CS235079B2 - Method of antitumour substance preparation - Google Patents
Method of antitumour substance preparation Download PDFInfo
- Publication number
- CS235079B2 CS235079B2 CS794488A CS448879A CS235079B2 CS 235079 B2 CS235079 B2 CS 235079B2 CS 794488 A CS794488 A CS 794488A CS 448879 A CS448879 A CS 448879A CS 235079 B2 CS235079 B2 CS 235079B2
- Authority
- CS
- Czechoslovakia
- Prior art keywords
- cells
- concentration
- treated
- hours
- preparation
- Prior art date
Links
- 239000000126 substance Substances 0.000 title claims abstract description 13
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 22
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 title abstract description 17
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title description 21
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims abstract description 11
- 230000002949 hemolytic effect Effects 0.000 claims abstract description 11
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 40
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 claims description 12
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 claims description 11
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 9
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 9
- 102000016911 Deoxyribonucleases Human genes 0.000 claims description 7
- 108010053770 Deoxyribonucleases Proteins 0.000 claims description 7
- 102000057297 Pepsin A Human genes 0.000 claims description 7
- 108090000284 Pepsin A Proteins 0.000 claims description 7
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 claims description 7
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 claims description 7
- 229940111202 pepsin Drugs 0.000 claims description 7
- 108010059712 Pronase Proteins 0.000 claims description 6
- 108090000317 Chymotrypsin Proteins 0.000 claims description 4
- 229960002376 chymotrypsin Drugs 0.000 claims description 4
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 4
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 4
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 4
- 239000007900 aqueous suspension Substances 0.000 claims description 3
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims 1
- 230000036407 pain Effects 0.000 abstract description 8
- 239000000463 material Substances 0.000 abstract description 7
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 abstract description 5
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 abstract description 5
- 239000004365 Protease Substances 0.000 abstract description 4
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 abstract description 3
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 abstract description 3
- 230000001698 pyrogenic effect Effects 0.000 abstract description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 26
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 18
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 12
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 11
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 9
- 241000193996 Streptococcus pyogenes Species 0.000 description 9
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 9
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 8
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 8
- MSWZFWKMSRAUBD-UHFFFAOYSA-N 2-Amino-2-Deoxy-Hexose Chemical compound NC1C(O)OC(CO)C(O)C1O MSWZFWKMSRAUBD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 7
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 7
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 7
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 7
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 7
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 7
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 6
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 6
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 5
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 5
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 5
- 206010070834 Sensitisation Diseases 0.000 description 5
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 5
- 230000008313 sensitization Effects 0.000 description 5
- SHZGCJCMOBCMKK-UHFFFAOYSA-N D-mannomethylose Natural products CC1OC(O)C(O)C(O)C1O SHZGCJCMOBCMKK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- SHZGCJCMOBCMKK-JFNONXLTSA-N L-rhamnopyranose Chemical compound C[C@@H]1OC(O)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O SHZGCJCMOBCMKK-JFNONXLTSA-N 0.000 description 4
- PNNNRSAQSRJVSB-UHFFFAOYSA-N L-rhamnose Natural products CC(O)C(O)C(O)C(O)C=O PNNNRSAQSRJVSB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 4
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WFDIJRYMOXRFFG-UHFFFAOYSA-N Acetic anhydride Chemical compound CC(=O)OC(C)=O WFDIJRYMOXRFFG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 3
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 3
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 3
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 3
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 3
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 3
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 235000019419 proteases Nutrition 0.000 description 3
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 3
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 3
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 3
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 3
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- SIKJAQJRHWYJAI-UHFFFAOYSA-N Indole Chemical compound C1=CC=C2NC=CC2=C1 SIKJAQJRHWYJAI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 2
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 2
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N Pyridine Chemical compound C1=CC=NC=C1 JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000264435 Streptococcus dysgalactiae subsp. equisimilis Species 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 2
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 2
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 2
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 2
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 2
- VLTRZXGMWDSKGL-UHFFFAOYSA-N perchloric acid Chemical compound OCl(=O)(=O)=O VLTRZXGMWDSKGL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 description 2
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 2
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 2
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 2
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MSWZFWKMSRAUBD-GASJEMHNSA-N 2-amino-2-deoxy-D-galactopyranose Chemical compound N[C@H]1C(O)O[C@H](CO)[C@H](O)[C@@H]1O MSWZFWKMSRAUBD-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- MSFSPUZXLOGKHJ-PGYHGBPZSA-N 2-amino-3-O-[(R)-1-carboxyethyl]-2-deoxy-D-glucopyranose Chemical compound OC(=O)[C@@H](C)O[C@@H]1[C@@H](N)C(O)O[C@H](CO)[C@H]1O MSFSPUZXLOGKHJ-PGYHGBPZSA-N 0.000 description 1
- IVLXQGJVBGMLRR-UHFFFAOYSA-N 2-aminoacetic acid;hydron;chloride Chemical compound Cl.NCC(O)=O IVLXQGJVBGMLRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930186147 Cephalosporin Natural products 0.000 description 1
- DYDCUQKUCUHJBH-UWTATZPHSA-N D-Cycloserine Chemical compound N[C@@H]1CONC1=O DYDCUQKUCUHJBH-UWTATZPHSA-N 0.000 description 1
