JPH09241287A

JPH09241287A - 新規コラゲナーゼ阻害物質ｆｏ−５９０４及びその製造法

Info

Publication number: JPH09241287A
Application number: JP8045827A
Authority: JP
Inventors: Satoshi Omura; 智大村; Junji Inokoshi; 淳嗣猪腰; Haruki Yamada; 陽城山田; Rokurou Masuma; 碌郎増間
Original assignee: Kitasato Institute
Current assignee: Kitasato Institute
Priority date: 1996-03-04
Filing date: 1996-03-04
Publication date: 1997-09-16

Abstract

(57)【要約】【課題】安定でかつ毒性が低く、しかも酵素阻害活性
の強い、コラゲナーゼ阻害物質およびその製造法を得る
ものである。【解決手段】アスペルギラス属に属するコラゲナーゼ
阻害物質ＦＯ−５９０４を生産する能力を有する微生物
を、培地に培養して培養物中にコラゲナーゼ阻害物質Ｆ
Ｏ−５９０４を蓄積せしめ、該培養物からコラゲナーゼ
阻害物質ＦＯ−５９０４を採取する。【効果】コラゲナーゼ阻害物質は、抗リウマチ剤、抗
炎症剤、抗癌剤、抗インフルエンザウイルス感染に対す
る治療剤としての効果が期待される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明はヒト由来のコラゲナ
ーゼの活性を阻害する新規コラゲナーゼ阻害物質ＦＯ−
５９０４及びその製造法に関する。更に詳しく言えば、
本発明のコラゲナーゼ阻害物質は、抗リウマチ剤、抗炎
症剤、抗癌剤、抗インフルエンザウイルス感染に対する
治療剤として有用である。

【０００２】

【従来の技術】例えば慢性関節リウマチ（Ｒｈｅｕｍａ
ｔｏｉｄＡｒｔｈｒｔｉｓ；以下、時としてＲＡと略
称する）は、関節滑膜に生じる原因不明の慢性かつ進行
性の炎症性疾患であり、また、例えばインフルエンザは
毎年のように流行を繰り返す代表的なウイルス感染症で
あることは周知のとおりである。

【０００３】しかして、上記ＲＡの現在における治療剤
としては、非ステロイド性抗炎症剤たとえばアスピリ
ン、インドメタシン、ロキソプロフェンや、免疫調節剤
たとえばＤ−ペニシラン、ブシラミン、オーラノフェ
ン、免疫抑制剤たとえば４−カルバモイル１−β−Ｄ−
リボフラノシルイミダゾリウム−５−オレート（４−ｃ
ａｒｂａｍｏｙｌ−１−β−Ｄ−ｒｉｂｏｆｕｒａｎｏ
ｓｙｌｉｍｉｄａｚｏｒｉｕｍ−５−ｏｌａｔｅ）や、
ステロイド剤たとえばプレドニゾロン等が使用されてい
る。

【０００４】しかしながら、これらの治療剤は、いずれ
も疼痛や炎症等の症状を緩和させるのみであり、しか
も、単独投与では効果を発揮するわけではなく、対症的
に複数の薬剤が使用されている。また、非ステロイド性
抗炎症剤や免疫調節剤は、初期のＲＡ患者の治療に対し
ては効果的であるが、症状が進行した患者の治療に対し
ては効果が弱くなる傾向があり、また、免疫抑制剤やス
テロイド剤は副作用が強く、長期投与には適さない。こ
のような背景から、現在新しい作用メカニズムの抗慢性
関節リウマチ剤等の開発が強く望まれている。

【０００５】また、前記のウイルス感染症であるヒトの
インフルエンザは、特に高齢者や慢性の呼吸器疾患、心
疾患を持つ患者にとっては肺炎などへと進展し、しばし
ば致死的感染症となる。しかしながら、現在のところ、
未だ抗インフルエンザウイルスの感染に対する有効な治
療剤は提案されておらず、したがって、抗慢性関節リウ
マチ剤等と同様にその開発が強く望まれている。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】例えば、慢性関節リウ
マチの症状が進行した病変部では、コラゲナーゼ活性が
上昇していることが知られている〔堀久枝、永井
裕：コラゲナーゼと組織破壊、コラーゲン代謝と疾患
（永井裕、藤本大三郎編）、講談社サイエンティフ
ィック、１９８２、ｐ．８６−１０９〕。コラゲナーゼ
は細胞外マトリックスの主要な構成成分の一つであるコ
ラーゲンを分解し、関節組織の破壊を引き起こす。それ
故、コラゲナーゼ活性を阻害すればコラーゲンの分解を
抑制することができ、その結果、慢性関節リウマチの進
行を阻止し得るものと期待される。

