DE2157148A1 - Immunisierungsmittel, verfahren zur herstellung und seine verwendung - Google Patents

Immunisierungsmittel, verfahren zur herstellung und seine verwendung

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Description

Patentanwälte Dipl.-Ing. F. Weigkmann,
Dipl.-Ing. H.Weickmann, D1PL.-PHYS. Dr. K. Fincke Dipl.-Ing. F. A-Weickmann, Dipl.-Chem. B. Huber
2157H8
8 MÜNCHEN 86, DEN POSTFACH H60 820
MÖHLSTRASSE 22, RUFNUMMER 48 3921/22
<983921/22>
Max-Planek-Geseilschaft zur Förderung der Wissenschaften e.Y,
Göttingen, Bunsenstraße 10
; 4
Immunisierungeinittel, Verfahren »ur Herstellung und seine Verwendung
Viele Infektionskrankheiten der Menschen, wie beispielsweise Typhus- und Paratypliuserkrankungen, bakterielle Ruhr (Shigellosen), Coliinfektionen, wie beispielsweise CoIi Enteritides der Säuglinge, Salmonella Enteritiden, wie beispielsweise Lebensmittel- und Fleischvergiftungen, und Erkrankungen durch andere Enterobacteriaceae werden durch Giftstoffe hervorgerufen, die erst beim Zerfall bzw. Auflösen der Bakterien frei werden. Auch werden viele Infektionen am Tier (Kühe, Schweine, Pferde, Ziegen, etc.) durch Enterobacteriacea? hervorgerufen. Diese Giftstoffe v/erden als Endotoxine^bezeichnet.
Die Immunität gegen Krankheiten, die durch Endotoxine hervorgerufen werden, beruht auf Abwehrstoffen, die der infizierte Organismus unmittelbar gegen den Erreger bildet, im Blut des Infizierten finden sich in diesen Fällen streng spezifische Stoffe, die das infektiöse Agens durch Verklumpung (Agglutination) oder Auflösung (Lyse) unschädlich machen.
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Den Verlauf einer Infektion kann man auf zwei verschiedene Arten beeinflussen. Man kann dem zu schützenden Organismus wiederholt geringe Mengen an dem für die Infektion spezifischen Antigen zuführen. Antigene sind Stoffe, die nach der-parenteralen Einverleibung spezifische Antikörper bilden. Durch die Antigene wird eine Antikörperbildung angeregt, die Immunität ergibt. Bei Infektion führt sie zu einer Antigen-Antikörperßeaktion (Bindung der Antigene durch die Antikörper), zur Eliminierung der Krankheitserreger und 'zur Heilung. Diese Art der Beeinflussung einer Infektion wird als Impfung bezeichnet und stellt eine Immunoprophylaxe dar.
Die Impfung zeichnet sich insbesondere durch- ihre vorbeugende Wirkung sowie dadurch aus, daß sie im Gegensatz zur Serumtherapie zu einer aktiven und langanhaltenden Immunität führt. Die nach Aufhören der Infektion fortdauernde Fähigkeit zur Antikörperbildung.ist dabei-Ursache der bleibenden Immunität.
Bei der Serumtherapie (Immunotherapie) werden dagegen dem schon erkrankten Organismus mit dem Sera fertigvorgebildete Antikörper zugeführt. Die Serumtherapie unterscheidet sich von der Impfprophylaxe insbesondere durch ihre Anwendbarkeit auch bei fortgeschrittenen Infektionen. Die mit ihr erzielbare, sogenannte passive Immunität hinterläßt niemals eine anhaltende Immunität, wie die aktive Immunisierung. Die passiv übertragenen Antikörper werden als artfremdes Eiweiß rasch abgebaut und kreisen nur kurze Zeit im Blut des Empfängers. In dieser Zeit entfaltet sich ihre loxlnbindung und Heilwirkung.^
Mit der Einverleibung isolierter Toxine, d.h. als Antigen wirkender Stoffe, oder virulenter Krankheitserreger zur aktiven Immunisierung, sind umfangreiche Verfahren verbunden. Einerseits kommen als Impfstoffe nur besonders vorbereitete Toxine in Frage und andererseits wirken die einzelnen Impfstoffe nur specif;sch. Es ißt daher stets notwendig, den richtigen Impfstoff bzw. das richtige Serum auszuwählen. So sind zu einer
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Iminunoprophylaxe gegenüber verschiedenen Erregern entsprechend viele Impfungen erforderlich. Besonders bei Kindern ergibt sich in zunehmendem Maße die Präge, wie man so viele Impfungen in der kurzen Zeit der ersten Lebensjahre unterbringen kann.
Bei der passiven Immunisierung mit (am Tier gewonnenen) Antiseren treten weitere Probleme auf. Bei Infektionskrankheiten ist es oft unbekannt, welche speziellen Erreger für die Krankheit verantwortlich sind. Die wiederholte Anwendung von Antisera bei Infektionskrankheiten kann zu Kreislaufversagen, Ödembildung und Auftreten von Exanthemen führen. Dies kommt dadurch zustande, daß dem Empfänger mit dem z.B. vom Pferd, Kind oder Hammel gewonnenen antitoxischen- Serum zwangsläufig auch Serumeiweiß dieser Tierarten einverleibt wird. Während die mit dem Serum übertragenen Antitoxine das im Blut des Kranken kreisende Toxin binden und unschädlich machen, bildet der Organismus gleichzeitig spezifische Antikörper gegen das artfremde ΈίντεΓΒ', das primär zwar völlig unschädlich ist, bei erneutem Kontakt des Organismus mit dem artfremden Eiweiß aber zu akuter und heftigster Reaktion führen kann. Dies ist für den Kranken eine unerwünschte Belastung und daher muß alles versucht werden, dies zu verhüten.