- DYDCUQKUCUHJBH-UHFFFAOYSA-N D-Cycloserine Natural products NC1CONC1=O DYDCUQKUCUHJBH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000012661 Dyskinesia Diseases 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 241000581652 Hagenia abyssinica Species 0.000 description 1
- 239000007836 KH2PO4 Substances 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 description 1
- MSFSPUZXLOGKHJ-UHFFFAOYSA-N Muraminsaeure Natural products OC(=O)C(C)OC1C(N)C(O)OC(CO)C1O MSFSPUZXLOGKHJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AHLPHDHHMVZTML-UHFFFAOYSA-N Orn-delta-NH2 Natural products NCCCC(N)C(O)=O AHLPHDHHMVZTML-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UTJLXEIPEHZYQJ-UHFFFAOYSA-N Ornithine Natural products OC(=O)C(C)CCCN UTJLXEIPEHZYQJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 206010037660 Pyrexia Diseases 0.000 description 1
- 206010039491 Sarcoma Diseases 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000194022 Streptococcus sp. Species 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000001015 abdomen Anatomy 0.000 description 1
- 238000000862 absorption spectrum Methods 0.000 description 1
- 230000021736 acetylation Effects 0.000 description 1
- 238000006640 acetylation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000000184 acid digestion Methods 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- PNEYBMLMFCGWSK-UHFFFAOYSA-N aluminium oxide Inorganic materials [O-2].[O-2].[O-2].[Al+3].[Al+3] PNEYBMLMFCGWSK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000011609 ammonium molybdate Substances 0.000 description 1
- APUPEJJSWDHEBO-UHFFFAOYSA-P ammonium molybdate Chemical compound [NH4+].[NH4+].[O-][Mo]([O-])(=O)=O APUPEJJSWDHEBO-UHFFFAOYSA-P 0.000 description 1
- 229940010552 ammonium molybdate Drugs 0.000 description 1
- 235000018660 ammonium molybdate Nutrition 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical class N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 description 1
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 1
- KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N boric acid Chemical compound OB(O)O KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004327 boric acid Substances 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 229940124587 cephalosporin Drugs 0.000 description 1
- 150000001780 cephalosporins Chemical class 0.000 description 1
- WORJEOGGNQDSOE-UHFFFAOYSA-N chloroform;methanol Chemical compound OC.ClC(Cl)Cl WORJEOGGNQDSOE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 230000001143 conditioned effect Effects 0.000 description 1
- 229960003077 cycloserine Drugs 0.000 description 1
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000004821 distillation Methods 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 238000000921 elemental analysis Methods 0.000 description 1
- 230000003203 everyday effect Effects 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 238000004817 gas chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000001030 gas--liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 229960002442 glucosamine Drugs 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 239000007973 glycine-HCl buffer Substances 0.000 description 1
- 238000000227 grinding Methods 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- PZOUSPYUWWUPPK-UHFFFAOYSA-N indole Natural products CC1=CC=CC2=C1C=CN2 PZOUSPYUWWUPPK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RKJUIXBNRJVNHR-UHFFFAOYSA-N indolenine Natural products C1=CC=C2CC=NC2=C1 RKJUIXBNRJVNHR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 1
- 201000006512 mast cell neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 208000006971 mastocytoma Diseases 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000004570 mortar (masonry) Substances 0.000 description 1
- OIPPWFOQEKKFEE-UHFFFAOYSA-N orcinol Chemical compound CC1=CC(O)=CC(O)=C1 OIPPWFOQEKKFEE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 229960003104 ornithine Drugs 0.000 description 1
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M potassium dihydrogen phosphate Chemical compound [K+].OP(O)([O-])=O GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 235000019833 protease Nutrition 0.000 description 1
- UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N pyridine Natural products COC1=CC=CN=C1 UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- AGDSCTQQXMDDCV-UHFFFAOYSA-M sodium;2-iodoacetate Chemical compound [Na+].[O-]C(=O)CI AGDSCTQQXMDDCV-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 150000005846 sugar alcohols Chemical class 0.000 description 1
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 208000030218 transient fever Diseases 0.000 description 1
- 238000002834 transmittance Methods 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002211 ultraviolet spectrum Methods 0.000 description 1
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/315—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Streptococcus (G), e.g. Enterococci
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
- A61K35/74—Bacteria
- A61K35/741—Probiotics
- A61K35/744—Lactic acid bacteria, e.g. enterococci, pediococci, lactococci, streptococci or leuconostocs
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
- C12N1/205—Bacterial isolates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
- C12P21/005—Glycopeptides, glycoproteins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/46—Streptococcus ; Enterococcus; Lactococcus
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/8215—Microorganisms
- Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
- Y10S435/885—Streptococcus
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Mycology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Virology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Compounds Of Unknown Constitution (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Description
Způsob přípravy protinádorové látky rozkladem buněk bakterií patřících do skupiny hemolytických streptokoků spočívající ve fyzikálním rozrušení uvedených buněk, získání ve vodě nerozpustné látky na bázi stěn uvedených buněk, na kterou se ve formě vodné suspenze působí deoxyribonukleázou a ribonukleázou za podmínek dostatečných k úplnému rozkladu kyseliny nukleové a dále se působí pronázou, chymotripsinem a pepsinem v intenzitě a za podmínek dostatečných k rozkladu proteinu.
Protinádorová látka Je nejen tepelně stabilní, ale také má nepatrné zánětlivé vlastnosti způsobující bolest a nízkou pyrogenní účinnost.
Vynález se týká způsobu přípravy protinádorové látky rozkladem buněk bakterií patřících do skupiny hemolytických streptokoků.
Bylo zjištěno, že žijící buňky bakterií patřících do hemolytických streptokoků mají určitou účinnost proti rakovině.
Avšak, protože je účinnost velice nestálá, bylo učiněno mnoho pokusů zvýšit její stabilitu. Japonské patenty č. 6699/68, a č. 8871/70, 2034/71 a 2674/71 uvádějí různé schůdné metody, kde žijící buňky bakterií se suspendují ve fyziologickém roztoku obsahujícím antibiotikum, jako penicilín, cefalosporin, cykloserin nebo podobně, zahřívají se při teplotě v rozmezí 37 až 45 °C a po přidání vhodného stabilizátoru k suspenzi se lyofilizují a získá se suchý přípravek.
