JP3029331B2 - 動物細胞生育促進剤 - Google Patents
動物細胞生育促進剤Info
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- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】この発明は動物細胞生育促進剤、
それを含有する培地およびそれを使用する培養法に関す
るものである。
それを含有する培地およびそれを使用する培養法に関す
るものである。
【０００２】
【従来の技術・発明が解決しようとする課題】近年分子
生物学の発展と相まって動物細胞培養の必要性が著しい
増加を示している。動物細胞の培養は、例えば細胞融
合、モノクローナル抗体の製造、ワクチンの製造等に広
く使用され、研究のみでなく、疾病治療薬製造の先端技
術として、社会的にも強くその発展が要請されている生
物技術である。ところが動物細胞の培養には仔牛血清の
使用が最適とされている。しかし本血清は極めて高価で
あり、また蛋白質含量が高いため滅菌操作が非常に繁雑
（高温滅菌が不可能）であるという欠点がある。また血
清の品質により培養条件および生育が大きく左右される
ことが動物細胞を用いた研究およびその応用に大きな障
害となっている。そのため、培養方法の改良、簡便化に
関する研究も盛んに行われており、無血清培養法に関す
る報告も多く提出されている。しかし、この場合も、用
いられる培地の中に、血清から分離されたＣＧＦの添加
を必須とするものがほとんどで、取り扱いおよび価格の
点で未完成の状態にあるのが現状である。したがって、
もし血清または血清成分であるＣＧＦの使用が最小限に
抑えられるならば、安価に培養でき、取り扱いも容易に
なり、動物細胞培養法に画期的な貢献ができることにな
る。この発明は、このような貢献を目的としてなされた
ものである。
生物学の発展と相まって動物細胞培養の必要性が著しい
増加を示している。動物細胞の培養は、例えば細胞融
合、モノクローナル抗体の製造、ワクチンの製造等に広
く使用され、研究のみでなく、疾病治療薬製造の先端技
術として、社会的にも強くその発展が要請されている生
物技術である。ところが動物細胞の培養には仔牛血清の
使用が最適とされている。しかし本血清は極めて高価で
あり、また蛋白質含量が高いため滅菌操作が非常に繁雑
（高温滅菌が不可能）であるという欠点がある。また血
清の品質により培養条件および生育が大きく左右される
ことが動物細胞を用いた研究およびその応用に大きな障
害となっている。そのため、培養方法の改良、簡便化に
関する研究も盛んに行われており、無血清培養法に関す
る報告も多く提出されている。しかし、この場合も、用
いられる培地の中に、血清から分離されたＣＧＦの添加
を必須とするものがほとんどで、取り扱いおよび価格の
点で未完成の状態にあるのが現状である。したがって、
もし血清または血清成分であるＣＧＦの使用が最小限に
抑えられるならば、安価に培養でき、取り扱いも容易に
なり、動物細胞培養法に画期的な貢献ができることにな
る。この発明は、このような貢献を目的としてなされた
ものである。
【０００３】
【課題を解決するための手段】すなわち、この発明は、 （１）下記特性 水分４１．８％の状態における組成 アミノ態窒素化合物 ２１．５％ 糖 ３３．０％ 灰分 ３．４％ 紫外線吸収スペクトル（図１） ２１０ｎｍおよび２８０ｎｍに極大吸収を有する。 赤外線吸収スペクトル（図２） ＣＯ−ＮＨ、ＣＯＯＨ、Ｃ−ＯＨの存在が認められる。 溶剤に対する溶解性 水に可溶。 アルコールに僅かに可溶。 ｐＨ安定性 ｐＨ２〜１２で安定。 温度安定性 １００〜１２０℃、３０分間の処理で安定。 水溶液の色調 無色〜淡褐色 生理活性 脳下垂体刺激活性を有する。 を有するリゾプス属菌生産物質であるＲＵ物質を有効成