Bei der Verabreichung von Sera soll daher die Zahl der Injektionen möglichst eingeschränkt werden und daher besteht ein Bedarf nach Sera, die ein möglichst weites Wirkungsspektrum aufweisen.
Aus diesen Ausführungen ergibt sich, daß die bisher bekannten Impfstoffe und Sera jeweils nur gegen spezielle Serotypen der Enterobacteriaceae wirksam sind und zur wirksamen Immunoprophylaxe und Immunotherapie es oft erforderlich ist, mehrere Impfstoffe und Sera zu vex^abreichen. Dies hat zur Folge, daß bei einer Infektion jeweils der Serotyp des Erregers ermittelt werden und danach der entsprechende Impfstoff produziert und angewandt werden muß.
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Man"hat bereits vorgeschlagen, Kombinationsimpfstoffe und Kombinationssera zu verwenden, und man bemüht sich schon seit langer Zeit, kombinierte Vaccinen herzustellen. Dabei tritt jedoch der Nachteil auf, daß sich die Antigene gegenseitig beeinflussen und Konkurrenzreaktion zwischen den einzelnen Antigenen zu beobachten ist. Beispielsweise findet Unterdrückung der Impfreaktion gegen ein schwaches Antigen durch ein stärkeres Antigen oder bei Lebendimpfstoffen durch Indifferenz der Infektiosität der Erreger, als auch eine gegenseitige Stimulation im Sinne eines Adjuvanseffektes statt. Die Verabreichung solcher Kombinationspräparate ist daher mit Schwierigkeiten verbunden.
Der vorliegenden Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, Impfstoffe und Sera zu schaffen, die die oben erwähnten Nachteile nicht aufweisen, die für die Immunotherapie und die Immunoprophylaxe verwendet werden können, und gleichzeitig gegenüber vielen, fast allen, Krankheiten, die von Enterobacteraceae hervorgerufen werden, wirksam sind.
Gegenstand der Erfindung ist ein Immunisierungsmittel, das dadurch gekennzeichnet ist, daß es als Antigen Lipoid A und/oder als Antikörper Antilipoid-A-Antikörper enthält.
Bei einer bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform (aktive ™ Immunisierung) liegt das Lipoid A absorbiert an nicht-hydrolysierten oder hydrolysieren Bakterien oder an einem inerten Trägerstoff vor. Das in dem Immunisierungsmittel verwendete Lipoid A kann auch mit Alkali vorbehandelt sein.
Gegenstand der Erfindung ist weiterhin ein Verfahren zur Herstellung des Immunisierungsmittels, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man das aus dem Lipopolysaccharid eines Enterobakteriums gewonnene Lipoid A als Antigen verwendet und daß man das aus dem Lipopolysaccharid eines Enterobakteriums gewonnene Lipoid A Säugetieren injiziert und aus den Säugetieren durch
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Blutentnahme Antilipoid-A-Antiserum isoliert und dies als Antikörper verwendet (passive Immunisierung).
Gegenstand der Erfindung ist weiterhin die Verwendung der iBfflninisierungsmittel als Impfstoff für die Immunoprophylaxe und als Serum bei der Immunotherapie und die Verwendung der Immunisierungsmittel gegen Infektionskrankheiten, wie Typhus- und Paratyphuserkrankungen, bakterielle Ruhr (Shigellosen), .CoIi Enteritides der Säuglinge, Coliinfektionen, Salmonella Enteritiden sowie Erkrankungen durch andere Enterobacteriaceae. Eine weitere Verwendung ist bei Tieren indiziert (Kühen, Pferden, Schweinen, Ziegen ect.)t sowohl erwachsenen wie neugeborenen. - " ρ
Untersuchungen der vergangenen Jahre (siehe Zusammenfassung Otto Lüderits, Angewandte Chemie 1970, Seite 708) haben gezeigt, daß auf der Oberfläche von Bakterien Lipopolysaccharide lokalisiert sind."Lipopolysaccharide bestehen aus einem Lipoid-Anteily der an Polysaccharide gebunden ist (Lipoid = fettartige Substanz).
Gramnegative Bakterien enthalten an ihrer Oberfläche Lipopolysaccharide, die sich durch vielfällige biologische Aktivität auszeichnen. Sie stellen die O-Antigene der Bakterien dar, sie sind hochwirksame Endotoxine und sie fungieren als Rezeptoren für Bakteriophagen. Durch Injektion von isoliertem Lipopolysaccharid können viele bei Infektionen auftretende Krankheitserscheinungen hervorgerufen werden. Besonders eindrucksvoll ist ihre pyrogene Wirkung. So bewirkt beispielsweise die Injektion von 1 짣ΐια Menschen nach kurzer Latenzzeit einen Pieberstoß auf 4O0C. Viele andere biologische Reaktionen werden von Lipopolysacchariden ausgelöst, z.B. das Shwartzman-Phänomen, Turaor-tfeerose, Blutdruckveränderungen, Fibrinolyse, Veränderungen der Resistenz gegenüber Infektionen, Adjuvanswirkungen usw.
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Die' Lipopolysaccharide gramnegativer Bakterien sind somit eine einzigartige große Klasse biologisch interessanter Haturstoffe, die als Antigene, als Endotoxine oder als Hiagenrezeptoren wirken, Lüderitz und Kollegen haben gezeigt, daß lipopolysaccharide nach einem gemeinsamen Bauprinzip aufgebaut sind und im allgemeinen aus drei Regionen verschiedener Struktur, wie es im folgenden zeichnerisch dargestellt ist, bestehen.