Ačkoliv tyto přípravky projevují protinádorovou účinnost, mají nedostatek pro farmaceúticku přípravu v tom, že způsobují bolest na místě, kde se podávají pacientovi, mají zánětlivé vlastnosti a vyvolávají u pacienta po podání přechodnou horečku.
Na druhé straně byly studovány různé metody extrakce protinádorových látek z buněk bakterií patřících do hemolytických streptokoků. Japonský patent číslo 1647/63 uvádí způsob, který zahrnuje rozrušení buněk, aby se získala látka plovoucí na povrchu, přidání organického rozpouštědla a shromáždění vysrážené antibiotické látky. Dále uveřejňuje japonský patent č. 43841/73 způsob, který zahrnuje rozrušení nebo rozklad buněk, aby se získala látka plovoucí na povrchu a shromáždění účinné látky jako frakce obsahující 50 až 80 % nasyceného roztoku síranu amonného. Tyto protinádorové látky získané z ve vodě rozpustných frakcí jsou ' hlavně tvořeny proteiny a jsou velice nestabilní vůči teplu a mají značně nižší protinádorovou účinnost než přípravky obsahující buňky. Kromě toho mají značné zánětlivé vlastnosti a relativně větší možnost vyvolat při podávání pacientovi horečku nebo bolest.
Také je známa z japonského patentu č. 6090/74 metoda, která zahrnuje účinek rozloženého enzymu na buňky bakterií patřících do hemolytických streptokoků a získání účinné látky ve vodě nerozpustné z rozkladného roztoku. Tento typ látky zahrnuje hlavně protoplasmickou membránu buněk a nemá v podstatě zánětlivé vlastnosti, pyrogenní účinnost a vlastnosti způsobující bolest. Avšak tato látka s protinádorovým účinkem je nestabilní vůči teplu.
Během výzkumu bylo zjištěno, že látky, které se získaly fyzikálním rozrušením buněk bakterií patřících do skupiny hemolytických streptokoků k získání ve vodě nerozpustné frakce obsahující hlavně složky stěn buněk, na kterou se působilo nukleázou nebo proteázou, mají nepatrné zánětlivé vlastnosti a vlastnosti způsobující bolest.
Předmětem vynálezu je proto způsob přípravy protinádorové látky rozkladem buněk
Λ patřících do skupiny hemolytických streptokoků, který se vyznačuje tím, že se uvedené buňky bakterií fyzikálním způsobem rozruší, získá se ve vodě nerozpustná látka na bázi složek stěn uvedených buněk, na kterou se ve formě vodné suspenze působí deoxyribonukleázou a ribonukleázou za podmínek dostatečných k úplnému rozkladu kyseliny nukleové a dále se působí pronázou, chymotripsinem a pepsinem v intenzitě a za podmínek dostatečných k rozkladu proteinu.
Na ve vodě nerozpustnou látku se působí deoxyribonukleázou v koncentraci 0,01 až 0,25 mg/ml a ribonukleázou v koncentraci 0,001 až 0,015 mě/ml při teplotě 25 až 39 °C po dobu 2 až 5 hodin a potom pronázou E v koncentraci 0,1 až 1,5 mg/ml, chymotrypsinem v koncentraci 0,05 až 0,65 mg/ml a pepsinem v koncentraci 0,0002 až 0,005 mg/ /mililitru při teplotě 25 až 39 °C po dobu 2 až 24 hodiny.
Vynález bude detailněji objasněn v následujícím. Buňky bakterií patřících do hemolytických streptokoků jako Streptococcus pyogenes Su kmen, Streptococcus pyogenes C 203 S kmen, Streptococcus pyogenes S-43 kmen Streptococcus pyogenes Blackmore kmen nebo Streptococcus equisimilis, které se získají kultivací, se suspendují ve vhodném solném roztoku, jako fyziologickém roztoku nebo podobně, nebo v destilované vodě, a rozruší se fyzikálním způsobem, například použitím sonikátoru buňkového homogenizátoru nebo podobně, nebo rozmělněním za přítomnosti práškovitého kysličníku hlinitého ve hmoždíři. Suspenze rozrušených buněk se odstředí nejprve při . nízké rychlosti otáčení, aby se odstranily nerozrušené buňky jako sraženina a potom látka plovoucí na povrchu se opět odstředí při vysoké rychlosti otáčení. Získaná sraženina se potom odstraní a promyje vhodným solným roztokem nebo destilovanou vodou a působí se proteázou, jako proteinázou, trypsinem, pepsinem, nagarsou nebo podobně a opět se promyje vhodným solným roztokem nebo destilovanou vodou. Takto získaný materiál obsahuje složky stěn buněk, které se mohou použít jako protinádorový přípravek suspendováním ve vhodném prostředí. Materiál se však musí čistit pomocí deoxyribonukleázy a ribonukleázy a popřípadě se dále čistí metodou gradientu hustoty sacharózy.
Působení nukleázou nebo proteázou podle vynálezu se výhodně provádí za optimálních podmínek pro použitý specifický enzym. Například se suspenduje substrát a enzym ve vhodném pufru, jako fosfátu nebo směsi glycin-kyselina chlorovodíková, aby se pH upravilo na optimální hodnotu pro enzym a zahřívá se asi při 37 °C po dobu v rozmezí několika hodin až několika desítek hodin. Protinádorová látky se získá jako směs peptidů.
Protinádorová látka získaná způsobem podle vynálezu, například podle způsobu popsaného v příkladu 1, je šedě bílý prášek a podle elementární analýzy má následující složení:
7,31 % N, 42,97 % C, 5,64 % H.
