volumen Diphterietoxin mit 475 UF/ccrn und Tetanustoxin mit 475 UF/ccm durch Glutaraldehydeiniuirkung einer
Endkonzentration von 0,0G263ii und bei unterschiedlicher Berührungzeit
bezieht, erfolgte der Unschädlichkeitstest bei Kaninchen durch intradermale Injektion von 0,1 ecm der unterschiedlichen
Verdünnungen an 2 Kaninchen. Der Reaktionsdurchmesser bei den Kaninchen wurde in mm angegeben. Die Beobachtung erfolgte
48 Stunden nach der Injektion.
Der Unschädlichkeitstest dieser Tabelle bei Mäusen erfolgte durch Injektion von 1 ecm an 3 Mäuse.
409847/1137
| .-■ Berühr.·- | » | 30 min | ι; κ,οπϊγο | xxen na | cn uiai | >20 | std | y | • | se eine | in ι jrioo-ig. Natriumbicarbonatlösung | bei Mäusejn | 48 std | 72 std | 96std | 1 Woche | 2 Woch. ■. | rr'— Ge ω. |
Beobacht. | |
| U I |
■ | Unschadlxchkeitstest | \20 ^12 ' |
>20 | Unschadlxchkeitstest | Beobachtungen | RAS | RAS | RAS | RAS | RAS | 3 | Wochen | |||||||
| 5 .rain | 1 ^atci. | bei Kaninchen | tr I |
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| festgestellt 48 nach Injektion |
12 | 14 | I | 0 std | RAS | RAS | . RAS | RAS | RAS | RAS | 23 | |||||||||
| 2 std | 1/10 | 0 | ^20 | 20 | RAS | RAS | IiAS | RAS | RAS | RAS | 24 | |||||||||
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22,5 | RAS | RAS | RAS | RAS | RAS | RAS | 30 | RAS | |||||||||||
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| RAS | ||||||||||||||||||||
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| RAS | ||||||||||||||||||||
| RAS | ||||||||||||||||||||
| RAS ' |
2.- Kontrollen nach
Tabelle 60
Dialyse einer Probe in 0,07M Dinatriuinphosphatlösung
Dialyse einer Probe in 0,07M Dinatriuinphosphatlösung
| Undschädlichkeitstest bei Kaninchen |
LJnsc | lädlichkeitstest bei Mäusen | RAS | 48 std | 72 std RAS . |
96 std RAS |
1 Woche | ■2 Woch. | • ■ ι | RAS | |
| .Berühr.- zeit bei 370C. |
restgestellt Ά8 std nach Injektion |
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| 22 | 26' | ||||||||||
| 22,5 | |||||||||||
| 21 |
CD OO CJ
Mischpolymerisate bildende Diphterie- und Tetanuseinheiten nach Entgiftung einer
Mischung aus gleichen Volumen an Diphterietoxin mit 475 UF/ccm unci Tetanustoxin
mit 475 UF/ccm
Berühr.zeit
bei 370C
bei 370C
in O, D7K Dinatriumphosphatlösung
mischpolym.
Einheiten, ausgedr. in Jj nach Ausfällung durch Antitetanusserum
Einheiten, ausgedr. in Jj nach Ausfällung durch Antitetanusserum
gereinigt nicht gerein, terieserum
mischpolyrn. Tetanuseinh., ausgedr. in %
n.Ausfälung durch ein gereinigtes Antidiph-
in 1-fbo-ig. Natriumbicarbonatlb'sunq
mischpolyrn.^ Diphterie- mischpolyrn.Teeinh.,
in % nach Ausfällung durch ein gereinigtes Antitetanusserurn
tanuseinheit. in /j nach Ausfällung mit
einem gereinigt. Antidiphterieserum
min
min
min
std
std
std
21,1
20
18,2
16,7
23
2,7,7
32,4
18,6
18,6
18,6
18,6
18,6
18,6
70,6 69,7 71,5 66,2 66,7 18,1 15,2 18,2 16,2 18,2
13,9
22,6
26,7
25
18,9
Claims (1)
- Patentansprüche1«- Verfahren zur Herstellung won Vaccinen, dadurch gekennzeichnet, daß man das toxische Produkt mit Glutaraldehyd einer solchen Konzentration und während einer solchen Dauer, die gerade zum
Inaktivieren des toxischen Produktes ausreichen,in Berührung
bringt und die Reaktion sofort nach Erreichen des Zustandes der
Entgiftung oder Inaktivierung durch pyhsikalische und/oder chemische Maßnahmen abbricht, wodurch das erhaltene inaktivierte Produkt als Vaccin verwendbar ist, das antigen bleibt und seine
Immunisierungskraft bewahrt.2.- Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man
als toxisches Produkt Mikroben- oder Giftschlangentoxine, Mischungen dieser Toxine, Mikroorganismen (Keime, Bakterien undViren usw.) allein oder in Mischung sowis die Derivate dieser
Mikroorganismen verwendet.3.- Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß man als toxisches Produkt Diphterietoxin verwendet.4,- Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß man sls toxisches Produkt Tetanustoxin verwendet.5.- Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß man als toxisches Produkt »C - und ß-Staphylococcustoxine verwendet.6.- Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß man als toxisches Produkt Schlangengifte allein oder in Mischung, wie z.B. solche der ViperB Aspis, Berus und Ammodytes, der