分とする、動物細胞生育促進剤、（２）上記（１）記載
の動物細胞生育促進剤を含有する、動物細胞培養培地、
および（３）動物細胞を培養するにあたり、上記（１）
記載の動物細胞生育促進剤を動物細胞に接触することを
特徴とする、動物細胞培養法を提供するものである。
分とする、動物細胞生育促進剤、（２）上記（１）記載
の動物細胞生育促進剤を含有する、動物細胞培養培地、
および（３）動物細胞を培養するにあたり、上記（１）
記載の動物細胞生育促進剤を動物細胞に接触することを
特徴とする、動物細胞培養法を提供するものである。
【０００４】この発明で使用するＲＵ物質は、ケカビ
目、クモノスカビ類に分類されるリゾプス（Ｒｈｉｚｏ
ｐｕｓ）属の菌体を温水抽出して得られる物質として知
られている。この物質は、間脳系を経由して脳下垂体を
刺激し、高等動物の繁殖障害の治療や産卵率の向上に役
立つ活性を有することが知られている（横浜医学第２１
巻第３９９頁、１９７０年）。このような活性に基づい
て、ＲＵ物質はうずらの精巣の発育促進、鶏の産卵率の
向上等に顕著な効果を示し、経口投与による飼料添加剤
として広く利用されている。また、家畜の繁殖障害、下
痢の治療にも卓越した効果が知られている。
目、クモノスカビ類に分類されるリゾプス（Ｒｈｉｚｏ
ｐｕｓ）属の菌体を温水抽出して得られる物質として知
られている。この物質は、間脳系を経由して脳下垂体を
刺激し、高等動物の繁殖障害の治療や産卵率の向上に役
立つ活性を有することが知られている（横浜医学第２１
巻第３９９頁、１９７０年）。このような活性に基づい
て、ＲＵ物質はうずらの精巣の発育促進、鶏の産卵率の
向上等に顕著な効果を示し、経口投与による飼料添加剤
として広く利用されている。また、家畜の繁殖障害、下
痢の治療にも卓越した効果が知られている。
【０００５】この発明で使用するＲＵ物質を得るには、
リゾプス属に属するＲＵ物質生産菌、例えばリゾプス・
Ｕ−１（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ Ｕ−１）を培地に培養す
る。上記生産菌は、例えば工業技術院微生物工業技術研
究所に微工研菌与第３６４６号として寄託されている。
また本発明の方法によりリゾプス・バタタス・ナカザワ
（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｂａｔａｔａｓ Ｎａｋａｚａｗ
ａ ＩＦＯ ４７４４），リゾプス・チネシス・サイト
ウ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｃｈｉｎｅｓｉｓ Ｓａｉｔ
ｏ，ＩＦＯ ４７３７），リゾプス・デレマア・ウェー
マー（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｄｅｌｅｍａｒ Ｗｅｈｍｅ
ｒｅｔ Ｈａｎｚａｗａ， ＩＦＯ ４６９７），リゾ
プス・ホルモセンシス・ナカザワ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ
ｆｏｒｍｏｓｅｎｓｉｓ Ｎａｋａｚａｗａ，ＩＦＯ４
７３２），リゾプス・ジャポニスカ・ブレイレミン（Ｒ
ｈｉｚｏｐｕｓ ｊａｐｏｎｉｃｕｓ Ｖｕｌｌｅｍｉ
ｎ，ＩＦＯ ４６９７），リゾプス・ジャバニカス・タ
ケダ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｊａｖａｎｉｃｕｓ Ｔａｋ
ｅｄａ，ＩＦＯ ５４４１）リゾプス・ニグリカンス・
エーレンベルグ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｎｉｇｒｉｃａｎ
ｓ Ｅｈｒｅｎｂｅｒｇ，ＩＦＯ ４７８１），リゾプ