O-spezifische Kette Kernpolysaccharid Mpoid A
Region I Region II Region III
So enthalten alle Lipopolysaccharide eine Mpoidkomponente, das Lipoid A ^Region III), an welche das KernpoXysaceharid (Region II) und O-spezifische Ketten geknüpft sind (Lüderits,O. Staub, A.M., und Westphal, 0., Bakt. Rev. 30 (1966) 192, Gmeiner, J., Luderitz, 0., und Westphal, 0., Eur.J.Biochem., 7, (1969) 370).
In der Natur gibt es nun unzählige gramnegative Species, denen allen das gleiche Bauprinzip zugrunde liegt, wobei die Regionen I und II Unterschiede aufweisen, aber in allen Fällen das Lipoid A als Region III vorhanden ist. Dies gilt für alle gramnegativen Bakterien.
R-Mutantenstämme enthalten defekte Lipopolysaccharide. Die 0-spezifischen Ketten sind nicht vorhanden und das Kernpolysaccharid ist abhängig von den Stellen der Mutation in mehr oder weniger vollständiger Form vorhanden (0. Lüderitz et al, Ann. N.Y.Acad.Sci. 133 (1966) 349)-
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Die Immunisierung von Tieren mit Bakterien oder isolierten Lipopolysacchariden führt zur Bildung spezifischer Antilipopolysaccharidantikörper. Sie betreffen hauptsächlich Determinanten im Zuckerteil des Moleküls. Zirkulierende Antikörper mit Antilipoid-A-Spezifität wurden noch nicht festgestellt. (Lüderitz et al. in "Microbial Toxins", Vol. IV, Ed. S.J.AjI, G.Weinbaum, S.Kadis, Publ. Academic Press, U.Y. Seite 145 233 (1971)).
Wie bereits erv/ähnt, ist das Lipoid A Hauptbaus te in. aller Lipopolysaccharide und strukturell identisch oder ähnlich bei allen Enterobacteriaceae (0.Lüderitz et al. in "Comprehensive Biochemistry, Eds. M. Plorkin und E.H. Stotz·, VoJ.. 26A (1968) 105-228), Die Bildung von Antikörpern gegen die allgemeine Lipoid-A-Struktur der Lipopolysaccharide wurde bisher nicht beschrieben und es wurde auch bislang kein Versuch unternommen, durch Immunisierung mit Lipoid A zirkulierende Antikörper mit Lipoid-A-Spezifität zu erzeugen.
Überraschenderweise wurde nun gefunden, daß Lipoid A unter bestimmten Bedingungen in Tieren als Immunogen wirkt und daß dadurch Antikörper gebildet werden, die spezifisch mit Lipoid A reagieren. Diese Tatsache kann man sich zu Nutze machen, um einerseits Impfstoffe herzustellen, die Lipoid A enthalten und andererseits kann man Sera herstellen, die Antilipoid-A-Antikörper enthalten. Dadurch erscheint es möglich, eine große Reihe von Infektionskrankheiten wirksam zu bekämpfen.
Zur Herstellung von Lipoid A werden Bakterien auf an sich bekannte Weise gezüchtet und dann werden die Kulturen abgetötet. Die Bakterien können auf bekannte Weise isoliert werden. Aus diesen Bakterien gewinnt man die Lipopolysaccharide und diese Lipopolysaccharide werden dann hydrolysiert, wobei man Lipoid A erhält.
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Zur 'Herstellung von Impfstoffen kann man Zusammensetzungen herstellen, die das Lipoid A und bekannte Trägerstoffe enthalten. Man kann weiterhin hydrolysierte und nicht-hydrolysierte Bakterien mit Lipoid A oder Alkali-behandeltem Lipoid A überziehen und alle diese Präparationen zur Herstellung von Impfstoffen verwenden. Um antikorperhaltige Sera herzustellen, kann man Menschen und Tiere aktiv mit Lipoid A oder den erwähnten Lipoid-A-Präparationen immunisieren. Die von den Serumspendern gewonnenen Rohsera können zur Prophylaxe und Therapie für Infektionskrankheiten verwendet werden.
Materialien und Verfahren
; k
Bakterien
Zur Durchführung der Erfindung werden Bakterien in üblicher Weise gezüßhtet,,.
Lipopolysaccharide, Lipoid A und alkalibehandeltes Lipoid A
Lipopolysaccharide werden aus G-lattformbakterien gemäß dem Phenol/Wasser-Verfahren (0. Westphal et al, Zeitschrift für Naturforschung, 7b (952) und aus Rauformbakterien gemäß dem Phenol/Chloroform/Petroläther-Verfahren (G. G-alanos et al. t Eur.J.Biochem. 9 (1969) 245) extrahiert.
Freies Lipoid A wird durch Hydrolyse des entsprechenden Lipopolysaccharids in verdünnter Säure, z.B. in 1$iger Essigsäure bei 100° während 2 Stunden hergestellt. Das wasserunlösliche freie Lipoid A wird mehrere Male mit destilliertem Wasser gewaschen und im Vakuum getrocknet. In solchen Präparationen kann kein 2-Keto-3-desoxyoctonat (KDO) festgestellt werden. Lipoid A kann durch Zugabe von Triäthylamin (1 μΐ) zu einer Suspension von Lipoid A in Wasser (2 mg/2 ml) solubilisiert werden (0. Westphal et al., Coil.Intern.C.N.R.S., Paris (Oktober 1967) 174 (1969) 69).
