CH641354A5

CH641354A5 - Material mit antitumorwirkung und verfahren zu dessen herstellung.

Info

Publication number: CH641354A5
Application number: CH611479A
Authority: CH
Inventors: Yutaka Sugawara; Akihiro Yamamoto; Mitsuaki Handa; Hiroko Usami; Haruki Ogawa
Original assignee: Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1978-06-29
Filing date: 1979-06-29
Publication date: 1984-02-29
Also published as: JPS557014A; SE449439B; JPS6169B2; GB2025768B; IT1119922B; FR2429594A1; CA1135640A; CS235079B2; SE7905703L; US4242326A; FR2429594B1; GB2025768A; DE2926406A1; IT7968342A0

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Material mit Antitumorwirkung, das aus Zellen von Bakterien extrahiert ist, welche zu den haemolytischen Streptococcen gehören. Des weiteren betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung des Materiales mit Antitumorwirkung.

Es ist bekannt, dass die lebenden Zellen von Bakterien, welche zu den haemolytischen Streptococcen gehören, eine bestimmte Wirksamkeit gegen Krebs besitzen. Da jedoch diese Wirkung sehr unbeständig ist, wurden viele Versuche unternommen, um die Beständigkeit derartiger Materialien zu erhöhen. Es sei in diesem Zusammenhang beispielsweise auf die japanischen Patentveröffentlichungen 6690/68, 8871/ 70,2034/71,2034/71 und 2674/71 hingewiesen, in welchen verschiedene praktisch durchführbare Methoden beschrieben sind, gemäss welchen lebende Zellen von Bakterien in einer Kochsalzlösung suspendiert werden, welche ein Antibiotikum, wie zum Beispiel Penicillin, Cephalosporin, Cyclose-rin oder ähnliche Antibiotika enthalten, und dieses Suspension auf eine Temperatur im Bereich von 37-45 °C erhitzt wird, wobei man dann nach der Zugabe eines geeigneten Stabilisierungsmittels zu dieser Suspension eine Lyophilisie-rung durchführt, um entsprechende trockene Präparate zu erhalten.

Obwohl diese Präparate starke Antitumorwirksamkeiten besitzen, weisen sie bestimmte Eigenschaften auf, die nachteilig für pharmazeutische Präparate sind, indem sie beispielsweise Schmerzen an derjenigen Stelle hervorrufen, wo sie an den Patienten verabreicht werden, entzündliche Eigenschaften besitzen und bei dem Patienten nach der Verabreichung ein vorübergehendes Fieber verursachen.

Anderseits wurden verschiedene Methoden zur Extraktion von Antitumormaterialien aus Zellen von Bakterien, die zu den haemolytischen Streptococcen gehören, untersucht. In der japanischen Patentveröffentlichung Nr. 1647/63 ist ein Verfahren beschrieben, bei dem die Zellen aufgebrochen werden, um das darüber stehende Material zu gewinnen, und bei dem man ein organisches Lösungsmittel zu dem darüber stehenden Material zugibt, und die ausfallenden antibiotischen Substanzen gewinnt. Ausserdem wird in der japanischen Patentveröffentlichung Nr. 43841/73 ein Verfahren beschrieben, bei dem man die Zellen aufbricht oder auflöst, um das darüber stehende Material zu gewinnen, und die aktiven Substanzen in Form einer Fraktion auffangt, welche eine zu 50 bis 80% gesättigte Ammoniumsulfatlösung enthält. Diese Antitumor-Substanzen, die aus den wasserlöslichen Fraktionen gewonnen werden, bestehen hauptsächlich aus Proteinen, und sie sind ausserordentlich unbeständig gegenüber Hitze und besitzen eine wesentlich geringere Antitumorak-tivität als ein Präparat, welches Zellen enthält. Ausserdem besitzen sie stark entzündliche Eigenschaften, und es besteht eine relativ hohe Wahrscheinlichkeit, dass bei ihrer Verabreichung beim Patienten Fieber oder Schmerzen hervorgerufen werden.

Aus der japanischen Patentveröffentlichung Nr. 6096/74 ist ferner ein Verfahren bekannt geworden, bei dem ein Verfahrensschritt durchgeführt wird, indem ein lytisches Enzym auf die Zellen derjenigen Bakterien, die zu den haemolytischen Streptococcen gehören, einwirken gelassen wird, und bei dem eine wasserunlösliche aktive Substanz aus der lysier-ten Lösung gewonnen wird. Diese Art an Substanz enthält im wesentlichen protoplasmische Membran der Zellen, und sie hat ferner im wesentlichen keine entzündlichen Eigenschaften oder keine Fieber hervorrufende Wirkung (pyroge-ne Aktivität) oder Schmerzen hervorrufende Eigenschaften. Die Antitumoraktivität dieser Substanz ist jedoch gegenüber Hitze unbeständig.