Vzorek podle vynálezu se suspenduje ve fyziologickém roztoku při koncentraci 30 miligramů na mililitr a stanoví se ultrafialové spektrum. Výsledky jsou uvedeny jako graf na obr. 1, kde na svislé ose je uvedena absorpce a na vodorovné ose vlnová délka ( vnm).
Na obr. 2 je uveden graf znázorňující infračervené absorpční spektrum za použití 2 mg vzorku podle vynálezu a KBr tablet. Na svislé ose je uvedená propustnost (v %) a na vodorovné ose vlnová délka (nahoře v ^m a dole v cm1).
Látka je proteinem kombinovaným s polysacharidy obsahujícími rhamnózu, hexosamin a další. Výsledky analýzy chemického složení jsou uvedeny v tabulce 1.
Tabulka 1
| Složka | Obsah* (%) |
| rhamnóza | 33,3 |
| hexosamin | 12,7 |
| protein | 16,7 |
| celkové lipidy | 0,2 |
| RNA | 0 |
| DNA | 0 |
xObsah rhamnózy byl stanoven Cibbonovou metodou, hexosamin metodou Elson
-Morgan, protein Lauryho metodou, celkové lipidy metodou zahrnující extrakci směsí chloroform-methanol (3:1) a zvážení suchého extraktu, RNA reakcí orcinu a DNA reakcí indolu.
Ačkoliv je protinádorová látka podle vynálezu stabilní vůči teplu a může se skladovat po dlouhou dobu ve formě suspenze, může se na rozdíl od přípravků obsahujících buňky hemolytických streptokoků suspendovat ve vhodném prostředí a potom lyofilizovat.
Vynález bude dále objasněn v následující pokusech a příkladech, aniž by omezoval rozsah vynálezu.
Pokus 1 _
180 nádorových buněk Sarcoma se subkutánně naočkuje do tříselné oblasti samečka myši ICR (4 týdny starého) v množství 3 X 106 buněk na myš. Dvacet čtyři hodiny po naočkování se každé myši vpíchne každý den po 4 dny subkutánně do břicha injekce protinádorového přípravku podle vynálezu, přípravek podle vynálezu, který se zahříval 30 minut při 90 °C nebo přípravek označený jako OK-432, byl pozitivní kontrola. Přípravek OK-432 byl připraven působením penicilinu na buňky Streptococcus pyogenes Su kmen a lyofilizací; 14 dní po naočkování nádorových buněk byl vyrostlý nádor každé myši vyříznut a zvážen. Jako kontrola se použil místo výše uvedeného přípravku fyziologický roztok.
Výsledky jsou uvedeny v tabulce 2.
Tabulka 2
| Typ přípravku | Dávka jUgAnyš | Počet zkoušených (hlav) zvířat | Průměrná hmotnost nádoru (mg) | Potlačení (°/p) |
| Přípravek podle příkladu 1 | 3,6 | 10 | 567 | 47,3 |
| Přípravek podle příkladu 2 | 3,2 | 10 | 613 | 43,1 |
| Přípravek podle příkladu 3 | 3,0 | 10 | 658 | 38,9 |
| Přípravek podle příkladu 4 | 2,7 | 10 | 635 | 41,0 |
| Přípravek podle příkladu 1 zahřívaný 30 minut pří 90 °C | 3,6 | 10 | 600 | 44,2 |
| OK-432 | 50,0 | 10 | 554 | 48,5 |
| Fyziologický roztok | — | 10 | 1076 | — |
| xDávka každého buněk. | přípravku odpovídá množství připravenému z 50 | ^g suchých |
Ί
Jak jasně vyplývá z tabulky 2, byla protinádorová účinnost přípravků podle vynálezu většinou ekvivalentní účinnosti přípravku OK-432 a přípravek podle vynálezu byl stabilní vůči teplu.
Pokus 2
Nádorové buňky mastocytoma P-815 se subkutánně naočkují do tríselné oblasti samečka myši BDFi [5 týdnů starého, 10 myší na zkušební skupinu) v množství 2,5 X 104 buněk na myš. Dvacetčtyři hodiny po naočkování se každé myši každý den po 4 dny podá intravenózně protinádorový přípravek získaný podle příkladu 1 nebo přípravek OK-432 jako pozitivní kontrola. Byla měřena rozměrová změna nádoru nad kůží s průběhem času a zaznamenávána v termínech nejdelší průměr x nejkratší průměr. Jako kontrola se použil místo přípravku fyziologický roztok.
Výsledky jsou uvedeny v tabulce 3.
Tabulka 3
Typ přípravku Dávka Rozměr nádoru (jUg/myš) 15 dní po 23 dní po
Průměr + Potlačení (%) Průměr Potlačení (%) + S. E. xxx + S. E.
| Přípravek po- | 14,4X | 4,0 +3,7 | 41 | 6,9 + 5,1 | 44 |
| dle příkladu 1 | 7,2XX A. 1 | 4,4 + 2,5 | 35 | 4,7 ± 4,1 | 61 |
| OK-432 | 100 x | 2,6 + 2,5 | 62 | 5,0 + 3,3 | 59 |
| Fyziologický roztok | . ·. : Λ'-/· i | .....' - · .......- 6,8 + 0,3 | 12,3 + 2,7 |
xDávka odpovídá množství připravenému z 200 ^g suchých buněk xxDávka odpovídá množství připravenému z 100 ^g suchých buněk XXXS. E.: standardní chyby
Z údajů v tabulce 3 je jasné, že přípravek získaný v příkladu 1 také projevuje pozoruhodnou protinádorovou účinnost proti nádoru P-815.