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Zur Solubilisierung von Lipoid A kann man auch andere Amine und andere basisch reagierende Stoffe verwenden.
Modifizierte Lipoid-A-Präparate wurden durch Behandlung von Lipoid A mit alkalischen Mitteln erhalten. So wurde z.B. freies Lipoid A in O,25n-Natriumhydroxyd 1 Stunde bei 560C erwärmt. (E. Neter, Bact. Rev. 20 (1956) 166). Das unlösliche Material wurde entfernt, die überstehende Flüssigkeit wurde mit Essigsäure neutralisiert, wobei sich ein Niederschlag bildete. Der Niederschlag wurde entfernt und die überstehende Lösung gegen destilliertes Wasser dialysiert. Ausgefallenes Material wurde erneut durch Zentrifugieren entfernt und die überstehende Flüssigkeit, die lösliches alkalibehandeltes Lipoid A enthielt, wurde gefriergetrocknet.
Zur Herstellung von mit Lipoid A überzogenen Bakterien wurde Lipoid A in destilliertem Wasser (1 mg/ml) suspendiert und durch Zugabe von Triäthylamin (1 μΙ/2 ml) solubilisiert. Aliquote Teile dieser Lösungen wurden mit 2 ml einer Suspension der Bakterien in destilliertem Wasser (1 mg/2 ml) vermischt und dann wurde die Mischung getrocknet. Auf diese Weise stellte man Bakterien her, die mit 10, 100 oder 500 μg Lipoid A pro 1 mg Trockengewicht überzogen waren.
Auf ähnliche Weise wurden hydrolysierte Bakterien mit Lipoid A überzogen. Zur Hydrolyse wurden die getrockneten Bakterien zweimal mit 1$iger Essigsäure gewaschen, dann in 1$iger Essigsäure (1 g/50 ml) suspendiert und während 2 Stunden bei 100° erwärmt. Sie wurden dann mit" destilliertem Wasser gewaschen und im Vakuum getrocknet und wie oben beschrieben mit Lipoid A überzogen.
Das so erhaltene Lipoid A und die Lipoid-A-Präparationen wurden bei den folgenden Untersuchungen verwendet. Selbstverständlich ist es möglich, Lipoid A auch noch auf andere Weise zu modifizieren. Bei den vorliegenden Versuchen wurden unbe-
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handelte, als auch mit Mpoid A überzogene hydrolysierte und nicht-hydrolysierte getrocknete Bakterien als Antigene verwendet. Weiterhin setzte man in Kontrollversuchen als Antigene frische, in der Wärme abgetötete Bakterien ein und verv/endete außerdem noch unvollständiges Freund 1S-Adjuvans alleine. Gemäß den von E.W. Wheat et al. (J.Bact. 94 (1967) 1366) beschriebenen Verfahren wurden antibakterielle Sera gegen S- und R-Pcnr.-bakterien hergestellt.
Bei der Herstellung von Antilipoid-Antisera wurden zwei verschiedene Immunisationsverfahren verwendet. Bei dem ersten ver- Jk abreichte man weißen Kaninchen aus Neuseeland mit einem Körpergewicht von 2 bis 2,5 kg vier intravenöse·Injektionen des Antigens mit unterschiedlichen Mengen an den angegebenen Sagen:
1. Tag 100 μδ
3. Tag 200 μβ
7. Tag 300 μg
11. Tag 500 μg
und entnahm den Tieren am 16. Tag durch Herzpunktur Blut, was dann näher untersucht wurde. Das Verhältnis von Bakterien zu Iiipoid A betrug dabei 1000:10 (Gew./Gew.).
In einer zweiten Versuchsreihe wurden champagnerfarbene Silberkaninchen mit einem Körpergewicht von 1,5 kg verwendet. Die Antigene (1,5 mg/1 ml), die in nicht vollständigem Freund 1S Adjuvans (1 ml) enthalten waren, wurden subkutan an vi^er verschiedenen Stellen injiziert. Zwei Immunisierungen wurden in einem Abstand von 7 Wochen durchgeführt. 10 Tage danach wurde aus der Ohrvene Blut entnommen. Das Verhältnis von Bakterien zu Iiipoid A betrug 1000:500 (Gew./Gew.).
Alle Sera wurden durch Erwärmen während 30 Minuten bei 56° von Komplement befreit.
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Um in den erhaltenen Sera die Konzentration an Antilipoid-A-Antikörper festzustellen, v/urde der passive Hämolysetest (Neter, E., Eact. Rev. 20 (1956) 166 und I. Beckmann et al., Biochem. Z. 339 (1964) 401) verwendet, der ein zweckdienliches und empfindliches Verfahren darstellt.
Bei diesem Versuch wurden menschliche Erythrozyten der Blutgruppe B Rh+ verwendet, da diese mit.Kaninchenserum oder mit Antilipoid-A-Serum keine Kreuzreaktion zeigen. Man fand, daß sie gleich gat mit Lipoid A, das mit Triäthylamin solubilisiert war, wie auch mit alkalibehandeltera Lipoid A sensibilisiert v/erden können. Wie Lipopolysaccharide überziehen diese beiden Präparationen Erythrozyten spontan". . ΐ
Erythrozyten, die entweder mit Lipoid A oder mit alkalibehandeltem Lipoid A sensibilisiert sind, ergeben im wesentlichen die gleichen Ergebnisse. Der Einfachheit halber wurde im allgemeinen alkalibehandeltes Lipoid A verwendet, um die Erythrozyten zu überziehen. ;
Absorption und Desorption von Antilipoid-A-Antikörper
Antilipoid-A-Antiserum (1 ml) wurde mit gepackten, mit lOrmalin behandelten roten Zellen (0,1 ml), die mit alkalibehandeltem Lipoid A (100 μg) sensibilisiert worden waren, vermischt. Die Mischung wurde bei Zimmertemperatur 15 Minuten gerührt und dann wurden die Zellen durch Zentrifugieren abgetrennt.