ス・オリーゼ・ウエント（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｏｒｙｚ
ａｅ Ｗｅｎｔ ｅｔ Ｂｉｎｓｅｎ−Ｇｅｅｒｉｉｇ
ｓ，ＩＦＯ４７０５），リゾプス・トンキネンシス・ブ
レイミン（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｔｏｎｋｉｎｅｎｓｉｓ
Ｖｕｉｌｌｅｍｉｎ，ＩＦＯ５４３８）等についても
製造した製品は何れも以上述べたと同様の効果が認めら
れた。これらの菌株は醗酵研究所から入手することがで
きる。培養方法は、原則的には一般微生物の培養方法に
準ずるが、通常は固体または液体培地による好気的培養
が有利である。培地組成には蒸煮ふすま、米糠、脱脂大
豆、綿実粉等の天然物や澱粉、グルコース、アラビノー
ス、キシロース等の糖類、硫酸アンモニウム、硝酸ナト
リウム、ペプトン、麦芽エキス、酵母エキス等の窒素
源、無機燐酸塩、マグネシウム塩、カルシウム塩等の無
機塩類を添加することができる。培養は１０〜４２℃、
好ましくは２６〜２８℃の温度、４〜９、好ましくは４
〜７のｐＨで、３〜１０日間好気的に行うのが適当であ
る。ＲＵ物質は培養物中に蓄積し、一般に５〜８日の培
養で最高に達する。培養物中からＲＵ物質を採取するに
は、従来から行われている天然物の分離採取法を適用す
ればよい。すなわち、液体培養物をろ過して菌体を除取
し、菌体を２０〜１００℃好ましくは約８０℃の温水で
抽出し、又固体培養なら、固形物を好ましくは５〜１０
倍量の温水で抽出し、必要に応じて透析のような手段で
低分子物質を除去し、こうして得られたＲＵ物質含有溶
液から濃縮、凍結乾燥等により溶媒を除くと、ＲＵ物質
が得られる。本品は慣用される精製法を適宜組合わせて
精製することができる。
リゾプス属に属するＲＵ物質生産菌、例えばリゾプス・
Ｕ−１（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ Ｕ−１）を培地に培養す
る。上記生産菌は、例えば工業技術院微生物工業技術研
究所に微工研菌与第３６４６号として寄託されている。
また本発明の方法によりリゾプス・バタタス・ナカザワ
（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｂａｔａｔａｓ Ｎａｋａｚａｗ
ａ ＩＦＯ ４７４４），リゾプス・チネシス・サイト
ウ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｃｈｉｎｅｓｉｓ Ｓａｉｔ
ｏ，ＩＦＯ ４７３７），リゾプス・デレマア・ウェー
マー（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｄｅｌｅｍａｒ Ｗｅｈｍｅ
ｒｅｔ Ｈａｎｚａｗａ， ＩＦＯ ４６９７），リゾ
プス・ホルモセンシス・ナカザワ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ
ｆｏｒｍｏｓｅｎｓｉｓ Ｎａｋａｚａｗａ，ＩＦＯ４
７３２），リゾプス・ジャポニスカ・ブレイレミン（Ｒ
ｈｉｚｏｐｕｓ ｊａｐｏｎｉｃｕｓ Ｖｕｌｌｅｍｉ
ｎ，ＩＦＯ ４６９７），リゾプス・ジャバニカス・タ
ケダ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｊａｖａｎｉｃｕｓ Ｔａｋ
ｅｄａ，ＩＦＯ ５４４１）リゾプス・ニグリカンス・
エーレンベルグ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｎｉｇｒｉｃａｎ
ｓ Ｅｈｒｅｎｂｅｒｇ，ＩＦＯ ４７８１），リゾプ