Während der Untersuchungen, die zur Entwicklung des erfmdungsgemässen Gegenstandes durchgeführt wurden, stellte es sich heraus, dass Substanzen, die durch eine physikalische Aufbrechung der Zellen derjenigen Bakterien erhalten werden, die zu den haemolytischen Streptococcen gehören, um eine wasserunlösliche Fraktion zu gewinnen, hauptsächlich Komponenten der Zellwände enthält, und dass man dadurch, dass man diese Fraktion mit einer Nu-klease oder Protease behandelt, erreicht, dass diese nur geringe entzündliche Eigenschaften und geringen Schmerz hervorrufende Eigenschaften besitzt, während sie eine starke Antitumorwirksamkeit und eine gute Beständigkeit gegenüber Hitze aufweist. Weitere Studien, die auf diesen Grundlagen durchgeführt wurden, führten dann zur Entwicklung des Erfindungsgegenstandes.

Ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Material mit Antitumorwirksamkeit, das eine gute Beständigkeit gegenüber Hitze und geringe entzündliche Eigenschaften und Schmerz hervorrufende Eigenschaften aufweist.

Ein anderer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung eines derartigen Materiales

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mit Antitumorwirksamkeit, das dadurch gekennzeichnet ist, dass man die Zellen derjenigen Bakterien, die zu den haemolytischen Streptococcen gehören, physikalisch aufbricht, und die wasserunlöslichen Substanzen aus dieser aufgebrochenen Mischung gewinnt, und diese Substanzen dann mit einer De-soxy-ribonuclease, einer Ribonuclease und/oder einer Protease behandelt, und gegebenenfalls dann die angestrebten Substanzen reinigt, indem man das Saccharose-dichte-gradienten-Verfahren anwendet.

Die Erfindung sei nun anhand spezieller Ausführungsarten näher erläutert.

Zellen von Bakterien, die zu den haemolytischen Streptococcen gehören, wie zum Beispiel der Streptococcus pyogenes Su Stamm, der Streptococcus pyogenes C 203 S Stamm, der Streptococcus pyogenes S-43 Stamm, der Streptococcus pyogenes Blackmore Stamm, oder der Streptococcus equisimilis, die durch eine entsprechende Züchtung erhalten werden, werden in einer geeigneten Salzlösung suspendiert, beispielsweise in einer physiologischen Kochsalzlösung oder einer ähnlichen Lösung, oder in destilliertem Wasser, und sie werden dann mit Hilfe physikalischer Mittel aufgebrochen. Als Beispiel für anwendbare physikalische Mittel sei die Verwendung eines Beschallungsgerätes (Ultraschall), die Verwendung eines Zellenhomogenisators von Braun oder eines ähnlichen Mittels, oder auch das Zermah-len der Zellen in Anwesenheit von pulverförmigem Aluminiumoxyd in einem Mörser erwähnt. Die Suspension der aufgebrochenen Zellen wird zuerst bei niedrigen Umdrehungsgeschwindigkeiten zentrifugiert, um die nicht aufgebrochenen Zellen in Form eines Niederschlages zu entfernen, und dann wird das darüber stehende Material nochmals mit hohen Umdrehungsgeschwindigkeiten zentrifugiert. Der dabei erhaltene Niederschlag wird dann gewonnen und mit einer geeigneten Salzlösung, beispielsweise Kochsalzlösung, oder destilliertem Wasser gewaschen und mit einer Protease behandelt, und dann wieder mit einer geeigneten Salzlösung, beispielsweise Kochsalzlösung, oder destilliertem Wasser gewaschen. Als Beispiele für verwendbare Proteasen seien Proteinase, Trypsin, Pepsin, Nagarase oder ähnliche Proteasen genannt.

Das so erhaltene Material enthält Bestandteile der Zellwand, welche als Antitumorpräparat verwendet werden können, indem man sie in einem geeigneten Medium suspendiert. Das Material kann jedoch reiner gemacht werden, indem man es mit einer Desoxy-ribonuclease und einer Ribonuclease behandelt, und gegebenenfalls kann eine weitere Reinigung des so behandelten Materials durchgeführt werden, indem man das Saccharose-dichtegradienten-Verfahren anwendet.