Zur Desorption der Antilipoid-A-Antikörper wurden die Zellen nach der Absorption in einen 0,1m Glycin-HCl-Puffer (pH 2,2), 2 ml bei Zimmertemperatur 1 Stunde gerührt. Nach der Zentrifugation wurde die überstehende Flüssigkeit mit Natriumhydroxyd neutralisiert und durch Ultrafiltration auf das ursprüngliche Volumen (1 ml) konzentriert.
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Chromatographische -Trennung der Immunoglobuline
Diese wurde nach Porath, J. , und Ui, IT. (Biochim.Biophys.Acta 90 (1964) 323) durchgeführt.
Phap;ocytose von E. coli Bakterien, die mit Anti-Li-poid-A-Serum behandelt worden sind
Das von J.L. Whitby und D.Rowley (Brit. J. exp. Pathol. 40 1959, Seite 358) beschriebene Verfahren wurde verwendet.
Antilipoid-A-Aktivität von verschiedenen Iminunsera
Kaninchen wurden mit verschiedenen Antigenen gemäß den oben beschriebenen Methoden immunisiert. Die verwendetenBakterien waren S. minnesota R595· Die Lipoid-A-Präparation wurde aus dem Lipopolysaccharid von S. minnesota R345 erhalten.
Um die Antilipoid-A-Aktivität in dem entsprechenden Serum zu bestimmen, wurde der passive Hämolyseversuch durchgeführt, wobei man rote Blutzellen verwendete, die mit alkalibehandeltem Lipoid A aus S. minnesota R345 überzogen waren. Im allgemeinen führt die subkutane Immunisierung in unvollständigem Freundfs Adjuvans zu einem geringfügig höherem Antilipoid-A-Titer, verglichen mit dem intravenösen Immunisierungsschema. Mit beiden Verfahren erhielt man die besten Ergebnisse, wenn man hydrolysierte S. minnesota R595-Bakterien, die mit Lipoid A überzogen waren, als Antigen verwendet. Man erhielt ebenfalls gute Ergebnisse, wenn man mit hydrolysierten Bakterien oder mit nicht-hydrolysierten Bakterien, die mit Lipoid A überzogen waren, immunisierte. Immunisierung mit entweder mit Phenol getöteten oder mit den wärmegetöteten Bakterien führte zu niedrigen Werten der Antilipoid-A-Aktivität. In dem Präblutserum oder nach der Injektion mit unvollständigem Freund's Adjuvans konnte man keine Antikörper feststellen. Einige der erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle I zusammengefaßt.
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Im letzten Versuch (7) wurden hydrolvsierte Bakterien, die mit Lipoid A aus einem E. coli Stamm (E. coli EH 100) überzogen waren, als Antigen benutzt.
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Tabelle I
Antilipoid-A-Aktivität von Immunsera, die man durch Immunisierung mit verschiedenen Antigenen erhält. In Anwesenheit von Komplement wurden menschliche rote "Blutzellen, die rait alkalibehandeltem Lipoid A überzogen waren, mit den Antisera inkubiert.
Serum für die Immunisierung Nr. verwendetes Antigen
7a,b
Hämolyseversuch
Sera erhalten durch
• intravenöse
Immuni sie rung
. ■ j
; <		 subkutane
Immuni sie rung
"' (mit unvollstän
digem Freund 's
Adjuvans)		 16
(Verfahren 1) (Verfahren 2) n.b.
(reziproker Endtiter) 128
Bakterium: S.minnesota
R595
Liüoid A: S.minnesota
R345		 1024
1a,b Bakterien n.b. 16
2a,b Bakterien überzogen
mit Lipoid A		 128
3a,b hydrolysierte
Bakterien		 128
4a,b hydrolysierte Bakterien
überzogen mit Lipoid A		 512
5a,b frisch wärmegetötete
Bakterien		 -16
6a,b unvollständiges
Freund's Adjuvans n.b.
Bakterium: S.minnesota
R595
Lipoid A: E. coli EH 100
hydrolysierte Bakterien überzogen mit Lipoid A 512
<4
n.b.
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2157H8
n.b. = nicht bestimmt
Zeit der Blutentnahme (a): am 16. Tag
(b): am 52. Tag
Ein Kaninchen wurde intravenös mit hydrolysierten Bakterien (S.minnesota R595)> die mit einer Lipoid-A-Präparation überzogen waren, die man aus dem Lipopolysaccliarid eines E.eoli-Stamnis erhalten hatte, immunisiert. Die Antilipoid~A-Aktivität wurde wie oben beschrieben bestimmt. Wie aus Tabelle I ersichtlich ist (Serum 7)» war das E.coli-Lipoid-A genau so immunogen wie.die Salmonellen-Mpoid-A-Präparation.
Ein Immunserum (Serum 4a der Tabelle I) wurde mit Erythrozyten geprüft, die mit Lipoid A aus verschiedenen Quellen sensibilisiert waren. Diese Lipoid-Α-Präparationen waren aus Lipopolyeacchariden (Glycolipoiden) der folgenden Stämme isoliert worden: S.typhimurium SR und TV161, S.minnesota R3, R5 und R595 und E.coil EH100 (Nikaido, H., Adv.Enzymol. 31 (1968) 77).