I
Pokus 3
V tomto pokuse byl potvrzen silný účinek protinádorového přípravku podle vynálezu pro zesílené vyvolání imunity proti leukémii způsobené buňkami L 1210 u myší. Suspenze buněk L 1210 (6 X 107 buněk/ /mililitr) se smíchá s ekvivalentním objemem 8 mM roztoku jodoacetátu sodného a nechá se stát 20 minut při 37 °C, aby se získaly upravené buňky (označeno IA-L 1210). Samičky myší BDFi (8 týdnů staré) se roz dělí do skupin po 5 členech a subkutánně se vpíchne Injekce buněk IA-L 1210 v množství 5 X 106 na myš (první sensibilace) a 10 dní po první sensibilaci se injekce opakuje (další sensibilace). Pokusným myším se podá subkutánně dvakrát ve stejnou dobu jako první a další sensibilace přípravek podle vynálezu nebo OK-432 jako pozitivní kontrola. Pět dní po další sensibilace se pokusným myším subkutánně naočkují přírodní buňky 1210 v množství 104 buněk/myš a pozoruje se procento přežitých.
Jako kontrola se podá jedné skupině myší pouze IA-L 1210 a druhá skupina myší se nesensibiluje.
Výsledky jsou uvedeny v tabulce 4.
Tabulka 4
| Sensibilace (dvakrát) | Typ přípravku (Celková dávka mg/hlava X 2) | Průměr přežitých dní | ILSX (%) | Počet přežitých zvířat 40 dní po naočkování L1210 |
| Přípravek podle příkladu 1 (7,2) | 38,8 | 62 | 4 | |
| IA-L 1210 | Přípravek podle příkladu 1 (7,2) | 37,4 | 56 | 4 |
| OK-432 (100) | 37,6 | 57 | 4 | |
| — | 25,4 | 6 | 1 | |
| — | — | 24,0 | — | 0 |
S т_p x ILT = ——- X 100
G
T ·== Průměr přežitých dní pro skupinu léčených myší
C · = Průměr přežitých dní pro skupinu neléčených myší
Pokus 4
Protinádorový přípravek získaný podle vynálezu pozoruhodně snižuje vlastnosti vyvolávající bolest a zánět ve srovnání s OK-432.
Myším samečkům ICR (5 týdnů starým, deset myší na skupinu) se intraperitoneálně podá přípravek podle vynálezu v dávce 25 pg na myš. Během 60 minut po podání se nepozoruje žádný abnormální pohyb. Naopak projevují myši, kterým byl podán pří pravek OK-432 v dávce 100 mg/myš na základě hmotnosti suchých buněk, · různou hranici tak zvaného kroutícího se syndromu, zejména kroucení těla nebo napínání zadních nohou, způsobený vyvoláním bolesti.
Na druhé straně se píchne intrakutánně, myším · samečkům ICR (5 týdnů starým; 5 myší na skupinu) do hřbetu injekce protinádorového přípravku podle vynálezu · v dávce 25 gg/myš nebo přípravku OK-432 v dávce 100 gg/myš na základě hmotnosti suchých buněk a 3 hodiny po injekci se intravenózně vpíchne do ocasu 0,5% Evansova modrého roztoku. Třicet minut po injekci barviva se myši · usmrtí, kůže injikované · části na hřbetě se sloupne a pozoruje se vytékání barviva z této části. Výsledky jsou uvedeny v tabulce 5.
Typ přípravku
Tabulka 5
Dávka (gg/hlava)
Zvířata s vytékáním barviva .______(hlava)
Celkový počet pokusných zvířat (hlava)
| Přípravek podle příkladu 1 | 25 | 0/5 |
| Přípravek podle příkladu 2 | 25 | 0/5 |
| Přípravek podle příkladu 3 | 25 | 0/5 |
| Přípravek podle příkladu 4 | 25 | 0/5 |
| OK-432 | 100 | 5/5 |
r. :
Jak výplývá z tabulky 5 je vytékání barviva u myší, kterým byl podán přípravek OK-432 pozitivní, zatímco se u myší, kterým byl podán protinádorový přípravek podle vynálezu, nepozoruje vytékání barviva. Tyto výsledky potvrzují slabý zánětlivý účinek přípravku podle vynálezu.
Přikladl
Streptococcus pyogenes Su-kmen/ATCC 21060) se naočkuje do bujónového prostředí (1500 ml) a kultivuje se 20 hodin. Celá živná půda se potom očkuje v 3% kvasničném extraktu (30 1) a staticky se · kultivuje 20 hodin při 37 °C; 3% kvasničný extrakt se připravil rozpuštěním kvasničného· extraktu ve vodě, upraveném pH vodným roztokem hydroxidu sodného na 7,4, zahříváním roztoku po dobu jedné hodiny při 100 °C a po ochlazení odstraněním sraženiny filtrací a sterilizací filtrátu párou při 120 °C a tlaku 0,098 MPa po dobu 10 minut. Živné prostředí se · ochladí ledem a buňky v živném prostředí se za chlazení odstředí, promyjí dvakrát studeným fyziologickým roztokem a suspendují se v BBM, jehož složení je 675 mililitrů maltózy, 6 ml 20% vodného roztoku KH2PO4 majícího pH 6,9 až 7,0 upravené hydroxidem sodným, 12 ml 2% vodného roztoku MgSOá. 7HzO a 66 ml destilované vody. Suspenze se smíchá s 180 g jemných skleněných částic o průměru 0,1 mililitru a po rozdělení na 6 alikvotních částí se každá alikvotní část směsi homogenizuje · v buňkovém homogenizátoru asi při 4000 otáčkách za minutu po dobu 5 minut, aby se rozrušily buňky. Výsledná suspenze se dekantuje, aby se odstranila většina skleněných částic a odstřeďuje se 10 minut · při 1500 otáčkách za minutu, aby se odstranily skleněné částice a nerozrušené buňky. Látka plovoucí na povrchu se opět 30 minut odstřeďuje při 13 000 otáčkách za minutu a sraženina se odstraní, promyje dvakrát studeným fyziologickým roztokem a suspenduje se v 300 ml 50 mM fosfátového pufru (pH 7,0). Suspenze se zahřívá 15 minut při 95 °C a po ochlazení se odstřeďuje 10 minut při 1000 otáčkách za minutu. Látka plovoucí na povrchu se opět 30 minut odstřeďuje při 13 000 otáčkách za minutu · a výsledná sraženina se suspenduje v 300 ml 50 mM fosfátového pufru. K suspenzi se přidá 15 mg deoxyribonukleázy (820 Knits-jednotek/mg) a 3 mg ribonukleázy (67 Knits-jednotek/mg) a směs se inkubuje 2 hodiny při 37 °C. Potom se směs odstřeďuje 30 minut · při 13 000 otáčkách za minutu a výsledná sraženina se shromáždí, suspenduje ve 300 ml 50 mM fosfátového pufru (pH 7,0) a po přidání 90 mg pronázy -E se inkubuje · 24 hodiny při 37 °C.