Die beim erfindungsgemässen Verfahren durchgeführte Behandlung mit einer Nuclease oder einer Protease wird wünschenswerterweise unter denjenigen Bedingungen durchgeführt, die für das jeweilige verwendete System optimale Bedingungen sind. Beispielsweise kann die Behandlung durchgeführt werden, indem man das Substrat und das Enzym in einem geeigneten Puffer suspendiert, beispielsweise in einem Phosphatpuffer oder in einem Glycerin-chlorwasser-stoffsäure-puffer, um den pH-Wert auf denjenigen pH einzustellen, der für das fragliche Enzym optimal geeignet ist, und die Behandlung bei einer Temperatur etwa um 37 °C herum während einer Zeitspanne durchführt, die von mehreren Stunden bis ein Mehrfaches von 10 Stunden reicht.

Das Material mit Antitumorwirkung, das nach dem erfindungsgemässen Verfahren erhalten wird, beispielsweise nach demjenigen Verfahren, das in Beispiel 1 beschrieben ist, ist ein gräulich-weisses Pulver, und es liefert bei der Elementaranalyse die folgenden Ergebnisse:

N = 7,31%; C = 42,97%; und H = 5,64%.

Das Ultraviolett-absorptionsspektrum wurde in Suspension in physiologischer Kochsalzlösung bestimmt, und dieses ist in Fig. 1 dargestellt.

Das Infrarot-absorptionsspektrum dieses Materiales mit Antitumorwirksamkeit, aufgenommen in KBr, ist in Fig. 2 dargestellt.

Man nimmt an, dass das erfindungsgemässe Material mit Antitumorwirksamkeit ein Protein ist, welches mit Polysacchariden kombiniert oder verbunden ist, wobei diese Polysaccharide Rhamnose, Hexosamin und andere derartige Materialien enthalten.

Die Ergebnisse der chemischen Analysen des Materiales mit Antitumorwirksamkeit sind in der folgenden Tabelle 1 zusammengestellt:

Tabelle 1

Bestandteil Gehalt in Gew.-%

Rhamnose 33,3

Hexosamin 12,7

Protein 16,7

Gesamtlipoid 0,2

Ribonucleinsäure (RNA) 0

Desoxy-ribonucleinsäure (DNA) 0

Der in der Tabelle 1 angegebene Gehalt an Rhamnose wurde nach dem Verfahren von Gibbon bestimmt.

Der Gehalt an Hexosamin wurde nach dem Elson-Mor-gan-Verfahren bestimmt.

Der Proteingehalt wurde nach dem Verfahren von Laury bestimmt.

Der Gehalt an Gesamtlipoid wurde nach einem Verfahren bestimmt, bei dem eine Extraktion mit einer Mischung aus Chloroform + Methanol im Verhältnis 3 : 1 durchgeführt wurde, der Extrakt getrocknet und das Trockengewicht bestimmt wurde.

Der Gehalt an Ribonucleinsäure wurde mit Hilfe der Or-cinol-reaktion bestimmt.

Der Gehalt an Desoxy-ribonucleinsäure wurde mit Hilfe der Indol-reaktion bestimmt.

Obwohl das erfindungsgemässe Material mit Antitumorwirkung gegenüber Hitze beständig ist, und lange Zeiten in Form einer Suspension gelagert werden kann, kann dieses erfindungsgemässe Material im Gegensatz zu einem Präparat, das die Zellen der haemolytischen Streptococcen enthält, in einem geeigneten Medium suspendiert und dann lyophilisiert werden.

Die Erfindung sei anhand der folgenden Versuche und Beispiele näher erläutert, die spezielle Ausführungsarten der Erfindung näher veranschaulichen sollen.

Versuch 1

Sarkom 180 Tumorzellen wurden subkutan in die Leistengegend von männlichen ICR-Mäusen injiziert, welche 4 Wochen alt waren, und zwar in einer Menge von 3 x 10® Zellen pro Maus. 24 Stunden nach der Einimpfung wurde jeder Maus durch subkutane Injektion in den Bauch jeden Tag während 4 Tagen das erfindungsgemässe Antitumor-präpa-rat verabreicht, bzw. ein erfindungsgemässes Präparat, welches 30 Minuten auf 90 °C erhitzt worden war, bzw. ein Präparat welches als OK-432-Präparat bezeichnet wird, und welches als positiver Vergleichsversuch dient.

