DE10331974A1

DE10331974A1 - Verfahren zur Herstellung und Verwendung antimikrobielle Proteine induzierender Faktoren

Info

Publication number: DE10331974A1
Application number: DE10331974A
Authority: DE
Inventors: Jens-Michael Prof. Dr. Schröder; Lars Dr. Schwichtenberg
Original assignee: UNI-KLINIKUM SCHLESWIG-HOLSTEIN CAMPUS KIEL; Schleswiger Tauwerkfabrik Oellerking GmbH and Co KG
Current assignee: UNI-KLINIKUM SCHLESWIG-HOLSTEIN CAMPUS KIEL; Schleswiger Tauwerkfabrik Oellerking GmbH and Co KG
Priority date: 2003-07-14
Filing date: 2003-07-14
Publication date: 2005-02-17
Also published as: WO2005007861A2; WO2005007861A3

Abstract

Die Erfindung stellt Wirkstoffe bakteriellen Ursprungs bereit, die die Synthese antimikrobieller Proteine/Peptide in Eukaryoten - insbesondere Epithelzellen - induzieren, ohne gleichzeitig Entzündungsreaktionen auszulösen. Die Erfindung beinhaltet die Kultivierungsbedingungen für Bakterien, die dazu führen, dass diese Wirkstoffe gebildet werden. Des Weiteren beinhaltet sie ein Verfahren, diese Induktoren antimikrobiell wirksamer Substanzen zu isolieren, von Induktoren proinflammatorischer Proteine zu trennen und aufzureinigen.

Description

Epithelien wie z.B. die menschliche Haut sind permanent einer Vielzahl pathogener Mikroorganismen ausgesetzt. Trotzdem kommt es bei gesunder Haut nur relativ selten zu Infektionen. Die Entdeckung verschiedener kostitutiv exprimierter und induzierbarer antimikrobieller Proteine/Peptide bestätigte die Hypothese, dass neben einer physikalischen Barriere auch ein epitheliales chemisches Abwehrsystem einen wichtigen Aspekt der natürlichen Resistenz der Epithelien darstellt. Die mRNA-Expression der induzierbaren antimikrobiellen Proteine/Peptide wird in zahlreichen Epithelzellen durch eine Stimulation mit proinflammatorischen Zytokinen (Harder et al, Am J Respir Cell Mol Biol. 22:714–721, 2000) aber auch durch Bakterien induziert.

Zu den induzierbaren, mehr oder weniger erregerspezifischen antimikrobiellen Proteinen (AP) gehören u.a. Defensine, Cathelicidine, RNAsen und auch Proteaseinhibitoren (Schröder JM. Cell Mol Life Sci. 56:32–46, Review, 1999). Es konnte gezeigt werden, dass die induzierbaren antimikrobiellen Proteine ein relativ breites Wirkungsspektrum aufweisen, das jedoch unterschiedlich und eher selektiv für die auf Epithelien vorkommenden pathogenen Mikroorganismen ist.

Aufgrund der zunehmenen Antibiotikarestisenz insbesondere von pathogenen Mikroorganismen, ist es erforderlich, antibiotisch wirksame Substanzen bereitzustellen, um diese Mikroorganismen erfolgreich zu bekämpfen. Aus der Patentliteratur sind verschiedene Verfahren bekannt, die die Bereitstellung antimikrobiell wirksamer Proteine/Peptide und deren therapeutische und vorbeugende Anwendung offenbaren ( DE 69424680T2 , WO 2000046245C1, DE340564 C2 , DE 19957043 A1 ). Die Herstellung dieser Substanzen ist jedoch aufwendig und bislang nicht in großem Maßstab durchzuführen. Zudem haben topisch verabreichte Antibiotika den Nachteil, dass sie nicht in die Epithelien penetrieren und die Schleimhaut nicht nur von Sekundärerregern befreien, sondern auch die an sich physiologische Schleimhautflora stark beeinträchtigen. Körpereigene, von den Schleimhautzellen produzierte antimikrobielle Peptide und Proteine schonen die physiologische Mikroflora.

Induzierbare antimikrobielle Peptide, beispielsweise Defensine, wurden kürzlich als wichtige Mediatoren der Infektionsabwehr von Zellen der Körperoberflächen gesehen. (Huttner, K. M. & Bevins, C. L. (1999) Pediatr. Res. 45, 785–794). Als wichtigster Teil des angeborenen Abwehrsystems von Körperoberflächen und weniger des adaptiven Immunsystems wird die Induktion antimikrobieller Peptide und Proteine durch ein System von sog. „Pathogen-Pattern-Erkennungs-Rezeptoren" kontrolliert (Medzhitov, R. & Janeway, C. A., Jr. (1997) Cell 91, 295–298) über die Epithelzellen Moleküle erkennen, die die Anwesenheit potentiell gefährlicher Mikroben signalisieren und nachfolgend die Synthese antimkrobieller Peptide und Proteine induzieren. Beispiele dieser Epitope sind bakterielle Lipopolysaccharide (Ingalls, R. R., Heine, H., Lien, E., Yoshimurs, A. & Golenbock, D. (1999) Infect. Dis. Clin. North Am. 13, 341–353), β-Glucane (Czop, J. K. & Kay, J. (1991) J. Exp. Med. 173, 1511–1520), Formylmethionyl-leucyl-phenylalanin (Panaro, M. A. & Mitolo, V. (1999) Immunopharmacol. Immunotoxicol. 21, 397–419), einige Mannose-haltige Kohlenhydrate (Fraser, I. P., Koziel, H. & Ezekowitz, R. A. (1998) Semin. Immunol. 10, 363–372), Peptidoglycane (Jin, Y., Gupta, D. & Dziarski, R. (1998) J. Infect. Dis. 177, 1629–1638), und bakterielle DNA (Heeg, K., Sparwasser, T., Lipford, G. B., Hacker, H., Zimmermann, S. & Wagner, H. (1998) Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 17, 464–469). Im Falle der Defensine zeigen Versuche, dass Lipopolysaccharide und Hitze-inaktivierte Bakterien oder Pilze Epithelzellen dazu bringen können, diese antimikrobiellen Peptide zu synthetisieren. Allerdings bewirken sie zusätzlich auch die Produktion entzündungsfördernder Zytokine wie Interleukin-1 und Tumornekrosefaktor-α, die zwar beide auch in Epithelzellen antimikrobielle Peptide induzieren können, aber primär Entzündungsreaktionen hervorrufen. Eine Verwendung dieser Agentien zur Induktion antimikrobieller Peptide als vorbeugender Infektionsschutz ist daher aufgrund dieser nachteiligen Eigenschaften nicht sinnvoll.

Aus Extrakten der Bäckerhefe wurde L-Isoleucin als spezifischer Induktor des β-Defensins EBD in Darmepithelien des Rindes isoliert (WO99059574A1). Bei L-Isoleucin ist das Unvermögen, proinflammatorischen Zytokine zu induzieren zwar von Vorteil, aber es scheint nur in Rinder-Epithelien als β-Defensin-Induktor wirksam zu sein, da über eine Induktion antimikrobieller Peptide durch L-Isoleucin in Epithelzellen des Menschen bislang nicht berichtet worden ist. Eigene Versuche zeigten, dass keines der induzierbaren antimikrobiellen Peptide des Menschen, beispielsweise die humanen β-Defensine 2 und 3 in verschiedenen Epithelzellen des Menschen nicht durch L-Isoleucin induziert werden.

Aufgabe der Erfindung ist es einen Wirkstoff zur Verfügung zu stellen, der die Synthese antimikrobieller Proteine/Peptide in Eukaryoten induziert, ohne gleichzeitig Entzündungsreaktionen auszulösen.

Die Aufgabe wird durch einen Wirkstoff mit den Merkmalen der Ansprüche 1–6 gelöst. Die Ansprüche 7–11 geben das Verfahren zur Herstellung und die Ansprüche 12–13 die Verwendung des Wirkstoffes an.

Da einige gram-negative Bakterien solche Wirkstoffe produzieren können, ist es Bestandteil der Erfindung Kultivierungsbedingungen bereitzustellen, die eine optimale Produktion und Freisetzung dieser Induktoren auslösen. Desweiteren besteht die Erfindung darin ein Verfahren anzugeben, das es erlaubt diesen Wirkstoff zu isolieren, von Induktoren entzündungsfördernder Faktoren abzutrennen und aufzureinigen. Die Erfindung beinhaltet desweiteren den Einsatz des Verfahrens zur Herstellung von wirkstoffhaltigen Zusammensetzungen sowohl zur Behandlung oder Vorbeugung von Infektionen und Krankheiten als auch zur selektiven Stimulierung des Immunsystems. Das Verfahren kann für die Aufreinigung im Labormaßstab (Milliliter- bis Literbereich) und für den industriellen Maßstab (Kubikmetermaßstab) eingesetzt werden.