In allen Fällen lagen die Hämolysetiter im Bereich von 1:250 bis 1:512, was anzeigte, daß die verschiedenen Lipοid-Α-Präparationen serologisch nicht unterscheidbar waren.
Spezifische Absorption und Desorption von Lipoid-A-Antikörper
Die Spezifität eines Antilipoid-A-Antiserums (Serum 4a der Tabelle I) wurde durch Absorption mit Pormalin-behandelten Erythrozyten, die mit Mpoid A sensibilisiert waren, (aus S.minnesota R345)» wie es zuvor beschrieben wurde, untersucht.
Vie aus Tabelle II ersichtlich, enthält das absorbierte Serum keine Antilipoid-A-Aktivität, während man bei der Vergleichs-
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probe (Behandlung mit nichtsensibilisierten Erythrozyten) keinen Titerabfall beobachtete.
Die absorbierten Antilipoid-A-Antikörper konnten dissoziiert werden, indem man die mit Lipoid A überzogenen Zellen mit Glycin-HCl-Puffer bei pH 2,2 inkubierte. Es wurde eine beträchtliche Menge der Antilipoid-A-Aktivität wiedergewonnen (Tabelle II).
Tabelle II
Absorption und Isolation von Lipoid-A-spezifischen Antikörpern aus Iminunserum mit Lipoid-A-sensibilij3ierten Erythrozyten.
Serumpräparationen
Hämolyseversuch
ursprüngliches Antiserum (4a von Tabelle I)
Antiserum, absorbiert an:
a) mit Formalin behandelten roten Blutzellen
b) mit Formalin behandelten roten Blutzellen, die mit Alkali-behandeltem Lipoid A überzogen sind
Wiedergewinnung der Antikörper nach der Desorption von den roten Blutzellen
(reziproker Endtiter) 512
512
4 256
Primäre und sekundäre Antikörperantwort auf Lipoid A
Bei diesem Versuch verabreichte man zwei Kaninchen zwei i.v. Injektionen von hydrolysierten Bakterien (S.minnesota R595), die mit Lipoid A überzogen waren (S.minnesota R345) Verhältnis 1000:100, Gew.-/Gew., und zwar 100 iig am ersten und 200 fig
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BAD ORjGfMAL
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am 15. Tag. Zu verschiedenen Intervallen wurde das Serum auf Antilipoid-A-Aktivität analysiert.
In Pig. 1 ist das Schema der Antikörperantwort dargestellt. Geringe Antikörper-Titer konnten am 4. Tag festgestellt werden. Nach einem stetigen Anstieg erhielt man am 12. Tag ein Maximum. Die Injektion am 15. Tag führte zu Maximaltitern am 25. Tag, die dann abnahmen.
Trennung von Antilipoid-A-Immunoglobulinen
Es wurde gezeigt, daß Antilipoid-A-Immunserum sowohl IgM wie auch IgG- Immunglobuline enthält. ' ' ■?
Serologische Kreuzreaktion zwischen Lipoid A und verschiedenen Lipopolysacchariden der S- und R-Pormen
Die Fähigkeit von Antilipoid-A-Antiserum (Serum 4a der Tabelle I) mit S- und R-Lipopolysacchariden von Salmonella- und E.coli-Stämmen zu reagieren, wurde im passiven Hämolysetest mit roten Zellen, die mit diesen Präparationen sensibilisiert waren, untersucht.
Wie in Tabelle III gezeigt ist, reagieren alle S- und R-Formen der Lipopolysaccharide mit dem Antilipoid-A-Serum (Serum 4a von Tabelle I). Der höchste Titer (1:250) wurde mit dem Lipopolysaccharid Glycolipoid) der Re-Mutante von S.minnesota R595 ■ erhalten, die die unvollständigste Struktur und den höchsten Anteil an Lipoid A enthält. Kreuzreaktionen in verschiedenen Größenordnungen (Titer zwischen 1:128 und 1:4) wurden mit allen anderen Präparationen erhalten. Um die Spezifität dieser Kreuzreaktionen zu zeigen, wurden die Lipopolysaccharide ebenfalls mit dem gleichen Serum nach der Absorption mit Lipoid A geprüft. Man fand, daß in allen Fällen keine Kreuzreaktionen auftraten. Weiterhin konnte keine Umsetzung der Lipopolysaccharide mit dem Vor-Immunserum beobachtet v/erden.
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Tabelle III
Serologische Kreuzreaktionen zwischen verschiedenen Lipopolysacchariden und Antilipoid-A-Antiserum
Bakterienstämme, aus denen Passiver Hämolyseversuch mit Lipopolysaccharide erhal- Lipopolysaccharide^ und Lipoten wurden Id-A-Antiserum (4a von Tabelle I)
S-Formen (reziproker Endtiter)
S.montevideo 128
S. typhimurium 32
S.abortus equi 16 · .->
S.typhi 64 '"*
S.worthington 32
S.minnesota 64
S.godesberg 32 S. milwaukee ■■---■-- 8
E.coli 0111 32
R-3?ormen
S.paratyphi B T1 16
S.friedenau T1 4
S.typhimurium TV161 32
S.minnesota R345 64
S. typhimurium M 64
S.minnesota R5 32
S.minnesota R7 -» 16 x _
S.minnesota R3 16
S.minnesota R595 256
Lipoid A 512
+) Menschliche rote Blutzellen wurden mit Lipopolysacchariden der S-Formen, alkalibehandelten Lipopolysacchariden der R-Formen und alkalibehandelten Lipoid A überzogen.