Das Präparat OK-432 wurde hergestellt, indem man die Zellen des Streptococcus pyogenes Su-Stammes mit Penicillin behandelte und lyophilisierte. 14 Tage nach dem Einimpfen der Tumorzellen wurde der gewachsene Tumor jeder Maus herausgeschnitten und gewogen.

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Zu Vergleichszwecken wurde physiologische Kochsalzlösung anstelle der oben angegebenen Präparate verwendet.

Die bei diesen Versuchen erzielten Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle 2 zusammengestellt.

Tabelle 2

Art des Präparates

Dosierung* in ng/Maus

Anzahl der getesteten Tiere (Köpfe)

Durchschn. Gewicht des Tumors in mg

Prozentuelle Unterdrückung

Präparat gem. Beispiel 1 Präparat gem. Beispiel 2 Präparat gem. Beispiel 3 Präparat gem. Beispiel 4 Hitzebehandeltes Präparat gem. Beispiel 1 (etwa 30 Min, bei 90 °C)

Präparat OK-432 Physiologische Kochsalzlösung

3.6 3,2 3,0

2.7

3,6 50,0

10 10 10 10

10 10

10

567 613 658 635

600 554

1076

47,3 43,1 38,9 41,0

44,2 48,5

* Die Dosierung die für jedes Präparat angewandt wurde entspricht einer Menge die aus 50 [ig trockenen Zellen hergestellt wurde.

Aus den in der Tabelle 2 angegebenen Resultaten sieht man deutlich, dass die Antitumorwirksamkeit der erfin-dungsgemässen Präparate fast äquivalent derjenigen des Präparates OK-432 war, und dass die erfindungsgemässen Präparate hitzebeständig sind.

Versuch 2

Mastocytom P-815 Tumorzellen wurden subkutan in die Leistengegend von 5 Wochen alten männlichen BDF^Mäu-sen injiziert, wobei pro Testgruppe 10 Mäuse verwendet wurden und 2,5 x 104 Zellen pro Maus eingeimpft wurden.

24 Stunden nach diesem Einimpfen wurde an jede Maus jeden Tag während eines Zeitraumes von 4 Tagen das An-titumor-präparat, das nach dem Verfahren gemäss Beispiel 1

erhalten wurde, bzw. das Präparat OK-432, intravenös ver-25 abreicht. Die Veränderung der Dimension des Tumors in Abhängigkeit von der verstrichenen Zeit wurde durch Messungen über die Haut bestimmt, und die Ergebnisse werden als Wurzelprodukt des aus längstem und kürzestem Durchmesser angegeben, also als

30

y längster Durchmesser x kürzester Durchmesser

Zu Vergleichszwecken wurde an eine Gruppe von Mäusen physiologische Kochsalzlösung anstelle der angegebenen 35 Präparate verabreicht.

Die bei diesem Versuch erzielten Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle 3 zusammengestellt.

Tabelle 3

Art des Präparates

Dosierung in (ig/Maus

Dimension des Tumors

15 Tage danach 23 Tage danach

Durchschnitt Unter- Durchschnitt Unter-

+ S. F. drückung in % ± S. F. drückung in %

Präparat gem. Beispiel 1

Präparat OK-432

Physiologische

Kochsalzlösung

14,4*

7 9*#

100*

4,0+3,7 4,4 ±2,5 2,6+2,5 6,8+0,3

41 35 62

6,9 + 5,1 4,7 ±4,1 5,0+3,3 12,3+2,7

44 61 59

* Die angewandte Dosierung entspricht einer Menge die aus 200 ng trockenen Zellen hergestellt wurde.

** Die angewandte Dosierung entspricht einer Menge die aus lOOjig trockenen Zellen hergestellt wurde.

***S.F. bedeutet Standardfehler.

Aus den in der Tabelle 3 angegebenen Resultaten sieht man deutlich, dass das nach dem Verfahren gemäss Beispiel 1 hergestellte Präparat auch eine deutliche Antitumorwirksamkeit gegen den P-815 Tumor zeigte.

Versuch 3

Bei diesem Versuch wurde die starke Wirkung des erfindungsgemässen Antitumor-präparates zur Verstärkung der Einführung einer Immunität gegen die Leukämie L1210-Zel-len der Maus bestätigt. Eine Suspension von Maus-Leukä-mie-L1210-Zellen, die 6 x 107 Zellen pro ml enthielt, wurde mit einem äquivalenten Volumen an einer 8 millimolaren Natriumjodacetatlösung vermischt, und man liess die Mischung bei 37 °C während 20 Minuten stehen, wobei man die 60 vorbehandelten Zellen erhielt, die in der Folge als «IA-L1210» bezeichnet werden.