Außerdem betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung des Wirkstoffes oder wirkstoff-haltiger Zusammensetzungen als selektiven Stimulus der „chemischen Barriere" von Körperoberflächen. Darunter versteht der Fachmann die Stimulation der Synthese von Stoffen in Zellen der Körperoberflächen, auch als Epithelzellen bezeichnet, die pathogenen Mikroorganismen das Eindringen in den Körper und die Vermehrung auf den Körperoberflächen verwehren ohne gleichzeitig eine Entzündung hervorzurufen. Der erfindungsgemäß verwendete Wirkstoff kann neben der Stimulation der Synthese antimikrobieller Peptide auch die Induktion von Botenstoffen bewirken, die in der Lage sind, „Gedächtnis-T-Lymphozyten" sowie jungfräuliche dendritische Zellen in die Haut zu locken und damit eine Immunantwort zu induzieren ohne Entzündungszellen (neutrophile Granulozyten) zu rekrutieren. Einer der wichtigsten Mediatoren ist das Chemokin MIP-3alpha, heute nach der neuen Nomenklatur als CCL20 bezeichnet. Es ist daher auch Bestandteil der Erfindung, den Wirkstoff wegen seiner CCL-20-induzierenden Eigenschaften als Adjuvans bei der Immunisierung mit unterschiedlichsten Antigenen zu verwenden. Erfindungsgemäß ist auch die Verwendung des Wirkstoffes zur Inhibierung des Wachstums von Bakterien und Hefen, insbesondere der Pityrosporum-Arten, auf der Haut. Es hat sich ferner herausgestellt, dass die erfindungsgemäß verwendeten Wirkstoffe die Bildung von seborrhoischen Erscheinungen, insbesondere Kopfschuppen, verhindern. Die erfindungsgemäß verwendeten Wirkstoffe eignen sich darüber hinaus gut für die Verwendung als desodorierender Wirkstoff in kosmetischen Desodorantien sowie gegen unreine Haut und leichte Formen der Akne bzw. Propionibacterium acnes. Der Induktor induziert nicht nur in Zellen des Menschen APs: In ähnlicher Weise wurden auch in kultivierten Epithelzellen des Rindes β-Defensine und Psoriasin durch den Induktor induziert. Der Induktor ist daher auch geeignet, bei Tieren zum vorbeugenden Infektionsschutz eingesetzt zu werden. Ferner führt der Wirkstoff in Pflanzen, beispielsweise Arabidopsis thaliana und der Gurke, zu einer Induktion von Genen antimikrobiell wirksamer Peptide sowie Genen, die eine Resistenz gegen Pilzerkrankungen und gegen bakteriell-bedingte Erkrankungen bewirken. Der Induktor eignet sich daher auch als Pflanzenschutzmittel.

Untersuchungen zur Induktion von HBD-2, HBD-3 und RNase7 in verschiedenen Epithelzellen (Hautkeratinozyten, primäre nasale, tracheale und bronchiale Epithelzellen, Darmepithelzellen) zeigen, dass die Induktion sowohl von der Art des Mikroorganismus als auch der Menge der Bakterien abhängt. So war eine auffällige Beobachtung, dass gerade ein klinisches, als mukoide Form wachsendes Isolat von Pseudomonas aeruginosa sowohl HBD-2 als auch HBD-3 und RNase 7 sehr gut induzierte, eine Eigenschaft, die nichtmukoide Pseudomonas aeruginosa Laborstämme nicht besaßen. Offensichtlich besitzen Epithelien ein Erkennungssystem für die mukoiden und pathogenen Formen von Pseudomonas aeruginosa und induzieren nur hier eine Abwehrleistung in Form einer Induktion von HBD-2 und anderen antimikrobiellen Peptiden (Induktor). Diese induzierenden Eigenschaften sind auch in Kulturüberständen mukoider Pseudomonas aeruginosa nachweisbar. Zur Gewinnung des antimikrobielle Peptide (AP) induzierenden Faktors (nachfolgend kurz als Induktor bezeichnet) ist es notwendig die Kulturbedingungen der Bakterien zu variieren, da die dem Fachmann bekannten üblichen Bedingungen zur Kultur von Mikroorganismen, beispielweise nährstoffreiche Medien und Schüttelkulturen bei relativ niedrigen Bakterien-Dichten, nicht geeignet sind. Unter diesen Kultivierungsbedingungen findet man auch bei anderen gramnegativen Bakterien, vorzugsweise Pseudomonas putida, Pseudomonas Fluoreszenz und Escherichia coli AP-induzierende Faktoren mit ähnlichen physikochemischen und biologischen Eigenschaften. Es ist daher Bestandteil der Erfindung, neben Pseudomonas aeruginosa auch andere gramnegative Bakterien als Quelle des Induktors zu verwenden.

Für den Einsatz des erfindungsgemäßen Induktors als prophylaktischer Immunstimulus ist es essentiell, die entzündungsfördernden (z.B. IL-1- und TNF-induzierenden) Faktoren abzutrennen. Dem Fachmann ist bekannt, dass Stoffe wie Phorbolester HBD-2 induzieren. Dieses ist aber gleichzeitig ein sehr effizienter Stimulus der Synthese von IL-1 und TNF und aufgrund dieser proentzündlichen Eigenschaften nicht zur Stärkung der chemischen Barriere verwendbar. Es ist dem Fachmann auch bekannt, dass gramnegative Bakterien entzündungsfördernde Faktoren, zu denen insbesondere Lipopolysaccharide (LPS) und formylierte Methionyl-Peptide (F-Met-Peptide) gehören, freisetzen. Diese führen bekanntermaßen in Blutleukozyten zur Freisetzung von entzündungsfördernden Peptid- und Lipid-Mediatoren wie Interleukin 1 und Tumornekrosefaktor alpha sowie Prostaglandinen und Leukotrienen. Dem Fachmann ist bekannt, dass – anders als bei Blutleukozyten – LPS und F-Met-Peptide sehr schlechte Stimuli für Hautkeratinozyten und andere Epithelzellen, beispielsweise Lungen- und Darmepithelzellen, sind. Sie wirken als unreine Präparation nur bei unphysiologisch hohen Konzentrationen (10 – 100 μg/ml). Es hat sich gezeigt, dass diese unreinen Präparationen bei ähnlich hohen Konzentrationen auch HBD-2 induzieren können, als chemisch reine Substanz diese Eigenschaft nicht besitzen. Es ist daher Bestandteil der Erfindung vorzugsweise durch Konzentrieren der Kulturüberstände über Molekularfiltern mit einer Ausschlußgrenze > 30 < 300 kDa und anschließender Präzipitation des Induktors mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmitteln, vorzugsweise Alkohole, bei neutralem pH die entzündungsfördernden Faktoren zu entfernen. Proinflammatorische Zytokine induzierende Faktoren zeigen bei einer gelchromatographischen Analyse eine Molekularmasse von ca. 60 kDa und lassen sich demnach durch Filter mit einem „Cutoff" von 300 kDa abtrennen. Zudem werden diese Faktoren nicht durch organische Lösungsmittel aus Bakterienkultur-Überstands-Konzentraten präzipitiert. Es erweist sich daher als vorteilhaft zur Abtrennung dieser proinflammatorischen Faktoren eine Konzentrierung der Kulturfiltrate über Filter mit einem „Cutoff" von 300 kDa mit einer sich anschließenden Präzipitation des Induktors vorzunehmen. Die Wirkung des gelösten Induktors auf Keratinozyten erfolgt in dosisabhängiger Weise. Dabei wurde festgestellt, dass bei Verwendung von Detergentien, vorzugsweise Rhamnolipid-Präparationen in Konzentrationen < 0.1 Vol.-%, die HBD-2-Induktion verstärkt wurde und bei niedrigeren Induktorkonzentrationen nachweisbar war. Eine Lösung des Induktors, beispielsweise in 0.1 % (Gewicht/Vol.) wässriger Rhamnolipid-Präparationen, stimuliert in verschiedenen Epithelzellen und Epithel-Zellinien des Menschen, vorzugsweise Keratinozyten der Haut und der Hornhaut der Augen, Schleimhaut-Epithelzellen des Aerodigestivtraktes, des Darmes und des Urogenitaltraktes sowie Knorpel- und Knochen-Zellen der Gelenke die Synthese der antimikrobiellen Peptide und Proteine β-Defensine 2, 3 und 4; RNase 7, Elafin und Psoriasin, ohne gleichzeitig entzündungsfördernde Zytokine wie IL-1β und TNF-alpha zu induzieren.