Reakční směs se 30 minut odstřeďuje při 13 000 otáčkách za minutu a sraženina se suspenduje v 300 ml 50 mM fosfátového pufru (pH 7,0) a po přidání 39 mg krystalického chymotrypsinu se inkubuje 2 - hodiny při 37 °C. Směs se odstřed'uje*30 minut při 13 000 otáčkách za minutu. Sraženina se odstraní, suspenduje v 300 ml 0,2 M glycin-HCl pufru (pH 2,0) a po přidání 30 mg pepsinu se inkubuje 2 hodiny při 37 °C. Směs se odstřeďuje- 30 minut při 13 000 otáčkách za minutu. Výsledná sraženina se suspenduje ve 28 ml 5 mM fosfátového pufru. Vrstvy sacharózy vodných roztoků (každá 4 ml), které mají rozdílnou hustotu 1,30, 1,25, 1,15 nebo 1,10, se umístí do odstředivkové zkumavky o objemu 40 ml ode dna k vrcholku a - potom se umístí 4 ml vrstvy výše připravené suspenze na vrcholek vrstev sacharózových roztoků. Po 70minutovém odstředění při 3000 otáčkách za minutu se střední vrstvy odstraní - pipetou a odstřeďu jí 30 minut při 13 000 otáčkách za minutu. Sraženina (0,63 g jako suchý základ) se shromáždí a promyje dvakrát odstředěním s 50 mM fosfátovým pufrem (pH 7,0), potom se suspenduje ve 100 ml 50 mM fosfátového pufru (pH 7,0) a získá se protinádorový přípravek.
Příklad 2
Opakuje se příklad 1 s rozdílem, že se použije Streptococcus pyogenes C 203 - S kmen (ATCC 821546) místo Su kmene a získá se protinádorový přípravek (0,56 g jako suchý základ).
Příklad 3
Opakuje se příklad 1 s rozdílem, že se použije Streptococcus pyogenes S-43 kmen (ATCC 21547) místo Su kmene a získá se protinádorový přípravek (0,53 g jako suchý základ).
Příklad 4
Opakuje se příklad 1 s rozdílem, že se použije Streptococcus pyogenes Blackmore kmen (ATCC 21548) - místo Su kmene a získá se - protinádorový přípravek (0,47 g jako suchý základ).
Příklad 5
Opakuje se příklad 1 s rozdílem, že se použije Streptococcus equisimilis (uložený s ATCc pod skupinou C Streptococcus sp. ATCC 21597) místo Su kmene a získá se protinádorový přípravek (0,54 g jako suchý základ).
Pro úplnou specifikaci protinádorové látky jsou v následujícím uvedeny pro příklady 1 až 5 výsledky aminokyselinové analýzy a analýzy dalších složek.
I — Aminokyselinová analýza, výsledky jsou uvedeny v tabulce 1.
Tabulka 1 moly/mg stěn buněk (°/o)
| asparagín | 8,6 | 0,03 |
| threonin | 7,3 | 0,03 |
| serin | 14,3 | 0,05 |
| kyselina muramová | 117,8 | 0,43 |
| kyselina glutamová | 273,4 | 1,00 |
| glycin | 24,2 | 0,09 |
| alanin | 1095,2 | 4,01 |
| valin | 12,9 | 0,05 |
| methionin | — | — |
| isoleucin | 7,5 | 0,03 |
| leucin | 12,1 | 0,04 |
| tyrosin | — | — |
| glukosamin | 579,6 | 2,12 |
| galaktosamin | — | — |
| ornithin | 7,5 | 0,03 |
| lysin | 299,2 | 1,09 |
| NHž | 1031,7 | 3,77 |
| histidin | 8,2 | 0,03 |
| arginin | 8,3 | 0,03 |
II. Analýza dalších složek
Metody kvantitativní analýzy následujících složek jsou uvedeny níže.
1. Obsah proteinu:
Obsah proteinu byl stanoven metodou podle Loweryho a dalších.
2. Obsah celkového hexosaminu:
Vzorek se hydrolyzoval ve 3 N HC1 po dobu 4 hodin ve vroucí vodní lázni a celkové množství hexosaminu se stanovilo metodou podle „Protein, Nucleic Acid, Enzyme“, sv. 14, č. 11 (1969) uveřejněno v Japonsku str. 1015 až 1016.