8 Wochen alte weibliche BDF^Mäuse wurden in zwei Gruppen zu je 5 Tieren aufgeteilt und an sie wurden durch subkutane Injektion die IA-L1210 Zellen in einer Menge 65 von 5 x 10e Zellen pro Maus verabreicht (erste Sensibilisierung), und dann erfolgte 10 Tage nach der ersten Sensibilisierung eine Wiederholung dieser Injektion (zusätzliche Sensibilisierung).

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An die Testgruppe der Mäuse wurde subkutan das erfindungsgemässe Präparat oder im Falle des positiven Vergleichsversuches das Präparat mit der Bezeichnung OK-432 verabreicht, und zwar erfolgte die Verabreichung dieser Präparate zweimal zu den gleichen Zeitpunkten wie die erste Sensibilisierung und die zusätzliche Sensibilisierung.

5 Tage nach der zusätzlichen Sensibilisierung wurden native L1210-Zellen subkutan eingeimpft, wobei an die diesem Test unterworfenen Mäuse die Zellen in einer Menge von

104 Zellen pro Maus eingeimpft wurden. Dann wurde beobachtet wieviel Prozent der Mäuse überlebten.

Zu Vergleichszwecken wurde an eine Gruppe der Mäuse nur die Zellen IA-L1210 verabreicht, und eine weitere Grup-5 pe an Mäuse wurde zu Vergleichszwecken nicht sensibilisiert.

Die bei diesem Test erzielten Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle 4 zusammengestellt.

Tabelle 4

Sensibilisierung Art des Präparates Mittlere Über- ILS* Anzahl der überlebenden Tiere

(2mal) (Gesamtdosierung in jxg lebenszeit in Tagen (%) 40 Tage nach der Einimpfung von L1210

pro Maus, 2 mal)

IA-L1210

Präparat gem. Beispiel 1 (7,2)

38,8

62

4

Präparat gem. Beispiel 1

37,4

56

4

(7,2)

OK-432 (100)

37,6

57

4

-

25,4

6

1

-

24,0

-

0

*ILS x 100

In dieser Formel bedeutet:

T = Mittelwert für die Überlebenstage der Gruppe der behandelten Mäuse. C= Mittelwert der Überlebenstage für die Gruppe der unbehandelten Mäuse.

Versuch 4

Das nach dem erfindungsgemässen Verfahren erhaltene Antitumor-präparat verminderte wesentlich die Schmerz hervorrufenden Eigenschaften und die entzündenden Eigenschaften im Vergleich mit dem Präparat OK-432.

An 5 Wochen alte männliche ICR-Mäuse, und zwar 10 Mäuse pro Gruppe, wurde das erfindungsgemässe Präparat intraperitoneal verabreicht, und zwar in einer Dosierung von 25 ng pro Maus. Während der 60 Minuten nach der Verabreichung wurde keine abnormale Bewegung beobachtet. Im Gegensatz dazu zeigten die Mäuse, an die das Präparat OK-432 in einer Dosierung von 100 Hg pro Maus auf der Basis des Gewichtes der trockenen Zellen verabreicht worden war, verschiedene Niveaus des sogenannten Verwin-dungs-syndroms, wobei sie insbesondere den Körper verdrehten oder die Hinterbeine ausstrecken, und dieses Ver-windungs-syndrom wird durch Schmerzen hervorgerufen.

Anderseits wurde an 5 Wochen alte männliche ICR-Mäuse, und zwar 5 Mäuse pro Gruppe, durch intrakutane Injektion in den Rücken das erfindungsgemässe Antitumor-präparat in einer Dosierung von 25 Hg pro Maus verabreicht, bzw. das Präparat OK-432 in einer Dosierung von 100 Hg pro Maus, jeweils bezogen auf das Gewicht der trok-kenen Zellen.

3 Stunden nach der Injektion wurde in die Schwanzvene jeder Maus 0,5prozentige Lösung des blauen Farbstoffes «Evans blue» injiziert. 30 Minuten nach der Injektion des Farbstoffes wurden die Mäuse getötet, und die Haut an derjenigen Stelle des Rückens wo die Injektion verabreicht wurde, wurde abgezogen und das Austreten des Farbstoffes in diesem Teil der Haut wurde beobachtet. Die dabei erzielten Ergebnisse werden in der folgenden Tabelle 5 zusammengestellt.