【０００７】このような作用をする物質として、アクチ
ノニンなどの天然物や、バチマスタット（ＢＢ−９４）
などの合成品が知られている。しかしながら、これらの
物質は、関節組織内では安定な活性を発現せしめるには
至らない。かかる実情において、本発明はヒトの医学上
または社会問題の解決策として極めて重要であることに
鑑みて研究開発されたものである。

【０００８】従って、本発明はより安定でかつ毒性が極
めて低く、しかも当該酵素阻害活性の強い物質を提供す
るものである。更に本発明は、慢性の呼吸疾患や心疾患
を持つ患者が致死的感染症へ進展することを阻害する抗
インフルエンザウイルスの感染に対する有効な物質を提
供するものである。更にまた本発明は、アスペルギラス
属に属するコラゲナーゼ阻害物質ＦＯ−５９０４を生産
する能力を有する微生物を培地に培養して培養物中に該
阻害物質ＦＯ−５９０４を蓄積せしめ、該培養物からコ
ラゲナーゼ阻害物質ＦＯ−５９０４を採取する製造法を
提供するものである。

【０００９】

【課題を解決するための手段】そこで、本発明者らは、
新規なコラゲナーゼ阻害物質の探索を目的として種々の
土壌から菌株を分離し、その生産する代謝産物について
研究を続けた結果、千葉県船橋市の土壌から新たに分離
した糸状菌ＦＯ−５９０４菌株の培養物中に、コラゲナ
ーゼ活性を阻害する物質が産生されることを見出した。
次いで、該培養物からコラゲナーゼ阻害物質を分離、精
製した結果、その理化学的性質を有する物質は、他に見
当たらないことから、この物質をＦＯ−５９０４と呼称
すことにした。

【００１０】本発明は、かかる知見に基づいて完成され
たものであり、本発明のコラゲナーゼ阻害物質を生産す
る能力を有する微生物（以下、時としてＦＯ−５９０４
物質生産菌と称することがある）は、アスペルギラス
（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属に属するが、例えば本発
明者らが千葉県船橋市の土壌から分離したアスペルギラ
スニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ）Ｆ
Ｏ−５９０４株は、本発明に最も有効に使用される菌株
の一例であって、本菌株の菌学的性状を示すと下記の通
りである。

【００１１】Ｉ．形態的性質ツァペック寒天培地、麦芽汁寒天培地などで良好に生育
し、分生子の着生も良好である。また、２０％ショ糖ツ
ァペック・イースト寒天培地でも良好に生育する。麦芽
汁寒天培地に生育したコロニーを顕微鏡で観察すると、
菌糸は透明で隔壁を有しており、分生子柄は基底菌糸よ
り直生している。また、その基部には足細胞を生じる。
その頂端、頂のうは球状に膨らみ、淡褐色である。

【００１２】アスペルギラは、複列性でメトレ、フィア
ライドを生じる。それぞれ大きさは、１６〜２０×５〜
８μｍ、５〜８×４〜６μｍでメトレが頂のうの全表面
を覆う。フィアライドの上に分生子を連鎖して生じ、球
状の分生子頭を形成する。分生子は褐色、球形で刺状突
起を持ち、大きさは４〜６μｍである。

【００１３】II．各種培地上での培養性状各種培地上で２５℃、７日間培養した場合の肉眼的観察
結果を下記の表１に示す。

【００１４】

【表１】なお、上記表１中における全ての培地において、菌の生
育に伴う分泌液および菌核の形成は観察されなかった。

【００１５】III ．生理学的諸性質（１）最適生育条件本菌株の最適生育条件は、ｐＨ４〜９、温度１４〜３３
℃である。（２）生育の範囲本菌株の生育範囲は、ｐＨ２〜１０、温度１２〜３９℃
である。（３）好気性、嫌気性の区別好気性