3. Obsah fosforu:
Vzorek se přeměnil v popel působením kyseliny sírové a kyseliny chloristé, podrobil se barevnému vyvolání za použití molybdenanu amonného a kyseliny askorbové a potom se provedlo stanovení (Lowry a další, J. В. C. sv. 207, str. 1 až 17 /1954/).,
4. Obsah glycerinu a rhamnózy:
Analýza se provedla metodou založenou na Alditolové metodě plynové chromatografie cukru (Koso Seikagaku Jikken-ho/ /základní biochemické pokusy/) č. 5, vydal Maruzen Co„ Ltd., Japonsko, hl. 4.3 — polysacharidy.
Vzorek se hydrolyzoval ve 2 N FICI při 100 °C po dobu jedné hodiny, sušil se za sníženého tlaku a redukoval se přes noc pomocí NaBHi. Potom se přebytek NaBI-U rozložil kyselinou octovou a odpařil se za sníženého tlaku do sucha. Zbytek se rozpustil v methanolu a destiloval se pro odstranění kyseliny borité. Tato destilace se opakovala několikrát. Potom se přidal ke zbytku pyridin a acetanhydrid (1:1) a směs se zahřívala za účelem acetylace 1,5 hodiny při 100 CC a odpařila se za sníženého tlaku.do sucha. Zbytek se rozpustil v předem stanoveném objemu chloroformu a analyzoval se chromatografií plyn — kapalina.
Výsledky každé analýzy jsou uvedeny v tabulce 2.
Tabulka 2
Protein ((Ug/ Celkový he- glycerin fosfor rhamnóza /ml buněk) xosamin (moly/mg (moly/mg (№r/nig (moly/mg ' (^g/mg (moly/mg stěn buněk) stěn buněk) stěn buněk] stěn buněk) stěn buněk) stěn buněk)
| 391,1 | 888,7 | 24,8 | 250.5 | 7,76 | 628,7 | 103,1 |
| 298,7 | 536,5 | 10,3 | 111,7 | 3,46 | 448,2 | 73,5 |
| 73,7 | 1316,5 | 6,8 | 234,6 | 7,07 | 723,8 | 118,7 |
Claims (2)
- PŘEDMĚT VYNALEZU1. Způsob přípravy protinádorové látky rozkladem buněk bakterií patřících do skupiny hemolytických streptokoků, vyznačený tím, že se uvedené buňky bakterií fyzikálním způsobem rozruší, získá se ve vodě nerozpustná látka na bázi složek stěn uvedených buněk, na kterou se ve formě vodné suspenze působí deoxyribonukieázou a ribonukleázou za podmínek dostatečných к úplnému rozkladu kyseliny nukleové a dále se působí pronázou, chymotrypsinem a pepsinem v intenzitě a za podmínek dostatečných к rozkladu proteinu.
- 2. Způsob podle bodu 1, vyznačený tím, že se na ve vodě nerozpustnou látku působí deoxyribonukieázou v koncentraci 0,01 až 0,25 ing/ml a ribonukleázou v koncentraci 0,001 až 0.015 mg/ml při teplotě 25 až 39 °C po dobu 2 až 5 hodin a potom pronázou E v koncentraci 0,1 až 1,5 mg/ml, chymotrypsinem v koncentraci 0,05 až 0,65 mg/ /mililitru a pepsinem v koncentraci 0,0002 až 0,005 mg/ml při teplotě 25 až 39 °C po dobu 2 až 24 hodiny.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7803978A JPS557014A (en) | 1978-06-29 | 1978-06-29 | Antitumor agent and its preparation |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CS235079B2 true CS235079B2 (en) | 1985-04-16 |
Family
ID=13650677
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CS794488A CS235079B2 (en) | 1978-06-29 | 1979-06-28 | Method of antitumour substance preparation |
Country Status (10)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4242326A (cs) |
| JP (1) | JPS557014A (cs) |
| CA (1) | CA1135640A (cs) |
| CH (1) | CH641354A5 (cs) |
| CS (1) | CS235079B2 (cs) |
| DE (1) | DE2926406A1 (cs) |
| FR (1) | FR2429594A1 (cs) |
| GB (1) | GB2025768B (cs) |
| IT (1) | IT1119922B (cs) |
| SE (1) | SE449439B (cs) |
Families Citing this family (14)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4479935A (en) * | 1980-04-22 | 1984-10-30 | Institut Pasteur | Fractions extracted from aerobic bacteria, endowed with antitumoral, antibacterial and interferon inducing properties, and process for their preparation |
| JPS58222026A (ja) * | 1982-06-18 | 1983-12-23 | Masahiro Yoshimura | 抗ガン性物質 |
| JPS6169725A (ja) * | 1984-09-13 | 1986-04-10 | Juzo Udaka | 抗腫瘍性物質ｓｐｆ−１４０及びその製法 |
| US4978622A (en) * | 1986-06-23 | 1990-12-18 | Regents Of The University Of California | Cytophaga-derived immunopotentiator |
| US5010062A (en) * | 1989-09-25 | 1991-04-23 | Vanderbilt University | Therapeutic agent and method of inhibiting vascularization of tumors |
| ES2027518A6 (es) * | 1990-12-18 | 1992-06-01 | Andromaco Lab | Procedimiento para la preparacion de nuevas asociaciones no covalentes polisacarido-proteina con actividad farmacologica. |
| US5811403A (en) * | 1996-09-30 | 1998-09-22 | Vanderbilt University | Polysaccharide toxin from Group B β-hemolytic Streptococcus (GBS) having improved purity |
| JPH10139670A (ja) * | 1996-11-11 | 1998-05-26 | Terukuni Yakida | インターロイキン１２誘導物質及び医薬組成物 |
| US6670337B1 (en) | 1998-01-29 | 2003-12-30 | Yeda Reaearch And Development Co., Ltd. | Facilitation of wound healing with CM101/GBS toxin |
| US5981508A (en) | 1997-01-29 | 1999-11-09 | Vanderbilt University | Facilitation of repair of neural injury with CM101/GBS toxin |