Tabelle 5

Art des Präparates

Dosierung in Hg pro Maus

FAL. GES.

Präparat gem. Beispiel 1 Präparat gem. Beispiel 2 Präparat gem. Beispiel 3 Präparat gem. Beispiel 4 45 Präparat OK-432

25 25 25 25 100

0/5 0/5 0/5 0/5 5/5

In der Tabelle 5 bedeutet der Ausdruck: FAL. Anzahl der Tiere mit Farbstoffauslaugung

GES.

Gesamtzahl der getesteten Tiere

Aus den Ergebnissen der Tabelle 5 sieht man deutlich, ss dass die Farbstoffauslaugung bei den Mäusen, an die das Präparat OK-432 verabreicht wurde positiv war, während keine Maus an die das erfindungsgemässe Antitumor-präparat verabreicht wurde eine derartige Farbstoffauslaugung zeigte. Diese Ergebnisse bestätigen, dass die entzündlichen 60 Eigenschaften des erfindungsgemässen Präparates ausgesprochen gering sind.

Beispiel 1

Der Streptococcus pyogenes Su-Stamm, der bei der 65 American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, USA, im Februar 1967 mit der Hinterlegungsnummer ATCC 21060 hinterlegt wurde, wurde in 1500 ml Bouillonmedium eingeimpft, und man züch-

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tete 20 Stunden lang. Die gesamte Zuchtbrühe wurde dann in 30 Liter eines 3prozentigen Hefe-extrakt-mediums eingeimpft, und man züchtete ohne Bewegung, also statisch, während 20 Stunden bei 37 °C. Das 3prozentige Hefe-ex-trakt-medium war hergestellt worden, indem man Hefe-ex-trakt in Wasser auflöste, den pH-Wert unter Verwendung einer wässrigen Natriumhydroxidlösung auf 7,4 einstellte, und die Lösung 1 Stunde lang auf 100 °C erhitzte, anschliessend dann kühlte und den dabei gebildeten Niederschlag durch Filtrieren entfernte, und schliesslich das Filtrat einer Sterilisierung unterwarf, indem man es einer Behandlung mit Dampf von 120°C unter einem Druck von 1 kg/cm2 während 10 Minuten unterwarf.

Nach der oben angegebenen Züchtungszeit wurde die Zuchtbrühe mit Eis gekühlt und die Zellen in der Brühe wurden durch Zentrifugieren unter Kühlen gewonnen, man wusch sie zweimal mit kalter physiologischer Kochsalzlösung und suspendierte sie dann in einem Medium mit der Bezeichnung BBM.

Das Medium mit der Bezeichnung BBM hatte die folgende Zusammensetzung:

675 ml Maltose, 6 ml einer 20prozentigen wässrigen Lösung von KH2P04, deren pH-Wert unter Verwendung von Natriumhydroxid auf 6,9 bis 7,0 eingestellt worden war, 12 ml einer 2prozentigen wässrigen Lösung von MgS04/7H20 und 66 ml destilliertes Wasser.

Die so erhaltene Suspension in dem BBM-Medium wurde mit 180 g an feinen Glasteilchen vermischt, die einen durchschnittlichen Durchmesser von 0,1 mm aufweisen, und nachdem man das Material in 6 gleiche Anteile aufgeteilt hatte, wurde jeder Anteil der Mischung einer Behandlung in einem Zellenhomogenisator der Firma Braun unterworfen. Dieser Zellenhomogenisator ist das Produkt der Firma B. Braun Melusungen, und die Behandlung erfolgte bei 4000 Umdrehungen pro Minute während 5 Minuten, wobei durch diese Behandlung eine Aufbrechung der Zellen erreicht wurde. Die so erhaltene Suspension wurde dekantiert um den grössten Teil der Glasteilchen zu entfernen, und dann zen-trifugierte man 10 Minuten lang bei 1500 Umdrehungen pro Minute, um noch zurückgebliebene Glasteilchen und nicht aufgebrochene Zellen auszufällen.

Das darüber stehende Material wurde entfernt und nochmals, jetzt jedoch bei 13 000 Umdrehungen pro Minuten, während 30 Minuten zentrifugiert, und das dabei ausgefallene Material wurde isoliert, zweimal mit kalter physiologischer Kochsalzlösung gewaschen und in 300 ml eines 50 mil-limolaren Phosphatpuffers, dessen pH-Wert 7,0 betrug, suspendiert.