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Opsonisierunp; von h'.coü 0111-Bakterien mit Antilipoid-A-Antiserum
Die Fähigkeit von Lipoid-A-Antiserum, die intraperitoneale Phagozytose von Bakterien in Mäusen zu aktivieren, wurde mit E.coli 0111-Bakterien untersucht, die mit verschiedenen Konzentrationen von Normal- und Immun-Serum behandelt worden waren.
Mäuse wurden mit konstanten Mengen an Bakterien intraperitoneal injiziert und die Anzahl der überlebenden Bakterien wurde zu verschiedenen Zeitintervallen bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle III gezeigt. . . #
Tiere, die entweder Bakterien alleine oder Bakterien inkubiert mit Nomal-Serum erhalten hatten, zeigten keine wesentliche Verminderung der Anzahl der lebensfähigen Bakterien innerhalb von 90 Minuten. "InrGegensa'tz dazu erhielt man ein 97$iges und 90$iges Absterben, wenn die Bakterien mit Antilipoid-A-Serum mit Verdünnungen von 1:500 oder 1:1000 vorbehandelt waren. Bei höheren Verdünnungen nahm die Absterbequote ab, aber selbst Behandlung der Bakterien mit Antiserura, das auf 1:10 000 verdünnt war, ergab ein 70$iges Absterben. Um zu zeigen, daß die Phagozytentätigkeit durch Antilipoid-A-Antiköxper aktiviert wird, wurde das Antiserum mit Erythrozyten, die mit Lipoid A überzogen waren, absorbiert. Wie aus Pig. 3 ersichtlich ist, induzierte das absorbierte Serum die Phagozytentätigkeit nicht mehr.
Aus den hier vorliegenden Ergebnissen ist ersichtlich, daß Lipoid A Antilipoid-A-Antikorper bildet, die mit allen bekannten Lxpopolysacchariden reagiert. Die Bildung von Antilipoid-A-Antikörpern wird in starkem Ausmaß unterdrückt, wenn die Immunisierung mit Lipopolysacchariden oder bakteriellen Zellen erfolgt, worin das Lipoid A lange Poiysaccharidketten enthält,
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wie beispielsweise in S-Formen, oder Oligosaccharideinheiten, wie in R-Mutanten.
Die erhaltenen Ergebnisse zeigen, daß Lipoid A, wenn es in geeigneter Form vorliegt, als Immunogen wirken kann.
Immunisierung mit intakten S.minnesota R595-Bakterien, die auf ihren Zelloberflächen das Glycolipoid (KDO),-Lipoid A enthalten, liefern niedrige Antilipoid-A-Aktivität. Verbesserte Titer werden erhalten, wenn man mit den gleichen Bakterien, aus denen man das KDO durch milde Säurehydrolyse abgespalten hat, immunisiert. Solche hydrolysieren Bakterien enthalten freies Lipoid A in ihren äußeren Zellmembranen. Werden diese hydrolysierten Bakterien mit zusätzlichem freien Lipoid A überzogen, das aus einem Lipopolysaccharid durch milde Säurehydrolyse isoliert wurde, und zur Immunisierung verwendet, so erhält man bis jetzt die höchsten Antdlipoid-A-Titer. Die Antikörperbildung zeigt dabei einen Zeitverlauf, der dem der Antikörperbildung gegen die Polysaccharidstruktur von Lipopolysacchariden ähnelt (S. Schlecht und Westphal 0., ZbI. Bakt.I.Orig. 205 (1968) 487). Im allgemeinen ist die Antikörperbildung bei der subkutanen Immunisierung mit Freund's Adjuvans etwas höher als bei dem intravenösen Immunisierungsverfahren. Die Ergebnisse zeigen, daß Lipoid A, wenn es an der Bakterienzelle in exponierter Lage auf der Oberfläche vorliegt, die BiI-.dung von Antikörpern in dem Tier stimuliert.
Zur Bestimmung der Antilipoid-A-Aktivität in solchem Antiserum erwies sich der passive Hämolysetest als empfindlich und zweckdienlich.
Menschliche Zellen der Blutgruppe B Rh+, die mit üblichem Kaninchenserum oder mit Antilipoid-A-Antiserum keine Kreuzreaktion zeigen, konnten leicht mit Lipoid A, das entweder mit Triäthylamin oder durch Alkalibehandlung solubilitiert war, überzogen werden.
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BAD
• 2157H8
Mit diesem empfindlichen Nachweis ist es möglich, in den IgM- und IgG-Praktionen Antikörper gegen Lipoid A festzustellen, wenn man das Immunserum an Sephadex G--200 chromatographiert. Pur die Absorption von Lipoid-A-Antikörpern aus Immunsera und für ihre Wiederisolierung v/erden Lipoid-A-sensibilisierte Erythrozyten verwendet. Dadurch konnte auch die Lipoid-A-Spezifität der Immunsera getestet werden.
Es wurde gefunden, daß Lipoid-A-Präparationen, die aus einem E.coli- und einer Zahl von Salmonella-Lipopolysacchariden erhalten wurden, starke serologische Kreuzreaktionen mit verschiedenen Lipoid-A-Antisera ergeben. Pur die postulierte biologische Bedeutung der Antilipoid-A-Antikörper scheint die Präge wichtig, ob diese Antikörper mit Lipopolysacchariden der S- und R-Pormen kreuzreagieren, die Lipoid A bedingt durch Polysaccharidketten in schwer zugänglicher Porm enthalten.