Schlangen Dendraspis, Bitis Gabonica, Lachesis, Echis Carinatus, f^aja, Naja Helanoleuca, Nigricollis, Haje usw. verwendet.409847/1137- QQ. -7.- Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß man als toxisches Produkt Staphylococcuskeime verwendet.8,- Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß man als toxisches Produkt Keuchhustenbazillen verwendet.9.- Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß man als toxisches Produkt Riiomyelitisviren verwendet.10,- Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dacurch gekennzeichnet, daß man als toxisches Produkt Maul- und Klauenseucheviren verwendet.11.- Verfahren nach Anspruch 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß man die Berührung von Glutaraldehyd und toxischem Produkt bei einer Temperatur zwischen Zimmertemperatur bis etwa 40 C., vorzugsweise zwischen 35-400C.., und insbesondere bei 37 C. durchführt.12.- Verfahren nach Anspruch 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß die Glutaraldehydkonzentration zwischen etwa 0,00131M und 0,0526M liegt.13.- Verfahren nach Anspruch 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß man die Reaktion zwischen dem toxischen Produkt una Glutaraldehyd durch Zugabe eines Mittels, das die Reaktion zwischen Glutaraldehyd und Antigen" blocken oder mit dem freien Glutaraldehyd im Reaktionsmedium reagieren kann, z.B. eine Aminosäure, insbesondere Lysin oder Glycin, oder ein anorganisches Salz, wie 'JMatriumbisulfit, abbricht.14.-. Verfahren nach Anspruch 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß man die Reaktion abbricht, indem man das entgiftete Produkt gegen eine wässrige Lösung eines anorganischen Salzes, wie Natriumphosphat oder Natriumchlorid, dem gegenenfalls Herthiolat409847/1137242 Ί 083zugefügt ist, zur Erzielung-eines flüssigen, als Vaccin veriuendbaren Produktes dialysiert.15»- Verfahren nach Anspruch 1 und 7 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß man die Reaktion durch Zentrifugieren und Waschen des entgifteten Produktes zur Entfernung des überschüssigen Glutaraldehyds abbricht."16.- Verfahren nach Anspruch 1 bis- 15, dadurch gekennzeichnet, daß man dem entgifteten, durch Di'alyse gegen eine Lösung, z.B. einen Natriumphosphatpuffer, in flüssiger Form erhaltenen Produkt eine sterile Calciumchloridlösung zufügt oder dem flüssigen, durch Dialyse gegen eine Natriumchloridlösung erhaltenen Vaccin Aluminiumhydroxid oder -phosphat zufügt, wodurch man ein als Vaccin verwendbares, adsorbiertes Produkt erhält.17.- Vaccine, erhalten nach dem Verfahren gemäß Anspruch 1 bis 16,18.- Vaccine nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß sie ein Mittel zum Blockieren der Glutaraldehyd-Antigen-Reaktion, wie eine Aminosäure, insbesondere Lysin oder Glycin, enthalten.19.- Vaccine nach Anspruch 17 und 18, dadurch gekennzeichnet, daß sie in flüssiger Form vorliegen.20.- Vaccine nach Anspruch 17 und 18, dadurch gekennzeichnet, daß sie in adsorbierter Form,.insbesondere auf Calciumphosphat oder Aluminiumhydroxid oder -phosphat, vorliegen.'21.- Vaccine nach Anspruch 17 bis 20, dadurch gekennzeichnet, daß sie entgiftete Derivate entsprechend den folgenden toxischen Produkten enthalten: Diphterie-, Tetanus-, o(_ und D-Staphylococcustoxine, Schlangengifte, Staphylococcuskeime, Keuchhustenbazillen, Poliomyelitisviren und Maul- und Klauenseucheviren«409847/113722.- Gemischte Vaccine nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, daß sie entgiftete Derivate entsprechend mindestens zwei toxischen Produktes, insbesondere Diphterie- und Tetanustoxine, enthalten.23.- Die Verwendung der Vaccine nach Anspruch 17 bis 22 bei Erkrankungen, die durch Mikroben oder Giftt.oxine, Keime, Bakterien und die verschiedensten Viren und Mikroorganismen hervorgerufen werden.24.- Die Verwendung der Vaccine nach Anspruch 17 bis 22 zur Bildung von Seren, die zur Behandlung von Mensch und Tier gegen Erkrankungen verwendet werden können, die durch Mikroorganismen oder deren Derivate entsprechend dem Vaccin hervorgerufen werden.Der Patentanwalt!409847/1137
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