【００１６】以上の形態的特徴、培養性状および生理的
性状に基づき、既知菌種との比較を試みた結果、本菌株
はアスペルギラスニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ
ｎｉｇｅｒ）に属することが明らかとなった。従って、
本菌株はアスペルギラスニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌ
ｕｓｎｉｇｅｒ）ＦＯ−５９０４と命名した。なお、
本菌株は、アスペルギラスニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌ
ｌｕｓｎｉｇｅｒ）ＦＯ−５９０４として工業技術院
生命工学工業技術研究所に寄託されている。受託番号は
８生寄文第７６号（ＦＥＲＭＰ−１５３９７）であ
る。

【００１７】本発明の好ましい菌株として、ＦＯ−５９
０４物質生産菌について説明したが、糸状菌の一般的性
状としての菌学上の性状はきわめて変異し易く、一定し
たものではなく、自然的にあるいは通常行われる紫外線
照射、Ｘ線照射または変異誘導体剤、例えばＮ−メチル
−Ｎ−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン、エチルメタン
スルホネートなどを用いる人工的変異手段により変異す
ることは周知の事実であり、このような人工的変異株は
勿論、自然変異株も含め、アスペルギラスニガー（Ａ
ｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ）ＦＯ−５９０４物
質を生産する能力を有する菌株はすべて本発明に使用す
ることができる。また、細胞融合、遺伝子操作などの細
胞工学的に変異させた菌株もＦＯ−５９０４物質生産菌
として包含される。

【００１８】本発明においては、先ずアスペルギラス
ニガー属に属するＦＯ−５９０４物質生産菌が、適当な
培地に培養される。本菌の培養においては、通常の糸状
菌の培養方法が一般に適用される。培地としては微生物
が同化し得る炭素源、資化し得る窒素源および無機物、
さらに必要に応じてその他の栄養物を程よく含有する合
成培地または天然培地を使用することができる。このよ
うに、培地に使用される炭素源および窒素源としては、
使用菌株の利用可能なものならば、いずれの種類でも用
いられる。

【００１９】上記の同化し得る炭素源としては、グリセ
リン、グルコース、ガラクトース、フルクトース、マン
ノース、キシロース、リボース、澱粉、糖密、デキスト
リン、セルロース、コーン・スティープ・リカーまたは
その加水分解物等の種々の炭水化物が利用できる。そし
て、その濃度は通常、培地に対して０．１〜５．０％が
好ましい。また、グルコン酸、ピルビン酸、乳酸、酢酸
等の各種の有機酸、グリシン、グルタミン酸、アスパラ
ギン酸等の各種アミノ酸、さらにはメタノール、エタノ
ール等のアルコール類やノルマルパラフィン等の各種の
非芳香属炭化水素、あるいは植物もしくは動物性の各種
油脂等も使用することができる。

【００２０】資化し得る窒素源としては、例えば市販さ
れているアンモニア、塩化アンモニウム、硝酸アンモニ
ウム、硫酸アンモニウム、燐酸アンモニウム等の各種の
無機酸あるいは有機酸のアンモニウム塩類、尿素、ペプ
トン、肉エキス、コーン・スティープ・リカー、酵母エ
キス、乾燥酵母、ＮＺ−アミン、大豆粉、綿実粉、落花
生粉あるいはその消化物、カゼインあるいはその水解物
などの有機窒素源、さらにはグリシン、グルタミン酸、
アラニン等の各種アミノ酸が単独または組み合わせて用
いられる。

【００２１】無機物としては、例えばナトリウム塩、カ
リウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩、リン酸塩な
どの無機塩類が添加される。その他必要に応じて微量の
金属塩、消泡剤としての動物・植物・鉱物油等を添加す
ることもできる。更に、培地には、必要に応じて、本菌
の生育や物質ＦＯ−５９０４の生産を促進する微量栄養
素、発育促進物質、前駆物質を適当に添加してもよい。
この種の栄養素は、天然物を含む培地を使用する場合に
は、特に必要としない場合がある。

【００２２】培養は通常振とうまたは通気攪拌培養など
の好気的条件下で行うのがよい。通常は静置培養で行う
のが好ましい。工業的には深部通気攪拌培養が好まし
い。培地のｐＨは５．０〜８．０であるが、好ましくは
ｐＨ６．５付近で培養を行うのがよい。培養温度は２０
〜３２℃の範囲でも行い得るが、通常は２６〜３０℃、
好ましくは２７℃付近に保つのがよい。培養時間は、液
体培養の場合、通常７〜１０日培養を行うと、本物質Ｆ
Ｏ−５９０４が生成蓄積されので、好ましくは培養中の
蓄積量が最大に達したときに培養を終了すればよい。