Es hat sich bei Versuchen zur Aufreinigung des Induktors aus Kulturüberständen von Pseudomonas aeruginosa gezeigt, dass er besondere physikochemische Eigenschaften aufweist, die ihn von bekannten „Immunstimuli" unterscheiden:
So findet man bei Versuchen der Aufkonzentrierung von Induktor-haltigen wässrigen Lösungen in Ultrafiltrationssystemen bei Verwendung von Filtern mit einer Ausschlußgrenze von 3 kDa, 30 kDa und 300 kDa HBD-2-induzierende Aktivität jeweils im Retentat. Diese Konzentrate bewirken in kultivierten Hautkeratinozyten in dosisabhängiger Weise neben der Induktion von HBD-2 auch die Induktion weiterer antimikrobieller Peptide wie HBD-3, RNase 7, Elafin und Psoriasin, aber auch der proinflammatorischen Zytokine Interleukin 1β (IL-1β) und Tumornekrosefaktor alpha (TNF-α) sowie Interleukin 8 (IL-8). Eine gelchromatographische Auftrennung dieser Konzentrate und Untersuchung der eluierten Fraktionen hinsichtlich ihrer Kapazität, in kultivierten Hautkeratinozyten HBD-2, HBD-3, RNase 7, IL-1β, TNF-α und IL-8 zu induzieren, zeigt, dass der Induktor antimikrobieller Peptide im vorderen Ausschlußvolumen, entsprechend einer Molekular-Größe > 70 kDa, eluiert wird, während IL-1β- und TNF-α-induzierende Aktivitäten in später eluierenden Fraktionen, entsprechend Molekularmassen von ca. 60 kDa, gefunden werden. Werden die Konzentrate einer Anionenaustauschchromatographie unterzogen, lassen sich antimikrobielle Peptide induzierende Faktoren durch einen Gradienten ansteigender NaCl-Konzentrationen von der Säule eluieren. Dabei findet man ein identisches Elutionsprofil unterschiedliche antimikrobielle Peptide, beispielsweise HBD-2-, HBD-3-, RNase7-, Elafin- oder Psoriasin-induzierender Faktoren. Werden Induktor-haltige Konzentrate von Bakterienkulturüberständen mit 30 Vol.-% Acetonitril versetzt und bei –20°C über Nacht stehen gelassen, lässt sich erfindungsgemäß ein Niederschlag isolieren, der HBD-2, HBD-3 und RNase 7, aber nicht die entzündungsfördernden Zytokine IL-1β und TNF-α induziert. Gelchromatographische Trennungen des gelösten Niederschlags zeigen diese Aktivitäten im vorderen Ausschlussvolumen. Der Niederschlag lässt sich mit Laugen, beispielsweise Natronlauge oder Ammoniak-Lösung, auflösen. Wird ein den Induktor enthaltender Niederschlag hydrolysiert und hinsichtlich der nachweisbaren Bestandteile analysiert, lassen sich die Fettsäuren Caprinsäure (C10:0), 3-OH-Caprinsäure, Laurinsäure (C12:0), 2-OH-Laurinsäure, 3-OH-Laurinsäure sowie die Zuckerkomponenten Glucosamin, FucNAc (in der O- Kette), Hexosen, 6-Deoxyhexosen und Ketodeoxysäuren (Kdo) nachweisen. Weiterhin enthält der Induktor Phosphorsäure in gebundener Form. Alkalische Lösungen des Induktors zeigen eine ausgeprägte Schaumbildung. Die HBD-2-induzierende Aktivität wird dabei nicht beeinträchtigt. Wird eine wässrige Lösung des Induktors mit 30 % Acetonitril versetzt und sofort über einem Ultrafilter mit „Cutoff" von 3 kDa diafiltriert, lässt sich HBD-2-induzierende Aktivität jetzt im Diafiltrat nachweisen, was einer Molekularmasse < 3 kDa entspricht. Bei Gelchromatographie des Induktors in wässrigem Phosphatpuffer, pH 7,4, der 30 Vol.-% Acetonitril enthält, wird HBD-2-induzierende Aktivität in Fraktionen eluiert, die Molekularmassen < 3 kDa entsprechen. Dem Fachmann ist bekannt, dass diese Eigenschaften typisch für Detergentien sind und zeigen, dass der Induktor auch oberflächenaktive Eigenschaften aufweist.

ESI-MS-Analysen in Isopropanol/Wasser/Ammoniak/Ammoniumacetat zeigen im positiven Modus Signale bei m/z 882, 903, 937, 937, 1000, 1071, 1154, 1250 und/oder 1363 Masse-Einheiten, jeweils +/– 3 Dalton.

Der Induktor ist in Laugen, aber auch in wässrigen Mischungen organischer Lösungsmittel, vorzugsweise Isopropanol/Wasser, 50 : 50, pH 8.0, löslich.

Für die chemische Struktur des Induktors ergibt sich aus den vorhandenen Daten, dass es sich um Gemische unterschiedlich substituierter Teilstrukturen der sog. Lipid A-Komponente des Lipopolysaccharids gramnegativer Bakterien handelt mit den Substituenten R1 bis R5 in der unten angegebenen Weise:
R₁: die Fettsäuren 2-OH-C14:0, 3-OH-C14:0, 2-OH-C12:0, 3-OH-C12:0, 2-OH-C:10, 3-OH-C10:0, C10:0, C12:0, C14:0 sowie Ester der Hydroxy-Fettsäuren, vorzugsweise mit C8:0, C10:0, C12:0, C14:0, C16:0 und den 2-OH- sowie 3-OH-Derivaten,
R₂: die Fettsäuren 2-OH-, 3-OH-C14:0, 2-OH-, 3-OH-C12:0, 2-OH-, 3-OH-C10:0, C10:0, C12:0, C14:0 sowie Ester der Hydroxy-Fettsäuren, vorzugsweise mit C8:0, C10:0, C12:0, C14:0, C16:0 und den 2-OH- sowie 3-OH-Derivaten,
R₃: Ketodeoxysäure (KDO), KDO-KDO,
R₄: die Fettsäuren 2-OH-, 3-OH-C14:0, 2-OH-, 3-OH-C12:0, 2-OH-, 3-OH-C10:0, C10:0, C12:0, C14:0 sowie Ester der Hydroxy-Fettsäuren, vorzugsweise mit C8:0, C10:0, C12:0, C14:0, C16:0 und den 2-OH- sowie 3-OH-Derivaten,
R₅: die Fettsäuren 2-OH-, 3-OH-C14:0, 2-OH-, 3-OH-C12:0, 2-OH-, 3-OH-C10:0, C10:0, C12:0, C14:0 sowie Ester der Hydroxy-Fettsäuren, vorzugsweise mit C8:0, C10:0, C12:0, C14:0, C16:0 und den 2-OH- sowie 3-OH-Derivaten,
C10:0 : Caprinsäure; C12:0 : Laurinsäure; C14:0 : Myristinsäure; KDO : 2-Keto-3-deoxyoctonsäure.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung des Induktors besteht aus den aufeinanderfolgenden Schritten:
Für die Produktion von HBD-2-Induktoren erfolgt die Kultivierung der Bakterien vorzugsweise unter statischen Bedingungen, bei sehr hohen Bakteriendichten und unter „Stressbedingungen" – vorzugsweise Nahrungsmangel, Mangel an essentiellen Elementen, Hitze, Kälte, erhöhte und sehr niedrige Ionenstärken und pH-Verschiebungen. Zur Gewinnung der Induktoren werden sterilfiltrierte Überstände von gramnegativen Bakterien, die unter den oben beschriebenen Bedingungen kultiviert wurden, beispielsweise unter Verwendung von Ultrafiltern konzentriert. Dabei hat es sich gezeigt, dass Ultrafilter mit einem Cut-off von > 300 kDa den Induktor anreichern. Durch Zugabe eines mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittels, vorzugsweise Alkohole wie Isopropanol, Ethanol und Methanol, aber auch dem Fachmann bekannte andere mit Wasser mischbare Lösungsmittel lässt sich der Induktor bei einem pH im neutralen Bereich präzipitieren. Dabei werden Konzentrationen zwischen 1 und 99 Vol.-Prozent des organischen Lösungsmittels, vorzugsweise 30 % für die Fällung des Induktors benötigt.

Eine Fällung des Induktors ist aber auch durch hohe Konzentrationen von Salzen, vorzugsweise NaCl, möglich.

Es ist daher auch Teil der Erfindung, den Induktor durch Salzfällung anzureichern.