ス・オリーゼ・ウエント（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｏｒｙｚ
ａｅ Ｗｅｎｔ ｅｔ Ｂｉｎｓｅｎ−Ｇｅｅｒｉｉｇ
ｓ，ＩＦＯ４７０５），リゾプス・トンキネンシス・ブ
レイミン（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｔｏｎｋｉｎｅｎｓｉｓ
Ｖｕｉｌｌｅｍｉｎ，ＩＦＯ５４３８）等についても
製造した製品は何れも以上述べたと同様の効果が認めら
れた。これらの菌株は醗酵研究所から入手することがで
きる。培養方法は、原則的には一般微生物の培養方法に
準ずるが、通常は固体または液体培地による好気的培養
が有利である。培地組成には蒸煮ふすま、米糠、脱脂大
豆、綿実粉等の天然物や澱粉、グルコース、アラビノー
ス、キシロース等の糖類、硫酸アンモニウム、硝酸ナト
リウム、ペプトン、麦芽エキス、酵母エキス等の窒素
源、無機燐酸塩、マグネシウム塩、カルシウム塩等の無
機塩類を添加することができる。培養は１０〜４２℃、
好ましくは２６〜２８℃の温度、４〜９、好ましくは４
〜７のｐＨで、３〜１０日間好気的に行うのが適当であ
る。ＲＵ物質は培養物中に蓄積し、一般に５〜８日の培
養で最高に達する。培養物中からＲＵ物質を採取するに
は、従来から行われている天然物の分離採取法を適用す
ればよい。すなわち、液体培養物をろ過して菌体を除取
し、菌体を２０〜１００℃好ましくは約８０℃の温水で
抽出し、又固体培養なら、固形物を好ましくは５〜１０
倍量の温水で抽出し、必要に応じて透析のような手段で
低分子物質を除去し、こうして得られたＲＵ物質含有溶
液から濃縮、凍結乾燥等により溶媒を除くと、ＲＵ物質
が得られる。本品は慣用される精製法を適宜組合わせて
精製することができる。
【０００６】こうして得られるＲＵ物質は、前記のよう
な特性を示し、動物細胞に対してＣＧＦ（Ｃｅｌｌ Ｇ
ｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ）としての活性を有する物質
である。この物質は、ほとんど全ての動物培養細胞、例
えば各種動物組織細胞、動物細胞由来のハイブリドー
マ、リンパ球、悪性腫瘍細胞に対して生育促進作用を有
する。したがって、ＲＵ物質は動物細胞生育促進剤とし
て使用することができる。また、上記の活性に基づき、
ＲＵ物質は、動物細胞培養培地に使用することができ
る。この培地は、一般に使用される培地成分に加えて、
ＲＵ物質を含有するものである。含有量は、希釈率とし
て１０〜１０8倍が適当であり、１０3〜１０6倍が好ま
しい。一般に使用される培地としては、例えばＢＭＥ培
地、ＭＥＭ培地、１９９培地、ハム培地、ＲＰＭＩ−１
６２９培地、マツコイ５Ａ培地、ウエイマウス培地、ウ
イリアムスＥ培地、Ｌ−１５培地、ＣＭＲＬ１０６６培
地、フイッシャー培地、トロウェル培地、ＮＣＴＣ１３
５培地、パックＮ培地、グレイス培地、ウオルフ・クイ
ンビー培地等が含まれる。さらに、ＲＵ物質は、動物細
胞と接触させることによる細胞生育促進法に使用するこ
とができる。
な特性を示し、動物細胞に対してＣＧＦ（Ｃｅｌｌ Ｇ
ｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ）としての活性を有する物質
である。この物質は、ほとんど全ての動物培養細胞、例
えば各種動物組織細胞、動物細胞由来のハイブリドー
マ、リンパ球、悪性腫瘍細胞に対して生育促進作用を有
する。したがって、ＲＵ物質は動物細胞生育促進剤とし
て使用することができる。また、上記の活性に基づき、
ＲＵ物質は、動物細胞培養培地に使用することができ
る。この培地は、一般に使用される培地成分に加えて、
ＲＵ物質を含有するものである。含有量は、希釈率とし