【００２３】これらの培養組成、培地の液性、培養温
度、攪拌速度、通気量などの培養条件は使用する菌株の
種類や外部の条件などに応じて好ましい結果が得られる
ように適宜調節、選択されることはいうまでもない。液
体培養において発泡があるときは、シリコン油、植物
油、界面活性剤などの消泡剤を適宜使用してもよい。

【００２４】このようにして得られた培養物中に蓄積さ
れた物質ＦＯ−５９０４は、培養濾液または培養菌体中
に含まれているので、培養濾液を必要に応じて濾過補助
剤、例えばセライト、ハイフロースーパーセル等を加え
て濾過するか、または遠心分離して培養濾液と菌体とに
分離し、培養濾液と菌体との有機溶媒抽出物を濃縮した
ものの中から物質ＦＯ−５９０４を採取するのが有利で
ある。

【００２５】また、培養濾液および菌体を分離しない
で、そのまま非親水性有機溶媒により抽出することがで
きる。更にまた、物質ＦＯ−５９０４の含有量が培養濾
液と菌体のどちらかに極端に多いときはその多いほうか
ら抽出してもよい。培養菌体から物質ＦＯ−５９０４を
分離精製するためには、通常、培養濾液と菌体の有機溶
媒抽出物を濃縮した物の混合物またはそれぞれを非浸水
性溶媒、例えば酢酸エチル、クロロホルムで抽出するこ
とにより、物質ＦＯ−５９０４が有機溶媒に転溶され
る。

【００２６】このようにして得られた有機溶媒層は、必
要に応じ種々の脱水剤、たとえば無水硫酸ナトリウム、
ビーズゲルなどを加えて脱水された後、減圧下で有機溶
媒が留去される。この濃縮操作において物質ＦＯ−５９
０４は、安定な物質であるが、通常加熱温度を４０℃以
下となるように行うのが好ましい。残渣にヘキサン、石
油エーテルなどの有機溶媒を加えて物質ＦＯ−５９０４
を沈澱させることができる。

【００２７】得られた沈澱物は数回ヘキサンなどで洗浄
後、吸引濾過または遠心分離により物質ＦＯ−５９０４
の粗製物を採取することができる。この粗製物をさらに
精製するためには、物質ＦＯ−５９０４と混雑物との溶
解度の差や混じり合わない二液相関の分配の差や各種吸
着担体に対する吸着力の差を利用した多くの手段が可能
であるが、特にクロマトグラフィーは物質ＦＯ−５９０
４の精製に有効な方法である。

【００２８】物質ＦＯ−５９０４の精製に有効なクロマ
トグラフィーとしては、シリカゲル、アルミナ、活性炭
セルロース、ヒドロキシアパタイト、ＨＰ−２０などの
吸着樹脂などによる吸着クロマトグラフィー、シラン化
シリカゲル、オクタデシルシラン化シリカゲルなどを用
いる逆相分配クロマトグラフィー、セファデックスＬＨ
−２０、トヨパール（商品名、東ソー社製、日本）など
を用いる分子ふるいにもとずくゲル濾過クロマトグラフ
ィーなどが挙げられる。

【００２９】物質ＦＯ−５９０４はこれらのクロマトグ
ラフィーや電気泳動、向流分配、限外濾過などの手段
を、単独あるいは任意の順序にて組み合わせ、または反
復して用いることにより、分離精製することができる。
例えば上記の粗製物を少量のクロロホルムに溶かし、シ
リカゲルに吸着させ、クロロホルム−アセトン系混合溶
液を用いてカラムクロマトグラフィーを行い、その活性
画分を減圧濃縮後、少量のメタノールに溶かし、これを
メタノールで分子ふるいにもとずくゲル濾過クロマトグ
ラフィーを行うことによりＦＯ−５９０４を分離精製す
ることができる。