Die Ergebnisse von Tabelle III zeigen, daß alle Lipopolysaccharide, die untersucht wurden, mit dem Lipoid-A-Antiserum Kreuzreaktionen ergeben, einige sogar in starkem MaSe. Andererseits zeigen nicht alle antibakteriellen Antisera (die man routinemäßig durch Immunisierung von Kaninchen mit abgetöteten Bakterien herstellt) Antilipoid-A-Aktivität. Dies bedeutet, daß, obgleich Lipoid A in den Bakterien nicht immer ausreichend exponiert ist um Antikörper zu stimulieren, Antilipoid-A-Antikörper in der Lage sind, mit Lipopolysacchariden zu reagieren, selbst mit solchen der S-Porm.
Daß Antilipoid-A-Antikörper in der Lage sind, mit Lipopolysacchariden auf der Bakterienaellwand zu reagieren, wurde dadurch bewiesen, daß sie als Opsonine wirken und die Phagozytose von Bakterien aktivieren können. TJm dies festzustellen, wurden E.coli 0111-Bakterien mit Lipoid-A-Antiserum behandelt und danrx wurde ihr Verhalten in dem Häuseperetoneum verfolgt. Man fand, daß Antilipoid-A-Antikörper in hohen Verdünnungen wirksam waren und die Bakterien für die nachfolgende Phagocytose sensibili-
slerten· 309821/1135
BAD
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Somit sind Antilipoid-A-Antikörper in der Lage, mit Lipopolysaccharide^ die an Zellwänden von Bakterien in der S-Forra vorhanden sind, zu reagieren. Da alle enterobakteriellen Zellwände Lipoid A enthalten, kann hochspezifisches Lipoid-A-Äntiserum universell mit einer großen Anzahl serologische verschiedener Arten reagieren. Antilipoid-A-Antikörper können somit einen Schutz gegen alle enterobakteriellen Infektionen ermöglichen.
In diesem Zusammenhang soll bemerkt werden, daß Lipoid A für die endotoxische Wirkung der Lipopolysaccharide wesentlich ist und es wird angenommen, daß Antikörper, die spezifisch mit Lipoid A reagieren können, antiendotoxische Aktivität aufweisen.
Die erfindungsgemäßen Sera unterscheiden sich serologisch eindeutig vom Anti-CA-(gemeinsames Antigen)-Antikörpern der Kunin-Art, da diese nicht mit Lipoid-A überzogenen roten Bluteellen reagieren.
In der Zeichnung ist das Überleben im Mäuseperitoneuia von E.coli 0111-Bakterien dargestellt, die mit Antilipoid-A-Immunserum opsonisiert sind. Die Opsonisierung erfolgte mit Antiserom ( Serum 4 von Tabelle I) in Verdünnungen von 1:500 ( izs ), 1:1000 ( ΪΆ ), 1:2000 ( S ) , 1:5000 (Q.), 1:10 000 ( O ) und als Vergleich wurde ein Versuch mit Lipoid-A-absorbiex'tem Antiserum (1:500 β ) und mit Vorblutserum (1:1000 X) durchgeführt .
BAD ORIGINAL
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Claims (11)

Pate η tans ρ r ü c h e
1. Iinmunisierun^smittel, dadurch gekennzeichnet, daß es als Antigen Lipoid A und/oder als Antikörper Antilipoid-A-Antikörper enthält.
£. ImiQunisierungsmittel gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Lipoid A absorbiert an nicht-hydrolysierten oder hydrolysierten Bakterien vorliegt.
3. Immunisierungsmittel gemäß Anspruch 1 und 2, dadurch ge- ' kennzeichnet, daß es mit Alkali-behandeltes Lipoid A enthält.
4. Immunisierungsmittel gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Lipoid A absorbiert an einem inerten Trägerstoff vorliegt. ... . ...
5. Immunisierungsmittel gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es als Antikörper nur Antilipoid-A-Antikörper enthält.
6. Verfahren zur Herstellung eines Immunisierungsmittels gemäß den Ansprüchen 1 bis 4» dadurch gekennzeichnet, daß man das aus dem Lipopolysaccharid eines Enterobakteriums gewonnene Lipoid A als Antigen verwendet.
7. Verfahren zur Herstellung eines Immunisierungsmittels gemäß Anspruch 1 und Anspruch 5t dadurch gekennzeichnet,^ daß man das aus dem Lipopolysaccharid eines Enterobakteriums gewonnene Lipoid A Säugetiereninjiziert und aus den Säugetieren durch Blutentnahme Antilipoid-A-Antiserum anreichert oder isoliert und als Antikörper verwendet.
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8. Verfahren zur Herstellung eines Immimisierungsmittels gemäß Anspruch 7» dadurch gekennzeichnet, daß man als Säugetiere Kaninchen verwendet.
9. Verwendung der Irnmunisieruiigsniittel gemäß den Ansprüchen 1 bis 4 als Impfstoff für die Immunoprophylaxe.
10. Verwendung der Arzneimittel gemäß Anspruch 1 und 5 als Serum bei der Immunotherapie.
11. Verwendung der Arzneimittel gemäß den Ansprüchen 1 bis 5 gegen Infektionskrankheiten, wie Typhus- und Paratyphuserkrankungen, bakterielle Ruhr (Shigellosen), Cöli Enteritides der Säuglinge, Coiiinfektionen, Salmonella Enteritideii sowie Erkrankungen durch andere Enterobacteriaceae, bei Mensch und Tieren wie Kühe, Pferde, Schweine, Schafe, Ziegen etc.
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'ί 0 98 21 /1
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