て１０〜１０8倍が適当であり、１０3〜１０6倍が好ま
しい。一般に使用される培地としては、例えばＢＭＥ培
地、ＭＥＭ培地、１９９培地、ハム培地、ＲＰＭＩ−１
６２９培地、マツコイ５Ａ培地、ウエイマウス培地、ウ
イリアムスＥ培地、Ｌ−１５培地、ＣＭＲＬ１０６６培
地、フイッシャー培地、トロウェル培地、ＮＣＴＣ１３
５培地、パックＮ培地、グレイス培地、ウオルフ・クイ
ンビー培地等が含まれる。さらに、ＲＵ物質は、動物細
胞と接触させることによる細胞生育促進法に使用するこ
とができる。
【０００７】以下、この発明の具体的実施態称を示す。 参考例１（ＲＵ物質の製造） Ｕ−１寄託菌株を上記のように培養して得たリゾプス醗
酵物に１０倍量の水を加え８０℃で１時間温水浸出し、
ろ過し、ろ液を６０℃以下で減圧濃縮した。濃縮物をさ
らにエーテルで３日間連続抽出器を用いて抽出を行い、
エーテル可溶物を除去する。エーテル不溶物は更に１０
倍量の水を加えて再びろ過し、ろ液を６０℃以下で減圧
濃縮するとリゾプス醗酵物のエーテル不溶、水可溶の濃
縮物が得られる。この濃縮物（ＲＵ物質）の収量は醗酵
生産物に対し約１０％である。
酵物に１０倍量の水を加え８０℃で１時間温水浸出し、
ろ過し、ろ液を６０℃以下で減圧濃縮した。濃縮物をさ
らにエーテルで３日間連続抽出器を用いて抽出を行い、
エーテル可溶物を除去する。エーテル不溶物は更に１０
倍量の水を加えて再びろ過し、ろ液を６０℃以下で減圧
濃縮するとリゾプス醗酵物のエーテル不溶、水可溶の濃
縮物が得られる。この濃縮物（ＲＵ物質）の収量は醗酵
生産物に対し約１０％である。
【０００８】実施例１ ベロ細胞の培養を次のように行った。イーグルのＭＥＭ
培地〔サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）第１３０巻第４３
２頁（１９５９年）〕９．４ｇに、Ｌ−グルタミン酸
０．３ｇ、ＮａＨＣＯ3 ２．２ｇ、トリプトースリン
酸ブロース（デイフコ社）２．９５ｇ、仔牛血清（ＦＣ
Ｓ）０〜８％を混合し、ミリポアフィルター（５）（ポ
アサイズ０．２μ）に通した蒸留水を加えて１ｌとし
た。ＲＵ物質は必要に応じ１０００〜１００００００倍
に希釈して倍地に加えた。培養は３７℃の炭酸ガスイン
キュベーター中で行い、細胞数の計測により生育を測定
した。また14Ｃ−標識アミノ酸および3Ｈ−標識チミジ
ンの取り込みを測定することにより蛋白合成能と核酸合
成能に対するＲＵ物質の効果を検定した。
培地〔サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）第１３０巻第４３
２頁（１９５９年）〕９．４ｇに、Ｌ−グルタミン酸
０．３ｇ、ＮａＨＣＯ3 ２．２ｇ、トリプトースリン
酸ブロース（デイフコ社）２．９５ｇ、仔牛血清（ＦＣ
Ｓ）０〜８％を混合し、ミリポアフィルター（５）（ポ
アサイズ０．２μ）に通した蒸留水を加えて１ｌとし
た。ＲＵ物質は必要に応じ１０００〜１００００００倍
に希釈して倍地に加えた。培養は３７℃の炭酸ガスイン
キュベーター中で行い、細胞数の計測により生育を測定
した。また14Ｃ−標識アミノ酸および3Ｈ−標識チミジ
ンの取り込みを測定することにより蛋白合成能と核酸合
成能に対するＲＵ物質の効果を検定した。
【０００９】８％のＦＣＳを添加した培地で前培養した
ベロ細胞を、２％ＦＣＳ培地下で、ＲＵ物質を１０００
倍〜１０6倍希釈で添加して培養したときの、細胞増殖
数を測定した。結果を図３に示す。ＲＵ物質無添加に比
較して、１０-5希釈のＲＵ物質添加では、６日目で２倍
の細胞数を示した。また、ＲＵ物質１０-6の濃度でさえ
高い効果を示した。１０-4〜１０-3と濃度が高くなると
かえって生育が抑制される傾向を示したが、この濃度で
もＲＵ物質添加時より高い生育度を示した。さらに、Ｒ