【００３０】次に、本発明物質ＦＯ−５９０４の理化学
的性質および生物学的性質について以下に述べる。（１）性状：黄色粉末（２）分子量：２８９（Ｍ＋Ｈ、高速原子衝撃質量分
析による）（３）分子式：Ｃ₁₅Ｈ₁₂Ｏ₆ （４）融点：１８０℃ （５）比旋光度：〔α〕_D ²⁰−０．４°（ｃ＝１．０，
エタノール中）

【００３１】（６）紫外部吸収スペクトル：エタノール
中で測定した紫外部吸収スペクトルは図１に示すとおり
であり、２５４、２８０（肩）、３６８（肩）、４０
２．５ｎｍ付近に特徴的な吸収極大を示す（７）赤外部吸収スペクトル：臭化カリウム法で測定し
た赤外部吸収スペクトルは図２に示すとおりであり、３
１５９、２９８５、２３６２、１６１６、１４９８、１
４５８、１３８５、１２６９、１１３４、１０４０、８
９１、８２７ｃｍ^-1に特徴的な吸収帯を有する

【００３２】（８）溶剤に対する溶解性：メタノール、
エタノール、酢酸エチル、ジメチルスルホキシドに可溶
であり、水、ヘキサン、アセトン、クロロホルムに難溶
である（９）呈色反応：硫酸に陽性、ニンヒドリン、ドラーゲ
ンドルフに陰性（１０）酸性、中性、塩基性の区別：酸性物質（１１）プロトン核磁気共鳴スペクトル：バリアン（Ｖ
ａｒｉａｎ）社製、ＶＸＲ−３００型各磁気共鳴スペク
トロメータを用いて測定した¹Ｈ−ＮＭＲスペクトル
（重ジメチルスルホキシド溶液中、３００ＭＨｚ）は、
１１．６５ｓ（１Ｈ）、６．７６ｓ（１Ｈ）、６．４１
ｓ（１Ｈ）、３．８０ｓ（３Ｈ）、２．７７ｓ（３Ｈ）
ｐｐｍに特徴的なシグナルを有する。（ｓは一重線、Ｈ
はプロトンの数を示す）

【００３３】（１２）¹³Ｃ−核磁気共鳴スペクトル：バ
リアン（Ｖａｒｉａｎ）社製、ＶＸＲ−３００型核磁気
共鳴スペクトロメータを用いて測定した¹³Ｃ−ＮＭＲス
ペクトル（重ジメチルスルホキシド中、３００ＭＨｚ）
は図４に示すとおりであり、１７０．１ｓ、１６８．２
ｓ、１６５．９ｓ、１６４．９ｓ、１６３．０ｓ、１４
６．８ｓ、１３２．８ｓ、１２７．１ｓ、１１６．７
ｄ、１１０．４ｓ、１０５．４ｓ、１０２．３ｓ、９
９．９ｄ、５９．６ｑ、２５．３ｑｐｐｍに特徴的な
シグナルを有する。（ｓは一重線、ｄは二重線、ｑは四
重線を示す）

【００３４】本物質ＦＯ−５９０４のコラゲナーゼ阻害
作用：本物質ＦＯ−５９０４のコラゲナーゼ阻害作用
は、公知のコラゲナーゼ阻害作用の反応系〔炎症、第４
巻、第１２３頁（１９８４年）〕に準じて酵素反応を行
った。反応液中にはコラゲナーゼの他にＦＩＴＣ標識コ
ラーゲン、ＮａＣｌ、ＣａＣｌ₂、およびトリス−塩酸
緩衝液（ｐＨ７．５）を含む。その反応結果は、物質Ｆ
Ｏ−５９０４のヒト由来のコラゲナーゼに対するＩＣ₅₀
は１７０μＭであった。

【００３５】本物質ＦＯ−５９０４の抗インフルエンザ
活性：イヌ腎臓由来ＭＤＣＫ細胞を１０％ウシ胎児血清
を添加したイーグル培地で５％炭酸ガス下３７℃で４日
間培養した。これにインフルエンザウイルス（Ａ／ＰＲ
／８／３４型）を０．００１ＰＦＵ／細胞で感染させ、
同時にＦＯ−５９０４物質を添加し、さらに３日間培養
した後、細胞の生存率と培養液のシアリダーゼ活性を測
定した。