Der den Induktor enthaltende Niederschlag wird durch Zugabe einer alkalischen wässrigen Lösung gelöst und durch Neutralisieren und anschließender erneuter Fällung durch Zugabe oben genannter organischer Lösungsmittel von kontaminierenden, entzündungsfördernden Faktoren befreit. Eine Abreicherung proinflammatorische Zytokine induzierender Faktoren erfolgt durch Behandlung des getrockneten Präzipitates mit Lipid-lösenden organischen Lösungsmitteln, vorzugsweise Chloroform/Methanol (50:50, Vol/Vol). Dabei verbleibt der erfindungsgemäße AP-Induktor im Präzipitat und entzündungsauslösende Faktoren in der organischen Phase. Natürlich sind auch andere, dem Fachmann bekannte Lösemittel, die die Eigenschaft besitzen, lipophile Induktoren proinflammatorischer Faktoren zu lösen, geeignet.

Es ist bislang keine hinreichend definierte Substanz bekannt, die in der Lage ist, in Zellen der Körperoberflächen des Menschen antimikrobiell wirksame Peptide und Proteine zu induzieren ohne gleichzeitig Entzündungen auszulösen. Es handelt sich daher bei der erfindungsgemäßen Substanz um ein neuartiges Prinzip zur prophylaktischen Infektionsabwehr auf Körperoberflächen des Menschen. Der Einsatz von Wirkstoffen, die gleichzeitig die Synthese mehrerer körpereigener antimikrobiell wirksamer Substanzen induzieren, hat den Vorteil, dass gleichzeitig mehrere z. T. gegen viele verschiedene pathogene Mikroorganismen gerichtete körpereigene antimikrobielle Peptide und Proteine von Zellen der Körperoberflächen dort produziert werden wo sie benötigt werden und gleichzeitig die physiologische Mikroflora schonen. Durch die Verwendung dieser Substanzen ist es möglich Infektionen und damit Entzündungen zu vermeiden, ohne dass die physiologische Mikroflora der Schleimhäute Einbußen erleidet.

Der Induktor erweist sich daher als ideal zur Stärkung der sogenannten „chemischen Barriere" unterschiedlichster Körperoberflächen, bestehend aus den o. g. antimikrobiellen Peptiden und Proteinen, vorzugsweise Haut, Augen, Schleimhäuten des Aerodigestivtraktes, des Darmes sowie des Urogenitaltraktes und auch der Gelenke des Menschen und der Tiere sowie die prophylaktische Behandlung von Pflanzen. Ein weiterer Vorteil des Wirkstoffes besteht darin, dass keine Aktivierung proinflammatorischer Zytokine ausgelöst wird. Diese Eigenschaft ermöglicht es daher, den Wirkstoff auch präventiv einzusetzen. Das beschriebene Verfahren ermöglicht es den Wirkstoff in großem Maßstab herzustellen.

HaCaT-Zellinie
Die verwendete HaCaT-Zellinie ist eine humane, immortalisierte, nicht-tumorigene Zellinie, die spontan aus normalen humanen Keratinozyten durch Kultur bei erhöhter Temperatur und geringer Kalziumkonzentration entstand.
Die aus bestehenden Kulturen des Labors übernommenen HaCaT-Zellen wurden in 10 ml DMEM-Medium (Dulbecco's Modified Eagle Medium; Cellconcepts GmbH, Umkirch) mit 10 % fetalem Kälberserum (FCS; PAA GmbH, Linz) angezüchtet. Vor der Verwendung wurde das fetale Kälberserum bei 65 C für 30 min inaktiviert. Weiterhin enthielt das Nährmedium 100 U/ml Penicillin, 100 μg/ml Streptomycin und 2 mM Glutamin. Die Kultivierung der HaCaT-Zellinie erfolgte bei 37 C wasserdampfgesättigter Atmosphäre mit CO₂-Begasung in 200 ml Kulturgefäßen (Sarstedt, Newton). Das Nährmedium wurde zweimal wöchentlich durch 37 C vorgewärmtes, frisches Medium ersetzt, wodurch gleichzeitig tote bzw. nicht adhärente Zellen entfernt wurden.
Isolierung und Kultur primärer humaner Keratinozyten
Humane Keratinozyten wurden aus frischen Vorhäuten isoliert, die bei entsprechenden Operationen anfielen. Nach dem Entfernen von Fett- und Bindegewebe wurden die Präparate in kleine Streifen (1–2 cm lang, 3–5 mm breit) geschnitten und zweimal in PBS gewaschen. Zur Ablösung der Epidermis erfolgte anschließend eine Inkubation in 0,25%iger Trypsinlösung (Gibco BRL, Eggenstein) über Nacht bei 4 C oder bei 37°C für 1 Std. Die Trypsinierung wurde durch Zugabe von FCS-haltigem Medium inhibiert und die Epidermis vom übrigen Gewebe abgezogen. Diese Zellen wurden anschließend durch mehrmaliges Aufund Abpipettieren resuspendiert und die Suspension bei 600 g und 4 C für 5 min zentrifugiert. Das Zellpräzipitat wurde dann in 10 % FCS/EpiLife-Medium (10 ml; Sigma, Deisenhofen) aufgenommen und in 200 ml Kulturflaschen überführt, die bei 37 C im Brutschrank inkubiert wurden. Die Lebensfähigkeit der Keratinozyten beschränkte sich auf ca. 3-4 Subkultivierungen, wobei die Zellen schon bei niedriger Konfluenz passagiert wurden, um eine zu schnelle Ausdifferenzierung zu verhindern.
Subkultivierung der Zellen
Eine Subkultivierung adhärent wachsender HaCaT-Zellen erfolgte bei 80–90 % Konfluenz, da diese Zellen in Kultur bei Erreichen der Konfluenz im Wachstum inhibiert werden, während bei den primären Keratinozyten der Grad der Ausdifferenzierung entscheidend für den Zeitpunkt der Subkultivierung war.
Zum Ablösen der adhärent wachsenden primären Keratinozyten bzw. HaCaT-Zellen vom Kulturgefäßboden wurden die Zellen zweimal mit PBS gewaschen und anschließend mit 5 ml einer 0,1%igen Trypsin-0,02 % EDTA-Lösung (Gibco BRL, Eggenstein) inkubiert. Die Inkubationszeit im Brutschrank betrug ca. 5 min. Das Ablösen der Zellen wurde durch mehrmaliges Klopfen an die Kulturflasche unterstützt, um die enzymatische Schädigung der Zellen möglichst gering zu halten. Dabei wurde fortwährend der Grad der Ablösung der Zellen mikroskopisch überprüft. Anschließend wurde durch Zugabe des gleichen Volumens an FCS-haltigem Medium die enzymatische Proteolyse abgestoppt. Nach mehrmaligem Resuspendieren der Zellen wurden diese bei 400 × g für 5 min zentrifugiert, mit DMEM-Medium gewaschen und in sterile Kulturflaschen eingesät (Subkultivierung) bzw. für Stimulationsversuche in 6-Loch bzw. 12-Loch Kultur-Platten (Becton Dickinson, Heidelberg) überführt.
Einfrieren und Auftauen von adhärent wachsenden Zellen
Zur Aufrechterhaltung der Kulturen wurden Zellen in Flüssigstickstoff eingefroren. Dazu wurden die Zellen einer Kultur zunächst mit Trypsin-Lösung von der Oberfläche der Kulturflasche abgelöst, trypsiniert und mit FCS-haltigem Medium gewaschen. Nach Zentrifugation für 5 min bei 400 × g und anschließendem Dekantieren des Überstandes erfolgte eine Überführung des Zellpräzipitats in 2 ml eiskaltes Nährmedium, welches zuvor mit 20 % FCS und 10 % Dimethylsulfoxid (DMSO), einem zelltoxischen Frostschutzmittel, versetzt wurde. Nach sofortigem Einfrieren der Zellen bei –70 C konnten diese nach 24 Stunden in den Flüssigstickstoffüberführt werden.
Zum Auftauen wurden die in Flüssigstickstoff tiefgefrorenen Zellen in einem Wasserbad bei 37 C aufgetaut. Um das DMSO möglichst rasch zu entfernen, wurde die 10-fache Menge an vorgewärmten FCS-haltigem Nährmedium (37°C) zu den Zellen gegeben und anschließend für 5 min bei 600 × g zentrifugiert. Nach Dekantieren des Überstandes wurde das Zellpräzipitat in ebenfalls vorgewärmtes FCS-haltiges Medium aufgenommen und in Kulturflaschen angezüchtet.
Stimulation der Zellen
Die zu stimulierenden Zellen wurden vor Beginn eines Experimentes in 6-Loch- bzw. 12-Loch-Kultur-Platten (Becton Dickinson, Heidelberg) mit 2 ml bzw. 1 ml Medium pro Loch überführt. Um ausschließen zu können, dass im FCS enthaltene, undefinierte Faktoren die Stimulierbarkeit der Zellen beeinflussen, wurde das Zellmedium zwölf Stunden vor dem Versuch nach zweimaligem Waschen mit PBS durch FCS-freies Nährmedium ersetzt.
Es wurde darauf geachtet, dass die Zelldichte bei der Stimulierung nicht zu hoch war (50-80 %), da eine zu hohe Zelldichte keine reproduzierbaren Stimulationseffekte zuließ.
Der Stimulus (Bakterien-Kulturüberstand, Induktor-haltige Lösungen) wurde in der gewünschten Konzentration in serumfreien 0,1 % BSA (bovines Serumalbumin)-DMEM-Medium aufgenommen und zu den Zellen gegeben, die zuvor nochmals mit PBS gewaschen wurden. Die Zugabe von BSA sollte dabei eine mögliche unspezifische Wechselwirkung der Stimuli mit den Gefäßwänden verhindern. Verschiedene Verdünnungen eines Stimulus (z.B. Überstände von Bakterienkulturen; siehe unten) wurden direkt im serumfreien Medium erstellt.
Stimulation der Epithelzellen mit Bakterien
Wurden Mikroorganismen für Stimulationsversuche von Keratinozyten benötigt, so wurde jeweils eine Einzelkolonie einer Plattenkultur oder 7–8 μl einer –70 C Flüssigkultur des entsprechenden Bakterienstammes entnommen und in 7–8 ml TSB-Medium angeimpft. Die Bakterienkultur wurde über Nacht bei 37 C unter Schütteln (200 Upm) inkubiert und die Zellzahl anhand der Absorption bei einer Wellenlänge von 620 nm (A620) bestimmt. Wenn nicht anders beschrieben, so wurde stets eine A620 von 0,2, entsprechend ca. 108 Bakterien, eingestellt und diese Suspension nochmals 1:10 in DMEM-Medium verdünnt, um eine Endkonzentration von 107 Bakterien/ml zu erhalten. Die Mikroorganismen wurden vor der Stimulation durch 30 min Inkubation bei 65°C abgetötet, für 15 min bei 2000 × g und 4°C zentrifugiert und in PBS-Puffer (pH 7,4) gewaschen.
Anzucht der Bakterien und Gewinnung Induktor-haltiger Bakterienkulturüberstände
Die Kultivierung von Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas stutzeri, Pseudomonas fluorescens, Escherichia coli, Staphylococcus aureus und Streptococcus pyogenes erfolgte bei 37°C auf Trypticase-Soy-Broth (TSB)-Agarplatten. Die Stammkulturen lagerten bei –70 C als Flüssigkeitskulturen.
Kultivierung der Bakterien zur präparativen Herstellung von Kulturüberständen
Für die Herstellung von Bakterienkulturüberständen zur Charakterisierung und molekularen Analyse HBD-2-induzierender Faktoren werden zunächst 7–8 μl der –70°C-Flüssigkultur des entsprechenden Bakterienstammes entnommen und in 7–8 ml TSB-Medium angeimpft. Nach einer 24-stündigen Inkubation wird diese Bakteriensuspension dann auf eine OD von 1,0 bis 1,2 eingestellt. 2 ml dieser verdünnten Flüssigkultur werden anschließend in 200 ml TSB-Medium angeimpft und über Nacht unter Schütteln (200 Upm) kultiviert. Nachdem die Bakterien zunächst zum Erreichen einer maximalen Zelldichte unter „optimalen" Wachstumsbedingungen (TSB-Medium, Suspensionskultur) für ca. 24 Std. inkubiert wurden, erfolgt eine Zentrifugation der Bakteriensuspension für 15 min bei 6000 × g. Das Bakterienpräzipitat wird anschließend in 200 ml Medium resuspendiert. Dabei werden die Bakterien auf zweierlei Weise für 24 Std. weiter kultiviert:

– in TSB-Medium oder definierten Medien (MG, AG, HP, M9) unter Schütteln (200 Upm → Suspensionskulturen)
– in TSB-Medium oder definierten Medien (MG, AG, HP, M9) unter statischen Bedingungen in 3-Schicht-Zellkulturflaschen

Die Bakterienkulturen werden anschließend erneut zentrifugiert. Auf eine Hitzeinaktivierung wird jedoch verzichtet, um eine Denaturierung eventuell am Stimulationsprozess beteiligter Moleküle in den Kulturüberständen ausschließen zu können. Die Kulturüberstände werden dekantiert und durch Verwendung des Stericup Filtrationssystems (Millipore GmbH, Eschborn) sterilfiltriert. Bis zur weiteren Verwendung werden diese Überstände bei –20 C gelagert. Sollen die Kulturüberstände als Stimuli verwendet werden, so werden diese zunächst mindestens 1:10 mit FCS-freiem 0,1%igem BSA/DMEM bzw. EpiLife-Medium verdünnt. 1 ml dieser Lösung wird jeweils zu den Zellen gegeben.
Nährmedien für Bakterienkulturen
Sämtliche Kulturmedien werden vor ihrer Verwendung sterilfiltriert.
Aufarbeitung HBD-2-Induktoren enthaltender Bakterienkulturüberstände
Nach der Sterilfiltration der Bakterienkulturüberstände werden diese in einer Ultrafiltrationskammer (Amicon^®-Kammer, Millipore GmbH, Eschborn) unter Verwendung eines YM30-Filters („Cutoff": 30 kD) oder XM300-Filters („Cutoff": 300 kD) konzentriert. Die Filtrate (< 300 kD) werden anschließend erneut in der Amicon-Kammer mittels eines YM30- und YM3-Filters konzentriert. Die so erzeugten vier Fraktionen (> 300 kD; 30–300 kD; 3–30 kD; < 3 kD) der Kulturüberstände werden dann separat auf mögliche induzierende Faktoren untersucht und gegebenenfalls mittels verschiedener HPLC-Verfahren weiter fraktioniert.
Acetonitril- und Säure-Behandlung bakterieller Kulturüberstände
Im Rahmen der biochemischen Charakterisierung der induzierenden Faktoren werden die 300 kD-Retentate der bakteriellen Kulturüberstände mit Acetonitril bzw. Säure inkubiert. Bei der Acetonitril-Behandlung der bakteriellen Kulturüberstände werden 30 kD-Retentate mit einem Anteil von 30 % Acetonitril versetzt und 16 Std. bei –20 C gelagert. Anschließend wird die Lösung 10 min bei 6000 × g und 4 C zentrifugiert. Die den HBD-2-Induktor enthaltenden Präzipitate werden zunächst in einem geringen Volumen 1 M NaOH gelöst und anschließend durch Zugabe von H₂O dem Volumen des Überstandes angeglichen, neutralisiert und erneut durch Zugabe von Acetonitril präzipitiert. Wird ein den Induktor enthaltender Niederschlag hydrolysiert und hinsichtlich der nachweisbaren Bestandteile analysiert, lassen sich die Fettsäuren 10:0 (3-OH), 12:0 (2-OH), 12:0 (3-OH) sowie die Zuckerkomponenten FucNAc (in der O-Kette), Glucosamin, Hexosen, 6-Deoxyhexosen und Ketodeoxysäuren (Kdo) nachweisen.
Im Rahmen einer Säurebehandlung werden Kulturüberstände zunächst durch Zugabe von 1 M HCl auf pH 3 eingestellt und anschließend das bei 4 C ausgefallene Präzipitat bei 6000 × g für 10 min zentrifugiert. Das Rhamnolipide, aber keine Defensin-induzierende Aktivität enthaltende Präzipitat wird nach Lösen in 1 M NaOH durch Wiederholung der Säureabhängigen Präzipitation gereinigt und besteht nach massenspektrometrischer Analyse vorwiegend aus C10-C10-Rhamnolipid und C10-C10-Dirhamnolipid.
Biochemische und biologische Charakterisierung Induktor-haltiger Kulturüberstände unter Verwendung verschiedener Hochleistungsflüssigkeitschromatographiesysteme
Größenausschlußchromatographie
Zur Charakterisierung des Molekulargewichtes der induzierenden Faktoren aus den Bakterienkulturüberständen werden diese durch Größenausschluß-chromatographie (Gelfiltration) unter Verwendung einer „Smart^®-Superdex 75 PC 3.2/50"-Säule (Pharmacia Biotech GmbH, Freiburg) aufgetrennt. Die Säule wird in einem Vorlauf zunächst durch die Verwendung folgender Eichsubstanzen kalibriert (Konzentration jeweils 500 μg/ml, Gesamtauftragsvolumen 25 μl), wobei PBS als Laufpuffer dient:
Flussrate: 80 μl/min
Die Messung der UV-Absorption erfolgt bei Wellenlängen von 215, 254 und 280 nm. Die Bakterienkulturüberstände werden unter identischen Bedingungen chromatographiert.
Die Messung der UV-Absorption erfolgt bei Wellenlängen von 215, 254 und 280 nm. Die Bakterienkulturüberstände werden unter identischen Bedingungen chromatographiert.
1 zeigt, dass eine maximale Eluierung der hBD-2-Induktoren im vorderen Ausschlussvolumen erfolgt. Dies entspricht einer Molekularmasse von mehr als 75 kD. Eine maximale Eluierung der IL-8-induzierenden Faktoren aus Überständen statischer MG-Kulturen wird in Fraktionen registriert, die einer Molekularmasse von ca. 65 kD entspeachen.
Einfluß von Acetonitril auf die Molekulargröße des HBD-2-Induktors
Um den Einfluß von Acetonitril auf die biologische Aktivität der Induktoren zu studieren, wurden 30 kD-Retentate von Kulturüberständen mit unterschiedlichen Anteilen Acetonitril versetzt und diese Mischungen direkt mittels eines 30 kD Filters erneut filtriert. Nach Lyophilisieren wurden Retentat und Filtrat in identischen Volumina H₂O gelöst und hinsichtlich der hBD-2-Induktion in Keratinozyten untersucht. 2 zeigt, dass Acetonitril offensichtlich die molekularen Eigenschaften der hBD-2-induzierenden Faktoren beeinflusst. Es stellte sich heraus, dass bei einer Acetonitril-Konzentration > 30 % nahezu keine hBD-2-Induktoren im Retentat (Molekülgrößen von > 30 kD) nachweisbar sind (ca. 5-fache Induktion). Dagegen fand sich nach der Inkubation der Kulturüberstände der Großteil der induzierenden Faktoren im Filtrat wieder (ca. 130-fache hBD-2-Induktion). Bei einer Konzentration von > 40 % Acetonitril nahmen dann jedoch auch die Konzentration hBD-2-induzierender Faktoren im Filtrat ab (ca. 50-fache Induktion). Es zeigt sich bei Untersuchungen der IL-8-induzierenden Faktoren durch diese Fraktionen, dass die Expression mit steigendem Acetonitrilgehalt im Überstand von einer ca. 30-fachen Induktion (10 % ACN) auf eine ca. 10-fache absinkt (> 40 % ACN). Es ist jedoch keine Erhöhung der IL-8-Induktion durch die entsprechenden Fraktionen des Filtrats festzustellen (zwischen 5 und 10-facher Induktion).
Anionenaustauschchromatographie
Um zu klären, ob die hBD-2-induzierenden Faktoren aus kationischen bzw. anionischen Komponenten bestehen, werden 30 kD-Retentate von P. aeruginosa-Überständen mittels eines Anionenaustauschers chromatographiert und HaCaT-Keratinozyten mit den resultierenden Fraktionen für 20 Std. inkubiert. Zur präparativen Analyse wird eine ResourceQ-Säule (Pharmacia, Freiburg) an einer Spectra-Physics-Anlage (Thermo Separation Products, Darmstadt) mit einer 2 ml Probenschleife (Macherey & Nagel, Düren), einer HPLC-Pumpe P 4000 (Spectra Physics, Darmstadt) sowie mit einem UV-Detektor Spectroflow 773 (Kratos, Karlsruhe) eingesetzt. Die Fraktionierung der aufgearbeiteten Überstände kann manuell nach der Absorption bei 280 nm unter folgenden Bedingungen erfolgen:
ResourceQ:
Puffer A: 20 mM Tris-H₂O, pH 8,0
Puffer B: 20 mM Tris-H₂O mit 1 M NaCl, pH 8,0
3 zeigt, dass ein Teil der hBD-2-Induktoren im Durchlauf (DL) der Anionenaustauschchromatographie zu finden ist. Weitere hBD-2-induzierende Faktoren lassen sich von dieser Säule mit 0,25 M NaCl (Retentionszeit 11 min) eluieren. Überraschenderweise werden hBD-3-, Psoriasin- und RNase-7-induzierende Faktoren in identischen HPLC-Fraktionen gefunden. Ein weiterer Induktor dieser AP – mit geringerer Amplitude – findet sich in Fraktionen, die zwischen 16–18 min eluiert werden. Durch Inkubation von Keratinozyten mit diesen Fraktionen kann eine 100-fache hBD-2-, 5-fache hBD-3-, 25-fache Psoriasin- und eine 5-fache RNase-7-Induktion nachgewiesen werden. Es zeigt sich, dass die Amplitude der Induktion verschiedener Zytokine nach 20-ständiger Stimulation generell geringer ausfällt (max. 35-fach) als die der Induktion der untersuchten AP (max. 1700-fach).
Einfluß von Rhamnolipid-Lösungen auf die Acetonitril-Präzipitat-abhängige Induktion
4 zeigt, dass bei hohen Verdünnungen des Induktors die induzierende Aktivität abnahm, aber überraschenderweise durch Zugabe von Lösungen der Präzipitate säurebehandelter Kulturüberstände erheblich gesteigert werden konnten.
Da Präzipitate aus Säure-behandelten Kulturüberständen nach eigenen massenspektrometrischen Untersuchungen und nach Untersuchungen anderer Arbeitsgruppen große Mengen an Rhamnolipiden (vorwiegend Monorhamnolipid (C10C10) und Dirhamnolipid (C10C12)) enthalten, wurde vermutet, dass diese für die hBD-2-Induktion in Keratinozyten von Bedeutung sein könnten. Es wurde daher untersucht, ob Rhamnolipide einen Einfluss auf die hBD-2-Induktion in Keratinozyten durch Kulturüberstände besitzen. Zu diesem Zweck wurden P. aeruginosa Kulturüberstände mit 30 % Acetonitril versetzt, die resultierenden Präzipitate in H₂O gelöst und mit verschiedenen Konzentrationen einer Rhamnolipid-Präparation (JBR 515, Jeneil Biosurfactant) bestehend aus Monorhamnolipid (C10C10) und Dirhamnolipid (C10C12) versetzt. Anschließend wurden HaCaT-Keratinozyten mit diesen Ansätzen inkubiert.
5 zeigt, dass Präzipitate Acetonitril-behandelter Überstände ohne Rhamnolipid-Zugabe eine maximal 50-fache hBD2-Induktion in Keratinozyten bewirken. Werden die gelösten Präzipitate Acetonitril-behandelter P. aeruginosa-Kulturüberstände jedoch mit einer 0.001 prozentigen Rhamnolipid-Lösung versetzt, so läßt sich die hBD-2-Expression bis zu 400-fach steigern.
Bei einer Anionenaustauschchromatographie gelöster Induktor-haltiger Präzipitate lassen sich hBD-2-induzierende Eigenschaften in HPLC-Fraktionen besonders gut bei Anwesenheit von Rhamnolipid (0,1 μl/ml Rhamnolipidlösung; Präparation JBL 515) nachweisen.
6 zeigt, dass die Fraktionen bei Abwesenheit von Rhamnolipid keine oder nur eine sehr geringe hBD-2-Induktion in Keratinozyten bewirken (max. 3-fach). Werden die Keratinozyten jedoch mit den entsprechenden Fraktionen in Anwesenheit von 0,1 μl/ml Rhamnolipidlösung inkubiert, so ergibt sich durch einzelne Fraktionen eine bis zu 20-fache Induktion von hBD-2 in Keratinozyten. Ein Vergleich der Retentionszeiten mit denen der hBD-2-induzierenden Faktoren aus 30 kD-Retentaten zeigt zudem, dass in beiden experimentellen Ansätzen identische Retentionszeiten der hBD-2-Induktoren nach 11 min bzw. im Bereich 16–18 min vorliegen.
Reversed Phase Chromatographie
Zur Untersuchung der Hydrophobizität der HBD-2-induzierenden Faktoren können verschiedene Reversed-Phase-Chromatographien durchgeführt werden. Dabei hat sich sowohl die Auftrennung an einer C2/C18-Säule (Pharmacia, Freiburg) mit Hilfe des Smart-Systems als auch die Trennung an einer Aqua C-18-Säule (Phenomenex, Aschaffenburg) unter folgenden Bedingungen bewährt:
Um das Acetonitril in den gesammelten Fraktionen zu entfernen, werden die Proben im Lyophilisator in Anwesenheit von 0,1 % BSA gefriergetrocknet. Anschließend werden die Fraktionen zur Inkubation von Epithelzellen verwendet.
Fraktionen der HPLC-Läufe, die induzierende Faktoren enthalten, werden unter Verwendung weiterer HPLC-Trennverfahren aufgereinigt.
Semiquantitative RT-PCR
RNA-Isolierung
Aus den kultivierten Keratinozyten wird die Gesamt-RNA mittels „TRIzol^TM"-Reagenz (Gibco BRL, Eggenstein) gemäß den Angaben des Herstellers isoliert.
Zuerst wird dazu das Inkubationsmedium entfernt und die Zellen zweimal mit PBS-Puffer gewaschen. Anschließend wird pro Loch einer 6-Loch-Platte 1 ml der „TRIzol^TM"-Lösung verwendet. Das Ablösen und die Lyse der Zellen werden durch wiederholtes Auf- und Abziehen mit einer Pipette unterstützt. Zu jeweils 1 ml dieses Zell-Lysats wird nach einer 5-minütigen Inkubationszeit bei Raumtemperatur 200 μl Chloroform gegeben und für ca. 15 Sekunden gemischt. Die für 2–3 min inkubierten Proben werden dann für 15 min bei 12000 g und 4 C zentrifugiert. Die entstandene obere, wässrige Phase (ca. 600 μl) wird nun von der unteren Chloroform-Phenol-Phase und der Interphase (mit Proteinen und anderen Zellbestandteilen) getrennt und in einem neuen Reaktionsgefäß mit 500 μl Isopropanol versetzt. Nach einer 10 minütigen Inkubation bei Raumtemperatur erfolgt die Präzipitation der RNA durch Zentrifugation bei 12000 × g für 10 min bei 4°C. Nachdem der Überstand entfernt worden ist, wird das RNA-Präzipitat mit 1 ml 70 % Ethanol gewaschen und erneut zentrifugiert (7500 × g für 5 min bei 4 C). Das so entstandene RNA-Präzipitat kann in 25 μl 25%-Formamid-H₂O gelöst und bis zur weiteren Verwendung bei –20°C verwahrt werden.
Reverse Transkription von RNA (cDNA-Synthese)
Zur weiteren Analyse und zum Schutz der RNA vor Degradation wurde die aus Zellen isolierte RNA in cDNA umgeschrieben. Bei diesem Prozeß der reversen Transkription wird die Eigenschaft des Enzyms Reverse Transkriptase genutzt. Dieses synthetisiert mittels einer RNA-Vorlage die komplementäre DNA (cDNA). Für einen Reaktionsansatz wurden 2 μg Gesamt-RNA und 2,5 μl Oligo(dT)-Primer (20 μM) mit DEPC-H₂O auf ein Volumen von 12 μl gebracht. Dieser Ansatz wurde für 10 min in einem Thermoblock auf 70 C erhitzt, um die Sekundärstruktur der RNA aufzuheben, und sofort auf Eis gestellt. Hinzugefügt wurden:

– 4 μl 5× Reaktionspuffer
– 2 μl 0,1 M DTT
– 1 μl dNTPs (10 mM)
– 1 μl Reverse Transkriptase (Superscript II)

Die reverse Transkription erfolgte für 1 Std. bei 42 C (Anhybridisierung der Oligo(dT)-Primer und Synthese der cDNA). Anschließend wurde die Lösung zur Inaktivierung des Enzyms für 5 min auf 90 C erhitzt. Die so gewonnene cDNA wurde bei –20°C bis zur weiteren Verwendung gelagert, nachdem die Probe mit 180 μl H₂O auf 200 μl Gesamtvolumen gebracht wurde.
Reverse-Transkription-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR)
Die Kombination von reverser Transkription und Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR) ermöglicht es, die Genexpression auf mRNA-Ebene zu untersuchen. Dabei können auch mRNA-Moleküle nachgewiesen werden, die nur in geringer Konzentration in der Zelle vorkommen.
Nachdem die mRNA mittels einer reversen Transkriptase in komplementäre DNA (cDNA) umgeschrieben worden war, wurde diese in einer PCR-Analyse mit zwei genspezifischen Primern (GSP 1 und GSP 2) amplifiziert. Es wurden Intron-überspannende Primer eingesetzt, um cDNA verlässlich von genomischer DNA unterscheiden zu können. Zur Ermittlung eines internen Standards wurden die Primer GA1neu und GA2 verwendet. Sie amplifizieren ein spezifisches, 360 Bp großes Fragment der Glycerinaldehyd-3-Phosphat-Dehydrogenase (GAPDH), die in Epithelzellen konstant exprimiert wird. Die PCR-Reaktionen erfolgten dabei unter Verwendung eines Realtime-Cyclers der Firma Roche (Light Cycler). Dabei wurden 10 ng cDNA in folgendem Reaktionsansatz verwendet: 5,8 μl H₂O
1,2 μl MgCl₂
1 μl Enzymlösung
je 0,5 μl der gen-spezifischen
Primer (10 μM)
Anschließend konnten mittels zuvor erstellter Standardkurven für die jeweiligen Gene genaue Angaben zu der entsprechenden relativen mRNA Expression gemacht werden.
Oligonukleotide
Die in der Reverse-Transkription-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR) verwendeten synthetischen Oligonukleotide wurden von der Firma Sigma und der MWG Biotech AG in lyophilisiertem Zustand bezogen. Durch Lösen in RNAse-freiem Wasser wurden sie auf eine Stammkonzentration von 100 μM gebracht und bis zur weiteren Verwendung bei –20°C gelagert.
Tabelle 1: Liste der verwendeten synthetischen Oligonukleotide (Primer) und ihre Nukleotidsequenzen (5' ⇒ 3') sowie die dazugehörigen Oligonukleotidprodukte.
Die Figuren zeigen:
1: HBD-2-, IL-8- und TNFα-Induktoren in den Überständen von P. aeruginosa besitzen unterschiedliche molekulare Eigenschaften: P. aeruginosa Kulturüberstände (ATCC 33358, MG-Medium, statische Bedingungen) wurden unter Verwendung einer Größenausschlußchromatographiesäule (Superdex 75) mit PBS als Laufpuffer fraktioniert (V∞ = vorderes Ausschlussvolumen, V = hinteres Ausschlussvolumen). Anschließend wurden HaCaT-Keratinozyten mit den Fraktionen für 20 Std. inkubiert und die mRNA Expression für hBD-2 (A), IL-8 (B) und TNFα (C) ermittelt. Dargestellt ist das repräsentative Ergebnis von 3 unabhängig durchgeführten Versuchen.
2: HBD-2- und IL-8-induzierende Faktoren in den Retentaten und Filtraten (30 kD Filter) von P. aeruginosa Kulturüberständen in Anwesenheit unterschiedlicher Anteile Acetonitril: HaCaT-Keratinozyten wurden für 20 Std. mit den von Acetonitril befreiten Retentaten bzw. Filtraten von Kulturüberständen inkubiert, die in Anwesenheit verschiedener Anteile Acetonitril mittels eines 30 kD-Filters fraktioniert wurden, inkubiert. Anschließend wurde die hBD-2-(A) und IL-8- (B) mRNA Expression quantitativ bestimmt. Das dargestellte Ergebnis ist repräsentativ für 3 voneinander unabhängig durchgeführte Versuche.
3: Induktion verschiedener antimikrobieller Proteine (AP) durch Fraktionen einer Anionenaustauschchromatographie von P. aeruginosa-Überständen: P. aeruginosa Kulturüberstände (30 kD-Retentate; ATCC 33358, MG-Medium, statische Kulturen) wurden mittels eines Gradienten ansteigender NaCl-Konzentration an einem Ionenaustauscher (ResourceQ) getrennt. HaCaT-Kulturen wurden mit den Fraktionen für 20 Std. inkubiert und die mRNA Expression von hBD-2 (A), hBD-3 (B), RNase-7 (C) und Psoriasin (D) quantitativ ermittelt. Die grauen Säulen repräsentieren die jeweilige relative mRNA Expression (DL = nicht gebundene Substanzen). Die durchgehende Linie stellt den Extinktionsverlauf der aufgetrennten Probe bei 280 nm dar. Die gestrichelte Linie steht für den Gradienten des Elutionspuffers. Die Abbildung stellt ein charakteristisches Ergebnis von 3 voneinander unabhängigen Versuchen dar.
4 Die Induktion der AP hBD-2 und Elafin sowie der PZ IL-8 und TNFα durch Acetonitril-behandelte bzw. Säure-behandelte Kulturüberstände von P. aeruginosa: HaCaT-Kulturen wurden für 20 Std. mit den Acetonitril- (ACN) bzw. Säure-behandelten (pH3) Kulturüberständen (30 kD Retentate, ATCC 33358, MG-Medium statische Kultur) und den jeweiligen gelösten Präzipitaten inkubiert und die mRNA Expression von hBD-2 (A), IL-8 (B), Elafin (C) und TNFα (D) quantitativ bestimmt. Die Präzipitate wurden in einem dem ursprünglichen Überstandsvolumen entsprechenden Volumen H₂O gelöst. Dargestellt ist das typische Ergebnis von 3 unabhängig durchgeführten Versuchen.
5: HBD-2-Induktion in HaCaT-Keratinozyten durch Präzipitate Acetonitril-behandelter P. aeruginosa Kulturüberstände und durch Rhamnolipidpräparationen: HaCaT-Kulturen wurden für 6 Std. mit verschiedenen Konzentrationen gelöster Acetonitril-(ACN) Präzipitate von P. aeruginosa-Überständen (ATCC 33358, MG-Medium, statische Kultur) und einer Rhamnolipid-Präparation (RL-Präp., JBR 515; Stammkonzentration 0,1 μl/ml) inkubiert und die hBD-2 mRNA Expression quantitativ ermittelt. Das dargestellte Resultat ist charakteristisch für die Ergebnisse aus 4 unabhängig voneinander durchgeführten Experimenten.
6: HBD-2-Induktion in Keratinozyten durch Fraktionen einer Ionenaustauschchromatographie von Acetonitril-Präzipitaten aus P. aeruginosa Kulturüberständen: HaCaT-Keratinozyten wurden für 20 Std. mit den Fraktionen einer Ionenaustauschchromatographie inkubiert und die hBD-2 mRNA Expression quantitativ bestimmt. Die Fraktionen wurden entweder ohne oder in Anwesenheit von 0,1 μl/ml Rhamnolipidlösung (= RL; Präparation JBR 515, Jeneil Biosurfactant) inkubiert. Die Kulturüberstände stammten von ATCC 33358 (MG-Medium, statische Bedingungen). Dargestellt ist das typische Ergebnis von 3 unabhängig durchgeführten Versuchen.
7: HBD-2-Induktion in HaCaT-Keratinozyten durch Fraktionen einer Reversed-Phase-Chromatographie von 30 kD Retentaten aus P. aeruginosa-Überständen: HaCaT-Keratinozyten wurden für 20 Std. mit den Fraktionen einer Reversed-Phase-Chromatographie inkubiert und die hBD-2-mRNA Expression quantitativ bestimmt. Chromatographiert wurden 30 kD-Retentate von MG-Kulturüberständen (ATCC 33358, statische Bedingungen) an einer Aqua C-18-Säule mittels eines Wasser-Acetonitril-Gradienten (pH 3,0). Die Fraktionen wurden vor der Inkubation der Keratinozyten durch Gefriertrocknung von Acetonitril befreit und mit 0,1 μl/ml Rhamnolipid (JBR 515) versetzt. Dargestellt ist das repräsentative Ergebnis von 3 voneinander unabhängig durchgeführten Versuchen.