Ｕ物質無添加では６〜７日目になると細胞が死亡しはじ
めるのに対し、ＲＵ物質添加によりこの細胞減少が著し
く抑制され、細胞の活度の上昇を示した。なお、ＦＣＳ
無添加の場合もＲＵ物質添加により培養６〜７日目で顕
著に細胞数が増加した。この場合ＲＵ物質無添加では生
育は全く認められなかった。以上の結果から、ＲＵ物質
中にはＦＣＳに替わり得る生育促進物質が存在すること
が明らかになった。
ベロ細胞を、２％ＦＣＳ培地下で、ＲＵ物質を１０００
倍〜１０6倍希釈で添加して培養したときの、細胞増殖
数を測定した。結果を図３に示す。ＲＵ物質無添加に比
較して、１０-5希釈のＲＵ物質添加では、６日目で２倍
の細胞数を示した。また、ＲＵ物質１０-6の濃度でさえ
高い効果を示した。１０-4〜１０-3と濃度が高くなると
かえって生育が抑制される傾向を示したが、この濃度で
もＲＵ物質添加時より高い生育度を示した。さらに、Ｒ
Ｕ物質無添加では６〜７日目になると細胞が死亡しはじ
めるのに対し、ＲＵ物質添加によりこの細胞減少が著し
く抑制され、細胞の活度の上昇を示した。なお、ＦＣＳ
無添加の場合もＲＵ物質添加により培養６〜７日目で顕
著に細胞数が増加した。この場合ＲＵ物質無添加では生
育は全く認められなかった。以上の結果から、ＲＵ物質
中にはＦＣＳに替わり得る生育促進物質が存在すること
が明らかになった。
【００１０】実施例２ 上記実施例１と同様に培養を行ったベロ細胞の培養３日
目に14Ｃ−標識蛋白質加水分解物（アミノ酸混合物）お
よび3Ｈ−標識チミジンを添加し、同様に３７℃で１時
間炭酸ガスインキュベーター中で反応させ、トリクロル
酢酸不溶性画分に取り込まれた3Ｈおよび14Ｃの放射活
性を測定して、核酸および蛋白質の合成活性とした。結
果を表１に示す。実施例１で３回目まではＲＵ物質の添
加効果は顕著ではないにもかかわらず、蛋白質合成活性
はＲＵ物質１０-5添加で約１０％、１０-4で２０％の促
進効果、核酸の合成活性は１０-6〜１０-5のＲＵ物質添
加で約１０％、１０-4で１５％、１０-3で約３０％の促
進効果が認められた。さらに５日目から６日目の細胞を
用いた蛋白質合成能の促進は１０-4〜２×１０-4のＲＵ
物質の添加で２．２倍、核酸の合成は５×１０-6のＲＵ
物質の添加で４．６倍にも達した。また２の際、蛋白質
の合成活性至適濃度と核酸合成活性促進至適濃度には相
違が明確に認められることから、蛋白質の合成を促進す
る因子と核酸の合成を促進する因子は別個の物質として
ＲＵ物質中に含まれることが考えられる。表１からも明
らかなように、ＲＵ物質を前もってトリプシンで３７
℃、ｐＨ８で１２時間処理しても、蛋白質合成および核
酸合成活性の促進効果は変化しなかったことから、消化
酵素にも安定であることが示された。
目に14Ｃ−標識蛋白質加水分解物（アミノ酸混合物）お
よび3Ｈ−標識チミジンを添加し、同様に３７℃で１時
間炭酸ガスインキュベーター中で反応させ、トリクロル
酢酸不溶性画分に取り込まれた3Ｈおよび14Ｃの放射活
性を測定して、核酸および蛋白質の合成活性とした。結
果を表１に示す。実施例１で３回目まではＲＵ物質の添
加効果は顕著ではないにもかかわらず、蛋白質合成活性
はＲＵ物質１０-5添加で約１０％、１０-4で２０％の促
進効果、核酸の合成活性は１０-6〜１０-5のＲＵ物質添
加で約１０％、１０-4で１５％、１０-3で約３０％の促
進効果が認められた。さらに５日目から６日目の細胞を
用いた蛋白質合成能の促進は１０-4〜２×１０-4のＲＵ
物質の添加で２．２倍、核酸の合成は５×１０-6のＲＵ
物質の添加で４．６倍にも達した。また２の際、蛋白質
の合成活性至適濃度と核酸合成活性促進至適濃度には相
違が明確に認められることから、蛋白質の合成を促進す
る因子と核酸の合成を促進する因子は別個の物質として