【００３６】細胞の生存率は公知の方法〔ジャーナル
オブイムノロジカルメソド（Ｊ．Ｉｍｍｕｎ．Ｍｅ
ｔｈｏｄｓ）、第６５巻、第５５頁、（１９８３）〕に
準じて測定した。また、シアリダーゼ活性の測定は公知
の反応系、ケミカルアンドファーマシュティカルビ
ュレチン〔（Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．）．，
第３８巻、第１３２９頁、（１９９０）〕に準じて酵素
反応を行った。その結果を表２に示す。

【００３７】

【表２】上記の表２に示す結果から明らかなように、１４０μＭ
のＦＯ−５９０４物質を添加するとインフルエンザを感
染させたＭＤＣＫ細胞の生存率は顕著に回復した。ま
た、ウイルスの感染の指標である培養液のシアリダーゼ
活性は著しく低下した。これらの結果よりＦＯ−５９０
４物質は、抗インフルエンザウイルス活性を有すること
を示している。

【００３８】

【実施例】次に、実施例を挙げて本発明を具体的に説明
するが、本発明はこれのみに限定されるものではない。
１リットル容ルー瓶２０本にサッカロース２．０％、グ
ルコース１．０％、コーン・スティープ・リカー０．５
％、肉エキス０．５％、硫酸マグネシウム７水塩０．０
５％、燐酸１カリウム０．１％、炭酸カルシウム０．３
％からなる液体培地（ｐＨ６．０）を２５０ｍl ずつ分
注し、１２１℃で１５分間、高圧蒸気滅菌し、これに澱
粉（溶性）１．５％、酵母エキス（オリエンタル酵母工
業社製、日本）０．４％、硫酸マグネシウム７水塩０．
０５％、燐酸カリウム０．１％、寒天２．０％を含む寒
天斜面培地で２７℃で培養したアスペルギラスニガー
（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ）ＦＯ−５９０
４株（ＦＥＲＭＰ−１５３９７）の胞子液を接種し、
２７℃で１０日間培養した。

【００３９】培養液をシャープレスで遠心分離（１０，
０００ｒｐｍ）し、得られた菌体に５リットルのアセト
ンを加えて攪拌し、これを減圧下でろ過し、アセトン抽
出液を得た。これを減圧濃縮した後、２リットルの０．
０１Ｎ塩酸溶液に溶解した。これに５リットルの酢酸エ
チルを加えて攪拌し、これをシャープレスで遠心分離
（１０，０００ｒｐｍ）して、水層と酢酸エチル層とに
分別した。

【００４０】得られた酢酸エチル層に無水硫酸ナトリウ
ム５００ｇを加え、脱水した後、酢酸エチル層を減圧濃
縮し、粗物質Ｉを３．０３ｇ得た。これを少量のエタノ
ールに溶解し、４０％アセトニトリルで充填したＯＤＳ
シリカゲル（ＯＤＳＲ−３０６０８、センシュー科学
社製、日本）の上端に負荷し、４０％アセトニトリルで
カラムを洗浄した後、６０％アセトニトリルで活性物質
を溶出した。

【００４１】これを減圧下で濃縮することによって粗物
質IIを８２０．６ｍｇ得た。これを少量のエタノールに
溶解し、あらかじめエタノールで充填したセァデックス
ＬＨ−２０カラム（２．３８×１１２ｃｍ）の上端に負
荷し、エタノールにて溶出した。活性画分を集め、減圧
下で濃縮することによって、粗物質III を４５３．５ｍ
ｇ得た。

【００４２】この粗物質III を少量のエタノールに溶解
し、続いて高速液体クロマトグラフイー（ＹＭＣ−Ｐａ
ｃｋＯＤＳ、φ２０×２５０ｍｍ、ワイエムシー社
製、日本）に注入し、０．１％リン酸を含む４０％アセ
トニトリルを移動相として２１０ｎｍの吸収を検出しな
がら、７ｍl ／分間の流速において、１３分に溶出する
ピークを集めた。これを減圧濃縮し、アセトニトリルを
留去したのち酢酸エチルで抽出し、酢酸エチル層を分別
し、脱水した後、減圧濃縮して、コラゲナーゼ阻害物質
ＦＯ−５９０４の黄色粉末を９７．５ｍｇ得た。