Claims

Lipoider Wirkstoff, gewonnen aus gramnegativen Bakterien, der in eukaryotischen Zellen die Synthese antimikrobell wirkender Peptide und/oder Proteine induziert, wobei der Wirkstoff in Alkali löslich ist und in wässriger Lösung eine Molekularmasse > 300 kD und nach Versetzen mit Acetonitril < 3 kD hat.
Lipoider Wirkstoff, gewonnen aus gramnegativen Bakterien, der in eukaryotischen Zellen die Synthese antimikrobell wirkender Peptide und/oder Proteine induziert, der in der ESI-MS-Analyse in Isopropanol/Wasser/Ammoniak mit Ammonium-Acetat im positiven Modus Signale bei m/z 882 und/oder 903 und/oder 937 und/oder 1000 und/oder 1071 und/oder 1154 und/oder 1250 und/oder 1363 oder Signale bei anderen m/z im Bereich zwischen m/z 700 und 1800 Masse-Einheiten, jeweils +/– 3 Dalton, zeigt.
Lipoider Wirkstoff, gewonnen aus gramnegativen Bakterien, der in eukaryotischen Zellen die Synthese antimikrobell wirkender Peptide und/oder Proteine induziert, der die Fettsäuren Octansäure (C8:0) und/oder Caprinsäure (C10:0) und/oder 3-OH-C10 und/oder Laurinsäure (C12:0) und/oder 2-OH-C12:0 und/oder 3-OH-12:0 und/oder Myristinsäure (C14:0) und/oder 2-OH-C14:0 und/oder 3-OH-14:0 sowie die Zuckerkomponenten Glucosamin und/oder FucNAc (in der O-Kette), Hexosen, 6-Desoxyhexosen und Ketodeoxysäuren mit den Substituenten R1 bis R5 in einer der nachfolgenden Strukturen angegebenen Weise:
wobei R₁: die Fettsäuren 2-OH-C14:0, 3-OH-C14:0, 2-OH-C12:0, 3-OH-C12:0, 2-OH-C:10, 3-OH-C10:0, C10:0, C12:0, C14:0 sowie Ester der Hydroxy-Fettsäuren, vorzugsweise mit C8:0, C10:0, C12:0, C14:0, C16:0 und den 2-OH- sowie 3-OH-Derivaten, R₂: die Fettsäuren 2-OH-, 3-OH-C14:0, 2-OH-, 3-OH-C12:0, 2-OH-, 3-OH-C10:0, C10:0, C12:0, C14:0 sowie Ester der Hydroxy-Fettsäuren, vorzugsweise mit C8:0, C10:0, C12:0, C14:0, C16:0 und den 2-OH- sowie 3-OH-Derivaten, R₃: KDO, KDO-KDO, KDO-KDO-FucNAc, KDO-KDO-Hexose, R₄: die Fettsäuren 2-OH-, 3-OH-C14:0, 2-OH-, 3-OH-C12:0, 2-OH-, 3-OH-C10:0, C10:0, C12:0, C14:0 sowie Ester der Hydroxy-Fettsäuren, vorzugsweise mit C8:0, C10:0, C12:0, C14:0, C16:0 und den 2-OH- sowie 3-OH-Derivaten, R₅: die Fettsäuren 2-OH-, 3-OH-C14:0, 2-OH-, 3-OH-C12:0, 2-OH-, 3-OH-C10:0, C10:0, C12:0, C14:0 sowie Ester der Hydroxy-Fettsäuren, vorzugsweise mit C8:0, C10:0, C12:0, C14:0, C16:0 und den 2-OH- sowie 3-OH-Derivaten und C10:0: Caprinsäure; C12:0 : Laurinsäure; C14:0 : Myristinsäure; KDO : 2-Keto-3-deoxyoctonsäure ist.
Wirkstoff nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet dass er an Anionenaustauscher bindet.
Wirkstoff nach einem der vorangehenden Ansprüche, gekennzeichnet durch eine die Wirksamkeit erhöhende Zugabe von Detergentien, vorzugsweise Rhamnolipiden.
Wirkstoff nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet dass er in Laugen und/oder in Mischungen organischer Lösungsmittel löslich ist.
Verfahren zur Herstellung des Wirkstoffes nach einem der vorangehenden Ansprüche gekennzeichnet durch folgende Schritte: Kultivierung gramnegativer Bakterien unter statischen Kulturbedingungen und/oder Stressbedingungen, Konzentrierung der Bakterienkultur-Überstände durch Ultrafiltration und Anreicherung des Wirkstoffes sowie Abtrennung der entzündungsfördernden Faktoren durch Fällung aus wässrigen Konzentraten.
Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Stressfaktoren Nahrungsmangel, Mangel an essentiellen Elementen, Hitze, Kälte, erhöhte oder sehr niedrige Ionenstärken und/oder pH-Verschiebungen sind.
Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Konzentrierung durch Verwendung eines Ultrafilters mit einem Cut-off > 30 < 300 kD erfolgt
Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Fällung durch Zugabe eines mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittels oder durch Erhöhung der Ionenstärke mit Salzen und/oder pH-Verschiebung erfolgt.
Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass das organische Lösungsmittel Isopropanol, Ethanol oder Methanol ist.
Verwendung des Wirkstoffs nach einem der Ansprüche 1 bis 6, für eine pharmazeutische oder kosmetische Zubereitung.
Verwendung des Wirkstoffs nach einem der Ansprüche 1 bis 6, für eine zum Pflanzenschutz verwendete Zubereitung.