Diese Suspension wurde 15 Minuten lang auf 95 °C erhitzt, anschliessend gekühlt und dann 10 Minuten lang mit einer Geschwindigkeit von 1000 Umdrehungen pro Minute zentrifugiert. Das darüber stehende Material wurde entnommen und nochmals mit 13 000 Umdrehungen pro Minute während 30 Minuten zentrifugiert, und der dabei gebildete Niederschlag wurde isoliert und in 300 ml eines 50 millimo-laren Phosphatpuffers suspendiert. Zu dieser Suspension setzte man 15 mg an einer Desoxy-ribonuclease mit einem Gehalt von 820 Knitz (i/mg, welche ein Produkt der Firma Sigma Chemical Co., USA ist sowie ferner 3 mg an Ribo-nuclease mit einem Gehalt von 67 Knits n/mg, welche ebenfalls ein Produkt der Firma Sigma Chemical Co., USA ist, zu und bebrütete diese Mischung bei einer Temperatur von 37 °C während 2 Stunden. Dann wurde die Mischung mit einer Geschwindigkeit von 13 000 Umdrehungen pro Minute während 30 Minuten zentrifugiert, und der dabei gebildete Niederschlag wurde isoliert, in 300 ml einer 50 millimolaren Phosphatpufferlösung eines pH-Wertes von 7,0 suspendiert, und dann setzte man 90 mg an einer Pronase - E, nämlich dem Produkt das von der Firma Kaken Kagaku Kabushiki Kaisha, Japan erhältlich ist, zu und bebrütete bei einer Temperatur von 37 C während 24 Stunden.

Die dabei erhaltene Reaktionsmischung wurde mit einer 5 Geschwindigkeit von 13 000 Umdrehungen pro Minute während 30 Minuten zentrifugiert, und der gebildete Niederschlag in 300 ml einer 50 millimolaren Phosphatpufferlösung eines pH-Wertes von 7,0 suspendiert, und dann setzte man 39 mg an kristallinem Chymotripsin, das von der Firma Sigio ma Chemical Co., USA, erhältlich ist, zu und bebrütete bei einer Temperatur von 37 ~C während 2 Stunden. Anschliessend wurde die Mischung mit einer Geschwindigkeit von 13 000 Umdrehungen pro Minuten während 30 Minuten zentrifugiert. Der dabei gebildete Niederschlag wurde ge-15 wonnen und in 300 ml eines 0,2 molaren Glycin-HCl Puffers, der einen pH-Wert von 2,0 aufwies, suspendiert, und dann wurden 30 mg an Pepsin, welches ein Produkt der Firma Sigma Chemical Co., USA ist, zugesetzt, und man bebrütete 2 Stunden lang bei einer Temperatur von 37 °C. Die 20 dabei erhaltene Mischung wurde während 30 Minuten mit einer Geschwindigkeit von 13 000 Umdrehungen pro Minuten zentrifugiert. Der dabei gebildete Niederschlag wurde in 28 ml eines 5 millimolaren Phosphatpuffers suspendiert. Schichten an wässrigen Rohrzuckerlösungen, und zwar je 25 4 ml, wobei von diesen Lösungen jede ein unterschiedliches spezifisches Gewicht besass, und zwar 1,30, bzw. 1,25, bzw. 1,15, bzw. 1,10, wurden vom Boden nach oben in ein Zentrifugenrohr gegeben, welches ein Volumen von 40 ml besass, und dann wurden oben auf diese Schichten jeweils eine 30 Schicht von 4 ml der nach dem oben beschriebenen Verfahren hergestellten Suspensionen aufgebracht. Dementsprechend befanden sich die Schichten der Suspension oberhalb der Schichten der Saccharoselösungen.

Man zentrifugierte dann mit einer Geschwindigkeit von 35 3000 Umdrehungen pro Minute während 70 Minuten und fing die Mittelschichten mit Hilfe einer Pipette auf und zentrifugierte anschliessend während 30 Minuten mit 13 000 Umdrehungen pro Minute. Dabei bildete sich ein Niederschlag und zwar 0,63 g, bezogen auf das Trockengewicht, 40 und diesen isolierte man und wusch ihn zweimal, indem man eine Zentrifugierung mit einer 50 millimolaren Phosphatpufferlösung eines pH-Wertes von 7,0 durchführte, und anschliessend wurde das Material dann in 100 ml eines 50 millimolaren Phosphatpuffers eines pH-Wertes von 7,0 suspen-45 diert, wobei dieses schliesslich erhaltene Präparat das Antitumor-präparat war.