ＲＵ物質中に含まれることが考えられる。表１からも明
らかなように、ＲＵ物質を前もってトリプシンで３７
℃、ｐＨ８で１２時間処理しても、蛋白質合成および核
酸合成活性の促進効果は変化しなかったことから、消化
酵素にも安定であることが示された。
【表１】
【００１１】実施例３ 実施例１および２と同様にベロ細胞を培養し、２４時間
毎に蛋白質の細胞内含有量を測定した結果を図４に示
す。蛋白質の定量は細胞を集めた後ローリー等の方法に
より比色法で行った。この結果実施例１で得られた細胞
増殖に対するＲＵ物質の効果と極めて類似した結果が得
られ、細胞内の蛋白質の合成が活発となり、その結果、
細胞内に蛋白質が蓄積されていることが認められた。
毎に蛋白質の細胞内含有量を測定した結果を図４に示
す。蛋白質の定量は細胞を集めた後ローリー等の方法に
より比色法で行った。この結果実施例１で得られた細胞
増殖に対するＲＵ物質の効果と極めて類似した結果が得
られ、細胞内の蛋白質の合成が活発となり、その結果、
細胞内に蛋白質が蓄積されていることが認められた。
【００１２】実施例４ ＲＵ物質中の細胞増殖促進因子の精製を行うために、吸
着樹脂を用いたカラムクロマトグラフィーを行った。Ｒ
Ｕ物質１ｇを酸性樹脂カラム（２．５×１０ｃｍ）に通
し、その後カラムを水で良く洗浄して非吸着画分を得
た。この画分は濃縮して塩基性樹脂カラム（２．５×１
０ｃｍ）に通し、カラムはさらに水で良く洗浄して非吸
着画分を得た。この画分は主成分として糖を含んでい
る。酸性カラムはその後１規定アンモニア水で吸着成分
を溶離し、これを全て集めてアンモニア臭がなくなるま
で凍結乾燥した。この画分はアミノ酸およびペプチド成
分である。塩基性カラムは１規定塩酸で吸着成分を溶離
し、凍結乾燥により塩酸を完全に除いた。この画分は酸
性アミノ酸、酸性ペプチド、および有機酸が含まれる。
これら画分の分離濃縮、乾燥操作には、促進物質が非常
に安定なのであらゆる方法が使用可能である。このよう
にして得られた３つの画分は元のＲＵ物質に相当する濃
度として保存される。
着樹脂を用いたカラムクロマトグラフィーを行った。Ｒ
Ｕ物質１ｇを酸性樹脂カラム（２．５×１０ｃｍ）に通
し、その後カラムを水で良く洗浄して非吸着画分を得
た。この画分は濃縮して塩基性樹脂カラム（２．５×１
０ｃｍ）に通し、カラムはさらに水で良く洗浄して非吸
着画分を得た。この画分は主成分として糖を含んでい
る。酸性カラムはその後１規定アンモニア水で吸着成分
を溶離し、これを全て集めてアンモニア臭がなくなるま
で凍結乾燥した。この画分はアミノ酸およびペプチド成
分である。塩基性カラムは１規定塩酸で吸着成分を溶離
し、凍結乾燥により塩酸を完全に除いた。この画分は酸
性アミノ酸、酸性ペプチド、および有機酸が含まれる。
これら画分の分離濃縮、乾燥操作には、促進物質が非常
に安定なのであらゆる方法が使用可能である。このよう
にして得られた３つの画分は元のＲＵ物質に相当する濃
度として保存される。
【００１３】実施例５ 実施例３で得られたアミノ酸ペプチド画分、有機酸画分
および糖画分について、ベロ細胞の増殖に与える効果
を、これまでのＲＵ物質の添加効果と同様の方法で検定
した。結果を図５に示す。図５に示すように、ＲＵ原液
相当として１０-5濃度で添加して細胞数の計測を行っ
た。その結果アミノ酸画分に極めて高い増殖促進効果が
認められた。一方有機酸および糖画分にもある程度の効
果が認められ、これらの効果は細胞の対数分裂を急速に
促進すると同時に最終的に細胞数をも極度に増加させる
という、２つの効果を持ち合わせていることが明らかと
なった。
および糖画分について、ベロ細胞の増殖に与える効果
を、これまでのＲＵ物質の添加効果と同様の方法で検定
した。結果を図５に示す。図５に示すように、ＲＵ原液