【００４３】

【発明の効果】以上のとおり、アスペルギラス属に属す
るコラゲナーゼ阻害物質ＦＯ−５９０４を生産する能力
を有する微生物を培地に培養し、その培養物中にコラゲ
ナーゼ阻害物質ＦＯ−５９０４を蓄積せしめ、該培養物
からコラゲナーゼ阻害物質ＦＯ−５９０４を採取するこ
とにより、新規なコラゲナーゼ阻害物質が得られ、該コ
ラゲナーゼ阻害物質は、コラーゲンの分解を抑制するこ
とから、抗リウマチ剤、抗炎症剤、抗癌剤、抗インフル
エンザウイルスの感染等に対する効果が期待されるもの
である。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明によるコラゲナーゼ阻害物質ＦＯ−５９
０４の紫外線吸収スペクトル（エタノール中）である。

【図２】本発明によるコラゲナーゼ阻害物質ＦＯ−５９
０４の赤外線吸収スペクトル（臭化カリウム法）であ
る。

【図３】本発明によるコラゲナーゼ阻害物質ＦＯ−５９
０４のプロトン−核磁気共鳴スペクトル（重ジメチルス
ルホキシド中、３００ＭＨｚ）である。

【図４】本発明によるコラゲナーゼ阻害物質ＦＯ−５９
０４の¹³Ｃ−核磁気共鳴スペクトル（重ジメチルスルホ
キシド中、３００ＭＨｚ）である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ａ６１Ｋ 35/70 ＡＥＤＡ６１Ｋ 35/70 ＡＥＤＣ１２Ｎ 1/14 Ｃ１２Ｎ 1/14 ＡＢＣ１２Ｐ 1/02 Ｃ１２Ｐ 1/02 Ａ //(Ｃ１２Ｎ 1/14 Ｃ１２Ｒ 1:685） (Ｃ１２Ｐ 1/02 Ｃ１２Ｒ 1:685） (72)発明者増間碌郎東京都港区白金５丁目９番１号社団法人北里研究所内

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】次の理化学的性質を有するコラゲナーゼ
阻害物質ＦＯ−５９０４。（１）性状：黄色粉末（２）分子量：２８９（Ｍ＋Ｈ、高速原子衝撃質量分析
による）（３）分子式：Ｃ₁₅Ｈ₁₂Ｏ₆ （４）融点：１８０℃（分解）（５）比旋光度：〔α〕_D ²⁰−０．４°（ｃ＝１．０，
エタノール中）（６）紫外部吸収スペクトル：エタノール中で測定した
紫外部吸収スペクトルは図１に示すとおりであり、２５
４、２８０（肩）、３６８（肩）、４０２．５ｎｍ付近
に特徴的な吸収極大を示す（７）赤外部吸収スペクトル：臭化カリウム法で測定し
た赤外部吸収スペクトルは図２に示すとおりであり、３
１５９、２９８５、２３６２、１６１６、１４９８、１
４５８、１３８５、１２６９、１１３４、１０４０、８
９１、８２７ｃｍ^-1に吸収帯を有する（８）溶剤に対する溶解性：メタノール、エタノール、
酢酸エチル、ジメチルスルホキシドに可溶、水、ヘキサ
ン、アセトン、クロロホルムに難溶（９）呈色反応：硫酸に陽性、ニンヒドリン、ドラーゲ
ンドルフに陰性（１０）酸性、中性、塩基性の区別：酸性物質
【請求項２】アスペルギラス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕ
ｓ）属に属するコラゲナーゼ阻害物質ＦＯ−５９０４を
生産する能力を有する微生物を培地に培養し、その培養
物中にコラゲナーゼ阻害物質ＦＯ−５９０４を蓄積せし
め、該培養物からコラゲナーゼ阻害物質ＦＯ−５９０４
を採取することを特徴とするコラゲナーゼ阻害物質ＦＯ
−５９０４の製造法。
【請求項３】アスペルギラス属に属し、コラゲナーゼ
阻害物質ＦＯ−５９０４を生産する能力を有する微生物
が、アスペルギラスニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ
ｎｉｇｅｒ）ＦＯ−５９０４（ＦＥＲＭＰ−１５３
９７）である請求項２記載の製造法。
【請求項４】アスペルギラス属に属し、コラゲナーゼ
阻害物質ＦＯ−５９０４物質を生産する能力を有する微
生物。
【請求項５】微生物がアスペルギラスニガー（Ａｓ
ｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ）（ＦＥＲＭＰ−１５
２５３）である請求項４記載の微生物。