Beispiel 2

Das in Beispiel 1 beschriebene Verfahren wurde wiederholt, mit Ausnahme dessen, dass jetzt als Mikroorganismus 50 der Streptococcus pyogenes C 203 S Stamm, der bei der American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, USA, am 26. Mai 1970 mit der Hinterlegungsnummer ATCC 21546 hinterlegt wurde, anstelle des in Beispiel 1 eingesetzten Su-Stammes verwendet 55 wurde. Man erhielt dabei ein Antitumor-präparat, und zwar 0,56 g berechnet als Trockengewicht.

Beispiel 3

Das in Beispiel 1 beschriebene Verfahren wurde wieder-60 holt, mit Ausnahme dessen, dass jetzt der Streptococcus pyogenes S-43 Stamm, der bei der American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, USA, am 26. Mai 1970 mit der Hinterlegungsnummer ATCC 21547 hinterlegt wurde, anstelle des in Beispiel 1 65, verwendeten Su-Stammes zur Herstellung des Antitumor-präparates verwendet wurde. Man erhielt dabei ein Antitu-morpräparat in einer Menge von 0,53 g, bezogen auf das Trockengewicht.

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Beispiel 4

Das in Beispiel 1 beschriebene Verfahren wurde wiederholt, mit Ausnahme dessen, dass jetzt der Streptococcus pyogenes Blackmore Stamm, der bei der American Type Culture Collection, 12301, Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, USA, am 26. Mai 1970 mit der Hinterlegungsnummer ATCC 21548 hinterlegt wurde, anstelle des in Beispiel 1 verwendeten Su-Stammes eingesetzt wurde. Man erhielt dabei ein Antitumor-präparat in einer Menge von 0,47 g, bezogen auf das Trockengewicht.

Beispiel 5

Das in Beispiel 1 beschriebene Verfahren wurde wiederholt, mit Ausnahme dessen, dass jetzt der Streptococcus equisimilis, der bei der American Type Culture Collection, s 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, USA, unter der Gruppe C' der Streptococcus Spezien am 21. August 1970 mit der Hinterlegungsnummer ATCC 21597 hinterlegt wurde, anstelle des in Beispiel 1 verwendeten Su-Stammes verwendet wurde. Man erhielt dabei ein Antitu-lo mor-präparat in einer Menge von 0,54 g, bezogen auf das Trockengewicht.

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2 Blatt Zeichnungen

Claims

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2. Verfahren zur Herstellung eines Materials mit Antitu-morwirksamkeit nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man die Zellen von Bakterien aufbricht, die zu den haemolytischen Streptococcen gehören und aus dem aufgebrochenen Material eine wasserunlösliche Substanz extrahiert und diese Substanz mit einer Desoxy-ribonuclease, einer Ribonuclease und/oder einer oder mehreren Proteasen aufschliesst.

2

PATENTANSPRÜCHE 1. Material mit Antitumorwirkung, dadurch gekennzeichnet, dass es die folgenden Eigenschaften besitzt:

a) Aussehen:

Ein weisses bis gräulich-weisses Pulver b) Löslichkeit:

In Wasser unlöslich c) Elementaranalyse:

C = 42,97%; H = 5,64%; N = 7,31%

d) Ultraviolett-absorptionsspektrum:

Das in Fig. 1 dargestellte Spektrum e) Infrarot-Absorptionsspektrum:

Das in Fig. 2 dargestellte Spektrum f) Chemische Zusammensetzung:

Bestandteil Gew.-%

Rhamnose 33,3

Hexosamin 12,7

Protein 16,7

Gesamtlipoid 0,2

Ribonucleinsäure 0

Desoxy-ribonucleinsäure 0
3. Verfahren nach Patentanspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Bakterien, welche zu den haemolytischen Streptococcen gehören, solche des Streptococcus pyogenes Su Stamm, Streptococcus pyogenes C 203 S Stamm, Streptococcus pyogenes S-43 Stamm, Streptococcus pyogenes Blackmore Stamm oder Streptococcus equisimilis sind.
4. Verfahren nach Patentanspruch 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, dass die verwendete Protease aus der Gruppe ausgewählt ist, welche Proteinasen, Trypsin, Pepsin und Na-garase umfasst.