相当として１０-5濃度で添加して細胞数の計測を行っ
た。その結果アミノ酸画分に極めて高い増殖促進効果が
認められた。一方有機酸および糖画分にもある程度の効
果が認められ、これらの効果は細胞の対数分裂を急速に
促進すると同時に最終的に細胞数をも極度に増加させる
という、２つの効果を持ち合わせていることが明らかと
なった。
【図１】 ＲＵ物質の紫外線吸収スペクトルを示すグラ
フである。
フである。
【図２】 ＲＵ物質の赤外線吸収スペクトルを示すグラ
フである。
フである。
【図３】 実施例１における細胞数の変化を示すグラフ
である。
である。
【図４】 実施例３における蛋白質含量の変化を示すグ
ラフである。
ラフである。
【図５】 実施例５における細胞数の変化を示すグラフ
である。
である。
Claims (3)
- 【請求項１】 下記特性 水分４１．８％の状態における組成 アミノ態窒素化合物 ２１．５％ 糖 ３３．０％ 灰分 ３．４％ 紫外線吸収スペクトル（図１） ２１０ｎｍおよび２８０ｎｍに極大吸収を有する。 赤外線吸収スペクトル（図２） ＣＯ−ＮＨ、ＣＯＯＨ、Ｃ−ＯＨの存在が認められる。 溶剤に対する溶解性 水に可溶。 アルコールに僅かに可溶。 ｐＨ安定性 ｐＨ２〜１２で安定 温度安定性 １００〜１２０℃、３０分間の処理で安定。 水溶液の色調 無色〜淡褐色 生理活性 脳下垂体刺激活性を有する。 を有するリゾプス属菌生産物質であるＲＵ物質を有効成
分とする、動物細胞生育促進剤。 - 【請求項２】 請求項１記載の動物細胞生育促進剤を含
有する、動物細胞培養用培地。 - 【請求項３】 動物細胞を培養するにあたり、請求項１
記載の動物細胞生育促進剤を動物細胞に接触することを
特徴とする、動物細胞培養法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3262200A JP3029331B2 (ja) | 1991-10-09 | 1991-10-09 | 動物細胞生育促進剤 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3262200A JP3029331B2 (ja) | 1991-10-09 | 1991-10-09 | 動物細胞生育促進剤 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0597685A JPH0597685A (ja) | 1993-04-20 |
| JP3029331B2 true JP3029331B2 (ja) | 2000-04-04 |
Family
ID=17372475
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3262200A Expired - Lifetime JP3029331B2 (ja) | 1991-10-09 | 1991-10-09 | 動物細胞生育促進剤 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3029331B2 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2506307B2 (ja) * | 1993-04-27 | 1996-06-12 | 中島 三夫 | 生理機能活性剤 |
-
1991
- 1991-10-09 JP JP3262200A patent/JP3029331B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0597685A (ja) | 1993-04-20 |
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