| US6028060A (en) | 1997-01-29 | 2000-02-22 | Vanderbilt University | Treatment of chronic inflammatory diseases with CM101/GBS toxin |
| US5858991A (en) * | 1997-01-29 | 1999-01-12 | Vanderbilt University | Facilitation of wound healing with CM101/GBS toxin |
| US6803448B1 (en) * | 1998-07-22 | 2004-10-12 | Vanderbilt University | GBS toxin receptor |
| US8609614B2 (en) * | 1998-07-22 | 2013-12-17 | Vanderbilt University | GBS toxin receptor compositions and methods of use |
Family Cites Families (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB1132676A (en) * | 1966-03-08 | 1968-11-06 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Anti-tumour preparation and process for preparing the same |
| GB1153113A (en) | 1967-01-20 | 1969-05-21 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Method of Treating Hemolytic Streptococci and the Resultant Preparation containing the same |
| GB1163865A (en) * | 1967-02-01 | 1969-09-10 | Kyowa Hakko Kogyo Kk | Process for the preparation of Anti-Tumor Substances |
| US3632746A (en) * | 1967-08-30 | 1972-01-04 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Dried stable anti-tumor preparations and process for preparing the same |
| JPS4843841B1 (cs) * | 1969-09-06 | 1973-12-21 | ||
| JPS496096B1 (cs) * | 1970-09-30 | 1974-02-12 | ||
| NL7505398A (nl) * | 1974-05-08 | 1975-11-11 | Wellcome Found | Werkwijze voor het bereiden van glucopeptiden. |
-
1978
- 1978-06-29 JP JP7803978A patent/JPS557014A/ja active Granted
-
1979
- 1979-06-14 GB GB7920677A patent/GB2025768B/en not_active Expired
- 1979-06-18 US US06/049,744 patent/US4242326A/en not_active Expired - Lifetime
- 1979-06-22 IT IT68342/79A patent/IT1119922B/it active
- 1979-06-26 CA CA000330751A patent/CA1135640A/en not_active Expired
- 1979-06-27 FR FR7916586A patent/FR2429594A1/fr active Granted
- 1979-06-28 SE SE7905703A patent/SE449439B/sv not_active IP Right Cessation
- 1979-06-28 CS CS794488A patent/CS235079B2/cs unknown
- 1979-06-29 DE DE19792926406 patent/DE2926406A1/de active Granted
- 1979-06-29 CH CH611479A patent/CH641354A5/de not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS6169B2 (cs) | 1986-01-06 |
| SE7905703L (sv) | 1979-12-30 |
| SE449439B (sv) | 1987-05-04 |
| CH641354A5 (de) | 1984-02-29 |
| FR2429594B1 (cs) | 1983-04-01 |
| JPS557014A (en) | 1980-01-18 |
| FR2429594A1 (fr) | 1980-01-25 |
| GB2025768B (en) | 1982-11-24 |
| IT7968342A0 (it) | 1979-06-22 |
| DE2926406A1 (de) | 1980-01-10 |
| GB2025768A (en) | 1980-01-30 |
| US4242326A (en) | 1980-12-30 |
| IT1119922B (it) | 1986-03-19 |
| CA1135640A (en) | 1982-11-16 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CA1217136A (en) | Refined detoxified endotoxin product | |
| Smith et al. | New histone kinases in nuclei of rat tissues | |
| CS235079B2 (en) | Method of antitumour substance preparation | |
| Fukushi et al. | Extraction and purification of endotoxin from Enterobacteriaceae: a comparison of selected methods and sources | |
| WO2021135544A1 (zh) | 一种普洱茶树叶片内生芽孢杆菌及其应用 | |
| Heckly et al. | TOXINS OF PSEUDOMONAS PSEUDOMALLEI II: Characterization | |
| US4812441A (en) | Hypocholesterolemically active protein derived from streptococcus | |
| CA1277617C (en) | Antibiotic polypeptide, process for preparing it and the use thereof | |
| US4645667A (en) | Antitumor agent and process for manufacturing said agent | |
| Ye et al. | Biochemical characterization of a proteoglycan complex from an edible mushroom Ganoderma lucidum fruiting bodies and its immunoregulatory activity | |
| US6136789A (en) | Polysaccharide toxin from group B -62 hemolytic streptococcus (GBS) having improved purity | |
| Huff | Lipoteichoic acid, a major amphiphile of Gram-positive bacteria that is not readily extractable | |
| US11926853B2 (en) | Botulinum toxin producing method | |
| US4209507A (en) | Novel anti-tumor substance and preparation thereof | |
| US4900724A (en) | Tumor necrosis factor inducing substance derived from acid-fast bacteria | |
| US4656037A (en) | SPF-100 and process for the preparation thereof | |
| CA1100876A (en) | Use of a nitrogen-containing polysaccharide for promoting drug-sensitivity of bacteria resistant to antibiotics | |
| JPH04300898A (ja) | 新規糖タンパク複合体およびその製造方法 | |
| Nerkar et al. | Stimulation of macrophages and antitumor activity of radiodetoxified endotoxin | |
| KR860001213B1 (ko) | 제암 및 면역자극 작용을 갖는 물질의 제조방법 | |
| KR820001848B1 (ko) | 항종양성(抗腫瘍性) 물질의 제조법 | |
| FR2536280A1 (fr) | Composition pharmaceutique et procede pour le traitement de tumeurs | |
| EP0186482A2 (en) | Hypocholesterolemically active RNA fractions | |
| JP3029331B2 (ja) | 動物細胞生育促進剤 | |
| JPH0525055A (ja) | 血圧降下剤 |